JPH0616703B2 - 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 - Google Patents
耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬Info
- Publication number
- JPH0616703B2 JPH0616703B2 JP3866387A JP3866387A JPH0616703B2 JP H0616703 B2 JPH0616703 B2 JP H0616703B2 JP 3866387 A JP3866387 A JP 3866387A JP 3866387 A JP3866387 A JP 3866387A JP H0616703 B2 JPH0616703 B2 JP H0616703B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peroxidase
- hydrogen peroxide
- enzyme
- thermostable
- around
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用の分野） 本発明は６０℃において１０分間加温処理をしても９５
％以上のペルオキシダーゼ活性を有している耐熱性ペル
オキシダーゼ及びその酵素の製造法およびその酵素を用
いる分析試薬に関する。
％以上のペルオキシダーゼ活性を有している耐熱性ペル
オキシダーゼ及びその酵素の製造法およびその酵素を用
いる分析試薬に関する。
従来よりペルオキシダーゼは過酸化水素の存在下で種々
の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断用として
グルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸の定量
に種々のオキシダーゼと共に使用されており、又、酵素
免疫試験法における標識酵素としても使用されている。
の化合物を酸化する酵素であり、近年臨床診断用として
グルコース、コレステロール、リン脂質及び尿酸の定量
に種々のオキシダーゼと共に使用されており、又、酵素
免疫試験法における標識酵素としても使用されている。
（従来の技術） ここで言うペルオキシダーゼとは酵素番号ＥＣ1.11.17
であり、系統名Donor：hydrogen−peroxideoxidoreduct
aseのことである。
であり、系統名Donor：hydrogen−peroxideoxidoreduct
aseのことである。
ペルオキシダーゼの供給源としては西洋ワサビ、大根等
の植物が広く知られている。しかしながら、これらの植
物由来のペルオキシダーゼには性質が僅かずつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純粋な酵
素を得るにはアイソザイムを分離する必要があり、非常
に手間を要するという問題がある。
の植物が広く知られている。しかしながら、これらの植
物由来のペルオキシダーゼには性質が僅かずつ異なるア
イソザイムが含まれるため、診断試薬に用いる純粋な酵
素を得るにはアイソザイムを分離する必要があり、非常
に手間を要するという問題がある。
微生物起源のペルオキシダーゼも各種知られており、オ
イデイオデンドロン（Oidiodendron）属（特開昭５９−
１７９０７５号）、アルスロマイセス属（特開昭６１−
４３９８７号）、ヒトヨタケ（特開昭６１−１２８８８
７号）に存在することが報告されている。
イデイオデンドロン（Oidiodendron）属（特開昭５９−
１７９０７５号）、アルスロマイセス属（特開昭６１−
４３９８７号）、ヒトヨタケ（特開昭６１−１２８８８
７号）に存在することが報告されている。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、従来から知られている上記ペルオキシダ
ーゼは熱安定性が不充分であり、臨床診断用試薬及び酵
素免疫試験法における標識酵素として用いる場合、問題
がある。
ーゼは熱安定性が不充分であり、臨床診断用試薬及び酵
素免疫試験法における標識酵素として用いる場合、問題
がある。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは熱安定性の優れたペルオキシダーゼを広く
検索したところ、バチルス・ステアロサーモフィラス(B
acillus stearothermophilus)の産生するペルオキシダ
ーゼが６０℃において１０分間加温処理をしても９５％
以上のペルオキシダーゼ残存活性を有していることを見
い出した。
検索したところ、バチルス・ステアロサーモフィラス(B
acillus stearothermophilus)の産生するペルオキシダ
ーゼが６０℃において１０分間加温処理をしても９５％
以上のペルオキシダーゼ残存活性を有していることを見
い出した。
また該耐熱性ペルオキシダーゼ、ペルオキシダーゼの存
在下、過酸化水素と作用すると発色螢光又は発光を生ず
る色原体及び緩衝剤により過酸化水素または種々のオキ
シダーゼから生成した過酸化水素をより熱安定性の優れ
た状態で分析することが出来ることを見い出し、本発明
の完成に至った。
在下、過酸化水素と作用すると発色螢光又は発光を生ず
る色原体及び緩衝剤により過酸化水素または種々のオキ
シダーゼから生成した過酸化水素をより熱安定性の優れ
た状態で分析することが出来ることを見い出し、本発明
の完成に至った。
すなわち本発明は下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペル
オキシダーゼである。
オキシダーゼである。
(1) 作用特異性：過酸化水素の存在下で水素供与体の
酸化を触媒する。
酸化を触媒する。
(2) 至適pH：pH６付近にある。
(3) 至適温度：５０℃付近にある。
(4) 温度安定性：６０℃において１０分間加温処理し
ても９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有する。
ても９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有する。
また本発明はバチルス属に属する下記性質(1)〜(4)を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ生産菌を培養し、培養物か
ら下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダーゼを
採取することを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製
造法である。
する耐熱性ペルオキシダーゼ生産菌を培養し、培養物か
ら下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダーゼを
採取することを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製
造法である。
さらに本発明は過酸化水素または過酸化水素を遊離する
系を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試薬にお
いて、下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダー
ゼおよび該酵素の存在下、過酸化水素と作用すると発
色、蛍光又は発光を生ずる色原体群を含有することを特
徴とする耐熱性ペルオキシダーゼを用いる分析用試薬で
ある。
系を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試薬にお
いて、下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダー
ゼおよび該酵素の存在下、過酸化水素と作用すると発
色、蛍光又は発光を生ずる色原体群を含有することを特
徴とする耐熱性ペルオキシダーゼを用いる分析用試薬で
ある。
本発明の酵素の内の１種、バチルス・ステアロサーモフ
ィラスＩＡＭ１１００１から産生する耐熱性ペルオキシ
ダーゼの理化学的性質を示す。
ィラスＩＡＭ１１００１から産生する耐熱性ペルオキシ
ダーゼの理化学的性質を示す。
(1) 作用特異性； 本酵素は過酸化水素の存在下で種々の化合物の酸化を触
媒する。その作用機構は次式に示す通りである。
媒する。その作用機構は次式に示す通りである。
［但し式中AH2は水素供与体を、又、Ａは酸化された水
素供与体を示す］２，４−ジクロロフェノール（2,4−D
ichlorophenol）と４−アミノアンチピリン（４−Amino
antipyrine）は良好な基質である。
素供与体を示す］２，４−ジクロロフェノール（2,4−D
ichlorophenol）と４−アミノアンチピリン（４−Amino
antipyrine）は良好な基質である。
(2) 至適pH；pH６付近にある。
(3) 至適温度；５０℃付近にある。
(4) 温度安定性； ６０℃において１０分間の加温処理後の残存活性は９６
％であり、３０℃において５日間は充分に安定である。
％であり、３０℃において５日間は充分に安定である。
(5) 分子量； 約164,000（ゲル濾過法による）であり、82,000（ＳＤ
Ｓ電気泳動による）のサブユニットの２量体である。
Ｓ電気泳動による）のサブユニットの２量体である。
(6) アミノ酸組成； 下記第２表に示す。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼを産生する微生物とし
てはバチルス属、例えばバチルス・ステアロサーモフィ
ラスなどが挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィ
ラスはバージース・マニュアル・オブ・ディタミネイテ
ィブバクテリオロジー（第８版）（１９７４）により
と、６５℃で生育する好熱性桿菌であり、０．６〜１×
２〜３．５の大きさを持ち、運動性を有する。
てはバチルス属、例えばバチルス・ステアロサーモフィ
ラスなどが挙げられる。バチルス・ステアロサーモフィ
ラスはバージース・マニュアル・オブ・ディタミネイテ
ィブバクテリオロジー（第８版）（１９７４）により
と、６５℃で生育する好熱性桿菌であり、０．６〜１×
２〜３．５の大きさを持ち、運動性を有する。
本発明に用いるバチルス属の微生物としては、例えばバ
チルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ１１００１株な
どがある。
チルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ１１００１株な
どがある。
本発明に使用される菌株を培養するためには、その菌株
の胞子菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を液
体培地に接種し培養する。液体培地の炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、
マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセリン、マン
ニトール等の一般的に使用されるものがいずれも使用で
きる。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキ
ス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー等
の天然窒素源の他に尿素等の有機窒素源ならびに硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を用いるこ
とができる。この他必要に応じてリン酸塩、硫酸マグネ
シウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微
量栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物
の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。使用上
一般に炭素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５
重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０．
１〜２重量％の濃度とするのが良い。又、培養温度は３
０〜７５℃、好ましくは４０〜６０℃とし、培地のpHは
４〜１０、好ましくは６〜９として、通気撹拌培養、振
盪培養もしくは静置培養を行なう。培養は通常８時間〜
３日間で行なわれる。
の胞子菌糸あるいは予め培養して得られた前培養液を液
体培地に接種し培養する。液体培地の炭素源としてはグ
ルコース、フラクトース、キシロース、サッカロース、
マルトース、可溶性デンプン、糖蜜、グリセリン、マン
ニトール等の一般的に使用されるものがいずれも使用で
きる。窒素源としてはペプトン、酵母エキス、麦芽エキ
ス、肉エキス、カザミノ酸、コーンスティープリカー等
の天然窒素源の他に尿素等の有機窒素源ならびに硝酸ナ
トリウム、硝酸アンモニウム等の無機窒素源を用いるこ
とができる。この他必要に応じてリン酸塩、硫酸マグネ
シウム、硫酸鉄、硫酸銅等の無機塩及びビタミン等も微
量栄養源として使用できる。これらの培地成分は微生物
の生育を害しない濃度であれば特に制限はない。使用上
一般に炭素源は０．１〜１０重量％、好ましくは１〜５
重量％、窒素源は０．０１〜５重量％、好ましくは０．
１〜２重量％の濃度とするのが良い。又、培養温度は３
０〜７５℃、好ましくは４０〜６０℃とし、培地のpHは
４〜１０、好ましくは６〜９として、通気撹拌培養、振
盪培養もしくは静置培養を行なう。培養は通常８時間〜
３日間で行なわれる。
ふすま、もみがら、米ぬか等を用いる固形培地も利用で
きるが、大量培養のためには液体培地を使用することが
好ましい。
きるが、大量培養のためには液体培地を使用することが
好ましい。
この様に培養して培養物中にペルオキシダーゼが生成蓄
積する。ここで培養物とは液体培養においては培養後の
菌体及び培養上澄液又は培養濾液を意味し、固形培養に
おいては菌体及び菌体の生育した培地を意味する。
積する。ここで培養物とは液体培養においては培養後の
菌体及び培養上澄液又は培養濾液を意味し、固形培養に
おいては菌体及び菌体の生育した培地を意味する。
液体培地を使用した場合には培養液中からペルオキシダ
ーゼの採取は次のごとく行なう。
ーゼの採取は次のごとく行なう。
培養終了後、培養液より遠心分離及び濾過などの固液分
離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得る。
離手段により菌体及び不溶物を除いて粗酵素液を得る。
この様にして得られた粗酵素液から、例えば有機溶媒分
別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法及びカラムクロ
マトグラフィー等通常の酵素精製法を単独にあるいは組
合せて用いることにより精製されたペルオキシダーゼを
得ることが出来る。
別法、硫安分別法、透析、等電点沈殿法及びカラムクロ
マトグラフィー等通常の酵素精製法を単独にあるいは組
合せて用いることにより精製されたペルオキシダーゼを
得ることが出来る。
本発明のペルオキシダーゼを活性測定は水素供与体とし
て、例えば４−アミノアンチピリン−フェノール系を使
用して次のように行なう。
て、例えば４−アミノアンチピリン−フェノール系を使
用して次のように行なう。
即ち ４mM４−アミノアンチピリン 0.5ml 24.6mM2.4−ジクロロフェノール 0.5ml 8.8mMＨ2Ｏ2 １ml 100mMリン酸緩衝液pH6.0 １ml を混合し、５分間５０℃で予備加温後酵素液１０μを
添加し、５００ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。
分子吸光係数は１．３６×１０4Ｍ-1cm-1を用いた。
添加し、５００ｎｍにおける吸光度の増加を測定した。
分子吸光係数は１．３６×１０4Ｍ-1cm-1を用いた。
本発明の分析用試薬は過酸化水素または過酸化水素を遊
離する系を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試
薬であり、上記耐熱性ペルオキシダーゼおよび該酵素の
存在下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を
生ずる色原体群を含有する。
離する系を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試
薬であり、上記耐熱性ペルオキシダーゼおよび該酵素の
存在下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を
生ずる色原体群を含有する。
本発明に用いる過酸化水素を遊離する系とは、例えば体
液試料中の基質となる各成分、例えばグルコース、尿
酸、コレステロール、ポリアミン等に各過酸化酵素を作
用させて過酸化水素を遊離する系を含む。
液試料中の基質となる各成分、例えばグルコース、尿
酸、コレステロール、ポリアミン等に各過酸化酵素を作
用させて過酸化水素を遊離する系を含む。
ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と作用すると発
色を生ずる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。
色を生ずる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。
(1) ４−アミノアンチピリンとフェノール及びフェノ
ール化合物 (2) ４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等のアニリン化合物 (3) ４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
(EHSPT)等のトルイジン化合物 (4) メチルベンゾチアゾリンヒドラゾンン(MBTH)とＮ
−エチル−Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニ
シジンESPAS)等のアニシジン化合物などがあり、ペルオ
キシダーゼの存在下過酸化水素と作用すると発色を生ず
る色原体であれば、上述の試薬に限定されるものではな
い。
ール化合物 (2) ４−アミノアンチピリンとＮ，Ｎ−ジメチルアニ
リン、Ｎ，Ｎ−ジエチルアニリン等のアニリン化合物 (3) ４−アミノアンチピリンとＮ−エチル−Ｎ−（２
−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−トルイジン
(EHSPT)等のトルイジン化合物 (4) メチルベンゾチアゾリンヒドラゾンン(MBTH)とＮ
−エチル−Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−アニ
シジンESPAS)等のアニシジン化合物などがあり、ペルオ
キシダーゼの存在下過酸化水素と作用すると発色を生ず
る色原体であれば、上述の試薬に限定されるものではな
い。
又、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素と作用すると
螢光を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。
螢光を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をいう。
例えば、ホモバニリン酸、ｐ−シドロキシフェニル酢酸
などがあり、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素と作
用すると螢光を生ずる色原体であれば、上述の試薬に限
定されるものではない。
などがあり、ペルオキシダーゼ存在下、過酸化水素と作
用すると螢光を生ずる色原体であれば、上述の試薬に限
定されるものではない。
さらにペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と作用す
ると発色を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をい
う。
ると発色を生じる色原体とは、例えば次の様な試薬をい
う。
例えば、ルミノール、ロイコ−２′，７′−ジクロロフ
ルオレッセンとビス（２，４，６−トリクロロフェニ
ル）オキザレートなどがあり、ペルオキシダーゼの存在
下、過酸化水素と作用すると発光を生じる色原体であれ
ば、上述の試薬に限定されるものではない。
ルオレッセンとビス（２，４，６−トリクロロフェニ
ル）オキザレートなどがあり、ペルオキシダーゼの存在
下、過酸化水素と作用すると発光を生じる色原体であれ
ば、上述の試薬に限定されるものではない。
本発明の分析用試薬は必要により緩衝液、各種安定剤な
どを含む。
どを含む。
本発明の分析用試薬とは上記耐熱性酵素と該酵素の存在
下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を生ず
る色原体群を含有する。したがって、過酸化水素と該分
析用試薬を作用させることにより、発色、螢光又は発光
が生じ、通常の方法に従い、発色、螢光又は発光の量を
測定することにより、過酸化水素の量を知ることができ
る。
下、過酸化水素と作用すると発色、螢光又は発光を生ず
る色原体群を含有する。したがって、過酸化水素と該分
析用試薬を作用させることにより、発色、螢光又は発光
が生じ、通常の方法に従い、発色、螢光又は発光の量を
測定することにより、過酸化水素の量を知ることができ
る。
本発明の耐熱性酵素は凍結乾燥して、又は液状にて使用
できる。又、固定化酵素として過酸化水素電極を利用し
た電極法、含浸性基材に吸収させた分析用キット、標識
酵素として免疫反応を利用した酵素免疫測定法などに利
用できる。
できる。又、固定化酵素として過酸化水素電極を利用し
た電極法、含浸性基材に吸収させた分析用キット、標識
酵素として免疫反応を利用した酵素免疫測定法などに利
用できる。
本発明の分析用試薬は過酸化水素分析のみならず、各種
体液成分（基質又は酵素）の測定が可能である。
体液成分（基質又は酵素）の測定が可能である。
（実施例） 以下、本発明を実施例により説明する。
実施例 １ Luria-Bertani(LB)−ブロス寒天培地（１あたりペプ
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩１０ｇ、寒天１５
ｇ、pH７．０）の斜面培地で５５℃、１日間培養したバ
チルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ１１００１株を
１２℃、１５分間オートクレーブ殺菌したＬＢ培地（１
あたりペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩１０
ｇ、pH７．０）１００mlに一白金耳植菌した。５５℃、
１２時間振盪培養を行い、種菌とした。
トン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩１０ｇ、寒天１５
ｇ、pH７．０）の斜面培地で５５℃、１日間培養したバ
チルス・ステアロサーモフィラスＩＡＭ１１００１株を
１２℃、１５分間オートクレーブ殺菌したＬＢ培地（１
あたりペプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、食塩１０
ｇ、pH７．０）１００mlに一白金耳植菌した。５５℃、
１２時間振盪培養を行い、種菌とした。
１２０℃、１５分間オートクレーブ殺菌したＬ−ブロス
培地３に上記種菌を３０ml植菌した。通気、撹拌しな
がら、５５℃、１８時間培養を行った結果、その培養物
中にペルオキシダーゼ活性０．１４u/mlを見出した。
培地３に上記種菌を３０ml植菌した。通気、撹拌しな
がら、５５℃、１８時間培養を行った結果、その培養物
中にペルオキシダーゼ活性０．１４u/mlを見出した。
遠心分離機で菌体を集めたのち、２０mMリン酸緩衝液、
pH７．０、１００mlで懸濁し、超音波破砕（20KHz、２
０分間）を行った。遠心分離し、その上清９０ml（６．
１５u/ml、比活性０．２２u/mg蛋白）を得た。上清を硫
安分画（３５％飽和〜５５％飽和）し、活性画分１８m
l、１１．１u/ml、比活性０．３５u/mgを得た。１００m
Mリン酸緩衝液pH７．０に対して透析し脱塩した。
pH７．０、１００mlで懸濁し、超音波破砕（20KHz、２
０分間）を行った。遠心分離し、その上清９０ml（６．
１５u/ml、比活性０．２２u/mg蛋白）を得た。上清を硫
安分画（３５％飽和〜５５％飽和）し、活性画分１８m
l、１１．１u/ml、比活性０．３５u/mgを得た。１００m
Mリン酸緩衝液pH７．０に対して透析し脱塩した。
さらに２０mMリン酸緩衝液pH７．０で緩衝化したＤＥＡ
Ｅ−セファデックスＡ−５０（ファルマシア社）に吸着
させた。２０mMリン酸緩衝液pH７．０４で洗浄後、０〜
０．５Ｍ Naclを含む２０mMリン酸緩衝液pH７．０で溶
出し、活性画分を集め、１５５ml（１．１５u/ml、比活
性０．７４u/mg蛋白）を得た。
Ｅ−セファデックスＡ−５０（ファルマシア社）に吸着
させた。２０mMリン酸緩衝液pH７．０４で洗浄後、０〜
０．５Ｍ Naclを含む２０mMリン酸緩衝液pH７．０で溶
出し、活性画分を集め、１５５ml（１．１５u/ml、比活
性０．７４u/mg蛋白）を得た。
再度、脱塩後、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０クロ
マトグラフィーを行ない、１００ml（１．６６u/ml、比
活性１．８６u/mg蛋白）を得た。
マトグラフィーを行ない、１００ml（１．６６u/ml、比
活性１．８６u/mg蛋白）を得た。
さらに、２０mMリン酸緩衝液pH７．０で緩衝化したトヨ
パールＨＷ５５（東洋曹達）で分子篩を行い、活性画分
３０ml（５．１u/ml、比活性２．７３u/mg蛋白）を得
た。
パールＨＷ５５（東洋曹達）で分子篩を行い、活性画分
３０ml（５．１u/ml、比活性２．７３u/mg蛋白）を得
た。
ＴＳＫ−ＤＥＡＥ−３７Ｗ（（東洋曹達）高速液体クロ
マトグラフィーで吸着、溶出し、高純度品６４ml（１．
８４u/ml、比活性９．７６u/mg蛋白）を得た。
マトグラフィーで吸着、溶出し、高純度品６４ml（１．
８４u/ml、比活性９．７６u/mg蛋白）を得た。
得られた酵素の理化学的性質は前述の通りである。
実施例 ２ 実施例で１得られた耐熱性ペルオキシダーゼと従来より
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼの熱安定性
を比較した。
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼの熱安定性
を比較した。
０．１mMリン酸緩衝液pH６．０ １mlにペルオキシダー
ゼ０．１u/mlになる様に調製し、各温度での熱安定性を
調べた。各温度の処理時間は１０分間とした。ペルオキ
シダーゼ活性の残存率で示した。
ゼ０．１u/mlになる様に調製し、各温度での熱安定性を
調べた。各温度の処理時間は１０分間とした。ペルオキ
シダーゼ活性の残存率で示した。
実施例 ３ 実施例１で得られた耐熱性ペルオキシダーゼと従来より
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた過
酸化水素測定用試薬溶液を調製し、その溶液中でのペル
オキシダーゼの安定性を調べた。過酸化水素測定用試薬
としては次の様な組成を用いた。
市販されている西洋ワサビペルオキシダーゼを用いた過
酸化水素測定用試薬溶液を調製し、その溶液中でのペル
オキシダーゼの安定性を調べた。過酸化水素測定用試薬
としては次の様な組成を用いた。
４．１mM２．４−ジクロロフェノール、０．６７mM４−
アミノアンチピリン、３３mMリン酸緩衝液pH６．０、ペ
ルオキシダーゼ（５u/ml）とした。
アミノアンチピリン、３３mMリン酸緩衝液pH６．０、ペ
ルオキシダーゼ（５u/ml）とした。
上記過酸化水素測定用試薬１０mlを３０℃で保存し、経
日変化をペルオキシダーゼ活性の残存率で示した。
日変化をペルオキシダーゼ活性の残存率で示した。
本発明の耐熱性ペルオキシダーゼは過酸化水素測定用試
薬としても安定性が優れていることが判明した。
薬としても安定性が優れていることが判明した。
（効果） 本発明では６０℃において１０分間加熱処理をしても９
５％以上のペルオキシダーゼ活性を有している新規な耐
熱性ペルオキシダーゼが得られ、該酵素を使用すること
により、従来の熱的性質の弱かったペルオキシダーゼで
は測定が熱的に困難であった過酸化水素の測定が可能と
なった。例えば該耐熱性ペルオキシダーゼを固定化して
バイオリアクターとして又は該耐熱性ペルオキシダーゼ
を標識とする酵素免疫測定に有効に利用することができ
る。また該耐熱性ペルオキシダーゼは基材に含浸させた
診断用キット又は液状酵素として利用しても充分に熱的
に安定である。
５％以上のペルオキシダーゼ活性を有している新規な耐
熱性ペルオキシダーゼが得られ、該酵素を使用すること
により、従来の熱的性質の弱かったペルオキシダーゼで
は測定が熱的に困難であった過酸化水素の測定が可能と
なった。例えば該耐熱性ペルオキシダーゼを固定化して
バイオリアクターとして又は該耐熱性ペルオキシダーゼ
を標識とする酵素免疫測定に有効に利用することができ
る。また該耐熱性ペルオキシダーゼは基材に含浸させた
診断用キット又は液状酵素として利用しても充分に熱的
に安定である。
第１図は反応pHと本発明のペルオキシダーゼの相対活性
との関係を示すグラフである。 第２図は反応温度と本発明のペルオキシダーゼの相対活
性との関係を示すグラフである。 第３図は温度安定性を示すグラフである。
との関係を示すグラフである。 第２図は反応温度と本発明のペルオキシダーゼの相対活
性との関係を示すグラフである。 第３図は温度安定性を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキ
シダーゼ。 (1) 作用特異性：過酸化水素の存在下で水素供 与体の酸化を触媒する。 (2) 至適pH：pH６付近にある。 (3) 至適温度：５０℃付近にある。 (4) 温度安定性：６０℃において１０分間加温処理し
ても９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有する。 - 【請求項２】バチルス属に属する下記性質(1)〜(4)を有
する耐熱性ペルオキシダーゼ生産菌を培養し、培養物か
ら下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダーゼを
採取することを特徴とする耐熱性ペルオキシダーゼの製
造法。 (1) 作用特異性：過酸化水素の存在下で水素供与体の
酸化を触媒する。 (2) 至適pH：pH６付近にある。 (3) 至適温度：５０℃付近にある。 (4) 温度安定性：６０℃において１０分間加温処理し
ても９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有する。 - 【請求項３】過酸化水素または過酸化水素を遊離する系
を有してなる試料中の過酸化水素を分析する試薬におい
て、下記性質(1)〜(4)を有する耐熱性ペルオキシダーゼ
および該酵素の存在下、過酸化水素と作用すると発色、
蛍光又は発光を生ずる色原体群を含有することを特徴と
する耐熱性ペルオキシダーゼを用いる分析用試薬。 (1) 作用特異性：過酸化水素の存在下で水素供与体の
酸化を触媒する。 (2) 至適pH：pH６付近にある。 (3) 至適温度：５０℃付近にある。 (4)温度安定性：６０℃において１０分間加温処理して
も９５％以上のペルオキシダーゼ活性を有する。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3866387A JPH0616703B2 (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3866387A JPH0616703B2 (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63207384A JPS63207384A (ja) | 1988-08-26 |
| JPH0616703B2 true JPH0616703B2 (ja) | 1994-03-09 |
Family
ID=12531507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3866387A Expired - Lifetime JPH0616703B2 (ja) | 1987-02-20 | 1987-02-20 | 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0616703B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105928892B (zh) * | 2016-04-12 | 2019-01-04 | 中山大学 | 立方氮化硼作为过氧化物模拟酶的应用 |
-
1987
- 1987-02-20 JP JP3866387A patent/JPH0616703B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63207384A (ja) | 1988-08-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH031949B2 (ja) | ||
| CA1286211C (en) | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol | |
| EP0016845B1 (en) | Method and test composition for the determination of a substrate for xanthine-oxidase, including a novel xanthine-oxidase and method for the preparation thereof | |
| AU722636B2 (en) | Method for quantitative determination of 1,5-anhydroglucitol | |
| JPS6279780A (ja) | １，５―アンヒドログルシトールの定量法 | |
| JPS61162174A (ja) | 耐熱性ザルコシン・オキシダ−ゼｎ及びその製造法 | |
| JP3041840B2 (ja) | 新規なグリセロールデヒドロゲナーゼ、その製法及びその用途 | |
| JPH0667317B2 (ja) | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット | |
| JPS5910190B2 (ja) | 新規な乳酸オキシダ−ゼの製造法 | |
| JPH0616703B2 (ja) | 耐熱性ペルオキシダ−ゼ、その製法および該酵素を用いる分析試薬 | |
| EP0353311B1 (en) | Nucleoside oxidase and analytical method using same | |
| JP3782621B2 (ja) | ヒスタミンデヒドロゲナーゼ及びその製造法 | |
| JP3773283B2 (ja) | Ｄ−乳酸脱水素酵素およびその製造法 | |
| JP5470906B2 (ja) | カタラーゼ | |
| JPH0272873A (ja) | ヌクレオシドオキシダーゼ及びこれを利用した分析法 | |
| JPS6214272B2 (ja) | ||
| JP3152855B2 (ja) | 新規なソルビトールデヒドロゲナーゼ、その製造方法並びに該酵素を用いたソルビトールの定量のための試薬及び方法 | |
| JP2017158441A (ja) | カタラーゼ | |
| JPH03996B2 (ja) | ||
| JP3778603B2 (ja) | ソルビトールオキシダーゼ、その製造法およびその用途 | |
| FR2517698A1 (fr) | Procede de dosage de l'ethanolamine | |
| JP2886846B2 (ja) | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 | |
| EP0081878A2 (en) | Method for producing cells containing cholesterol oxidase | |
| JPS6156996B2 (ja) | ||
| JPH066075B2 (ja) | Ｌ−アミノ酸及びα−ケト酸の定量方法 |