JPS604716B2 - 新規なコリンオキシダーゼおよびその製法 - Google Patents
新規なコリンオキシダーゼおよびその製法Info
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Description
本発明は、新規なコリンオキシダーゼおよびその製法に
関する。 従来、コリンを酸化してべタィンァルデヒドとする公知
の酵素としては、酵素番号１．１．９９．１コリン：（
アクセプター）オキシドレダクターゼ〔ｃｈｏｌｉｎｅ
：（ａｃｃｅｐ■ｒ）ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃねｓｅ〕、
常用名コリンデヒドロゲナーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅ岬ｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７
５頁（１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕が挙
られ、この酵素は次式で示す反応を触媒する。 〔式中、Ａはフラビンアデニンジ又クレオチド（ＦＡＤ
）、チトクロームＣなどの呼吸鎖成分、フエナジンメト
サルフエート、フエリサイアナイド、２６−ジクロフエ
ノールインドフエノール、メチレンプル−などの酸化還
元色素を示す。〕〔メソウズ・イン・エンチモロジー（
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｍＭｍｏｌｏ磯）Ｖ，５６２−
５７０（１９６２）アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。上記反応において、Ａが呼吸鎖
成分であるＦＡＤの場合には、コリンの酸化反応は次式
に示す通り進行すると推定されている。 即ちコリンによって還元されたＦＡＤ（ＦＡＤ比）は電
子をチトクローム系に伝達し、伝達された電子は最終的
に酸素に渡されて水を生成する（これはコリンオキシダ
ーゼ系とも呼ばれる）〔メソウズ・イン・エンチモロジ
−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＭＭｍｏｌｏの）１ ，
６７４‐６７８（１９５５）アカデミック・プレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。 以上の如く、公知の、コリンのべタィンアルデヒドへの
酵素的酸化反応は、種々の電子受容体を伴って進行する
ものであって、動物ではミトコンドリアの呼吸鎖、微生
物、例えばシュードモナス・エルギノーサ（ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｍｏｓｅ）Ａ−１６繭株では、
その細胞膜に結合している電子伝達系の成分が関与して
行なわれると報告されている〔アグリカルチユラル・ア
ンド・バイオロジ力ル・ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔひ ）３９，１５１３一 １５１４（１９７５）、
日本農芸化学会講演要旨集５１，１００（１９７６）日
本農芸化学会〕。 また、上記コリンデヒドロゲナーゼによってコリンから
生成したべタィンアルデヒドは、酵素番号１．２．１．
８ペタインアルデヒド：ＮＡＤオキシドレダクターゼ（
Ｂｅｂｉｎ ａｉｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＤｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ）常用名べタインアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（Ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄ
ｒｏ史ｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７６（
１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕によって、
次式に示す通りの反応によりべタインまで酸化される。 （なお、ＮＡＤはニコチナミドアデニンジヌクレオチド
、ＮＡＤＰはニコチナミドアデニンジヌクレオチドホス
フエートおよびＮＡＤＨ２、ＮＡＤＰＨ２Ｚは各々の還
元体を略称したものである。）〔酵素研究法第２巻第４
２５−４２６（１９５６）朝倉書店、メソウズ・イン・
エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍＥ此れｍｏｌｏ雛
）１，６７４一６７８（１９６２）アカデミック・プレ
ス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）。日本農芸化学２会
議演要旨集５１，１００（１９７６）日本農芸化学会〕
このべタインアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シュード
モナス・ェルギノーサＡ−１６菌株より単離、精製され
、その分子量は約１４５０００（ゲル炉過法）、等露点
は５．１、至適ｐＨは８．０〜９．０、安定ｐＨは２７
．針寸近であることが確認されている。本発明者らは、
鹿児島県川辺郡川辺町高田のさつまいも畑より分離した
アースロバクター（Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属す
る細菌Ｂ−０５７７菌株が、その菌体内に、コリンのべ
タィンの酸化反応３を触媒する酵素を生産することを見
し、出し、該酵素を単一にまで精製した。 この酵素は、等電点４６（キャＩＪア・アンホラィトを
用いる竜気泳動法）、分子量約８４０００±２１００（
セフアデックスＧ−１５０ゲル炉過法）の物理的性３状
を有し、コリンおよびべタィンアルデヒドーこ基質特異
性を示し、その酵素反応において補酵素の添加を必要と
せず、基質を直接酸素と反応せしめ、１モルのコリンを
べタインアルデヒドを経由してべタィンまで酸化して２
モルの過酸化水素を；生成せしめ、また１モルのべタィ
ンアルデヒドをべタインまで酸化して１モルの過酸化水
素を生成せしめる反応を触媒するものであるて、新規な
コリンオキシダーゼであることを見し、出した。 上記の細菌Ｂ−０５７斤菌株の肉眼的および顕微鏡的観
察に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記載す
る通りである。Ａ．肉眼的観察 ２６００、１８〜４幼時間培養の結果、次の通りである
。 ■ 肉汁寒天板培養 発育は良好、円形で周囲はなめらかであ り、光沢を有するコンペックス（Ｃｏｎｖｅｘ）状とな
る。 集落の色は灰白色（ｈｕｅｌｌ′２ｃａ）から淡黄色（
ｈｕｅｌｌ′ねａ）に変化する。拡散性色素は産生しな
い。■ 肉汁寒天斜面培養 発育は良好で、線状に生育し光沢を有す る。 集落の色は灰白色（ｈｕｅ１ｌ／２ｃａ）から淡黄色（
ｈ雌１１／滋ａ）に変化する。拡散性色素は産生しない
。■ 肉汁液体培養 表面発育において、菌膜を形成しないか、もしくは形成
しても非常にうすし、。 その培養液は一様に混濁後沈澱を生じるが透明にはなら
ない。■ 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみ発育し、その発育は良好である。 ゼラチンを液化しない。 ■リトマス・ミルク 発育は弱く、２週間位でべプトン化する。 軟かし、凝固またはアルカリ化する場合もある。 リトマスは還元しない。（注）色の表示記載は１９５群
王コンティナ−・コーポレーション・オブ・アメリカ（
Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ○ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆ Ａ
ｍｅｎｉｃａ）発行「カラー．ハーモニ・マニュアル（
ＣｏｌｏｒＨａｒｍｏｎｙＭａｎｕａｌ）」の表示法に
従った。 Ｂ．顕微鏡的観察■ 細胞の形、大きさ 肉汁寒天平板培養による、若い細胞（６時間）は樟状で
、大きさは０．５〜０．８×１．５〜２．０仏で、古い
細胞（１錨時間）は球状（０．５〜０．８仏）も存在す
る。 ■ 多形性 肉汁液体培養において、Ｔ字型、Ｙ字型のＺ細胞を観察
することがある。 ■ 運動性 なし（軟寒夫培地にて観察）。 ■ 胞子 なし。 Ｊ■ グラム染色 若い細胞は陽・性、古い細胞は陰性である。 ■ 抗酸性染色陰性 Ｃ．次に性理学的性質を記載する。 ２硝酸塩の還元
陰性脱窒反応 陰性
ＭＲテスト 陰性ＶＰテス
ト 陰性インドールの生成
陰性２硫化水素の生成
弱陽性スターチの加水分解
翁陽・性クエン酸の利用コーザー（Ｋｏｓｅｒ）培地
陰性クリステンゼン（Ｃｈｒｉｓにｎｓ
ｅｎ）塔地 陽・性３硝酸塩の利用
陰性アンモニウム塩の利用 陰
性色素の生成 陰性ウレアー
ゼ 陽性オキシダーゼ
弱陽性３カタラーゼ
陽性生育ｐＨ範囲
４．０〜１１．０生育温度範囲
５〜３７０酸素に対する態度 好
気性セルロースの加水分解 陰性カゼ
インの加水分解 陰性○−Ｆテスト
（注１） ○（酸化的分解）糖より酸の産生（ガス
は産生しない）（注２）１週間以内グルコ−ス、イノシ
トール ２週間以内 セロビオース、エリスリトール、フラクト−ス、マルト
−ス、マンニトール、マンノース、ソルビトール、シユ
クロース、トレハロース、スターチ、 酸を作らないもの Ｌーアラビノース、ヅルシトール、エスクリン、ガラク
トース、グリセリン、ラクトース、メレジトース、メリ
ビオース、サリシン、ソルボース、キシロース、 注１：○−Ｆテスト用渚地 本細菌Ｂ−０５７万寅株は、ベプトンを含む培地では酸
を産生しないため、変法培地（組成：Ｎ日日２Ｐ０４１
夕、イーストエキス粉末１夕、ＫＣＩＯ．２９、ＭｇＳ
０４・７日２００．２夕、グルコ−ス１０夕、細菌用寒
天末２夕、蒸留水１そ、ｐＨ７．２）を用いた。 洋２： 基礎培地（組成：ＮＨ４ＱＰ０４１夕、イーストエキス
粉末１夕、Ｋ ＣＩＯ．２夕、ＭｇＳ０４・７日２００
．２夕、細菌用寒天末２夕、蒸留水１そ、ｐＨ７．２）
を用いた。 以上の諸性質、特にグラム陽性菌、非抗酸性、非運動性
の梶菌または球菌で、分枝することがあるが、線維状に
はならず、糖を酸化的に分解し、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ弱陽性でセルロ−スを分解しない性質を示す本
細菌Ｂ−０５７７菌株は、パージース・マニュアル・オ
ブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇ
ｅｙ’ ｓｍａｎｕａｌｏｆＤｅにｒｍｉｎａｔｉｖｅ
ＢａＣｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１９７４によればコリネホ
ーム・グル−プ・バクテリア（Ｃｏひｎｅｆｏｒｍｇｒ
ｏｕｐＢａｃｔｅｒｉａ）のアースロバクター属に属す
るものと認められた。 なお、アースロバクタ−属と他のコリネホ−ム・グルー
プ・バクテリアとを比較すれば、明らかに次の点で大別
される。 コリネバクテリウム：糖を発酵的に分解する（Ｃｏひｎ
ｅｂａｃにｒｉｍｍ）ロチゥ：線総状となり、糖を発酵
的に分解する（Ｒｏ仇ｉａ）クルチア：糖より酸を産生
しない （Ｋｕｎｈｉａ） セルロモナス：セルロース分解能を有する（Ｃｅｌｌ山
ｏｍｏＭＳ） ブレビバクテリウム：糖を発酵的に分解する（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃにｒ仙ｍ）ミクロバクテリウム：糖を発酵的に
分解する（Ｍｉｃｒｏ舷ｃｔｅｒｉｍｍ）プロピオニバ
クテリウム：嫌気的細菌 （ｐｒｏｐｉｏｎｉ舷ｃｔｅｒｉｕｍ） フバクテリゥム：嫌気的細菌 （Ｆゆａｃにｒｉｍｍ） アースロバクタ−：糖を酸化的に分解する（Ａｒ仇ｒｏ
ｂａｃｔｅｒ） 以上の通り、本細菌Ｂ−０５７斤菌株はアースロ、バク
ター属に属する菌と認められ、またパージース・マニュ
アル・オプ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー１
９７４によれば、アースロバクター属は７種に分けられ
ることが報告されており、これらの種についてその標準
菌株を餅行試験および文献記載の事項の基き、次の通り
の結果を得た。 なお、培養温度は２６ｏｏであり、使用菌株およびその
略号は次の通りである。ア−スロ／ゞクター・シンプレ
ツクス （Ａｒｍｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）ＩＦＯ１２
０６９（以下Ｓと略す）アースロバクタ−・グロビフオ
ーミス （Ａｒ仇ｒｏｂａｃｔｅｒｇｏｂｉｆｏｎｈｉｓ）ＩＦ
Ｏ１２１３７（以下Ｇと略す）アースロバクター・シテ
レウス（Ａ比ｈｒｏ舷ｃｔｅｒＣｉｔｒｅ雌）ＩＦＯ１
２９５７（以下Ｃと略す）アースロノゞクター・ツメツ
センス（Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｔｍｍｅｓｃｅ船）Ｉ
ＦＯ１２９６０（以下Ｔｕと略す）アースロバクター・
ターレゲンス （Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｍｅ繋ｎｓ）ＩＦＯ１２
９６１（以下Ｔｅと略す）アースロバクター・ヅユオデ
カデイス （Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｄ肌ｄｅｃａｄｊｓ）ＩＦＯ
１２９５９（以下Ｄと略す）アースロノゞクター・フラ
ベツセンス （Ａｒ仇ｒｏｂａｃｔｅｒｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）（以
下Ｆと略す）なお、ＤおよびＦの菌については、パージ
ース・マニュアル・オブ・デイタミネイテイプ・バクテ
リオロジー１９７４に記載の事項のみによるものである
。 十：反応陽性、糖より酸の産生の糠反応の場合は１週間
以内で陽一性のものを示す。 （十）：反応弱陽性、糖反応の場合は１〜２週間で陽性
のものを示す。 −：反応陰性。 Ｓ−Ｒ：樟状、球状、Ｔ字型、Ｙ字型のものが観察され
たもの。 ＮＴ：ノンテスト（ｎｏｎｔｅｓｔ） またＤ菌株は、普通寒天培地では生育せず。 以上の比較実験の結果において、本細菌Ｂ−０５７斤菌
株は、集落の色、スターチ分解能、一部の糖よりの酸の
産生能を除いてアースロバクター・グロビフオ−ミスＩ
ＦＯ１２１３７に一致している。またアースロバクター
・グロビフオーミスは普通寒天培地などでは特有の色素
は産生しない菌株が多いが、非水潟性のレモン様の黄色
の色素を産生する菌株もある点、さらに本細菌Ｂ−０５
７斤菌株およびアースロバクタ−・グロビフオーミスＩ
ＦＯ１２１３７の両菌株ともスターチより酸を産生する
スターチ分解能の点、さらにまたアースロバクタ−・グ
ロビフオーミスＩＦＯ１２１３７は、本菌株Ｂ−０５７
斤菌株が酸を産生する糖のうち、ェリスリトールを除く
全部の糖から酸を産生する酸産生能の点より、本細菌Ｂ
−０５７７菌株をアースロバクター・グロビフオーミス
に属するものと同定し、アースロ／ゞクタ−・グロビフ
オーミスＢ−０５７７（Ａｒｔｈｒｏ舷ｃｔｅｒｇｏｂ
ｉｆｏｒｍｌｓ Ｂ−０５７７）と命名した。また本菌
は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号「
ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．３５１８」として＊＊寄託されてい
る。またこの新規な酵素コリンオキシダーゼはコリンお
よびべタィンアルデヒドをその基質とする酵素であるた
め、種々の確認試験などの定量手段などを用いることに
より、コリンまたはべタインアルデヒドを含有する液体
にコリンオキシダーゼを作用せしめ、次いで生成する過
酸化水量の定量、生成するべタィンの定量、消費された
酸素の定量を行なうことによりコリンまたはべタインア
ルデヒドを含有してなる液体の分析を可能ならしめるも
のであることを見し、出した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の基質特異性、至適ｐＨ、等露点、分子量、酵
素作用の理化学的性質を有してなる新規なコリンオキシ
ダーゼ基質特異性：一般式 無言テＮ＋−ＣＨ２−ＲＩ ＣＨ３ （式中、Ｒ，は−ＣＱＯＨ基または一ＣＨＯ基を示す。 ）で表わされる化合物至薄ｐＨ：８（トリスー塩酸緩衝
液） 等亀点：４．６（キャリア・アンホラィトを用いる電気
氷勤法）分子量：８４０００±２１００〔セフアデツク
スＧ−１５０（商品名）ゲル炉過法〕酵素作用：反応式
〔１〕および／または
関する。 従来、コリンを酸化してべタィンァルデヒドとする公知
の酵素としては、酵素番号１．１．９９．１コリン：（
アクセプター）オキシドレダクターゼ〔ｃｈｏｌｉｎｅ
：（ａｃｃｅｐ■ｒ）ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃねｓｅ〕、
常用名コリンデヒドロゲナーゼ（ｃｈｏｌｉｎｅｄｅｈ
ｙｄｒｏｇｅ岬ｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７
５頁（１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕が挙
られ、この酵素は次式で示す反応を触媒する。 〔式中、Ａはフラビンアデニンジ又クレオチド（ＦＡＤ
）、チトクロームＣなどの呼吸鎖成分、フエナジンメト
サルフエート、フエリサイアナイド、２６−ジクロフエ
ノールインドフエノール、メチレンプル−などの酸化還
元色素を示す。〕〔メソウズ・イン・エンチモロジー（
ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｍＭｍｏｌｏ磯）Ｖ，５６２−
５７０（１９６２）アカデミツク・プレス（Ａｃａｄｅ
ｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。上記反応において、Ａが呼吸鎖
成分であるＦＡＤの場合には、コリンの酸化反応は次式
に示す通り進行すると推定されている。 即ちコリンによって還元されたＦＡＤ（ＦＡＤ比）は電
子をチトクローム系に伝達し、伝達された電子は最終的
に酸素に渡されて水を生成する（これはコリンオキシダ
ーゼ系とも呼ばれる）〔メソウズ・イン・エンチモロジ
−（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ＥＭＭｍｏｌｏの）１ ，
６７４‐６７８（１９５５）アカデミック・プレス（Ａ
ｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。 以上の如く、公知の、コリンのべタィンアルデヒドへの
酵素的酸化反応は、種々の電子受容体を伴って進行する
ものであって、動物ではミトコンドリアの呼吸鎖、微生
物、例えばシュードモナス・エルギノーサ（ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｍｏｓｅ）Ａ−１６繭株では、
その細胞膜に結合している電子伝達系の成分が関与して
行なわれると報告されている〔アグリカルチユラル・ア
ンド・バイオロジ力ル・ケミストリ−（Ａｇｒｉｃｕｌ
ｔｕｒａｌ ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔひ ）３９，１５１３一 １５１４（１９７５）、
日本農芸化学会講演要旨集５１，１００（１９７６）日
本農芸化学会〕。 また、上記コリンデヒドロゲナーゼによってコリンから
生成したべタィンアルデヒドは、酵素番号１．２．１．
８ペタインアルデヒド：ＮＡＤオキシドレダクターゼ（
Ｂｅｂｉｎ ａｉｄｅｈｙｄｅ：ＮＡＤｏｘｉｄｏｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ）常用名べタインアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（Ｂｅｔａｉｎｅａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄ
ｒｏ史ｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７６（
１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕によって、
次式に示す通りの反応によりべタインまで酸化される。 （なお、ＮＡＤはニコチナミドアデニンジヌクレオチド
、ＮＡＤＰはニコチナミドアデニンジヌクレオチドホス
フエートおよびＮＡＤＨ２、ＮＡＤＰＨ２Ｚは各々の還
元体を略称したものである。）〔酵素研究法第２巻第４
２５−４２６（１９５６）朝倉書店、メソウズ・イン・
エンチモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｍＥ此れｍｏｌｏ雛
）１，６７４一６７８（１９６２）アカデミック・プレ
ス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）。日本農芸化学２会
議演要旨集５１，１００（１９７６）日本農芸化学会〕
このべタインアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シュード
モナス・ェルギノーサＡ−１６菌株より単離、精製され
、その分子量は約１４５０００（ゲル炉過法）、等露点
は５．１、至適ｐＨは８．０〜９．０、安定ｐＨは２７
．針寸近であることが確認されている。本発明者らは、
鹿児島県川辺郡川辺町高田のさつまいも畑より分離した
アースロバクター（Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属す
る細菌Ｂ−０５７７菌株が、その菌体内に、コリンのべ
タィンの酸化反応３を触媒する酵素を生産することを見
し、出し、該酵素を単一にまで精製した。 この酵素は、等電点４６（キャＩＪア・アンホラィトを
用いる竜気泳動法）、分子量約８４０００±２１００（
セフアデックスＧ−１５０ゲル炉過法）の物理的性３状
を有し、コリンおよびべタィンアルデヒドーこ基質特異
性を示し、その酵素反応において補酵素の添加を必要と
せず、基質を直接酸素と反応せしめ、１モルのコリンを
べタインアルデヒドを経由してべタィンまで酸化して２
モルの過酸化水素を；生成せしめ、また１モルのべタィ
ンアルデヒドをべタインまで酸化して１モルの過酸化水
素を生成せしめる反応を触媒するものであるて、新規な
コリンオキシダーゼであることを見し、出した。 上記の細菌Ｂ−０５７斤菌株の肉眼的および顕微鏡的観
察に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記載す
る通りである。Ａ．肉眼的観察 ２６００、１８〜４幼時間培養の結果、次の通りである
。 ■ 肉汁寒天板培養 発育は良好、円形で周囲はなめらかであ り、光沢を有するコンペックス（Ｃｏｎｖｅｘ）状とな
る。 集落の色は灰白色（ｈｕｅｌｌ′２ｃａ）から淡黄色（
ｈｕｅｌｌ′ねａ）に変化する。拡散性色素は産生しな
い。■ 肉汁寒天斜面培養 発育は良好で、線状に生育し光沢を有す る。 集落の色は灰白色（ｈｕｅ１ｌ／２ｃａ）から淡黄色（
ｈ雌１１／滋ａ）に変化する。拡散性色素は産生しない
。■ 肉汁液体培養 表面発育において、菌膜を形成しないか、もしくは形成
しても非常にうすし、。 その培養液は一様に混濁後沈澱を生じるが透明にはなら
ない。■ 肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみ発育し、その発育は良好である。 ゼラチンを液化しない。 ■リトマス・ミルク 発育は弱く、２週間位でべプトン化する。 軟かし、凝固またはアルカリ化する場合もある。 リトマスは還元しない。（注）色の表示記載は１９５群
王コンティナ−・コーポレーション・オブ・アメリカ（
Ｃｏｎｔａｉｎｅｒ ○ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆ Ａ
ｍｅｎｉｃａ）発行「カラー．ハーモニ・マニュアル（
ＣｏｌｏｒＨａｒｍｏｎｙＭａｎｕａｌ）」の表示法に
従った。 Ｂ．顕微鏡的観察■ 細胞の形、大きさ 肉汁寒天平板培養による、若い細胞（６時間）は樟状で
、大きさは０．５〜０．８×１．５〜２．０仏で、古い
細胞（１錨時間）は球状（０．５〜０．８仏）も存在す
る。 ■ 多形性 肉汁液体培養において、Ｔ字型、Ｙ字型のＺ細胞を観察
することがある。 ■ 運動性 なし（軟寒夫培地にて観察）。 ■ 胞子 なし。 Ｊ■ グラム染色 若い細胞は陽・性、古い細胞は陰性である。 ■ 抗酸性染色陰性 Ｃ．次に性理学的性質を記載する。 ２硝酸塩の還元
陰性脱窒反応 陰性
ＭＲテスト 陰性ＶＰテス
ト 陰性インドールの生成
陰性２硫化水素の生成
弱陽性スターチの加水分解
翁陽・性クエン酸の利用コーザー（Ｋｏｓｅｒ）培地
陰性クリステンゼン（Ｃｈｒｉｓにｎｓ
ｅｎ）塔地 陽・性３硝酸塩の利用
陰性アンモニウム塩の利用 陰
性色素の生成 陰性ウレアー
ゼ 陽性オキシダーゼ
弱陽性３カタラーゼ
陽性生育ｐＨ範囲
４．０〜１１．０生育温度範囲
５〜３７０酸素に対する態度 好
気性セルロースの加水分解 陰性カゼ
インの加水分解 陰性○−Ｆテスト
（注１） ○（酸化的分解）糖より酸の産生（ガス
は産生しない）（注２）１週間以内グルコ−ス、イノシ
トール ２週間以内 セロビオース、エリスリトール、フラクト−ス、マルト
−ス、マンニトール、マンノース、ソルビトール、シユ
クロース、トレハロース、スターチ、 酸を作らないもの Ｌーアラビノース、ヅルシトール、エスクリン、ガラク
トース、グリセリン、ラクトース、メレジトース、メリ
ビオース、サリシン、ソルボース、キシロース、 注１：○−Ｆテスト用渚地 本細菌Ｂ−０５７万寅株は、ベプトンを含む培地では酸
を産生しないため、変法培地（組成：Ｎ日日２Ｐ０４１
夕、イーストエキス粉末１夕、ＫＣＩＯ．２９、ＭｇＳ
０４・７日２００．２夕、グルコ−ス１０夕、細菌用寒
天末２夕、蒸留水１そ、ｐＨ７．２）を用いた。 洋２： 基礎培地（組成：ＮＨ４ＱＰ０４１夕、イーストエキス
粉末１夕、Ｋ ＣＩＯ．２夕、ＭｇＳ０４・７日２００
．２夕、細菌用寒天末２夕、蒸留水１そ、ｐＨ７．２）
を用いた。 以上の諸性質、特にグラム陽性菌、非抗酸性、非運動性
の梶菌または球菌で、分枝することがあるが、線維状に
はならず、糖を酸化的に分解し、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ弱陽性でセルロ−スを分解しない性質を示す本
細菌Ｂ−０５７７菌株は、パージース・マニュアル・オ
ブ・デイタミネイティブ・バクテリオロジー（Ｂａｒｇ
ｅｙ’ ｓｍａｎｕａｌｏｆＤｅにｒｍｉｎａｔｉｖｅ
ＢａＣｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１９７４によればコリネホ
ーム・グル−プ・バクテリア（Ｃｏひｎｅｆｏｒｍｇｒ
ｏｕｐＢａｃｔｅｒｉａ）のアースロバクター属に属す
るものと認められた。 なお、アースロバクタ−属と他のコリネホ−ム・グルー
プ・バクテリアとを比較すれば、明らかに次の点で大別
される。 コリネバクテリウム：糖を発酵的に分解する（Ｃｏひｎ
ｅｂａｃにｒｉｍｍ）ロチゥ：線総状となり、糖を発酵
的に分解する（Ｒｏ仇ｉａ）クルチア：糖より酸を産生
しない （Ｋｕｎｈｉａ） セルロモナス：セルロース分解能を有する（Ｃｅｌｌ山
ｏｍｏＭＳ） ブレビバクテリウム：糖を発酵的に分解する（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃにｒ仙ｍ）ミクロバクテリウム：糖を発酵的に
分解する（Ｍｉｃｒｏ舷ｃｔｅｒｉｍｍ）プロピオニバ
クテリウム：嫌気的細菌 （ｐｒｏｐｉｏｎｉ舷ｃｔｅｒｉｕｍ） フバクテリゥム：嫌気的細菌 （Ｆゆａｃにｒｉｍｍ） アースロバクタ−：糖を酸化的に分解する（Ａｒ仇ｒｏ
ｂａｃｔｅｒ） 以上の通り、本細菌Ｂ−０５７斤菌株はアースロ、バク
ター属に属する菌と認められ、またパージース・マニュ
アル・オプ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー１
９７４によれば、アースロバクター属は７種に分けられ
ることが報告されており、これらの種についてその標準
菌株を餅行試験および文献記載の事項の基き、次の通り
の結果を得た。 なお、培養温度は２６ｏｏであり、使用菌株およびその
略号は次の通りである。ア−スロ／ゞクター・シンプレ
ツクス （Ａｒｍｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐｌｅｘ）ＩＦＯ１２
０６９（以下Ｓと略す）アースロバクタ−・グロビフオ
ーミス （Ａｒ仇ｒｏｂａｃｔｅｒｇｏｂｉｆｏｎｈｉｓ）ＩＦ
Ｏ１２１３７（以下Ｇと略す）アースロバクター・シテ
レウス（Ａ比ｈｒｏ舷ｃｔｅｒＣｉｔｒｅ雌）ＩＦＯ１
２９５７（以下Ｃと略す）アースロノゞクター・ツメツ
センス（Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｔｍｍｅｓｃｅ船）Ｉ
ＦＯ１２９６０（以下Ｔｕと略す）アースロバクター・
ターレゲンス （Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｔｅｍｅ繋ｎｓ）ＩＦＯ１２
９６１（以下Ｔｅと略す）アースロバクター・ヅユオデ
カデイス （Ａｒ比ｒｏｂａｃｔｅｒｄ肌ｄｅｃａｄｊｓ）ＩＦＯ
１２９５９（以下Ｄと略す）アースロノゞクター・フラ
ベツセンス （Ａｒ仇ｒｏｂａｃｔｅｒｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）（以
下Ｆと略す）なお、ＤおよびＦの菌については、パージ
ース・マニュアル・オブ・デイタミネイテイプ・バクテ
リオロジー１９７４に記載の事項のみによるものである
。 十：反応陽性、糖より酸の産生の糠反応の場合は１週間
以内で陽一性のものを示す。 （十）：反応弱陽性、糖反応の場合は１〜２週間で陽性
のものを示す。 −：反応陰性。 Ｓ−Ｒ：樟状、球状、Ｔ字型、Ｙ字型のものが観察され
たもの。 ＮＴ：ノンテスト（ｎｏｎｔｅｓｔ） またＤ菌株は、普通寒天培地では生育せず。 以上の比較実験の結果において、本細菌Ｂ−０５７斤菌
株は、集落の色、スターチ分解能、一部の糖よりの酸の
産生能を除いてアースロバクター・グロビフオ−ミスＩ
ＦＯ１２１３７に一致している。またアースロバクター
・グロビフオーミスは普通寒天培地などでは特有の色素
は産生しない菌株が多いが、非水潟性のレモン様の黄色
の色素を産生する菌株もある点、さらに本細菌Ｂ−０５
７斤菌株およびアースロバクタ−・グロビフオーミスＩ
ＦＯ１２１３７の両菌株ともスターチより酸を産生する
スターチ分解能の点、さらにまたアースロバクタ−・グ
ロビフオーミスＩＦＯ１２１３７は、本菌株Ｂ−０５７
斤菌株が酸を産生する糖のうち、ェリスリトールを除く
全部の糖から酸を産生する酸産生能の点より、本細菌Ｂ
−０５７７菌株をアースロバクター・グロビフオーミス
に属するものと同定し、アースロ／ゞクタ−・グロビフ
オーミスＢ−０５７７（Ａｒｔｈｒｏ舷ｃｔｅｒｇｏｂ
ｉｆｏｒｍｌｓ Ｂ−０５７７）と命名した。また本菌
は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号「
ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．３５１８」として＊＊寄託されてい
る。またこの新規な酵素コリンオキシダーゼはコリンお
よびべタィンアルデヒドをその基質とする酵素であるた
め、種々の確認試験などの定量手段などを用いることに
より、コリンまたはべタインアルデヒドを含有する液体
にコリンオキシダーゼを作用せしめ、次いで生成する過
酸化水量の定量、生成するべタィンの定量、消費された
酸素の定量を行なうことによりコリンまたはべタインア
ルデヒドを含有してなる液体の分析を可能ならしめるも
のであることを見し、出した。 本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、少なく
とも下記の基質特異性、至適ｐＨ、等露点、分子量、酵
素作用の理化学的性質を有してなる新規なコリンオキシ
ダーゼ基質特異性：一般式 無言テＮ＋−ＣＨ２−ＲＩ ＣＨ３ （式中、Ｒ，は−ＣＱＯＨ基または一ＣＨＯ基を示す。 ）で表わされる化合物至薄ｐＨ：８（トリスー塩酸緩衝
液） 等亀点：４．６（キャリア・アンホラィトを用いる電気
氷勤法）分子量：８４０００±２１００〔セフアデツク
スＧ−１５０（商品名）ゲル炉過法〕酵素作用：反応式
〔１〕および／または
〔０〕およびアースロバクター属
に属するコリンオキシダーゼ生産菌を培地に培養し、そ
の培養物からコ４リンオキシダーゼを採取することを特
徴とする新規なコリンオキシダーゼの製法である。 本発明における新規なコリンオキシダーゼとしては、上
記の性状、作用を有するものであればよ〈、その元素分
析値、添加物による阻害、活性化など多少の相異を示す
ものであっても上記の性状、作用を有するものは本発明
のそれに包含されるものであり、この新規なコリンオキ
シダーゼを得るために使用菌としては上記の菌はその一
例である。 また本発明の製法における使用菌としては、上記の菌は
その一例であって、アースロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産能力を有するものであればすべて本発
明において使用できる。 もちろん微生物は、自然的、人工的に変異を起こしやす
く、本菌も例外ではないが、これらの変異株であっても
コリンオキシダーゼの生産能力を失わない限り本発明に
使用し得ることはいうまでもないことである。本発明を
実施するに当って、アースロバクターＺ属に属するコリ
ンオキシダーゼ生産菌による製法について例示すれば、
次の如くである。 即ちアースロバクター属に属するコリンオキシダーゼ生
産菌を、抗生物質、酵素などを生産する通常の方法で培
養する。培養の形態は液体培養でも固体培養Ｚでもよい
が、工業的にはコリンオキシダーゼ生産菌の細胞をその
生産用培地に接種し、深部通気蝿梓培養を行なうのが有
利である。培養の栄養源としては、微生物の培養に通常
用いられるものが広く使用される。 窒素源としては２利用可能な窒素化合物であればよく、
例えばコーン・スチーブ・リカー、大豆粉、ベプトン、
種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化アンモニウム
などが使用される。炭素源としては、同化可能な炭素化
合物であればよく、例えば糠蜜、ブドウ２糖、スターチ
加水分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸
第二カリウムなどの種々の無機塩やデイスホームＢＣ一
５１Ｙ、同ＣＡ−２２０、同ＣＡ−３３０（商品名：日
産油脂社製）など３の消泡剤が必要に応じて使用される
。また、培地中にコリンを添加せしめることによって、
培養時にコリンオキシダーゼの生産能を上昇せしめるこ
とが好ましい。このコリンの添加量としては約０．５〜
１％程度であり、この添加によ・リコリンオ３キシダー
ゼの生産曲ま少なくとも１ぴ音以上上昇する。培養温度
は菌が発育し、コリンオキシダーゼを生産する範囲内で
適宜変更し得るが、特に好ましくは２５〜３０つ○であ
る。 培養時間は条件によって異なるが、通常１５〜５餌時間
程度であって、コリンオキシダーゼが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよい
。かくして得られた培養物中において、コリンオキシダ
ーゼはその菌体内に含有、蓄積されている。 この様にして得られた培養物中よりコリンオキシダーゼ
を抽出し、粗製のコリンオキシダーゼ含有液を得るため
に、例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿
菌体を、必要に応じてトＩＪスー塩酸緩衝液などの溶液
に懸濁せしめ、次いで、リゾチーム処理、超音波処理、
フレンチプレス処理などの種々の菌体処理手段を適宜選
択組合せればよい。 特に、リゾチーム処理により、その収率およびその比活
‘性は良好となる。次いでこの粗製のコリンオキシダー
ゼ含有液を、さらに公知の、蛋白質、酵素などの単離、
精製手段を用いて処理することにより精製されたコリン
オキシダーゼを得ることができる。 例えば、粗製のコリンオキシダーゼ含有液に、アセトン
、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩折法などを
用いて水溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さらに
この沈澱物を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示
すまで精製すればよく、その精製手段としては目的とす
るコリンオキシダーゼの性質を利用した手段を用いれば
よく、例えば上記の沈澱物をトリス−塩酸緩衝液などの
媒体に溶解し、これをジェチルアミノェチルーセルロー
ス、ーデキストランゲル架橋体などの陰イオン交換体、
デキストランゲル、ボリアクリルアマィドゲルなどのゲ
ル炉過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて、精製すればよく、次いで
これを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してコリンオキ
シダーゼの精製粉末を得る。本発明によって得られるコ
リンオキシダーゼは次下に述べる理化学的性質を有する
ものである。 ‘１）作用コリンを酸化してべタィンアルデヒドとなし
、ベタィンアルデヒドを酸化してべタィンとする。 コリンの場合には、１モルのコリンより１モルのべタィ
ンアルデヒドおよび１モルの過酸化水素を生成し、さら
にこのべタィンアルデヒドより１モルのべタィンおよび
１モルの過酸化水素を生成する。 即ち、１モルのコリンより１モルのべタィンおよび２モ
ルの過酸化水素を生成する。またべタインアルデヒドの
場合には、１モル＊のべタインアルデヒドより１モルの
べタインおよび１モルの過酸化水素を生成する。 （２｝ 力価の測定法 Ｚ
Ｏ．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０５肌
、３の９／叫の４ーアミノアンチピリン０．０５のＺ、
０．１％フェノール０．１０の上、沙．／ｍｇ／ぐーオ
キシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）０．１０、０．１
Ｍ塩化コリン０．１０の【および蒸留水０．１０の【よ
りなる反応液０．５０の【２に、酵素溶液５仏夕加え、
３７℃にて５分間反応ごてた後これに２．５私のエタノ
ールを加えて反応を止める。 比色は４８仇ｍで行い、酵素活性は、１分間に１仏ｍｏ
ｌｅの過酸化水素を生成する活性を１単位（１皿ｉｔ，
ｌｕ．）とする。また力２価の算出は次式に従う。酵素
活性（Ｕ．／私）＝△Ａ４８ｏ／ｍｉｎ×１４（なお、
△へ８ｏは４８仇ｍの波長における１分間の吸光度変化
を示す）｛３’ 基質特異性
３上言己の力価の測定法における測定法を利用し
て、その反応液中の塩化コリンの代りに、種々の基質（
ベタィンアルデヒド、Ｎーメチルアミノエタノール、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノエタノール、モノエタノールアミ
ン、ジエタノールア３ミン、トリェタノールアミン）を
用いて、コリンに対する相対活性を求めた基 質
相対活性 コリン １００
．０べタインアルデヒド ５０．
０４Ｎ−メチルアミノエタノール ３．
６ジメチルアミノエタノール ５．２
モノエタノールアミン ０．４
ジエタノールアミン ０．０
トリエタノールアミン ３．６そ
の結果、この酵素は、少なくともコリン、ベタィンアル
デヒドーこ高い活性を示すものと認められる。 【４｝ 至適ｐＨ トリスー塩酸緩衝液を用いて、コリンオキシダーゼのコ
リンに対する酵素活性を測定した結果、第１図に示す通
りであって、その至通ｐＨは８付近と認められる。 ■ 至適温度 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その温
度条件を変えて酵素反応を行ない、コリンオキシダーゼ
のコリンに対する酵素活性を測定した結果、第２図に示
す通りであって、その至適温度は４０ｑｏ付近と認めら
れる。 ■ ＰＨ安定性ＰＨ６〜７はジメチルグルタル酸緩衝液
、ｐＨ７〜８はトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１０はグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。 ２５ｍＭの各ｐＨの緩衝液０．１のとに、酵素溶液（酵
素蛋白質濃度１０仏夕／の【）５仏〆を加え、３７００
にて３０分間放置する。 次いでこれに、０．９Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）０．０５のとを加えてｐＨを調節した後、反応液を
加えて、上記の力価の測定法に従って、コリンオキシダ
ーゼのコリンに対する酵素活性を測定した結果、第３図
に示す通りであって、そのｐＨ安定性は８付近と認めら
れる。‘７’熱安定性 酵素蛋白質１０一夕／叫を含有してなる１肌Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１の‘を各温度にて１０分間
放置し、次いで上記の力価の測定法に従って、コリンオ
キシダーゼのコリンに対する酵素活性（残存活性）を測
定した結果、第４図に示す通りであって、酵素は、４０
００付近では安定であり、４０００付近を超える温度で
は急速に低下するものと認められる。 ■ 種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて、
コリンオキシダーゼのコリンに対すＺる酵素活性を測定
した結果、次の通りである。 なお、添加物の内、金属塩の添加量は風Ｍであり、界面
活性剤の添加量は０．１％Ｗ／Ｖである。添 加 量
相対活性ＺＣａＣ１２
１０１．０ＭｇＣ１２
１００．０ＦｅＣ１
３ ０．０Ｚｎ
Ｃ１２ ７．９
ＭｎＣ１２ ９７
．７ＣｏＣ１２
３０．７ＭｏＣ１２
斑．０ＫＣＩ
９３．２ＮａＣＩ
９６．６ＮはＣＩ
ＩＯＯ．０ＬｉＣＩ
９６．６ＢａＣ１
２ １０３．４ト
リトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（界面活性剤：商品
名：和光純薬工業社製） ９５．５アデカ
トール（Ａｄｅｋａｔｏｌ）ＳＯ−１２０（界面活性剤
：商品名：旭電化工業社製） １０５．７ラウ
リル硫酸ナトリウム ９４．３デオキシ
コール酸ナトリウム ９４．３ッゥィーン（
Ｔｗｅｅｎ）２０（界面活性剤：商品名：和光純薬工業
社製） ９６．６ラゥリルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム ９１．０カチオンＤＴ２０５（界面
活性剤：商品名：日産油脂社製）
６５．９（添加物なし
１００．０）■ 分子量８４０００±２１００〔セフ
アデツクＧ−１５０（商品名：ファルマシア社製）ゲル
炉過法により測定〕６５０００±３０００（ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法：１０％ポリアクリルアミド
ゲル、厚さ２柳のスラブ電気泳動、ＳＤＳ、メルカプト
ェタノール処理、存在下泳動、１肌当り３のＡの条件）
【１０ 等電点 ４．６（キャリア・アンホライトを用いる露気泳動法に
より測定：ＬＫＢ社のキャリア・アンホラィトＰＨ４〜
１０の１１０磁力ラム、低電圧７００Ｖ、４８時間泳動
、１フラクション２の‘にて測定）ＯＵ 電気泳動 ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８．３）を用い、ディス
ク電気泳動法を用いた。 まず、コリンオキシダーゼを亀気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルをアミドブラックにて染色した結果、第５
図の１に示す通り、濃青色の一本の帯のみ認められた。 また、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルを、下記組成よりなる反応液反応液組成０
．２Ｍトリス−塩酸緩衝液 １．０の‘呈
色試液 ２．０羽０．１Ｍ基
質溶液 １．０の【蒸留水
６．０の上１０．０の‘（
ただし、上記反応液組成中、呈色試液とは０．１Ｍトリ
スー塩酸緩衝液１０の‘、５の９／机【０ージアニジン
・エタノール溶液０．３似、パーオキシダーゼ１肌．よ
りなる組成の試液を示し、基質溶液とは基質である塩化
コリンまたはべタィンアルデヒドの水溶液を示す。 ）に浸し、３７℃、２０〜３０分間放置して、現われる
帯を確認した。その結果、基質溶液として塩化コリンを
用いた酵素反応生成物による染色は、第５図の２に示す
通りであって、赤色の一本の帯が認められ、また基質溶
液としてべタィンアルデヒドを用いた酵素反応生成物に
よる染色は、第５図の３に示す通りであって、赤色の一
本の帯が認められた。さらに、これらの染色されたゲル
は水洗後７％酢酸に浸し固定する。さらにまた、この第
５図の１，２，３より明らかな通り、ゲル上に示された
泳動度は全て同一であり、単一の帯を認めることにより
、このコリンオキシダーゼは単一の蛋白質であることが
確認された。 ０２ 作用機序の確認試験 コリンあるし、はべタインアルデヒドを０．０１〜０．
０５りｍｏｌｅ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１
０仏ｍｏｌｅ、４−アミノアンチピリン１５．０Ａ夕、
フェノール１００仏夕、パーオキシダーゼ０．机．、コ
リンオキシダーゼ０．２５ｕ．を含有する反応液０．５
地を、３７０、２５分間反応せしめ、しかる後２．５の
‘のエタノールを加えて４８瓜ｍ‘こて吸光度を測定し
た。 また、コリン、ベタィンアルデヒドの代りに、定量の過
酸化水素を加えて同様に行なって、検量線を求めた。 その結果は第６図に示す通りであって、図中、ｏ−ｏは
基質としてコリンを用いた場合の測定結果であり、．−
・は基質としてべタインアルデヒドを用いた測定結果で
あり、さらに△−△は基質の代りに過酸化水素を用いた
検量線を示す測定結果であり、これらの図は酵素がコリ
ン１モルより過酸化水素２モルを生成する反応およびべ
タインアルデヒド１モルより過酸化水素１モルを生成す
る反応を触媒することを示すものである。 また上記試料にて、酸素電極を用いて酸素の消費量を測
定した結果、コリン１モルが酸化されるとき酸素２モル
が消費され、ベタィンアルデヒド１モルが酸化されると
き酸素１モルが消費されることを確認した。さらに上記
試料の反応終了物より生成したべタィンの定量は、該反
応終了物をまずｐＨＩに調節し、次いでこれを活性炭処
理した後１０“苦濃縮して、これをライネッケ塩（Ｒｅ
ｉｎｅｃｋｅＳａｌｔ）法により定量して行った、コリ
ン１モルよりべタイン１モル、ベタインアルデヒド１モ
３ルよりべタィン１モルが生成されることを確認した。 以上の通り、本発明の酵素コリンオキシダーゼは、コリ
ンおよびべタィンアルデヒ日こ作用して酸化せしめる際
、補酵素を必要とせず、直接酸素４と反応せしめ、過酸
化水素を生成せしめること、またその分子量が８４００
０±２１００、その等露点が４．６であることなどの理
化学的性質より、公知のコリンデヒドロゲナーゼやべタ
インアルデヒドロゲナーゼと異なったものと認められ、
本発明の酵素コリンオキシダーゼは新規な酵素と認めら
れる。 また上記の理化学的性質の酵素の作用機序の確認試験に
使用した定量手段はその一例であるが、以下に述べる通
り、本発明の新規な酵素コリンオキシダーゼは上記の確
認試験と同様な定量手段、例えば過酸化水素の定量、生
成するべタィンの定量、消費された酸素の定量などの手
段を用いることにより、コリンまたはべタインアルデヒ
ドを含有してなる液体の分析を可能ならしへたものであ
る。またこの酵素はコリンやべタィンアルデヒドの試薬
の純度測定、コリンやべタィンアルデヒドの誘導体を分
解せしめて生成するコリンやべタィンアルデヒドを測定
してなるコリンやべタインアルデヒドの誘導体の定量、
コリンやべタィンアルデヒドの誘導体を分解してコリン
やべタインアルデヒドを生成せしめる酵素の活性測定な
どの酵素的定量の方法を提供するものである。 本発明に使用されるコリンまたはべタィンアルデヒドを
含有してなる液体とは、コリンまたはべタィンアルデヒ
ドそのものの水または水性媒体の溶液であってもよく、
またコリンまたはべタインァルデヒドの誘導体であって
、この譲導体よりコリンまたはべタィンアルデヒドを遊
離せしめたものであってもよい。 また上記水性媒体として、好ましくは、コリンオキシダ
ーゼに対し阻害効果を及ぼさない、例えばトリスー塩酸
緩衝液が挙げられる。さらにコリンの議導体としては、
例えば生体内においてリン脂質として知られている、リ
ゾレシチン、レシチン、スフインゴミエリンさらにアセ
チルコリン、シチジンリン酸コリン、ホスホリルコリン
などの生体内成分や、ベンゾィルコリン、プロピオニル
コリン、ブチリルコリン、サクシニルコリンなどの合成
物であって、要は化学的または酵素的手段にてコリンを
遊離し得るそれらの譲導体であればよい。またこれらの
誘導体よりコリンを遊離せしめる手段としては、例えば
アルカリ分解又は酸分解などの化学的手段が挙げられ、
またクロストリジウム・ウエルチ（ＣＩｏｓ■ｄｉｕｍ
Ｗｅｌｃｈｉｉ）、バチルスｏセレウス（Ｂａｃｍｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ）などのホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｌｉｐａｓｅＣ）と牛、ブタ、ニワトリの小腸粘膜
、牛の肝臓、ェシェリシァ・コリー（Ｅｓｏｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｊ）などのアルカリホスフアターゼ（Ｍｉ
ｃａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａねｓｅ）との組合せ、キャ
ベツ、ストレプトマイセス・ハチジヨウエンシス（ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈａｃｈｉＰｅｎｓｉｓ）ＡＩｌ
４３．ストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｏｍｏｆ船ｃｕｓ）Ａ−０８４
８などのホスホリパーゼＤ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓ
ｅＤ）、牛血球、電気ウナギ、馬血清、人血清などのコ
リンェステラーゼ（Ｃｈｏｌｉｎｅｅｓｔｅｒａｓｅ）
などの酵素的手段が挙られる。 なお上記の酵素およびその由来は何んら限定されるもの
でなく、各々ホスホリパーゼＣ、アルカリホスフアター
ゼ、ホスホリパーゼＤ、コリンェステラーゼの活性を有
しているものであればよい。さらに詳しく述べれば、例
えばホスホリパーゼＣとアルカリホスフアターゼによる
レシチンに対する反応は、次式に示す通りであって、
＊レシチンはホスホリパーゼＣにより、ジグリセリ
ドとホスホリルコリンに加水分解され、さらにこのホス
ホリルコリンはアルカリホスフアターゼに※※より無機
リン酸とコリンに分解されるものである。またホスホリ
パーゼＤによるレシチンに対する反応は次式に示す通り
であり、レシチンはホスホリパーゼＤによりホスフアチ
ジン酸とコリンに加水分解されるものである。 さらにコリンエステラーゼによるペンゾイルコリンに対
する反応は、次式に示す通りであり、ペンゾィルコリン
はコリンェステラーゼにより安息香酸とコリンとに分解
されるものである。 上記の酵素は一例であって、さらにコリンまたはべタィ
ンアルデヒドの誘導体よりコリンまたはべタィンァルデ
ヒドを遊離し得る手段であれば、如何なる手段であって
もよい。なお、これらの前処理を必要とするコリンまた
はべタインアルデヒドの譲導体を用いて対応する酵素を
作用せしめるに当って、その処理は別の工程として先に
行なってコリンまたはべタィンァルデヒドを遊離せしめ
、これをコリンまたはべタィンアルデヒドを含有する液
体としてもよく、または上記の酵素反応が短時間である
ため、別工程とすることなく、対応する酵素および目的
とするコリンオキシダーゼとを同時に加えて、以下に述
べる操作を行なう。この様にして用意された、コリンま
たはべタインアルデヒドを含有する液体に、コリンオキ
シダーゼを作用せしめるのであるが、このコリンオキシ
ダーゼは、緩衝液に溶解した溶液であってもよく、さら
にその酵素活性を劣化せしめない状態に２て、マイクロ
カプセル化手段、樹脂または多糖類などとの共有結合手
段、吸着手段などの公知の酵素固定化手段を施したもの
であってもよい。 またこのコリンオキシダーゼの添加量としては、試料の
量などによって異なるが、酵素による反応時間３を好適
な短時間とせしめるに、１単位以上であればよく、好ま
しくは１．５〜５単位程度である。また用いるコリンオ
キシダーゼの比活性は高いものほど反応にとって良好で
あることは言うまでもないことであるが必ずしも最高純
度のものを要求す３るものではない。このようにして、
該液体にコリンオキシダーゼを添加して、一定時間イン
キュベイトした該液体中には、過酸化水素およびべタィ
ンが生成され、対応した酸素の減少が起きる。 次いで、これらの４過酸化水素、ベタィン、酸素の測定
を行なうのであるが、酸素の測定については、上記した
通り、酸素電極を用いる方法が最も簡便であり、ベタィ
ンについても一例として上記したラィネツケ塩法が好ま
しく、またべタィンをェステル化してガスクロマトグラ
フィ一などによる測定方法もある。また過酸化水素の測
定法としては好ましくは過酸化水素と反応してその色調
に変化を生ずる１種もしくは２種以上の呈色剤からなる
システムによって、比色測定によって測定することが好
ましい。測定する方法としては、例えば、生成する過酸
化水素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタン
化合物とキシレールオレンジによる反応、或はフェノー
ル、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼに
よる反応などを利用する方法などが挙られる。このフェ
ノール、４−アミノアンチピリン、パーオキシダーゼに
よる反応を利用する過酸化水素の測定において、フェノ
ールはコリンオキシダーゼの活性を阻害するため、最小
限の濃度とすることが好ましく、また４ーアミノアンチ
ピリンは生成する過酸化水素量に対し１／２仏ｍｏｌｅ
以上、好ましくは２仏ｍｏｌｅ以上、さらにパーオキシ
ダーゼは０．１ｕ以上、好ましくは０．２〜０．５叫陸
度使用することが望ましい。さらにまた４−アミノアン
チピリンの代りに４−アミノフヱナゾーンを用いてもよ
く、それらの各試薬は溶液としてあらかじめ混合、調製
すればよい。このようにして星色せしめた色調を適当な
波長にて測定し、その検量線より存在する過酸化水素を
定量し、存在するコリンまたはべタィンアルデヒドもし
くはコリンの誘導体またはべタィンアルデヒドの誘導体
の定量、またはコリンの誘導体を加水分解する酵素活性
などの定量を行なう。また上記の方法以外に、２，６−
ジクロルフェノ−ルィンドフェノールとパーオキシダー
ゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、グアャク脂と
パーオキシダーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定
、ホモバニリン酸とパーオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定などの種々の方法が挙げられる。上
記の過酸化水素、ベタィン、酸素の定量において、特に
過酸化水素の定量、さらに過酸化水素をパーオキシダー
ゼおよび呈色剤によって定量する方法が簡便かつ正確で
あるため好ましい。 従って、この過酸化水素、ベタィン、酸素の測定値、お
よびそれらの検量線より、使用した液体中のコリンまた
はべタィンアルデヒドの量的関係を求めればよく、コリ
ンまたはべタインアルデヒドそのものである試薬などの
純度測定においてはそのままの値から容易に求められ、
コリンなどの誘導体を用いて酵素などにて処理した場合
においては、測定値からコリン誘導体の量的関係を求め
るか、測定値から使用した酵素活性の関係を求めること
によって分析されるものである。また上記分析法は、コ
リンオキシダーゼによるコリンのべタィンアルデヒドを
経由したべタィンへの酸化反応を利用した分析手段を挙
げたものであるが、またこの酸化反応過程の中間生成物
たるべタィンアルデヒドまたはその生成量に対応する過
酸化水素を定量してコリンの定量を行ってもよい。しか
しこの生成したべタィンアルデヒドはさらにコリンオキ
シダーゼにより酸化され過酸化水素を生じるため、測定
誤差を生じる欠点を有しており、そのため生成したべタ
インアルデヒドがコリンオキシダーゼによって次工程の
酸化作用を受けないような反応阻害剤、例えばべタィン
アルデヒド容易にシック塩基どを形成する阻害剤やべタ
インアルデヒドデヒドロゲナーゼとＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐとによる反応系路を変更せしめるコリンオキシダーゼ
のべタインへの阻害剤を添加するなどの方法が推定され
る。さらに、これらの分析法において使用される種々の
組成は適宜選択変更されるものであって、またこの分析
法はその分析の目的に応じて、それぞれ適宜選択された
組成を有するキットとして組立てられるものである。 また上記の分析法において使用する、リン脂質よりコリ
ンを遊離せしめるホスホリパーゼＤについて詳しく述べ
る。使用するホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマ
イセス・ハチジョウェンシスＡＩｌ４３菌株やストレプ
トマィセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌株由来の酵
素が挙られ、これらの菌株は、工業技術院微生物工業技
術研究所に各々微生物受託番号「ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．１
３２９」（特関昭４８一９９３８６号）、「ＦＥＲＭ−
ＰＮｏ．３５１９」として寄託されている。特にストレ
プトマイセス・クロモフスカスＡ一０８４８菌株「ＦＥ
ＲＭ−ＰＮｏ．３５１９」の菌学的性状、培養手段、精
製手段、さらに得られるホスホリパーゼＤの理化学性質
などを述べれば、次の通りである。菌学的性状‘ａ’形
態 肉眼的観察によれば、胞子を形成した気菌糸は灰色を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄燈色を呈し、可溶性色素
は通常生成しない。 スターチ、無機塩寒天培地上で、３０こ○、１０〜１５
日間培養観察し、顕微鏡観察した所見は次の通りである
。 気菌糸は直径０．６〜０．８仏、波状で単純分枝をなし
て伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。 胞子の連鎖は通常ゆるく１〜３回巻いた螺旋を形成（Ｓ
ｐｉｒａｌｅｓ）し、まれに４〜５回巻いた螺旋もみら
れ、またときには波状または直状で螺旋を形成しないも
の（ＲＦ）もみられる。胞子は球形ないし楕円形で、大
きさは０．６〜０．８×０．７〜０．９仏であり、表面
にとげ状の突起を形成している。基生菌糸は分枝をもっ
て屈曲状に伸長し、直径０．４〜０．６仏で、菌糸の分
裂や胞子の着生は認められない。鞭毛胞子や胞子のうち
の着生も認められない。【ｂ｝ 全菌体分析によるジア
ミノピメリン酸の分析べネッッ（茂ｎｎｅｔｔ’ｓ）塔
地で５日間振濠培養した菌体をべッカー（技ｃｋｅｒ）
らの方法〔アプライド・マイクロバイオロジ−（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ難）１２｛５）４２１
一４２３（１９６４）〕で分析した結果、ＬＬージアミ
ノピメリン酸が検出され、メソ（ｍｅｓｏ）−型は検出
されなかった。 【ｃー 培養的性状 下記の培地を用い、３０午０、２０日間培養観察した性
状は、次に示す通りであって、色の表示は「カラー・ハ
ーモニ・マニュアル」に従った。 【１｝ シュクロース・硝酸塩寒天培地生育：僅少、無
色。 気菌糸：僅少。 可溶性色素：生じない。 【２１ グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、パステル・オレンジ（Ｐａｓ
に１のａｎｇｅ；４ｉｃ）。 気菌糸：生じない、ないし僅少。 可溶性色素：ヌード・タン（ＮｕｄｅＴａｎ；蜜ｃ）、
僅かに生じる。 ‘３’グルコース・アスパラギン寒天培地生育：中程度
、バンブー（母ｍＰわ：がｄ）ないしアンバー（Ａｍは
ｒ；３ｐｅ）。 気菌糸：貧弱ない中程度、ホワイト （Ｗｈｉに；ａ）。 夕可溶性色素：生じない。｛４
）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：中程度、コ
ールデン・ブラウン （ＧｏｌｄｅｎＢｒｏｗｎ；３ｐｇ−３ｐｉ）。 気菌糸：中程度、シルバー・グィ（ＳｉｌｖｅｒＪＯＧ
ｒａｙ；紬ｅ）ないしナチュラル（Ｎａｔｕｒａｌ；桝
ｃ）。可溶性色素：生じない。｛５’ スターチ・無機
塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・ブＺタラウン（
３ｐｉ）ないしクロフ・ブラウン（ＣｌｏｖｅＢｒｏｗ
ｎ：３ｐｌ）。 気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グレイ（群ｅ）
ないしナチュラル（幻ｃ）、一部ホワイト（ａ）。 ２０可溶性色素：生じない。
■ チロシン寒天塔地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・フラウン（３ｐ
ｇ−３ｐｉ）。 気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グ２５レイ（３
ｆｅ）ないしナチュラル（紅ｃ）。 可溶性色素：生じない。｛７｝ グリセリン・スターチ
・グルタメィト寒天培地生育：中程度ないし良好、ルス
ト・タン３０（Ｒ聡ｔ Ｔａｎ；舷ｃ）ないしメイプル
（Ｍａｐｌｅ：４１ｅ）。 気菌糸：中程度、オィスター・ホワイト （０ｙｓにｒＷｈｉｔｅ；ｂ）ないしライト・グレイく
Ｌｔ．Ｇｒａｙ；Ｃ）。 ３タ可溶性色素：生じない。｛
８） オート・ミル寒天培地 生育：中程度ないし良好、マスタード・ゴールド（Ｍｕ
ｓｔａｒｄＧ℃ｌｄ；机ｅ）ないしゴールデン・ブラウ
ン（３ｐｇ）。 ４０気菌糸：中程度ないし良好、ナチ
ュラル（紅ｃ）ないしベイジ・ブラウン（Ｂｅｉ袋Ｂｒ
ｏｗｎ；３ｉｇ）。 可溶性色素：生じない。 ■ イースト・麦芽寒天培地 生育：中程度ないし良好、アンバー （母ｃ）ないしイエロー・メイプル（ＹｅｌｌｏｗＭａ
ｐｌｅ；紬ｇ）。 気菌糸：中程度、シルバー・グレィ （乳ｅ）ないしベイジ・ブラウン（３ｉｇ）ないしベイ
ジ（滋ｃ）。 可溶性色素：生じない。 胤 栄養寒天塔地 生育：中程度、アンバー（３ｐｅ）。 気菌糸：僅少ないし貧弱、ホワイト （ａ）。 可溶性色素：生じない。 ＯＵ べプトン・イースト・鉄寒天培地 生育：中程度ないし良好、無色、裏面；ゴールデン・ブ
ラウン（３ｐｇ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ−３ｐｉ）
。 ０２ トリプトン・イーストエキス培地 生育：良好、アンバー（３ｎｃ−３ｐｃ）。 気菌糸：生じない。可溶性色素：生じない、ないしゴー
ルデ ン・ブラウン（３ｐｇ）。 ０３ グルコース・ベプトン・ゼラチン培地生育：貧弱
、コールデン・ブラウン（３ｐｇ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：ゴールデン・ブラウン （３ｐｉ）。 肌 脱脂乳培地 生育：良好ないし極めて良好、ライト・アンバー（Ｌｔ
Ａｍはｒ；３ｉｃ）ないしライト・タン山上Ｔａｎ；穣
ｃ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：メイプル（４１ｅ）ないしパステル・オレ
ンジ（４ｉｃ）。 ー 生理的性状 ｛１１ メラニン様色素の生成：べブトン・イースト・
鉄寒天塔地で陽性、トリプトン・イーストエキス培地で
凝陽性、チロシン寒天塔地で陰性。 ‘２ー ゼラチンの液化：グルコース・ベプトン・ゼラ
チン培地で陽性。 〔３｝ スターチの加水分解：スターチ・無機塩寒天塔
地で陽性。 ｛４’脱脂乳：凝固：陰性、ベプトン化；陽性■ 炭素
源の同化性：Ｄーグルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄー
マンニツト、Ｌーラムノース、Ｄ−キシロースは陽性、
ィノシトール、ラフィノースは凝陽性、シュクロースは
陰性。 ｛６｝ 生育温度：１０〜４７午０。 以上の通り、本菌株は分裂を生じない真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖をもつ気菌糸を生じ、また菌糸の
直径および胞子の大きさ、さらに細胞壁にＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸を含有することなどよりストレプトマィセ
ス属に属するものと認められる。 また本菌株の特徴として、気菌糸は灰色を呈し、胞子の
連鎖は主として螺旋を形成し、胞子の表面はとげ状を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄燈色で、通常可溶性色素
を生成せず、メラニン様色素はべプトン・イースト・鉄
寒天培地で生成し、チロシン寒天培地では生成しないこ
と、および炭素源の同化能は比較的広範囲に及んでいる
ことなどが挙られ、このような特徴を有する菌種を種々
の文献より検索すれば、ストレプトマイセス・クロモフ
スカス〔プロプレムス・オブ・クラシフイケイシヨン・
オプ・アクチノマイセテスーアンタゴニスツ（Ｐｒｏｂ
ｌｅｍｓ ｏｆｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ａ
ｃｔｊｎｏｍｙｃｅｔｅｓ−ａｎｔａ■ｎｉｓｔｓ）１
７６−１７７（１９５７）、インターナショナル・ジヤ
−ナル・オブ・システマテイク・／ゞクテリオロジー（
ｌｎｔｅｒｎａｔｉ○ｎａＩ Ｊｏｕｒｎａｌ ○
ｆ ＳｙＳにｍａｔｉＣＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
１熱４｝３０７−３０９（１９６８）、アプライド・マ
イクロバイオロジー（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ）６５２−７９（１９５８）〕が類似菌として
挙られ、さらに本菌株とストレプトマィセス・クロモフ
スカスとを詳細に比較すれば、形態的にはストレプトマ
ィセス・クロモフスカスの方が螺旋の形成がやや良好な
こと、培養的性状においてグリセリン・スターチ・グル
タメィト寒天塔地およびグリセリン・硝酸塩塔地上で可
溶性色素の生成の有無などの相違が両菌株の比較実験に
て認められたものの、これらの多少の相違は菌株間の相
違と認め、他の諸性状においてはよく一致していること
より、本菌株をストレプトマィセス・クロモフスカス（
プレオブラソエンスカラ・エト・オル）プリダム・エト
・オル〔ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＣｍｏｍｏｆ船Ｃｕ
Ｓ（ＰｒｅｏｂｒａＺｈｅ船ｋａｙａ ｅｔ ａｌ ）
Ｐｒｉｄｈａｍｅｔａｌ〕に属するものと同定し、本菌
株をストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８
と命名した。次いで、本菌株を培養してホスホリパーゼ
Ｄを得るに当って、本菌株を、酵素を生産する通常の方
法で培養すればよく、その培養の形態は通常液体培養を
行なうが、工業的には深部通気蝿梓培養を行なうのが有
利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常
用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては同
化可能な炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、シ
ョ糖、乳糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリ
ンなどが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチーブ・リカー
、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ベプトン、肉エキス
、酵母エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウ
ム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に
応じて使用される。培養温度は本菌が発育し、ホスホリ
パーゼＤを生産する範囲内で適宜変更し得るが、特に好
ましくは２５〜３０ｏ○であり、また培養時間は条件に
よって異なるが、ホスホリパーゼＤが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよく
、通常、２〜４日程度である。このようにして得られた
培養物からホスホリパーゼＤを採用するのであるが、本
酵素は水に易溶性であって、主として培養液中に存在す
る。培養液中に存在するホスホリパーゼＤは、培養炉液
を濃縮するか、もしくは濃縮することなく可溶性塩類、
例えば硫安などで半飽和または飽和沈澱させるか、また
は親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、ア
セトなどを添加することにより沈澱させることができる
。沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜で透析する
ことにより低分子不純物を除去することができる。また
吸着剤、イオン交換体あるいはゲル炉過剤などを用いて
不純物を除去してもよい。これらの手段により得られる
酵素溶液を、減圧濃縮、凍結乾燥などの操作により処理
して固形の粗製ホスホリパーゼＤを得ることができる。
さらにこの粗製ホスホリパーゼＤは、蛋白質、酵素など
の精製に通常用いられる手段、例えば吸着剤、イオン交
換体、ゲル炉過剤などを用いて精製され、さらにジェチ
ルアミノェチルセルロースおよびデキストランゲル架橋
体（商品名：セフアデックスＧ−５０）カラムクロマト
グラフィーにより精製される。次にホスホリパーゼＤの
理化学性質について述べる。将１）作 用 リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのェステ′結合に作用
してリン化合物と相当する含窒素基と遊離する。 レシチンについての作用を例示すれば次式の通りである
。｛２） 力価の測定法 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１のと
、０．１ｍＭレシチンェマルジョン０．１の‘、０．１
Ｍ塩化Ｚ力ルシウム０．０５の【、１％トリトンＸ−１
０００．１帆、水０．１の‘よりなる反応液に、酵素溶
液０．０５の‘を加え３７ｏｏ、１０分間反応させた後
、５分間煮沸して反応を停止した。 次いで反応液を３７ｑ０まで冷却し、これに、４ーアミ
ノアンチピリン２（３雌／奴）０．１の‘、狐．／舷パ
ーオキシダーゼ０．１のと、０．１％フエフール０．仇
‘、１狐．／泌コリンオキシダーゼ０．１のと、水０．
１のとを加えて３７ｏ０、２０分間反応せしめた後１％
トリトンＸ−１００２のとを加え、６０仇ｍの吸光度を
求めた。ホスホリパ２ーゼＤ、１単位（Ｕｎｉｔ．Ｕ．
）は１分間にＩＡｍｏｌｅのコリンを生成せしめる酵素
活性と定めた。また力価の算出は次式に従った。Ｕ．／
机ニ△Ａ５００×〇．５５ （式中、△ふｏｏは５００ｎｍにおける吸光度を示３す
）糊 基質特異性 上言己の力価の測定の反応液において、基質としてレシ
チン、リゾレシチン、スフインゴミエリンのエマルジョ
ン（１仇ｈＭ、０．１のと）を用３い、同様の操作を行
ない、コリンの定量をして、リゾレシチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求めた。 基 質 相対活性レシチン
５１％４０スフインゴミエリ
ン １９％リゾレシチン
１００％‘４１ｐＨ安定性ｐＨ５：
酢酸緩衝液、対６〜７：ジメチルグルタス酸−水酸化ナ
トリウム緩衝剤、ｐＨ８〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐ
ＨＩＯ：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（各々１０
ｈＭ）の各ｐＨで、酵素溶液（１の９／肌）を、３７０
、６０分間インキュベィトした後、上記の力価の測定法
に従ってホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第７図
に示す通り、酵素はｐＨ７〜９で比較的安定であると認
められる。 ‘５’至適ｐＨ ＰＨ６〜７．５：ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜
１０：グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液の各々の緩衝
液を用い、上記の力価の測定法に従ってホスホリパーゼ
Ｄの活性を求めた結果、第８図に示す通りであって、そ
の至薄ｐＨは７．５〜８付近と認められる。 ｛６｝ 熱安定性 １肌Ｍトリス‐塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）、酵素溶液濃
度（１秘／のと）の条件で、４０，５０，６０，７０，
８０ｄｏの各々の温度にて１０分間インキュベイトした
後、上記の力価の測定法に従ってホスホリパーゼＤの活
性を求めた結果、第９図に示す通りであって、酵素は７
０ｑｏまで安定である。 ‘７１血清リン脂質への作用条件１の試料 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．２
の‘市販品血清 ０．５の‘
〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１泌−６血．／奴ホスホリパーゼＤ
Ｏ．１の【蒸留水 ０．
１の‘条件２の試料０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０） ０．物上市販品血清
０．５の‘〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１の‘６肌．／肌ホスホリパーゼＤ
Ｏ．１の【ホスファチジン酸ホスフアター
ゼ か．蒸留水 ０
．１の【条件３の試料０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０） ０．２叫市販品血清
０．５の‘〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１泌蒸留水
０．２の‘Ｚなお、上記各条件における試料
に用いた、市販品血清はハィランド（Ｈｙｌａｎｄ）社
製の製品であり、ホスフアチジン酸ホスフアターゼはス
トレプトマイセス・ミラピリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｍｉｒａｂｊｌｉｓ）Ａ−２３１３菌株よりＺ得ら
れたホスフアチジン酸ホスフアターゼ（特開昭５０−１
４２７８び号）である。 上記の条件で、１，２および３の試料を３７℃、３０分
間反応せしめた後、各々にクロロホルム：メタノール（
２：１）６叫、次いで水１の【を加えて充分混合し、３
００仇ｐｍ、１０分間遠心分離し、そのクロロホルム層
を回収した。 このクロロホルム層を減圧乾固し、シリカゲルＧ（東京
化成工業社製）にて薄層クロマトグラフィーを行ない（
展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５
：３）、プレート乾燥後、モリブデンブルー試薬により
、リン脂質の確認を行なった。また、標準リン脂質とし
て、ホスフアチジルエタノールアミノ、ホスフアチジル
コリン、スフインゴミエリン、リゾホスフアチジル３コ
リン、ホスフアチジン酸を用いて、上記と同一の条件で
薄層クロマトグラフィーを行なった。その結果、第１０
図に示す通りであって、、１は条件１の試料のスポット
、２は条件２の試料のスポット、３は条件３の試料のス
ポット、４はホスフアチジルエタノールアミン、ホスフ
アチジルコリン、スフインゴミエリンおよびリソホスフ
アチジルコリンよりなる標準リン脂質のスポット、５は
ホスフアチジン酸である標準リン脂質のスポットを示し
、Ａは標準リン脂質より判明したホスフアチジルエタノ
ールアミンのスポット、Ｂは同様ホスフアチジルコリン
、Ｃは同様スフィンゴミェリン、Ｄは同様ホスフアチジ
ン酸、Ｅは同様ＩＪゾホスフアチジルコリンを示す。 第１０図より、血清（条件３の試料）中にはホスフアチ
ジルェタノールアミン、ホスフアチジルコリン、スフイ
ンゴミェリンおよびリゾホスフアチジルコリンが存在す
ることが明らかである。この血清にホスホリパーゼＤを
作用せしめる（条件１の試料）とホスフアチジン酸のみ
存在する。さらにこの血清にホスホリパーゼＤおよびホ
スフアチジン酸ホスフアターゼを作用せしめる（条件２
の試料）と全くスポットが見られないことより、血清中
のリン脂質はホスホリパーゼＤによりホスフアチジン酸
にまで分解‐され、さらにこのホスフアチジン酸がホス
フアチジン酸ホスフアターゼにより無機リン酸とジグリ
セリドに分解されたと推定される。またこの結果は、こ
のホスホリパーゼＤが、血清中のホスフアチジルェタノ
ールアミンをも基質とし得る酵素であることを示してい
る。このホスホリパーゼＤ即ちストレプトマイセス・ク
ロモフスカスＡ−０８４８菌株より得られるホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマイセス・ハチジョウェンシスＡ
Ｉｌ４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ（特開昭４
８一９９３８６号）よりも至適ｐＨ、ｐＨ安定性、熱安
定性においてより優れており、さらにストレプトマイセ
ス・ハチジヨウエンシスＡＩｌ４３菌株はホスホリパー
ゼＤのほかにホスホリパーゼＣをも生産する（持開昭４
９−５５８９３号）ため、ほぼ完全な精製を行なわない
限り、その最終標品にホスホリパーゼＣの混入を伴い、
これによる副反応を生じる欠点を有している。 従って、本発明に使用されるリン脂質の分析定量用のホ
スホリパーゼＤとしてはストレプトマイセス・クロモフ
スカスＡ−０８５８菌株より得られるホスホリパーゼＤ
が好ましい。次に、本発明におけるコリンオキシダーゼ
の製法およびその酵素を用いてなる種々の分析法を具体
的に述べるが、本発明はこれらによって何んら限定され
るものではない。実施例 １ コリン１．０％，ＫＣＩＯ．５％，Ｋ２ＨＰ〇４０．１
％，ＭｇＳ０４・７日２００．０５％、酵母エキス０．
２５％、フィシユ・ソルブル（Ｆｉｓｈｓｏｌｕｂｌｅ
）１．０％、デスホームＣＡ−２２００．１％よりなる
培地１００机【（ｐＨ７．２）を５００の‘客三角フラ
スコに加え、１２０ｑｏ、２０分間滅菌処理し、次いで
これにアースロバクター・グロビフオーミスＢ−０５７
万菌株を接種し、３ぴ０、１日間培養して種菌を得た。 次いで、この種菌を、上記と同一組成を有す培養液１０
そを有してなる滅菌後の３０そ容ジャー・フアメンター
に移植し、３０℃、２日間、２０比ｐｍ、２０そ／ｍｊ
ｎの滅菌空気の条件下通気魔梓培養し、得られる培養液
を遠心分離して集菌し、この菌体を１仇ｈＭトリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ＭＭＥＤＴＡ（エチレンジ
アミンテトラアセティクアシド）、１％ＫＣＩよりなる
溶液１れこて洗浄した。この洗浄菌体を１その他ｈＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｈＭＥＤＴＡ、１％ＫＣ
Ｉよりなる溶液に懸濁し、これにリゾチーム（長瀬産業
社製、塩化リゾチーム）２００の９を加え、３７Ｃ０、
３０分間蝿拝した。リゾチーム処理後、溶液を５００仇
ｐｍ、１５分間遠心分離し、得られた上清液にアセトン
１夕を加えて析出する不純物を遠心にて除去し、さらに
これにアセトンを加えて６５％アセトン濃度とし、次い
で５００仇ｐｍ、１５分間遠心分離して沈澱物を回収し
、これを４０の‘の１仇ｈＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２ｈＭＥＤＴＡ、１％ＫＣＩよりなる溶液に
溶解し、不熔部分は遠心して除去した。次いでこれに６
０の‘の飽和硫安溶液を加えて１５分間燭拝した後、１
２００仇ｐｍにて１５分間遠心分離を行い、得られた沈
澱物を１５の‘の肋ｈＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）、
机Ｍ旧ＤＴＡよりなる溶液に溶解し、これを流速３０の
とノｈｒにてセフアデツクスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５）のカラムに通じて脱塩した後、得られた溶
液を、ｐＨ７．０で緩衝化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（カラム径２．０×７．０ｃの）に通じて酵素を吸
着せしめ、さらに０．２Ｍ〜０．弧のＫＣＩのィオン強
度勾配を用いて溶出せしめた。約０．４ＭＫＣＩ濃度で
の溶出画分を回収して活性画分１７２叫を得た（流速：
１．４の‘／ｍｉｎ、１フラクション；６の‘）。さら
にこの活性画分１７２の‘を透析膜（セルロースアセテ
ート）にて７時間透析せしめ（外液：５ｍＭリン酸緩衝
液、２ｈＭＥＤＴＡよりなる溶液）、次いでこの透析液
を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、１０の上の１
仇ｈＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｈＭＥＤ
ＴＡ、１％ＫＣＩよりなる溶液に溶解せしめた後、セフ
アデツクスＧ−２００を用いたカラムクロマトグラフイ
ーを行ない（カラム径：２．８×９．５仇、流速：０．
１８の【／ｍｉｎ、１フラクシヨン：６叫）、そのフラ
クシヨンＮｏ．４２〜４８の活性画分を回収し、凍結乾
燥した。次いで同様のセフアデックス操作を行った。こ
の得られた凍結乾燥物は、先の霞気泳動の結果において
述べた通り、唯一の蛋白質の帯を示すものであった。全
活性 全蛋白質量 比 活 性菌 体抽 出 液 ９９
８ｕ． ７６８吻 ０１がス似ァセトン沈澱 ９００
ｕ． ５８の咳 １．５５ｕん牧硫 安 沈 澱
８２５ｕ． ３０肌夕 ２７５ｕ×物ＤＲＡＢ−せ
ぬース ４２０ｕ． １１９咳 ３．６５ｕス燐。 セフをきる伽 ３９０ｕ‐５８‐郷 ６‐７０ッ似セフ
アテツクスＧ−２ｏｏ（２） ３８０ｕ． ５５．動
物 ６．８０ｕ〆雌また各採取工程における、コリン
オキシダーゼの全活性、全蛋白質量、比活性は上記表に
示す通夕りである。 参考例 １ （コリンの定量） 過酸化水素０．０１〜０．０５山ｍｏｌｅ、トリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）１仏ｍｏｌｅ、４−アミノアン
チピリ０ン１５０〃夕、フェノール２００仏夕、パーオ
キシダ−ゼ０．か、コリンオキシダーゼ０．２５ｕ．を
含有する反応液０．５地を、３７℃にて２５分間反応せ
しめた後エタノール２．５偽を加えて４８仇ｍにおける
吸光度を測定して、過酸化水素の検量線を得た。 ５ 次いで、上記の反応液中の過酸緩水素の代りに塩化
コリンを加え、同様に行なってその吸光度を測定し、過
酸化水素の検量線よりコリンを定量した。 参考例 ２ （ベタィンアルデヒドの定量） 上記参考例１のコリンの代りにべタィンアルデヒドを用
いて同様に行なうことにより、ベタィンアルデヒド試薬
のべタィンアルデヒド純度を測定した。 参考例 ３ （リン脂質の定量） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１
５奴【３の９／机４−アミノアンチピリン ０．５
０凧【０．１％フ工／ール ０
．３０の【１％トリトンＸ−１００
０．３０の‘１仇ｈＭＣａＣ１２
０．３０の【１５ｕ／の‘コリンオキ
シダーゼ ０．１０の【狐／泌パーオキシダー
ゼ ０．１０の‘１か／叫ホスホリパーゼ
Ｄ Ｏ．１０の【蒸留水
１．１５の【３．００の‘シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した卵黄レシチン或
は市販品血清（ハィランド社製）を各々添加し、３７０
０、２０分間反応せしめた後、５０仇ｍにて比色測定し
た結果、第１１図および第１２図に示す通りである。 （第１１図は卵黄レシチンに対する測定結果を示し、第
１２図は市販品血清に対する測定結果を示す。この第１
１図（卵黄レシチンの測定結果）と先の過酸化水素の検
量線とより、卵黄レシチン中の遊離されたコリン量が算
出され、さらにこのコリン量より卵黄レシチンのモル数
が求められる。同様、この第１２図（血清の測定結果）
と先の過酸化水素の検量線とより血清中のリン脂質が定
量される。なお、上記方法に用いたホスホリパーゼＤは
、ストレプトマィセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌
株より得られたホスホリパーゼＤであって、その使用量
は一般に０．５ｕ．以上、好ましくは１〜５ｕ．程度で
ある。参考例 ４（コリンェステラーゼの測定） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．０
５私３の９／叫４ーアミノアンチピリン ０．０５
の【０．１フエノール
０．１０の‘狐．／私パーオキシダーゼ
０．１０の【２０ｕ．／泌コリンオキシダーゼ
０．２０の‘５■ｈＭペンゾイルコリン
０．０２の【〇．５２のＺ生理食塩水にて１針音
希釈したヒト血清（健康人より採取）を加え、３７０、
３び分間反応せしめ、次いでこれに０．２ｍＭネオスチ
グミン溶液（コリンェステラーゼ阻害剤）３．０似加え
た後さらに室温下１０分間放置して５０Ｍｍにて比色測
定した結果、第１３図に示す通りであって、血清中コリ
ンェステラーゼ活性は、反応液中のペンゾィルコリンよ
り遊離されたコリンの量より（コリンはコリンオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フ
ェノール系により定量）測定されたものであって、この
吸光度より血清中コリンェステラーゼの活性が求められ
る。 またコリンヱステラーゼの活性は、血清１．０の【中の
酵素が３７℃で１分間に２仏ｍｏｌｅの過酸化水素を生
じたとき、ｌｕ．として表わすことができる。活性ｕ．
／の‘＝△Ａ５の／ｍｉｎ×４．８上記コリンェステラ
ーゼ、ベンゾィルコリンの組合せの代りに他のコリン誘
導体の加水分解酵素および他のコリン誘導体を粗合せて
用いることにより種々の酵素活性の測定や、コリン誘導
体の定量に使用し得る反応系を設定し得る。 参考例 ５ べプトン２％、ラクトース２％、ＮａＣＩＯ．１％、Ｋ
Ｈ２Ｐ０４０．０５％、ＭｇＳ０４・７日２００．０５
％、デスホームＢＣ−５１ＹＯ．５％よりなる組成の培
地１００の‘を有する５００の上客三角フラスコ（１２
０℃、２０分間滅菌処理）にストレプトマイセス・クロ
モフスカスＡ−０８４８菌株を接種し、２６ｑｏ、３日
間培養して種菌を得、これを上記と同一組成よりなる培
地２０〆を有する３０そ客ジャーファーメンタ−に移植
し、２６℃、２日間、３０仇ｐｍ、２０〆／ｍｉｎの条
件下通気燈枠培養した。 この培養液は０．５ｕ／の‘の活性を示す。この培養物
を遠心分離して得た培養炉液１８そを３夕になるまで減
圧濃縮し、この濃縮液にアセトン２．４そを加え、生じ
た沈澱物を遠心分離して除去した。得られた上情液にさ
らにアセトン２そを加えて生じた沈澱物を遠心分離にて
回収し、これを５００叫の精製水に溶解せしめた後、こ
れにアセトン３５０の‘加えて沈澱する不純物を遠心分
離により除去し、その上清液にアセトン３３０の‘を加
えて生じた沈澱物を遠心分離により回収し、これを２０
０の‘の精製水に溶解した。これに、飽和硫安溶液２０
０叫を加えて生じた沈澱物を遠心分離により回収した後
、これを５０の‘の精製水に溶解し、セファデックスＧ
−２５により脱塩した後凍結乾燥して５ｕ．／雌の活性
を有する粗製ホスホリパーゼＤの粉末７００雌を得た。
本発明においては、この粗製ホスホリパーゼ０をそのま
ま利用したものであって、必ずしも完全に精製したもの
を必要とするものではなく、またこの粗製ホスホリパー
ゼＤは上記記載の一般的手段にて精製し、この精製ホス
ホリパーゼＤを用いてもよい。図面の簡単な説明第１図
はコリンオキシダーゼの至適ｐＨを示し第２図はコリン
オキシダーゼの至適温度を示し、第３図はコリンオキシ
ダーゼのｐＨ安定性を示し、第４図はコリンオキシダー
ゼの熱安定性を示し、第５図はコリンオキシダーゼの雷
気泳動図を示し、第６図はコリン・ベタィンアルデヒド
および過酸化水素の検量線を示し、第７図はホスホリパ
ーゼＤのｐＨ安定性を示し、第８図はホスホリパーゼＤ
の至造ｐＨを示し、第９図はホスホリパーゼＤの熱安定
性を示し、第１０図はホスホリパーゼＤの血清リン脂質
の分離作用を示す薄層クロマトグラムを示し、第１１図
は卵黄レシチンの定量結果を示し、第１２図は血清リン
脂質の定量結果を示し、第１３図はヒト血清コリンェス
テラーゼ活性の測定結果を示す。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１１図 第１２図 第１３図
に属するコリンオキシダーゼ生産菌を培地に培養し、そ
の培養物からコ４リンオキシダーゼを採取することを特
徴とする新規なコリンオキシダーゼの製法である。 本発明における新規なコリンオキシダーゼとしては、上
記の性状、作用を有するものであればよ〈、その元素分
析値、添加物による阻害、活性化など多少の相異を示す
ものであっても上記の性状、作用を有するものは本発明
のそれに包含されるものであり、この新規なコリンオキ
シダーゼを得るために使用菌としては上記の菌はその一
例である。 また本発明の製法における使用菌としては、上記の菌は
その一例であって、アースロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産能力を有するものであればすべて本発
明において使用できる。 もちろん微生物は、自然的、人工的に変異を起こしやす
く、本菌も例外ではないが、これらの変異株であっても
コリンオキシダーゼの生産能力を失わない限り本発明に
使用し得ることはいうまでもないことである。本発明を
実施するに当って、アースロバクターＺ属に属するコリ
ンオキシダーゼ生産菌による製法について例示すれば、
次の如くである。 即ちアースロバクター属に属するコリンオキシダーゼ生
産菌を、抗生物質、酵素などを生産する通常の方法で培
養する。培養の形態は液体培養でも固体培養Ｚでもよい
が、工業的にはコリンオキシダーゼ生産菌の細胞をその
生産用培地に接種し、深部通気蝿梓培養を行なうのが有
利である。培養の栄養源としては、微生物の培養に通常
用いられるものが広く使用される。 窒素源としては２利用可能な窒素化合物であればよく、
例えばコーン・スチーブ・リカー、大豆粉、ベプトン、
種々の肉エキス、酵母エキス、硫安、塩化アンモニウム
などが使用される。炭素源としては、同化可能な炭素化
合物であればよく、例えば糠蜜、ブドウ２糖、スターチ
加水分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリ
ウム、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸
第二カリウムなどの種々の無機塩やデイスホームＢＣ一
５１Ｙ、同ＣＡ−２２０、同ＣＡ−３３０（商品名：日
産油脂社製）など３の消泡剤が必要に応じて使用される
。また、培地中にコリンを添加せしめることによって、
培養時にコリンオキシダーゼの生産能を上昇せしめるこ
とが好ましい。このコリンの添加量としては約０．５〜
１％程度であり、この添加によ・リコリンオ３キシダー
ゼの生産曲ま少なくとも１ぴ音以上上昇する。培養温度
は菌が発育し、コリンオキシダーゼを生産する範囲内で
適宜変更し得るが、特に好ましくは２５〜３０つ○であ
る。 培養時間は条件によって異なるが、通常１５〜５餌時間
程度であって、コリンオキシダーゼが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよい
。かくして得られた培養物中において、コリンオキシダ
ーゼはその菌体内に含有、蓄積されている。 この様にして得られた培養物中よりコリンオキシダーゼ
を抽出し、粗製のコリンオキシダーゼ含有液を得るため
に、例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿
菌体を、必要に応じてトＩＪスー塩酸緩衝液などの溶液
に懸濁せしめ、次いで、リゾチーム処理、超音波処理、
フレンチプレス処理などの種々の菌体処理手段を適宜選
択組合せればよい。 特に、リゾチーム処理により、その収率およびその比活
‘性は良好となる。次いでこの粗製のコリンオキシダー
ゼ含有液を、さらに公知の、蛋白質、酵素などの単離、
精製手段を用いて処理することにより精製されたコリン
オキシダーゼを得ることができる。 例えば、粗製のコリンオキシダーゼ含有液に、アセトン
、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩折法などを
用いて水溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さらに
この沈澱物を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示
すまで精製すればよく、その精製手段としては目的とす
るコリンオキシダーゼの性質を利用した手段を用いれば
よく、例えば上記の沈澱物をトリス−塩酸緩衝液などの
媒体に溶解し、これをジェチルアミノェチルーセルロー
ス、ーデキストランゲル架橋体などの陰イオン交換体、
デキストランゲル、ボリアクリルアマィドゲルなどのゲ
ル炉過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて、精製すればよく、次いで
これを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してコリンオキ
シダーゼの精製粉末を得る。本発明によって得られるコ
リンオキシダーゼは次下に述べる理化学的性質を有する
ものである。 ‘１）作用コリンを酸化してべタィンアルデヒドとなし
、ベタィンアルデヒドを酸化してべタィンとする。 コリンの場合には、１モルのコリンより１モルのべタィ
ンアルデヒドおよび１モルの過酸化水素を生成し、さら
にこのべタィンアルデヒドより１モルのべタィンおよび
１モルの過酸化水素を生成する。 即ち、１モルのコリンより１モルのべタィンおよび２モ
ルの過酸化水素を生成する。またべタインアルデヒドの
場合には、１モル＊のべタインアルデヒドより１モルの
べタインおよび１モルの過酸化水素を生成する。 （２｝ 力価の測定法 Ｚ
Ｏ．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．０５肌
、３の９／叫の４ーアミノアンチピリン０．０５のＺ、
０．１％フェノール０．１０の上、沙．／ｍｇ／ぐーオ
キシダーゼ（ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）０．１０、０．１
Ｍ塩化コリン０．１０の【および蒸留水０．１０の【よ
りなる反応液０．５０の【２に、酵素溶液５仏夕加え、
３７℃にて５分間反応ごてた後これに２．５私のエタノ
ールを加えて反応を止める。 比色は４８仇ｍで行い、酵素活性は、１分間に１仏ｍｏ
ｌｅの過酸化水素を生成する活性を１単位（１皿ｉｔ，
ｌｕ．）とする。また力２価の算出は次式に従う。酵素
活性（Ｕ．／私）＝△Ａ４８ｏ／ｍｉｎ×１４（なお、
△へ８ｏは４８仇ｍの波長における１分間の吸光度変化
を示す）｛３’ 基質特異性
３上言己の力価の測定法における測定法を利用し
て、その反応液中の塩化コリンの代りに、種々の基質（
ベタィンアルデヒド、Ｎーメチルアミノエタノール、Ｎ
，Ｎ−ジメチルアミノエタノール、モノエタノールアミ
ン、ジエタノールア３ミン、トリェタノールアミン）を
用いて、コリンに対する相対活性を求めた基 質
相対活性 コリン １００
．０べタインアルデヒド ５０．
０４Ｎ−メチルアミノエタノール ３．
６ジメチルアミノエタノール ５．２
モノエタノールアミン ０．４
ジエタノールアミン ０．０
トリエタノールアミン ３．６そ
の結果、この酵素は、少なくともコリン、ベタィンアル
デヒドーこ高い活性を示すものと認められる。 【４｝ 至適ｐＨ トリスー塩酸緩衝液を用いて、コリンオキシダーゼのコ
リンに対する酵素活性を測定した結果、第１図に示す通
りであって、その至通ｐＨは８付近と認められる。 ■ 至適温度 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その温
度条件を変えて酵素反応を行ない、コリンオキシダーゼ
のコリンに対する酵素活性を測定した結果、第２図に示
す通りであって、その至適温度は４０ｑｏ付近と認めら
れる。 ■ ＰＨ安定性ＰＨ６〜７はジメチルグルタル酸緩衝液
、ｐＨ７〜８はトリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜１０はグ
リシン−水酸化ナトリウム緩衝液を用いた。 ２５ｍＭの各ｐＨの緩衝液０．１のとに、酵素溶液（酵
素蛋白質濃度１０仏夕／の【）５仏〆を加え、３７００
にて３０分間放置する。 次いでこれに、０．９Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）０．０５のとを加えてｐＨを調節した後、反応液を
加えて、上記の力価の測定法に従って、コリンオキシダ
ーゼのコリンに対する酵素活性を測定した結果、第３図
に示す通りであって、そのｐＨ安定性は８付近と認めら
れる。‘７’熱安定性 酵素蛋白質１０一夕／叫を含有してなる１肌Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１の‘を各温度にて１０分間
放置し、次いで上記の力価の測定法に従って、コリンオ
キシダーゼのコリンに対する酵素活性（残存活性）を測
定した結果、第４図に示す通りであって、酵素は、４０
００付近では安定であり、４０００付近を超える温度で
は急速に低下するものと認められる。 ■ 種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて、
コリンオキシダーゼのコリンに対すＺる酵素活性を測定
した結果、次の通りである。 なお、添加物の内、金属塩の添加量は風Ｍであり、界面
活性剤の添加量は０．１％Ｗ／Ｖである。添 加 量
相対活性ＺＣａＣ１２
１０１．０ＭｇＣ１２
１００．０ＦｅＣ１
３ ０．０Ｚｎ
Ｃ１２ ７．９
ＭｎＣ１２ ９７
．７ＣｏＣ１２
３０．７ＭｏＣ１２
斑．０ＫＣＩ
９３．２ＮａＣＩ
９６．６ＮはＣＩ
ＩＯＯ．０ＬｉＣＩ
９６．６ＢａＣ１
２ １０３．４ト
リトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００（界面活性剤：商品
名：和光純薬工業社製） ９５．５アデカ
トール（Ａｄｅｋａｔｏｌ）ＳＯ−１２０（界面活性剤
：商品名：旭電化工業社製） １０５．７ラウ
リル硫酸ナトリウム ９４．３デオキシ
コール酸ナトリウム ９４．３ッゥィーン（
Ｔｗｅｅｎ）２０（界面活性剤：商品名：和光純薬工業
社製） ９６．６ラゥリルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム ９１．０カチオンＤＴ２０５（界面
活性剤：商品名：日産油脂社製）
６５．９（添加物なし
１００．０）■ 分子量８４０００±２１００〔セフ
アデツクＧ−１５０（商品名：ファルマシア社製）ゲル
炉過法により測定〕６５０００±３０００（ＳＤＳポリ
アクリルアミド電気泳動法：１０％ポリアクリルアミド
ゲル、厚さ２柳のスラブ電気泳動、ＳＤＳ、メルカプト
ェタノール処理、存在下泳動、１肌当り３のＡの条件）
【１０ 等電点 ４．６（キャリア・アンホライトを用いる露気泳動法に
より測定：ＬＫＢ社のキャリア・アンホラィトＰＨ４〜
１０の１１０磁力ラム、低電圧７００Ｖ、４８時間泳動
、１フラクション２の‘にて測定）ＯＵ 電気泳動 ポリアクリルアミドゲル（ｐＨ８．３）を用い、ディス
ク電気泳動法を用いた。 まず、コリンオキシダーゼを亀気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルをアミドブラックにて染色した結果、第５
図の１に示す通り、濃青色の一本の帯のみ認められた。 また、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルを、下記組成よりなる反応液反応液組成０
．２Ｍトリス−塩酸緩衝液 １．０の‘呈
色試液 ２．０羽０．１Ｍ基
質溶液 １．０の【蒸留水
６．０の上１０．０の‘（
ただし、上記反応液組成中、呈色試液とは０．１Ｍトリ
スー塩酸緩衝液１０の‘、５の９／机【０ージアニジン
・エタノール溶液０．３似、パーオキシダーゼ１肌．よ
りなる組成の試液を示し、基質溶液とは基質である塩化
コリンまたはべタィンアルデヒドの水溶液を示す。 ）に浸し、３７℃、２０〜３０分間放置して、現われる
帯を確認した。その結果、基質溶液として塩化コリンを
用いた酵素反応生成物による染色は、第５図の２に示す
通りであって、赤色の一本の帯が認められ、また基質溶
液としてべタィンアルデヒドを用いた酵素反応生成物に
よる染色は、第５図の３に示す通りであって、赤色の一
本の帯が認められた。さらに、これらの染色されたゲル
は水洗後７％酢酸に浸し固定する。さらにまた、この第
５図の１，２，３より明らかな通り、ゲル上に示された
泳動度は全て同一であり、単一の帯を認めることにより
、このコリンオキシダーゼは単一の蛋白質であることが
確認された。 ０２ 作用機序の確認試験 コリンあるし、はべタインアルデヒドを０．０１〜０．
０５りｍｏｌｅ、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１
０仏ｍｏｌｅ、４−アミノアンチピリン１５．０Ａ夕、
フェノール１００仏夕、パーオキシダーゼ０．机．、コ
リンオキシダーゼ０．２５ｕ．を含有する反応液０．５
地を、３７０、２５分間反応せしめ、しかる後２．５の
‘のエタノールを加えて４８瓜ｍ‘こて吸光度を測定し
た。 また、コリン、ベタィンアルデヒドの代りに、定量の過
酸化水素を加えて同様に行なって、検量線を求めた。 その結果は第６図に示す通りであって、図中、ｏ−ｏは
基質としてコリンを用いた場合の測定結果であり、．−
・は基質としてべタインアルデヒドを用いた測定結果で
あり、さらに△−△は基質の代りに過酸化水素を用いた
検量線を示す測定結果であり、これらの図は酵素がコリ
ン１モルより過酸化水素２モルを生成する反応およびべ
タインアルデヒド１モルより過酸化水素１モルを生成す
る反応を触媒することを示すものである。 また上記試料にて、酸素電極を用いて酸素の消費量を測
定した結果、コリン１モルが酸化されるとき酸素２モル
が消費され、ベタィンアルデヒド１モルが酸化されると
き酸素１モルが消費されることを確認した。さらに上記
試料の反応終了物より生成したべタィンの定量は、該反
応終了物をまずｐＨＩに調節し、次いでこれを活性炭処
理した後１０“苦濃縮して、これをライネッケ塩（Ｒｅ
ｉｎｅｃｋｅＳａｌｔ）法により定量して行った、コリ
ン１モルよりべタイン１モル、ベタインアルデヒド１モ
３ルよりべタィン１モルが生成されることを確認した。 以上の通り、本発明の酵素コリンオキシダーゼは、コリ
ンおよびべタィンアルデヒ日こ作用して酸化せしめる際
、補酵素を必要とせず、直接酸素４と反応せしめ、過酸
化水素を生成せしめること、またその分子量が８４００
０±２１００、その等露点が４．６であることなどの理
化学的性質より、公知のコリンデヒドロゲナーゼやべタ
インアルデヒドロゲナーゼと異なったものと認められ、
本発明の酵素コリンオキシダーゼは新規な酵素と認めら
れる。 また上記の理化学的性質の酵素の作用機序の確認試験に
使用した定量手段はその一例であるが、以下に述べる通
り、本発明の新規な酵素コリンオキシダーゼは上記の確
認試験と同様な定量手段、例えば過酸化水素の定量、生
成するべタィンの定量、消費された酸素の定量などの手
段を用いることにより、コリンまたはべタインアルデヒ
ドを含有してなる液体の分析を可能ならしへたものであ
る。またこの酵素はコリンやべタィンアルデヒドの試薬
の純度測定、コリンやべタィンアルデヒドの誘導体を分
解せしめて生成するコリンやべタィンアルデヒドを測定
してなるコリンやべタインアルデヒドの誘導体の定量、
コリンやべタィンアルデヒドの誘導体を分解してコリン
やべタインアルデヒドを生成せしめる酵素の活性測定な
どの酵素的定量の方法を提供するものである。 本発明に使用されるコリンまたはべタィンアルデヒドを
含有してなる液体とは、コリンまたはべタィンアルデヒ
ドそのものの水または水性媒体の溶液であってもよく、
またコリンまたはべタインァルデヒドの誘導体であって
、この譲導体よりコリンまたはべタィンアルデヒドを遊
離せしめたものであってもよい。 また上記水性媒体として、好ましくは、コリンオキシダ
ーゼに対し阻害効果を及ぼさない、例えばトリスー塩酸
緩衝液が挙げられる。さらにコリンの議導体としては、
例えば生体内においてリン脂質として知られている、リ
ゾレシチン、レシチン、スフインゴミエリンさらにアセ
チルコリン、シチジンリン酸コリン、ホスホリルコリン
などの生体内成分や、ベンゾィルコリン、プロピオニル
コリン、ブチリルコリン、サクシニルコリンなどの合成
物であって、要は化学的または酵素的手段にてコリンを
遊離し得るそれらの譲導体であればよい。またこれらの
誘導体よりコリンを遊離せしめる手段としては、例えば
アルカリ分解又は酸分解などの化学的手段が挙げられ、
またクロストリジウム・ウエルチ（ＣＩｏｓ■ｄｉｕｍ
Ｗｅｌｃｈｉｉ）、バチルスｏセレウス（Ｂａｃｍｕｓ
ｃｅｒｅｕｓ）などのホスホリパーゼＣ（Ｐｈｏｓｐ
ｈｏｌｉｐａｓｅＣ）と牛、ブタ、ニワトリの小腸粘膜
、牛の肝臓、ェシェリシァ・コリー（Ｅｓｏｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｊ）などのアルカリホスフアターゼ（Ｍｉ
ｃａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａねｓｅ）との組合せ、キャ
ベツ、ストレプトマイセス・ハチジヨウエンシス（ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｈａｃｈｉＰｅｎｓｉｓ）ＡＩｌ
４３．ストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓｃｈｒｏｍｏｆ船ｃｕｓ）Ａ−０８４
８などのホスホリパーゼＤ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓ
ｅＤ）、牛血球、電気ウナギ、馬血清、人血清などのコ
リンェステラーゼ（Ｃｈｏｌｉｎｅｅｓｔｅｒａｓｅ）
などの酵素的手段が挙られる。 なお上記の酵素およびその由来は何んら限定されるもの
でなく、各々ホスホリパーゼＣ、アルカリホスフアター
ゼ、ホスホリパーゼＤ、コリンェステラーゼの活性を有
しているものであればよい。さらに詳しく述べれば、例
えばホスホリパーゼＣとアルカリホスフアターゼによる
レシチンに対する反応は、次式に示す通りであって、
＊レシチンはホスホリパーゼＣにより、ジグリセリ
ドとホスホリルコリンに加水分解され、さらにこのホス
ホリルコリンはアルカリホスフアターゼに※※より無機
リン酸とコリンに分解されるものである。またホスホリ
パーゼＤによるレシチンに対する反応は次式に示す通り
であり、レシチンはホスホリパーゼＤによりホスフアチ
ジン酸とコリンに加水分解されるものである。 さらにコリンエステラーゼによるペンゾイルコリンに対
する反応は、次式に示す通りであり、ペンゾィルコリン
はコリンェステラーゼにより安息香酸とコリンとに分解
されるものである。 上記の酵素は一例であって、さらにコリンまたはべタィ
ンアルデヒドの誘導体よりコリンまたはべタィンァルデ
ヒドを遊離し得る手段であれば、如何なる手段であって
もよい。なお、これらの前処理を必要とするコリンまた
はべタインアルデヒドの譲導体を用いて対応する酵素を
作用せしめるに当って、その処理は別の工程として先に
行なってコリンまたはべタィンァルデヒドを遊離せしめ
、これをコリンまたはべタィンアルデヒドを含有する液
体としてもよく、または上記の酵素反応が短時間である
ため、別工程とすることなく、対応する酵素および目的
とするコリンオキシダーゼとを同時に加えて、以下に述
べる操作を行なう。この様にして用意された、コリンま
たはべタインアルデヒドを含有する液体に、コリンオキ
シダーゼを作用せしめるのであるが、このコリンオキシ
ダーゼは、緩衝液に溶解した溶液であってもよく、さら
にその酵素活性を劣化せしめない状態に２て、マイクロ
カプセル化手段、樹脂または多糖類などとの共有結合手
段、吸着手段などの公知の酵素固定化手段を施したもの
であってもよい。 またこのコリンオキシダーゼの添加量としては、試料の
量などによって異なるが、酵素による反応時間３を好適
な短時間とせしめるに、１単位以上であればよく、好ま
しくは１．５〜５単位程度である。また用いるコリンオ
キシダーゼの比活性は高いものほど反応にとって良好で
あることは言うまでもないことであるが必ずしも最高純
度のものを要求す３るものではない。このようにして、
該液体にコリンオキシダーゼを添加して、一定時間イン
キュベイトした該液体中には、過酸化水素およびべタィ
ンが生成され、対応した酸素の減少が起きる。 次いで、これらの４過酸化水素、ベタィン、酸素の測定
を行なうのであるが、酸素の測定については、上記した
通り、酸素電極を用いる方法が最も簡便であり、ベタィ
ンについても一例として上記したラィネツケ塩法が好ま
しく、またべタィンをェステル化してガスクロマトグラ
フィ一などによる測定方法もある。また過酸化水素の測
定法としては好ましくは過酸化水素と反応してその色調
に変化を生ずる１種もしくは２種以上の呈色剤からなる
システムによって、比色測定によって測定することが好
ましい。測定する方法としては、例えば、生成する過酸
化水素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタン
化合物とキシレールオレンジによる反応、或はフェノー
ル、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼに
よる反応などを利用する方法などが挙られる。このフェ
ノール、４−アミノアンチピリン、パーオキシダーゼに
よる反応を利用する過酸化水素の測定において、フェノ
ールはコリンオキシダーゼの活性を阻害するため、最小
限の濃度とすることが好ましく、また４ーアミノアンチ
ピリンは生成する過酸化水素量に対し１／２仏ｍｏｌｅ
以上、好ましくは２仏ｍｏｌｅ以上、さらにパーオキシ
ダーゼは０．１ｕ以上、好ましくは０．２〜０．５叫陸
度使用することが望ましい。さらにまた４−アミノアン
チピリンの代りに４−アミノフヱナゾーンを用いてもよ
く、それらの各試薬は溶液としてあらかじめ混合、調製
すればよい。このようにして星色せしめた色調を適当な
波長にて測定し、その検量線より存在する過酸化水素を
定量し、存在するコリンまたはべタィンアルデヒドもし
くはコリンの誘導体またはべタィンアルデヒドの誘導体
の定量、またはコリンの誘導体を加水分解する酵素活性
などの定量を行なう。また上記の方法以外に、２，６−
ジクロルフェノ−ルィンドフェノールとパーオキシダー
ゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、グアャク脂と
パーオキシダーゼの組合せによる過酸化水素の定量測定
、ホモバニリン酸とパーオキシダーゼの組合せによる過
酸化水素の定量測定などの種々の方法が挙げられる。上
記の過酸化水素、ベタィン、酸素の定量において、特に
過酸化水素の定量、さらに過酸化水素をパーオキシダー
ゼおよび呈色剤によって定量する方法が簡便かつ正確で
あるため好ましい。 従って、この過酸化水素、ベタィン、酸素の測定値、お
よびそれらの検量線より、使用した液体中のコリンまた
はべタィンアルデヒドの量的関係を求めればよく、コリ
ンまたはべタインアルデヒドそのものである試薬などの
純度測定においてはそのままの値から容易に求められ、
コリンなどの誘導体を用いて酵素などにて処理した場合
においては、測定値からコリン誘導体の量的関係を求め
るか、測定値から使用した酵素活性の関係を求めること
によって分析されるものである。また上記分析法は、コ
リンオキシダーゼによるコリンのべタィンアルデヒドを
経由したべタィンへの酸化反応を利用した分析手段を挙
げたものであるが、またこの酸化反応過程の中間生成物
たるべタィンアルデヒドまたはその生成量に対応する過
酸化水素を定量してコリンの定量を行ってもよい。しか
しこの生成したべタィンアルデヒドはさらにコリンオキ
シダーゼにより酸化され過酸化水素を生じるため、測定
誤差を生じる欠点を有しており、そのため生成したべタ
インアルデヒドがコリンオキシダーゼによって次工程の
酸化作用を受けないような反応阻害剤、例えばべタィン
アルデヒド容易にシック塩基どを形成する阻害剤やべタ
インアルデヒドデヒドロゲナーゼとＮＡＤまたはＮＡＤ
Ｐとによる反応系路を変更せしめるコリンオキシダーゼ
のべタインへの阻害剤を添加するなどの方法が推定され
る。さらに、これらの分析法において使用される種々の
組成は適宜選択変更されるものであって、またこの分析
法はその分析の目的に応じて、それぞれ適宜選択された
組成を有するキットとして組立てられるものである。 また上記の分析法において使用する、リン脂質よりコリ
ンを遊離せしめるホスホリパーゼＤについて詳しく述べ
る。使用するホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマ
イセス・ハチジョウェンシスＡＩｌ４３菌株やストレプ
トマィセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌株由来の酵
素が挙られ、これらの菌株は、工業技術院微生物工業技
術研究所に各々微生物受託番号「ＦＥＲＭ−ＰＮｏ．１
３２９」（特関昭４８一９９３８６号）、「ＦＥＲＭ−
ＰＮｏ．３５１９」として寄託されている。特にストレ
プトマイセス・クロモフスカスＡ一０８４８菌株「ＦＥ
ＲＭ−ＰＮｏ．３５１９」の菌学的性状、培養手段、精
製手段、さらに得られるホスホリパーゼＤの理化学性質
などを述べれば、次の通りである。菌学的性状‘ａ’形
態 肉眼的観察によれば、胞子を形成した気菌糸は灰色を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄燈色を呈し、可溶性色素
は通常生成しない。 スターチ、無機塩寒天培地上で、３０こ○、１０〜１５
日間培養観察し、顕微鏡観察した所見は次の通りである
。 気菌糸は直径０．６〜０．８仏、波状で単純分枝をなし
て伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。 胞子の連鎖は通常ゆるく１〜３回巻いた螺旋を形成（Ｓ
ｐｉｒａｌｅｓ）し、まれに４〜５回巻いた螺旋もみら
れ、またときには波状または直状で螺旋を形成しないも
の（ＲＦ）もみられる。胞子は球形ないし楕円形で、大
きさは０．６〜０．８×０．７〜０．９仏であり、表面
にとげ状の突起を形成している。基生菌糸は分枝をもっ
て屈曲状に伸長し、直径０．４〜０．６仏で、菌糸の分
裂や胞子の着生は認められない。鞭毛胞子や胞子のうち
の着生も認められない。【ｂ｝ 全菌体分析によるジア
ミノピメリン酸の分析べネッッ（茂ｎｎｅｔｔ’ｓ）塔
地で５日間振濠培養した菌体をべッカー（技ｃｋｅｒ）
らの方法〔アプライド・マイクロバイオロジ−（Ａｐｐ
ｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏ難）１２｛５）４２１
一４２３（１９６４）〕で分析した結果、ＬＬージアミ
ノピメリン酸が検出され、メソ（ｍｅｓｏ）−型は検出
されなかった。 【ｃー 培養的性状 下記の培地を用い、３０午０、２０日間培養観察した性
状は、次に示す通りであって、色の表示は「カラー・ハ
ーモニ・マニュアル」に従った。 【１｝ シュクロース・硝酸塩寒天培地生育：僅少、無
色。 気菌糸：僅少。 可溶性色素：生じない。 【２１ グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、パステル・オレンジ（Ｐａｓ
に１のａｎｇｅ；４ｉｃ）。 気菌糸：生じない、ないし僅少。 可溶性色素：ヌード・タン（ＮｕｄｅＴａｎ；蜜ｃ）、
僅かに生じる。 ‘３’グルコース・アスパラギン寒天培地生育：中程度
、バンブー（母ｍＰわ：がｄ）ないしアンバー（Ａｍは
ｒ；３ｐｅ）。 気菌糸：貧弱ない中程度、ホワイト （Ｗｈｉに；ａ）。 夕可溶性色素：生じない。｛４
）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：中程度、コ
ールデン・ブラウン （ＧｏｌｄｅｎＢｒｏｗｎ；３ｐｇ−３ｐｉ）。 気菌糸：中程度、シルバー・グィ（ＳｉｌｖｅｒＪＯＧ
ｒａｙ；紬ｅ）ないしナチュラル（Ｎａｔｕｒａｌ；桝
ｃ）。可溶性色素：生じない。｛５’ スターチ・無機
塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・ブＺタラウン（
３ｐｉ）ないしクロフ・ブラウン（ＣｌｏｖｅＢｒｏｗ
ｎ：３ｐｌ）。 気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グレイ（群ｅ）
ないしナチュラル（幻ｃ）、一部ホワイト（ａ）。 ２０可溶性色素：生じない。
■ チロシン寒天塔地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・フラウン（３ｐ
ｇ−３ｐｉ）。 気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グ２５レイ（３
ｆｅ）ないしナチュラル（紅ｃ）。 可溶性色素：生じない。｛７｝ グリセリン・スターチ
・グルタメィト寒天培地生育：中程度ないし良好、ルス
ト・タン３０（Ｒ聡ｔ Ｔａｎ；舷ｃ）ないしメイプル
（Ｍａｐｌｅ：４１ｅ）。 気菌糸：中程度、オィスター・ホワイト （０ｙｓにｒＷｈｉｔｅ；ｂ）ないしライト・グレイく
Ｌｔ．Ｇｒａｙ；Ｃ）。 ３タ可溶性色素：生じない。｛
８） オート・ミル寒天培地 生育：中程度ないし良好、マスタード・ゴールド（Ｍｕ
ｓｔａｒｄＧ℃ｌｄ；机ｅ）ないしゴールデン・ブラウ
ン（３ｐｇ）。 ４０気菌糸：中程度ないし良好、ナチ
ュラル（紅ｃ）ないしベイジ・ブラウン（Ｂｅｉ袋Ｂｒ
ｏｗｎ；３ｉｇ）。 可溶性色素：生じない。 ■ イースト・麦芽寒天培地 生育：中程度ないし良好、アンバー （母ｃ）ないしイエロー・メイプル（ＹｅｌｌｏｗＭａ
ｐｌｅ；紬ｇ）。 気菌糸：中程度、シルバー・グレィ （乳ｅ）ないしベイジ・ブラウン（３ｉｇ）ないしベイ
ジ（滋ｃ）。 可溶性色素：生じない。 胤 栄養寒天塔地 生育：中程度、アンバー（３ｐｅ）。 気菌糸：僅少ないし貧弱、ホワイト （ａ）。 可溶性色素：生じない。 ＯＵ べプトン・イースト・鉄寒天培地 生育：中程度ないし良好、無色、裏面；ゴールデン・ブ
ラウン（３ｐｇ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ−３ｐｉ）
。 ０２ トリプトン・イーストエキス培地 生育：良好、アンバー（３ｎｃ−３ｐｃ）。 気菌糸：生じない。可溶性色素：生じない、ないしゴー
ルデ ン・ブラウン（３ｐｇ）。 ０３ グルコース・ベプトン・ゼラチン培地生育：貧弱
、コールデン・ブラウン（３ｐｇ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：ゴールデン・ブラウン （３ｐｉ）。 肌 脱脂乳培地 生育：良好ないし極めて良好、ライト・アンバー（Ｌｔ
Ａｍはｒ；３ｉｃ）ないしライト・タン山上Ｔａｎ；穣
ｃ）。 気菌糸：生じない。 可溶性色素：メイプル（４１ｅ）ないしパステル・オレ
ンジ（４ｉｃ）。 ー 生理的性状 ｛１１ メラニン様色素の生成：べブトン・イースト・
鉄寒天塔地で陽性、トリプトン・イーストエキス培地で
凝陽性、チロシン寒天塔地で陰性。 ‘２ー ゼラチンの液化：グルコース・ベプトン・ゼラ
チン培地で陽性。 〔３｝ スターチの加水分解：スターチ・無機塩寒天塔
地で陽性。 ｛４’脱脂乳：凝固：陰性、ベプトン化；陽性■ 炭素
源の同化性：Ｄーグルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄー
マンニツト、Ｌーラムノース、Ｄ−キシロースは陽性、
ィノシトール、ラフィノースは凝陽性、シュクロースは
陰性。 ｛６｝ 生育温度：１０〜４７午０。 以上の通り、本菌株は分裂を生じない真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖をもつ気菌糸を生じ、また菌糸の
直径および胞子の大きさ、さらに細胞壁にＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸を含有することなどよりストレプトマィセ
ス属に属するものと認められる。 また本菌株の特徴として、気菌糸は灰色を呈し、胞子の
連鎖は主として螺旋を形成し、胞子の表面はとげ状を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄燈色で、通常可溶性色素
を生成せず、メラニン様色素はべプトン・イースト・鉄
寒天培地で生成し、チロシン寒天培地では生成しないこ
と、および炭素源の同化能は比較的広範囲に及んでいる
ことなどが挙られ、このような特徴を有する菌種を種々
の文献より検索すれば、ストレプトマイセス・クロモフ
スカス〔プロプレムス・オブ・クラシフイケイシヨン・
オプ・アクチノマイセテスーアンタゴニスツ（Ｐｒｏｂ
ｌｅｍｓ ｏｆｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ ａ
ｃｔｊｎｏｍｙｃｅｔｅｓ−ａｎｔａ■ｎｉｓｔｓ）１
７６−１７７（１９５７）、インターナショナル・ジヤ
−ナル・オブ・システマテイク・／ゞクテリオロジー（
ｌｎｔｅｒｎａｔｉ○ｎａＩ Ｊｏｕｒｎａｌ ○
ｆ ＳｙＳにｍａｔｉＣＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）
１熱４｝３０７−３０９（１９６８）、アプライド・マ
イクロバイオロジー（ＡｐｐｌｉｅｄＭｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ）６５２−７９（１９５８）〕が類似菌として
挙られ、さらに本菌株とストレプトマィセス・クロモフ
スカスとを詳細に比較すれば、形態的にはストレプトマ
ィセス・クロモフスカスの方が螺旋の形成がやや良好な
こと、培養的性状においてグリセリン・スターチ・グル
タメィト寒天塔地およびグリセリン・硝酸塩塔地上で可
溶性色素の生成の有無などの相違が両菌株の比較実験に
て認められたものの、これらの多少の相違は菌株間の相
違と認め、他の諸性状においてはよく一致していること
より、本菌株をストレプトマィセス・クロモフスカス（
プレオブラソエンスカラ・エト・オル）プリダム・エト
・オル〔ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓＣｍｏｍｏｆ船Ｃｕ
Ｓ（ＰｒｅｏｂｒａＺｈｅ船ｋａｙａ ｅｔ ａｌ ）
Ｐｒｉｄｈａｍｅｔａｌ〕に属するものと同定し、本菌
株をストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８
と命名した。次いで、本菌株を培養してホスホリパーゼ
Ｄを得るに当って、本菌株を、酵素を生産する通常の方
法で培養すればよく、その培養の形態は通常液体培養を
行なうが、工業的には深部通気蝿梓培養を行なうのが有
利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常
用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては同
化可能な炭素化合物であればよく、例えばブドウ糖、シ
ョ糖、乳糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリ
ンなどが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素
化合物であればよく、例えばコーン・スチーブ・リカー
、大豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ベプトン、肉エキス
、酵母エキス、乾燥酵母、カゼイン加水分解物などが使
用される。その他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウ
ム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に
応じて使用される。培養温度は本菌が発育し、ホスホリ
パーゼＤを生産する範囲内で適宜変更し得るが、特に好
ましくは２５〜３０ｏ○であり、また培養時間は条件に
よって異なるが、ホスホリパーゼＤが最高力価に達する
時期をみはからつて適当な時期に培養を終了すればよく
、通常、２〜４日程度である。このようにして得られた
培養物からホスホリパーゼＤを採用するのであるが、本
酵素は水に易溶性であって、主として培養液中に存在す
る。培養液中に存在するホスホリパーゼＤは、培養炉液
を濃縮するか、もしくは濃縮することなく可溶性塩類、
例えば硫安などで半飽和または飽和沈澱させるか、また
は親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、ア
セトなどを添加することにより沈澱させることができる
。沈澱物は水または緩衝液に溶解し、半透膜で透析する
ことにより低分子不純物を除去することができる。また
吸着剤、イオン交換体あるいはゲル炉過剤などを用いて
不純物を除去してもよい。これらの手段により得られる
酵素溶液を、減圧濃縮、凍結乾燥などの操作により処理
して固形の粗製ホスホリパーゼＤを得ることができる。
さらにこの粗製ホスホリパーゼＤは、蛋白質、酵素など
の精製に通常用いられる手段、例えば吸着剤、イオン交
換体、ゲル炉過剤などを用いて精製され、さらにジェチ
ルアミノェチルセルロースおよびデキストランゲル架橋
体（商品名：セフアデックスＧ−５０）カラムクロマト
グラフィーにより精製される。次にホスホリパーゼＤの
理化学性質について述べる。将１）作 用 リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのェステ′結合に作用
してリン化合物と相当する含窒素基と遊離する。 レシチンについての作用を例示すれば次式の通りである
。｛２） 力価の測定法 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）０．１のと
、０．１ｍＭレシチンェマルジョン０．１の‘、０．１
Ｍ塩化Ｚ力ルシウム０．０５の【、１％トリトンＸ−１
０００．１帆、水０．１の‘よりなる反応液に、酵素溶
液０．０５の‘を加え３７ｏｏ、１０分間反応させた後
、５分間煮沸して反応を停止した。 次いで反応液を３７ｑ０まで冷却し、これに、４ーアミ
ノアンチピリン２（３雌／奴）０．１の‘、狐．／舷パ
ーオキシダーゼ０．１のと、０．１％フエフール０．仇
‘、１狐．／泌コリンオキシダーゼ０．１のと、水０．
１のとを加えて３７ｏ０、２０分間反応せしめた後１％
トリトンＸ−１００２のとを加え、６０仇ｍの吸光度を
求めた。ホスホリパ２ーゼＤ、１単位（Ｕｎｉｔ．Ｕ．
）は１分間にＩＡｍｏｌｅのコリンを生成せしめる酵素
活性と定めた。また力価の算出は次式に従った。Ｕ．／
机ニ△Ａ５００×〇．５５ （式中、△ふｏｏは５００ｎｍにおける吸光度を示３す
）糊 基質特異性 上言己の力価の測定の反応液において、基質としてレシ
チン、リゾレシチン、スフインゴミエリンのエマルジョ
ン（１仇ｈＭ、０．１のと）を用３い、同様の操作を行
ない、コリンの定量をして、リゾレシチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求めた。 基 質 相対活性レシチン
５１％４０スフインゴミエリ
ン １９％リゾレシチン
１００％‘４１ｐＨ安定性ｐＨ５：
酢酸緩衝液、対６〜７：ジメチルグルタス酸−水酸化ナ
トリウム緩衝剤、ｐＨ８〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐ
ＨＩＯ：グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（各々１０
ｈＭ）の各ｐＨで、酵素溶液（１の９／肌）を、３７０
、６０分間インキュベィトした後、上記の力価の測定法
に従ってホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第７図
に示す通り、酵素はｐＨ７〜９で比較的安定であると認
められる。 ‘５’至適ｐＨ ＰＨ６〜７．５：ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７〜９：トリス−塩酸緩衝液、ｐＨ９〜
１０：グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液の各々の緩衝
液を用い、上記の力価の測定法に従ってホスホリパーゼ
Ｄの活性を求めた結果、第８図に示す通りであって、そ
の至薄ｐＨは７．５〜８付近と認められる。 ｛６｝ 熱安定性 １肌Ｍトリス‐塩酸緩衝液（ＰＨ８．０）、酵素溶液濃
度（１秘／のと）の条件で、４０，５０，６０，７０，
８０ｄｏの各々の温度にて１０分間インキュベイトした
後、上記の力価の測定法に従ってホスホリパーゼＤの活
性を求めた結果、第９図に示す通りであって、酵素は７
０ｑｏまで安定である。 ‘７１血清リン脂質への作用条件１の試料 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．２
の‘市販品血清 ０．５の‘
〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１泌−６血．／奴ホスホリパーゼＤ
Ｏ．１の【蒸留水 ０．
１の‘条件２の試料０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０） ０．物上市販品血清
０．５の‘〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１の‘６肌．／肌ホスホリパーゼＤ
Ｏ．１の【ホスファチジン酸ホスフアター
ゼ か．蒸留水 ０
．１の【条件３の試料０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０） ０．２叫市販品血清
０．５の‘〇．ＩＭＣａＣ１２
０．１泌蒸留水
０．２の‘Ｚなお、上記各条件における試料
に用いた、市販品血清はハィランド（Ｈｙｌａｎｄ）社
製の製品であり、ホスフアチジン酸ホスフアターゼはス
トレプトマイセス・ミラピリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｅｓｍｉｒａｂｊｌｉｓ）Ａ−２３１３菌株よりＺ得ら
れたホスフアチジン酸ホスフアターゼ（特開昭５０−１
４２７８び号）である。 上記の条件で、１，２および３の試料を３７℃、３０分
間反応せしめた後、各々にクロロホルム：メタノール（
２：１）６叫、次いで水１の【を加えて充分混合し、３
００仇ｐｍ、１０分間遠心分離し、そのクロロホルム層
を回収した。 このクロロホルム層を減圧乾固し、シリカゲルＧ（東京
化成工業社製）にて薄層クロマトグラフィーを行ない（
展開溶媒；クロロホルム：メタノール：水＝６５：２５
：３）、プレート乾燥後、モリブデンブルー試薬により
、リン脂質の確認を行なった。また、標準リン脂質とし
て、ホスフアチジルエタノールアミノ、ホスフアチジル
コリン、スフインゴミエリン、リゾホスフアチジル３コ
リン、ホスフアチジン酸を用いて、上記と同一の条件で
薄層クロマトグラフィーを行なった。その結果、第１０
図に示す通りであって、、１は条件１の試料のスポット
、２は条件２の試料のスポット、３は条件３の試料のス
ポット、４はホスフアチジルエタノールアミン、ホスフ
アチジルコリン、スフインゴミエリンおよびリソホスフ
アチジルコリンよりなる標準リン脂質のスポット、５は
ホスフアチジン酸である標準リン脂質のスポットを示し
、Ａは標準リン脂質より判明したホスフアチジルエタノ
ールアミンのスポット、Ｂは同様ホスフアチジルコリン
、Ｃは同様スフィンゴミェリン、Ｄは同様ホスフアチジ
ン酸、Ｅは同様ＩＪゾホスフアチジルコリンを示す。 第１０図より、血清（条件３の試料）中にはホスフアチ
ジルェタノールアミン、ホスフアチジルコリン、スフイ
ンゴミェリンおよびリゾホスフアチジルコリンが存在す
ることが明らかである。この血清にホスホリパーゼＤを
作用せしめる（条件１の試料）とホスフアチジン酸のみ
存在する。さらにこの血清にホスホリパーゼＤおよびホ
スフアチジン酸ホスフアターゼを作用せしめる（条件２
の試料）と全くスポットが見られないことより、血清中
のリン脂質はホスホリパーゼＤによりホスフアチジン酸
にまで分解‐され、さらにこのホスフアチジン酸がホス
フアチジン酸ホスフアターゼにより無機リン酸とジグリ
セリドに分解されたと推定される。またこの結果は、こ
のホスホリパーゼＤが、血清中のホスフアチジルェタノ
ールアミンをも基質とし得る酵素であることを示してい
る。このホスホリパーゼＤ即ちストレプトマイセス・ク
ロモフスカスＡ−０８４８菌株より得られるホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマイセス・ハチジョウェンシスＡ
Ｉｌ４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ（特開昭４
８一９９３８６号）よりも至適ｐＨ、ｐＨ安定性、熱安
定性においてより優れており、さらにストレプトマイセ
ス・ハチジヨウエンシスＡＩｌ４３菌株はホスホリパー
ゼＤのほかにホスホリパーゼＣをも生産する（持開昭４
９−５５８９３号）ため、ほぼ完全な精製を行なわない
限り、その最終標品にホスホリパーゼＣの混入を伴い、
これによる副反応を生じる欠点を有している。 従って、本発明に使用されるリン脂質の分析定量用のホ
スホリパーゼＤとしてはストレプトマイセス・クロモフ
スカスＡ−０８５８菌株より得られるホスホリパーゼＤ
が好ましい。次に、本発明におけるコリンオキシダーゼ
の製法およびその酵素を用いてなる種々の分析法を具体
的に述べるが、本発明はこれらによって何んら限定され
るものではない。実施例 １ コリン１．０％，ＫＣＩＯ．５％，Ｋ２ＨＰ〇４０．１
％，ＭｇＳ０４・７日２００．０５％、酵母エキス０．
２５％、フィシユ・ソルブル（Ｆｉｓｈｓｏｌｕｂｌｅ
）１．０％、デスホームＣＡ−２２００．１％よりなる
培地１００机【（ｐＨ７．２）を５００の‘客三角フラ
スコに加え、１２０ｑｏ、２０分間滅菌処理し、次いで
これにアースロバクター・グロビフオーミスＢ−０５７
万菌株を接種し、３ぴ０、１日間培養して種菌を得た。 次いで、この種菌を、上記と同一組成を有す培養液１０
そを有してなる滅菌後の３０そ容ジャー・フアメンター
に移植し、３０℃、２日間、２０比ｐｍ、２０そ／ｍｊ
ｎの滅菌空気の条件下通気魔梓培養し、得られる培養液
を遠心分離して集菌し、この菌体を１仇ｈＭトリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ＭＭＥＤＴＡ（エチレンジ
アミンテトラアセティクアシド）、１％ＫＣＩよりなる
溶液１れこて洗浄した。この洗浄菌体を１その他ｈＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、２ｈＭＥＤＴＡ、１％ＫＣ
Ｉよりなる溶液に懸濁し、これにリゾチーム（長瀬産業
社製、塩化リゾチーム）２００の９を加え、３７Ｃ０、
３０分間蝿拝した。リゾチーム処理後、溶液を５００仇
ｐｍ、１５分間遠心分離し、得られた上清液にアセトン
１夕を加えて析出する不純物を遠心にて除去し、さらに
これにアセトンを加えて６５％アセトン濃度とし、次い
で５００仇ｐｍ、１５分間遠心分離して沈澱物を回収し
、これを４０の‘の１仇ｈＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）、２ｈＭＥＤＴＡ、１％ＫＣＩよりなる溶液に
溶解し、不熔部分は遠心して除去した。次いでこれに６
０の‘の飽和硫安溶液を加えて１５分間燭拝した後、１
２００仇ｐｍにて１５分間遠心分離を行い、得られた沈
澱物を１５の‘の肋ｈＭリン酸緩衝液（ＰＨ７．０）、
机Ｍ旧ＤＴＡよりなる溶液に溶解し、これを流速３０の
とノｈｒにてセフアデツクスＧ−２５（Ｓｅｐｈａｄｅ
ｘＧ−２５）のカラムに通じて脱塩した後、得られた溶
液を、ｐＨ７．０で緩衝化したＤＥＡＥ−セルロースカ
ラム（カラム径２．０×７．０ｃの）に通じて酵素を吸
着せしめ、さらに０．２Ｍ〜０．弧のＫＣＩのィオン強
度勾配を用いて溶出せしめた。約０．４ＭＫＣＩ濃度で
の溶出画分を回収して活性画分１７２叫を得た（流速：
１．４の‘／ｍｉｎ、１フラクション；６の‘）。さら
にこの活性画分１７２の‘を透析膜（セルロースアセテ
ート）にて７時間透析せしめ（外液：５ｍＭリン酸緩衝
液、２ｈＭＥＤＴＡよりなる溶液）、次いでこの透析液
を凍結乾燥した。得られた凍結乾燥物を、１０の上の１
仇ｈＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、２ｈＭＥＤ
ＴＡ、１％ＫＣＩよりなる溶液に溶解せしめた後、セフ
アデツクスＧ−２００を用いたカラムクロマトグラフイ
ーを行ない（カラム径：２．８×９．５仇、流速：０．
１８の【／ｍｉｎ、１フラクシヨン：６叫）、そのフラ
クシヨンＮｏ．４２〜４８の活性画分を回収し、凍結乾
燥した。次いで同様のセフアデックス操作を行った。こ
の得られた凍結乾燥物は、先の霞気泳動の結果において
述べた通り、唯一の蛋白質の帯を示すものであった。全
活性 全蛋白質量 比 活 性菌 体抽 出 液 ９９
８ｕ． ７６８吻 ０１がス似ァセトン沈澱 ９００
ｕ． ５８の咳 １．５５ｕん牧硫 安 沈 澱
８２５ｕ． ３０肌夕 ２７５ｕ×物ＤＲＡＢ−せ
ぬース ４２０ｕ． １１９咳 ３．６５ｕス燐。 セフをきる伽 ３９０ｕ‐５８‐郷 ６‐７０ッ似セフ
アテツクスＧ−２ｏｏ（２） ３８０ｕ． ５５．動
物 ６．８０ｕ〆雌また各採取工程における、コリン
オキシダーゼの全活性、全蛋白質量、比活性は上記表に
示す通夕りである。 参考例 １ （コリンの定量） 過酸化水素０．０１〜０．０５山ｍｏｌｅ、トリスー塩
酸緩衝液（ｐＨ８．０）１仏ｍｏｌｅ、４−アミノアン
チピリ０ン１５０〃夕、フェノール２００仏夕、パーオ
キシダ−ゼ０．か、コリンオキシダーゼ０．２５ｕ．を
含有する反応液０．５地を、３７℃にて２５分間反応せ
しめた後エタノール２．５偽を加えて４８仇ｍにおける
吸光度を測定して、過酸化水素の検量線を得た。 ５ 次いで、上記の反応液中の過酸緩水素の代りに塩化
コリンを加え、同様に行なってその吸光度を測定し、過
酸化水素の検量線よりコリンを定量した。 参考例 ２ （ベタィンアルデヒドの定量） 上記参考例１のコリンの代りにべタィンアルデヒドを用
いて同様に行なうことにより、ベタィンアルデヒド試薬
のべタィンアルデヒド純度を測定した。 参考例 ３ （リン脂質の定量） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１
５奴【３の９／机４−アミノアンチピリン ０．５
０凧【０．１％フ工／ール ０
．３０の【１％トリトンＸ−１００
０．３０の‘１仇ｈＭＣａＣ１２
０．３０の【１５ｕ／の‘コリンオキ
シダーゼ ０．１０の【狐／泌パーオキシダー
ゼ ０．１０の‘１か／叫ホスホリパーゼ
Ｄ Ｏ．１０の【蒸留水
１．１５の【３．００の‘シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した卵黄レシチン或
は市販品血清（ハィランド社製）を各々添加し、３７０
０、２０分間反応せしめた後、５０仇ｍにて比色測定し
た結果、第１１図および第１２図に示す通りである。 （第１１図は卵黄レシチンに対する測定結果を示し、第
１２図は市販品血清に対する測定結果を示す。この第１
１図（卵黄レシチンの測定結果）と先の過酸化水素の検
量線とより、卵黄レシチン中の遊離されたコリン量が算
出され、さらにこのコリン量より卵黄レシチンのモル数
が求められる。同様、この第１２図（血清の測定結果）
と先の過酸化水素の検量線とより血清中のリン脂質が定
量される。なお、上記方法に用いたホスホリパーゼＤは
、ストレプトマィセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌
株より得られたホスホリパーゼＤであって、その使用量
は一般に０．５ｕ．以上、好ましくは１〜５ｕ．程度で
ある。参考例 ４（コリンェステラーゼの測定） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．０
５私３の９／叫４ーアミノアンチピリン ０．０５
の【０．１フエノール
０．１０の‘狐．／私パーオキシダーゼ
０．１０の【２０ｕ．／泌コリンオキシダーゼ
０．２０の‘５■ｈＭペンゾイルコリン
０．０２の【〇．５２のＺ生理食塩水にて１針音
希釈したヒト血清（健康人より採取）を加え、３７０、
３び分間反応せしめ、次いでこれに０．２ｍＭネオスチ
グミン溶液（コリンェステラーゼ阻害剤）３．０似加え
た後さらに室温下１０分間放置して５０Ｍｍにて比色測
定した結果、第１３図に示す通りであって、血清中コリ
ンェステラーゼ活性は、反応液中のペンゾィルコリンよ
り遊離されたコリンの量より（コリンはコリンオキシダ
ーゼ、パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリン、フ
ェノール系により定量）測定されたものであって、この
吸光度より血清中コリンェステラーゼの活性が求められ
る。 またコリンヱステラーゼの活性は、血清１．０の【中の
酵素が３７℃で１分間に２仏ｍｏｌｅの過酸化水素を生
じたとき、ｌｕ．として表わすことができる。活性ｕ．
／の‘＝△Ａ５の／ｍｉｎ×４．８上記コリンェステラ
ーゼ、ベンゾィルコリンの組合せの代りに他のコリン誘
導体の加水分解酵素および他のコリン誘導体を粗合せて
用いることにより種々の酵素活性の測定や、コリン誘導
体の定量に使用し得る反応系を設定し得る。 参考例 ５ べプトン２％、ラクトース２％、ＮａＣＩＯ．１％、Ｋ
Ｈ２Ｐ０４０．０５％、ＭｇＳ０４・７日２００．０５
％、デスホームＢＣ−５１ＹＯ．５％よりなる組成の培
地１００の‘を有する５００の上客三角フラスコ（１２
０℃、２０分間滅菌処理）にストレプトマイセス・クロ
モフスカスＡ−０８４８菌株を接種し、２６ｑｏ、３日
間培養して種菌を得、これを上記と同一組成よりなる培
地２０〆を有する３０そ客ジャーファーメンタ−に移植
し、２６℃、２日間、３０仇ｐｍ、２０〆／ｍｉｎの条
件下通気燈枠培養した。 この培養液は０．５ｕ／の‘の活性を示す。この培養物
を遠心分離して得た培養炉液１８そを３夕になるまで減
圧濃縮し、この濃縮液にアセトン２．４そを加え、生じ
た沈澱物を遠心分離して除去した。得られた上情液にさ
らにアセトン２そを加えて生じた沈澱物を遠心分離にて
回収し、これを５００叫の精製水に溶解せしめた後、こ
れにアセトン３５０の‘加えて沈澱する不純物を遠心分
離により除去し、その上清液にアセトン３３０の‘を加
えて生じた沈澱物を遠心分離により回収し、これを２０
０の‘の精製水に溶解した。これに、飽和硫安溶液２０
０叫を加えて生じた沈澱物を遠心分離により回収した後
、これを５０の‘の精製水に溶解し、セファデックスＧ
−２５により脱塩した後凍結乾燥して５ｕ．／雌の活性
を有する粗製ホスホリパーゼＤの粉末７００雌を得た。
本発明においては、この粗製ホスホリパーゼ０をそのま
ま利用したものであって、必ずしも完全に精製したもの
を必要とするものではなく、またこの粗製ホスホリパー
ゼＤは上記記載の一般的手段にて精製し、この精製ホス
ホリパーゼＤを用いてもよい。図面の簡単な説明第１図
はコリンオキシダーゼの至適ｐＨを示し第２図はコリン
オキシダーゼの至適温度を示し、第３図はコリンオキシ
ダーゼのｐＨ安定性を示し、第４図はコリンオキシダー
ゼの熱安定性を示し、第５図はコリンオキシダーゼの雷
気泳動図を示し、第６図はコリン・ベタィンアルデヒド
および過酸化水素の検量線を示し、第７図はホスホリパ
ーゼＤのｐＨ安定性を示し、第８図はホスホリパーゼＤ
の至造ｐＨを示し、第９図はホスホリパーゼＤの熱安定
性を示し、第１０図はホスホリパーゼＤの血清リン脂質
の分離作用を示す薄層クロマトグラムを示し、第１１図
は卵黄レシチンの定量結果を示し、第１２図は血清リン
脂質の定量結果を示し、第１３図はヒト血清コリンェス
テラーゼ活性の測定結果を示す。 第１図 第２図 第３図 第４図 第５図 第６図 第７図 第８図 第９図 第１０図 第１１図 第１２図 第１３図
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 下記の理化学的性質を有する新規なコリンオキシダ
ーゼ。 （ａ）基質特異性：一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は−ＣＨ＿２ＯＨ基または−ＣＨＯ基を
示す。 ）で表わされる化合物（ｂ）酵素作用：反応式〔I〕お
よび／または〔II〕▲数式、化学式、表等があります▼ （ｃ）至適ｐＨ：８付近（トリス−塩酸緩衝液）（ｄ）
安定ｐＨ範囲：８付近（トリス−塩酸緩衝液）（ｅ）等
電点：４．６（キヤリア・アンホライトを用いる電気泳
動法）（ｆ）分子量：８４０００±２１００〔セフアデ
ツクスＧ−１５０（商品名）ゲル濾過法〕（ｇ）至適温
度：４０℃付近（トリス−塩酸緩衝液）（ｈ）熱安定性
：ｐＨ８において４０℃付近まで安定（トリス−塩酸緩
衝液）２ アースロバクター属に属するコリンオキシダ
ーゼ生産菌を培地に培養し、その培養物からコリンオキ
シダーゼを採取することを特徴とする新規なコリンオキ
シダーゼの製法。 ３ 培地にコリンを含有せしめてなる特許請求の範囲第
２項記載の新規なコリンオキシダーゼの製法。 ４ アースロバクター属に属するコリンオキシダーゼ生
産菌がアースロバクター・グロビフオーミスＢ−０５７
７菌株である特許請求の範囲第２項または第３項記載の
新規なコリンオキシダーゼの製法。 ５ 培養物からコリンオキシダーゼを採取するに際し、
その培養菌体をリゾチーム処理してなる特許請求の範囲
第２項、第３項または第４項記載の新規なコリンオキシ
ダーゼの製法。
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