KR960015263B1

KR960015263B1 - 신규의 모노글리세라이드 리파제를 이용한 모노글리세라이드의 분석방법

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Publication number: KR960015263B1
Application number: KR1019880003676A
Authority: KR
Inventors: 시게유끼 이마무라; 마모루 타까하시; 히데오 미사끼; 카즈오 마쯔우라
Original assignee: 아사히 가세이 고오교 가부시끼가이샤; 유미꾸라 레이이찌
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1988-04-01
Publication date: 1996-11-07
Also published as: EP0285101A1; DE3889577T2; EP0285101B1; JPS63245672A; KR880012754A; DE3889577D1; US5079158A

Abstract

내용없음.

Description

신규의 모노글리세라이드 리파제를 이용한 모노글리세라이드의 분석방법

제 1 도는 본 발명의 모노글리세라이드 리파제에 대한 최적 pH 곡선이다.

제 2 도는 상기 효소의 최적온도 곡선이다.

제 3 도는 상기 효소의 pH 안정성에 대한 곡선이다.

제 4 도는 상기 효소의 열적안정성에 대한 곡선이다.

제 5 도는 상기 효소에 대한 정제 단계에서의 용출프로파일이다.

제 6 도는 모노글리세라이드에 대한 보정 곡선이다.

본 발명은 신규의 모노글리세라이드 리파제와 그 제조방법 및 췌장리파제의 효소활성에 대한 분석방법 뿐만 아니라 신규의 모노글리세라이드 리파제를 사용한 분석방법에 관한 것이다.

미생물로부터 고등동물에 이르기까지 넓은 범위의 유기체내에 존재하는 것으로 알려져 있는 모노글리세라이드 리파제는 모노글리세라이드 뿐만 아니라 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에도 작용하는 것으로 알려져 있다. ["코소 핸드북(엔자임 핸드북)"424페이지, 아사꾸라쇼덴 K·K에 의하여 1982년 12월 1일 발간]

또 다른 모노글리세라이드 리파제로서 스타필로코카스 속의 특정균주로부터 유도된 것이 알려져 있다(일본국 특허출원 공개번호 42532/1980). 이 효소도 또한, 모노글리세라이드외에 트리글리세라이드에 대하여도 기질특이성을 갖고 있으므로 이에 대하여도 작용하며, 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖고 있다. 그 최적 pH은 pH11이다.

또한 최적온도는 "애디올(Ediol)"(상표명, 코코넛 기름 유탁액)을 기질로서 사용할때, 37-50℃의 범위에서 높은 활성을 나타내며, 37-40℃ 부근에 활성피크가 존재한다.

또한 그 분자량이 약 174,000이며, 등전점은 2.56이다.

더욱이 55℃ 이상에서는 급격히 불활성화되며, 70℃에서는 10분내에 불활성화된다.

한편 리파제의 활성에 대한 공지의 분석방법으로서는 트리올레인 유탁액을 사용하는 탁도측정법, 합성기질을 사용하는 비색측정법(일본국 특허출원 공개번호 254,197/1986), 유리된 지방산으로 적정하는 적정법, 천연기질로서 1,2-다이글리세라이드를 사용하거나, 합성기질을 사용하여 생성된 지방산을 측정하는 효소적 측정법(일본국 특허출원 공개번호 888/1983과 91,898/1984) 등이 있다.

종래의 모노글리세라이드 리파제는 모노글리세라이드 뿐만 아니라 상기한 바와 같이 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에 대하여도 작용하므로 리파제의 활성에 대한 측정방법에 있어서 합성기질로부터 유리된 모노글리세라이드만을 측정하는 데에는 사용할 수 없었다.

더욱이 스타필로코카스 속의 미생물 균주로부터 얻은 모노글리세라이드 리파제는 트리글리세라이드와도 반응하며, 그 분자량이 크고, 최적 pH가 높으며, 열에 불안정하기 때문에 그 어느 것도 사용될 수 없었다.

전술한 바와 같이 문제점들을 고려하여 본 발명자들은 광범위한 연구를 수행하였다.

그 결과 일본의 카꼬시마현키리시마의 온천장의 온천부근 토양으로부터 분리된 바실러스 H-165 미생물균주가 적어도 다음의 반응식(a)

(a) 모노글리세라이드+H₂O→글리세롤+지방산

의 반응을 촉매화할 수 있으며, 모노글리세라이드에는 작용하지만 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용하지 않는 기질특이성을 갖고 있는 신규의 모노글리세라이드 리파제(이하, "본 발명의 모노글리세라이드 리파제"라 칭한다)를 생산한다는 것을 발견하였다.

또한 바실러스 스티로더모필러스(Bacillus stearothennophilus) H-165에의해서 생성된 모노글리세라이드 리파제가 그 기질특이성으로서 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용하지 않고 모노글리세라이드만에 대하여 전적으로 신규이고도 우수한 효소학적 작용효과를 갖고 있다는 것을 효소정제 결과 밝혀냈다.

또한 이 모노글리세라이드 리파제가 pH 5 부근에서 최적 pH를 갖으며, 최적온도 75℃에서 최대활성을 나타내고, 등전점이 4.6이며, 분자량이 27,000 정도로 낮고, 70℃에서는 실질적으로 전혀 불활성화되지 않으며, 90℃에서의 처리후에 있어서 조차도 그 활성의 20%를 여전히 갖고 있는 내열성 효소라는 것을 발견하였다. 이 모노글리세라이드 리파제는 신규이며, 모노글리세라이드의 측정방법에 있어서 유용한 효소이다.

따라서 본 발명은 적어도 하기의 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있고, 모노글리세라이드에는 작용할 수 있지만, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있는 신규의 모노글리세라이드 리파제와 적어도 하기의 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있고, 모노글리세라이드에는 작용할 수 있지만, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있는모노글리세라이드 리파제를 생산하는 미생물인 바실러스를 배지중에서 배양하고, 그 배양물로부터 상기의 모노글리세라이드를 모으는 것으로 이루어지는 신규의 모노글리세라이드 리파제의 제조방법 그리고 시료용액내의 모노글리세라이드의 측정을 위하여 적어도 하나의 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있고, 모노글리세라이드에는 작용할 수 있지만, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있는 모노글리세라이드 리파제를 상기에서 유리된 모노글리세라이드에 작용시킨 다음, 이 반응에서 모노글리세라이드의 성분으로서 생성된 글리세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하는 것으로 이루어지는 시료용액중의 췌장리파제의 활성에 대한 측정방법에 관한 것이다.

(a) 모노글리세라이드+H₂O→글리세롤+지방산

본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 그 기질특이성으로 인하여, 단지 모노글리세라이드에만 작용한다. 또한 그 분자량과 최적 pH는 각기 27,000±2,700과 pH 5이다. 그리고 최적온도인 75℃에서 최대활성을 나타내며, pH 7-8에서 안정하고, 등전점은 pH 4.6±0.4이며, 70℃에서 열적으로 안정하다.

이 효소는 각종 분석에 유용하며, 예컨대 음료, 식품, 체액 등에 함유되어 있는 모노글리세라이드의 분석 및 체액, 혈청 등에 함유되어 있는 췌장 리파제의 활성측정 등에 유용하다.

본 발명에 따라서 얻어진 신규의 모노글리세라이드 리파제는 다음과 같은 물리화학적 특성을 갖고 있다.

(1) 작용효과 :

모노글리세라이드+H₂O→글리세롤+지방산

(모노글리세라이드는 α-모노글리세라이드 또는 β-모노글리세라이드의 어느 것이라도 좋다.)

(2) 분자량 : 27,000±2,700[폴리비닐 젤 "TSK3000SW"(상표명, 토요소다 매뉴팩쳐 주식회사 제)컬럼과 이동상으로서 0.2M Nacl을 함유하는 50mM 포스페이트 완충용액(pH 6.5)을 사용하여 측정하였다.]

(3) 최적 pH : 효소활성에 대한 측정방법은 다음과 같다.

모노라우린과 효소를 각기 완충용액으로서 다이메틸글루타레이트 완충용액(pH 4-7, 제 1 도에서 -●-표시)과 트리스-HCl 완충용액(pH 7-9.5, 제 1 도에서 -△-로 표시)을 사용하여 10분 동안 서로 반응시켰다.

그 다음 반응혼합물을 2분간 끓여서 효소를 불활성화시켜, 반응을 종결시켰다.

그후 이 반응 혼합물을 37℃에서 인큐베이트한 다음, 생성된 글리세린의 양에 대하여 효소적 측정을 하였다.

그 결과를 제 1 도에 나타낸다. 최적 pH은 pH 5 부근이다.

(4) 최적온도 : PIPES-NaOH 완충용액(pH 7.3)을 사용하여 제 2 도에 나타낸 각각의 온도에서 개별적으로 반응을 수행하였다. 각각의 해당 반응에 이어서 반응혼합물들을 개별적으로 끓였다.

하기의 측정방법에 따라 생성된 글리세린의 양을 개별적으로 측정하였다.

그 결과를 제 2 도에 나타낸다. 최대활성은 75℃에서 나타났다.

(5) pH 안정성 : 본 발명의 효소용액(1.0U/ml)을 각각 10mM의 다이메틸글루탈산-NaOH 완충용액(pH4-7, 제 3 도에서 -○-로 표시), 트리스-HCl 완충용액(pH 8-9, 제 3 도에서 -●-로 표시), 글라이신-NaOH 완충용액(pH 9-10, 제 3 도에서 -△-로 표시)으로 제조하였다. 75℃에서 10분동안 각각의 용액을 처리한 후에 하기의 효소활성에 대한 측정법에 따라 그 잔류 활성을 측정하였다. 그 결과를 제 3 도에 나타낸다.

효소활성은 pH 범위 7-8에서 안정하게 유지되었다.

(6) 열적안정성 : 본 발명의 효소용액(1.0U/ml)을 10mM의 트리스-HCl 완충용액(pH 7.5)으로 제조하였다.

제 4 도에 나타낸 각각의 온도에서 10분 동안 용액이 차있는 부분을 열처리 한후, 하기의 효소활성에 대한 측정법에 따라 잔류활성을 측정하였다.

그 결과를 제 4 도에 나타낸다. 효소활성은 70℃까지는 안정하게 유지되었다.

(7) 등전점 : pH 4.6±0.4(담체로서 양성전해질을 사용한 등전성 포커싱 전기영동으로 정전압 700V의 전류를 4℃에서 40시간 동안 공급한 후, 각 분액의 효소활성을 측정하였다.)

(8) 기질특이성 : 본 발명의 모노글리세라이드 리파제의 기질특이성을 하기의 본 발명의 모노글리세라이드리파제에 대한 효소활성 측정벙법에 따른 조건하에서 조사하였다.

그 결과 표 1에 요약해 놓은 바와 같이 최대활성은 α-몬라우린에서 나타났다.

노른자 레시틴으로부터 유도된 다이글리제라이드인 1,2-딜린올레인, 1,3-딜린올레인과 트리올레인올 기질로서 사용하였을때에는 이들 기질로부터 가수분해된 글리세롤은 본 발명의 모노글리세라이드 리파제의 존재하에서는 검출되지 않았다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 기질로서 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용하지 않는 것으로 간주되었다.

이하의 설명은 기질특이성으로서 β-모노글리세라이드에 대한 본 발명의 모노글리세라이드 리파제의 작용에 관한 것이다.

1) 고능력 액체크로마토그라피(HPLC)에 의하여, 기질인 α-리놀레오일-β-올레오일-다이글리세라이드로부터 유리된 지방산의 확인 :

i ) 췌장으로부터 유도된 리파제(50μl)를 0.5mg의 α-리놀레오일-β-올레오일-다이글리세라이드, 1.8mg의 비이온성 계면활성제("트리톤 X-100" : 상표명, 시그마 케미칼 컴퍼니제). 3.8mg의 데옥시콜린산, 20U의 코리파제, 0.15mg의 염화칼슘 및 200μl의 0.1mM N-트리(하이드록시메틸)메틸-3-아미노프로판술폰산(TAPS)-NaOH(pH 8.3)의 조성을 갖는 1.0ml의 반응용액에 가하였다.

37℃에서 10분간 반응되도록 한 후, 반응을 종결시켰다.

이 반응 혼합물의 15μl 부분 표본을 컬럼에 가하고, 다음 조건하에서 고능력 액체크로마토그라피로 분석하였다.

컬 럼 : "조박스(Zorbox)ODS" (상표명 4.6mm∮ × 25cm)

용매 : 아세토니트릴 : H2O(96 : 4)

검출 : 205nm에서 자외선 흡수

유속 : 1.2ml/min

그 결과로서 리텐션타임(retention time) 23분에서 리놀산이 검출되었으며, 올레인산을 검출되지 않았다.

제 1 위치인 α위치에 결합되어 있던 리놀신의 검출을 고려할때 췌장 리파제는 기질인 α,β-다이글리세라이드의 제1, 2위치인 α,β위치중에서 α위치에만 작용하며, 이 위치를 가수분해시킨다는 것을 알 수 있었다.

생성된 β-올레인-모노글리세라이드가 모아졌다.

ii) 모노글리세라이드 리파제(0.5U)를 위에서 사용한 것과 같은 조성의 반응용액에 가하였다.

상기와 본질적으로 동일한 방법에 의해서 유리된 지방산을 고능력 액체 크로마토그라프로 검출하였다.

그 결과로서 리텐션타임 23분과 31분에서 각기 리놀산과 올레인산이 확인되어졌다.

이러한 결과로부터 본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 췌장 리파제에 의하여 α,β-다이글리세라이드로부터 생성된 기질인 β-모노글리세라이드의 제 2 위치에 작용하여 이 β 위치에 결합된 리놀산을 유리시킨다는 것을 발견하였다.

α,β-다이글리세라이드로부터 유리된 글리세롤이 검출되었다.

2) 기질로서 α,β-다이글리세라이드를 사용한 모노글리세라이드 리파제의 기질특이성 :

i ) 다음에 기술한 α,β-다이글리세라이드를 기질로서 각각 사용하였다.

이 기질들의 α 위치를 췌장 리파제를 가수분해시키고, 생성된 β-모노글리세라이드에 본 발명의 모노글리제라이드를 리파제를 작용시켰다.

그 다음 유리된 글리세롤을 분석하였다.

그 결과로서 모든기질 즉 α-올레핀-β-팔미토일다이글세라이드, α-팔미토일-β-올레오일다이글리세라이드, α,β-딜린올레일글리세라이드에 대하여도 글리세롤이 검출되었다.

덧붙여 말하면 췌장 리파제를 단독으로 사용하였을때에는 글리세롤은 검출되지 않았다.

(9) 계면활성제와 금속이온의 작용효과 :

"트리톤 X-100"(상표명)이나 콜산등과 같은 계면활성제를 가하였을때, 고농도 범위에서 활성억제가 관찰되었다.

또한 본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 Ca⁺⁺나 Mg⁺⁺등의 금속 2가 이온의 첨가에 의하여 영향을 받지 않았다.

[표 1]

모노글리세라이드 리파제의 기질특이성

* 제조방법 : 정제된 노른자 레시틴에 포스포리파제 C를 작용시켰다. 클로로포름-메탄올로 추출된 프랙션을 사용하였다.

[표 2]

모노글리세라이드 리파제에 대한 계면활성제와 금속이온의 작용효과

<효소활성의 측정법>

0.2M PIPES-NaOH 완충용액(pH 7.3) 0.1ml

0.3% 4-아미노안티피리딘 0.05ml

0.2% TOOS** 0.05ml

(45U/ml) 퍼록시 다제 0.05ml

20mM MgCl2 0.025ml

20mM ATP 0.025ml

(25U/ml)글리세롤 키나제 0.01ml

(1000U/ml) 글리세로포스폰산옥시다제 0.01ml

정 제 수 0.075ml

(**TOOS : N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-메타-톨루이딘) 상기 조성의 반응용액 0.4ml에 50μl의 10mM 모노라우린("트리톤 X-100"의 0.5% 수용액)을 가하였다. 이 혼합액을 2-3분 동안 37℃로 급히 가온하고, 반응이 일어나도록 효소용액 50μl을 가하였다.

정확히 10분후에 0.5% SDS(소디움도데실설페이트) 2.5ml을 가하여 반응을 종결시켰다.

550nm의 파장에서 흡관도를 측정하였다.

효소활성에 대하여는 1분당 마이크로몰의 글리세롤을 생성할 수 있는 활성을 1유니트(1U)로 정의하였다.

다음의 식으로부터 이 효소 활성측정법에 의한 효소활성(효력)의 계산을 이해하게 될 것이다.

△A 550 : 파장 550nm에서의 흡광도

2.95 : 반응혼합액의 총부피(ml)

18.0 : H₂O₂의 밀리몰 흡광율(㎠/μmole)

50 : 사용된 효소용액의 부피(μl)

10 : 반응시간(분)

본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 생산할 수 있는 1미생물의 한 예인 바실러스 스티로티모필러스(Bacillus stearothennophilus) H-165균주는 다음과 같은 균학적 특성을 갖고 있다.

A. 육안적 관찰 :

다음의 결과들은 50-55℃에서 18-44시간 배양하여 얻어진 것이다.

(1) 영양한천 사면배양 :

황색을 띠는 회백색을 나타낸다. 선상으로 생육한다. 생육이 양호하며, 어떠한 가용성 색소도 생산하지 않는다.

(2) 영양한천 평판배양 :

황색을 띠는 회색을 나타낸다. 원형의 납작하고, 가장 자리에 톱니가 없는 집락을 형성하며, 어떠한 가용성 색소도 생산하지 않는다.

(3) 액체 배지 :

생육은 양호한 것으로 관찰되었다. 배지는 균일하게 탁해졌다.

(4) BCP 우유 배지 :

배지는 변하지 않은 상태로 남아 있었다.

B. 형태학적 특성 :

(1) 형상 및 배열 :

이 균주는 똑바르거나 또는 양쪽 혹은 한쪽끝이 조금 굽은 원통상의 바실러스이다. 세포들은 서로 분리되어 있거나 또는 2개씩 연결되어 있다. 짧은 사슬형상도 가끔 형성된다.

(2) 크기 :

0.6 - 0.8 × 2.5 -4.0μm

(3) 운동성 :

없음

(4) 포자 :

각 세포의 중앙부 또는 각 세포의 윤곽부에 접근하는 부위에 계란 또는 신장된 원형형상의 포자가 발견된다. 그 크기는 0.8-1.2×1.5-2.0μm이다. 세포는 포자에 의해서 팽창된다.

(5) 다형성 :

없음

C. 생리학적 및 생화학적 특성들 :

그램염색 +

KOH반응 -

항산성 반응 -

캅슐 형성 -

OF시험 (휴즈-레프슨(Hugh-Leifson) 배지 ) 변환없음

OF시험 (수정배지) 0(산화)

혐기적 조건하에의 생육 -

생육 온도 60℃ +

50℃ +

47℃

생육 pH 8.6 -

7.7 +

5.6 +

4.4 -

내염성 0% +

3% +

5% -

젤라틴의 가수분해 -

전분의 가수분해 +

카제인의 가수분해 -

에스클린의 가수분해 +

셀룰로오스의 가수분해 -

알지닌의 가수분해 +

카탈라제의 생성 +

옥시다제의 생성 +

우레아제의 생성(SSR 배지) -

우레아제의 생성(크리스 배지) +

인돌의 생성 -

황화수소의 생성 -

아세토인의 생성 -

MR 시험 -

질산염의 환원 +

탈질소작용 -

* * * 배지조성 :

(NH₄)₂HPO₄1.0g

MgSO₄·7H₂O 0.2g

글루코오스 10.0g

BTB(0.2% 수용액) 10.0g

KCl 1.0g

한 천 3.0g

증류수(pH 7.0) 1000.0ml

동화시험(시몬스 배지) :

구연산염 -

말레인산염 -

능금산염 +

글루콘산염 +

프로피온산염 -

말론산염 -

호박산염 +

동화시험(크리스텐센 배지) :

구연산염 +

말레인산염 -

능금산염 +

글루콘산염 +

프로피온산염 +

말론산염 -

호박산염 +

글루코오스로부터 가스의 생성 -

당으로부터의 산의 생성

[질소원으로서(NH₄)₂HPO₄를 사용]

아도니톨 -

L(+) -아라비노오스 -

셀로바이오스 +

딜시톨 -

메조-에리쓰리톨 -

프락토오스 +

갈락토오스 -

글루코오스 +

글리세린 +

이노시톨 -

이눌린 -

락토오스 +

만니톨 +

만노오스 +

멜레자이토스 +

멜리바이오스 +

라피노오스 +

L(+) - 람노오스 -

D-라이보오스 +

살리신 +

솔비톨 -

솔보오스 -

전 분 +

수크로오스 +

트레할로오스 +

자일로오스 +

상기한 균학적 특성들로부터 균주 H-165는 똑바른 형상 또는 한쪽 끝 혹은 양쪽끝이 조금 굽은 형상을 하고 있는 운동성이 없는 원통상의 바실러스이고, 그램양성이며, 크기가 0.6-0.8×2.5-4.0μm이고, 포자를 형성하며, 포자에 의해서 세포팽창이 일어나고, 산화적으로 글루코오스를 분해하여 산을 생성하며, 카탈라제 및 옥시다제 생산성이 양성인 호기성 고온박테리아로 정의될 수 있다.

이러한 다양한 특성들을 갖는 이 균주는 포자를 형성하고, 그램양성이며, 호기성의 막대모양의 박테리아이기 때문에 바실러스(Bacillus)과에 속하는 것으로 판단되어졌다.

아세토인 생산성, 인돌생산성, 글루코오스로부터 가스생성, 혐기적 조건하에서의 생육성에 대한 상기 균주와 같은 특성들을 나타내는 다른 미생물 균주로서는 (A) 바실러스 스티로티모필러스(Bacillus stearothermophilus), (B) 바실러스 알칼로필러스(Bacillus alcalophilus), (C) 바실러스 바디우스(Bacillus)와 (D) 바실러스 퍼머스(Bacillus firmus)를 들 수 있다.

본 발명의 이들 박테리아 속의 균주들에 대한 균학적 특성들을 다음과 같이 비교하였다.

[ + : 양성, - : 음성, d : 균주에 따라 다름, ND : 유용한 자료가 없음]

상기의 비교로부터 본 발명의 균주의 특성들은 젤라틴 분해를 제외하고는 바실러스 스티로더모필러스(Bacillus stearothermophilus)의 특성들과 잘 일치하고 있었다.

따라서 본 발명의 균주는 바실러스 스티로더모필러스(Bacillus stearothermophilus )에 속하는 것으로 동정되어 바실러스 스티로더모필러스(Bacillus stearothermophilus H-165로 명명되었으며, 일본국 통상산업성 공업기술원 미생물공업기술 연구소(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, the Government of Japan) 에 1987년 2월 4일자로 FERM BP-1673으로 기탁되어졌다.

상기의 바실러스 스티로더모필러스(Bacillus stearothermophilus)H-165는 단지 본 발명의 실시예 유용한 모노글리세라이드 리파제를 생산하는 미생물인 바실러스(Bacillus)의 일예이다.

본 발명은 이 특정한 균주의 사용에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 모노글리세라이드리파제를 생산할수 있는 모든 미생물들도 본 발명에 사용될 수가 있다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제의 생산에 있어서, 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 생산할 수 있는 미생물은 항체효소 등을 생산하는데 일상적으로 사용되는 방법으로 배양될 수 있다. 배양방식은 액체 배양이나 고체배양 어느 것도 사용할 수 있다.

공업적인 용도로서는 생산배지에 모노글리세라이드 리파제를 생산하는 미생물을 접종한 다음 세포들을 통기교반 배양하는 것이 바람직하다.

베지의 영양원으로서는 미생물의 배양에 일반적으로 사용되는 각종 영양원이 사용될 수 있다.

탄소원으로서는 그것이 동화될 수 있는 한 어떠한 탄소화합물도 사용될 수 있다.

예를들면, 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 갈락토오스, 말토오스, 만니톨, 솔비톨, 덱스트린, 전분등의 탄화수소류, 각종 유기산, 대두유, 올리브유 등의 식물유, 동물유, 라아드 및 닭기름 등의 지방등이 사용될 수 있다.

질소원으로서는 그것이 동화될 수 있는 한 어떠한 질소 화합물도 사용될 수 있다.

예를들면, 펩톤, 분말효소 추출물, 육유추출물, 대두분, 카제인, 탈지목화씨 분말등이 사용될 수 았다.

또한 포스페이트, 마그네슘염, 칼슘염, 칼륨염, 나트륨염, 아연염, 철염, 망간염, 할로겐염 등의 하나 또는 그 이상의 각종 염과 옥수수침지액, 각종 비타민등도 필요에 따라 사용될 수 있다. 배양온도는 본 발명의 요노글리세라이드 리파제를 생산할 수 있는 미생물이 생육할 수 있고, 본 발명의 효소를 생산할 수 있는 온도범위 내에서 적절히 선택될 수 있다. 바람직한 배양온도는 40-65℃이지만, 특히 바람직한 것은 45-50℃이다. 비록 배양시간은 배양 조건에 따라 변화되지만, 본 발명의 효소의 효력이 최대에 도달하는 시간을 조사하여, 적절한 시간에 배양을 종결시키는 것이 필요하다.

바람직한 배양시간은 10-22시간이다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 이렇게 하여 얻어진 모노글리세라이드 리파제를 생산하는 미생물을 배양하여 제조된다.

본 발명의 효소는 그 균체내에 함유되어 있으므로 여과나 원심분리와 같은 방법으로 배양액으로부터 균체들을 모은다. 그 다음 이렇게 하여 모아진 균체들을 초음파 분쇄법, 프렌치압착법, 유리구슬법등의 기계적 파쇄법, 라이소자임 처리 등의 효소적 파쇄법과 같은 각종의 세포파쇄법을 조합선택하여 파쇄하고, 이렇게하여 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 함유하는 조정 제용액을 얻는다.

"트리톤 X-100"(상표명)과 같은 계면활성제도 필요에 따라 첨가할 수 있다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 그 다음 단백질, 효소 등에 대한 공지의 분리 및 정제법을 사용하여 조정제 용액으로부터 정제된 형태로 얻는다.

본 발명의 효소를 예를 들면 분별침전 또는 분별염석 등에 의해서 다시 회수한다.

전자는 아세톤, 메탄올, 에탄올 또는 아이소프로판올 등의 유기용매를 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 함유하는 조정제 효소용액에 기하는 것으로 이루어지며, 후자는 암모늄설페이트, 소디움클로라이드, 소디움설페이트 등을 조정제 효소용액에 가하는 것으로 이루어진다.

이렇게하여 얻은 침전을 분자체 크로마토그라피 등의 한 종류 또는 그 이상의 각종 크로마토그라피법으로 정제하고, 다시 단하나의 피크를 얻을 때까지 전기영동, 초원심분리 등을 행한다. 이들 정제방법들로서는 원하는 본 발명의 모노글리세라이드 리파제의 특성들을 이용하는 정제방법들을 선택할 필요가 있다. 예를들면 상기의 첨전을 필요하다면, 물이나 완충용액에 용해시킨 후, 반투과성 막을 통하여 상기의 액을 투석시키고, 이 용액 또는 투석물을 DEAE-셀룰로오스, DEAE-"세파셀"(상표명), DEAE-"세파로스"(상표명), DEAE-"세파덱스 A-50"(상표명), DEAE-"토요펄"(상표명) 등의 음이온 교환수지인 이온교환수지 또는 "세파덱스 G-100"(상표명), "세파덱스 G-75"(상표명), "세파크릴 S-200"(상표명) 등의 젤여과매체로 처리한다.

둘 또는 그 이상의 이들 방법들을 조합하여 적절히 사용한 후에 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 단일피크가 나타날 때까지 전기영동, 초원심분리등으로 정제한다.

당류 즉 만니톨, 수크로오스, 솔비톨 등의 안정제, 글루타민산, 글라이신 등의 아미노산, 또는 송아지 혈청 알부민 등의 단백질이나 펩타이드 등을 가한 다음 본 발명의 효소를 정제된 형태의 분말로 얻기 위하여 동결건조 등의 조작을 행한다.

상기한 바와 같이 본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 모노글리세라이드에는 작용할 수 있지만 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있기 때문에 적어도 하기의 반응식(a)의 효소 반응을 촉매화할 수 있으나, 하기의 반응식(b)와 (c)의 효소반응을 촉매화할 수 없다. 또한 그 분자량 및 최적 pH은 각기 27,000±2,700과 pH 5이다.

최적온도인 75℃에서 최대활성을 나타낸다.

또한 pH 7-8에서 안정하며, 등전점은 pH 4.6±0.4이고 70℃까지는 열적으로 안정하다.

이러한 물리화학적 특성들로부터 본 발명의 모노글리세라이드 리파제는 종래의 모노글리세라이드 리파제와는 다른 것으로 인정되었다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제가 신규의 효소라는 것은 명백하다.

(a) 모노글리세라이드+H2O→글리세롤+지방산

(b) 다이글리세라이드+H2O→모노글리세라이드+지방산

(c) 트리글리세라이드+H2O→다이글리세라이드+지방산

더욱이 모노글리세라이드를 함유하는 시료용액은 본 발명의 신규한 효소 즉 본 발명의 모노글리세라이드리파제를 시료용액중의 모노글리세라이드에 작용시키고, 그 다음 결과로서 생성된 글러세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하는 것에 의하여 분석될 수 있다. 모노글리세라이드에 대한 새로운 분석방법은 음료, 식품, 체액 등에 함유된 모노글리세라이드의 분석 및 체액혈청 등에 함유된 췌장 리파제의 활성측정등과 같은 각종 분석법에 있어서 매우 유용하다.

즉 본 발명은 모노글리세라이드에는 작용할 수 있지만, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있기 때문에 적어도 하기의 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있으나 하기의 반응식(b)와 (c)의 효소반응은 촉매화할 수 없는 모노글리세라이드 리파제를 모노글리세라이드에 작용시키고 그 다음 반응에서 모노글리세라이드의 성분으로서 형성된 글리세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하는 것으로 이루어지는 모노글리세라이드를 함유하는 시료용액에 대한 분석방법을 제공한다.

(a) 모노글리세라이드+H₂O→글리세롤+지방산

(b) 다이글리세라이드+H₂O→모노글리세라이드+지방산

(c) 트리글리세라이드+H₂O→다이글리세라이드+지방산

본 발명에서 모노글리세라이드를 함유하는 시료용액으로서는 본 발명의 신규의 효소에 대한 기질 즉 모노글리세라이드를 기질로서 함유하고 있는 한 어떤 특별한 제한은 없다.

음료나 식품으로부터 얻어진 모노글리세라이드 함유 시료용액도 가능하며, 또한 췌장 리파제 시료용액에 1,2-다이글리세라이드를 가하여 형성된 모노글리세라이드를 췌장 리파제의 활성을 측정하기 위하여 어떤특정한 조건하에서 반응을 시키게 되는 모노글리세라이드 함유 시료용액도 좋다.

췌장 리파제에 대한 기질로서 1,2-다이글리세라이드와 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 조합하여 췌장 리파제의 활성을 측정하는 방법으로서는 예를 들면, 췌장 리파제에 대한 기질인 1,2-다이글리세라이드 및 비이온성 계면활성제를 시료용액인 췌장 리파제를 함유하는 체액에 가하고, 기질인 1,2-다이글리세라이드로부터 췌장 리파제의 작용에 의하여 모노글리세라이드를 생성하도록 측정한 조건하에서 반응을 수행한 다음 이렇게하여 생성된 모노글리세라이드에 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 작용시키고, 모노글리세라이드의 성분으로서 생성된 글리세롤과 지방산의 어느 하나를 정량적으로 분석하는 것을 들 수 있다. 반응시료 용액중의 췌장 리파제의 활성측정에 있어서, 췌장 리파제의 작용을 증진시키기 위하여 첨가되는 첨가제로서는 코리파제, 소디움데옥시콜레이트, 염화칼슘, 염화암모늠 등을 예로 들 수 있다.

더욱이 소디움클레이트등은 기질에 대한 가용화제로서 언급될 수 있다.

췌장 리파제의 활성측정에 유용한 모노글리세라이드 리파제는 상기한 바와 같이 본 발명의 신규한 효소이다.

이 효소는 시료 용액중에서 췌장 리파제에 의해서 생성된 모노글리세라이드를 가수분해시키기에 충분한 양을 사용하는 것이 좋다. 일반적으로는 0.1U/ml 또는 그 이상의 양을 사용하는 것으로 충분하며, 바람직하게는 0.5-2U/m1이다. 본 발명의 효소는 완충용액을 가한 수용액 상태로 사용할 수 있으며, 또는 동결건조시킨 형태로 사용할 수도 있다.

상기한 바와 같은 방법으로 본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 모노글리세라이드에 작용시키고, 일정한 시간동안 인큐베이트한다. 반응시간 및 반응온도는 효소가 충분히 반응할 수 있으면 된다.

예를 들면, 반응온도는 30-40℃, 바람직하게는 37℃ 부근이다. 이 반응의 결과로서 글리세롤과 지방산의 시료용액중에 생성되며, 그 다음으로는 이들 지방산과 글리세롤의 어느 하나를 측정한다.

글리세롤을 측정하기 위해서는 기질인 글리세롤에 작용할 수 있는 효소를 사용하게 되며, 예를 들면 글리세로키나제, 글리세로포스페이트 옥시다제법 또는 글리세롤 옥시다제법이 간단하고 효과적이다.

예를 들면 전자의 방법에 있어서, ATP와 글리세로키나제를 사용하여 글리세롤로부터 생성된 글리세로-3-포스페이트는 글리세로포스페이트옥시다제에 의해서 산화된다.

글리세로키나제, 글리세로포스페이트 옥시다제법에 있어서, 0.1-10U/m1의 글리세로키나제, 0.1-2.0mM 아데노신트리포스페이트(ATP), 2-50mM의 염화마그네슘을 본 발명의 모노글리세라이드 리파제에 의해서 모노글리세라이드로부터 생성된 글리세롤에 가하여 아데노신다이포스페이트(ADP)와 글리세로-3-포스페이트가 생성된다.

이렇게 생성된 글리세로-3-포스페이트에 2.0-50U/m1의 글러세로포스페이트 옥시다제를 작용시키는 것에 의하여, 다이하이드록시아세톤포스페이트와 H₂O₂를 생성시키는 것으로 산소를 소모시킨다.

따라서 반응 혼합액중에 생성된 다이하이드록시아세톤포스페이트와 H₂O₂의 어느 하나 또는 반응혼합액중에서 소모된 산소를 측정하는 것에 의하여 글리세롤의 양을 정량적으로 측정할 수 있다.

소모된 산소의 양을 측정하기 위하여는 산소전극을 사용하는 것이 간단하고도 간편하다.

결과로서 생성되는 H₂O₂의 측정방법으로서는, H₂O₂전극을 사용하는 방법, H₂O₂와의 반응에 의해서 흡광도가 변화되는 한 종류 또는 그 이상의 색소시약을 함유하는 염료조성물을 사용하는 비색정량법등을 들수 있다.

이러한 색소시약의 대표적인 예로서는 생성되는 H₂O₂와의 반응에 의해서 안전한 적색물질을 생성시킬 수 있는 4가지 티타늄 화합물과 키실레놀오렌지 사이의 반응과 N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-메타-톨루이딘(이하, 약칭으로 "TOOS"라 칭함) 또는 메들, 4-아미노안티피리딘과 퍼록시다제 사이의 반응등에 사용되는 것들을 들 수 있다.

TOOS나 페놀 또는 4-아미노안티피리딘과 퍼록시다제와의 반응에 있어서, 페놀 또는 TOOS는 전체 용액에 대하여 약 0.01-0.1%의 양으로 사용된다.

한편 4-아미노안티피리딘은 생성되는 H₂O₂의 양에 대하여 0.01-0.1%, 바람직하게는 0.03%의 양으로 사용되며, 퍼록시다제는 0.5-l0U/ml의 양으로 사용된다.

이렇게 제조된 색소시약은 본 발명의 모노글리세라이드 리파제와 함께 혼합하여 제조될 수도 있다.

그후 발색반응의 결과로서 생성된 퀴논이민 염료를 적당한 파장에서 측정한다. 그 다음 보정곡선을 통하여 H₂O₂를 정량적으로 분석한다.

또한 호모바닐린산과 같은 형광물질이 상기의 색소시약 대신에 사용될 수도 있다.

이와 유사하게 글리세롤 옥시다제법에서는 5-50U/ml의 글리세롤 옥시다제를 글리세롤에 작용시켜서 산소를 소모시키고, 다이하이드록시아세톤과 H₂O₂를 생성시킨다.

그 다음에는 글리세로키나제, 글리세로포스폐이트 옥시다제법에서 산소 또는 H₂O₂의 양을 측정하는 것과 같은 방법으로 하여 생성된 H₂O₂의 양을 측정하면 된다.

또한 글리세롤의 정량분석을 위한 방법으로서는 상기의 글리세로포스페이트 옥시다제 대신에 글리세로포스페이트 디하이드로게나제를 사용하여 생성된 환원 NAD를 공지의 정량분석법으로 분석할 수도 있다.

ATP에 대하여 글리세로키나제를 작용시켜 ATP로부터 생성된 ATP도 공지의 방법으로 측정할 수 있다.

또한 췌장 리파제의 활성을 측정하는데 있어서는 예를들면 췌장 리파제에 대한 기질로서 제공될 수 있는 1, 2-다이글리세라이드이다. 비이온성 계면활성제, 췌장 리파제의 활성을 증진시키는 효과를 갖는 첨가제, 기질에 대한 가용화제, 모노글리세라이드로부터 글리세롤과 지방산을 생성하는 반응을 촉진시키기 위한 첨가제, 기질에 대한 가용화제, 모노글리세라이드로부터 글리세롤과 지방산을 생성하는 반응을 촉진시키기 위한 처가제, 생성된 글리세롤을 측정하기 위한 효소, 효소의 작용을 증진시키기 위한 첨가제, 생성된 H₂O₂를 측정하기 위한 색소시약 등을 본 발명의 모노글리세라이드 리파제와 함께 사용할 수 있다. 췌장 리파제의 활성을 측정하는데 사용할 수 있는 계면활성제 및 기질 예를 들면 1, 2-다이글리세라이드의 종류 및 양은 일본국 특허출원 공개번호 91, 898/1984호를 참조하여 적절히 선택할 수 있다.

췌장 리파제의 활성을 측정하기 위한 방법인 변화율 검정(Rate assay)에서는 췌장 리파제의 활성 측정을 위하여 제공된 시료(혈청) 30μl을 미리 제조된 반응용액 1.5ml에 작용시킨 다음, 이 반응 혼합액을 파장 550nm, 37℃(30℃ 또는 25℃로 임의로 선택할 수도 있다.)에서는 췌장 리파제의 활성측정을 위하여 제공된 시료(혈청) 50μl을 미러 제조한 반응용액 1.0m1에 작용시키고, 37℃에서 정확히 30분동안 상기의 혼합액을 반응시킨 후 l.0m1의 0.5% SDS를 가한 다음 파장 550nm에서 비색측정을 하였다.

한편 지방산을 측정하기 위한 방법으로서는 순환반응(Cycling reaction)이 사용될 수 있다.

이 순환반응은 모노글리세라이드 리파제의 작용으로 모노글리세라이드로부터 유리된 지방산이 출발물질인 아실-CoA로 변환되는 초기단계인 효소의 반응단계 앞의 단계에서 얻어진 효소반응 생성물이 다음 단계에서의 효소반응을 위한 기질로 사용되는 몇 개의 반응단계가 조합되어 이루어지는 일련의 연속단계 그리고 초기단계에서 생성된 아실-CoA로 변환되는 최종단계로 이루어진다, 더욱 상세하게는 이들 단계들은 초기단계에서 지방산이 아실-CoA로 변환되고, 다음 단계에서 아실-CoA가 디하이드로아실-CoA로 변환되며, 이 디하이드로아실-CoA의 하이드록시아실-CoA로 변환된 다음, 이 하이드록시아실-CoA가 케토아실-CoA로 변환되며, 최종적으로 이 케토아실-CoA가 아실-CoA로 변환되는 아실-CoA까지의 변환단계들이다.

이들 단계들의 조합인 순환반응으로서 지방산의 양을 성공적으로 측정할 수 있다.

즉 반응의 최종단계에서 생성된 아실-CoA의 아실기는 반응의 출발물질인 지방산의 사슬 길이보다 탄소수가 2개 적어진다. 그 다음 이 아실-CoA는 순환반응을 통하여 디하이드로아실-CoA, 하이드톡시아실-CoA, 케토아실-CoA로 연속하여 변환된다. 이 순환반응은 최종단계에서 탄소수가 2개 적은 이 아실-CoA가 생성되는 것을 반복하게 되는 반응이다.

따라서 지방산의 탄소수에 해당되는 높은 반복도의 순환반응이 일어난다. 다양한 방법들에 따라 순환단계의 과정에서 지방산 1몰로부터 생성되거나 소모되는 높은 몰비의 물질에 대한 누적량을 측정지방산의 누적량을 검출가능한 반응생성들을 사용하여 초고감도로 측정할 수 있다.

이 즉청은 다음의 반응단계 (a)-(e)를 포함한다.

(a) ATP 또는 GTP, CoASH와 아실-CoA, 신테타제의 활성에 의한 반응으로 지방산이 아실 -CoA로 변환된다.

(b) 그리고 산소와 아실-CoA·옥시다제의 활성에 의한 반응으로 아실-CoA가 디하이드로 변환된다.

(c) 그 다음 물과 에노일-CoA, 하이드라타제의 활성에 의한 반응으로 디하이드로아실-CoA가 하이드록시아실-CoA로 변환된다.

(d) 그후, NAD와 3-하이드록시아실-CoA, 디하이드로게나제의 활성에 의한 반응으로 하이드록시아실-CoA가 케토아실-CoA 및 환원된 NAD로 변환된다.

(e) 최종적으로 CoASH와 3-케트아실-CoA, 티올라제의 활성에 의한 반응으로 케토아실-CoA가 반응단계(a)에서 생성된 아실-CoA의 아실기보다 탄소수가 2개 적은 아실기를 갖는 아실-CoA로 변환된다.

즉 이렇게 생성된 아실-CoA은 이어지는 반응단계들의 반응을 통하여 β-산화되어서 첫번째로 언급한 아실-CoA보다 탄소수가 2개 적은 아실기를 갖는 아실-CoA로 변환된다.

반응계내에서 생성된 물질의 검출가능한 변위로서 순환반응의 과정중에 축적되어지거나 생성되는 환원된 NAD는 분광측정법으로 측정되기만 하면 된다.

이 환원된 NAD는 NAD에는 특이적이지 않지만, 환원된 NAD에는 특이적인 파장인 약 320 -360mm에서 분광측정법으로 측정된다. 또는 이 환원된 NAD를 수소전달계 내에 참여하는 색소와 다이아포라제 및수용성 테트라졸륨염을 사용하여 비색계로 측정할 수도 있다.

지방산의 측정에 사용되는 효소 및 시약들은 일본국 특허출원 공개번호 51899/1983과 9189하여 적절히 준비할 수가 있다.

상기에서 언급한 바와 같은 방법으로 제조된 본 발명의 신규한 모노글리세라이드 리파제를법은 결과로서 생성되는 글러세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하게 된다.

본 발명의 모노글리세라이드 리파제를 사용하는 분석방법은 음료식품, 체액등에 함유된 모노의 분석 및 체액, 혈청 등에 함유된 췌장 리파제의 활성측정에 매우 유용하다.

본 발명은 지금부터 다음의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.

그러나 본 발명은 다음의 실시예에 의해서 결코 제한되는 것이 아니라는 사실을 숙지하기 바란다.

[실시예 1]

(균체의 배양)

1.0% 펩톤, 0.5% 효모추출물분말, 1.0 우유카제인, 0.2% NaCl 0.1% K₂HPO₄, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.5% 올리브 기름을 함유하는 100ml의 배지(pH 7.0)를 120℃에서 20분간 멸균한 후 상기의 배양액과 같은 조성의 한전배지에서 사전에 15시간동안 50℃에서 배양한 바실러스 스티로더모필러스(Bacillusstear -othermophilus) H-165 종균배양물을 상기의 배지에 접종하였다.

이 균주를 50℃에서 25시간동안 진탕배양하였다.

약 10시간후로부터 생육된 균체내의 모노글리세라이드 리파제의 활성을 검사하였다.

활성이 정점(0.1U/ml)에 도달하였을 때 배양을 종결시키고, 그 배양액올 3,000rpm에서 10분간 원심분리하여 균체들을 모았다.

[실시예 2]

(효소의 추출 및 정제)

실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 배양액(500ml 용량의 엘렌메이어 플라스크 10개) 1,000m1로부터 모은 균체를 10mM의 포스페이트 완충용액(pH 7.0) 200ml에 현탁시키고, 초음파 파쇄(Ultrasonication : 200W, 10분)하여 효소를 용해시켰다.

이와 같은 효소가 용해되어 있는 용액을 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 175ml의 맑은 상칭액을 얻었으며, 여기에 350ml의 냉각된 아세톤을 가하여 효소를 침전시켰다. 10% 암모늄 설페이트를 함유하는 10mM 포스페이트 완충용액(pH 7.0) 65ml에 상기의 침전을 다시 용해시키고, 이 용액을 "옥틸-세파로스"(상표명, 파마시아 AB제)가 충전된 칼럼(3.5×5cm)에 가하여 효소를 흡착시켰다.

컬럼에 흡착되지 않은 성분들을 10% 암모늄 설페이트가 함유된 50ml의 포스페이트 완충용액(pH 7.0)으로 씻어냈다. 10mM 포스페이트 완충용액(pH 7.0)으로 컬럼을 씻어낸 다음, 3% 트리톤 X-100을 사용하여 컬럼으로부터 용출시켰다.

그 결과를 제 5 도에 나타낸다.

활성을 갖고 있는 분액들(번호 22-25)을 합한 다음, 아미콘 사(AMICON CORP)제의 초여과막을 사용하여 4ml로 농축하였다. 냉각된 아세톤 10m1을 가하여 효소를 침전시키고, 3,000rpm에서 10분동안 원심분리하여 침전을 모았다.

5ml의 10mM 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 침전을 용해시킨후 동일한 완충용액 500ml을 사용하여 20시간동안 투석하였다. 그 다음 투석물을 동결 건조하여 정제된 형태(3.8U/mg)의 효소 8mg을 얻었다.

[실시예 3]

(췌장 리파제 활성의 측정방법)

글리세로키나제 글리세로포스페이트 옥시다제법[GK·GPO법]에 대한 반응용액의 조성:

글리세롤옥시다제볍[GO법]에 대한 반응용액의 조성 :

****표는 완충용액으로서, BES바이신(Bicine), DIPSO, EPPS, HEPES, HEPPSO, MOPS, POPS, TAPS, TAPSO, TES 및 트리신(Tricine), 트리스-HCl, 다이메틸글루탈산, 이미다졸 등의 다양한 상품의 완충용액중의 어느 것을 사용하여도 좋다. 페놀은 TOOS 대신에 사용할 수도 있다.

[측정 방법]

(1) 변화율 검정(Rate assay):

상기 조성의 반응용액 1.5ml에 인간혈청 30μl을 가하고, 혼합한후, 분광계 ("시마쯔 VV=250", 상표명 시마쯔 세이사꾸쇼가 제)를 사용하여 37℃, 550nm에서 연속적으로 흡광도를 측정하였다.

분광 흡광도의 증가율은 3분후부터 측정하였다.

다음에 나타낸 식에 따라서, 리파제의 활성을 계산하였다.

GP·GPO법에 의한 결과를, 제 3 표에 GO법에 의한 결과를 표 4에 나타낸다.

표 3

표 4

리파제의 활성(U/L) 측정

=흡광도 증가분(A550nm)/분×1.53/l.56×1,000/30×1,000

15.6 : H₂O₂에 의해서 생성된 색깔의 밀리몰 흡광율(cm²/U몰)

1.53 : 반응용액의 총부피(ml)

1,000/30 : ml로의 변환

1,000 : ℓ로의 변환

(2) 종점검정(End point assay):

상기 조성의 반응용액 1.0ml에 인가혈청 50μl을 가하여 혼합한후, 37℃에서 30분동안 판응시켰다. 0.5%의 SDS 1.0ml을 가하여 반응을 종결시키고, 550nm(AS)에서 흡광도를 측점하였다.

블랭크(blank)시험으로서 1, 2-다이글리세라이드, 코리파제, 데옥시코린산을 첨가하지 않은 반응용액으로 상기의 절차를 반복하였다. 이 반응용액을 블랭크(AB)로 사용하였다. 다음에 나타낸 식에 따라서 리파제의 활성을 계산하였다.

GP·GPO법에 의한 결과를 표 5에, GO법에 의한 결과를 표 6에 나타낸다.

표 5

표 6

리파제의 활성(U/L) 측정

= A550nm(AS -AB) × 2.05/15.6 × 1/30 × 1,000/50 × 1,000

15.6 : H₂O₂에 의해서 생성된 색깔의 밀리몰 흡광율(㎠ >μ몰)

1/30 : 1분으로의 변환

1,000/50 : ml로의 변환

1,000 : ℓ로의 변환

2.05 : 반응용액의 총부피(ml)

[실시예 4]

(모노글리세라이드의 측정)

글리세롤 옥시다제법[GO법]에 대한 반응용액의 조성 :

****표는 완충용액으로서, BES, 바이신(Bicine), DIPSO, EPPS, HEPES, HEPPSO, MOPS, POPS, TAPS, TAPSO, TES 및 트리신(Tricine), 트리스-HCl, 다이메틸글루달산, 이미다졸 등의 다양한 상품의 완충용액들중의 어느 것을 사용하여도 좋다. 페놀은 TOOS 대신에 사용할 수도 있다.

[측정 방법]

각각의 반응혼합액 3.0ml에 모노글리세라이드(1-모노올레인) 0-0.5μ들을 함유하는 시료 50μl을 가하였다.

GK·GPO법으로 37℃에서 15분간 발색반응시킨후, 각각 500nm에서 흡광도를 측정하였다.

제 6 도에 도시한 바와 같이 비례상관 관계를 나타내는 직선이 모노글리세라이드 0.5μ몰의 양까지에서 얻어졌다.

또한 GO법에서도 또한 모노글리세라이드 0.5μ몰의 양까지에서 비례 상관 관계를 나타내는 직선을 얻었다.

Claims

시료용액내의 모노글리세라이드의 함량을 측정하기 위하여, 모노글리세라이드에는 작용할 수 있으나, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있으며, 적어도 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있는 모노글리세라이드 리파제를, 시료용액내의 모노글리세라이드에 작용시킨 다음, 반응에 의해서 생성된 글리세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하는 것으로 이루어지는, 시료용액중에 함유된 모노글리세라이드의 분석방법.

모노글리세라이드 + H₂O→글리세롤 +지 방산 (a)
제 1 항에 있어서, 시료용액내의 모노글리세라이드가 시료용액내의 1, 2-다이글리세라이드에 췌장 리파제를 작용시켜서 유리시킨 모노글리세라이드인, 모노글리세라이드의 분석방법.
제 1 항에 있어서, 글리세롤의 측정이 글리세롤에 글리세롤옥시다제, 글리세로키나제 또는 글리세로포스페이트 옥시다제를 작용시켜 생성되는 H₂O₂를 측정하는 것으로 이루어지는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 3 항에 있어서, H₂O₂의 측정이 H₂O₂의 존재하에서 비색변화를.나타낼 수 있는 적어도 한 종류 이상의 색소시약을 함유하는 염료조성들을 사용하여 이루어지는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 4 항에 있어서, 염료조성물이 퍼록시다제를 포함하는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 5 항에 있어서, 퍼록시다제가 0.5∼l0U의 양으로 사용되는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 4 항에 있어서, 염료조성물의 색소시약이 4-아미노안티피린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-메타-톨루이딘 또는 페놀과 퍼록시다제로 이루어지는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 1 항에 있어서, 지방산의 측정이, (a) 지방산이 아실-CoA로 변환되고, (b) 상기의 아실-CoA가 네하이드로아실-CoA로 변환되며, (c)상기의 데하이드로아실-CoA가 하이드록시아실-CoA로 변환되고, (d) 상기의 하이드록시아실-CoA가 케토아실-CoA로 변환된 다음, (e) 상기의 케트아실-CoA가 아실-CoA로 변환되는 것으로 구성되는 반응단계(a)(b)(c)(d) 및 (e)로부터 검출가능한 반응생성들에 대한 양적변화의 측정으로 이루어지는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 8 항에 있어서, 반응단계 (a)가 아실-CoA, 신데타제의 활성은 물론 지방산, CoASH 및 ATP 또는 GTP에 근거하며, 반응단계(b)가 아실-CoA, 옥시다제의 활성은 물론, 아실-CoA 및 산소에 근거하고, 반응단계(c)가 에노일-CoA, 하이드라타제의 활성은 물론, 데하이드로아실-CoA 및 물에 근거하며, 반응단계(d)가 3-하이드록시아실-CoA, 데하이드로게나제의 활성은 물론 하이드록시아실-CoA 및 NAD에 근거하고, 반응단계(e)가 3-케토아실-CoA, 티올라제의 활성은 물론 케토아실-CoA 및 CoASH에 근거하고 있는 모노글러세라이드의 분석방법.
제 8 항에 있어서, 검출가능한 반응생성물에 대한 양적변화의 측정이 반응단계에서 생성된 환원된 NAD를 정량적으로 측정하여 수행되는 모노글리세라이드의 분석방법,
제 10 항에 있어서, 환원된 NAD의 정량분석이 NAD에는 특이적이지 아니하나, 환원된 NAD에는 특이적인 흡수파장을 나타내는 320∼360nm 부근에서 분광광도법으로 수행하여 이루어지는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 10 항에 있어서, 환원된 NAD의 정량분석이 환원된 NAD의 수소원자에 대한 수용성을 갖으며, 수소전달계에 참여하는 색소에 의해서 발생되는 것에 근거하여 수행되는 모노글리세라이드의 분석방법.
제 12 항에 있어서, 환원된 NAD의 수소원자에 대한 수용성을 갖는 색소가, 수용성 테트라졸륨염 및 다이아포라제를 함유하고, 수소전달계에 참여하는 색소인, 모노글리세라이드의 분석방법.
시료용액중 췌장 리파제를 적어도 1, 2-다이글리세라이드를 함유하는 시약에 작용시켜 모노글리세라이드를 유리시키고, 모노글리세라이드에는 작용할 수 있으나, 다이글리세라이드 및 트리글리세라이드에는 작용할 수 없는 기질특이성을 갖고 있으며, 적어도 반응식(a)의 효소반응을 촉매화할 수 있는 모노글리세라이드 리파제를 상기에서 유리된 모노글리세라이드에 작용시킨 다음, 상기 반응에서 모노글리세라이드의 성분으로서 생성된 글리세롤과 지방산의 어느 하나를 측정하는 것으로 이루어지는 시료용액중의 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.

모노글리세라이드 + H₂O→ 글리세롤 +지방산 (a )
제 14 항에 있어서, 글리세롤의 측정이 글리세롤에 글리세롤옥시다제, 글리세로키나제 또는 글리세로포스페이트옥시다제를 작용시켜 생성되는 H₂O₂를 측정하는 것으로 이루어지는 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.
제 15 항에 있어서, H₂O₂의 측정이 H₂O₂의 존재하에서 비색변화를 나타낼 수 있는 적어도 한 종류 이상의 색소시약을 함유하는 염료조성물을 사용하여 이루어지는 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.
제 16 항에 있어서, 염료조성들이 퍼록시다제를 포함하는 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.
제 17 항에 있어서, 퍼록시다제가 0.5∼10U의 양으로 사용되는 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.
제 6 항에 있어서, 염료조성물의 색소시약이 4-아미노안티피린, N-에틸-N-(2-하이드록시-3-술포프로필)-메타-톨루이딘 또는 페놀과 퍼록시다제로 이루어지는 췌장 리파제의 활성에 대한 분석방법.