FR2517698A1 - Procede de dosage de l'ethanolamine - Google Patents

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Abstract

PROCEDE DE DOSAGE DE L'ETHANOLAMINE DANS UN ECHANTILLON. LE PROCEDE EST CARACTERISE EN CE QUE L'ON TRAITE UN ECHANTILLON CONTENANT DE L'ETHANOLAMINE AVEC DE L'ETHANOLAMINE OXYDASE, ENZYME QUI CATALYSE UNE REACTION CONSOMMANT DE L'ETHANOLAMINE, DE L'OXYGENE ET DE L'EAU POUR FORMER DU GLYCOLALDEHYDE, DE L'AMMONIACET DU PEROXYDE D'HYDROGENE, ET EN CE QUE L'ON MESURE UNE QUANTITE D'OXYGENE CONSOMMEE OU UNE QUANTITE D'AMMONIAC OU DE PEROXYDE D'AMMONIAC ENGENDRE DANS UN SYSTEME DE REACTION. APPLICATION AU DOSAGE DE PHOSPHOLIPIDES DU SERUM.

Description

-1- La présente invention concerne un procédé de dosage de 1 'éthanolamine
L'invention concerne
plus particulièrement un procédé de dosage de l'étha-
nolamine dans un échantillon, qui consiste à traiter un échantillon contenant de l'éthanolamine avec de l'éthanolamine oxydase qui catalyse une réaction consommant de l'éthanolamine, de l'oxygène et de l'eau et libérant du glycolaldéhyde, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène, et à mesurer la quantité d'oxygène consommée ou d'ammoniac ou de peroxyde
d'hydrogène engendré.
A l'examen clinique, le phospholipide du sérum, dont 95 % sont des phospholipides de dérivé
de choline, peut être dosé par un procédé enzyma-
tique comprenant de la phospholipase D et de la choline oxydase Cependant, le reste représentant environ % des phospholipides ne peut être dosé en raison
de la non réactivité avec la choline oxydase Ces phos-
pholipides non dosables sont des phospholipides de
dérivés d'éthanolamine.
On a constaté que Bacillus sp B-0783 FERM-P No 5798 produit de l'éthanolamine oxydase qui catalyse
une réaction partant d'éthanolamine, d'oxygène et -
d'eau pour aboutir à du glycolaldéhyde, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène On a également constaté que l'éthanolamine peut être doseen traitant un échantillon contenant de l'éthanolamine avec de l'éthanolamine oxydase, et en mesurant la quantité d'oxygène consommée ou d'ammoniac ou de peroxyde d'hydrogène libéré En outre, on a constaté qu'en appliquant ce procédé, on pouvait également doser des phospholipides de dérivésd'éthanolamine seuls en traitant ces dérivés avec de la phospholipase D -2- pour libérer de l'éthanolamine, et les traiter simultanément ou successivement avec de l'éthanolamine oxydase, puis mesurer l'oxygène ainsi consomme ou
l'ammoniac ou le peroxyde d'hydrogène ainsi libéré.
Un but de la présente invention est de fournir un procédé de dosage d'éthanolamine dans
un échantillon.
Un autre but de la présente invention est de fournir un procédé de dosage comprenant le traitement d'un échantillon liquide contenant de l'éthanolamine avec de l'éthanolamine oxydase, enzyme qui catalyse une réaction consommant de l'éthanolamine, de l'oxygène et de l'eau, et produisant du glycolaldéhyde, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène, et la mesure d'une quantité d'oxygène consommé ou d'ammoniac ou
de peroxyde d'hydrogène libéré.
Un autre but de l'invention est de fournir un procédé de dosage simple et précis de l'éthanolamine
dans un échantillon.
Un autre but de l'invention est de réaliser une détermination quantitative de dérivés spécifiques d'éthanolamine dans un échantillon contenant divers phospholipides tels que des phospholipides de dérivés
éthanolamine et de dérivés de choline.
Des exemples d'éthanolamine sont l'éthanola-
mine libérée de dérivés d'éthanolamine ou l'éthanolamine elle-même. Les exemples de dérivés d'éthanolamine qui libèrent de l'éthanolamine sont la phospholipide phosphatidyl éthanolamine physiologique et des dérivés d'éthanolamine qui proviennent d'une synthèse chimique sur le groupe hydroxyle ou le groupe amino de l'6thanolamine Ces dérivés ne sont pas limités -3- au cas o ils libèrent de l'éthanolamine Par exemple,
la phosphatidyle éthanolamine peut libérer de l'étha-
nolamine par traitement avec de la phospholipase D. La phospholipase D est une enzyme catalysant une réaction qui peut engendrer de l'acide phosphatidique et de la choline à partir d'une mole de lécithine
et d'eau.
La phospholipase D est de préférence obtenue à partir d'une source microbienne Par exemple, elle peut être obtenue à partir d'un bouillon cultivé de Streptomyces hachijoensis A-1143 FERM-P No 1329, Streptomyces chromofuscus A-0848 FERM-P No 3519
ou de phospholipase D disponible dans le commerce.
La quantité de phospholipase D utilisée doit être une quantité suffisante pour libérer de l'thanolamine, par exemple supérieure à 0,1 U/ml
d'activité enzymatique, de préférence de 2-à 50 U/ml.
La réaction se déroule dans une solution tampon faiblement acide ou alcaline comme un tampon Tris-H Cl,
un tampon citrate, un tampon borate, un tampon Pipes-
Na OH ou un tampon imidazole, pendant une durée supérieure à 5 minutes, de préférence de 10 à 20 minutes à 370 C. D'autres dérivés d'éthanolamine peuvent être scindés lors de la liaison du groupe hydroxyle ou amino pour libérer de l'éthanolamine par des enzymes ou des
réactifs chimiques appropriés.
L'éthanolamine ainsi libérée ou l'éthanolamine existant à l'origine est traitée par de l'éthanolamine oxydase qui consomme de l'êthanolamine, de l'oxygène et de l'eau pour former du glycoladéhyde, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène L'éthanolamine oxydase peut être obtenue, par exemple, à partir d'un bouillon cultivé de Bacillus sp B-0783 FERM-P No 5798 (demande de brevet japonais No 56-91937) ou d'une
source microbienne appartenant au germe Arhrobacter.
-4- (J.Biol Chem, 239, 2189 ( 1964)) L'enzyme peut de préférence être purifiée, ou modifiée pour immobiliser l'enzyme
Les propriétés taxonomiques de Bacilius sp.
B-0783 sont les suivantes: (A) Croissance sur divers milieux ( 1) Bouillon de plaques d'agar ( 30 C, 18 heures de culture): coloniearrondie, plane, à bord lisse, blanc gris&tre
à gris jaunâtre pâle.
Pas de formation de pigment soluble ( 2) Bouillon d'agar incliné ( 30 QC, 18 heures de culture): Bonne croissance filamenteuse, blanc grisatre à gris jaunatre pâle Pas de formation de pigment
soluble.
( 3) Bouillon ( 30 C, 32 heures de culture):
croissance faible, précipitation.
(B) Observation microscopique: Culture sur milieu d'agar nutritif à 30 C pendant
18 heures.
( 1) Forme-et taille-des cellules: Bacilles simples, doubles ou à courte liaison, à bordsarrondis,
1,0 1,5 X 2,0 5,0 um.
( 2) Polymorphisme: Néant ( 3) Mobilité et flagelles:
Peritricheux, mobile.
( 4) Spore (forme, position, taille): Spore, oosphérique ou elliptique, forme aux bords
ou presque aux bords des cellules, spores en fuseau.
(C) Propriétés physiologiques: Réduction de nitrate, + Réaction de dénitration -5- Test /R Test VP formation d'Indole H 25 Hydrolyse de Gélatine Hydrolyse de l'amidon Utilisation de Citrate Milieu de Simons Milieu de Chrystensen Utilisation de nitrate Utilisation de sel d'ammonium Formation de pigment Oxydase Catalase Uréase Milieu SSR Milieu de Chrystensen Conditions de croissance: p H: p H optimal p H de croissance température: température optimale température de croissance Nature: aérobique Test OF (milieu de Hugh Leifson) Test OF (milieu modifié) Décomposition d'esculine Décomposition de Cellulose Tache de Gram's Tache rapide d'acide Formation d'acide et de gaz + (faible) + + +
6; 5 8,0
,0 9,0
- - A 1 A 1 37 C 42 C (alcalin) (alcalin) + acide: gaz: adnitol L(+) arabinose cellobiose l -6- dulcitol
méso-érythritol + -
D(-) fructose fucose D(+)galactose D(+)glucose glycérol inositol inuline lactose maltose D-mannitol D-mannose Melezitose melibiose raffinose L(+) rhamnose Salicine L-sorbose sorbitol
amidon -
saccharose tréhalose D-xylose teneur en GC de l'ADN 37,3 % (méthode Tm)
Compte tenu des propriétés taxonomiques précé-
dentes, la souche B-0783 étant Gram positive et étant un bacille formant spore, il se confirme que cette souche appartient au genre Bacillus si l'on se réfère au Manual of Determinative Bacteriology, Bergey 8 e
Ed ( 1974) En outre, diverses caractéristiques taxo-
nomiques ont été comparées conformément à une -7-
description de l'ouvrage précédent et à The Genus
Bacillus, dans Agricultural Handbook, p 427, et les caractéristiques identiques n'ont pas été trouvées, si bien que cette souche a été désignée sous le terme Bacillus sp B-0783 Cette souche a été déposée auprès
du Fermentation Research Institute, Agency of Technolo-
gical Science and Industry, M I T I, Japon sous
l'identification FERM-P No 5798.
L'ethanolamine oxydase peut être obtenue en
cultivant le Bacillus sp ci-dessus produisant de l'étha-
nolamine dans un milieu classique On peut utiliser un milieu solide ou liquide, mais on préfère toutefois une culture liquide avec aération pour la production industrielle. On peut choisir des milieux nutritifs classiques pour la production d'enzyme En ce qui concerne les sources de carbone, on peut utiliser des sources de carbone assimilables telles que le glucose, le sucrose, le lactose, le maltose, l'amidon, la dextrine, les molasses ou la glycérine On peut utiliser des sources d'azote assimilables telles que de la liqueur de blé macéree, de la poudre de soja, de la poudre de graines de coton, du glutène de blé, de la peptone, de l'extrait de viande, de l'extrait de levure ou un hydrolysat de caséine On peut utiliser facultativement divers sels tels que le chlorure de sodium, le chlorure de potassium,
le phosphate de potassium ou le sulfate de magnésium.
L'addition d'alcoylamine telle que l'éthanolamine ou la propionolamine au milieu a une concentration de O,1
à 1 % induit la production d'éthanolamine oxydase.
La température de culture peut être choisie dans les intervalles convenant à la croissance de microorganismes et à la production d'enzyme, et est de préférence de 26 à 33 C, et mieux de 30 C La durée de la culture peut être choisie en fonction des -8-
conditions et est habituellement de 15 à 25 heures.
La culture est effectuée à 200 à 400 tours par minute sous aération et doit naturellement être terminée lorsque la production d'éthanolamine oxydase est pratiquement complète. Des exemples d'extraction d'éthanolamine oxydase à partir de la masse-de culture sont les suivants: Etant donné que l'éthanolamine oxydase est une endo-enzyme, la masse cultivée est filtrée ou centrifugée et les cellules bactériennes sont brisées par des moyens mécaniques comme une presse à la française ou un traitement avec des billes de verre ou encore par des moyens enzymatiques tels
que la lysozyme.
En outre, on peut ajouter facultativement des agents tensio-actifs tels que Triton X-l O O (nom
commercial) ou Adekatol SO-120 (nom commercial).
L'éthanolamine oxydase brute ainsi obtenue est purifiée par des méthodes d'isolation et de purification classique pour les enzymes Par exemple, on utilise de préférence une précipitation par fraction avec de l'acétone de l'éthanol ou de l'isopropanol et un relargage avec du sulfate d'ammonium On peut effectuer une purification supplémentaire, par exemple, par chromatographie échangeuse d'ions en utilisant DEAE-Sephadex, DEAESephalose, DEAE-cellulose,
CM-cellulose, CM-Sephadex ou CM-Sephadex, ou une chro-
matographie de filtration surgel utilisant Sephadex G-200, Sepharose CL-6 B ou Sephacryl S-200, et une lyophilisation. Le procédé de dosage et les propriétés biochimiques de l'éthanolamine oxydase obtenue -9- à partir de Bacillus sp B-0783 sont les suivants: ( 1) Procédé de dosage: Tampon TrisH Cl 0,2 M (p H 8,0) 0,1 mi 4-aminoantipyrine 0,3 % 0,02 ml N,N-diéthyl-mtoluidine 3 m M 0,05 ml ( 45 U/ml) peroxydase 0,05 ml Ethanolamine 0,1 M 0,05 ml Eau: distillée 0,18 ml Total 0,45 ml On pré-incube le mélange cidessus ( 0,45 ml) à 37 C pendant 2 minutes, on ajoute une solution
d'enzyme ( 50 p 1) et on incube à 37 "C pendant 10 minutes.
La réaction est arrêtée par addition d'éthanol ( 2,5 ml)
et est mesurée par colorimétrie à 550 nm.
On définit ( 1 unité, 1 U) d'activité enzyma-
tique comme l'activité d'enzyme qui produit une
micromole de peroxyde d'hydrogène par minute.
La puissance de l'enzyme est calculée par l'équation suivante: Activité de l'enzyme (U/ml) = AA 550 X 0,25 X X 1 O 550 50 i* 5
o AA 550 est la valeur d'absorption a 550 nm.
( 2) Action de l'enzyme: L'oxydation d'une mole d'éthanolamine consomme une mole d'oxygène et une mole d'eau et libère une mole de glycolaldéhyde, une mode d'ammoniac et une mole
de peroxyde d'hydrogène.
H 2 N-CH 2 CH 2-OH + 02 + H 20 * OCH-CH 2-OH + NH 3 + H 202
éthanolamine glycolaldéhyde -10- ( 3) Spécificité du substrat:
Tableau 1.
Substrat Activité(% éthanolartine 100 1-amino-2-propanol 26,5 3-amino-2-propanol 357 3-amnino-1, 2-propanediol O diéthanolamine O triéthano lamine O
choline O-
( 4) p H optimal: p H 7 7,5 comme représenté à la figure 1; p H 6 7: tampon phosphate,
p H 7 9: tampon Tris-HC 1.
-11- ( 5) stabilité du p H: on ajoute une solution d'enzyme à des tampons ( 100 m M)
de différents p H, (p H 5 7,5: tampon diméthyl-
glutarate, p H 8 9,5: tampon Tris-H Cl, p H 9 10: tampon glycine-Na OH), on traite à 60 C pendant minutes et on détermine l'activité restante Le résultat est représenté à la figure 2 o le p H stable
est le p H 6 8.
( 6) Stabilité à la chaleur: On traite la solution d'enzyme ( 2,5 U/Ml) dans 10 m M de tampon Tris-H Cl (p H 8,0) pendant minutes à 40 75 C, et on détermine l'activité restante. Le résultat est présenté à la figure 3
o l'enzyme est stable jusqu'à 60 C.
( 7) Point isoélectrique: Environ p H 4,60 (déterminé par focalisation
isoélectrique en utilisant un support ampholite).
( 8) Effet de l'ion métallique et de 1 IEDTA: Ion métallique, EDTA activité ( 9 b) Témoin (pas d'addition) O / m M Ca C 12 3 S / m M Mg C 12 / / O / m M Ba C 12 5 g / m M Mn O 12 S 2 / m M E D T A /22 /O Om M KO l 7 / O O m M Na C /O O m M NH 01 C / /OO m M Li Ol 3 li -12- ( 9) Effet des agents tensio-actifs: Agents tensio-actifs activité (%) Témoin (pas d'addition) 100 Triton X= 100 0,1 % 98 Adekatol SO-145 0,1 % 90 Déoxycholate de sodium 0,1 % 83 Lauryl benzène sulfate de sodium
0,1 % 29
Lauryl sulfate de sodium 0,1 % 26 Une quantité d'éthanolamine oxydase utilisée dans un essai est supérieure à 0,1 U/il, de préférence supérieure à 0,5 U/ml, à 37 C pendant
1 minute, de préférence pendant plus de 5 minutes.
L'éthanolamine oxydase peut être utilisée simultanément ou successivement avec la phospholipase D. A la fin de la réaction, on mesure lbxygène
ou de l'ammoniac ou le peroxyde d'hydrogène libéré.
On utilise l'électrode correspondante, telle qu'une électrode à oxygène, une électrode à ammoniac, une électrode à ammonium ou une électrode au peroxyde d'hydrogène, pour la détection, ou bien on utilise une électrode à enzyme immobilisé d'éthanolamine oxydase ou d'éthanolamine oxydasephospholidase D Lors de l'essai avec l'électrode, on mesure quantitativement les variations du courant électrique correspondant à la quantité du composant à détecter, et on mesure ce courant électrique par interface par la méthode du point final, par une méthode d'essai cinétique ou par une méthode différentielle quadratique pour l'enregistrer
sur un enregistreur.
-13- L'examen clinique en combinaison avec la détermination du dérivé de choline et du dérivé
d'éthanolamine peut donner une détermination -
fractionnée du phospholipide des dérivés d'éthanol-
amine et du phospholipide des dérivés de choline. Les exemples et l'exemple de référence suivants illustrent l'invention sans pour autant la limiter.
EXEMPLE 1 -
Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 8,0) 0,5 ml 4-aminoantipyrine 0,3 % 0,3 ml Phénol 0,2 % 0,3 ml Peroxydase ( 45 U/ml, Sigma Cher) 0,1 ml Ethanolamine oxydase ( 6 U/ml, obtenue à partir de l'exemple de référence 1) Na N 3 0, 5 % 0,3 ml Triton X-100 5 % 0,2 ml Mg C 12 10 m M 0,3 ml Eau distillée 0, 9 ml TOTAL 3,O ml Une solution d'éthanolamine ( 5 25 1 l) est ajoutée au mélange réactionnel ci-dessus ( 3,0 ml), incubée à 37 C pendant 20 minutes et mesurée par
colorimétrie à 500 nm.
Le résultat est représenté à la figure 4 o l'on peut obtenir la courbe standard précise de l'éthanolamine. L'éthanolamine est remplacée par un mélange réactionnel de phosphatidyl éthanolamine traité par de la phospholipase D (contenant du Triton X-100 et du Mg Cl 2) à 37 C pendant 10 minutes pour déterminer la
phosphatidyl éthanolamine.
-14-
EXEMPLE 2 -
Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 8,0) 0,5 ml 4-aminoantiypyrine 0,3 % 0,3 ml Phénol 0,2 % 0,3 mi Peroxydase ( 45 U/ml) 0,1 ml Ethanolamine oxydase ( 6 U/ml) 0,1 ml Na N 3 0,5 % 0,3 ml Triton X-100 5 % 0,2 ml m M Mg C 12 0,3 ml Phospholipase D ( 20 U/ml; Toyo Jozo Co) 0,1 ml Eau distillée 0,8 ml TOTAL 3,0 ml On ajoute une émulsion de phospholipide 10 m M ( 5 25 il) au mélange réactionnel ci-dessus ( 3 ml), on incube à 37 C pendant 20 minutes et on mesure par
colorimétrie à 500 nm.
Le résultat est représenté à la figure-5 o o-o; phosphatidyl-amine et oo; lécithine sont utilisés comme phospholipide Sur la figure, l'enzyme
ne pouvait pas agir sur la lécithine et la phospha-
tidyl éthanolamine a pu être déterminée exactement.
EXEMPLE 3 -
Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 7,5) 0,2 ml Ethanolamine oxydase ( 6 U/ml) 0, 1 ml Eau distillée 0,7 ml TOTAL 1,0 ml On ajoute de l'éthanolamine 2 m M ( 5 - 25 il) au mélange réactionnel ci-dessus (lml), on incube à 37 C pendant 10 minutes et on mesure l'oxygène consommé au moyen d'une électrode à oxygène (produit de
Ishikawa Seisakusho).
-15- Le résultat est représenté sur la figure 6 o l'on peut observer la courbe standard linéaire exacte, et observer cette linéarité en dessous de
0,05 gmole d'éthanolamine.
On peut déterminer quantitativement la phosphatidyl éthanolamine par remplacement avec de la
phosphatidyl éthanolamine traitée par de la phospho-
lipase D (contenant du Triton X-100 et du Mg C 12).
EXEMPLE 4 -
Tampon Tris-H Cl 0,2 M 0,5 ml Ethanolamine oxydase ( 6 U/ml) 0,1 ml Mg C 12 10 m M 0,2 ml Triton X-100 5 % 0,1 ml Phospholipase D ( 20 U/ml) 0,1 ml Eau distillée 1,0 ml TOTAL 2,0 ml On ajoute de la phosphatidyl éthanolamine 2 m M ( 5 25 il) au mélange réactionnel ci-dessus ( 2,0 ml) et on incube à 37 C pendant 10 minutes On mesure la quantitéYde peroxyde d'hydrogène produit en utilisant une électrode au peroxyde d'hydrogène (YSI Co, oxidase meter) et 0,05 9 mole de phosphatidyl êthanolamine
ont été déterminés linéairement.
L'électrode au peroxyde d'hydrogène ci-dessus peut être remplacée par une électrode à oxygène dans
laquelle on peut mesurer la quantité d'oxygène consommée.
EXEMPLE 5 -
Tampon Tris-H Cl 0,2 M (p H 7,5) 0,2 ml Ethanolamine oxydase ( 6 U/ml) 0, 1 ml Triton X-100 5 % 0,1 ml Eau distillée 2,6 ml
TOTAL-
3,0 ml -16- On ajoute de l'éthanolamine 2,5 m M ( 10 50 1) au mélange réactionnel ci-dessus ( 3,0 ml), on incube à 37 C pendant 15 minutes, on ajoute ensuite Na OH 5 N( 50 b 11, et on mesure la quantité d'ammoniac libéré en utilisant une électrode à ammoniac (produite
par Ishikawa Works).
Le résultat est représenté à la figure 7 o
l'on peut déterminer linéairement 0,025 gmole d'éthanol-
amine. A la place de l'éthanolamine, on peut déterminer la phosphatidyl éthanolamine, traitée par de la phospholipase D (contenant du Triton X100 et du
Mg C 12).
EXEMPLE DE REFERENCE -
On stérilise à 120 C pendant 20 minutes un mélange aqueux ( 20 lit, p H 6,8) comprenant de la peptone 1,5 %, de l'extrait de levure en poudre 0,5 %, du K Cl 0,2 %, du Na Cl 0,1 %, du K 2 HPO 4 0,1 %, du Mg SO 4 0,1 %, du silicium KM-72 0,05 % et de l'éthanolamine 0,5 %, dans un récipient de fermentation de 20 lit Une culture de germes de Bacillus sp B-0783 FERM-P No 5798 cultivé dans un agitateur rotatif à secousses à 30 C pendant 20 heures dans le même milieu ( 500 ml) est inoculée au milieu précédent et cultivée à 30 C pendant 17 heures à 3 000 tours/minute et avec une aération de litres/minute Le bouillon de culture est centrifugé à 5 000 tours/minute pendant 20 minutes pour obtenir des cellules bactériennes Les cellules mises en suspension dans une solution ( 2 litres) de lysozyme (Eizai Co, 500 mg) dans un tampon phosphate 10 m M (p H 7,0) sont traitées à 37 C pendant deux heures pour obtenir la
solution d'enzymebrute ( 1 700 ml, 0,2 U/ml)-.
-17- On ajoute de l'acétone froide ( 850 ml) et on élimine le précipité par centrifugation ( 5000 tours/ minute, 10 minutes) On ajoute encore de ll'acétone froide ( 1200 ml) à la solution surnageante et on recueille le précipité à O C, à 5000 tours/minute pendant 10 minutes par centrifugation On dissout le précipité dans un tampon Tris-H Cl 0,1 m M (p H 8,0, 100 ml) contenant
du K Cl 0,5 M et dialysé par un tube de cellophane.
Le dialisat est lyophilisé pour obtenir une
poudre d'éthanolamine oxydase ( 0,1 U/mg, 3,2 g).
La poudre ( 1,0 g) dissoute dans un tampon Tris-H Cl 10 m M (p H 8,0, 15 ml) est chargée sur une colonne ( 2,5 x 21 cm) de DEAE-Sepharose CL-6 B (Pharmacia Co) equilibrée avec le même tampon et lavée avec le même tampon ( 500 ml) On effectue une élution par gradient avec 200 ml de tampon Tris-H Cl 10 m M (p H 8,0) et le même tampon contenant du K Cl 0,5 M. On fractionne chaque fraction de 10 ml et on recueille les fractions actives n 56 66 La fraction active combinée est dialisée contre un tampon Tris-H Cl 10 m M
(p H 8,0) et liophylisée pour obtenir une poudre -
d'éthanolamine oxydase ( 0,7 U/ml, 110 mg).
4 BREVE EXPLICATION DES DESSINS:
figure 1: p H optimal de l'éthanolamine
oxydase, -
figure 2: courbe de stabilité du p H de l'éthanolamine oxydase, figure 3: courbe de stabilité thermique de l'éthanolamine oxydase,
figure 4: courbe standard de l'éthanol-
amine, figure 5: courbe de détermination quantitative de la phosphatidyl éthanolamine par détermination de la quantité de peroxyde d'hydrogène, 18- figure 6: courbe de détermination quantitative de l'éthanolamine par détermination de la quantité d'oxygène consomme, figure 7: courbe de détermination quantitati- ve de l'éthanolamine par une
électrode à ammoniac.
-19-

Claims (4)

REVENDICATIONS
1 Procédé de dosage de l'éthanolamine dans-un échantillon, caractérisé en ce que l'on traite un échantillon contenant de l'éthanolamine avec de l'éthanolamine oxydase, enzyme qui catalyse une réaction consommant de l'éthanolamine, de l'oxygène et de l'eau pour former du glycolaldéhyde, de l'ammoniac et du peroxyde d'hydrogène, et en ce que l'on mesure une quantité d'oxygène consommée ou une quantité d'ammoniac ou de peroxyde d'ammoniac engendré dans un système de
réaction.
2 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'échantillon contenant de l'éthanolamine est un échantillon contenant de l'éthanol amine ou de
l'éthanolamine libérée d'un dérivé d'éthanolamine.
3 Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le dérivé d'éthanolamine est la phosphatidyl éthanolamine.
4 Procédé selon l'une des revendications 1 et 2,
caractérisé en ce que l'éthanolamine libérée du dérivé d'éthanolamine est de l'éthanolamine libérée de la phosphatidiyl éthanolamine par l'action de phospholipase D.
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