JPS63245672A - 新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法 - Google Patents

新規なモノグリセリドリパ−ゼ、その製法およびそれを用いる分析法

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JPS63245672A
JPS63245672A JP62080299A JP8029987A JPS63245672A JP S63245672 A JPS63245672 A JP S63245672A JP 62080299 A JP62080299 A JP 62080299A JP 8029987 A JP8029987 A JP 8029987A JP S63245672 A JPS63245672 A JP S63245672A
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monoglyceride
coa
lipase
reaction step
reaction
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Shigeyuki Imamura
茂行 今村
Mamoru Takahashi
守 高橋
Hideo Misaki
美崎　英生
Kazuo Matsuura
松浦　一男
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Toyo Jozo KK
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、新規なモノグリセリドリパーゼ、その製法お
よびそれを用いる分析法、さらに膵リパーゼの酵素活性
測定法に関する。
〈従来の技術〉 従来、微生物から高等動物まで広く存在が知られている
公知のモノグリセリドリパーゼは、モノグリセリドのみ
ならず、ジグリセリド、トリグリセリドにも作用するこ
とが知られており（酵素ハンドブック第４２４頁：昭和
５７年１２月１日朝倉書店発行）、さらに別のモノグリ
セリドリパーゼとしては、スタフィロコッカス（Ｓｔａ
ｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する菌株由来のものが
知られている（特開昭５５−４２５３２号公報）が、こ
の酵素は、基質特異性としてモノグリセリドの他にトリ
グリセリドにも作用するもので、その理化学的性質とし
て、至適ｐ　ＨはｐＨ１１、至適温度はエディオール（
Ｅｄｉａｌ：ヤシ油エマルジョン）を基質とする場合に
３７〜４０℃をピークに３７〜５０℃の範囲で高活性を
示し、等電点は２．５６、分子量は約１７４，０００で
、さらに５５℃以上で急速に失活し７０℃での失活は１
０分以内に起こるものである。また、公知のリパーゼ活
性測定法としては、トリオレインを用いる比濁法、合成
基質を用いる発色法（特開昭６１−２５４１９７号公報
）、分解した脂肪酸を滴定する滴定法、天然型基質であ
る１、２−ジグリセリドを合成基質として用いて生成す
る脂肪酸を酵素的に測定する方法等が知られている（特
開昭５８−８８８号公報、特開昭５９−９１８９８号公
報）。
〈発明が解決しようとする問題点〉 前述の如く、従来のモノグリセリドリパーゼはモノグリ
セリドのみならず、ジグリセリド、トリグリセリドにも
作用するため、例えばリパーゼ活性測定におけるグリセ
リド合成基質から遊離するモノグリセリドのみを測定す
る方法には利用できないものであり、さらにスタフィロ
コッカス属に属する菌株からのモノグリセリドリパーゼ
も、トリグリセリドに作用しかつ分子量が大きく、至適
ｐ　Ｈも高く、さらに熱に対して不安定なもので使用し
得ないものであった。
〈問題を解決するための手段〉 本発明者らは、前述の問題点を鑑み、鋭意研究の結果、
鹿児島県霧島温泉の泉源周辺の土壌より分離したバチル
ス属に属する菌株Ｈ−１６５株が少なくとも下記の式（
ａ）の酵素反応を触媒し、（ａ）モノグリセリド＋Ｈｆ
ｆｉＯ−−→グリセロール＋脂肪酸 基質特異性としてモノグリセリドに作用してジグリセリ
ドおよびトリグリセリドに作用しない新規なモノグリセ
リドリパーゼ（以下、本発明モノグリセリドリパーゼと
云うことがある）を産生ずることを見出し該酵素を精製
し、このバチルス属に属するバチルス　ステアロサーモ
フィラス（Ｂａｃ　１ｆｌｕｓ　Ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ　）　Ｈ−１６５によるモノグリセリ
ドリパーゼが、基質特異性としてモノグリセリドに作用
してジグリセリドおよびトリグリセリドに作用しない極
めて優れた全く新規な酵素作用を示すことを見出し、か
つ至適ｐＨがｐＨ５付近、至適温度が７５℃で最大の活
性を示し、等電点が４．６、分子量が２７，０００と小
さく、さらに熱安定性が７０℃では殆ど失活せず９０℃
で処理しても２０％活性が残るという耐熱性のモノグリ
セリドリパーゼであって、新規かつモノグリセリド測定
において有用な酵素であることを見出した。
本発明は、上記の知見に基づいて完成されたもので、少
なくとも、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、基質特
異性としてモノグリセリドに作用してジグリセリドおよ
びトリグリセリドに作用しない新規なモノグリセリドリ
パーゼ、およびバチルス属に属する、少なくとも、下記
の式（ａ）の酵素反応を触媒し、基質特異性としてモノ
グリセリドに作用してジグリセリドおよびトリグリセリ
ドに作用しないモノグリセリドリパーゼ生産菌を培地に
培養し、培養物からモノグリセリドリパーゼを採取する
ことを特徴とする新規な該モノグリセリドリパーゼの製
法、ならびに被検液中のモノグリセリドを測定するに当
たり、被検液に、少なくとも、下記の式（ａ）の酵素反
応を触媒し、基質特異性としてモノグリセリドに作用し
てジグリセリドおよびトリグリセリドに作用しないモノ
グリセリドリパーゼを作用せしめ、次いで反応において
生成されたモノグリセリドの成分であるグリセロールま
たは脂肪酸のいづれか一方を測定することを特徴とする
モノグリセリドを含有する被検液の分析法、さらに被検
液中の膵リパーゼ活性測定において、少なくとも１：　
２−ジグリセリド含有試薬に被検液の膵リパーゼを作用
せしめ、次いで遊離したモノグリセリドに少なくとも、
下記の式＜ａ＞の酵素反応を触媒し、基質特異性として
モノグリセリドに作用してジグリセリドおよびトリグリ
セリドに作用しないモノグリセリドリパーゼを作用せし
め、次いで反応において生成されたモノグリセリドの成
分であるグリセロールまたは脂肪酸のいづれか一方を測
定することを特徴とする被検液中の膵リパーゼ活性の測
定法に関するものである。
（ａ）モノグリセリド十Ｈ１０−−→ グリセロール＋脂肪酸 まず、本発明によって得られる新規モノグリセリドリパ
ーゼは以下に述べる理化学的性質を有するものである。
＋１１作用； モノグリセリド千Ｈ１０−−− グリセロール＋脂肪酸 （モノグリセリドはα−またはβ−モノグリセリドのい
づれであってもよい） （２）分子量；２７．ｏｏｏ±２．７００Ｃポリビニル
ゲル（商品名：ＴＳＫ３０００ＳＷ；東洋曹達社製）の
カラムを用い、０．２ＭＮａＣ１を含む５０ｍＭリン酸
緩衝液（ｐＨ６，５）を移動層とするゲル濾過法により
測定〕 （３）至適ｐＨ；後記の酵素活性測定法に従い、緩衝液
としてジメチルグルタル酸緩衝液（ｐＨ４〜７、第１図
の−・−）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９．５、第
１図の一〇−）を用いてモノラウリンと酵素とを１０分
間反応せしめた後、２分間煮沸して酵素活性を失活させ
、反応を停止せしめ、３７℃に保温し、生成したグリセ
リンの量を酵素的に測定した結果は、第１図の通りであ
って、至適ｐＨはｐＨ５付近であった。
（４）至適温度；ビペスー水酸化ナトリウム（ＰＩＰＥ
Ｓ−ＮａＯＨ）　緩ｉ！ｊ？（！Ｅ　（ｐＨ７，３）を
用い、後記の酵素活性測定法に従い、第２図に示す各温
度での反応後、煮沸して反応を止め、生成したグリセリ
ンの量を酵素的に測定した結果は、第２図に示す通りで
あり、７５℃で最大の活性を示した。
（５１ｐＨ安定性；本酵素液（１，ＯＵ／ｍｌ）を、１
０ｍＭのジメチルグルタル酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ　Ｈ
４〜７、第３図の−・−）、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８〜９、第３図の一〇−）、グリシン−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ９〜１０、第３図の一△−）の各緩衝液で調製し
、７５℃で１０分間処理した後、その残存活性を後記の
酵素活性測定法に従って測定して、第３図の結果が得ら
れ、酵素活性はｐ　Ｈ７〜８の範囲で安定であった。
（６）熱安定性；本酵素液（１，ＯＵ／ｍｌ）を１０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で調製し、第４図
の各温度で１０分間加熱処理後その残存活性を後記の酵
素活性測定法に従って測定した結果は、第４図の結果が
得られ、酵素活性は７０℃まで安定であった。
（７）等電点；ｐＨ４，６±０．４（キャリアアンフオ
ライトを用いる焦点電気泳動法により４℃、７００Ｖの
定電圧で４０時間通電した後、各両分の酵素活性を測定
した） （８）基質特異性；第１表に示す通り、α−モノラウリ
ンに対して最大の活性を示す。卵黄レシチン由来のジグ
リセリド、■、２−シリルイン、１．３−シリルインお
よびトリオレインには全（作用しない。
（９）界面活性剤、金属イオンの影響；第２表に示す通
り、トリトンＸ−１００およびコール酸等の界面活性剤
添加では高濃度領域において活性阻害が見られる。Ｃａ
イオン、Ｍｇイオン等の二価金弟１表　モノグリセリド
リパーゼの基質特異性ホ調製法：精製した卵黄レシチン
にホスホリパーゼＣを作用させ、クロロホルム−メタノ
ールで抽出した両分を使用した。
第２表　モノグリセリドリパーゼにおける界面活性剤、
金属イオンの影響 く酵素活性測定法〉 （＊＊ＴＯＯ３：Ｎ−エチルーＮ−（２−Ａイドロキシ
−３−スルホプロピル）−メタ−トルイジン） 上記組成の反応液０．４ｍｌに、１０ｍＭモノラウリン
（０，５％トリトンＸ−１００水溶液）５０μｌを加え
、３７℃で２〜３分間予備加温し５０μｌの酵素液を加
え、反応を開始する。正確に１０分後、０．５％Ｓ　Ｄ
　Ｓ　（Ｓｏｄｉｕｍ　ｄｏｄｅｃｙｌ　５ｕｌｆａｔ
ｅ）　　２　、　５　ｍ　ｌを加え反応を止める。分光
分析による比色測定の波長は５５０　ｎｍで行い、酵素
活性は、１分間に１μｍｏｌｅのグリセロールを生成す
る活性を１単位（Ｉ　Ｕｎｉ　ｔ、　１０．　）とする
、また、この酵素活性測定法による酵素活性（力価）の
算出は次式に従う。
％式％） ΔＡ　５５０　　：　５５０ｎｍの波長における吸光度
２．９５：発色液総ｆｉｔ（ｍｌ） １８．０　：過酸化水素ミリ分子吸光係数（ｃ１１！／
μｍｏｌｅ） ５０：使用酵素液Ｎ（μ１） １０：反応時間（分） 次に、本発明モノグリセリドリパーゼ生産菌の一例であ
るバチルス　ステアロサーモフィラスＨ−１６５菌株の
菌学的性状は以下の通りである。
Ａ、肉眼的観察 ５０〜５５℃、１８〜４４時間培養の結果は、次の通り
である。
■普通寒天斜面培地 黄味を帯びた灰白色を呈し、線状に生育し、生育は良好
であり、可溶性色素は産生しない。
■普通寒天平面培地 黄味を帯びた灰色を呈し、円形で平らな金縁の集落を形
成するが、可溶性色素は産生じない。
■液体培地 生育良好で一様に混濁する。
■ＢＣＰミルク壇地 不変である。
Ｂ、形態的特徴 Φ形および配列 まっすぐ又はやや曲がった端の丸い桿菌で、単独、二連
、たまに短連鎖する。
■大きさ ０．６〜０．８　Ｘ２．５〜４．０　μｍ。
■運動性 なし。
■芽胞 細胞の中央または端に近い位置に卵形または長円形の形
状を呈して存在する。大きさは０．８〜１゜２　Ｘｌ、
５〜２．０μｍで菌体は芽胞により膨張する。
■多形成 なし。
Ｃ５生理的生化学的特徴 ダラム染色　　　　　　　　　　　　　十ＫＯＨ反応　
　　　　　　　　　　　　−抗酸性染色　　　　　　　
　　　　　　−カプセル形成　　　　　　　　　　　　
−〇Ｆテスト（Ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ培地）　変化
なしＯＦテスト（変法培地）””　　　Ｏ（酸化）嫌気
下での生育　　　　　　　　　　　−生育温度　６０℃
　　　　　　　　　　＋５０℃十 ４７℃　　　　　　　　　　＋ 生育ｐＨ８，６− ７，７＋ ５．６　　　　　　　　　　＋ ４．４　　　　　　　　　− 耐塩性　　Ｏ％　　　　　　　　　　＋３　％　　　　
　　　　　　＋ ５　％　　　　　　　　　　− ゼラチンの加水分解　　　　　　　　　−デンプンの加
水分解　　　　　　　　　十カゼインの加水分解　　　
　　　　　　−エスクリンの加水分解　　　　　　　　
十セルロースの加水分解　　　　　　　　−アルギニン
の加水分解　　　　　　　　十カタラーゼ産生　　　　
　　　　　　　十オキシダーゼ産生　　　　　　　　　
　十ウレアーゼ産生（ＳＳＲ培地）　　　　　−ウレア
ーゼ産生（ｃｈｒｉｓ、培地）　＋インドール産生　　
　　　　　　　　　−硫化水素産生　　　　　　　　　
　　　−アセトイン産生　　　　　　　　　　　　−Ｍ
Ｒテスト　　　　　　　　　　　　　　−硝酸塩還元　
　　　　　　　　　　　　十脱窒反応　　　　　　　　
　　　　　　−＊＊＊培地組成 （ＮＨ４）ｚＨＰＯ４１，Ｏｇ ＭｇＳＯ，・　７ＨｔＱ　　　　　　０．２ｇグルコー
ス　　　　　　　　１０．０ｇＢＴＢ（０，２χ水溶液
＞　　　　　１０．０ｇＫＣｌ　　　　　　　　　　　
　　０．２ｇイースト抽出物　　　　　　　１．０ｇ寒
天　　　　　　　　　　　　３．０ｇ蒸蒸水水　　　　
　　　１０００．０ｍ１（ｐＨ７，０） 利用性テスト（Ｓｉｍｏｎｓ培地） クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　−マレイン酸塩
　　　　　　　　　　　　　−リンゴ酸塩　　　　　　
　　　　　　　“グルコン酸塩　　　　　　　　　　　
　十プロピオン酸塩　　　　　　　　　　　　−マロン
酸塩　　　　　　　　　　　　　　−コハク酸塩　　　
　　　　　　　　　　十利用性テスト（ｃｈｒｉｓｔｅ
ｎｓｅｎ培地）クエン酸塩　　　　　　　　　　　　　
十マレイン酸塩　　　　　　　　　　　　　−リンゴ酸
塩　　　　　　　　　　　　　十グルコン酸塩　　　　
　　　　　　　　十プロピオン酸塩　　　　　　　　　
　　　十マロン酸塩　　　　　　　　　　　　　−コハ
ク酸塩　　　　　　　　　　　　　十グルコースよりガ
スの産生− 纏より酸の産生 ＣＮ源として（ＮＨ４）　ｚｌｌＰＯｎを使用）アドニ
トール　　　　　　　　　　　　−しく＋）−アラビノ
ース　　　　　　　−セロビオース　　　　　　　　　
　　　　＋ヅルシトール　　　　　　　　　　　　−メ
ソーエリスリトール　　　　　　　　−フラクトース　
　　　　　　　　　　　＋ガラクトース　　　　　　　
　　　　　−グルコース　　　　　　　　　　　　　　
＋グリセリン　　　　　　　　　　　　＋イノシトール
　　　　　　　　　　　　−イヌリン　　　　　　　　
　　　　　　−ラクトース　　　　　　　　　　　　　
　−マルトース　　　　　　　　　　　　　　＋マンニ
トール　　　　　　　　　　　　＋マンノース　　　　
　　　　　　　　　　　＋メレジトース　　　　　　　
　　　　　＋メリビオース　　　　　　　　　　　　　
＋ラフィノース　　　　　　　　　　　　＋Ｌ　（＋）
−ラムノース　　　　　　　　　−〇−リボース　　　
　　　　　　　　　＋サリシン　　　　　　　　　　　
　　　＋ソルビトール　　　　　　　　　　　　−ソル
ボース　　　　　　　　　　　　　−デンプン　　　　
　　　　　　　　　　　＋シュクロース　　　　　　　
　　　　　　＋トレハロース　　　　　　　　　　　　
　＋キシロース　　　　　　　　　　　　　　＋上記の
菌学的性質から、零Ｈ−１６５菌株の菌学的特徴は、ま
っすぐ又はやや曲がった端の丸い非運動性桿菌、ダラム
陽性、大きさは０．６〜０．８×２．５〜４．０μｍで
、芽胞を形成し芽胞によって菌体が膨張し、グルコース
を酸化的に分解して酸を産生し、カタラーゼおよびオキ
シダーゼ産生能陽性の高温性好気細菌であるといえる。
このような諸性状を有する本菌株は、芽胞を形成するダ
ラム陽性の好気性桿状細菌であることがらバチルス属に
属するものと判定される。さらに、本菌株のアセトイン
産生能、インドール産生能、グルコースよりガスの産生
能、嫌気下での生育能と同じ性状を示す他の菌種として
、バチルス　ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋ｍｏｐｈｉｌｕｓ　）：　
（Ａ）、バチルス　アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ　ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ　）　　：　　（Ｂ）　
、バチルス　バディウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｂａｄｉ
ｕｓ　）　　：　　（ｃ）　、バチルスフィルムス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｆｉｒｍｕｓ　）　　：　　（Ｄ）が
挙げられるが、これらの菌種と本菌株の菌学的性状を比
較すると次の通りである〔＋：陽性、−：陰性、ｄ：菌
株によって異なる、ＮＤ：データなし〕。
ＡＢＣＤ　　　本菌株 ダラム染色　　　　　＋　＋＋＋＋ 芽胞での 菌体の膨張　　　　ｄ　　−−−＋ 嫌気での生育　　　　−一一一一 カタラーゼ　　　　　＋　＋＋＋＋ ゼラチン分解　　　　＋　＋　　）ＩＱ　　＋　　　　
−デンプン分解　　　　＋　十−＋＋ カゼイン分解　　　　ｄ＋＋＋　　　　−インドール産
生　　　−一一一一 アセトイン産生　　　−−一一一 硝酸塩還元　　　　　ｄ−−ｄ　　　　＋クエン酸塩の
利用　　ｄ−−−− グルコース（ガス）−一−−− し−アラビノース（酸）ｄ　　＋　　−−−Ｄ〜グルコ
ース（酸）　　＋＋−＋　　　　＋マンニトール（酸）
ｄ＋−＋− Ｄ−キシロース（酸）ｄ＋−−＋ ６０℃での生育　　　＋−−一十 以上の比較から、本菌株の性状は、バチルスステアロサ
ーモフィラス（Ｂｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍ。
ｐｈｉｌｕｓ）の性状とゼラチン分解性の点で異なるが
、その他の諸性状についてはよく一致した。よって、本
菌株をバチルス　ステアロサーモフィラスに属するもの
と同定し、バチルス　ステアロサーモフィラスＨ−１６
５と命名し、本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所
に［微工研菌寄第９１６６号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９１６
６）Ｊとして寄託した。
本発明において使用されるバチルス属に属するモノグリ
セリドリパーゼ生産菌としては、上記のバチルス　ステ
アロサーモフィラスＨ−１６５はその一例であって、こ
の菌株に限らず、本発明モノグリセリドリパーゼを生産
する菌はすべて本発明において使用できる。
本発明のモノグリセリドリパーゼを製造するに当たり、
本発明モノグリセリドリパーゼ生産菌は、抗生物質およ
び酵素などの生産に使用される通常の方法で培養するこ
とができる。培養の形態は液体培養でも固体培養でもよ
いが、工業的にはモノグリセリドリパーゼ生産菌の細胞
をその生産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行うの
が望ましい。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものを広く使用することができる。炭素源としては同化
可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、
シュクロース、ラクトース、ガラクトース、マルトース
、マンニトール、ソルビトール、デキストリン、澱粉等
の炭水化物類、各種を機酸類、大豆油、オリーブ油等の
植物性油脂、ラード、鶏油等の動物性油脂などを使用で
きる。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であれば
よく、例えば、ペプトン、粉末酵母エキス、肉エキス、
大豆粉、カゼイン、脱脂綿実粉等を使用できる。その他
、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、ナ
トリウム、亜鉛、鉄、マンガン、ハロゲン等の種々の塩
類またはコーンスチブリカー、各種ビタミン類等が必要
に応じて使用される。
培養温度は、本発明モノグリセリドリパーゼ生産菌が発
育し、本酵素を生産する範囲内で適宜変更し得るが、４
０〜６５℃、特に４５〜５０℃が好ましい。培養時間は
、培養条件によって異なるが、本酵素が最高力価に達す
る時期を見計らって適当な時期に培養を終了すればよく
、１０〜２２時間が好ましい。
かくして得られたモノグリセリドリパーゼ生産菌の培養
物から本発明モノグリセリドリパーゼを採取するのであ
るが、本酵素はその菌体内に含有されるので、得られた
培養物から濾過または遠心分離等の手段により集菌し、
この菌体を超音波処理、フレンチプレス処理、ガラスピ
ーズ処理等の機械的破壊手段やリゾチーム等の酵素的破
壊手段等の種々の菌体処理手段を適宜選択組み合わせて
、粗製の本発明モノグリセリドリパーゼ含有液が得られ
る。また、必要に応じて、トリトンＸ−ｔＯＯ（商品名
）等の界面活性剤を添加してもよい。
次いで、この粗製の本発明モノグリセリドリパーゼ含有
液から公知の、蛋白質、酵素等の単離・精製手段を用い
ることによりさらに精製された本発明モノグリセリドリ
パーゼを得ることができる。
例えば、粗製の本発明モノグリセリドリパーゼ含有液に
、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパツー
ル等の有機溶媒を添加する分別沈澱法、硫安、食塩、硫
酸、アルミニウム等を添加する塩析沈澱法等により本酵
素を回収すればよい。さらにこの沈澱物は、分子篩別法
または各種のクロマトグラフィー法などにより電気泳動
法あるいは超遠心分析法等で単一のピークを示すまでに
精製すればよく、その精製手段としては、目的とする本
発明モノグリセリドリパーゼの性質を利用した手段を用
いればよく、例えば上記の沈澱物を水または緩衝液に熔
解した後、必要に応じて半透膜にて透析し、さらにＤＥ
ＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−セファセル、ＤＥＡＥ−
セファロース、ＤＥＡＥ−セファデックスＡ−５０、Ｄ
ＥＡＥ−トヨバール等のイオン交換樹脂や、セファデッ
クスＧ−１００，Ｇ−７５、セファクリルＳ−２００等
のゲル濾過剤による分子篩クロマトを行えばよく、また
これらの手段を適宜組み合わせて電気泳動法または超遠
心分析法等により単一のピークを示すまで精製すればよ
く、その後必要に応じてＷＩ！、例工ばマンニトール、
シ＝ＩＩ！、ソルビトール等、アミノ酸、例えばグルタ
ミン酸、グリシン等、ペプタイドまたは蛋白質として牛
血清アルブミン等の安定化剤を添加し、凍結乾燥等の処
理により精製された本酵素の粉体を得ることができる。
以上の通り、本発明モノグリセリドリパーゼは少なくと
も、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、下記の式（ｂ
）、（ｃ）の酵素反応を触媒せず、基質特異性としてモ
ノグリセリドに作用してグリセリドおよびトリグリセリ
ドに作用せず、さらに分子量が２７，０００±２，７０
０．至適ｐＨがｐＨ５、至適温度が７５℃で最大の活性
を示し、ｐＨ安定性がｐＨ７〜８、等電点がｐＨ４，６
±０．４、熱安定性が７０℃まで安定であること等の理
化学的性質から、公知のモノグリセリドリパーゼと異な
ることが認められ、よって本発明モノグリセリドリパー
ゼは新規な酵素であることが明白である。
（ａ）モノグリセリド十ＨｚＯ−−−→グリセロール＋
脂肪酸 （ｂ）ジグリセリド十Ｈ２Ｏ→−モノ グリセリド＋脂肪酸 （ｃ）トリグリセリド十ＨｔＯ ジグリセリド＋脂肪酸 さらに、被検液のモノグリセリドに、本発明の新規な酵
素モノグリセリドリパーゼを作用せしめ、次いで生成す
るグリセロールまたは脂肪酸のいづれか一方の測定を行
うことにより、モノグリセリドを含有してなる被検液の
分析を可能ならしめたものである。さらに、このモノグ
リセリドの新規な分析法は、例えば飲食物または体液等
に含まれるモノグリセリドの分析や、体液または血清な
どの中に存在する膵リパーゼの活性測定等の種々の分析
法として有用である。
即ち、本発明は被検液のモノグリセリドに、少なくとも
、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、下記の式（ｂ）
、（ｃ）の酵素反応を触媒せず、基質特異性としてモノ
グリセリドに作用してジグリセリドおよびトリグリセリ
ドに作用しない新規なモノグリセリドリパーゼを作用せ
しめ、次いで反応において生成されたモノグリセリドの
成分であるグリセロールまたは脂肪酸のいづれか一方を
測定してなるモノグリセリドを含有する被検液の分析法
を提供するものである。
（ａ）モノグリセリド十ＨｚＯ−−−−グリセロール＋
脂肪酸 （ｂ）ジグリセリド十Ｈ，Ｏ−−− モノグリセリド＋脂肪酸 （ｃ）トリグリセリド十ＨｔＯ−−−→ジグリセリド＋
脂肪酸 本発明におけるモノグリセリドを含有する被検液として
は、本発明の新規な酵素モノグリセリドリパーゼの基質
としてのモノグリセリドを含有してなるものであれば何
ら限定されるものではなく、飲食物中のモノグリセリド
含有被検液であってもよく、また膵リパーゼの活性を測
定するために、膵リパーゼ含有被検液に１．２−ジグリ
セリドを加えた後、一定条件下で反応生成せしめたモノ
グリセリドを含有する被検液であってもよい０例えば、
体液である膵リパーゼを含有する被検液において、これ
に膵リパーゼの基質である１、２−ジグリセリドならび
に非イオン性界面活性剤を加えて、一定の反応条件下で
反応せしめて、膵リパーゼの作用で基質である１、２−
ジグリセリドからモノグリセリドを生成させ、さらに該
生成モノグリセリドに本発明のモノグリセリドリパーゼ
を作用せしめて生成されるモノグリセリドの成分である
グリセロールまたは脂肪酸のいづれか一方を定量する、
膵リパーゼ基質の１．２−ジグリセリドと本発明のモノ
グリセリドリパーゼとを組み合わせてなる膵リパーゼ活
性測定法を挙げることができる。この反応被検液中、膵
リパーゼの活性を測定するに当り、膵リパーゼの作用を
高めるために添加される添加物としては、例えばコリパ
ーゼ、デオキシコール酸ナトリウム、塩化カルシウムお
よび塩化アンモニウム等があり、また基質の可溶化剤と
しては、コール酸ナトリウム等がある。
さらに、この膵リパーゼ活性測定に使用されるモノグリ
セリドリパーゼは、上記した如く第本発明の新規な酵素
であってその使用量としては、被検液中の膵リパーゼに
よって生成されるモノグリセリドを加水分解するにたる
充分な量であればよく、通常０　、　　Ｉ　Ｕ／＋Ｉ以
上好ましくは０．５〜２０／１程度使用すればよく、ま
たこの時に用いられる本酵素は水溶液のまま、または緩
衝液を添加したものでもよく、さらに凍結乾燥したもの
でもよい・このようにして、該被検液体に本発明のモノ
グリセリドリパーゼを作用せしめ、一定時間インキュベ
ートせしめるのであるが、その反応時間、反応温度とし
ては酵素が充分に反応する程度であればよく、例えば反
応温度では３０〜４０℃、好ましくは３７℃付近がよい
、かくして、この反応の結果、該被検液体中にグリセロ
ール、脂肪酸が生成され、次いでこれらのグリセロール
、脂肪酸のいづれか一方を測定するものである。
グリセロールの測定においては、まずグリセロールを基
質とする酵素、例えばグリセロキナーゼを用いてグリセ
リンから生成されるグリセロ−３−リン酸をグリセロリ
ン酸オキシダーゼで酸化させるグリセロキナーゼ・グリ
セロリン酸オキシダーゼ法やグリセロールオキシダーゼ
を用いる方法が簡便かつ有効に使用でき、例えばグリセ
ロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法としては、
本発明のモノグリセリドリパーゼによってモノグリセリ
ドから生成されたグリセロールにグリセロキナーゼ０．
１〜１００／＋ｗｌ、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）０
．１〜２．０ｍＭおよび塩化マグネシウム２〜５０ｍＭ
の添加でグリセロキナーゼを作用させることによりアデ
ノシンニリン酸（ＡＤＰ）およびグリセロ−３−リン酸
が生成され、さらにこのグリセロ−３−リン酸にグリセ
ロリン酸オキシダーゼ２，０〜５００／ｍｌを作用させ
ることにより酸素を消費してジヒドロキシアセトンリン
酸および過酸化水素が生成される。従って、この反応に
おいて消費される酸素、または生成されるジヒドロキシ
アセトンリン酸および過酸化水素のいづれかを測定して
グリセロールを定量すればよい、消費される酸素の測定
としては酸素電極を用いることが簡便である。また、生
成された過酸化水素の測定としては、過酸化水素電極を
用いる方法や過酸化水素と反応してその色調に変化を生
ずる１種もしくは２種以上の呈色剤を含有する染料組成
物を用いることによって比色測定する等の方法が挙げら
れる。またこの呈色剤としては、例えば生成する過酸化
水素と反応して安定な赤色体を形成する４価チタン化合
物とキシレノールオレンジによる反応、あるいはＮ−エ
チル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプロピル）
−メタ−トルイジン（以下Ｔ００Ｓと略す）あるいはフ
ェノール、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダ
ーゼによる反応を利用する方法などが挙げられる。さら
にこのＴＯＯ３あるいはフェノール、４−アミノアンチ
ピリンおよびパーオキシダーゼによる反応においては、
フェノールあるいはＴＯＯ８は全液量に対し０．ＯＩ〜
０．１％程度使用すればよく、４−アミノアンチピリン
は生成する過酸化水素量に対して、０．０１〜０．１％
、好ましくは０．０３％、さらにパーオキシダーゼは０
゜５〜１０Ｕ／ｓ＋１使用すればよく、またこのように
調製された呈色剤は必要に応じて、本発明のモノグリセ
リドリパーゼとともに調製してもよく、次いで呈色反応
の結果呈色せしめた色調を適当な波長にて測定し、検量
線から過酸化水素を定量すればよい、さらに上記の呈色
剤の代りに、ホモバニリン酸などの螢光剤を用いて行っ
てもよい。
同様に、グリセロールオキシダーゼ法としては、上記の
通り生成されたグリセロールにグリセロールオキシダー
ゼ５〜５０Ｕ／１１作用させることにより酸素を消費し
てジヒドロキシアセトンおよび過酸化水素が生成される
ので、この生成された過酸化水素をグリセロキナーゼ・
グリセロリン酸オキシダーゼ法における酸素や過酸化水
素定量手段と同様にして定量すればよい、さらにグリセ
ロールの定量手段としては上述のグリセロリン酸オキシ
ダーゼの代りにグリセロリン酸デヒドロゲナーゼを用い
て生成する還元型ＮＡＤを公知方法による定量手段を用
いて分析してもよく、さらにＡＴＰを用いてグリセロキ
ナーゼを作用させた場合においてＡＴＰから生成するＡ
ＤＰを公知方法に基づいて測定してもよい。
また、例えば、膵リパーゼ活性測定において、膵リパー
ゼの基質となる１、２−ジグリセリドおよび非イオン性
界面活性剤およびこの作用を高める添加剤、基質の可溶
化剤、モノグリセリドからグリセロールおよび脂肪酸が
生成される作用を高める添加剤、生成されたグリセロー
ルを測定するための各酵素およびこの作用を高める添加
剤、生成した過酸化水素の定量のための呈色剤等は、必
要に応じて、本発明のモノグリセリドリパーゼとともに
調製してもよい、さらに膵リパーゼ活性測定において使
用し得る基質であるｌ、２−ジグリセリドおよび非イオ
ン性界面活性剤の種類、使用量については、特開昭５９
−９１８９８号公報を参照して適宜調製すればよい、そ
の際、膵リパーゼ活性測定法における、例えばレイト・
アッセイ（Ｒａｔｅ　ａｓｓａｙ）法としては、調製し
た反応液１゜５ｍｌに膵リパーゼ活性測定のための検体
（血清）３０μｍを作用させ、３７℃（３０℃、２５℃
でも可）で、５５０ｎｍの波長にて連続的に比色測定す
る。またエンド・ポイン・アッセイ（Ｅｎｄｐｏｉｎｔ
　ａｓｓａｙ　）法としては調製した反応液１．Ｏｍｌ
に膵リパーゼ活性測定のための検体（血清）５０μｍを
作用させ、３７℃で正確に３０分間反応させた後、０．
５％５ＤＳＩ、Ｏｍｌを加え、５５０ｎｍの波長にて比
色測定する。
一方、脂肪酸を測定する方法としては、まずモノグリセ
リドリパーゼの作用でモノグリセリドから遊離される脂
肪酸を出発物質としてアシル−ＣｏＡに変換せしめる酵
素の反応工程を出発工程とし、以後、前工程で得られる
酵素反応物質を次の工程における酵素反応基質として用
いて、その次の工程の酵素反応基質へ転換する反応工程
の組合せからなる数段階の工程を経る一連の逐次反応工
程と最終工程における出発工程で生成されたアシル−Ｃ
ｏＡの転換反応とによるサイクリング反応を応用するも
のである。さらに詳しくは、これらの各工程は、出発工
程の脂肪酸からアシル−ＣＯＡ、次の工程のアシル−Ｃ
ｏＡからデヒドロアシル−Ｃｏ　Ａ　ｓデヒドロアシル
−ＣｏＡからヒドロキシアシル−ＣｏＡ、さらにヒドロ
キシアシル−ＣｏＡからケトアシル−Ｃｏ　Ａ　ｓ次い
でケトアシル−ＣｏＡからアシル−ＣｏＡとなすアシル
Ｃ０Ａへの転換反応工程であり、これらの工程を組合わ
せることにより、サイクリング反応として脂肪酸量を良
好に測定し得るものである。即ち、この反応の最終工程
で生成されたアシル−ＣｏＡは反応の・出発脂肪酸の鎖
長に比べて炭素数が２個少ないアシル基を有するもので
、さらにこのアシル−ＣｏＡはサイクリング反応により
順次にデヒドロアシル−ＣｏＡ、ヒドロキシアシル−Ｃ
ｏＡ、／ｙドアシルーＣｏＡとなり、次いでサイクリン
グ最終工程で再び２個炭素数を減じたアシル−ＣｏＡを
生成するサイクルを形成するため、脂肪酸の炭素数に応
じた高次のサイクリング反応を呈することになる。この
高次サイクルの過程におけるサイクル数に応じて、１モ
ル比の脂肪酸からサイクル工程の過程で生成または消費
される物質の高モル比の累積量を種々の手段により測定
することによって極めて高感度に検出できる変化量とし
て測定する。この測定において脂肪酸はｆａｌ、ＡＴＰ
またはＧＴＰとＣｏＡＳＨおよびアシル−ＣｏＡ・シン
セターゼ活性に基く反応工程によりアシル−ＣｏＡとな
し、次いで（ｂｌ、アシル−ＣｏＡを酸素およびアシル
−ＣｏＡ・オキシダーゼ活性に基く反応工程によりデヒ
ドロアシル−ＣｏＡとなし、さらに（ｃ）、このデヒド
ロアシル−ＣｏＡを水およびエノイル−ＣｏＡ・ヒドラ
ターゼ活性に基く反応工程によりヒドロキシアシル−Ｃ
ｏＡとなし、そして（ｄ）、このヒドロキシアシル−Ｃ
ｏＡをＮＡＤおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ・デ
ヒドロゲナーゼ活性に基く反応工程によりケトアシル−
ＣｏＡおよび還元型ＮＡＤとなし、最後に（ｅ）、この
ケトアシル−ＣｏＡをＣｏＡＳＨおよび３−ケトアシル
−ＣｏＡ・チオラーゼ活性に基（反応工程により（ａ）
、の反応工程で生ずるアシル−Ｃ，ｏＡのアシル基にお
ける炭素数に比べて炭素数が２個少ないアシル基からな
るアシル−ＣｏＡを生成するとともにＮＡＤを還元して
還元型ＮＡＤを生成する。即ち、この生成されたアシル
−ＣｏＡは、以後のそれぞれの反応工程の反応を経由し
てβ酸化を受けてアシル基の炭素数が２個少ないアシル
−ＣｏＡとなり、その際反応系において生成される物質
の検出できる変化量として、サイクリング反応の過程で
生成し蓄積する還元型ＮＡＤを分光分析により測定すれ
ばよく、この還元型ＮＡＤをＮＡＤに特異な吸収波長で
なく、還元型ＮＡＤに特異な吸収波長である３２０ｎｍ
〜３６０ｎｍ近辺の分光分析に基づいて定量するか、ま
たはジアホラーゼおよび水溶性テトラゾリウム塩を含存
する水素伝達系色原体を用いて比色定量すればよい。
脂肪酸の測定に際して、使用される酵素、試薬について
は特開昭５８−５１８９９号公報および特開昭５９−９
１８９８号公報を参照して適宜調製すればよい。
以上の通りに、調製された、本発明の新規なモノグリセ
リドリパーゼを使用してなる分析法は、その生成するグ
リセロールまたは脂肪酸のいづれか一方を測定すること
によって、例えば、飲食物または体液等に含まれるモノ
グリセリドの分析や、体液または血清等の中に存在する
膵リパーゼの活性測定等の種々の分析に使用される有用
なものである。
次に、実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが本
発明は何ら実施例によりて限定されるものではない。
実施例１　（菌体の培養） ペプトン１．０％、粉末酵母エキス０．５％、ミルクカ
ゼイン１．０％、ＮａＣ１０，２％、Ｋ、ＨＰＯ４０，
１％、Ｍｇ５Ｏ，−ＩＨｚ　００゜０５％、オリーブ油
０．５％からなる培地（ｐＨ７，０）１００ｍｌを１２
０℃、２０分間滅菌処理した後、これと同一組成の寒天
培地上で５０℃１５時間前培養したバチルス　ステアロ
サーモフィラスＨ−１６５の種菌を上記の培地に移植し
、５０℃で２５時間振とう培養を行った。１０時間目頃
から生育した菌体内にモノグリセリドリパーゼ活性が見
出された。活性がピークに達した時（０，１＋１／重ｌ
）培養を止め３０００回転１０分間の遠心分離を行い、
菌体を集めた。
実施例２　（酵素の抽出・精製） 実施例１と同様にして得られた培養液１．０００ｍ１　
　（５００ｍｌ容三角フラスコ１０本分）からの菌体を
１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）２００ｍｌにＱｉ
し、超音波処理（２００Ｗ、１０分間）を行って酵素を
可溶化した。可溶化液を１５、ＯＯＯｒｐｍｌＯ分間遠
心分離して澄明な上清液１７５ｍ１を得、この上清液に
冷アセトン３５０ｍ１を加えて酵素を沈澱させた。この
沈澱物を６５ｍ１の１０％硫安を含む１０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐ　Ｈ７，０）に溶解後、オクチル−セファロー
ス（）奪ルマシア製）を充填したカラム（３，５ｘ５ｃ
ｍ）に通し酵素を吸着させた。カラムの未吸着成分を１
０％硫安を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｍｌで
洗浄し、次いで１０ｍＭ　ＩＪン酸緩衝液（ｐ　Ｈ７，
０）で洗浄後、３％トリトンｘ−ｉｏｏで酵素をカラム
から溶出させた。
ｌフラクションｌＱｍｌとして分画し、その結果は第５
図に示す通りである。その活性画分（Ｎｏ。
２２−２５）を集め、アミコン社製限外濾過膜で４ｍｌ
にまで濃縮を行った後、１０　ｍ　ｌの冷アセトンで酵
素を沈澱せしめ、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離し
て沈澱を回収後、これを１０ｍＭリン酸緩衝１（ｐＨ７
，０）５ｍｌに熔解後、５００ｍ１の同緩衝液に対して
２０時間透析を行い、凍結乾燥し精製された酵素３ｍｇ
　（３，８Ｕ／ｍｇ）が得られた。
実施例３（膵リパーゼ活性測定法） グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法反応
液組成（ＧＫ−ＧＰＯ法〕 １グリセロリン酸オキシダーゼ　　　　２０．ＯＵ／ｍ
ｌグリセロールオキシダーゼ法反応液組成ＣＧｏ法〕１
．２−シリルイン　　　　　　　　　１．０＋ｍＭ＊＊
＊＊バッファーとしては、グツドの各種バッフｙ−ＢＢ
Ｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＤＩＰＳＯｌＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ
．、ＨＥＰＰＳＯ，ＭＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＴＡＰＳ、Ｔ
ＡＰＳＯ１ＴＥＳ％Ｔｒ　１ｃｉｎｅおよびトリス−塩
酸、ジメチルグルタル酸、イミダゾール等を使用できる
。また、ＴｏＯ８の代りにフェノールを用いてもよい。
〔測定方法〕
■レイト・アッセイ　（Ｒａｔｅ　ａｓｓａｙ）法上記
組成の反応液１．５ｍｌに３０μｌのヒト血清を加え、
混合した後、３７℃で５５０　ｎｍの吸光度を分光光度
計（島津ＶＶ−２５０）を用いて、連続的に記録し、３
分目以降の１分間当りの吸光度の増加速度を測定した。
リパーゼ活性は次式により算出した。結果を、ａＫ−ｃ
ｐｏ法については第３表、ＧＯ法については第４表に示
す。
第３表　　　（ＧＫ−ＧＰＯ法〕 第４表　　　ＣＧｏ法〕 リパーゼ活性測定（Ｕ／Ｌ　） ＝吸光度増加（Ａ５５０ｎｍ）　／分×」Ｊｌ−Ｉｇ、
ら ×」」遁−Ｘｌ、ＯＯＯ ｉｓ、ｅ：　　過酸化水素発色のミリ分子吸光係数（ｃ
ｍ”／　μ５ｏｌｅ） １．５３：　　反応液全容！（ｍり 旦：　ｍｌへの換算 １．０００：　　ｔへの換算 ■エンド・ポイン・アッセイ（ＩＥｎｄ　ｐｏｉｎｔ　
ａｓｓａｙ　）法 同−組成の反応液１．Ｑｍｌに５０μｍのヒト血清を加
え、混合した後、３７℃で３０分間反応後、０．５％５
ＤＳ１．Ｑｍｌで反応を止め、５５０ｎｍの吸光度を測
定した（ＡＳ）。
また、盲検として１，２−ジグリセリド、コリパーゼ、
デオキシコール酸を添加していない反応液で同様の操作
を行い、ブランクとした（ＡＢ）。
リパーゼ活性は次式により算出した。結果を、ＧＫ　−
ＧＰＯ法については第５表、ＧＯ法については第６表に
示す。
第５表　　　（ＧＫ−ＧＰＯ法〕 第６表　　　（Ｇｏ法） リパーゼ活性測定（Ｕ／Ｌ　’） １５．６：　　過酸化水素発色のミリ分子吸光係数（ｃ
ｍ”／μｍｏｌｅ） １．０００：　　１への換算 ２．０５ｊ　　反応液全容！（■ｌ） 実施例４（モノグリセリドの測定） グリセロキナーゼ・グリセロリン酸オキシダーゼ法反応
液組成（ＧＫ−ＧＰＯ法〕 グリセロールオキシダーゼ法反応液組成ＣＧｏ法〕＊＊
＊＊バッファーとしては、グツドの各種バッフｙ−ＢＥ
Ｓ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＤＩＰＳＯｌＥＰＰＳ、ＨＥＰＥＳ
、ＨＥＰＰＳＯ，ＭＯＰＳ、ＰＯＰＳ、ＴＡＰＳ、ＴＡ
ＰＳＯｌＴＥＳ、Ｔｒ　１ｃｉｎｏおよびトリス−塩酸
、ジメチルグルタル酸、イミダゾール等を使用できる。
また、ＴｏＯ８の代りにフェノールを用いてもよい。
〔測定方法〕
上記各反応液３．０ｍｌにモノグリセリド（１−モノオ
レイン）Ｏ〜０．５μ５ｏｌｅを含有する検体５０μｌ
を加え、ＧＫ−ＧＰＯ法により３７℃で１５分間発色反
応を行った後、５００ｎｍの吸光度を測定した。第５図
に示す様に、０．５μ５ｏｌｅのモノグリセリド量まで
比例した直線が得られた。
また、ＧＯ法も同様に０．５μ５ｏｌｅのモノグリセリ
ド量まで比例した直線が得られたものである。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明モノグリセリドリパーゼの至適ｐ）１
曲線、第２図は同酵素の至適温度曲線、第３図は同酵素
のｐＨ安定性曲線、第４図は同酵素の熱安定性曲線、第
５図は同酵素品精製工程の溶出曲線、第６図はモノグリ
セリドの検量線を示すものである。 第　１　図 １　九　Ｐ’ｒ’１ ｐＨ 第２図 支　１＆／￥− 辰にシＩＬ入（・Ｃ） 第３図 Ｐ　　’ｒ”＋　　９　’ｉｔ−’ｒ’ＬＨ 第４図 外　を足・阻 反Ｎ：／＆度（００） 第　　５　図 ↑ ／♂五着当 第６図 七ノ　イ　しイン：／ル爪（ｐ、ｍｏｌ已）特許庁長官
　小　川　邦　夫　殿 １．事件の表示 昭和６２年特許願第８０２９９号 ２、発明の名称 新規なモノグリセリドリパーゼ、その製法およびそれを
用いる分析法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　静岡県田方郡大仁町三福６３２番地の１自　　発 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 ６、補正の内容 明細書第１４頁第６行の「移動層」を「移動相同第１４
頁第１１行の「−〇−」を「−へ−」と訂正する。 同第１５頁第５行の「−・−」を「−〇−」と訂正する
。 同頁第６行のｒ−０−Ｊを「−・− 」と訂正する。 同第１６頁第２行から第６行の「（８）基質特異性・・
・・作用しない。」を以下の通り訂正する。 「（８）基質特異性；後述の本発明モノグリセリドリパ
ーゼ酵素活性測定測定法に従った条件下において、本発
明モノグリセリドリパーゼの基質特異性を調べた結果、
第１表に示す通り、α−モノラウリンに対して最大の活
性を示した。卵黄レシチン由来のジグリセリド、１，２
−シリルイン、１．３−シリルインおよびトリオレイン
を基質として用いた場合、本発明モノグリセリドリパー
ゼの存在において該基質から加水分解されたグリセロー
ルは検出されなかった理由から、本発明モノグリセリド
リパーゼは基質としてジグリセリド、トリグリセリドに
は作用しないものと判断された。 さらに、本発明モノグリセリドリパーゼのβ−モノグリ
セリドの基質に対する作用について説明する。 ■基質としてα−リルオイルーβ−オレオイル−ジグリ
セリドを用い酵素作用によって、遊離される脂肪酸の高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による確認 ｉ）α−リルオイルーβ−オレオイル−ジグリセリド０
．５削ｇ、非イオン性界面活性剤（トリトンｘ−ｉ　ｏ
　ｏ、　　シグマ社製）１．８Ｂ　、デオキシオール酸
３．８ｍｇ　、コリパーゼ２０単位、塩化カルシウム０
．１５ｍｇ、　０．１ＭＮ　−トリ　（ヒドロキシメチ
ル）メチル−３−アミノプロパンスルフォン酸（ＴＡＰ
Ｓ）−ＮａＯＨ（ｐＨ８，３）２００　／１１の組成の
反応液１．０　ｍβに膵由来リパーゼ５０μ！を加え、
３７°Ｃ・１０分間反応せしめその後反応を停止し、こ
の１５μ６ｔ−ＨｐＬｃに注入して下記の条件にて分析
した。 カラム：　Ｚｏｒｂｏｘ　００Ｓ（４，６ｍｍ　１２Ｉ
Ｘ２５ｃ、ｍ）溶　媒ニアセトニトリル：　Ｈ，Ｏ（９
６：４）検　出：紫外部吸収　２０５ｒｖ＋ 流　速：　１．２　ｍＡ！／ｍｉ　ｎ その結果、リルン酸がリテンションタイム２３分に検出
され、オレイン酸は検出されなかった。 このα位に結合したリルン酸の検出結果から、α、β−
ジグリセリドの基質に対しては、膵リパーゼはα位にの
み作用し加水分解するものと判明し、かつβ−オレオイ
ル−モノグリセリドが生成されると判断した。 ｉｉ）上記と同じ組成の反応液に本発明モノグリセリド
リパーゼ０．５単位を添加し同様の操作を行ない、遊離
される脂肪酸をＨＰ　Ｌ　Ｃで検出した。その結果、リ
テンションタイム２３分にリルン酸が、３１分にオレイ
ン酸が確認された。その結果から、本発明モノグリセリ
ドリパーゼは、膵リパーゼによってα、β−ジグリセリ
ドから生成したβ−モノグリセリドを基質として作用し
、β位に結合したリルン酸を遊離することが判明した。 かつこれによりα、β−ジグリセリドから遊離されたグ
リセロールを検出した。 ０５ｇとしてα、β−ジグリセリドを用いる本発明モノ
グリセリドリパーゼの基質特異性ｉ）基質として下記の
α、β−ジグリセリドについて膵リパーゼおよび本発明
モノグリセリドリパーゼを用いて、膵リパーゼによりα
位を加水分解せしめ、生成されたβ−モノグリセリドに
本発明モノグリセリドリパーゼを作用せしめて′ｔ１離
されるグリセロールを分析した結果、基質α−オレオイ
ル−β−バルミトイル−ジグリセリド、α−バルミトイ
ル−β〜オレオイルージグリセリド、α、β−シリルイ
ルグリセリドについてすべてグリセロールが検出された
。なお、膵リパーゼ単独使用の場合は、グリセロールは
検出されなかった。」明細書第２２頁第４行の「多形成
」を「多形性」と訂正する。 同第２８頁第２行の「カタラーゼ」を「カタラーゼ産生
」と訂正する。 ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１６７３）ｊを加入する・同第３１
頁第２０行の「硫酸、アルミニウム」を「硫酸ナトリウ
ム」と訂正する。 同第３２頁第２行から４行の「分子篩・・・・分析法等
で」を「分子篩、各種のクロマトグラフィー法、電気泳
動法あるいは超遠心分析法等を適宜組合せ用いて」と訂
正する。 同第３３頁第６行から第７行の「グリセリド」を「ジグ
リセリド」と訂正する。 同第３７頁第１６行の「グリセリン」を「グリセロール
」と訂正する。 、同第３８頁第２０行の「染料」を「染色」と訂正する
。 同第３９頁第９行の「方法」を「試薬」と訂正する。 同第５６頁第８行の「第５図」を「第６図」と訂正する
。 ７、添付書類の目録

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）少なくとも、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し
    、基質特異性としてモノグリセリドに作用してジグリセ
    リドおよびトリグリセリドに作用しない新規なモノグリ
    セリドリパーゼ。 （ａ）モノグリセリド＋Ｈ＿２Ｏ→ グリセロール＋脂肪酸
  2. （２）モノグリセリドリパーゼが下記の理化学的性質を
    有する特許請求の範囲第１項記載の新規なモノグリセリ
    ドリパーゼ。 ［１］分子量：２７，０００±２，７００ ［２］至適ｐＨ：ｐＨ５付近 ［３］至適温度：７５℃付近で最大の活性を示す［４］
    ｐＨ安定性：ｐＨ７〜８（７５℃、１０分間処理） ［５］熱安定性：７０℃まで安定である（ｐＨ７．５、
    １０分間処理） ［６］等電点：ｐＨ４．６±０．４
  3. （３）バチルス属に属する、少なくとも、下記の式（ａ
    ）の酵素反応を触媒し、基質特異性としてモノグリセリ
    ドに作用してジグリセリドおよびトリグリセリドに作用
    しないモノグリセリドリパーゼ生産菌を培地に培養し、
    培養物から該モノグリセリドリパーゼを採取することを
    特徴とする新規なモノグリセリドリパーゼの製法。 （ａ）モノグリセリド＋Ｈ＿２Ｏ→ グリセロール＋脂肪酸
  4. （４）バチルス属に属する該モノグリセリドリパーゼ生
    産菌が、バチルス　ステアロサーモフィラスである特許
    請求の範囲第３項記載の製法。
  5. （５）バチルス　ステアロサーモフィラスに属する該モ
    ノグリセリドリパーゼ生産菌が、バチルス　ステアロサ
    ーモフィラスＨ−１６５（ＦＥＲＭＰ−９１６６）であ
    る特許請求の範囲第４項記載の製法。
  6. （６）被検液中のモノグリセリドを測定するに当たり、
    被検液に、少なくとも、下記の式（ａ）の酵素反応を触
    媒し、基質特異性としてモノグリセリドに作用してジグ
    リセリドおよびトリグリセリドに作用しないモノグリセ
    リドリパーゼを作用せしめ、次いで反応において生成さ
    れたモノグリセリドの成分であるグリセロールまたは脂
    肪酸のいづれか一方を測定することを特徴とするモノグ
    リセリドを含有する被検液の分析法。 （ａ）モノグリセリド＋Ｈ＿２Ｏ→ グリセロール＋脂肪酸
  7. （７）被検液中のモノグリセリドが、被検液中で１，２
    −ジグリセリドに膵リパーゼを作用させることにより遊
    離したモノグリセリドである特許請求の範囲第６項記載
    の分析法。
  8. （８）グリセロールの測定において、生成グリセロール
    にグリセロールオキシダーゼ、またはグリセロキナーゼ
    およびグリセロリン酸オキシダーゼを作用させることに
    より生成する過酸化水素を測定してなる特許請求の範囲
    第６項記載の分析法。
  9. （９）過酸化水素の測定において、過酸化水素の存在下
    で色調変化を受けることができる１種もしくは２種以上
    の呈色剤を含有する染色組成物を用いる特許請求の範囲
    第８項記載の分析法。
  10. （１０）染色組成物が、パーオキシダーゼを含有してな
    る特許請求の範囲第９項記載の分析法。
  11. （１１）パーオキシダーゼを０．５〜１０Ｕ使用してな
    る特許請求の範囲第１０項記載の分析法。
  12. （１２）染色組成物の呈色剤が４−アミノアンチピリン
    とＮ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプ
    ロピル）−メタ−トルイジンまたはフェノールとパーオ
    キシダーゼからなる特許請求の範囲第９項記載の分析法
    。
  13. （１３）脂肪酸の測定において、下記の反応工程（ａ）
    ．、（ｂ）．、（ｃ）．、（ｄ）．、（ｅ）．、（ａ）
    ．脂肪酸をアシル−ＣｏＡにする反応工程、（ｂ）．ア
    シル−ＣｏＡをデヒドロアシル−ＣｏＡにする反応工程
    、 （ｃ）．デヒドロアシル−ＣｏＡをヒドロキシアシル−
    ＣｏＡにする反応工程、 （ｄ）．ヒドロキシアシル−ＣｏＡをケトアシル−Ｃｏ
    Ａにする反応工程、 （ｅ）．ケトアシル−ＣｏＡをアシル−ＣｏＡにする反
    応工程、 および検出できる反応工程経由生成物の量的変化を測定
    する工程である特許請求の範囲第６項記載の分析法。
  14. （１４）反応工程（ａ）．、（ｂ）．、（ｃ）．、（ｄ
    ）．、（ｅ）．において、 （ａ）．反応工程が、脂肪酸とＣｏＡＳＨとＡＴＰまた
    はＧＴＰおよびアシル−ＣｏＡ・シンセターゼ活性に基
    く反応工程、 （ｂ）．反応工程が、アシル−ＣｏＡと酸素およびアシ
    ル−ＣｏＡ・オキシダーゼ活性に基く反応工程、 （ｃ）．反応工程が、デヒドロアシル−ＣｏＡと水およ
    びエノイル−ＣｏＡ・ヒドラターゼ活性に基く反応工程
    、 （ｄ）．反応工程が、ヒドロキシアシル−ＣｏＡとＮＡ
    Ｄおよび３−ヒドロキシアシル−ＣｏＡ・デヒドロゲナ
    ーゼ活性に基く反応工程、 （ｅ）．反応工程が、ケトアシル−ＣｏＡとＣｏＡＳＨ
    および３−ケトアシル−ＣｏＡ・チオラーゼ活性に基く
    反応工程、 である特許請求の範囲第１３項記載の分析法。
  15. （１５）検出できる反応工程経由生成物の量的変化を測
    定する工程が、反応工程によって生成する還元型ＮＡＤ
    を定量する工程である特許請求の範囲第１３項記載の分
    析法。
  16. （１６）生成する還元型ＮＡＤの定量が、ＮＡＤに特異
    な吸収波長でなく、還元型ＮＡＤに特異な吸収波長であ
    る３２０ｎｍ〜３６０ｎｍ近辺の分光分析に基づく定量
    である特許請求の範囲第１５項記載の分析法。
  17. （１７）生成する還元型ＮＡＤの定量が、還元型ＮＡＤ
    の水素原子の受容能を有する水素伝達系色原体の発色に
    よる定量である特許請求の範囲第１５項記載の分析法。
  18. （１８）還元型ＮＡＤの水素原子の受容能を有する水素
    伝達系色原体がジアホラーゼおよび水溶性テトラゾリウ
    ム塩を含有する水素伝達系色原体である特許請求の範囲
    第１７項記載の分析法。
  19. （１９）被検液中の膵リパーゼ活性測定において、少な
    くとも１，２−ジグリセリド含有試薬に被検液の膵リパ
    ーゼを作用せしめ、次いで遊離したモノグリセリドに少
    なくとも、下記の式（ａ）の酵素反応を触媒し、基質特
    異性としてモノグリセリドに作用してジグリセリドおよ
    びトリグリセリドに作用しないモノグリセリドリパーゼ
    を作用せしめ、次いで反応において生成されたモノグリ
    セリドの成分であるグリセロールまたは脂肪酸のいづれ
    か一方を測定することを特徴とする被検液中の膵リパー
    ゼ活性の測定法。 （ａ）モノグリセリド＋Ｈ＿２Ｏ→ グリセロール＋脂肪酸
  20. （２０）グリセロールの測定において、生成グリセロー
    ルにグリセロールオキシダーゼ、またはグリセロキナー
    ゼおよびグリセロリン酸オキシダーゼを作用させること
    により生成する過酸化水素を測定してなる特許請求の範
    囲第１９項記載の測定法。
  21. （２１）過酸化水素の測定において、過酸化水素の存在
    下で色調変化を受けることができる１種もしくは２種以
    上の呈色剤を含有する染色組成物を用いる特許請求の範
    囲第２０項記載の測定法。
  22. （２２）染色組成物が、パーオキシダーゼを含有してな
    る特許請求の範囲第２１項記載の測定法。
  23. （２３）パーオキシダーゼを０．５〜１０Ｕ使用してな
    る特許請求の範囲第２２項記載の測定法。
  24. （２４）染色組成物の呈色剤が４−アミノアンチピリン
    とＮ−エチル−Ｎ−（２−ハイドロキシ−３−スルホプ
    ロピル）−メタ−トルイジンまたはフェノールとパーオ
    キシダーゼからなる特許請求の範囲第２１項記載の測定
    法。
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