JPH06113837A - 新規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−ｔ酵素、その製造法およびこれを用いた測定法並びに該酵素を含有する分析用組成物 - Google Patents
新規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−ｔ酵素、その製造法およびこれを用いた測定法並びに該酵素を含有する分析用組成物Info
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- JPH06113837A JPH06113837A JP32906491A JP32906491A JPH06113837A JP H06113837 A JPH06113837 A JP H06113837A JP 32906491 A JP32906491 A JP 32906491A JP 32906491 A JP32906491 A JP 32906491A JP H06113837 A JPH06113837 A JP H06113837A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】キサンチンオキシダーゼ活性を有さず、アデノ
シン、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニ
ン、グアニン、プリン、チミジンに活性を有さず、これ
らの基質およびヒポキサンチン、キサンチンによつて活
性が阻害されない酵素を用いて、試料中に存在するキサ
ンチンあるいはキサンチンを生成する反応系に係わる基
質もしくは酵素活性の定量を行うものである。 【構成】アデノシン、イノシン、キサントシン、グアノ
シン、アデニン、グアニン、チミジンに対して基質特異
性を示さず、ヒポキサンチン、キサンチンに対して基質
特異性を有し、補酵素としてＮＡＤ類および／またはチ
オＮＡＤ類を利用して、ヒポキサンチンを基質としてキ
サンチンに酸化して還元型ＮＡＤ類および／または還元
型チオＮＡＤ類を生成するか、またはキサンチンを基質
として尿酸に酸化して還元型ＮＡＤ類および／または還
元型チオＮＡＤ類を生成する反応を触媒せしめるもので
ある。
シン、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニ
ン、グアニン、プリン、チミジンに活性を有さず、これ
らの基質およびヒポキサンチン、キサンチンによつて活
性が阻害されない酵素を用いて、試料中に存在するキサ
ンチンあるいはキサンチンを生成する反応系に係わる基
質もしくは酵素活性の定量を行うものである。 【構成】アデノシン、イノシン、キサントシン、グアノ
シン、アデニン、グアニン、チミジンに対して基質特異
性を示さず、ヒポキサンチン、キサンチンに対して基質
特異性を有し、補酵素としてＮＡＤ類および／またはチ
オＮＡＤ類を利用して、ヒポキサンチンを基質としてキ
サンチンに酸化して還元型ＮＡＤ類および／または還元
型チオＮＡＤ類を生成するか、またはキサンチンを基質
として尿酸に酸化して還元型ＮＡＤ類および／または還
元型チオＮＡＤ類を生成する反応を触媒せしめるもので
ある。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アデノシン、イノシ
ン、キサントシン、グアノシン、アデニン、グアニン、
チミジンに対し基質特異性を示さず、少なくともヒポキ
サンチン、キサンチンに対し基質特異性を有する新規な
キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素と、その製造法、
および該酵素を用いた試料中に存在するヒポキサンチン
またはキサンチンもしくはヒポキサンチンまたはキサン
チンを生成する反応系に係わる基質または酵素活性の定
量法並びにそれを含有する分析用組成物に関する。
ン、キサントシン、グアノシン、アデニン、グアニン、
チミジンに対し基質特異性を示さず、少なくともヒポキ
サンチン、キサンチンに対し基質特異性を有する新規な
キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素と、その製造法、
および該酵素を用いた試料中に存在するヒポキサンチン
またはキサンチンもしくはヒポキサンチンまたはキサン
チンを生成する反応系に係わる基質または酵素活性の定
量法並びにそれを含有する分析用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】キサンチンデヒドロゲナーゼは、ヒポキ
サンチンをキサンチンに、キサンチンを尿酸に酸化する
反応を触媒する酵素〔ＥＣ．１．２．１．３７〕で酸化
反応の際、補酵素としてＮＡＤ+ を利用することが知ら
れている。すなわち、試料中に存在するヒポキサンチン
とキサンチン、あるいはヒポキサンチンとキサンチンを
生成する反応系により生成されたヒポキサンチンとキサ
ンチンを酸化する際に等量生成されるＮＡＤＨを測定す
ることにより、試料中に存在、あるいは生成されたヒポ
キサンチンとキサンチン、あるいはこれらの基質を生成
する反応系に係わる基質もしくは酵素活性を定量できる
（特開昭６２−３２９００号公報）。
サンチンをキサンチンに、キサンチンを尿酸に酸化する
反応を触媒する酵素〔ＥＣ．１．２．１．３７〕で酸化
反応の際、補酵素としてＮＡＤ+ を利用することが知ら
れている。すなわち、試料中に存在するヒポキサンチン
とキサンチン、あるいはヒポキサンチンとキサンチンを
生成する反応系により生成されたヒポキサンチンとキサ
ンチンを酸化する際に等量生成されるＮＡＤＨを測定す
ることにより、試料中に存在、あるいは生成されたヒポ
キサンチンとキサンチン、あるいはこれらの基質を生成
する反応系に係わる基質もしくは酵素活性を定量できる
（特開昭６２−３２９００号公報）。
【０００３】ヒポキサンチンおよび／あるいはキサンチ
ンを生成する反応系に係わる基質としては、アデノシ
ン、アデニン、イノシン、キサントシン、グアノシン、
グアニン等が、酵素としてはアデノシンデアミナーゼ
（ＥＣ．３．５．４．４）、グアニンデアミナーゼ（Ｅ
Ｃ．３．５．４．３）、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ（ＥＣ．２．４．２．１）、５’−ヌクレオチダー
ゼ等が知られている。
ンを生成する反応系に係わる基質としては、アデノシ
ン、アデニン、イノシン、キサントシン、グアノシン、
グアニン等が、酵素としてはアデノシンデアミナーゼ
（ＥＣ．３．５．４．４）、グアニンデアミナーゼ（Ｅ
Ｃ．３．５．４．３）、プリンヌクレオシドホスホリラ
ーゼ（ＥＣ．２．４．２．１）、５’−ヌクレオチダー
ゼ等が知られている。
【０００４】これらは臨床診断において肝障害のスクリ
ーニングとして有用であり、例えばグアニンデアミナー
ゼの場合は、グアニンを基質として生成されるキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼを用いて酸化し、その時、
生成される過酸化水素を測定する方法が汎用されてい
る。
ーニングとして有用であり、例えばグアニンデアミナー
ゼの場合は、グアニンを基質として生成されるキサンチ
ンをキサンチンオキシダーゼを用いて酸化し、その時、
生成される過酸化水素を測定する方法が汎用されてい
る。
【０００５】また、アデノシンデアミナーゼの場合は、
反応で生成されるアンモニアを、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いてα−ケトグルタル酸と還元型ＮＡＤＰ
の存在下、還元型ＮＡＤＰの減少を測定する方法が汎用
されている。しかし、キサンチンオキシダーゼを用いた
グアナーゼ活性測定は試料中のアスコルビン酸等の還元
物質の影響を受けやすく、また、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いたアデノシンデアミナーゼ活性測定は、
試料中に存在するアンモニアの影響を回避できないとい
う、それぞれ大きな問題点を有していた。
反応で生成されるアンモニアを、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いてα−ケトグルタル酸と還元型ＮＡＤＰ
の存在下、還元型ＮＡＤＰの減少を測定する方法が汎用
されている。しかし、キサンチンオキシダーゼを用いた
グアナーゼ活性測定は試料中のアスコルビン酸等の還元
物質の影響を受けやすく、また、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼを用いたアデノシンデアミナーゼ活性測定は、
試料中に存在するアンモニアの影響を回避できないとい
う、それぞれ大きな問題点を有していた。
【０００６】キサンチンデヒドロゲナーゼは鳥、ラツト
肝臓由来の酵素〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４２
（１８）；４０９７（１９６７）〕が代表的なものとし
て知られているが、その他微生物に由来するものとして
は、ストレプトミセス属〔Ａｇｒ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅ
ｍ．，４１；１１６１（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，８６，４５（１９７９）〕，ミクロコツカス属
〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４２，４１０８（１９
６７）〕、ノイロスポラ属〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５３，２６０４（１９７８）〕、シュウドモナ
ス属〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４
１０，１２（１９７５）〕、ノルカルデイオイデス属あ
るいはノカルデイア属（特開昭６１−１７０３８６号公
報）のものが知られている。
肝臓由来の酵素〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４２
（１８）；４０９７（１９６７）〕が代表的なものとし
て知られているが、その他微生物に由来するものとして
は、ストレプトミセス属〔Ａｇｒ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅ
ｍ．，４１；１１６１（１９７７），Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，８６，４５（１９７９）〕，ミクロコツカス属
〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４２，４１０８（１９
６７）〕、ノイロスポラ属〔Ｊ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅ
ｍ．，２５３，２６０４（１９７８）〕、シュウドモナ
ス属〔Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４
１０，１２（１９７５）〕、ノルカルデイオイデス属あ
るいはノカルデイア属（特開昭６１−１７０３８６号公
報）のものが知られている。
【０００７】しかし、これらの酵素は基質特異性に問題
がある。即ち、ストレプトミセス属の酵素はグアニンに
活性を有し、ミクロコツカス属およびシユウドモナス属
の酵素は、プリンに活性を有するばかりか本質的にオキ
シダーゼ活性を有している。ノイロスポラ属の酵素は、
低濃度のヒポキサンチンとキサンチンによつて活性が阻
害され、ノカルデイオイデス属あるいはノカルデイア属
の酵素は、イノシンに活性を有していることが知られて
いる。このように、既知のキサンチンデヒドロゲナーゼ
はそれぞれ問題点を抱えており実用されるに至つていな
い。
がある。即ち、ストレプトミセス属の酵素はグアニンに
活性を有し、ミクロコツカス属およびシユウドモナス属
の酵素は、プリンに活性を有するばかりか本質的にオキ
シダーゼ活性を有している。ノイロスポラ属の酵素は、
低濃度のヒポキサンチンとキサンチンによつて活性が阻
害され、ノカルデイオイデス属あるいはノカルデイア属
の酵素は、イノシンに活性を有していることが知られて
いる。このように、既知のキサンチンデヒドロゲナーゼ
はそれぞれ問題点を抱えており実用されるに至つていな
い。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】キサンチンオキシダー
ゼ活性を有さず、少なくともアデノシン、イノシン、キ
サントシン、グアノシン、アデニン、グアニン、プリ
ン、チミジンに活性を有さず、これらの基質およびヒポ
キサンチン、キサンチンによつて活性が阻害されない新
規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を見出し、本
発明酵素を用いて試料中に存在するキサンチンあるいは
キサンチンを生成する反応系に係わる基質もしくは酵素
活性の定量を提供するものである。
ゼ活性を有さず、少なくともアデノシン、イノシン、キ
サントシン、グアノシン、アデニン、グアニン、プリ
ン、チミジンに活性を有さず、これらの基質およびヒポ
キサンチン、キサンチンによつて活性が阻害されない新
規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を見出し、本
発明酵素を用いて試料中に存在するキサンチンあるいは
キサンチンを生成する反応系に係わる基質もしくは酵素
活性の定量を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】人の血液中には、アデノ
シン、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニ
ン、グアニン、プリン等が存在し、例えばイノシンは約
０．１ｍＭ、アデノシンは約０．３ｍＭ存在しているこ
とが知られている〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６
（１），８１（１９９０）〕。従前のキサンチンデヒド
ロゲナーゼを用いて、例えば血液中のヒポキサンチンや
キサンチンを測定しようとした場合には、上述の基質の
存在は正誤差として問題になつてくる。
シン、イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニ
ン、グアニン、プリン等が存在し、例えばイノシンは約
０．１ｍＭ、アデノシンは約０．３ｍＭ存在しているこ
とが知られている〔Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３６
（１），８１（１９９０）〕。従前のキサンチンデヒド
ロゲナーゼを用いて、例えば血液中のヒポキサンチンや
キサンチンを測定しようとした場合には、上述の基質の
存在は正誤差として問題になつてくる。
【００１０】特に、ノカルデイオイデス属あるいはノカ
ルデイア属のキサンチンデヒドロゲナーゼは、イノシン
に対して約７％の相対活性（キサンチンに対して）を示
すので、生体内成分中にはイノシン含量が高いために大
きな測定誤差を与えるという欠点があり、測定系に使用
し得ない。
ルデイア属のキサンチンデヒドロゲナーゼは、イノシン
に対して約７％の相対活性（キサンチンに対して）を示
すので、生体内成分中にはイノシン含量が高いために大
きな測定誤差を与えるという欠点があり、測定系に使用
し得ない。
【００１１】また、グアニンデアミナーゼやアデノシン
アミナーゼ活性を測定しようとした場合には従前のキサ
ンチンデヒドロゲナーゼがアデノシンやグアニンに活性
を有していろときには実用に供することはできない。こ
れらの問題点を解決するために広く自然界よりスクリー
ニングしたところ、目的とする性能を有するキサンチン
デヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を生産する菌株を発見し、本
発明を完成するに至つた。
アミナーゼ活性を測定しようとした場合には従前のキサ
ンチンデヒドロゲナーゼがアデノシンやグアニンに活性
を有していろときには実用に供することはできない。こ
れらの問題点を解決するために広く自然界よりスクリー
ニングしたところ、目的とする性能を有するキサンチン
デヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を生産する菌株を発見し、本
発明を完成するに至つた。
【００１２】即ち、本発明は、細菌性桿菌に属し、キサ
ンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌、細菌−Ｎｏ．
１９７（１０）〔Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｎｏ．１９７（１
０）に関するものである。従つて本発明は細菌性桿菌、
細菌−Ｎｏ．１９７（１０）であつて、キサンチンデヒ
ドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素
を生成蓄積し、これよりアデノシン、イノシン、キサン
トシン、グアノシン、アデニン、グアニンに実質的に作
用しないキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を採取す
ることにより得られる新規なキサンチンデヒドロゲナー
ゼ−Ｔ酵素、その製造法およびそれを用いた基質あるい
は酵素活性の定量法並びにその酵素を含有する分析用組
成物に関する。
ンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌、細菌−Ｎｏ．
１９７（１０）〔Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｎｏ．１９７（１
０）に関するものである。従つて本発明は細菌性桿菌、
細菌−Ｎｏ．１９７（１０）であつて、キサンチンデヒ
ドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産能を有する微生物を培地に培
養し、培養物中にキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素
を生成蓄積し、これよりアデノシン、イノシン、キサン
トシン、グアノシン、アデニン、グアニンに実質的に作
用しないキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を採取す
ることにより得られる新規なキサンチンデヒドロゲナー
ゼ−Ｔ酵素、その製造法およびそれを用いた基質あるい
は酵素活性の定量法並びにその酵素を含有する分析用組
成物に関する。
【００１３】本発明で使用するアデノシン、イノシン、
キサントシン、グアノシン、アデニン、グアニンに実質
的に作用しないキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素
は、好ましくは細菌性桿菌に属する本菌株、細菌Ｎｏ．
１９７（１０）（微工研条寄第３６６４）より得られる
が、本発明酵素を生産する能力を有するものであればい
ずれの菌株から得てもよいが、例えば本発明者らが三重
県度合郡南島町の土壌より分離した細菌性桿菌に属する
細菌−Ｎｏ．１９７（１０）が挙げられ、この菌株は本
発明に最も有効に使用される菌株の一例であつて、本菌
株の菌学的性質を示すと次の通りである。
キサントシン、グアノシン、アデニン、グアニンに実質
的に作用しないキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素
は、好ましくは細菌性桿菌に属する本菌株、細菌Ｎｏ．
１９７（１０）（微工研条寄第３６６４）より得られる
が、本発明酵素を生産する能力を有するものであればい
ずれの菌株から得てもよいが、例えば本発明者らが三重
県度合郡南島町の土壌より分離した細菌性桿菌に属する
細菌−Ｎｏ．１９７（１０）が挙げられ、この菌株は本
発明に最も有効に使用される菌株の一例であつて、本菌
株の菌学的性質を示すと次の通りである。
【００１４】尚、本菌株の同定に当たつては、同定試験
は医学細菌同定の手引き（第２版）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９７４）に準じて
行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｖｏｌ．１（１９８４）、同誌，Ｖｏｌ．２（１
９８６）、同誌，Ｖｏｌ．３（１９８９）などと対比し
て同定を行つた。
は医学細菌同定の手引き（第２版）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９７４）に準じて
行い、実験結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏ
ｆ ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ Ｖｏｌ．１（１９８４）、同誌，Ｖｏｌ．２（１
９８６）、同誌，Ｖｏｌ．３（１９８９）などと対比し
て同定を行つた。
【００１５】（１）生育の特徴 普通寒天斜面培地 線状に良好に生育する。灰白色〜淡黄土色を呈する。可
溶性色素は産生しない。 普通寒天平面培地 円形で丘状の集落を形成する。表面は滑らかで、光沢が
あり湿潤である。灰白色〜淡黄土色を呈するが、可溶性
色素は産生能しない。 液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁し、薄い皮膜を形成する。 リトモスミルク培地 アルカリになる。
溶性色素は産生しない。 普通寒天平面培地 円形で丘状の集落を形成する。表面は滑らかで、光沢が
あり湿潤である。灰白色〜淡黄土色を呈するが、可溶性
色素は産生能しない。 液体培地（ペプトン水） 生育良好で一様に混濁し、薄い皮膜を形成する。 リトモスミルク培地 アルカリになる。
【００１６】（２）ＤＮＡのＧＣｍｏl ％ ６０〜６０．２ （３）主たるイソプレノイドキノン Ｑ−１０ （４）形態的特徴 端の丸いまっすぐまたはやや曲がった桿状細菌で、単独
または二連、たまに短連鎖する。大きさは０．３〜０．
５×０．５〜１．０ｕｍで極毛、双極毛または周毛で運
動する。芽胞非形成で多形性はない。Ｙ字形に配列する
ときがある。
または二連、たまに短連鎖する。大きさは０．３〜０．
５×０．５〜１．０ｕｍで極毛、双極毛または周毛で運
動する。芽胞非形成で多形性はない。Ｙ字形に配列する
ときがある。
【００１７】（５）生理・生化学的性質〔＋；陽性、
（＋）；弱陽性、−；陰性、ＮＴ；未実施〕 グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ） ＮＴ
（＋）；弱陽性、−；陰性、ＮＴ；未実施〕 グラム染色 ＋ ＫＯＨ反応 − 抗酸性染色 − カプセル形成 − ＯＦテスト（ｈｕｇｈ−Ｌｅｉｆｓｏｎ） ＮＴ
【００１８】 ＯＦテスト（Ｎ源にＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ） Ｏ（酸化） 好気での生育 ＋ 嫌気での生育 − 生育温度 ４２℃ − ３７℃ − ３０℃ ＋ ２０℃ ＋ １０℃ ＮＴ 食塩耐性 ０％ ＋ １．５％ ＋ ３．０％ − 生育ｐＨ ５．７ − ６．７ ＋ ９．０ ＋ １０．０ − ゲラチン分解 − デンプン分解 − カゼイン分解 −
【００１９】 エスクリン分解 ＋ セルロース分解 − チロシン分解 − ｔｗｅｅｎ８０分解 − アルギニン分解 ＮＴ カタラーゼ産生 ＋ オキシダーゼ産生 ＋ レシチナーゼ産生 − ウレアーゼ産生（ＳＳＲ） −
【００２０】 ウレアーゼ産生（Ｃｈｒｉｓ．） ＋ インドール産生 − 硫化水素産生（lead acetate paper） ＋ アセトイン産生（Ｋ2 ＨＰＯ4 ） − アセトイン産生（ＮａＣl ） − ＭＲテスト − 硝酸塩還元テスト（ガス産生） − （ＮＯ2 - の検出） − （ＮＯ3 - の検出） ＋
【００２１】シモンズ培地での利用性（アルカリ産生） クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋
【００２２】 クリステンゼン培地での利用性（アルカリ産生） クエン酸塩 ＋ リンゴ酸塩 ＋ マレイン酸塩 − マロン酸塩 − プロピオン酸塩 − グルコン酸塩 − コハク酸塩 ＋ グルコースよりのガス産生 −
【００２３】糖よりの酸の産生 アドニトール ＋ Ｌ（＋）アラビノース ＋ セロビオース ＋ ズルシトール ＋ メソエリスリトール − フラクトース ＋ Ｄガラクトース ＋ Ｄグルコース ＋ グリセリン ＋ イノシトール ＋ イヌリン −
【００２４】 ラクトース （＋） マルトース ＋ マンニトール ＋ マンノース ＋ メレジトース − メリビオース ＋ ラフイノース − Ｌ（＋）ラムノース ＋
【００２５】 Ｄリボース ＋ サリシン − Ｌ−ソルボース ＋ ソルビトール ＋ スターチ − サツカロース ＋ トレハロース ＋ Ｄキシロース ＋
【００２６】以上の通り、本菌株−Ｎｏ．１９７（１
０）の主性状は、グラム陽性の桿状細菌で、周鞭毛で運
動する。グルコースを酸化的に分解し、酸を産生する。
カタラーゼ・オキシダーゼ産生、主たるイソプレイノイ
ドキンはユビキノン−１０（Ｑ−１０）。ＤＮＡのＧＣ
ｍｏl は、６０〜６０．２％である。
０）の主性状は、グラム陽性の桿状細菌で、周鞭毛で運
動する。グルコースを酸化的に分解し、酸を産生する。
カタラーゼ・オキシダーゼ産生、主たるイソプレイノイ
ドキンはユビキノン−１０（Ｑ−１０）。ＤＮＡのＧＣ
ｍｏl は、６０〜６０．２％である。
【００２７】本菌株−Ｎｏ．１９７（１０）はグラム陽
性細菌なのに、キノン型は、ユビキノン（Ｑ−１０）で
ある。含有するイソプレノイドキノンの種類の決定は、
細菌の分類に有用であることが判つているため、イソプ
レノイドキノンの種類とそのキノンを持つ菌を大まかに
下記表１に示す。
性細菌なのに、キノン型は、ユビキノン（Ｑ−１０）で
ある。含有するイソプレノイドキノンの種類の決定は、
細菌の分類に有用であることが判つているため、イソプ
レノイドキノンの種類とそのキノンを持つ菌を大まかに
下記表１に示す。
【００２８】
【表１】
【００２９】一部キノンには還元型のキノンが知られて
いる。表１よりグラム陽性細菌はメナキノンを含有する
が、ユビキノンを含有する菌属の報告はない。故に、本
菌の主性状と一致する菌属の記載はないので、本菌株を
公知のものと区別するため、細菌−Ｎｏ．１９７（１
０）株と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所の受
託番号微工研条寄第３６６４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６
６４）として寄託した。
いる。表１よりグラム陽性細菌はメナキノンを含有する
が、ユビキノンを含有する菌属の報告はない。故に、本
菌の主性状と一致する菌属の記載はないので、本菌株を
公知のものと区別するため、細菌−Ｎｏ．１９７（１
０）株と命名し、工業技術院微生物工業技術研究所の受
託番号微工研条寄第３６６４号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６
６４）として寄託した。
【００３０】本発明の新規なキサンチンデヒドロゲナー
ゼ−Ｔ酵素生産菌を用いた該酵素の製造のために使用さ
れる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他の
栄養物より適宜選択して組み合わせれば良いが、本発明
酵素がキサンチンあるいはヒポキサンチンにより誘導的
に生成されることよりキサンチンあるいはヒポキサンチ
ンを培地に添加することが望ましい。
ゼ−Ｔ酵素生産菌を用いた該酵素の製造のために使用さ
れる培地としては、炭素源、窒素源、無機物、その他の
栄養物より適宜選択して組み合わせれば良いが、本発明
酵素がキサンチンあるいはヒポキサンチンにより誘導的
に生成されることよりキサンチンあるいはヒポキサンチ
ンを培地に添加することが望ましい。
【００３１】炭素源としては例えばサツカロース、グル
コース、廃糖密等が挙げられ、窒素源としては例えばペ
プトン、酵母エキス、ブレイン・ハート・フユジョン
（ＢＨＩ）等が挙げられ、無機物としては例えばナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、モリブデ
ン等の金属塩が使用できる。
コース、廃糖密等が挙げられ、窒素源としては例えばペ
プトン、酵母エキス、ブレイン・ハート・フユジョン
（ＢＨＩ）等が挙げられ、無機物としては例えばナトリ
ウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、モリブデ
ン等の金属塩が使用できる。
【００３２】例えば塩析、透析、ＤＥＡＥ−セファロー
ス、Ｑ−セファロース（フアルマシア社製）等のイオン
交換クロマトグラフイー法、オクチル−セファロース等
の疎水クロマトグラフイー法、セフアデツクスＧ−１０
０、セフアクリルＳ−２００等のゲルクロマトグラフイ
ー法などを適宜組み合わせ、高度に精製された本発明酵
素標品を得ることができる。
ス、Ｑ−セファロース（フアルマシア社製）等のイオン
交換クロマトグラフイー法、オクチル−セファロース等
の疎水クロマトグラフイー法、セフアデツクスＧ−１０
０、セフアクリルＳ−２００等のゲルクロマトグラフイ
ー法などを適宜組み合わせ、高度に精製された本発明酵
素標品を得ることができる。
【００３３】本発明によれば、少なくともアデノシン、
イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニン、グア
ニン、チミジンの影響を受けずに、試料中に存在するヒ
ポキサンチンおよび／あるいはキサンチン、あるいはヒ
ポキサンチンおよび／キサンチンを生成する反応系に係
わる基質もしくは酵素を含有する試料中の該基質をヒポ
キサンチンおよび／あるいはキサンチンに変換させ、も
しくは該酵素を利用してヒポキサンチンおよび／あるい
はキサンチンを生成させ、存在もしくは生成したヒポキ
サンチンおよび／あるいはキサンチンを補酵素として、
ＮＡＤ類あるいはチオＮＡＤ類の存在下、本発明酵素の
作用により尿酸に分解し、このとき生成される還元型Ｎ
ＡＤ類あるいは還元型チオＮＡＤ類を定量することによ
り基質もしくは酵素活性を定量することができる。
イノシン、キサントシン、グアノシン、アデニン、グア
ニン、チミジンの影響を受けずに、試料中に存在するヒ
ポキサンチンおよび／あるいはキサンチン、あるいはヒ
ポキサンチンおよび／キサンチンを生成する反応系に係
わる基質もしくは酵素を含有する試料中の該基質をヒポ
キサンチンおよび／あるいはキサンチンに変換させ、も
しくは該酵素を利用してヒポキサンチンおよび／あるい
はキサンチンを生成させ、存在もしくは生成したヒポキ
サンチンおよび／あるいはキサンチンを補酵素として、
ＮＡＤ類あるいはチオＮＡＤ類の存在下、本発明酵素の
作用により尿酸に分解し、このとき生成される還元型Ｎ
ＡＤ類あるいは還元型チオＮＡＤ類を定量することによ
り基質もしくは酵素活性を定量することができる。
【００３４】ヒポキサンチンまたはキサンチンを生成す
る反応系としては、下記が例示されれる。すなわち、
る反応系としては、下記が例示されれる。すなわち、
【００３５】
【化１】
【００３６】反応を実施するに際しては、試料にキサン
チンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を加えて適当な緩衝液中
で反応させ、生成されてくる還元型ＮＡＤ類あるいは還
元型チオＮＡＤ類の増加量を定量することにより目的物
の定量を行うことができる。
チンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を加えて適当な緩衝液中
で反応させ、生成されてくる還元型ＮＡＤ類あるいは還
元型チオＮＡＤ類の増加量を定量することにより目的物
の定量を行うことができる。
【００３７】本発明で用いられるキサンチンデヒドロゲ
ナーゼ−Ｔ酵素は、アデノシン、イノシン、キサントシ
ン、グアノシン、アデニン、グアニンに対し実質的に作
用せず（従ってこれらに基質特異性を有しない）、ＮＡ
Ｄ類、あるいは、チオＮＡＤ類の存在下、キサンチンを
分解して化学量論的に還元型ＮＡＤ類あるいは還元型チ
オＮＡＤ類を生成する反応を触媒する酵素であればいず
れも用いることができる。
ナーゼ−Ｔ酵素は、アデノシン、イノシン、キサントシ
ン、グアノシン、アデニン、グアニンに対し実質的に作
用せず（従ってこれらに基質特異性を有しない）、ＮＡ
Ｄ類、あるいは、チオＮＡＤ類の存在下、キサンチンを
分解して化学量論的に還元型ＮＡＤ類あるいは還元型チ
オＮＡＤ類を生成する反応を触媒する酵素であればいず
れも用いることができる。
【００３８】最も好ましい酵素の例としては、本発明に
おける酵素キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素であつ
て、細菌性桿菌に属するキサンチンデヒドロゲナーゼ−
Ｔ酵素生産菌、細菌Ｎｏ．１９７（１０）によつて製造
される酵素が挙げられる。
おける酵素キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素であつ
て、細菌性桿菌に属するキサンチンデヒドロゲナーゼ−
Ｔ酵素生産菌、細菌Ｎｏ．１９７（１０）によつて製造
される酵素が挙げられる。
【００３９】反応に使用される緩衝液としては、リン酸
緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液等が用いられる。反応は２０〜６０℃、好まし
くは２０〜４０℃、pH５〜１０、好ましくはpH６．５〜
９．５で３０秒〜６０分行われる。測定される対象が被
験液中のヒポキサンチンまたはキサンチンである場合
は、その被験液中に本発明酵素キサンチンデヒドロゲナ
ーゼ−Ｔ酵素を加え、該酵素の作用によりヒポキサンチ
ンまたはキサンチンを分解し、前記した方法により定量
することができる。
緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウ
ム緩衝液等が用いられる。反応は２０〜６０℃、好まし
くは２０〜４０℃、pH５〜１０、好ましくはpH６．５〜
９．５で３０秒〜６０分行われる。測定される対象が被
験液中のヒポキサンチンまたはキサンチンである場合
は、その被験液中に本発明酵素キサンチンデヒドロゲナ
ーゼ−Ｔ酵素を加え、該酵素の作用によりヒポキサンチ
ンまたはキサンチンを分解し、前記した方法により定量
することができる。
【００４０】測定される対象がヒポキサンチンまたはキ
サンチンを生成する反応系に係わる物質（基質）である
場合は、これら基質をヒポキサンチンまたはキサンチン
に変換するに必要とされる酵素、基質等を加えてヒポキ
サンチンまたはキサンチンに変換し、キサンチンデヒド
ロゲナーゼ−Ｔ酵素の作用によつて分解し、前記した方
法により測定すればよい。
サンチンを生成する反応系に係わる物質（基質）である
場合は、これら基質をヒポキサンチンまたはキサンチン
に変換するに必要とされる酵素、基質等を加えてヒポキ
サンチンまたはキサンチンに変換し、キサンチンデヒド
ロゲナーゼ−Ｔ酵素の作用によつて分解し、前記した方
法により測定すればよい。
【００４１】また、測定される対象がヒポキサンチンま
たはキサンチンを生成する反応系に係わる酵素である場
合は、活性が測定されるべき酵素の基質等を加えてヒポ
キサンチンまたはキサンチンを生成せしめ、これらをキ
サンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の作用によつて分解
し、前記した方法により測定すればよい。上記した反応
は、各反応工程ごとに一段落ずつ順次行ってもよいが、
各反応段階に必要とされる酵素、基質等を加えて一段階
で反応を行わせることも可能である。
たはキサンチンを生成する反応系に係わる酵素である場
合は、活性が測定されるべき酵素の基質等を加えてヒポ
キサンチンまたはキサンチンを生成せしめ、これらをキ
サンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の作用によつて分解
し、前記した方法により測定すればよい。上記した反応
は、各反応工程ごとに一段落ずつ順次行ってもよいが、
各反応段階に必要とされる酵素、基質等を加えて一段階
で反応を行わせることも可能である。
【００４２】測定は上記反応により生成した尿酸または
還元型ＮＡＤ類（還元型チオＮＡＤ類）〔以下、ＮＡＤ
Ｈ類（チオＮＡＤＨ類）と称することもある〕の増加
量、あるいは消費されたＮＡＤ（チオＮＡＤ類）の減少
量などを測定することにより行われ得るが、本発明にお
いては生成したＮＡＤＨ類（チオＮＡＤＨ類）を定量す
ることが最も簡便である。
還元型ＮＡＤ類（還元型チオＮＡＤ類）〔以下、ＮＡＤ
Ｈ類（チオＮＡＤＨ類）と称することもある〕の増加
量、あるいは消費されたＮＡＤ（チオＮＡＤ類）の減少
量などを測定することにより行われ得るが、本発明にお
いては生成したＮＡＤＨ類（チオＮＡＤＨ類）を定量す
ることが最も簡便である。
【００４３】ＮＡＤＨ類（チオＮＡＤＨ類）の測定は、
それぞれの特異的極大吸収波長、例えばＮＡＤＨ類の場
合は、３４０ｎｍ、チオＮＡＤＨ類の場合は４０５ｎｍ
の吸収量の増加を測定する方法、あるいは色源体と水素
受容体の存在下、ジアホラーゼ等の酵素の作用によつて
色素を生成させ、ホルマザンの発色により着色した反応
液における可視部吸収度を測定する方法、例えばキサン
チンの場合は、ホルマザンの発色を５５０ｎｍの吸収増
加量を測定する方法、等によればよい。用いられる水素
の受容体としては、メチレンブルー、ニトロブルーテト
ラゾリウム等、公知の受容体が使用可能であり、それら
は市販されている。
それぞれの特異的極大吸収波長、例えばＮＡＤＨ類の場
合は、３４０ｎｍ、チオＮＡＤＨ類の場合は４０５ｎｍ
の吸収量の増加を測定する方法、あるいは色源体と水素
受容体の存在下、ジアホラーゼ等の酵素の作用によつて
色素を生成させ、ホルマザンの発色により着色した反応
液における可視部吸収度を測定する方法、例えばキサン
チンの場合は、ホルマザンの発色を５５０ｎｍの吸収増
加量を測定する方法、等によればよい。用いられる水素
の受容体としては、メチレンブルー、ニトロブルーテト
ラゾリウム等、公知の受容体が使用可能であり、それら
は市販されている。
【００４４】上記したように、本発明においては、ヒポ
キサンチンまたはキサンチンを含有する被験液にＮＡＤ
類および／またはチオＮＡＤ類の存在下に、本発明の新
規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を作用せし
め、次いで反応によつて生じた測定できるＮＡＤＨ類お
よび／またはチオＮＡＤＨ類の量を定量することを特徴
とするヒポキサンチンまたはキサンチンの測定法によつ
て、被験液中に存在するヒポキサンチンまたはキサンチ
ンのみならず、ヒポキサンチンまたはキサンチンを生成
する反応系に係わる基質もしくは酵素活性の測定法も包
含されることに留意されなければならない。
キサンチンまたはキサンチンを含有する被験液にＮＡＤ
類および／またはチオＮＡＤ類の存在下に、本発明の新
規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を作用せし
め、次いで反応によつて生じた測定できるＮＡＤＨ類お
よび／またはチオＮＡＤＨ類の量を定量することを特徴
とするヒポキサンチンまたはキサンチンの測定法によつ
て、被験液中に存在するヒポキサンチンまたはキサンチ
ンのみならず、ヒポキサンチンまたはキサンチンを生成
する反応系に係わる基質もしくは酵素活性の測定法も包
含されることに留意されなければならない。
【００４５】本発明は、更に上記した測定法を実施する
ために使用される、基質または酵素活性の分析用組成物
に関し、キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を含有す
る分析用組成物である。分析用組成物の例としては、下
記が概略的に例示される。 （１）定量すべき対象が、被験液中に存在するヒポキサ
ンチンまたはキサンチンである場合は、キサンチンデヒ
ドロゲナーゼ−Ｔ酵素およびＮＡＤ類および／またはチ
オＮＡＤ類ならびに反応生成物定量用試薬および緩衝
液。
ために使用される、基質または酵素活性の分析用組成物
に関し、キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を含有す
る分析用組成物である。分析用組成物の例としては、下
記が概略的に例示される。 （１）定量すべき対象が、被験液中に存在するヒポキサ
ンチンまたはキサンチンである場合は、キサンチンデヒ
ドロゲナーゼ−Ｔ酵素およびＮＡＤ類および／またはチ
オＮＡＤ類ならびに反応生成物定量用試薬および緩衝
液。
【００４６】（２）定量すべき対象が、ヒポキサンチン
またはキサンチンを生成する反応系に係わる基質または
酵素活性である場合は、該基質をヒポキサンチンまたは
キサンチンに導くのに必要な試薬系、または活性を測定
すべき該酵素の基質およびこの基質をヒポキサンチンに
導くのに必要な試薬系。キサンチンデヒドロゲナーゼ−
Ｔ酵素およびＮＡＤ類および／またはチオＮＡＤ類、な
らびに反応生成物定量用試薬、および緩衝液。
またはキサンチンを生成する反応系に係わる基質または
酵素活性である場合は、該基質をヒポキサンチンまたは
キサンチンに導くのに必要な試薬系、または活性を測定
すべき該酵素の基質およびこの基質をヒポキサンチンに
導くのに必要な試薬系。キサンチンデヒドロゲナーゼ−
Ｔ酵素およびＮＡＤ類および／またはチオＮＡＤ類、な
らびに反応生成物定量用試薬、および緩衝液。
【００４７】上記（１）における反応生成物定量用試薬
としては、既に前記したＮＡＤＨ類の定量用のホルマザ
ン発色のための試薬類やその他公知の試薬類が挙げられ
る。上記（２）における定量すべき基質をヒポキサンチ
ンまたはキサンチンに導くのに必要な試薬系としては、
該基質をヒポキサンチンまたはキサンチンに導くのに必
要な酵素が挙げられる。
としては、既に前記したＮＡＤＨ類の定量用のホルマザ
ン発色のための試薬類やその他公知の試薬類が挙げられ
る。上記（２）における定量すべき基質をヒポキサンチ
ンまたはキサンチンに導くのに必要な試薬系としては、
該基質をヒポキサンチンまたはキサンチンに導くのに必
要な酵素が挙げられる。
【００４８】この基質としては前記したヒポキサンチン
またはキサンチンを生成する反応系に例示される、各種
基質、すなわち、アデノシン、イノシン、グアノシン、
グアニン等であり、該酵素としては同反応系中に例示さ
れる各種酵素、すなわちアデノシンデアミナーゼ、プリ
ンヌクレオチドホスホリラーゼ、グアナーゼ等の１種も
しくはそれらの組み合わせである。また活性を測定すべ
き酵素の基質およびこの基質をヒポキサンチンに導くの
に必要な試薬系としては上記した基質および酵素から選
択される必要な成分である。
またはキサンチンを生成する反応系に例示される、各種
基質、すなわち、アデノシン、イノシン、グアノシン、
グアニン等であり、該酵素としては同反応系中に例示さ
れる各種酵素、すなわちアデノシンデアミナーゼ、プリ
ンヌクレオチドホスホリラーゼ、グアナーゼ等の１種も
しくはそれらの組み合わせである。また活性を測定すべ
き酵素の基質およびこの基質をヒポキサンチンに導くの
に必要な試薬系としては上記した基質および酵素から選
択される必要な成分である。
【００４９】本発明のキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素の性状は以下の通りである。 （１）酵素作用 下記式に示すように、ヒポキサンチンおよびＮＡＤ+ あ
るいはチオＮＡＤ+ からキサンチンおよびＮＡＤＨある
いはチオＮＡＤＨを生成する反応を触媒し、次に生成さ
れたキサンチンおよびＮＡＤ+ あるいはチオＮＡＤ+ か
ら尿酸およびＮＡＤＨあるいはチオＮＡＤＨを生成する
反応を触媒する。
酵素の性状は以下の通りである。 （１）酵素作用 下記式に示すように、ヒポキサンチンおよびＮＡＤ+ あ
るいはチオＮＡＤ+ からキサンチンおよびＮＡＤＨある
いはチオＮＡＤＨを生成する反応を触媒し、次に生成さ
れたキサンチンおよびＮＡＤ+ あるいはチオＮＡＤ+ か
ら尿酸およびＮＡＤＨあるいはチオＮＡＤＨを生成する
反応を触媒する。
【００５０】
【化２】
【００５１】 （２）基質特異性 ヒポキサンチン １００％ キサンチン ７５％ 尿酸 ０ アデノシン ０ イノシン ０ キサントシン ０ グアノシン ０ アデニン ０ グアニン ０ ８−アザキサンチン ０ ８−アザグアニン ０
【００５２】（３）分子量 トーソー社製ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷ（０．７５×６
０cm）を用いたゲル濾過法により測定した本発明酵素の
分子量は約２４万であった。
０cm）を用いたゲル濾過法により測定した本発明酵素の
分子量は約２４万であった。
【００５３】（４）等電点 ｐＨ３．５〜１０．０のキヤリアアンフオライトを用い
た焦点電気泳動より本発明酵素の等電点は４．５であっ
た。
た焦点電気泳動より本発明酵素の等電点は４．５であっ
た。
【００５４】（５）Ｋｍ値 本発明酵素のヒポキサンチンに対するＫｍ値は０．１４
ｍＭ、キサンチンに対しては０．２４ｍＭ、ＮＡＤに対
しては０．０７５ｍＭ、チオＮＡＤに対しては０．０８
ｍＭであった。
ｍＭ、キサンチンに対しては０．２４ｍＭ、ＮＡＤに対
しては０．０７５ｍＭ、チオＮＡＤに対しては０．０８
ｍＭであった。
【００５５】（６）熱安定性 本発明酵素液（０．１ｕ／ml）を４０ｍＭリン酸緩衝液
（pH７．５）で調製し、１５分間の加熱処理の後に残存
活性を測定した結果は、図１に示される通りであって、
酵素活性は少なくとも４０℃までは安定であり、６０℃
においても元の８９％の活性を保持していた。
（pH７．５）で調製し、１５分間の加熱処理の後に残存
活性を測定した結果は、図１に示される通りであって、
酵素活性は少なくとも４０℃までは安定であり、６０℃
においても元の８９％の活性を保持していた。
【００５６】（７）至適温度 １００ｍＭトリス塩酸緩衝液（pH８）を用い、３５、４
０、４５、５０、５５および６０℃の各温度で活性測定
をした結果は、図２に示す通りであって、５５℃付近で
最大の活性を有している。
０、４５、５０、５５および６０℃の各温度で活性測定
をした結果は、図２に示す通りであって、５５℃付近で
最大の活性を有している。
【００５７】（８）pH安定性 本発明酵素（０．１ｕ／ml）を４０ｍＭの酢酸緩衝液
（pH５．０５〜６．１２−○−）、リン酸緩衝液（pH
６．１２〜８．０１−●−）、トリス塩酸緩衝液（pH
７．８４〜８．５８−△−）およびグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH８．７３〜９．３６−□−）の各緩
衝液で調製し、４５℃で１５分間加熱した後の残存活性
を測定した結果は、図３に示される通りであつて、酵素
活性はpH６．５〜９．５の広いpH範囲で９０％以上の活
性を保持している。
（pH５．０５〜６．１２−○−）、リン酸緩衝液（pH
６．１２〜８．０１−●−）、トリス塩酸緩衝液（pH
７．８４〜８．５８−△−）およびグリシン−水酸化ナ
トリウム緩衝液（pH８．７３〜９．３６−□−）の各緩
衝液で調製し、４５℃で１５分間加熱した後の残存活性
を測定した結果は、図３に示される通りであつて、酵素
活性はpH６．５〜９．５の広いpH範囲で９０％以上の活
性を保持している。
【００５８】（９）至適pH 後記の酵素活性測定法にしたがい、反応液中の１００ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８）に換えて１００ｍＭのリン
酸緩衝液（pH６．５〜７．５−●−）、トリス塩酸緩衝
液（pH８．０〜９．０−△−）およびグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１０．０−□−）の各緩
衝液を用いて反応液を調製し、その活性測定をした結果
は、図４に示される通りであつて、pH８．５付近で最大
の活性を示す。
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH８）に換えて１００ｍＭのリン
酸緩衝液（pH６．５〜７．５−●−）、トリス塩酸緩衝
液（pH８．０〜９．０−△−）およびグリシン−水酸化
ナトリウム緩衝液（pH９．０〜１０．０−□−）の各緩
衝液を用いて反応液を調製し、その活性測定をした結果
は、図４に示される通りであつて、pH８．５付近で最大
の活性を示す。
【００５９】（１０）キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素の活性に及ぼす金属イオンおよび界面活性剤の影響 反応液の調製 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．０） １ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ キサンチン ０．０２ｕ／ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素
酵素の活性に及ぼす金属イオンおよび界面活性剤の影響 反応液の調製 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（pH８．０） １ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ キサンチン ０．０２ｕ／ml キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素
【００６０】上記反応液で金属塩が１０あるいは１ｍＭ
になるように反応液を調製し、３７℃で反応を行わし
め、その時生成されるＮＡＤＨのＡ340nm の増加量を測
定した結果を表１に示した。又、反応液で界面活性剤が
０．５％になるように反応液を調製し、３７℃で反応を
行わしめ、その時生成されるＮＡＤＨ340nm の増加量を
測定した結果を表２に示した。
になるように反応液を調製し、３７℃で反応を行わし
め、その時生成されるＮＡＤＨのＡ340nm の増加量を測
定した結果を表１に示した。又、反応液で界面活性剤が
０．５％になるように反応液を調製し、３７℃で反応を
行わしめ、その時生成されるＮＡＤＨ340nm の増加量を
測定した結果を表２に示した。
【００６１】
【表２】
【００６２】（１１）キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素の酵素活性測定法 （１）反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．０） ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ キサンチン
酵素の酵素活性測定法 （１）反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ９．０） ２ｍＭ ＮＡＤ ２ｍＭ キサンチン
【００６３】（２）酵素活性測定 （１）の反応液１mlを光路長１cmの１ml容石英セルに分
注し、３７℃で５分間インキュベイトした後に適当に希
釈した酵素液０．０２mlを添加し、反応で生成されるＮ
ＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に測
定する。 （３）計算式
注し、３７℃で５分間インキュベイトした後に適当に希
釈した酵素液０．０２mlを添加し、反応で生成されるＮ
ＡＤＨの３４０ｎｍにおける吸光度の変化を経時的に測
定する。 （３）計算式
【００６４】
【化３】 ６．２２：分子吸光係数cm2 ／ｕｍｏl １０ ：反応時間（分） Ｚ ：希釈倍数
【００６５】（１２）反応液における酵素と補酵素の使
用量 ヒポキサンチンおよび／あるいはキサンチンを測定しよ
うとする場合のキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の
使用量は、その反応条件によつて適宜調製されればよい
が、０．０１〜１００ｕ／ml、通常は０．１〜１０ｕ／
mlで使用される。また補酵素としてのＮＡＤあるいはチ
オＮＡＤの使用量は０．０１〜１０ｍＭ、通常は０．１
〜２．０ｍＭで使用される。
用量 ヒポキサンチンおよび／あるいはキサンチンを測定しよ
うとする場合のキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の
使用量は、その反応条件によつて適宜調製されればよい
が、０．０１〜１００ｕ／ml、通常は０．１〜１０ｕ／
mlで使用される。また補酵素としてのＮＡＤあるいはチ
オＮＡＤの使用量は０．０１〜１０ｍＭ、通常は０．１
〜２．０ｍＭで使用される。
【００６６】また例えばリン酸イオンの測定を行う場合
には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの使用量は、
その反応条件によつて適宜調製されればよいが、０．０
１〜１００ｕ／ml、通常は０．１〜２０ｕ／mlで使用さ
れる。
には、プリンヌクレオシドホスホリラーゼの使用量は、
その反応条件によつて適宜調製されればよいが、０．０
１〜１００ｕ／ml、通常は０．１〜２０ｕ／mlで使用さ
れる。
【００６７】
【発明の効果】本発明の細菌性桿菌に属する細菌−Ｎ
ｏ．１９７（１０）由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ
−Ｔ酵素はアデノシン、イノシン、キサントシン、グア
ノシン、アデニン、グアニン、チミジンに対して酵素活
性を有さず、既存のキサンチンデヒドロゲナーゼと比べ
て格段に基質特異性が高い。
ｏ．１９７（１０）由来のキサンチンデヒドロゲナーゼ
−Ｔ酵素はアデノシン、イノシン、キサントシン、グア
ノシン、アデニン、グアニン、チミジンに対して酵素活
性を有さず、既存のキサンチンデヒドロゲナーゼと比べ
て格段に基質特異性が高い。
【００６８】即ち、本発明酵素を用いて補酵素としてＮ
ＡＤ類および／あるいはチオＮＡＤ類を利用して存在あ
るいは生成されてくるヒポキサンチンおよび／あるいは
キサンチンを尿酸に酸化し、このとき生成されてくるＮ
ＡＤＨ類あるいはチオＮＡＤＨ類を測定してなる測定試
薬を使用する場合、試料中に存在するヒポキサンチンあ
るいはキサンチン以外の各種基質の影響を受けることの
無い特異性の高い測定試薬を供給することが可能であ
る。
ＡＤ類および／あるいはチオＮＡＤ類を利用して存在あ
るいは生成されてくるヒポキサンチンおよび／あるいは
キサンチンを尿酸に酸化し、このとき生成されてくるＮ
ＡＤＨ類あるいはチオＮＡＤＨ類を測定してなる測定試
薬を使用する場合、試料中に存在するヒポキサンチンあ
るいはキサンチン以外の各種基質の影響を受けることの
無い特異性の高い測定試薬を供給することが可能であ
る。
【００６９】また、本発明酵素が、反応によつて生成さ
れるキサンチンに対してもヒポキサンチンと同様に活性
を示すことから、存在あるいは生成されたヒポキサンチ
ンを測定する場合には２倍の感度で測定することができ
る。またＮＡＤの代わりにチオＮＡＤを使用した場合に
は分子吸光係数が約２倍であることから２倍の感度が得
られる。
れるキサンチンに対してもヒポキサンチンと同様に活性
を示すことから、存在あるいは生成されたヒポキサンチ
ンを測定する場合には２倍の感度で測定することができ
る。またＮＡＤの代わりにチオＮＡＤを使用した場合に
は分子吸光係数が約２倍であることから２倍の感度が得
られる。
【００７０】
【実施例】次に、実施例を挙げて本発明を具体的に述べ
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００７１】実施例 １ 細菌Ｎｏ．１９７（１０）の培養 キサンチン（ヤマサ醤油社製）１％、Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．
２５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ０．０５％、酵母エキス
（極東製薬社製）０．１％、ＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ社製）
１％、ｐＨ７．０を含む液体培地１００mlを５００ml容
三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌し
た後、これに１白金耳の細菌−Ｎｏ．１９７（１０）を
接種し、２８℃、１２０ｒ．ｐ．ｍ．の振とう培養器で
６０時間培養し、この５０本分の培養液４．５l を得た
（酵素活性０．２ｕ／ml）。
２５％、ＭｇＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ０．０５％、酵母エキス
（極東製薬社製）０．１％、ＢＨＩ（Ｄｉｆｃｏ社製）
１％、ｐＨ７．０を含む液体培地１００mlを５００ml容
三角フラスコに分注し、１２０℃、２０分間加熱滅菌し
た後、これに１白金耳の細菌−Ｎｏ．１９７（１０）を
接種し、２８℃、１２０ｒ．ｐ．ｍ．の振とう培養器で
６０時間培養し、この５０本分の培養液４．５l を得た
（酵素活性０．２ｕ／ml）。
【００７２】一方、上記と同様の培地組成２０l に消泡
剤として０．０５％のデイスフオームＣＢ４４２（日本
油脂社製）を添加し、３０l 容ジャーフアーメンターに
仕込み、加熱滅菌した後、前記で得た種母１００mlを移
植し、培養温度２８℃、通気量２０l ／分、内圧０．４
kg／cm2 、攪拌速度２００ｒ．ｐ．ｍ．で４０時間培養
し、培養物１９l を得た（酵素活性０．３ｕ／ml）。
剤として０．０５％のデイスフオームＣＢ４４２（日本
油脂社製）を添加し、３０l 容ジャーフアーメンターに
仕込み、加熱滅菌した後、前記で得た種母１００mlを移
植し、培養温度２８℃、通気量２０l ／分、内圧０．４
kg／cm2 、攪拌速度２００ｒ．ｐ．ｍ．で４０時間培養
し、培養物１９l を得た（酵素活性０．３ｕ／ml）。
【００７３】実施例 ２ 酵素の分離精製 実施例１で得た培養物１９l を遠心分離して集菌し、４
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３l に懸濁し
た。これをダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆ
ｅｎ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ社製 ＴＹＰＥ
ＫＤＬ）を用いてホモジネイトし、処理液を遠心分離
して沈澱物を除去し、上清２．９l （酵素活性１．８２
ｕ／ml）を得た。
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）３l に懸濁し
た。これをダイノミル（Ｗｉｌｌｙ Ａ．Ｂａｃｈｏｆ
ｅｎ Ｍａｓｃｈｉｎｅｎｆａｂｒｉｋ社製 ＴＹＰＥ
ＫＤＬ）を用いてホモジネイトし、処理液を遠心分離
して沈澱物を除去し、上清２．９l （酵素活性１．８２
ｕ／ml）を得た。
【００７４】この粗酵素液を、４０ｍＭトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セフアロース
・２００mlのカラムに通した後、同様の緩衝液５l で洗
浄した。その後、同様の緩衝液に５０、１５０、２０
０、２５０、３００ｍＭのＫＣl を含んだ緩衝液をそれ
ぞれ４００mlずつ流した。キサンチンデヒドロゲナーゼ
−Ｔ酵素は、３００ｍＭのＫＣl を含んだ緩衝液で溶出
し、４００mlの酵素溶液（酵素活性９．０ｕ／ml）を得
た。
液（ｐＨ８．０）で緩衝化したＤＥＡＥ−セフアロース
・２００mlのカラムに通した後、同様の緩衝液５l で洗
浄した。その後、同様の緩衝液に５０、１５０、２０
０、２５０、３００ｍＭのＫＣl を含んだ緩衝液をそれ
ぞれ４００mlずつ流した。キサンチンデヒドロゲナーゼ
−Ｔ酵素は、３００ｍＭのＫＣl を含んだ緩衝液で溶出
し、４００mlの酵素溶液（酵素活性９．０ｕ／ml）を得
た。
【００７５】得られた酵素溶液をＡｍｉｃｏｎ社製２４
ＣＥＮＴＲＩＦＬＯ ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯ
Ｎ ＭＥＭＢＲＡＮＥ ＣＯＮＥＳ ＣＦ２５を用いて
４０ml（酵素活性８５ｕ／ml）に濃縮し、０．３ＭＫＣ
l を含んだ１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で緩衝化したセファアクリルＳ−２００（７．５cm×１
００cm）のカラムを用いて分子篩クロマトグラフイーを
行い、活性画分を集め２００ml（酵素活性１２ｕ／ml）
の酵素溶液を得ることができた。得られた酵素溶液は２
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０l に対して
一晩透析した後に凍結乾燥して４４５mg（酵素活性５．
０ｕ／mg）の酵素標品を得ることができた。
ＣＥＮＴＲＩＦＬＯ ＵＬＴＲＡＦＩＬＴＲＡＴＩＯ
Ｎ ＭＥＭＢＲＡＮＥ ＣＯＮＥＳ ＣＦ２５を用いて
４０ml（酵素活性８５ｕ／ml）に濃縮し、０．３ＭＫＣ
l を含んだ１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）
で緩衝化したセファアクリルＳ−２００（７．５cm×１
００cm）のカラムを用いて分子篩クロマトグラフイーを
行い、活性画分を集め２００ml（酵素活性１２ｕ／ml）
の酵素溶液を得ることができた。得られた酵素溶液は２
０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０l に対して
一晩透析した後に凍結乾燥して４４５mg（酵素活性５．
０ｕ／mg）の酵素標品を得ることができた。
【００７６】実施例 ３ 補酵素としてＮＡＤ+ を用いたヒポキサンチンの定量 ４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭＮＡ
Ｄ+ にヒポキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０
２、０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反
応液を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、
５分間の反応の前後に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm の
増加量を測定した。その結果を図５に示した。
Ｄ+ にヒポキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０
２、０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反
応液を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、
５分間の反応の前後に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm の
増加量を測定した。その結果を図５に示した。
【００７７】実施例 ４ 補酵素としてＮＡＤを用いたキサンチンの定量 ４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭＮＡ
Ｄ+ にキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０２、
０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反応液
を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、５分
間の反応の前後に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm の増加
量を測定した。その結果を図６に示した。
Ｄ+ にキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０２、
０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反応液
を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、５分
間の反応の前後に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm の増加
量を測定した。その結果を図６に示した。
【００７８】実施例 ５ 補酵素としてチオＮＡＤを用いたヒポキサンチンの定量 ４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭチオ
ＮＡＤにヒポキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０
２、０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反
応液を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、
５分間の反応の前後に生成されたチオＮＡＤＨのＡ
405nm の増加量を測定した。その結果を図７に示した。
ＮＡＤにヒポキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０
２、０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反
応液を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、
５分間の反応の前後に生成されたチオＮＡＤＨのＡ
405nm の増加量を測定した。その結果を図７に示した。
【００７９】実施例 ６ 補酵素としてチオＮＡＤを用いたキサンチンの定量 ４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭチオ
ＮＡＤにキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０２、
０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反応液
を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、５分
間の反応の前後に生成されたチオＮＡＤＨのＡ405nm の
増加量を測定した。その結果を図８に示した。
ＮＡＤにキサンチンがそれぞれ、０．０１、０．０２、
０．０３、０．０４、０．０５ｍＭとなるように反応液
を調製し、本発明酵素を１ｕ／ml添加し、３７℃、５分
間の反応の前後に生成されたチオＮＡＤＨのＡ405nm の
増加量を測定した。その結果を図８に示した。
【００８０】実施例 ７ ホルマザンの発色によるキサンチンの測定 ４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭＮＡ
Ｄ、０．２％トリトンＸ−１００、５ｕ／mlジアフォラ
ーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ニトロブルーテト
ラゾリウム（和光純薬社製）、本発明酵素１ｕ／mlとな
るように反応液を調製し、その１mlを試験管に分注し、
１、２、３、４、５ｍＭの調製したキサンチンを０．０
１mlづつ添加し、３７℃、５分間の反応の後に２mlの
０．１Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、Ａ550nm を測定
した。その結果を図９に示した。
Ｄ、０．２％トリトンＸ−１００、５ｕ／mlジアフォラ
ーゼ（東洋醸造社製）、０．０２５％ニトロブルーテト
ラゾリウム（和光純薬社製）、本発明酵素１ｕ／mlとな
るように反応液を調製し、その１mlを試験管に分注し、
１、２、３、４、５ｍＭの調製したキサンチンを０．０
１mlづつ添加し、３７℃、５分間の反応の後に２mlの
０．１Ｎ塩酸を添加して反応を停止し、Ａ550nm を測定
した。その結果を図９に示した。
【００８１】実施例 ８ イノシン、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ
Ｌ）、本発明酵素およびＮＡＤを用いたリン酸イオンの
測定４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ
ＮＡＤ、２０ｍＭイノシン、１０ｕ／mlＰＮＰＬ、１ｕ
／ml本発明酵素となるように反応液を調製し、１、２、
３、４、５ｍＭの調製したリン酸１カリを０．０１mlづ
つ添加し、３７℃、５分間の反応の前後に生成されたＮ
ＡＤＨのＡ340nm の増加量を測定した。その結果を図１
０に示した。なお、ＰＮＰＬは、以下の方法に基いて調
製した。即ち、ＰＮＰＬは、バチルス・セレウスＩＦＯ
１３４９４をＪ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４６
（５），１４７５−１４８０（１９７１）に記載されて
いる方法で培養、精製を行い４０l 分のジャーファメン
ター液体培養の培養菌体より２１０００Ｕ（酵素活性４
２ｕ／mg）の酵素標品を得ることができた。
Ｌ）、本発明酵素およびＮＡＤを用いたリン酸イオンの
測定４０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、１ｍＭ
ＮＡＤ、２０ｍＭイノシン、１０ｕ／mlＰＮＰＬ、１ｕ
／ml本発明酵素となるように反応液を調製し、１、２、
３、４、５ｍＭの調製したリン酸１カリを０．０１mlづ
つ添加し、３７℃、５分間の反応の前後に生成されたＮ
ＡＤＨのＡ340nm の増加量を測定した。その結果を図１
０に示した。なお、ＰＮＰＬは、以下の方法に基いて調
製した。即ち、ＰＮＰＬは、バチルス・セレウスＩＦＯ
１３４９４をＪ．Ｂｉｏl ．Ｃｈｅｍ．，２４６
（５），１４７５−１４８０（１９７１）に記載されて
いる方法で培養、精製を行い４０l 分のジャーファメン
ター液体培養の培養菌体より２１０００Ｕ（酵素活性４
２ｕ／mg）の酵素標品を得ることができた。
【００８２】実施例 ９ キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を用いたアデノシ
ンデアミナーゼの活性測定 シグマ社製の牛ひ蔵由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｐ
ＲＯＤＵＣＴ ＮＵＭＢＥＲ；Ａ５７７３）を用いて以
下の実験を行った。
ンデアミナーゼの活性測定 シグマ社製の牛ひ蔵由来のアデノシンデアミナーゼ（Ｐ
ＲＯＤＵＣＴ ＮＵＭＢＥＲ；Ａ５７７３）を用いて以
下の実験を行った。
【００８３】反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） ５ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８．５） ５ｍＭ アデノシン（シグマ社製） ０．５％ ＢＳＡ（シグマ社製） ２ｍＭ ＮＡＤ（オリエンタル酵母社製） １０ｕ／ml ＰＮＰＬ １ｕ／ml 本発明キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素
酵素
【００８４】アデノシンデアミナーゼ溶液の調製；０．
１％ＢＳＡを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）を用いて牛ひ蔵由来の酵素を１ｕ／mlに調製した。
１％ＢＳＡを含んだ１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．
５）を用いて牛ひ蔵由来の酵素を１ｕ／mlに調製した。
【００８５】操作 反応液１mlを試験管に分注し、３７℃で３分間インキュ
ベイトした後に上記調製アデノシンデアミナーゼを０．
００５、０．０１、０．０１５、０．０２mlづつ添加
し、正確に５分間に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm を測
定した。その結果を図１１に示した。
ベイトした後に上記調製アデノシンデアミナーゼを０．
００５、０．０１、０．０１５、０．０２mlづつ添加
し、正確に５分間に生成されたＮＡＤＨのＡ340nm を測
定した。その結果を図１１に示した。
【００８６】実施例 １０ キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を用いたグアナー
ゼの活性測定 シグマ社製の兎肝臓由来のグアナーゼ（ＰＲＯＤＵＣＴ
ＮＵＭＢＥＲ；Ｇ５７５２）を用いて以下の実験を行
った。
ゼの活性測定 シグマ社製の兎肝臓由来のグアナーゼ（ＰＲＯＤＵＣＴ
ＮＵＭＢＥＲ；Ｇ５７５２）を用いて以下の実験を行
った。
【００８７】反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） １ｍＭ グアニン（シグマ社製） ０．５％ ＢＳＡ ２ｍＭ ＮＡＤ １ｕ／ml 本発明キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素
酵素
【００８８】グアナーゼ溶液の調製；０．１％ＢＳＡを
含んだ１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
て兎肝臓由来の酵素を０．５ｕ／mlに調製した。
含んだ１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
て兎肝臓由来の酵素を０．５ｕ／mlに調製した。
【００８９】操作 反応液１mlを試験管に分注し、３７℃で３分間インキュ
ベイトした後に上記調製グアナーゼを０．００５、０．
０１、０．０２mlづつ添加し、正確に１０分間に生成さ
れたＮＡＤＨのＡ340nm を測定した。その結果を図１２
に示した。
ベイトした後に上記調製グアナーゼを０．００５、０．
０１、０．０２mlづつ添加し、正確に１０分間に生成さ
れたＮＡＤＨのＡ340nm を測定した。その結果を図１２
に示した。
【００９０】実施例 １１ キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を用いたグアナー
ゼの活性測定 シグマ社製の兎肝臓由来のグアナーゼ（ＰＲＯＤＵＣＴ
ＮＵＭＢＥＲ；Ｇ５７５２）を用いて以下の実験を行
った。
ゼの活性測定 シグマ社製の兎肝臓由来のグアナーゼ（ＰＲＯＤＵＣＴ
ＮＵＭＢＥＲ；Ｇ５７５２）を用いて以下の実験を行
った。
【００９１】反応液組成 １００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５） １ｍＭ グアニン（シグマ社製） ０．５％ ＢＳＡ ２ｍＭ チオＮＡＤ １ｕ／ml 本発明キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ
酵素
酵素
【００９２】グアナーゼ溶液の調製；０．１％ＢＳＡを
含んだ１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
て兎肝臓由来の酵素を０．５ｕ／mlに調製した。
含んだ１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用い
て兎肝臓由来の酵素を０．５ｕ／mlに調製した。
【００９３】操作 反応液１mlを試験管に分注し、３７℃で３分間インキュ
ベイトした後に上記調製グアナーゼを０．００５、０．
０１、０．０１５、０．０２mlづつ添加し、正確に５分
間に生成されたチオＮＡＤＨのＡ415nm を測定した。そ
の結果を図１３に示した。
ベイトした後に上記調製グアナーゼを０．００５、０．
０１、０．０１５、０．０２mlづつ添加し、正確に５分
間に生成されたチオＮＡＤＨのＡ415nm を測定した。そ
の結果を図１３に示した。
【図１】本発明酵素の熱安定性を示す図である。
【図２】本発明酵素の至適温度を示す図である。
【図３】本発明酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図４】本発明酵素の至適ｐＨを示す図である。
【図５】ＮＡＤを用いたヒポキサンチンの定量を示す図
である。
である。
【図６】ＮＡＤを用いたキサンチンの定量を示す図であ
る。
る。
【図７】チオＮＡＤを用いたヒポキサンチンの定量を示
す図である。
す図である。
【図８】チオＮＡＤを用いたキサンチンの定量を示す図
である。
である。
【図９】ホルマザンの発色によるキサンチンの定量を示
す図である。
す図である。
【図１０】イノシン、ＰＮＰＬおよびＮＡＤを用いたリ
ン酸イオンの測定結果を示す図である。
ン酸イオンの測定結果を示す図である。
【図１１】アデノシンデアミナーゼの活性測定を示す図
である。
である。
【図１２】グアナーゼの活性測定結果を示す図である。
【図１３】グアナーゼの活性測定結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (12)
- 【請求項１】 アデノシン、イノシン、キサントシン、
グアノシン、アデニン、グアニン、チミジンに対して基
質特異性を示さず、少なくともヒポキサンチン、キサン
チンに対して基質特異性を有し、補酵素としてＮＡＤ類
および／またはチオＮＡＤ類を利用して、ヒポキサンチ
ンを基質としてキサンチンに酸化して還元型ＮＡＤ類お
よび／または還元型チオＮＡＤ類を生成するか、または
キサンチンを基質として尿酸に酸化して還元型ＮＡＤ類
および／または還元型チオＮＡＤ類を生成する反応を触
媒することを特徴とする新規なキサンチンデヒドロゲナ
ーゼ−Ｔ酵素。 - 【請求項２】 キサンチンデヒロゲナーゼ−Ｔ酵素が、
グラム染色＋、ＫＯＨ反応−、運動性＋、オキシダーゼ
産生能＋、カタラーゼ産生能−、キノン系Ｑ−１０の生
理学的特徴を有する細菌性桿菌に属するキサンチンデヒ
ドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌である請求項１記載のキサ
ンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素。 - 【請求項３】 細菌性桿菌に属するキサンチンデヒドロ
ゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌が、細菌−Ｎｏ．１９７（１
０）株（微工研条寄第３６６４）である請求項２記載の
キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素。 - 【請求項４】 グラム染色＋、ＫＯＨ反応−、運動性
＋、オキシダーゼ産生能＋、カタラーゼ産生能−、キノ
ン系Ｑ−１０の生理学的特徴を有する細菌性桿菌に属す
るキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌を培地に
培養し、得られた培養物からキサンチンデヒドロゲナー
ゼ−Ｔ酵素を採取することを特徴とする新規なキサンチ
ンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の製造法。 - 【請求項５】 細菌性桿菌に属するキサンチンデヒドロ
ゲナーゼ−Ｔ酵素生産菌が、細菌−Ｎｏ．１９７（１
０）株（微工研条寄第３６６４）である請求項４記載の
キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素の製造法。 - 【請求項６】 ヒポキサンチンまたはキサンチンを含有
する被検液に、ＮＡＤ類および／またはチオＮＡＤ類の
存在下に、アデノシン、イノシン、キサントシン、グア
ノシン、アデニン、グアニン、チミジンに対して基質特
異性を示さず、少なくともヒポキサンチン、キサンチン
に対して基質特異性を有し、補酵素としてＮＡＤ類およ
び／またはチオＮＡＤ類を利用して、ヒポキサンチンを
基質としてキサンチンに酸化して還元型ＮＡＤ類および
／または還元型チオＮＡＤ類を生成するか、またはキサ
ンチンを基質として尿酸に酸化して還元型ＮＡＤ類およ
び／または還元型チオＮＡＤ類を生成する反応を触媒す
るキサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を作用せしめ、
次いで反応によつて生じた還元型ＮＡＤ類および／また
は還元型チオＮＡＤ類の量を定量することを特徴とする
ヒポキサンチンまたはキサンチンの測定法。 - 【請求項７】 ヒポキサンチンまたはキサンチンを含有
する被検液が、被検液中にヒポキサンチンまたはキサン
チンの形で存在する被検液であるか、またはヒポキサン
チンまたはキサンチンの前駆体から生成されたヒポキサ
ンチンまたはキサンチンを含有する被検液である請求項
６記載の測定法。 - 【請求項８】 ヒポキサンチンまたはキサンチンの前駆
体から生成されたヒポキサンチンまたはキサンチンが、
イノシンとプリンヌクレオシドホスホリラーゼから生成
されたヒポキサンチンまたはこのヒポキサンチンから生
成されたキサンチン、グアニンとグアナーゼから生成さ
れたキサンチンである請求項７記載の測定法。 - 【請求項９】 アデノシン、イノシン、キサントシン、
グアノシン、アデニン、グアニン、チミジンに対して基
質特異性を示さず、少なくともヒポキサンチン、キサン
チンに対して基質特異性を有し、補酵素としてＮＡＤ類
および／またはチオＮＡＤ類を利用して、ヒポキサンチ
ンを基質としてキサンチンに酸化して還元型ＮＡＤ類お
よび／またはチオＮＡＤ類を生成するか、またはキサン
チンを基質として尿酸に酸化して還元型ＮＡＤ類および
／またはチオＮＡＤ類を生成する反応を触媒する新規な
キサンチンデヒドロゲナーゼ−Ｔ酵素を含有する分析用
組成物。 - 【請求項１０】 請求項９のキサンチンデヒドロゲナー
ゼ−Ｔ酵素を含有する組成物において、同組成物にＮＡ
Ｄ類および／またはチオＮＡＤ類を含有せしめた分析用
組成物。 - 【請求項１１】 グラム染色＋、ＫＯＨ反応−、運動性
＋、オキシダーゼ産生能＋、カタラーゼ産生能−、キノ
ン系Ｑ−１０の生理学的特徴を有する細菌性桿菌。 - 【請求項１２】 細菌性桿菌が、細菌−Ｎｏ．１９７
（１０）株（微工研条寄第３６６４）である請求項１１
記載の桿菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32906491A JP3065754B2 (ja) | 1991-12-12 | 1991-12-12 | 新規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−ｔ酵素、およびこれを用いた測定法並びに該酵素を含有する分析用組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32906491A JP3065754B2 (ja) | 1991-12-12 | 1991-12-12 | 新規なキサンチンデヒドロゲナーゼ−ｔ酵素、およびこれを用いた測定法並びに該酵素を含有する分析用組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06113837A true JPH06113837A (ja) | 1994-04-26 |
| JP3065754B2 JP3065754B2 (ja) | 2000-07-17 |
Family
ID=18217212
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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