FR2555197A1

FR2555197A1 - Nouvelle maltose deshydrogenase, sa production, methode d'analyse l'utilisant et composition utilisable pour cette methode

Info

Publication number: FR2555197A1
Application number: FR8417801A
Authority: FR
Inventors: Hidehiko Ishikawa; Kazuo Matsuura; Hideo Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1983-11-22
Filing date: 1984-11-22
Publication date: 1985-05-24
Also published as: FR2555197B1; DE3442856A1; DE3442856C2; JPH047190B2; IT1196333B; JPS60114193A; IT8423684A0; IT8423684A1; US4683198A

Abstract

L'INVENTION CONCERNE UNE NOUVELLE ENZYME ET SA PRODUCTION. IL S'AGIT D'UNE ENZYME QUI AGIT SUR UNE EXTREMITE REDUCTIBLE DE MONOSACCHARIDE OU D'OLIGOSACCHARIDE SANS EXIGER DE NAD OU DE NADP ET QUI CATALYSE UNE REACTION SUIVANTE: (CF DESSIN DANS BOPI) OU R EST UN RESIDU DE CHAINE DE SACCHARIDE OU DE L'HYDROGENE, A EST UN ACCEPTEUR D'HYDROGENE A L'EXCEPTION DE NAD OU NADP, AH OU AHN EST UN ACCEPTEUR DANS UNE FORME REDUITE ET N EST UN NOMBRE ENTIER CHOISI PARMI 1 ET 2. APPLICATION A LA DETERMINATION DE SACCHARIDE OU D'UNE ACTIVITE D'ENZYME LIBERATRICE DE SACCHARIDE.

Description

-1- La présente invention concerne une nouvelle maltose déshydrogénase, sa

production, une méthode d'analyse qui

l'utilise et une composition pour cette méthode d'analyse.

Plus particulièrement, la présente invention concerne une nouvelle enzyme qui agit sur une extrémité réductible de monosaccharide ou d'oligosaccharide sans exiger de NAD (nicotine adénine dinucléotide) ou de NADP (nicotine adénine dinucléotide phosphate) et qui catalyse une réaction suivante:

CH2OH CH2OH

H Hn A-

H R-Cî0 eH T e0' + nAH ou AHn

OH R OH

o R est un résidu de chaîne de saccharide ou de l'hydro-

gène, A est un accepteur d'hydrogène à l'exception de NAp ou NADP, AH ou AHn est un accepteur dans une forme réduite et n est un nombre entier choisi parmi 1 et 2; un procédé pour la production de cette enzyme, selon lequel on cultive les microorganismes producteurs de cette enzyme appartenant au genre Staphylococcus et on isole l'enzyme; une méthode de dosage pour la détermination de saccharide ou de l'activité d'une enzyme libératrice de saccharide qui comprend la réaction de l'enzyme ci-dessus avec un substrat et la mesure de changements détectables; et une

composition utilisable pour cette détermination.

Jusqu'à présent, on connaît divers types de déshydro-

génase, une enzyme qui agit sur l'extrémité réductible de monosaccharide ou d'oligosaccharide et catalyse la réaction de déshydrogénation en présence d'un accepteur d'hydrogène, comme la glucose déshydrogénase LEC. 1.1.1.47 glucose dehydrogenase (Enzyme Handbook, page 19, décembre 1982), EC. 1.1.1.118 glucose dehydrogenase (NAD+)(ibid, page 42), -2- EC. 1.1.1. 119 glucose dehydrogenase (NADP +)(ibid, page 43)7 ou la maltose déshydrogénase (brevet britannique publié N 2 088 052 A). Ces enzymes exigent NAD ou NADP comme accepteur d'hydrogène. De plus, on connatt une enzyme qui n'utilise pas NAD et NADP, mais utilise le phénazine

méthosulfate (PMS) et effectue l'oxydation (déshydrogé-

nation) du glucose, par exemple une enzyme produite par Pseudomonas sp ou Gluconobacter suboxydance. /Matsushita et autres, Agr. Biol. Chem., 44, 1505 - 1512 (1980), ibid., 45, 851 - 861 (1981)7. Ces enzymes connues ont présenté une activité sur le glucose, mais ont présenté moins d'activité sur les oligosaccharides plus gros que le maltose. On a trouvé que la souche N B-0875 appartenant au genre Staphylococcus, isolée à partir d'un échantillon de terre provenant d'un champ de pommes de terre de Oazamoriuchi, Iwakuni-shi, Yamaguchi-ken, Japon, produit

une nouvelle enzyme /âppelée ci-après maltose déshydrogé-

nase (accepteur)7 qui agit sur une extrémité réductible de monosaccharide ou d'oligosaccharide, n'exigeant pas de NAD ni de NADP comme facteur associé, mais exigeant PMS, du l-méthoxy-phénazine méthosulfate (MPMS) ou du bleu

Meldola (chlorure de 9-diméthylaminobenzo-alpha-

phénazoxonium) comme accepteur d'hydrogène, se montrant

plus active sur le maltose que sur le glucose, à la diffé-

rence de la glucose déshydrogénase connue antérieurement, ayant aussi une spécificité de substrat sur le maltotriose, le maltotétraose, le maltopentaose et le maltohexaose, et qui catalyse la réaction suivante:

CH2OH CH20H

3H0H -H R-C ^O1 H >R-A -O + nAH ou AHn 3 0Fo

OH 0 H

-3-

o R est un résidu de chaîne de saccharide ou de l'hydro-

gène, A est un accepteur d'hydrogène à l'exception de NAD ou NADP, AH ou AHn est un accepteur dans une forme réduite

et n est un nombre entier choisi parmi 1 et 2.

On a trouvé aussi qu'une détermination de saccharide ou une détermination d'enzyme qui libère un saccharide peut être effectuée avantageusement en présence d'un accepteur d'hydrogène en utilisant la présente maltose déshydrogénase

(accepteur). -

Les propriétés taxonomiques des microorganismes pro-

ducteurs de maltose déshydrogénase (accepteur) sont

illustrées comme suit.

(1) Caractéristiques morphologiques: Observées sur une gélose nutritive* après culture

à 30 C pendant 18 heures.

* peptone 10 g, extrait de viande 5 g, NaCi 3 g, eau distillée 1000 ml, pH 7,2 1) Forme, dimensions et polymorphisme des cellules: Principalement en paires, ou isolément, chaînes courtes et coques floculeuses. Pas de polymorphisme. Dimensions:

0,6 - 0,8 x 0,6 - 1,0 dm.

2) Motilité et flagelles: néant 3) Spores: néant 4) Coloration Gram: positive (décoloration facile) 5) Coloration résistant aux acides: négative (2) Caractéristiques de développement: 1) Milieu plaque de gélose au bouillon (30 C, 18 heures) et milieu plaque de gélose nutritive: colonies; convexes, bords ronds et lisses. Blanc crémeux ou blanc

grisâtre. Pas de formation de pigment soluble.

2) Culture inclinée sur gélose au bouillon (30 C, 18 heures) et culture inclinée sur gélose nutritive: Bon

développement avec croissance linéaire. Blanc grisâtre -

blanc crémeux. Pas de formation de pigment soluble.

-4- 3) Bouillon de culture (30 C, 18 - 42 heures): Bon développement avec turbidité uniforme. Forme une

pellicule mince.

4) Lait tournesols ou lait BCP: Coagulation acide dans les 2 semaines de culture, pepto-

nisation partielle.

(3) Propriétés physiologiques:

Réduction de nitrate -

Réaction de dénitrification -

Essai MR -

Essai VP

Formation de H2S -

Hydrolyse d'amidon + (faible) Utilisation de citrate (milieu de Simons) + (milieu de Christenssen) +

Utilisation de nitrate -

Utilisation d'ammonium +

Formation de pigment -

Uréase (SSR) (Christenssen) + Oxydase Catalase + Développement (pH) 5 - 9 (temp.) 10 - 37 C Nature aérobie Essai OF (milieu de Hugh et Leifson*) 0 (faible formation

d'acide dans des con-

ditions anaérobies dans culture de 2-3 semaines) * milieu de Hugh et Leifson: peptone 2,0 g NaCl 5,0 g, K2HPO4 0,3 g, Bleu de bromothymol (0,2 %) 10,0 ml, eau 1000 ml, gélose 3,0 g, pH 7,2 -5- (milieu nonpeptonique**) 0 ** milieu non-peptonique: NH4H2PO4 1,0 g, KC1 0,2 g, MgSO4'7H2O 0,2 g, extrait de levures 1,0 g, gélose 3,0 g, BTB (0,2 %) 10, 0 ml, eau distillée 1000 ml, pH 7,2

Liquéfaction de gélatine -

Hydrolyse de caséine Décomposition d'arginine + Décarboxylation de lysine pas d'essai Résistance à NaCl jusqu'à 5 %

Développement sur milieu FTO -

GC % (méthode Tm) 39 % (4) Formation d'acide ou de gaz à partir de sucre (milieu de base: milieu de Hugh et Leifson et milieu non-peptonique; on a obtenu les mêmes résultats)

Tableau 1

Sucre Acide Gaz Sucre Acide Gaz

adonitol - - D-mannitol - -

L-arabinose + - D-mannose + -

cellobiose + - mélézitose - -

dulcitol - - mélibiose + -

méso-érythritol - - raffinose - -

D-fructose - - L(+)rhamnose + -

fucose + - D-ribose +

D-galactose + - salicine - -

D-glucose + - L-sorbose - -

glycérine - - sorbitol - -

inositol - - amidon - -

inuline - - saccharose - -

lactose + - tréharose - -

maltose - - D-xylose + -

Pour résumer les principales caractéristiques de la souche ci-dessus, la souche est généralement sous la forme de paires, parfois de chaînes liées courtes isolées ou de coques Gram-positives floculeuses (facilement décolorées), -6-

bactéries aérobies non motiles et pas de polymorphisme.

La souche est positive en catalase, négative en oxydase, en décomposition par voie oxydante de sucres et en formation d'acide. Quelquefois, elle donne un résultat F en essai OF à 3 semaines de culture dans un milieu dans

lequel le phosphate d'ammonium est enlevé d'un milieu non-

peptonique, et il y a une faible formation d'acide dans des conditions anaérobies. La teneur en guanine-citonine

(GC %) est de 39 %.

Si on consulte la souche avec le Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8ème édition (1974), la souche appartient aux Micrococcuceae. Dans les Micrococcuceae, le genre Micrococcus, le genre Staphylococcus, le genre

Planococcus et le genre Stomatococcus ont été rapportés.

D'après les propriétés morphologiques (motilité) et les propriétés biochimiques (essai OF), la souche semble appartenir au genre Micrococcus, toutefois le GC % du genre Micrococcus est indiqué comme étant de 66 %,

différant de plus de 25 % de celui de la présente souche.

Comme la différence de GC % indique une grande distance dans un polymorphisme génétique et du point de vue phylogénétique, la présente souche ne peut pas appartenir au genre Micrococcus. Dans un organisme anaérobie éventuel, le genre Staphylococcus (généralement, essai OF: F, GC %: 30-40 %), un mutant qui présente une décomposition

par voie oxydante du sucre a été rapporté (Int. J. Syst.

Bacteriol., 26: 22-37, 1976). La présente souche B-0875 est identifiée comme appartenant au genre Staphylococcus sur la base de ses caractéristiques de GC % de 39 %, de faible formation d'acide dans des conditions anaérobies (fermentatives) pour culture de longue durée de plus de 3 semaines dans l'essai OF, c'est-à-dire résultat F dans l'essai OF, et pas de propriétés de développement dans un milieu de gélose FTO. (Se reporter à The Prokaryotes, Vol II, 1981). La présente souche est appelée Staphylococcus sp. B-0875 et la souche a été déposée au Fermentation -7Institute, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I., sous le numéro de dépôt FERM BP-385 conformément

au Traité de Budapest.

On peut obtenir la maltose déshydrogénase (accepteur) de la présente invention en cultivant le micro-organisme producteur de maltose déshydrogénase (accepteur) de la

présente invention dans un milieu classique pour la pro-

duction d'antibiotiques ou d'enzymes. La culture peut être effectuée dans un milieu solide ou liquide. Une culture immergée avec aération est préférable pour une production industrielle. Les sources nutritives pour le milieu sont

des milieux classiques pour la culture de microorganismes.

Les sources nutritives sont des sources d'azote assimi-

lables comme la liqueur de macération de mais, la peptone, la caséine, la poudre de soja, l'extrait de levures ou des extraits de viande. Les sources de carbone sont des sources de carbone assimilables comme la mélasse, la glucose, le glycérol, le sucrose ou la dextrine. Des sels inorganiques comme du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du sulfate de magnésium, du dihydrogénophosphate de potassium ou de l'hydrogénophosphate de potassium peuvent être ajoutés. La température de culture peut varier suivant le développement des microorganismes et la production de maltose déshydrogénase (accepteur) et est de préférence de 25-30 C. La durée de culture dépend des conditions et est

habituellement de 15-72 heures. La culture doit être ter-

minée au stade de production maximale de l'enzyme. La maltose déshydrogénase (accepteur) de la présente invention

est contenue dans les cellules obtenues par culture.

Un exemple de l'extraction d'enzyme est que des cellules obtenues par culture isolées humides sont traitées par la lysozyme dans un tampon trisHC1, avec sonication ou traitement à la presse française pour obtention d'une solution de maltose déshydrogénase (accepteur) brute. La solution d'enzyme brute est traitée par des techniques -8- connues d'isolement et de purification d'enzymes pour obtention de l'enzyme purifiée. On peut utiliser la précipitation par un solvant organique comme au moyen d'acétone, de méthanol ou d'éthanol, ou le relargage au moyen de sulfate d'ammonium, de chlorure de sodium ou de sulfate d'aluminium. On peut effectuer une purification

supplémentaire par chromatographie d'adsorption en uti-

lisant un échangeur d'ions comme la carboxyméthyl celluoose, un gel de carboxyméthyl-dextrane ou un gel de sulfopropyl-dextrane ou un agent de filtration du type gel comme du gel de dextrane ou du gel de polyacrylamide, avec lyophilisation pour obtenir la poudre de maltose

déshydrogénase (accepteur) purifiée.

On indique ci-dessous une méthode de détermination et les propriétés biochimiques de la maltose déshydrogénase (accepteur) ainsi obtenue: (1) Méthode de détermination: mM tampon phosphate (pH 7,5) 0,1 % albumine de sérum bovin 0,025 % bleu de nitrotétfazolium (NTB) 0,2 % Triton X-100 0, 001 % phénazine méthosulfate (PMS: accepteur d'hydrogène) 0,1 M maltose Le mélange réactionnel ci-dessus (1,0 ml) dans un petit tube à essai est mis en pré-incubation à 37 C. On y ajoute une solution d'enzyme (10 g1) et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On arrête la réaction en ajoutant 0,1 N HC1 (2,0 ml) et on mesure la densité optique à 550 nm (As). On ajoute de l'eau distillée (10 g1) comme

témoin et la quantité est mesurée à 550 nm (Ab).

Une unité est définie par la quantité d'enzyme qui oxyde (déshydrogène) 1 gmole de maltose en une minute et l'activité enzymatique est calculée par la relation suivante: -9- activité (unités/ml) (As - Ab) x 0 3,01 124x10 x 0,01 La réaction enzymatique ci-dessus peut être représentée comme suit: maltose + 2PMS -> maltoglucono-gamma-lactone + 2PMSH 2PMSH + NTB -> 2PMS + NTBH2 (formation de monomère de diformazan) (2) Spécificité du substrat: Le maltose dans la méthode de détermination ci-dessus est remplacé par les substrats indiqués dans le tableau 2 (chacun 0,1 M, 0,1 ml) et on effectue la détermination

selon la méthode ci-dessus.

Tableau 2

Substrat Activité relative (%) maltose 100 xylose 53,7: glucose 80,0 galactose 56,1 mannose 52,4 fructose 31,4 sucrose 0 lactose 58,2 raffinose 0 maltotriose 77,4 maltotétraose 60,3 maltopentaose 36,4 maltohexaose 28,6 maltoheptaose 22,4 dextrine (poids mol. plus de 1700) 11,0 inositol 0 sorbitol 0 glycérol 0 éthanol 0 Comme on le voit d'après le tableau 2, l'enzyme de la présente invention a une spécifité de substrat sur le maltose et aussi sur des oligosaccharides comme le glucose, -10- le maltotriose, le maltotétraose, le maltopentaose, le

maltohexaose, le maltoheptaose et la dextrine.

(3) Accepteur d'hydrogène (A): L'accepteur d'hydrogène (la co-enzyme) de la maltose déshydrogénase (accepteur) dans la réaction d'oxydation (déshydrogénation) du maltose est mesuré selon la méthode de détermination. Les résultats sont présentés dans le tableau 3. La maltose déshydrogénase (accepteur) de la

présente invention n'exige pas NAD ou NADP comme co-enzyme.

Une diminution de l'oxygène soluble est observée au moins

quand on utilise PMS, du méthosulfate de l-méthoxy-

phénazine (MPMS) ou du Bleu de Meldola comme accepteur d'hydrogène. De plus, le méthosulfate de 1-acétamide

phénazine et le 2,6-dichlorophénolindophénol et le phénol-

indophénol comme composés du groupe des phénolindophénols

peuvent aussi être un accepteur d'hydrogène.

La réaction peut être illustrée comme suit: maltose + 2PMS -maltogluconolactone + 2PMSH

2PMSH + 1/2 02 - 2 PMS + H20 (?)

De plus, la réaction suivante peut être estimée: maltose + nA --> maltogluconolactone + nAH (ou AHn)

Tableau 3

Accepteur d'hydrogène pH de activité consommation

réaction relative (%) de 2-

NAD 7,5 0 -

NADP " 0

PMS "g 100 +

MPMS " 30 +

Bleu de Meldola 7,5 20 +

Bleu de méthylène " 0 -

Ferricyanure " 0 -

NTB " 0 -

-11- (4) Action de l'enzyme: L'enzyme catalyse une réaction comme suit CH2OH CH9oOH H k- O 2 PMS H O

H OHQH

H OH 2 PMSH H OH

o R est un résidu de chaîne de saccharide ou de l'hydrogène. Comme représenté, l'enzyme catalyse une réaction de déshydrogénation dans laquelle l'extrémité réductible d'un substrat tel que du glucose ou un oligosaccharide est déshydrogénée en présence d'un accepteur d'hydrogène tel

que PMS pour former un substrat oxydé.

(5) pH optimal La solution tampon 20 mM phosphate (pH 7,5) dans la méthode de détermination ci-dessus est remplacée par d'autres solutions tampon et on mesure l'effet du pH sur l'enzyme. Les résultats sont représentés sur la figure 1, o o- : tampon phosphate 0,2 M (pH 6,4 - 8,4) , e-s: tampon Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8 - 8,7),

A-a: tampon glycine-NaOH (pH 8,0 - 9,4).

(6) Température optimale: Un mélange réactionnel (1 ml) comme dans la méthode

de détermination ci-dessus est chauffé à diverses tempé-

ratures dans l'intervalle 25-50 C pendant 3 minutes. On y ajoute une solution d'enzyme (0,2 U/ml, 0,02 ml) et le mélange est mis à incuber à la température en question pendant 10 minutes. On ajoute 0,1 N HC1 (2,0 ml) pour arrêter la réaction de l'enzyme, et ensuite la quantité

accrue de PMSH2 est mesurée par densité optique à 550 nm.

Les résultats sont représentés sur la figure 2. La tempé-

rature optimale pour la maltose déshydrogénase (accepteur) -12-

de la présente invention est d'environ 35 C.

(7) Stabilité au pH: Un mélange de solution d'enzyme (10 U/ml, 0,1 ml), d'un certain nombre de solutions tampon (0,1 ml, chacune à un pH différent) et d'eau distillée (0,8 ml) est mis en pré-incubation à 37 C pendant 60 minutes. Le mélange de réaction est immédiatement refroidi dans de l'eau glacée et on détermine l'activité de l'enzyme selon la méthode de détermination ci-dessus. Les résultats sont représentés sur la figure 3. Sur la figure, o-o: tampon Tris-HCl (pH 6,6 - 8,3), e-e: tampon glycine-NaOH (pH 8,1 - 9,2), A: tampon TES (pH 7,0) et A: tampon BES (pH 7,0). La meilleure stabilité au pH de la maltose déshydrogénase (accepteur) de la présente invention se trouve à un pH de 7,5 - 8,5 à 37 C pour un traitement de 60 minutes, avec

stabilisation par le tampon de Good.

(8) Stabilité à la chaleur: Un mélange de solution d'enzyme (10 U/ml, 0,1 ml), de tampon 0,2 M BES (pH 7,0, 0,1 ml) et d'eau distillée (0,8 ml) est mis en pré-incubation à diverses températures dans l'intervalle de 3060 C pendant 10 minutes. Après le traitement, le mélange de réaction est refroidi dans de l'eau glacée et ensuite l'activité enzymatique du mélange

est déterminée selon la méthode de détermination ci-dessus.

Les résultats sont représentés sur la figure 4. La maltose déshydrogénase (accepteur) de la présente invention a une une stabilité à la chaleur audessous de 40 C au pH 7,5

pour un traitement de 10 minutes.

(9) Poids moléculaire: 80 000 10 000 (méthode de filtration sur gel en

utilisant Sephacryl S-200 (marque de fabrique).

(10) Point iso-électrique: pH 9,5 environ (électrophorèse utilisant un ampholyte

comme véhicule).

-13- (1) Valeur de Km: La relation entre la concentration du substrat (maltose; mélange alpha et bêta) et la vitesse de

réaction est représentée sur la figure 5. Dans les con-

ditions expérimentales, on ne peut pas déterminer Vmax et

on ne peut pas obtenir de courbe linéaire de Lineweaver-

Burk. La valeur correcte de Km ne peut donc pas être

déterminée, et la valeur approximative de Km est cal-

culée d'après la figure 5 comme étant environ 3,8 mM, et la

valeur de Km pour le bêta-maltose est de 1,36 mM.

(12) Effet d'ions métalliques, de EDTA et de KCN: Des ions métalliques, EDTA ou KCN comme indiqué dans le tableau 4 sont ajoutés au mélange réactionnel comme dans la méthode de détermination, et on mesure leur effet. Les

résultats sont présentés dans le tableau 4.

Tableau 4

Additifs Activité Additifs Activité relative (%) relative (%) pas d'addition 100 1,0 mM CoCl2 17,9 1,0 mM LiCl 95 1,0 mM ZnCl2 4,5 1,0 mM CaC12 101 1,0 mM CuCl2 0 1,0 mM MgCl2 106 1,0 mM NaN3 95 1,0 mM BaCl2 61, 2 1,0 mM KCN 95 1,0 mM MnCl2 13,4 5,0 mM EDTA 73 (13) Effet des agents tensio-actifs: Un agent tensio-actif comme indiqué dans le tableau 5 est ajouté au mélange réactionnel comme dans la méthode de détermination à la place de 0,2 % de Triton X-100, et on

mesure l'activité enzymatique. Les résultats sont pré-

sentés dans le tableau 5.

-14-

Tableau 5

Agent tensio-actif Concen- Activité tration (%) relative (%) pas d'addition - 100 cation P C - 8 0,1 107

" F B " 96

" D T -2 0 5 " 111

sarcosinate P N " 114 laurylbenzène sulfate de sodium " 0,2

S D S " 3,8

briggi 3 5 " 106 Tween- 8 0 " 104 Nikkol - O P - 1 0 " 104 span- 8 5 " 103 adekatol-S O - 1 4 5 " 103

" S O - 1 2 0 " 120

Triton X - 1 0 0 " 115 cholate de sodium " 86 chlorure de cétyl triméthyl ammonium " 94 La nouvelle maltose déshydrogénase (accepteur) de la présente invention peut être utilisée pour divers types de déterminations sur la base de la spécifité pour les substrats et de son action enzymatique. Par exemple,

dans une détermination d'activité d'amylase, l'oligo-

saccharide produit à partir d'amidon par une action d'amy-

lase est traité par la présente maltose déshydrogénase (accepteur) en présence d'un accepteur d'hydrogène tel que PMS, et le PMS réduit ainsi produit est mesuré directement ou on mesure colorimétriquement le pigment formazan formé

après la réaction avec un sel de tétrazolium. En consé-

quence, l'enzyme de la présente invention est utile comme

enzyme pour diagnostic clinique.

De plus, la présente invention comprend une détermi-

nation quantitative de saccharides tels que le glucose et le maltose et une méthode de détermination d'activité -15- enzymatique comme d'alphaamylase et de bêta-amylase et de gluco-amylase dans un échantillon tel que de sérum, de salive et d'urine en utilisant la présente maltose déshydrogénase (accepteur), qui comprend la décomposition du substrat tel qu'un polymère de glucose ayant un résidu de glucose terminal réductible modifié ou un polymère cyclique de glucose, par l'action de la nouvelle maltose déshydrogénase (accepteur) et la mesure quantitative du

substrat décomposé.

Les méthodes de détermination d'activité d'amylase connues jusqu'à présent sont basées sur le fait qu'un substrat polymère de glucose comme l'amidon est hydrolysé par action de l'amylase pour former du glucose, du maltose ou des oligosaccharides. Des exemples sont des méthodes de détermination comprenant la mesure de la diminution de la

viscosité de l'amidon par action de l'amylase; l'iodo-

métrie; la réaction du glucose avec la glucose oxydase ou la glucose déshydrogénase et NAD (NADP), o du glucose est formé par action de l'alpha-glucosidase sur le maltose qui est produit par action de l'amylase sur l'amidon; et la méthode à l'amidon bleu ou la méthode à la maltose phosphorylase comprenant la mesure colorimétrique du pigment soluble produit par action de l'amylase sur l'amidon lié au pigment insoluble (Publication de

brevet japonais N 55-27800).

Parmi les autres méthodes, par exemple une méthode de détermination, qui comprend l'hydrolyse d'un substrat tel

que le p-nitrophénylmaltopentaoside, le p-nitrophényl-

maltohexaoside ou le p-nitrophénylmaltoheptaoside par une action d'amylase, le traitement du p-nitrophénylmaltotriose ou du pnitrophénylmaltoside produit par l'alpha-glycosidase ou la bêtaglycosidase et la mesure colorimétrique du

p-nitrophénol libéré, est connue.

Ces méthodes antérieures ont un certain nombre d'incon-

vénients, par exemple: variabilité de l'hydrolyse causée -16- par le réactif utilisé et les conditions de réaction imposées, et l'action inhibitrice du glucose et du maltose coexistants. De plus, dans la méthode à l'amidon

bleu, une opération compliquée de séparation par centri-

fugation est nécessaire, qui empêche l'automatisation, et dans la méthode à la maltose phosphorylase, les quatre étapes de traitement par enzyme qui sont nécessaires et

qui rendent les opérations coûteuses et difficiles.

Ces méthodes de détermination antérieures ont en outre un certain nombre d'inconvénients; par exemple, une quantité de substrat hydrolysé par une action d'amylase ou de glycosidase ne peut pas être mesurée correctement et est seulement-en relations proportionnelles. Toutefois, ces méthodes de la technique antérieure ont été utilisées parce qu'il n'y avait pas de méthodes de détermination pratiques. On a trouvé que l'activité d'enzyme libératrice de saccharide peut être déterminée avec simplicité et une bonne précision si le groupe terminal réductible d'un polymère de glucose ayant un résidu de glucose terminal réductible est estérifié, éthérifié ou oxydé afin de former un groupe terminal réductible modifié qui ne peut pas être un substrat pour la maltose déshydrogénase (accepteur). Le polymère de glucose ayant un résidu de glucose terminal réductible modifié ainsi produit est ensuite soumis à un

substrat pour détermination de l'activité d'enzyme libé-

ratrice de saccharide.

De plus, on a trouvé que cette enzyme peut être déter-

minée avantageusement si le polymère de glucose ayant un résidu de glucose terminal réductible modifié est remplacé

par un polymère cyclique de glucose.

Des avantages supplémentaires peuvent être obtenus si le substrat décomposé produit dans la réaction enzymatique est déshydrogéné par la maltose déshydrogénase (accepteur) avec un accepteur d'hydrogène, et la maltose déshydrogénase -17- (accepteur) réduite ainsi produite est mesurée directement ou est mesurée indirectement par un réactif colorant à transport d'hydrogène dans une forme réduite, ou on mesure

une quantité réduite d'oxygène.

De plus, dans la présente invention, quand on

utilise un substrat ayant un assez bas degré de polyméri-

sation de saccharide tel qu'un degré de polymérisation de 4 - 8, le résultat précis peut être obtenu sous la forme

d'un signal unique en une seule action.

De plus, on a trouvé qu'une activité enzymatique de

glycosidase comme d'amylase, de glycosidase, de gluco-

amylase, de phosphatase ou d'estêrase dans un échantillon comme de sérum, de salive ou d'urine peut être déterminée avantageusement sans effet nuisible d'un sucre coexistant

comme du glucose dans un échantillon, en traitant préala-

blement ou simultanément l'échantillon par l'hexose oxydase, de préférence la glucose oxydase et la catalase, ou par traitement par l'hexokinase en présence de Mg++ et de ATP, ou par traitement préalable par la maltose déshydrogénase (accepteur) en présence d'oxygène et d'un

accepteur d'hydrogène.

C'est donc un but de la présente invention de fournir une méthode de détermination de saccharide et d'activité d'enzyme libératrice de saccharide, dans laquelle un substrat est traité par la maltose déshydrogénase (accepteur) en présence d'un accepteur d'hydrogène, et on mesure la

quantité ainsi révélée de changements détectables.

Un autre but de la présente invention est de fournir une méthode de détermination de saccharide, ou une méthode de détermination d'enzyme libératrice de saccharide comme

l'amylase et la glycosidase.

Des exemples de substrats utiles dans la présente invention sont des polymères de glucose ayant des résidus

de glucose terminaux réductibles modifiés, des oligo-

saccharides ayant une chaîne de sucre terminale réductible -18- qui n'est pas hydrolysée par la maltose déshydrogénase (accepteur) ou des polymères cycliques de glucose, de préférence d'un degré de polymérisation audessus de 1,

en particulier au-dessus de 4.

Des exemples de polymères de glucose ayant des résidus de glucoseterminaux réductibles modifiés sont le maltotétraose, le maltopentaose, le maltohexaose, le maltoheptaose, l'amylose, l'amylopectine, l'amidon ou des hydrolysats d'amidon comme l'amidon soluble (appelé dextrine) dans lequel le résidu de glucose terminal

réductible du polymère de glucose est modifié.

Le résidu de glucose terminal réductible modifié de la présente invention est un résidu ne possédant pas d'activité réductible, ou un substrat ne convenant pas pour

la maltose déshydrogénase (accepteur).

Des exemples sont des groupes terminaux réductibles

éthérifiés ou estérifiés produits par des méthodes clas-

siques, ou une extrémité réductible combinée avec du fructose, de l'isonisol ou du sorbitol, ou des résidus d'acide gluconique de résidu de glucose oxydé ou leurs

dérivés estérifiés.

Des exemples de ces modifications sont les suivants: Une solution de polysaccharides comme d'amidon soluble

ou de dextrine est mise à réagir avec de l'acide chlorhy-

drique méthanolique à 4 % à 70 C pendant 4 heures, neutra-

lisée, et une fraction ayant divers degrés de polyméri-

sation est recueillie par chromatographie sur colonne de

filtration sur gel de façon qu'on obtienne un oligo-

* saccharide éthérifié par l'oxyde de méthyle. L'amidon soluble est ajouté à de l'anhydride acétique (3,5 ml) dans de la pyridine anhydre et on laisse réagir à 0 C toute une nuit. On provoque ensuite une précipitation en ajoutant de l'acétone, et on recueille une fraction ayant divers degrés de polymérisation au moyen d'une chromatographie sur

colonne de filtration sut gel, pour obtenir un oligo-

saccharide acétylé.

-19- 2555197

De l'amidon soluble dans de la liqueur de Fehling est mis à bouillir pendant 5 minutes à 20 heures, concentré, on élimine les matières insolubles après addition de méthanol et on recueille la fraction ayant divers degrés de polymérisation pour obtenir un composé dans lequel les résidus de glucose terminaux réductibles sont oxydés en résidus d'acide gluconique qui peuvent être éventuellement estérifiés. Ou le groupe carboxyle dans le résidu d'acide gluconique est réduit pour donner un

groupe terminal réduit du type alcool.

Ces modifications de résidus de glucose ne sont pas limitées à ce qui est dit ci-dessus, mais peuvent être effectuées par d'autres méthodes classiques. Par exemple, l'éthérification méthyle peut être remplacée par une alcoylation inférieure comme une éthérification éthyle ou une éthérification isopropyle ou une éthérification phényle substitué telle qu'une éthérification phényle, une

éthérification p-nitrophényle, une éthérification 2,4-

dinitrophényle, une éthérification p-aminophényle, une

éthérification 2,6-dibromo-4-aminophényle ouune éthé-

rification 2,4-dichlorophényle; ou l'acétylation peut être remplacée par une propionylation, une phosphorylation ou une estérification en C5_20; ou des résidus d'acide gluconique peuvent être remplacés par des anhydrides tels

que ceux du type gluconolactone. La synthèse de ces poly-

mères de glucose est rapportée, par exemple, dans les brevets des E.U.A. N 4 145 527 et 4 147 860, dans les publications de brevet japonais non examinées N 54-51892 et 57-68798. Le degré de polymérisation du glucose n'est pas nécessairement limité à un degré de polymérisation

uniforme, mais peut comprendre divers degrés de polyméri-

sation. Des exemples de polymères cycliques de glucose sont des dextrines avec plus de six mailles de glucose obtenues à partir d'amidons comme l'alpha-, la bêta-, la gamma-, la

delta- ou l'epsilon-cyclodextrine.

-20- Des exemples d'enzymes qui libèrent un saccharide

autres qu'une glycosidase comme l'amylase sont des phospha-

phatases et des estérases. Des exemples de substrats pour des phosphatases comme la phosphatase alcaline, la glucose-6-phosphatase, la glucose-l-phosphatase ou la

fructose-l,6-diphosphatase sont des saccharides phospho-

rylés comme le glucose-l-phosphate, le glucose-l,6-

diphosphate ou le fructose-l,6-diphosphate. Ces enzymes

peuvent être utilisées pour la détermination d'une oxydo-

réductase qui agit sur le saccharide phosphorylé, par

exemple pour déterminer l'activité de glucose déshydrogé-

nase en mesurant le glucose-6-phosphate restant dans une réaction enzymatique de glucose-6-phosphate déshydrogénase avec un substrat glucose-6-phosphate. De plus, ces enzymes peuvent être utilisées pour la détermination de l'activité de kinase lors de la synthèse enzymatique d'un saccharide phosphorylé en présence d'ATP. Des exemples de substrats utilisés pour détermination d'activité d'estérase sont des dérivés Cs 20acyle de saccharides. Ces substrats sont hydrolysés par une enzyme libératrice de saccharide, par exemple une glycosidase comme l'amylase, la phosphatase et l'estérase dans un échantillon à 37 C tamponné à unpH 6- 8 pour former des substrats décomposés comme du glucose,

du maltose ou d'autres oligosaccharides comme du malto-

triose, du maltotétraose, du maltopentaose ou du malto-

hexaose. La durée d'incubation peut être un temps suffisant pour la libération de saccharide à partir du substrat et est habituellement de plus d'une minute. L'activité d'une - enzyme libératrice de saccharide comme la glycosidase, une enzyme hydrolysant la liaison glycoside dans le sucre, peut être déterminée en mesurant le substrat décomposé. On peut conduire la réaction en mettant à incuber le substrat décomposé avec la maltose déshydrogénase (accepteur) et un accepteur d'hydrogène à 370C pendant plus de 30 secondes,

de préférence pendant 1 - 60 minutes.

-21- Une détermination quantitative de saccharide dans un échantillon peut être effectuée en remplaçant le substrat décomposé ci-dessus par un saccharide comme du xylose, du glucose, du galactose, du maltose, du fructose, du mannose, du lactose, du maltotriose, du maltotétraose, du malto-

pentaose, du maltohexaose ou du maltoheptaose.

Comme illustré ci-dessus, le substrat décomposé par l'action d'une enzyme libératrice de saccharide, par

exemple une glycosidase comme l'alpha-amylase, la bêta-

amylase, l'alpha-glucosidase ou une gluco-amylase, phospha-

tase ou estérase, ou le saccharide à déterminer est traité par la maltose déshydrogénase en présence d'un accepteur

d'hydrogène tel que PMS, MPMS, le méthosulfate de 1-acéta-

mide-phénazine, le Bleu de Meldola et le 2,6-dichlorophénol indophénol pour produire un accepteur d'hydrogène dans une

forme réduite.

La quantité d'accepteur d'hydrogène est en excès de 0,05 à 10 fois par rapport à la quantité de substrat décomposé ou de saccharide à déterminer. On peut mesurer l'accepteur d'hydrogène dans une forme réduite, dans les

conditions d'une quantité d'accepteur d'hydrogène infé-

rieure à une quantité équimolaire, au moyen d'un système

de réaction avec recyclage dans lequel l'accepteur d'hydro-

gène dans une forme réduite est régénéré en accepteur

d'hydrogène avec utilisation d'un agent de réaction trans-

porteur d'hydrogène dans une forme réduite ou d'oxygène.

Une quantité préférable de maltose déshydrogénase

(accepteur) est généralement de 0,01 - 100 U dans un essai.

Ensuite, on mesure des changements détectables, par

exemple on détermine quantitativement l'accepteur d'hydro-

gène dans une forme réduite ainsi produit, que l'on fait de préférence réagir avec l'agent de réaction transporteur d'hydrogène du système dans une forme réduite pour produire

des changements du facteur d'absorption.

Des exemples d'agent de réaction transporteur d'hydro-

gène dans une forme réduite sont, par exemple, un sel de -22-

tétrazolium comme le chlorure de 3-(p-iodophényl)-2-(p-

nitrophényl-5-phényl-2H.tétrazolium, le bromure de 3-(4,5-

diméthyl-2,4-azolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium, le 3,3'-

(4,4'-biphénylène)-bis(chlorure de 2,5-diphényl-2H-tétra-

zolium), le 3,3'-(3,3'-diméthoxy-4,4'-biphénylène)-bis- Lchlorure de 2(pr-nitrophényl)-5-phényl-2H-tétrazolium7

(Bleu de nitrotétrazolium) ou le 3,3'-(3,3'-diméthoxy-4,4'-

biphénylène)-bis(chlorure de 2,5-diphényl-2H'tétrazolium),

le 2,6-dichlorophénolindophénol ou le bleu de méthylène.

Ces agents de réaction transporteurs d'hydrogène dans une forme réduite peuvent être ajoutés en quantité équimolaire ou en excès par rapportd l'accepteur d'hydrogène dans une forme réduite produit. On peut déterminer cette quantité en fonction du temps nécessaire comprenant celui de la réaction de recyclage pour l'accepteur d'hydrogène et le temps de réaction, et c'est de préférence de 10 à 1000

fois la quantité équimolaire.

Le produit de réaction résultant est mesuré colorimé-

triquement. On en variante:laccepteur d'hydrogène dans une forme réduite est mis à réagir avec de l'oxygène dissous et la quantité d'oxygène consommée peut être mesurée par

une électrode à oxygène.

Un échantillon comme d'urine, de salive ou de sang est de préférence prétraité par une hexose oxydase comme la glucose oxydase et la catalase, ou par une kinase telle que l'hexokinase, Mg++ et ATP de façon à éviter un effet nuisible du glucose pour une erreur dans la mesure. Ce prétraitement peut être effectué en même temps que la réaction avec la glycosidase et le substrat. On peut

éliminer le glucose présent dans l'échantillon par trai-

tement préalable par la maltose déshydrogénase (accepteur) et un accepteur d'hydrogène en présence d'oxygène dissous

ou en faisant barboter de l'oxygène ou de l'air.

Les exemples suivants illustrent la présente invention, mais ne doivent pas être considérés comme la limitant. -23-

Exemple 1

A partir d'une culture inclinée sur gélose au bouillon de Staphylococcus sp. B-0875 FERM BP-385, la quantité prélevée par une boucle de platine est inoculée à un milieu aqueux (100 ml) comprenant 1,0 % de peptone, 1!0 % d'extrait de bonite et 0,3 % de NaC1 (stérilisé à 120 C pendant 20 minutes, pH 7,2) dans un erlenmeyer de 500 ml, et la culture est conduite avec secousses à 28 C pendant 24 heures. La culture d'ensemencement ainsi préparée est

transférée dans un autre milieu aqueux (20 litres) com-

prenant 1 % de peptone, 0,1 % de K2HPO4, 0,3 % de NaCl, 0,1 % de MgSO4 7H20, 0,1 % de silicon SA G-471 (marque de fabrique, additif antimousse) (préalablement stérilisé à

C pendant 20 minutes, pH 7,2) dans un fermenteur cylin-

drique (cuve) de 30 litres et on opère dans des con-

ditions de culture immergée à 30 C pendant 18 heures, 300 tpm, aération de 20 litres par minute. Les cellules

produites par la culture sont recueillies par centrifu-

gation à 5000 tpm pendant 10 minutes. Les cellules humides sont traitées par une solution de 0,1 % de lysozyme et mM EDTA dans un tampon phosphate (pH 7,0, 1,5 litre) à

37 C pendant 60 minutes. La solution de cellules solubi-

lisées est centrifugée (5000 tpm, 10 min.) pour séparation du liquide surnageant (11,8 U/ml, 3,2 litres). A la solution surnageante, on ajoute du sulfate d'ammonium jusqu'à saturation à 28 %, on centrifuge (5000 tpm, 20 min.) et on recueille la solution surnageante. On ajoute encore du sulfate d'ammonium à la solution surnageante jusqu'à

saturation à 72 %. Le précipité est recueilli par centri-

fugation (5000 tpm, 20 min.) et dissous dans du tampon phosphate 20 mM (pH 7,0, 220 ml) et on centrifuge (15 000 tpm, 10 min.) pour obtenir la solution surnageante (200 ml, 123,5 U/ml). La solution surnageante est dialysée et chargée sur une colonne de CM-Sepharose CL-6B (volume de lit 80 ml) et éluée avec une élution à gradient de KC1 0 - 0,5 M de -24- façon qu'on obtienne une fraction contenant de la maltose déshydrogénase (accepteur). La fraction est concentrée par membrane à ultrafiltration XM30 (6 ml), purifiée par chromatographie sur une colonne de Sephacryl S200, et dépouillée de sel à travers une colonne de Sephadex G-25. L'éluat dans une solution à 1 % de sucrose est lyophilisé pour donner la maltose déshydrogénase (accepteur) purifiée

(160 mg, 38 U/mg).

Exemple 2

Tampon Tris-HCl 80 mM, pH 7,0 0,1 % d'albumine de sérum bovin 0,05 % de Bleu de nitrotétrazolium (NTB) 0,2 % de Triton X-100 maltose déshydrogénase (accepteur) (10 U/ml) On ajoute du glucose, du maltose, du maltotriose, du maltotétraose, du maltopentaose ou du maltohexaose (20 il, concentration finale 0,05 - 0,25 % (poids/volume)) au mélange réactionnel ci-dessus dans un petit tube à essai et on fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. Après la réaction, on ajoute 0,1 N HC1 (2 ml) et on mesure le

mélange à 550 nm par colorimétrie.

Les résultats sont représentés sur la figure 6, o on obtient une bonne linéarité. Sur la figure: *-*, glucose; o-o, maltose; O-e, maltotriose, A&, maltotétraose,

A-A, maltopentaose, Q-D, maltohexaose.

Exemple 3

Le mélange réactionnel (chaque fois 1 ml), dans lequel

on a ajouté 5 mM p-nitrophénylpentaoside ou p-nitrophényl-

heptaoside au même mélange réactionnel que décrit dans

l'exemple 2, dans un petit tube à essai, est mis en pré-

incubation à 37 C. On y ajoute de la salive diluée 500 fois (un échantillon contenant de l'amylase, 20 4l) et on fait

incuber pendant 5, 10 et 15 minutes, respectivement.

Les résultats sont représentés sur la figure 7, o une bonne quantitativité a été obtenue. On a obtenu une activité -25- trois fois plus forte pour le p-nitrophénylheptaoside que pour le pnitrophénylpentaoside. On ne peut pas observer de

temps de retard net. Sur la figure: o-o, p-nitrophényl-

maltoheptaose; *--, p-nitrophénylmaltopentaose.

Exemple 4

Le mélange réactionnel (chaque fois 1,0 ml), dans

lequel on a ajouté 5 mM p-nitrophénylheptaoside, méthyl-

heptaoside ou delta-gluconolactone heptaoside au même mélange réactionnel que décrit dans l'exemple 2, dans un petit tube à essai, a été mis en préincubation à 37 C. On y a ajouté de l'urine humaine (20 Al) et on a fait incuber

pendant 5, 10 ou 15 minutes, respectivement.

Les résultats sont représentés sur la figure 8, o une bonne quantitativité a été obtenue. Sur la-figure:

o-o, p-nitrophénylmaltoheptaose; o-, lméthylmalto-

heptaose; A-A, delta-gluconolactone maltoheptaose.

Exemple 5

Tampon phosphate 50 mM, pH 7,5 0,1 % d'albumine de sérum 0,2 % de Triton X-100 1 % d'alpha-cyclodextrine 0,05 % de NTE 0,2 mM PMZ 2 mM MgCl2 hexokinase (25 U/ml) 2 mM ATP maltose déshydrogénase (accepteur) (10 U/ml) mM p-nitrophényl maltoheptaose. Le mélange réactionnel ci-dessus (1,0 ml) a été placé dans une cuvette pour spectrophotomètre. On y a ajouté du sérum humain (20 41, échantillon contenant de l'amylase, dilution 1/1, 3/4, 1/2, 1/4) et on a fait incuber à 37 C et les changements dans la densité optique ont été mesurés de

manière continue à 550 nm.

Les résultats sont représentés sur la figure 7. Les -26- changements de facteur d'absorption en 2 minutes (de 5 à 7 minutes) sont représentés sur la figure 10 o la dilution du sérum est en proportion inverse du facteur

d'absorption dans la densité optique.

Sur la figure 9: 1, sans hexokinase; 2, 3, 4 et 5,

dilution du sérum, 1/1, 3/4, 2/4 et 1/4, respectivement.

Trait plein (la - 5a), pas d'addition de p-nitrophényl-

maltoheptaose. Ligne formée de tirets (lb - 5b), addition

de p-nitrophényl maltoheptaose.

Exemple 6

Mélange réactionnel I: Tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 Glucose oxydase (100 U/ml) Catalase (1500 U pl) Mélange réactionnel II: mM p-nitrophényl heptaoside ajouté au mélange

réactionnel décrit dans l'exemple 2.

On a ajouté du sérum (20 il) au mélange réactionnel I (0,2 ml) dans une cuvette de spectrophotomètre et on a fait incuber le mélange à 37 C pendant 5 minutes. On a enregistré de manière continue les changements de facteur d'absorption en densité optique. Les résultats sont représentés sur la figure 11(2). La glucose oxydase a été enlevée du système

réactionnel comme expérience témoin, et cela est repré-

senté sur la figure 11 (1).

Exemple 7

Tampon BES 40 mM, pH 7,0

0,02 % PMS

mM p-nitrophényl heptaoside Le mélange à réaction ci-dessus (1,0 ml) a été chargé dans un récipient à réaction équipé d'un électrode à oxygène et soumis à une pré-incubation à 37 C. On y a ajouté de l'urine humaine diluée (1/8, 3/4, 1/2, 3/4, 1/1)

et on a mesuré l'activité d'amylase dans l'utine. Les ré-

sultats sont représentés sur la figure 2, o on a obtenu de

bons résultats quantitatifs.

-27-

Exemple 8

On a ajouté du p-nitrophényl heptaoside dans le

mélange réactionnel décrit dans l'exemple 2 à une concen-

tration de 5 mM. La solution (20 g!) a été placée dans un récipient plat. On y a plongé du sérum traité par électron phorèes sur une plaque d'agarose, on a coloré la fraction active à la température ambiante pendant 30 minutes et on a arrêté la réaction en plongeant la plaque dans 0,1 N HCl. Le résultat est représenté sur la figure 13, o l'activité d'amylase peut être colorée de manière simple et la bande colorée se révèle nette et exempte de diffusion.

Exemple 9

Une extrémité réductible méthylée de dextrine (fraction de poids moléculaire de plus de 1000) de fractosyl-maltoheptaoside (G7-fructose) a été ajoutée dans _ le mélange réactionnel décrit dans l'exemple 2 à une

concentration de 1 %.

De l'alpha-amylase (suc pancréatique humain dilué, 0, 5, 10, 20, 30, 40 et 50 il, respectivement) a été ajouté au mélange réactionnel ci-dessus (10 ml) dans un petit tube à essai et le mélange a été mis à incuber à 37 C pendant minutes. On a arrêté la réaction en ajoutant 0,1 N HC!

(2 ml) et on a effectué une mesure colorimétrique à 550 nm.

On a remplacé la dextrine méthylée par du phényl-

alpha-D-glucopyranoside (2 mM) et après addition d'alpha-

glucosidase (provenant de levure, SIGMA CHEM), on a con-

tinué la même opération. On a obtenu une bonne relation

linéaire entre la quantité d'enzyme et le facteur d'ab-

sorption en densité optique (figure 14). Sur la figure:

o-o, G7-fructose; A-A, dextrine méthylée; -a, phényl-

alpha-D-glucopyranoside.

Exemple 10

Dans l'exemple 2, la solution tampon dans le mélange réactionnel et le substrat ont été remplacés par -28-

du tampon Tris-HC1 50 mM (pH 9,0) et 2 mM glucose-6-

phosphate, respectivement. Le mélange réactionnel (1,0 ml) dans un petit tube à essai a été mis en pré-incubation à 37 C. On y a ajouté une solution de phosphatase alcaline (10 il, E. coli) et on a fait incuber à 37 C pendant 10 minutes. On a arrêté la réaction en ajoutant 0,1 N HCl (2, 0 ml) et on a effectué une mesure colorimétrique à 550 nm. Les résultats sont représentés sur la figure 15,

o on a obtenu une bonne linéarité.

Exemple 11

Mélange réactionnel I: Tampon Tris-HC1 50 mM, pH 7,0 0,2 mM PMS maltosé déshydrogénase (accepteur) (13 U/ml) 2 mM CaCl2 Mélange réactionnel II: Tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7,0 2 mM NTB ,0 mM p-nitrophényl heptaoside 2 mM CaC12 Le mélange réactionnel I (0,5 ml) dans une cellule

de spectrophotomètre a été mis en pré-incubation à 30 C.

On y a ajouté du sérum humain ou de l'urine (20 il) et on a fait incuber à 37 C pendant 5 minutes. On y a ajouté le mélange réactionnel II, après pré-incubation à 37 C (1,5 mm) et les changements de facteur d'absorption à 550 nm ont

été mesurés de manière continue à 37 C.

On a préparé une solution témoin comme suit.

Le mélange réactionnel I (0,5 ml) et le mélange

réactionnel II (1,5 ml) ont été mélangés après la pre-

mière étape, mis en pré-incubation à 37 C, on a ajouté du

sérum ou de l'urine (20 il) et on a fait incuber à 37 C.

Les résultats sont représentés sur la figure 16, o on voit qu'une solution prétraitée par le mélange réactionnel

I supprime un effet de saccharides existant antérieurement.

-29- Sur la figure: *-e, sérum témoin; o-o, sérum prétraité;

A-&, urine témoin; A-A, urine prétraitée.

Exemple 12

Mélange réactionnel I: Tampon phosphate 40 mM, pH 7,0 33 mM ATP 0,002 % accepteur d'hydrogène 4,17 mM MgCl2 maltose déshydrogénase (accepteur) (16,7 U/ml) hexokinase (11,7 U/ml) Mélange réactionnel II: 12,6 mM CaC12 , 0 mM EDTA

0,013 % NTB

0,5 % Triton X-100 2,5 % dextrine réduite

On a ajouté du sérum humain (20 1) au mélange réac-

tionnel ci-dessus (l'accepteur d'hydrogène est indiqué dans le tableau 6), et on a fait incuber à 37 C pendant 5 minutes. On a ajouté le mélange réactionnel II (0,4 ml) et on a fait incuber à 37 C. On a mesuré les changements de facteur d'absorption à 550 nm. Les résultats sont présentés dans le tableau 6, o l'amylase du sérum peut être mesurée

sans différence d'accepteur d'hydrogène.

Tableau 6 Accepteur d'hydrogène Activité relative __ __ __ __ __ __ d'amylase

PMS 100 %

MPMS 102 %

méthosulfate de 1-acétamidephénazine 103 % Bleu de Meldola 97,4 % -30-

Exemple 13

Mélange réactionnel: Tampon phosphate 40 mM mM ATP 2,5 mM MgC12 hexokinase (5 U/ml) maltose déshydrogénase (accepteur; 10 U/ml) 2 % dextrine réduite 0,2 mM 2,6-dichlorophénolindophénol Le mélange réactionnel ci-dessus (1,0 ml) dans des

cellules de spectrophotomètre a été mis en pré-

incubation à 37 C. On y a ajouté du sérum humain (5, 10, , 30 et 50 1l) et on a fait incuber à 37 C pendant 5 minutes. Apres achèvement de la réduction, on a mesuré de manière continue les changements de facteur d'absorption à 600 nM. Les résultats sont représentés sur la figure 17,

o une bonne quantitativité a été obtenue.

4. Brève explication des dessins: Fig. 1: pH optimal de la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 2: température optimale de la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 3: stabilité au pH de la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 4: stabilité à la chaleur de la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 5: effet de la concentration du substrat de maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 6: résultats de détermination quantitative de mono- et d'oligosaccharide en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 7; résultats de détermination d'activité d'amylase salivaire en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) 31- Fig. 8: résultats de détermination d'amylase d'urine en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 9 et 10: résultats de détermination d'amylase de sérum en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 11: résultats de détermination d'amylase de sérum en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 12: résultats de détermination d'amylase d'urine en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 13: diagramme électrophorétique d'activité d'amylase de sérum en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 14: résultats de détermination d'amylase en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) ou l'alpha-glucosidase Fig. 15: résultats de détermination de phosphatase alcaline en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 16: résultats de détermination d'amylase de sérum humain ou d'urine en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) Fig. 17: résultat de détermination d'amylase de sérum humain en utilisant la maltose déshydrogénase (accepteur) -32-

Claims

REVENDICATIONS

1. Une enzyme qui agit sur une extrémité réductible de monosaccharide ou d'oligosaccharide sans exiger de NAD ou de NADP et qui catalyse une réaction suivante:

CH20H CH20H

H R-O H i+ A R-A O - O-+ O iAH ou AHn HH OH Ho0 o R est un résidu de chaine de saccharide ou de l'hydro- gène, A est un accepteur d'hydrogène à l'exception de NAD ou NADP, AH ou AHn est un accepteur dans une forme réduite

et n est un nombre entier choisi parmi 1 et 2.

2. Une enzyme selon la revendication 1, dont le substrat est au moins du maltose, du D-glucose, du xylose, du mannose, du galactose, du fructose, du lactose, du maltotriose, du maltotétraose, du maltopentaose, du

maltohexaose ou du maltoheptaose.

3. Une enzyme selon la revendication l,dans laquelle l'accepteur d'hydrogène est au moins du méthosulfate de phénazine, du méthosulfate de l-méthoxy-phénazine, du Bleu de Meldola, du 2,6-dichlorophénolindophénol ou du phénolindophénol.

4. Une enzyme selon la revendication 1, qui est de

la maltose déshydrogénase.

5. Une enzyme selon la revendication 1, qui a les propriétés physicochimiques et biologiques suivantes: - poids moléculaire: 80 000 + 10 000 (mesurée par la méthode de filtration sur gel en utilisant Sephacryl S200) - point iso-électrique, pH 9,5 environ - valeur de Km: environ 3,8 mM (pour le maltose) - température optimale: environ 35 C -33- - stabilité au pH: stable à des pH d'environ 7,5-8,5 - stabilité à la chaleur: stable au dessous d'environ 40 C

6. Un procédé pour la production de maltose déshydro-

génase qui agit sur une extrémité réductible de mono- saccharide ou d'oligosaccharide sans exiger de NAD ou NADP et qui catalyse une réaction suivante:

CH201O CH2OH

\4 =

HT+nA R - X 0 O+ nAH buAHn R0e H 0 H

o R est un résidu de chaîne de saccharide ou de l'hydro-

gène, A est un accepteur d'hydrogène à l'exception de NAD ou NADP, AH ou AHn est un accepteur dans une forme réduite et n est un nombre entier choisi parmi 1 et 2, qui comprend la culture du microorganisme producteur de maltose déshydrogénase appartenant au genre Staphylococcus

et l'isolement de la maltose déshydrogénase produite.

7. Un procédé selon la revendication 6, dans lequel le microorganisme producteur de maltose déshydrogénase appartenant au genre Staphylococcus est Staphylococcus

sp. B-0875 FERM BP-385.

8. Une méthode de dosage pour la détermination de saccharide ou d'une activité d'enzyme libératrice de saccharide, selon laquelle on fait réagir la maltose déshydrogénase ayant les propriétés indiquées ci- dessous avec un substrat en présence d'un accepteur d'hydrogène et on mesure une quantité de changements détectables; -34-

CH2OU CH20H

R-QoAH+,i)A -R-O H) O+ nAH ou AHn OH "

o R est un résidu de chaine de saccharide ou de l'hydro-

gène, A est un accepteur d'hydrogène à l'exception de NAD

ou NADP, AH ou AHn est un accepteur dans une forme ré-

duite et n est un nombre entier choisi parmi 1 et 2; - spécificité du substrat: agit au moins sur le maltose, le D-glucose, le xylose, le mannose, le galactose, le fructose, le lactose, le maltotriose, le maltotétraose, le maltopentaose, le maltohexaose ou le maltoheptaose; accepteur d'hydrogène: pas d'utilisation de NAD ou NADP, et utilisation au moins de méthosulfate de phénazine,

méthosulfate de l-méthoxy-phénazine, Bleu de Meldola, 2,6-

dichlorophénolindophénol ou phénolindophénol.

9. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce que le saccharide est un monosaccharide ou un oligosaccharide ou un saccharide libéré par l'action

d'une enzyme libératrice de saccharide.

10. Une méthode de dosage selon la revendication 9, caractérisée en ce que le saccharide ou le saccharide libéré par l'action d'une enzyme est au moins du xylose, du glucose, du galactose, du fructose, du maltose, du lactose, du maltotriose, du maltotétraose, du maltopentaose, du maltohexaose ou du maltoheptaose,

11. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'enzyme libératrice de saccharide

est au moins une glycosidase, phosphatase ou estérase.

12. Une méthode de dosage selon la revendication 11, caractérisée en ce que la glycosidase est de l'alpha-amylase, de la bâta-amylase, de l'alphaglucosidase ou de la -35- gluco-amylase.

13. Une méthode de dosage d'enzyme libératrice de saccharide selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'on détermine l'activité d'enzyme en titrant le substrat décomposé par une action enzymatique en utilisant un polymère de glucose ayant un résidu de glucose à extrémité réductible modifiée ou un polymère cyclique de glucose

comme substrat.

14. Une méthode de dosage d'enzyme libératrice de saccharide selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'on détermine l'activité d'enzyme en déterminant le substrat décomposé par une action enzymatique en utilisant un monosaccharide ou un oligosaccharide ayant une extrémité réductible modifiée, ou un oligosaccharide qui n'est pas décomposé par la maltose déshydrogénase dans

la revendication 8 comme substrat.

15. Une méthode de dosage selon la revendication 13, caractérisée en ce que le substrat est un polymère de glucose ayant un résidu de glucose à extrémité réductible modifiée d'amylose, d'amylopectine, d'amidon ou

d'hydrolysat d'amidon.

16. Une méthode de dosage selon la revendication 13, caractérisée en ce que le résidu de glucose à extrémité réductible modifiée est un résidu de gluconolactone ou d'acide gluconique à extrémité réductible éthérifiée, à extrémité réductible estérifiée ou un résidu à une

forme réduite correspondant.

17. Une méthode de dosage selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'on effectue le dosage en mesurant une quantité produite d'accepteur d'hydrogène dans une

forme réduite.

18. Une méthode de dosage selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'on effectue le dosage en mesurant les changements de facteur d'absorption résultant de la réaction d'un accepteur d'hydrogène dans une forme réduite -36- avec son réactif de réaction colorimétrique de transport

d'hydrogène dans une forme réduite.

19. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce que l'accepteur d'hydrogène est au moins du méthosulfate de phénazine, du méthosulfate de

1-méthoxyphénazine, du Bleu de Meldola, du 2,6-dichloro-

phénolindophénol ou du phénolindophénol.

20. Une méthode de dosage selon la revendication 17, caractérisée en ce qu'on mesure un accepteur d'hydrogène dans une forme réduite en mesurant l'oxygène en utilisant

une électrode à oxygène.

21. Une méthode de dosage selon la revendication 18,

caractérisée en ce que le réactif de réaction colorimé-

trique de transport d'hydrogène dans une forme réduite est un sel de tétrazolium, du 2,6-dichlorophénolindophénol ou

du bleu de méthylène.

22. Une méthode de dosage d'une activité d'enzyme libératrice de saccharide dans un échantillon selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'on détermine une activité de glycosidase en traitant préalablement ou simultanément l'échantillon au moyen d'hexose oxydase et de catalase.

23. Une méthode de dosage selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'hexose oxydase comprend une

glucose oxydase.

24. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'on détermine une activité d'enzyme libératrice de saccharide en traitant préalablement ou simultanément l'échantillon par une kinase en présence

de Mg++ et de ATP.

25. Une méthode de dosage selon la revendication 24,

caractérisée en ce que la kinase est l'hexokinase.

26. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'on détermine une activité d'enzyme libératrice de saccharide dans un échantillon après -37- traitement préalable de l'échantillon par la maltose déshydrogénase selon la revendication 8 en présence

d'un accepteur d'oxygène et d'un accepteur d'hydrogène.

27. Une méthode de dosage selon la revendication 8, caractérisée en ce que la maltose déshydrogénase a les propriétés suivantes: - poids moléculaire: 80 000 + 10 000 (filtration sur gel avec Sephacryl S-100) - point iso-électrique: pH 9,5 environ - valeur de Km: environ 3,8 mM (pour le maltose) - température optimale: environ 35 C - pH optimal: environ 7, 0 8,0 - stabilité au pH: stable à des pH d'environ 7,5 - 8,5 - stabilité à la chaleur: stable au-dessous

d'environ 40 C.