JPH1118762A - １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法Info
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- JPH1118762A JPH1118762A JP17571297A JP17571297A JPH1118762A JP H1118762 A JPH1118762 A JP H1118762A JP 17571297 A JP17571297 A JP 17571297A JP 17571297 A JP17571297 A JP 17571297A JP H1118762 A JPH1118762 A JP H1118762A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 １，５−アンヒドログルシトールに特異的に
作用する１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、
及び上記１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の
製造法を提供する。 【解決手段】 １，５−アンヒドログルシトールに特異
的に作用し、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フルクトース、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオ
イノシトール、マルトース、ラクトースに全く作用しな
い１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、及び上
記１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の生産能
を有する微生物を培養し、培養物から上記１，５−アン
ヒドログルシトール脱水素酵素を採取することを特徴と
する１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造
法。
作用する１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、
及び上記１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の
製造法を提供する。 【解決手段】 １，５−アンヒドログルシトールに特異
的に作用し、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フルクトース、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオ
イノシトール、マルトース、ラクトースに全く作用しな
い１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素、及び上
記１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の生産能
を有する微生物を培養し、培養物から上記１，５−アン
ヒドログルシトール脱水素酵素を採取することを特徴と
する１，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素の製造
法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な１，５−ア
ンヒドログルシトール脱水素酵素（以下、１，５−ＡＧ
ＤＨと略記する）及びその製造法に関するものであり、
さらに詳しくは、１，５−アンヒドログルシトール（以
下、１，５−ＡＧと略記する）に特異的に作用する１，
５−ＡＧＤＨとその製造法に関するものである。
ンヒドログルシトール脱水素酵素（以下、１，５−ＡＧ
ＤＨと略記する）及びその製造法に関するものであり、
さらに詳しくは、１，５−アンヒドログルシトール（以
下、１，５−ＡＧと略記する）に特異的に作用する１，
５−ＡＧＤＨとその製造法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】１，５−ＡＧはヒト髄液及び血漿中に存
在する化合物であるが、ある種の疾患、特に糖尿病の際
には血漿中の１，５−ＡＧレベルが低下することから、
糖尿病の診断マーカーとして有効であることが知られて
いる。従来、１，５−ＡＧは、ガスクロマトグラフィー
による分離方法やピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソ
ルボースオキシダーゼを利用した酵素法により測定され
ていた（特公平５−４１２３８号公報）。その後、１，
５−ＡＧに作用する１，５−ＡＧ酸化酵素（以下、１，
５−ＡＧＯＤと略記する）や補酵素をＮＡＤ+に限定し
た１，５−ＡＧＤＨが見い出され、それぞれの酵素を利
用した酵素法による測定方法が開発された（特公平３−
２４２００号公報、特開平２−２６８６７９号公報）。
ピラノースオキシダーゼの生産菌としては、ポリポラス
・オブッサス（Polyporus obtusus ）、バシジオマイセ
タウス・フンギ（Basidiomycetous fungi ）等が挙げら
れる。Ｌ−ソルボースオキシダーゼの生産菌としては、
トラメテスサングイネア（Trametessanguinea ）ＩＦＯ
−４９２３が挙げられる。また、１，５−ＡＧＯＤの生
産菌としては、ピクノポラス・コクシネウム（Pycnopor
us coccineus）ＩＦＯ−４９２３、同ＩＦＯ−６４９
０、コリオラス・コンソルス（Coriolus consors）ＩＦ
Ｏ−９０７８、シュードモナス（Pseudomonas ）sp.NK
−85001 （ＦＥＲＭ Ｐ−８１００）が挙げられる（特
公平３−２４２００号公報）。さらに、１，５−ＡＧＤ
Ｈの生産菌としては、オイペニシリウム・クルスタセウ
ム（Eupenicillium crustaceum）ＩＦＯ−８９３８、ハ
ンセヌラ・カリホニア（Hansenura carifonia ）ＨＵＴ
−７３２１、ピチア・シュードポリモルファ（Pichia p
seudopolymorha）ＨＵＴ−７３３０等の各種真菌（特開
平２−２６８６７９号公報）が挙げられる。また、シュ
ードモナス属に属する微生物を代表とする各種１，５−
ＡＧＯＤ生産菌を、１，５−ＡＧを含有する培地で培養
することにより、１，５−ＡＧＯＤ活性の高い酵素を取
得していたが、それらの酵素は菌体の膜画分に存在して
おり、抽出操作が容易でなかった（特公平７−１２３０
６号公報）。
在する化合物であるが、ある種の疾患、特に糖尿病の際
には血漿中の１，５−ＡＧレベルが低下することから、
糖尿病の診断マーカーとして有効であることが知られて
いる。従来、１，５−ＡＧは、ガスクロマトグラフィー
による分離方法やピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソ
ルボースオキシダーゼを利用した酵素法により測定され
ていた（特公平５−４１２３８号公報）。その後、１，
５−ＡＧに作用する１，５−ＡＧ酸化酵素（以下、１，
５−ＡＧＯＤと略記する）や補酵素をＮＡＤ+に限定し
た１，５−ＡＧＤＨが見い出され、それぞれの酵素を利
用した酵素法による測定方法が開発された（特公平３−
２４２００号公報、特開平２−２６８６７９号公報）。
ピラノースオキシダーゼの生産菌としては、ポリポラス
・オブッサス（Polyporus obtusus ）、バシジオマイセ
タウス・フンギ（Basidiomycetous fungi ）等が挙げら
れる。Ｌ−ソルボースオキシダーゼの生産菌としては、
トラメテスサングイネア（Trametessanguinea ）ＩＦＯ
−４９２３が挙げられる。また、１，５−ＡＧＯＤの生
産菌としては、ピクノポラス・コクシネウム（Pycnopor
us coccineus）ＩＦＯ−４９２３、同ＩＦＯ−６４９
０、コリオラス・コンソルス（Coriolus consors）ＩＦ
Ｏ−９０７８、シュードモナス（Pseudomonas ）sp.NK
−85001 （ＦＥＲＭ Ｐ−８１００）が挙げられる（特
公平３−２４２００号公報）。さらに、１，５−ＡＧＤ
Ｈの生産菌としては、オイペニシリウム・クルスタセウ
ム（Eupenicillium crustaceum）ＩＦＯ−８９３８、ハ
ンセヌラ・カリホニア（Hansenura carifonia ）ＨＵＴ
−７３２１、ピチア・シュードポリモルファ（Pichia p
seudopolymorha）ＨＵＴ−７３３０等の各種真菌（特開
平２−２６８６７９号公報）が挙げられる。また、シュ
ードモナス属に属する微生物を代表とする各種１，５−
ＡＧＯＤ生産菌を、１，５−ＡＧを含有する培地で培養
することにより、１，５−ＡＧＯＤ活性の高い酵素を取
得していたが、それらの酵素は菌体の膜画分に存在して
おり、抽出操作が容易でなかった（特公平７−１２３０
６号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た従来のガスクロマトグラフィー法は、試料の前処理及
び分析機器の維持・管理に高度な技術が必要であったた
め、一般的に用いられる方法ではなかった。ピラノース
オキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダーゼを利用
した酵素法では、１，５−ＡＧのみならずグルコースを
酸化するという性質を有することから、測定の際、血漿
中に正常時で１，５−ＡＧの約４０倍、糖尿病時では更
に多量に存在するグルコースを除去する必要があった。
また、１，５−ＡＧＯＤ及び従来の１，５−ＡＧＤＨを
利用した酵素法では、その基質特異性がそれ程厳密でな
かった。さらに、１，５−ＡＧＯＤの生産菌の培養に
は、炭素源として高価な１，５−ＡＧを使用していたた
め、製造コストが高くなるという欠点があった。さらに
また、上記酵素は菌体の膜画分に存在していたため、可
溶化等による酵素の抽出操作が必要であった。本発明
は、１，５−ＡＧに特異的に作用する１，５−ＡＧＤ
Ｈ、及びその製造法を提供することを目的とするもので
ある。
た従来のガスクロマトグラフィー法は、試料の前処理及
び分析機器の維持・管理に高度な技術が必要であったた
め、一般的に用いられる方法ではなかった。ピラノース
オキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダーゼを利用
した酵素法では、１，５−ＡＧのみならずグルコースを
酸化するという性質を有することから、測定の際、血漿
中に正常時で１，５−ＡＧの約４０倍、糖尿病時では更
に多量に存在するグルコースを除去する必要があった。
また、１，５−ＡＧＯＤ及び従来の１，５−ＡＧＤＨを
利用した酵素法では、その基質特異性がそれ程厳密でな
かった。さらに、１，５−ＡＧＯＤの生産菌の培養に
は、炭素源として高価な１，５−ＡＧを使用していたた
め、製造コストが高くなるという欠点があった。さらに
また、上記酵素は菌体の膜画分に存在していたため、可
溶化等による酵素の抽出操作が必要であった。本発明
は、１，５−ＡＧに特異的に作用する１，５−ＡＧＤ
Ｈ、及びその製造法を提供することを目的とするもので
ある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者等はこのような
課題を解決するために鋭意研究した結果、土壌より分離
したラフネラ属、エンテロバクター属、セラチア属に属
する微生物より得た酵素が、ＮＡＤ+ の存在下、１，５
−ＡＧを酸化する反応を触媒し、かつ、その酵素が血中
に存在するグルコース等の糖類と全く反応しない１，５
−ＡＧＤＨであること、及びこれらの微生物を培養する
場合、培地に１，５−ＡＧを含有させなくても、１，５
−ＡＧＤＨを生産できることを見い出し、本発明に到達
した。
課題を解決するために鋭意研究した結果、土壌より分離
したラフネラ属、エンテロバクター属、セラチア属に属
する微生物より得た酵素が、ＮＡＤ+ の存在下、１，５
−ＡＧを酸化する反応を触媒し、かつ、その酵素が血中
に存在するグルコース等の糖類と全く反応しない１，５
−ＡＧＤＨであること、及びこれらの微生物を培養する
場合、培地に１，５−ＡＧを含有させなくても、１，５
−ＡＧＤＨを生産できることを見い出し、本発明に到達
した。
【０００５】すなわち、本発明は、以下の（１）から
（６）の理化学的性質を有する１，５−ＡＧＤＨ、及び
その１，５−ＡＧＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培
養物から１，５−ＡＧＤＨを採取することを特徴とする
１，５−ＡＧＤＨの製造法を要旨とするものである。 （１）作用：電子受容体の存在下、１，５−ＡＧを酸化
する。 （２）分子量：約６万５千〜７万（ゲルろ過クロマトグ
ラフィー法） （３）基質特異性：１，５−ＡＧに特異的に作用する。
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、マルトース、ラクトースに全く作用しない。 （４）至適ｐＨ：８．５（温度３０℃） （５）安定ｐＨ：６．０〜７．５ （６）作用適温の範囲：２０〜４０℃（リン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０）
（６）の理化学的性質を有する１，５−ＡＧＤＨ、及び
その１，５−ＡＧＤＨ生産能を有する菌株を培養し、培
養物から１，５−ＡＧＤＨを採取することを特徴とする
１，５−ＡＧＤＨの製造法を要旨とするものである。 （１）作用：電子受容体の存在下、１，５−ＡＧを酸化
する。 （２）分子量：約６万５千〜７万（ゲルろ過クロマトグ
ラフィー法） （３）基質特異性：１，５−ＡＧに特異的に作用する。
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、マルトース、ラクトースに全く作用しない。 （４）至適ｐＨ：８．５（温度３０℃） （５）安定ｐＨ：６．０〜７．５ （６）作用適温の範囲：２０〜４０℃（リン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０）
【０００６】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
【０００７】本発明に用いる微生物は上記１，５−ＡＧ
ＤＨを産生し得るものであって、その種類には特に限定
はないが、例えば、ラフネラ属、エンテロバクター属、
セラチア属に属する微生物が挙げられる。これらの微生
物の中でも、好適な例として、ラフネラ・アクアティリ
ス４７４、エンテロバクター・クロアカエ３４０、セラ
チア・マルセッセンス８２５が挙げられる。以下に、ラ
フネラ・アクアティリス４７４、エンテロバクター・ク
ロアカエ３４０、セラチア・マルセッセンス８２５の菌
学的性質を以下に示す。
ＤＨを産生し得るものであって、その種類には特に限定
はないが、例えば、ラフネラ属、エンテロバクター属、
セラチア属に属する微生物が挙げられる。これらの微生
物の中でも、好適な例として、ラフネラ・アクアティリ
ス４７４、エンテロバクター・クロアカエ３４０、セラ
チア・マルセッセンス８２５が挙げられる。以下に、ラ
フネラ・アクアティリス４７４、エンテロバクター・ク
ロアカエ３４０、セラチア・マルセッセンス８２５の菌
学的性質を以下に示す。
【０００８】 試験項目 試験結果 菌 株 ４７４ ３４０ ８２５ 形態 桿菌 桿菌 桿菌 グラム染色性 − − − 胞子 − − − 運動性 ＋ ＋ ＋ 酸素に対する態度 通性嫌気性 通性嫌気性 通性嫌気性 オキシダーゼ − − − カタラーゼ ＋ ＋ ＋ ＯＦ Ｆ Ｆ Ｆ 乳糖からのガスの生成 ＋ ＋ − 集落の色調 ＮＰ ＮＰ ＮＰ （ＮＰ：特徴的集落色素を生成せず）
【０００９】上記性状試験の結果から、いずれの菌株も
腸内細菌であることが示唆されたので、自動細菌検査装
置ATB Expression（ビオメリュー）による同定試験を行
った。なお、試験には腸内細菌同定キットID 32E（ビオ
メリュー）を用いた。
腸内細菌であることが示唆されたので、自動細菌検査装
置ATB Expression（ビオメリュー）による同定試験を行
った。なお、試験には腸内細菌同定キットID 32E（ビオ
メリュー）を用いた。
【００１０】 試験項目 試験結果 菌 株 ４７４ ３４０ ８２５ オルニチンデカルボキシラーゼ − ＋ ＋ アルギニンジヒドラーゼ − ＋ − ウレアーゼ − − − 酸の生成 Ｌ−アラビトール − − − Ｄ−ガラクツロン酸 ＋ ＋ − ５−ケトグルコン酸カリウム ＋ − ＋ リパーゼ ？ − ＋ 酸の生成 ピルビン酸ナトリウム − − − β−グルコシダーゼ ＋ ＋ ＋ 酸の生成 Ｄ−マンニトール ＋ ＋ ＋ Ｄ−マルトール ＋ ＋ ＋ インドールの生成 − − − Ｎ−アセチル−β−グルコサミニダーゼ − − ＋ β−ガラクトシダーゼ ＋ ＋ ＋ 酸の生成 グルコース ＋ ＋ ＋ シュークロース ＋ ＋ − Ｌ−アラビノース ＋ ＋ − Ｄ−アラビトール − − − α−グルコシダーゼ − − − α−ガラクトシダーゼ ＋ ＋ − 酸の生成 トレハロース ＋ ＋ ＋ Ｌ−ラムノース ＋ ＋ − イノシトール − ＋ ＋ アドニトール − − ＋ パラチノース − ＋ − β−グルクロニダーゼ ＋ − − 酸の生成 Ｄ−セロビオース ＋ ＋ − Ｄ−ソルビトール ＋ ＋ ＋ α−マルトシダーゼ − ？ − マロン酸塩の利用 ＋ ＋ − Ｌ−アスパラギン酸アリルアミダーゼ − − ＋ （？：判定保留）
【００１１】菌学的性質から、バージィのマニュアル・
オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bargey's
mannual of Systematic Bacteriology ）に基き検索し
た結果、４７４株、３４０株、８２５株は、それぞれラ
フネラ・アクアティリス、エンテロバクター・クロアカ
エ、セラチア・マルセッセンスに属する細菌と判明し、
それぞれラフネラ・アクアティリス４７４、エンテロバ
クター・クロアカエ３４０、セラチア・マルセッセンス
８２５と命名し、平成９年３月２６日に通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号は
それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５８、ＦＥＲＭ Ｐ−
１６１５７、ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５９である。
オブ・システマティック・バクテリオロジー（Bargey's
mannual of Systematic Bacteriology ）に基き検索し
た結果、４７４株、３４０株、８２５株は、それぞれラ
フネラ・アクアティリス、エンテロバクター・クロアカ
エ、セラチア・マルセッセンスに属する細菌と判明し、
それぞれラフネラ・アクアティリス４７４、エンテロバ
クター・クロアカエ３４０、セラチア・マルセッセンス
８２５と命名し、平成９年３月２６日に通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所に寄託した。その寄託番号は
それぞれ、ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５８、ＦＥＲＭ Ｐ−
１６１５７、ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５９である。
【００１２】本発明における微生物を培養する際に用い
られる栄養培地は、炭素源として、１，５−ＡＧ、グリ
セロール、コハク酸、グルコース、シュークロース、マ
ルトース、ラクトース等が使用できるので、高価な１，
５−ＡＧは必ずしも使用しなくてもよい。窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒
素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コ
ーンスチープリカー等の有機窒素が使用できる。無機塩
類としては、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マグネ
シウム、マンガン等の各塩類、必要に応じて微量金属
塩、ビタミン類等を使用してもよい。
られる栄養培地は、炭素源として、１，５−ＡＧ、グリ
セロール、コハク酸、グルコース、シュークロース、マ
ルトース、ラクトース等が使用できるので、高価な１，
５−ＡＧは必ずしも使用しなくてもよい。窒素源として
は、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等の無機窒
素、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コ
ーンスチープリカー等の有機窒素が使用できる。無機塩
類としては、カリウム、ナトリウム、亜鉛、鉄、マグネ
シウム、マンガン等の各塩類、必要に応じて微量金属
塩、ビタミン類等を使用してもよい。
【００１３】培養は通常、微好気的な条件下で行う。培
養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃、最適
には３０℃で行う。このような条件下で１０〜８０時
間、好ましくは２０〜７０時間培養することにより、菌
体内に１，５−ＡＧＤＨが生成、蓄積される。本発明で
は、１，５−ＡＧＤＨが菌体内に蓄積されるので、菌体
の膜画分から抽出するよりも、容易に、効率よく、１，
５−ＡＧＤＨを抽出することができる。
養温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３７℃、最適
には３０℃で行う。このような条件下で１０〜８０時
間、好ましくは２０〜７０時間培養することにより、菌
体内に１，５−ＡＧＤＨが生成、蓄積される。本発明で
は、１，５−ＡＧＤＨが菌体内に蓄積されるので、菌体
の膜画分から抽出するよりも、容易に、効率よく、１，
５−ＡＧＤＨを抽出することができる。
【００１４】本発明の１，５−ＡＧＤＨを得るために
は、まず、例えば、上記のごとく微生物を培養し、培養
終了後、遠心分離や濾過等の操作で培養液から菌体を回
収する。次に、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すれば
よい。具体的には、酵素の抽出法は、自己消化、超音波
破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理、リゾチーム処
理等いずれの方法を用いてもよく、こうした処理後、遠
心分離により細胞片を除去し、粗酵素液が得られる。粗
酵素液は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組
み合わせ、処理することにより、本発明の１，５−ＡＧ
ＤＨを精製することができる。
は、まず、例えば、上記のごとく微生物を培養し、培養
終了後、遠心分離や濾過等の操作で培養液から菌体を回
収する。次に、菌体から粗酵素液を抽出し、精製すれば
よい。具体的には、酵素の抽出法は、自己消化、超音波
破砕、フレンチプレス、界面活性剤処理、リゾチーム処
理等いずれの方法を用いてもよく、こうした処理後、遠
心分離により細胞片を除去し、粗酵素液が得られる。粗
酵素液は、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニテ
ィークロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲ
ル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組
み合わせ、処理することにより、本発明の１，５−ＡＧ
ＤＨを精製することができる。
【００１５】イオン交換樹脂としては、Ｑ−セファロー
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
（ファルマシア社製）等が挙げられる。アフィニティー
クロマト用樹脂としては、ブルーセファロースＣＬ−６
Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社
製）等やプロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、
または、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ（チバガイギー
社製）等のトリアジン色素から作製した樹脂が用いられ
る。疎水クロマト用樹脂としては、オクチル−セファロ
ースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）等が挙げられる。
ゲル濾過用担体または樹脂としては、セファデックスＧ
−１００等が挙げられる。
スＦＦ（ファルマシア社製）、ＤＥＡＥ−セファロース
（ファルマシア社製）等が挙げられる。アフィニティー
クロマト用樹脂としては、ブルーセファロースＣＬ−６
Ｂ、レッドセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア社
製）等やプロシオンブルーＨ−ＥＲＤ（ＩＣＩ社製）、
または、チバクロンイエローＨＥ−３Ｇ（チバガイギー
社製）等のトリアジン色素から作製した樹脂が用いられ
る。疎水クロマト用樹脂としては、オクチル−セファロ
ースＣＬ−４Ｂ（ファルマシア社製）等が挙げられる。
ゲル濾過用担体または樹脂としては、セファデックスＧ
−１００等が挙げられる。
【００１６】また、これらのカラムクロマトグラフィー
に加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン処理
による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパク質
の塩析を行ってもよい。
に加え、硫酸ストレプトマイシンや硫酸プロタミン処理
による除核酸、硫酸アンモニウム処理によるタンパク質
の塩析を行ってもよい。
【００１７】このようにして得られた１，５−ＡＧＤＨ
の理化学的性質を以下に示す。 （１）作用：電子受容体の存在下、１，５−ＡＧを酸化
する。 本発明で用いられる電子受容体としては、１，５−ＡＧ
を脱水素による酸化反応に関与するものであれば特に制
限はなく、例えば、酸素、フェナンジンメトサルフェー
ト、ジクロルフェノールインドフェノール、フェリシア
ン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム等のフェリシ
アン化化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+ 、
ＦＭＮなどの補酵素が挙げられる。電子受容体としてＮ
ＡＤ+ またはＮＡＤＰ+ を用いた場合には、生成したＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを基質としてニトロブルーテト
ラゾリウム等のテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフ
ェノールインドフェノール等を還元発色させ、可視部で
測定することもできる。 （２）分子量：約６万５千〜７万（ゲルろ過クロマトグ
ラフィー法） （３）基質特異性：１，５−ＡＧに特異的に作用する。
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオイノシトー
ル、マルトース、ラクトースに全く作用しない。 （４）至適ｐＨ：８．５（温度３０℃） （５）安定ｐＨ：６．０〜７．５ （６）作用適温の範囲：２０〜４０℃（リン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０）
の理化学的性質を以下に示す。 （１）作用：電子受容体の存在下、１，５−ＡＧを酸化
する。 本発明で用いられる電子受容体としては、１，５−ＡＧ
を脱水素による酸化反応に関与するものであれば特に制
限はなく、例えば、酸素、フェナンジンメトサルフェー
ト、ジクロルフェノールインドフェノール、フェリシア
ン化カリウム、フェリシアン化ナトリウム等のフェリシ
アン化化合物、チトクロムＣ、ＮＡＤ+、ＮＡＤＰ+ 、
ＦＭＮなどの補酵素が挙げられる。電子受容体としてＮ
ＡＤ+ またはＮＡＤＰ+ を用いた場合には、生成したＮ
ＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを基質としてニトロブルーテト
ラゾリウム等のテトラゾリウム塩や２，６−ジクロロフ
ェノールインドフェノール等を還元発色させ、可視部で
測定することもできる。 （２）分子量：約６万５千〜７万（ゲルろ過クロマトグ
ラフィー法） （３）基質特異性：１，５−ＡＧに特異的に作用する。
Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、
Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトー
ス、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオイノシトー
ル、マルトース、ラクトースに全く作用しない。 （４）至適ｐＨ：８．５（温度３０℃） （５）安定ｐＨ：６．０〜７．５ （６）作用適温の範囲：２０〜４０℃（リン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０）
【００１８】なお、活性の測定は、４００mMの１，５−
ＡＧ、１０ｍＭのＮＡＤ+ 、５０μＭのニトロテトラゾ
リウムブルー及び１０Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ（Bacill
us stearothermophilus 由来、生化学工業社製）を含む
０．２Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に酵素溶液
を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で５５０ｎｍ
における吸光度変化を測定した。測定は、３０℃で行っ
た。１分間に１マイクロモルのフォルマザンを生成する
酵素量を１単位（Ｕ）とした。
ＡＧ、１０ｍＭのＮＡＤ+ 、５０μＭのニトロテトラゾ
リウムブルー及び１０Ｕ／ｍｌのジアホラーゼ（Bacill
us stearothermophilus 由来、生化学工業社製）を含む
０．２Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に酵素溶液
を加え、緩やかに混和した後、分光光度計で５５０ｎｍ
における吸光度変化を測定した。測定は、３０℃で行っ
た。１分間に１マイクロモルのフォルマザンを生成する
酵素量を１単位（Ｕ）とした。
【００１９】本発明の１，５−ＡＧＤＨは、１，５−Ａ
Ｇに特異的に作用し、血液等の体液中に存在する他の糖
類、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フルクトース、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオ
イノシトール、マルトース、ラクトース等には全く作用
しないので、体液を試料とした１，５−ＡＧの測定にお
いて、測定誤差が生じにくい。このため、体液を試料と
した１，５−ＡＧの測定用試薬に好適に利用できる。
Ｇに特異的に作用し、血液等の体液中に存在する他の糖
類、例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガ
ラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロース、Ｄ−
フルクトース、Ｄ−ソルビトース、キシリトール、ミオ
イノシトール、マルトース、ラクトース等には全く作用
しないので、体液を試料とした１，５−ＡＧの測定にお
いて、測定誤差が生じにくい。このため、体液を試料と
した１，５−ＡＧの測定用試薬に好適に利用できる。
【００２０】
【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。なお、％はいずれも重量％を表す。
する。なお、％はいずれも重量％を表す。
【００２１】実施例１ グリセロール０．５％、ペプトン５．０％、酵母エキス
０．０５％、リン酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム・七水和物０．０２５％、ｐＨ７．０よりなる
培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメン
ターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ラフネ
ラ・アクアティリス４７４（ＦＥＲＭＰ−１６１５８）
を接種した。３０℃で６０時間、１００ｒｐｍで撹拌
し、通気しない条件下培養し、遠心分離により約１８０
ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は凍結で保存した。次
に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡ及び２−メルカプト
エタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）５００ｍｌに懸濁し、超音波処理により、菌
体を破砕後、遠心分離により細胞片を除去し、１，５−
ＡＧＤＨを含む粗酵素液を得た。この粗酵素液を２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−
セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通
じ、ＫＣｌの濃度勾配により溶出せしめると、ＫＣｌ濃
度０．１５〜０．２Ｍで１，５−ＡＧＤＨ活性画分を得
た。続いて、得られた画分を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ
カラム（ファルマシア社製）に通じ、ＫＣｌの濃度勾配
により溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４〜０．５Ｍに
１，５−ＡＧＤＨ活性画分を得た。このようにして得ら
れた１，５−ＡＧＤＨの収率は約４０％で、酵素蛋白質
１ｍｇ当たり約２０単位の比活性を示し、その精製度は
粗酵素液を１とすると約３００倍であった。
０．０５％、リン酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグ
ネシウム・七水和物０．０２５％、ｐＨ７．０よりなる
培地１８リットルを３０リットル容のジャーファーメン
ターに仕込み、１２１℃で１５分間滅菌した後、ラフネ
ラ・アクアティリス４７４（ＦＥＲＭＰ−１６１５８）
を接種した。３０℃で６０時間、１００ｒｐｍで撹拌
し、通気しない条件下培養し、遠心分離により約１８０
ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は凍結で保存した。次
に、凍結菌体約１００ｇをＥＤＴＡ及び２−メルカプト
エタノールを２ｍＭずつ含む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）５００ｍｌに懸濁し、超音波処理により、菌
体を破砕後、遠心分離により細胞片を除去し、１，５−
ＡＧＤＨを含む粗酵素液を得た。この粗酵素液を２５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＤＥＡＥ−
セファロース−ＦＦカラム（ファルマシア社製）に通
じ、ＫＣｌの濃度勾配により溶出せしめると、ＫＣｌ濃
度０．１５〜０．２Ｍで１，５−ＡＧＤＨ活性画分を得
た。続いて、得られた画分を２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．０）で平衡化したブルーセファロースＣＬ−６Ｂ
カラム（ファルマシア社製）に通じ、ＫＣｌの濃度勾配
により溶出せしめると、ＫＣｌ濃度０．４〜０．５Ｍに
１，５−ＡＧＤＨ活性画分を得た。このようにして得ら
れた１，５−ＡＧＤＨの収率は約４０％で、酵素蛋白質
１ｍｇ当たり約２０単位の比活性を示し、その精製度は
粗酵素液を１とすると約３００倍であった。
【００２２】得られた１，５−ＡＧＤＨは、スーパーロ
ース（ファルマシア社製）ゲル瀘過クロマトグラフィー
により分子量を測定したところ、６万５千〜７万であっ
た。また、得られた１，５−ＡＧＤＨは、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アラビノ
ース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルビ
トース、キシリトール、ミオイノシトール、マルトー
ス、ラクトースには全く作用しなかった。さらに、ｐＨ
６〜７．５で安定で、ｐＨ８．５で最大の活性を示し
た。
ース（ファルマシア社製）ゲル瀘過クロマトグラフィー
により分子量を測定したところ、６万５千〜７万であっ
た。また、得られた１，５−ＡＧＤＨは、Ｄ−グルコー
ス、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アラビノ
ース、Ｄ−キシロース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−ソルビ
トース、キシリトール、ミオイノシトール、マルトー
ス、ラクトースには全く作用しなかった。さらに、ｐＨ
６〜７．５で安定で、ｐＨ８．５で最大の活性を示し
た。
【００２３】実施例２ 実施例１と同様の培地、条件により、エンテロバクター
・クロアカエ３４０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５７）を培
養し、約３９０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍
結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様
の方法で粗抽出液を得た。さらに、実施例と同様の方法
で粗抽出液から精製酵素標品を得た。このようにして得
られた１，５−ＡＧＤＨの収率は約３０％で、酵素蛋白
質１ｍｇ当たり約２０単位の比活性を示し、その精製度
は粗酵素液を１とすると約２００倍であった。また、得
られた１，５−ＡＧＤＨは、請求項１記載の性質を示し
た。
・クロアカエ３４０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５７）を培
養し、約３９０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍
結で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様
の方法で粗抽出液を得た。さらに、実施例と同様の方法
で粗抽出液から精製酵素標品を得た。このようにして得
られた１，５−ＡＧＤＨの収率は約３０％で、酵素蛋白
質１ｍｇ当たり約２０単位の比活性を示し、その精製度
は粗酵素液を１とすると約２００倍であった。また、得
られた１，５−ＡＧＤＨは、請求項１記載の性質を示し
た。
【００２４】実施例３ 実施例１と同様の培地、条件により、セラチア・マルセ
ッセンス８２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５９）を培養
し、約４１０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結
で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様の
方法で粗抽出液を得た。さらに、実施例と同様の方法で
粗抽出液から精製酵素標品を得た。このようにして得ら
れた１，５−ＡＧＤＨの収率は約２５％で、酵素蛋白質
１ｍｇ当たり約４５単位の比活性を示し、その精製度は
粗酵素液を１とすると約２５０倍であった。また、得ら
れた１，５−ＡＧＤＨは、請求項１記載の性質を示し
た。
ッセンス８２５（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５９）を培養
し、約４１０ｇの湿菌体を得た。得られた菌体は、凍結
で保存した。次に、これらの菌体から実施例１と同様の
方法で粗抽出液を得た。さらに、実施例と同様の方法で
粗抽出液から精製酵素標品を得た。このようにして得ら
れた１，５−ＡＧＤＨの収率は約２５％で、酵素蛋白質
１ｍｇ当たり約４５単位の比活性を示し、その精製度は
粗酵素液を１とすると約２５０倍であった。また、得ら
れた１，５−ＡＧＤＨは、請求項１記載の性質を示し
た。
【００２５】
【発明の効果】本発明の１，５−ＡＧＤＨは、１，５−
ＡＧに特異的に作用するので、１，５−ＡＧの測定用試
薬に利用可能であり、特に、血液等の体液中に存在する
他の糖類には全く作用しないので、体液中の１，５−Ａ
Ｇの測定においても誤差が生じにくく、体液を試料とす
る１，５−ＡＧの測定用試薬としても好適に利用でき
る。また、本発明の製造法は、１，５−ＡＧに特異的に
作用する１，５−ＡＧＤＨを安価に、効率よく、生産す
ることができる。
ＡＧに特異的に作用するので、１，５−ＡＧの測定用試
薬に利用可能であり、特に、血液等の体液中に存在する
他の糖類には全く作用しないので、体液中の１，５−Ａ
Ｇの測定においても誤差が生じにくく、体液を試料とす
る１，５−ＡＧの測定用試薬としても好適に利用でき
る。また、本発明の製造法は、１，５−ＡＧに特異的に
作用する１，５−ＡＧＤＨを安価に、効率よく、生産す
ることができる。
Claims (8)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する１，５−ア
ンヒドログルシトール脱水素酵素。 （１）作用：電子受容体の存在下、１，５−アンヒドロ
グルシトールを酸化する。 （２）分子量：約６万５千〜７万（ゲルろ過クロマトグ
ラフィー法） （３）基質特異性：１，５−アンヒドログルシトールに
特異的に作用する。Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、
Ｄ−ガラクトース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−フルクトース、マルトース、ラクトースに全く
作用しない。 （４）至適ｐＨ：８．５（温度３０℃） （５）安定ｐＨ：６．０〜７．５ （６）作用適温の範囲：２０〜４０℃（リン酸緩衝液ｐ
Ｈ６．０） - 【請求項２】 請求項１記載の１，５−アンヒドログル
シトール脱水素酵素の生産能を有する微生物を培養し、
培養物から請求項１記載の１，５−アンヒドログルシト
ール脱水素酵素を採取することを特徴とする１，５−ア
ンヒドログルシトール脱水素酵素の製造法。 - 【請求項３】 請求項１記載の１，５−アンヒドログル
シトール脱水素酵素の生産能を有する微生物が、ラフネ
ラ（Rahnella）属に属する微生物である請求項２記載の
製造法。 - 【請求項４】 ラフネラ属に属する１，５−アンヒドロ
グルシトール脱水素酵素の生産能を有する微生物が、ラ
フネラ・アクアティリス（Rahnella aquatitlis ）４７
４（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５８）である請求項３記載の
製造法。 - 【請求項５】 請求項１記載の１，５−アンヒドログル
シトール脱水素酵素の生産能を有する微生物が、エンテ
ロバクター（Enterobacter）属に属する微生物である請
求項２記載の製造法。 - 【請求項６】 エンテロバクター属に属する１，５−ア
ンヒドログルシトール脱水素酵素の生産能を有する微生
物が、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter c
loacae）３４０（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５７）である請
求項５記載の製造法。 - 【請求項７】 請求項１記載の１，５−アンヒドログル
シトール脱水素酵素の生産能を有する微生物がセラチア
（Serratia）属に属する微生物である請求項２記載の製
造法。 - 【請求項８】 セラチア属に属する１，５−アンヒドロ
グルシトール脱水素酵素の生産能を有する微生物が、セ
ラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens ）８２
５（ＦＥＲＭ Ｐ−１６１５９）である請求項７記載の
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17571297A JPH1118762A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP17571297A JPH1118762A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1118762A true JPH1118762A (ja) | 1999-01-26 |
Family
ID=16000928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP17571297A Pending JPH1118762A (ja) | 1997-07-01 | 1997-07-01 | １，５−アンヒドログルシトール脱水素酵素及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1118762A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1213357A2 (en) * | 2000-10-11 | 2002-06-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1, 5-Anhydroglucitol |
| WO2009154247A1 (ja) | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 日本化薬株式会社 | 耐熱性１，５－アンヒドログルシトール脱水素酵素及びそれを用いた１，５－アンヒドログルシトールの測定法 |
| JP2010104239A (ja) * | 2008-10-28 | 2010-05-13 | Kagoshima Univ | １，５−ｄ−アンヒドログルシトールの製造法 |
| WO2010067769A1 (ja) | 2008-12-08 | 2010-06-17 | 日本化薬株式会社 | １，５－アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット |
| US8945864B2 (en) | 2006-06-22 | 2015-02-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Method of determining 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determining 1,5-anhydroglucitol |
| DE102014112184A1 (de) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Fanuc Corporation | Magnetanbring- und Positioniervorrichtung |
-
1997
- 1997-07-01 JP JP17571297A patent/JPH1118762A/ja active Pending
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1213357A2 (en) * | 2000-10-11 | 2002-06-12 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1, 5-Anhydroglucitol |
| EP1213357A3 (en) * | 2000-10-11 | 2003-12-03 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Method and reagent for quantitative determination of 1, 5-Anhydroglucitol |
| US8945864B2 (en) | 2006-06-22 | 2015-02-03 | Ikeda Food Research Co., Ltd. | Method of determining 1,5-anhydroglucitol, and reagent composition for determining 1,5-anhydroglucitol |
| WO2009154247A1 (ja) | 2008-06-19 | 2009-12-23 | 日本化薬株式会社 | 耐熱性１，５－アンヒドログルシトール脱水素酵素及びそれを用いた１，５－アンヒドログルシトールの測定法 |
| US8574882B2 (en) | 2008-06-19 | 2013-11-05 | Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha | Thermostable 1,5-anhydroglucitol dehydrogenase, and method for measurement of 1,5-anhydroglucitol by using the same |
| JP2010104239A (ja) * | 2008-10-28 | 2010-05-13 | Kagoshima Univ | １，５−ｄ−アンヒドログルシトールの製造法 |
| WO2010067769A1 (ja) | 2008-12-08 | 2010-06-17 | 日本化薬株式会社 | １，５－アンヒドログルシトールの電気化学的測定用バイオセンサ、それを用いた測定方法および測定用キット |
| DE102014112184A1 (de) | 2013-08-30 | 2015-03-05 | Fanuc Corporation | Magnetanbring- und Positioniervorrichtung |
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