DE3442856A1

DE3442856A1 - Neue maltose-dehydrogenase, deren herstellung und deren verwendung fuer analytische untersuchungen

Info

Publication number: DE3442856A1
Application number: DE19843442856
Authority: DE
Inventors: Hidehiko Ishikawa; Kazuo Matsuura; Hideo Tagata Shizuoka Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1983-11-22
Filing date: 1984-11-22
Publication date: 1985-06-13
Also published as: DE3442856C2; IT8423684A1; FR2555197B1; JPH047190B2; JPS60114193A; FR2555197A1; IT8423684A0; IT1196333B; US4683198A

Description

Neue Maltose-Dehydrogenase , deren Herstellung und deren' Verwendung für analytische Untersuchungen

Die Erfindung bezieht sich auf eine neue Maltose-De hydro- -" genäse und betrifft ein neues Enzym, das auf eine reduzierende Endgruppe von Monosacchariden oder Oligosacchariden zu wirken vermag, ohne daß dazu NAD (Nicotinadenindinucleotid) oder NADP (Nicotinadenindinucleotidphosphat) benötigt wird, und das die folgende Reaktion zu katalysieren vermag:

CH₂OH

KOH R Λ-ΟΗ-τιΑ m-oX^_T _Η/=^{0+ ηΑΗ 0Γ ΑΗ}η

H ^

OH H

OH

worin R ein Saccharidkettenrest oder Wasserstoff, A ein Wasserstoff-Akzeptor, ausgenommen NAD und NADP ist, AH -und AHn die reduzierte Form des Akzeptors bedeutet und η für die Zahl 1 oder 2 steht.

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein Verfahren zur Gewinnung dieses neuen Enzyms sowie die Verwendung der neuen Maltose-Dehydrogenase für analytische Zwecke und die dafür benutzte Analysenmethoden sowie dieses Enzym enthaltende Zusammensetzungen.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Gewinnung dieses Enzyms ist dadurch gekennzeichnet, daß man dieses Enzym produzierende Mikroorganismen der Gattung Staphylococcus züchtet und das Enzym daraus isoliert. Eine Prüfungsmethode zur

Bestimmung von dieses Enzym freisetzenden Sacchariden oder einer Saccharidaktivität ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß man dieses Enzym in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors mit einem Substrat reagieren läßt und erkennbare Änderungen mengenmäßig meßtechnisch erfaßt.

Zum Stand der Technik gehören zahlreiche Arten von Dehydrogenase, einem Enzym, das auf reduzierende Endgruppen von Monosaccharide η oder Oligosaccharide η zu wirken vermag und in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors eine Dehydrierungsreaktion katalysiert. Beispiele für bekannte Wasserstoff-Akzeptoren sind Glucose-Dehydrogenase /~EC. 1.1.1.4 7 Glucose-De hydroge nase (Enzyme Handbook, S. 19, Dez. 1982), EC. 1.1.1.118 Glucose-Da hydroge nase (NAD ) (ebenda, S. 42) , EC. 1.1.1.119 Glucose-Dehydrogenase (NADP⁺) (ebenda, S. 43)_7 und Maltose-De hydroge nase (Britische Patentveröffentlichung 2,088,052 A). Diese Enzyme erfordern NAD oder NADP als Wasserstoff-Akzeptor.

Weiterhin ist ein Enzym bekannt, das zwar nicht NAD oder NADP benötigt, jedoch Phenazinmethosulfat (PMS) erfordert und Glucose oxidiert (Dehydrierung) , beispielsweise ein Enzym, das von Pseudomonas sp oder Gluconobacter suboxydance produziert wird /""Matsushita und Mitarb., Agr. Biol. Chem. , 44, 1505 - 1512 (1980), ebenda, 45, 851 - 861 (1981) J. Diese bekannten Enzyme wirken mit guter Aktivität auf Glucose, zeigen aber nur geringe Aktivität bei Einwirkung auf Oligosaccharide, die größer als Maltose sind.

Das erfindungsgemäße neue Enzym / das nachstehend als Maltose-De hydroge nase (Akzeptor) bezeichnet wlrd__/ zeichnet sich dadurch aus, daß es auf reduzierende Endgruppen von Monosacchariden und Oligosaccharlden zu wirken vermag und dazu als Cofaktor weder NAD noch NADP als Wasserstoff-

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Akzeptor benötigt, sondern mit PMS, 1-Methoxyphenazinmethosulfat (MPMS) oder Msldolablau (9-Dirtethylaminobenzo- oL -p he nazoxoniumchlorid) als Wasserstoff-Akzeptor arbeitet, sich von den bisher bekannten Glucose-De hydroge nase η dadur ch unte rs ehe idett_daß se ine Aktivitä t ge ge nübe r Maltose größer ist als die gegenüber Glucose, und daß darüber hinaus Substratspezifizität gegenüber Maltotriose, Maltote tr aose , Maltopentaose und Maltohexaose vorhanden ist, und die folgende Reaktion katalysiert wird ___

CH₂OH

_R__o J^iH/^H^+RO-S^h _H)^{0+ nAH Or AHn}

OH

worin R einen Saccharidkettenrest oder Wasserstoff, A einen Wasserstoff-Akzeptor, ausgenommen NAD und NADP, - AH und AHn die reduzierte Form des Akzeptors und η eine der ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten.

Es wurde gefunden, daß dieses neue Enzym Maltose-De hydroge nase (Akzeptor) produziert wird von der zur Gattung Staphylococcus gehörenden Art No. B-0875, die isoliert wurde aus einer Bodenprobe von dem Kartoffelfeld in Oaza-moriuchi, Iwakuni-shl, Yamaguchi-ken, Japan.

Es vor de weiterhin gefunden, daß sich das erfindungsgemäße Enzym Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) zur Bestimmung von Sacchariden oder zur Prüfung auf Enzyme, die Saccharid freisetzen, vorteilhaft in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors benutzen läßt.

Die taxonomischen Eigenschaften von die Maltose-De hy dröge nase (Akzeptor) produzierenden Mikroorganismen werden wir folgt veranschaulicht:

(1) Morphologische Charakteristiken:

Beobachtet auf Nähragar , bebrütet 18 Stunden lang bei 30°C.

g Pep ton, 5 g Fleischextrakt, 3 g NaCl, ml destilliertes Wasser, pH 7,2

1) Form, Größe und Polymorphismus der Zellen: Hauptsächlich paarweise oder einzeln, kurze Ketten und flockige Kokken.

Kein Polymorphismus.

Größe 0,6 - 0,8 χ 0,6 - 1,0 »um.

2) Beweglichkeit und Geißeln: keine

3) Sporen: keine

4) Gram-Färbung: positiv (schwache Entfärbung)

5) Färbung zum Nachweis der Sä ure festigkeit: negativ

(2) Wachstums-Charakteristiken:

1) Bouillon-Agar-Plattenmedium (30°C, 18 Stunden) und Nähragar-Plattenmedium:

Kolonien; konvex, rund und glattrandig. Cremig weiß oder grau weiß. Keine Bildung von löslichem Pigment

2) Schrägbouillonagar (30°C, 18 Stunden) und Schrägnähragar:

Gutes Wachstum mit Li near-Vermehrung.

Grau weiß bis cremig weiß.

Keine Bildung von löslichem Pigment.

3) Bouillon-Fleischbrühe (30°C, 18 - 42 Stunden): Gutes Wachstum mit gleichförmiger Trübung. Bildung eines dünnen Haut ehe ns.

4) Lakmus-Milch oder BCP-Milch:
Sauerkoagulation innerhalb zweiwöchiger Kultur, teilweise Peptonisation.

(3) Physiologische—Eigenschaften:

Nitrat-Re duktion - Denitrifikationsreaktion

MR-Te st

VP-Test

H S-Bi Idling

Stärke-Hydrolyse Citrat-Verbrauch (Simons Medium) (Christenssen Medium)

Nitrat-Verbrauch Ammonium-Verbrauch Pigment-Bildung Urease (SSR)

(Christenssen)

Oxidase

Katalase

Wachstum (pH) Wachstum (Temperatur) Natur:

OF-Te st

(Hugh-Leifson Medium )

(Nicht-peptonisches Medium Gelatine verflüssigung Kaseinhydrolyse Argininzersetzung: Lysindecarboxylierung Resistenz gegen NaCl Wachstum auf FTO-Medium GC% (Tm-Methode)

(schwach)

- aerob

37°C

(schwache Säurebildung unter anaeroben Bedingungen in einer 2-3-Wochen-Kultur)

nicht untersucht bis zu 5%

39%

Hugh-Leifson Medium: 2,0 g Pepton, 5,0 g NaCl,

0,3 g K-HPO., 10,0 ml Bromthymolblau (0,2%), 1000 ml dest.Wasser, 3,0 g Agar, pH 7,2

Nicht-peptonisches Medium: 1,0 g NH₄H-PO₄, 0,2 g KC

0,2 g MgSO₄·7Η₂Ο, 1,0 g Hefeextrakt, .^#--— 3,0 g Agar,

10,0 ml BTB (0,2%),

' 1000 ml dest. Wasser,

pH 7,2.

(4) Säure- oder Gas-Bildung aus Zucker (Basal-Medium: Hugh-Leifson Medium und Nicht-peptonisches Medium; es wurden die gleichen Resultate beobachtet)

Tabelle 1

Zucker

Säure Gas

Zucker

Säure

Adonit L-Arabinose Cellobiose Dulcit meso-Erythrit D-Fructose Fucose D-Galaktose D-Glucose Glycerin Inosit Inulin Lactose Maltose

D-Mannitol D-Mannose Melezitose Melibiose Raffinose L(+) Rhamnose D-Riböse Salicin L-Sorbose Sorbitol Stärke Saccharose Trehalose D-Xy Io se

Die Haupt-Eigenschaften der zuvor beschriebenen Mikroorganis — menart lassen sich wie folgt zusammenfassen: Der Stamm bildet im allgemeinen paarweise auftretende, gelegentlich einzelne, kurzkettige oder flockige granpositive Kokken (leicht entfärbt) , aerob nicht beweglich und ohne Polymorphismus. Die Art ist Katalase-positiv, Oxidase-negativ,

negativ hinslchtlich oxidative r Zersetzung von Zuckern und Säurebildung. Manchmal zeigt er F beim OF-Test bei mehr als 3-wÖchiger Bebrütung in einem Medium, in dem Ammoniumphosphat von einem nicht-peptonischen Medium entfernt Worden ist, und unter anaerober Bedingung entwickelt sich eine schwache Säurebildung. Der Guanln-Cytosln-Gehalt (GC%) beträgt 39%.

Wenn man den Stamm mittels Bergey's Mannual of Determinative Bacteriology, 8. Edition (1974) prüft, dann gehört dieser Stamm zu den Micrococcuceae. Zu den Micrococcuceae rechnet man die Gattung Micrococcus, die Gattung Staphylococcus, die Gattung Planococcus und die Gattung Stomatocoecus. Gemäß den morphologischen Eigenschaften (Beweglichkeit) und den biochemischen Eigenschaften (OF-Test) gehört der Stamm anscheinend zur Gattung Micrococcus, jedoch wird GC% für die Gattung Micrococcus mit 66 - 75% angegeben, was einer Differenz von mehr als 25% zu dem vorliegenden Stamm ausmacht. Da die Differenz bezüglich des GC%-Wertes ein Anzeichen für einen großen Abstand ist im Hinblick auf genetischen PoIymorphismus und phylögenetische Geischtspunkte, kann man diesen vorliegenden Stamm nicht der Gattung Micrococcus zurechnen. Als fakaultativer Anaerobier, Gattung Staphylococcus (generell, OF-Test: F, GC%: 30-40%) , wurde von einem Mutanten berichtet, der oxidative Zersetzung von Zucker zeigt (Int. J. Syst. Bacteriol., 26: 22-37, 1976). Der vorliegende Stamm B-0875 wird auf der Grundlage seiner Charakteristiken bezüglich GC% von 39%, schwacher Säurebildung bei anaeroben (ferrrentativen) Bedingungen bei Langzeitbebrütung über 3 Wochen im OF-Test, und zwar F im OF-Test, und der fehlenden Wachstumseigenschaften auf FTO-Agar-Medium als zur Gattung Staphylococcus gehörend identifiziert. ( Es wird Bezug genommen auf The Prokaryotes, VoI II, 1981). Entsprechend wird der vorliegende Stamm bezeichnet als Staphylococcus sp. B-0875, und dieser Stamm wurde hinterlegt beim Fermentation Institute,

Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I. Er ist dort unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-385 entsprechend dem Budapester Abkommen registriert.

Erfindungsgemäße Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) läßt sich dadurch gewinnen, daß man die diese Maltose-Dehydrogenase " (Akzeptor) produzierenden Mikroorganismen in einem für Antibiotika-bzw. Enzyme-Produktion geeigneten Medium züchtet. Die Züchtung kann mit Hilfe von festem oder flüssigem Msidum durchgeführt werden. Für industrielle Produktion verwendet man bevorzugt das Submarsverfahren unter Belüftung. "Als Nährstoffquellen für das Medium setzt man die für die Züchtung von Mikroorganismen gebräuchlichen Medien ein. Zu den Nährstoffquellen gehören Quellen für assimilierbaren Stickstoff, wie beispielsweise Maisquellwasser, Pepton, Kasein, Sojabohnenpulver, Hefeextrakt und Fleischextrakte. Kohlenstoffquellen sind Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie beispielsweise Melassen, Glucose, Glyzerin, Saccharose oder Dextrin. Anorganische Salze , wie beispielsweise Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumdihydrogenphosphat oder Kaliumhydrogenphosphat können zugegeben werden. Die Züchtungstemperatur kann je nach Wachstum der Mikroorganismen und Bildung der Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) variieren; sie liegt vorzugsweise bwi 25-30 C. Die Züchtungsdauer hängt von den jeweiligen Bedingungen ab und beträgt gebräuchlicherweise 15-72 Stunden. Die Züchtung sollte dann abgebrochen werden, wenn die Maximum-Produktion an Enzym erreicht ist. Die erfindungsgemäße Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ist in den gezüchteten Zellen enthalten.

Man kann dieses Enzym beispielsweise dadurch extrahieren, daß die gezüchteten feuchten Zellen abgetrennt, dann in einem tris-HCl-Puffer mit Lysozym behandelt und einer Beschallung oder Behandlung mit der French-Presse unterzogen werden, wobei man eine Lösung von roher Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) gewinnt. Das gereinigte Enzym erhält man dann

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dadurch, daß man die Lösung des rohen Enzyms bekannter Methoden zur Enzym-Isolierung und Reinigungsverfahren unterwirft. Man kann dazu die'^ÄÜsfällung mittels organischer Lösungsmittel, wie beispielsweise Aceton, Methanol odear Ethanol benutzen,~~oder ~man kann mit Ammoniumsulfat, Natriumchlorid oder Aluminiumsulfat aussalzen. Feinere Peinigung läßt sich mittels Adsorptions chromatografie unter Verwendung eines Ionenaustauschers, wie beispielsweise Carboxymethylcellulose, Carboxymethyldextrangel oder SuIf op ropy ldextr angel, sowie mit Hilfe eines Gelfiltrationsmittels, wie beispielsweise Dextrangel oder Polyacrylamidgel, mittels Lyophilisation zur Gewinnung der gereinigten Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) in Form von Pulver vornehmen.

Eine Untersuchungsmethode und die biochemischen Eigenschaften der so erhaltenen Maltose-De hy droge nase (Akzeptor) waren die folgenden:

(1) Untersuchungsmethode:

20 mM Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,1 % Rinderserum-Albumin

0,025% Nitrotetrazoliumblau (NTB) 0,2% eines handelsüblichen Tensids (Handelsprodukt

Triton X-IOO)

0,001% Phenozinmethosulfat (PMS; Wasserstoff-Akzeptor) 0,1 M Maltose

Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in einem schmalen Prüfröhrchen bei 37 C vorbebrütet. Es wurde Enzymlösung (10 ,ul) hinzugegeben, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37° inkubiert. Durch Zugabe von 0,1 η HCl (2,0 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und es wurde die optische Dichte bei 550 nm -(As) gemessen. Zur Kontrolle wurde destilliertes Wasser (10 ,ul) hinzugefügt, und dessen Wert wurde bei 550 nm gemessen (Ab) .

Als eine Einheit wurde die Menge an Enzym definiert, die 1 ,uMol an Maltose in einer Minute oxidiert (dehydriert) , und die Enzymaktivität wurde nach folgender Gleichung bere chne t :

Aktivität (Einheit/ml) =

(As - Ab) χ 3,01 12,4 χ 10 χ 0,01

Die enzymatische Reaktion bei dem obigen Vorgang kann wie folgt veranschaulicht werden:

Maltose + 2 PMS > Maltoglucono- y-lacton + 2 PMSH

5> 2 PMS + NTBH₂ (Bildung von monomerein oder di-Formazan)

2 PMSH + NTB

(2) Substratspezifizität:

Die Untersuchung wurde nach der zuvor beschriebenen Methode durchgeführt, jedoch wurden anstelle von Maltose die in Tabelle 2 aufgeführten Substrate eingesetzt (jeweils 0,1 M, 0,1 ml) , und die Prüfung wurde wie zuvor beschrieben durchge führt.

Tabe He 2

Substrat	Relative (%)	Aktivität Substrat Relative Akti vität (%)	77,4
Maltose	100	Maltotriose	60,3
Xylose	53,7	' Maltotetraose	36,4
Glucose	80	~ Maltopentaose	28,6
Galaktose	56,1	Maltohexaose	22,4
Mannose	52,4	Maltoheptaose	0
Fructose	31,4	Inosit	0
Saccharose	0	. Sorbit	0
Lactose	58,2	Glycerin	0
Raffinose	0	Ethanol
Dextrin (Mol. über	-Gew. 11,0 1700)

Wie man aus _Sabe_lle_2 sieht, wirkt das erfindungsgemäße Enzym substratspezifisch auf Maltose und auch auf Oligosaccharide , wie Glucose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose und Dextrin.

(3) Wasserstoff-Akzeptor_(A) :

Der Wasserstoff-Akzeptor (Coenzym) der Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) bei der oxidativen Reaktion (Dehydrierung) von Maltose wird nach der Untersuchungsirethode gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Erfindungsgemäße Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) erfordert nicht NAD oder NADP als Coenzym. Man beobachtet eine Abnahme an löslichem Sauerstoff, mindestens wenn PMS, 1-Me thoxyphe naz inme thosul fat (MPMS) oder Meldolablau als Wasserstoff-Akzeptor benutzt werden. Weiterhin lassen sich als Wasserstoff-Akzeptoren l-Acetamidphenazinmsthosulfat und Verbindungen der Phenolindophenolgruppe, wie beispielsweise Phenolindophenol und 2,6-Dichlorphenolindophenol einsetzen.
Die Reaktion kann wie folgt veranschauliht werden:

Maltose + 2 PMS > Maltogluconolacton + 2 PMSH

2 PMSH + 1/2 O₂ > 2 PMS + H₃O (?) .

Weiterhin könnte schätzungsweise die folgende Reaktion stattfinden:

Maltose + nA ^ Maltogluconolacton + nAH

(oder AHn)

Tabelle 3

Wasserstoff-Akzeptor pH bei der ReI.Aktiv. O^-Verbr".

Reaktion (%)

NAD	7,5	O
NADP	7,5	0
PMS	7,5	100
MPMS	⁷'⁵	30
Meldolablau	7,5	20
Methylenblau	7,5	0
Ferricyanid	7,5	0
NTB	7,5 ·	0

(4) Enzymwirkung:

Das Enzym katalysiert eine wie folgt gezeigte Reaktion:

CH₂OH

CH₂OH Hj—ο

y*^R-°-\°Ha

2 PMSH

worin R einen Saccharidke tte nre st oder Wasserstoff bedeutet.

Wie veranschaulicht katalysiert das Enzym eine Dehydrierungsreaktion, bei der die reduzierende endständige Gruppe des Substrats, wie beispielsweise Glucose oder Oligosaccharid, in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors, wie beispielsweise PMS dehydriert wird, wobei oxidiertes Substrat entsteht.

(5) pH-Optimum:

Es wurde die wie zuvor beschriebene Prüf methode durchgeführt, jedoch wurden anstelle der 20 mM Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,5) andere Pufferlösungen verwendet, und es wurde die Wirkung des pH auf das Enzym gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 der beiliegenden Zeichnung veranschaulicht. Darauf ist auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die relative Aktivität in % abgetragen. Parameter sind die verschiedenen Pufferlösungen, und zwar wie folgt:
G-o: 0,2 M Phosphatpuffer (pH 6,4-8,4 ·-·: 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 6,8-8,7) a-Δ: Glycin-NaOH-Puffer (pH 8,0-9,4).

3442856 -igte) Te mpe r at ur-Optimum:

Das Reaktionsgemisch (1,0 ml) , das wie bei den zuvor beschriebenen Prüfungsmethoden zusammengesetzt war, wurde 3 Minuten lang ,auf verschiedene Temperaturen im Bereich von 25-5O°C erhitzt. Es wurde Enzymlösung (0,2 U/ml, JO,02 ml) hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei den jeweiligen Temperaturen 10 Minuten lang bebrütet. Dann wurde 0,1 η HCl (2,0 ml) hinzu gefügt, um die Enzymreaktion abzubrechen, und danach wurde die. mengenmässiga Zunahme an PMSH mittels der optischen Dichte bei 550 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 der beiliegenden Zeichnung veranschaulicht. Es sind dort auf der Abszisse die Temperatur in ⁰C und auf der Ordinate die relative Aktivität in % abgetragen, Man ersieht daraus, daß das Temperatur-Optimum der erfindungsgemäßen Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) bei annähernd 35°C liegt.

(7) pH-Stabilität:

Es wurden Mischungen von Enzymlösung (10 U/ml, 0,1 ml), einer Anzahl Pufferlösungen (0,1 ml, jeweils mit verschiedenem pH) und destilliertem Wasser (0,8 ml) 60 Minuten lang bei 37 C vorbebrütet. Das Reaktionsgemisch wurde dann in Eiswasser abgeschreckt, und die Enzymaktivität wurde gemäß der zuvor beschriebenen Methode geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 der beiliegenden Zeichnung veranschaulicht. Dort sind auf der Abszisse der pH-Wert und auf der Ordinate die Aktivität in % abgetragen. Parameter sind die verschiedenen Pufferlösungen, und zwar:
©-©: Tris-HCl-Puffer (pH 6,6-8,3) ·-·: Glycin-NaOH-Puffer (pH 8,1-9,2)

Δ : TES-P.uffer (pH 7,0) · ■

▲ : BES-Puffer (pH 7,0).

Man erkennt, daß das Optimum für die pH-Stabilität erfindungsgemäßer Maltose-De hy droge nase (Akzeptor) für 60 Minuten lange Behandlung bei 37°C und Stabilisierung mittels Good's Puffer bei pH 7,5 - 8,5 liegt.

(8) Wärme Stabilität:

Ein Gemisch aus Enzymlösung (10 U/ml, 0,1 ml), 0,2 M BES Puffer (pH 7,0, 0,1 ml) und destilliertem Wasser (0,8 ml wurde 10 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen im Bereich von 30 - 60°C vorbebrütet. Nach der Behandlung wurde das Reaktionsgemisch in Eiswasser gekühlt* und dann wurde die Enzymaktivität des Gemisches entsprechend der zuvor beschriebenen Prüf methode untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 der beiliegenden Zeichnung veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Temperatur in °C und auf der Ordinate die Aktivität in % abgetragen Man erkennt, daß die erfindungsgemäße Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) während 10 Minuten langer Behandlung bei pH 7,5 wärmestabil ist bei Temperaturen unterhalb 40 C.

(9) Molekulargewicht:

80000 + 10000 (Gelfiltrationsmethode unter Verwendung

von Ionenaustauscherharz (Handelsbezeichnung Sephacryl S-200)).

(10) Isoelektrischer Punkt:

Annähernd 9,5 (Elektrophorese unter Verwendung von

amphoterem Trägermaterial (Ampholite)).

(11) Km-Wert:

Die Relation von Substrat (Maltose; cC- und ß-Gemisch)-Konzentration und Reaktionsgeschwindigkeit ist in Fig. 5 der beigefügten Zeichnung veranschaulicht. Darin ist auJ der Abszisse die Konzentration an Maltose in mM und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen.

Unter den experimentellen Bedingungen konnte Vmax nicht bestimmt werden, und es konnte keine lineare Lineweaver-Burk-Aufzeichnung erhalten werden. Daher konnte der korrekte Km-Wert nicht bestimmt werden. Der angenäherte Km-Wert wurde aus Fig. der beigefügten Zeichnung auf annähernd 3,8 mM kalkuliert, und der Km-Wert für ß-Maltose auf 1,36 mM. In Fig. 5 sind auf der Abszisse der Wert für Maltose in mM und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen.

(12) Effekt von Metallionen, EDTA und KCN:

Es wurden Metallionen, EDTA bzw. KCN, wie in Tabelle veranschaulicht, dem Reaktionsgemisch zugesetzt, und dann wurde entsprechend der zuvor erläuterten Prüfmethode gearbeitet und die Einwirkung der Zusätze gemessen. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 4 zu ersehen.

Tabelle 4

Zusätze

ReI.Aktivität Zusätze

ReI. Aktivität

ohne	Zusatz .	100	,2	1,0	mM	CoCl₂	17,9
1,0	mM LiCl	95	,4	1,0	mM	ZnCl₂	4,5
1,0	mM CaCl₂	101	1,0	mM	CuCl₂	0
1,0	mM MgCl₂	106	1,0	mM	NaN₃	95
1,0	mM BaCl₂	61	1,0	mM	KCN	95
1,0	mM MnCl₂	13	5,0	mM	EDTA	73

(13) Wirkung von Tensiden:

Tenside, wie sie in Tabelle 5 angegeben sind, wurden dem Reaktionsgemisch zugegeben anstelle der in der oben beschriebenen üntersuchungsmethode verwendeten Menge an 0,2% Tensid (Handelsprodukt: Triton X-IOO) . Dann wurde die Enzymaktivität wie beschrieben gemssen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 veranschaulicht.

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Tabe lie

Tensid

Konzentration Relative Ak ti-(%) vität (%)

ohne Zugabe

l.Tensid /	0,1
2. Te ns id '..	0,1
3.Tensid	0,1
4.Tensid	0,1
Natriumlaurylbenzol- sulfat Natriumdodecylbenzol- sulfat (SDS)	0,1 0,1
5.Tensid	0,1
6 .Tensid	0,1
7.Tensid	0,1
8.Tensid	0,1
9.Tensid	0,1
10.Tensid	0,1
11.Tensid	0,1
Natriuracholat	0,1
Ce tyItrime thylammonium- chlorid	0,1

100 107 96 111 114

0,2

106 104 104 103 103 120 115 86

94

Die aufgeführten Tenside sind Handelsprodukte mit

l.Tensid Handelsname

2. Tensid Handelsname

3. Tensid Hände lsnama 4.Tensid Handelsname 5.Tensid Handelsname 6.Tensid Handelsname

7. Tensid Handelsname

8. Tensid Handelsname

9. Tensid Handelsname

10. Tensid Handelsname 11.Tensid Handelsname

in der vorstehenden Tabelle den folgenden Handelsnamen:

cation PC-8

cation FB

cation DT-205

Sarconisate PN

briggi 35

Twee n-80

Nikkol-OP-10

span-85

adekatol-SO-145

adekatol-SO-120

Triton X-IOO

Erfindungsgemäße Maltose-Öehydrogenase (Akzeptor) kann für unterschiedliche Arten an Prüfungen, die auf deren Substratspezifizität und der Enzymwirkung basieren, eingesetzt werden. Beispielsweise wird bei Untersuchung von Amy läse aktivität das durch die Wirkung der Amylase aus Stärke gebildete Oligosaccharid durch erfindungsgemäße Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors, wie beispielsweise PMS behandelt, und das dabei gebildete reduzierte PMS läßt sich direkt meßtechnisch ermitteln, oder es läßt sich nach Reaktion mit Tetrazoliumsalz das daraus gebildete Formazan-Pigment colorimetrisch messen. Demzufolge ist das erfindungsgemäße Enzym für die klinische Diagnostik brauchbar.

Weiterhin läßt sich mit dem erfindungsgemäßen Enzym ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Sacchariden, wie beispielsweise Glucose und Maltose , und eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität, wie beispielsweise et -Amylase und ß-Amylase und Glucoamylase in einer Probe, beispielsweise einer Se rum-, Spe i ehe 1- oder Urin-Probe, unter Benutzung erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzept-or) durchführen, wobei das Substrat, beispielsweise ein Glucosepolymer mit modifiziertem reduzierendem endständigem Glucoserest oder ein cyclisches Glucosepolymer durch die Wirkung der erfindungsgemäßen Maltose-De hy drogenase (Akzeptor) zersetzt und das zersetzte Substrat quantitativ gemessen wird. -

Bisher bekannte Untersuchungsmethoden zur Bestimmung der Amylase aktivität basieren auf" der Tatsache, daß das Glucosepolymar-Substrat, wie beispielsweise Stärke, durch die Wirkung der Amylase hydrolysiert und Glucose, Maltose oder Oligosaccharide gebildet werden. Beispiele dafür sind Untersuchungsmethoden, bei denen die Abnahme der Viskosität der Stärke infolge der Einwirkung der Amylase gemessen wird, die Jodometrie, die Reaktion von Glucose mittels Glucose-Oxidase

oder Glucose-Dehydrogenase und NAD (NADP), wobei Glucose infolge der Einwirkung von oi- -Glucosidase auf durch die Amyläsewirkung auf Stärke gebildete Maltose entsteht; sowie die Stärke blau-Methode oder Maltose -Phosphory läse -Methode , bei der das durch die Einwirkung von Amylase auf an unlösliches Pigment gebundene Stärke gebildete lösliche Pigment colorimetriscn gemessen wird (Japanische Patentpublikation No. 55-27800).

Bisher bekannt war beispielsweise eine Prüfungsmsthode , bei der ein Substrat, wie beispielsweise p-Nitrophenylmaltopentaosid, p-Nitrophenylmaltohexaosid oder p-Nitrophenylmaltoheptaosid durch Einwirkung von Amylase hydrolysiert, die dabei gebildete p-Nitrophenylmaltotriose bzw. das p-Nitrophenylmaltosid mit dC-Glycosidase oder ß-Glycosidase behandelt und das dabei freigesetzte p-Nitrophenol colorimetrisch gemessen wird.

Diese vorbekannten Methoden haben eine Reihe von Nachteilen, beispielsweise: Die vielfältigen Unterschiede der Hydrolyse, die durch das verwendete Reagenz und die eingesetzten Reaktionsbedingungen verursacht werden, sowie die Inhibierungswirkung der in Coexistenz vorliegenden Glucose und Maltose. Darüber hinaus ist bei der Stärkeblau-Methode ein komplizierter Abtrennvorgang mittels Abzentrifugieren erforderlich, wodurch die Automation der Methode behindert wird, und bei der Maltose-Phosphorilase-Methode benötigt man einen vierstufigen Vorgang für die Enzymbehandlung, was diese Arbeitsweise technisch aufwendig und schwierig macht.

Die bisher bekannten Untersuchungsmethoden haben noch weitere Nachteile. Beispielsweise kann man die Menge an durch die Einwirkung von Amylase oder Glykosidase hydrolysiertem Substrat nicht korrekt massen, es läßt sich nur eine proportionale Beziehung feststellen. Dennoch hat man diese bisher bekannten

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- 25 Methoden benutzt, weil keine besser praktikablen Untersu-

chungsmethoden zur Verfügung stehen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß man sehr einfach und mit guter Genauigkeit die "saccharidfreisetzende Enzymaktivität prüfen kann, wenn man die reduzierende endständige Gruppe eines Glucosepolymer, das einen reduzierenden endständigen , Glucoserest aufweist, verestert, veräthert oder oxidiert, sodaß eine modifizierte reduzierende endständige Gruppe gebildet wird, die für Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) als Substrat nicht bruachbar ist. Das so gebildete , mit einem modifizierten reduzierenden endständigen Glucoserest bestückte Glucosepolymer wird dann einer Substrat-Reaktion zur Prüfung auf saccharidfreisetzende Enzymaktivität unterworfen.

Es wurde weiterhin gefunden, daß dieses Enzym sehr vorteilhaft geprüft werden kann, wenn das einen modifizierten reduzierenden endständigen Glucoserest aufweisende Glucosepolymer durch ein cyclisches Glucosepolymer ersetzt worden ist.

Weitere Vorteile lassen sich erreichen, wenn das durch die enzymatische Reaktion gebildete zersetzte Substrat durch Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors dehydriert und der dabei gebildete reduzierte Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) direkt meßtechnisch ermittelt oder indirekt gemessen wird durch ein Wasserstoff überführendes farbgebendes Mittel in reduzierter Form, oder wenn die Sauer stoff abnähme meßtechnisch ermittelt wird.

Die Erfindung hat weiterhin den Vorteil, daß man, wenn ein Substrat mit niedrigerem Polymerisationsgrad an Saccharid, wie beispielsweise einem Polymerisationsgrad von vier bis acht verwendet wird, das genaue Ergebnis mittels eines einzigen Signals in einer einzigen Aktion erhalten kann.

Es wurde weiterhin gefunden, daß sich die enzymatische Aktivität einer Glycosidase, wie beispielsweise Amylase, Glycosidase, Glucoamylase, Phosphatase oder Esterase in einer Probe, beispielsweise einer Serum-, Speichel- oder Urinprobe, vorteilhaft prüfen läßt, ohne daß eine schädliche Einwirkung auf gleichzeitig vorhandene Zucker, wie beispielsweise Glucose, in der Probe erfolgt, wenn man vorher oder gleichzeitig die Probe mit Hexose-Oxidase, vorzugsweise Glucose-Oxidase oder Katalase behandelt, oder wenn man sie mit Hexokinase in Anwesenheit von Mg und ATP behandelt, oder wenn man sie mit erfindungsgemäßer Maltose-De hy droge nase (Akzeptor) in Anwesenheit von Sauerstoff- und Wasser stoff-Akzeptor vorbehandelt.

Dementsprechend deckt die vorliegende Erfindung auch eine Untersuchungsmethode auf Saccharid und saccharidfreisetzende Enzymaktivität, bei der man ein Substrat in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors mit erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) behandelt und die dabei auftretende Größe an erkennbaren Änderungen meßtechnisch ermittelt.

Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung eine Bestimmungsmathode für Saccharid bzw. eine Prüfmethode auf saccharidfreisetzendes Enzym, wie beispielsweise Amylase und Glycosidase .

Beispiele für bei der vorliegenden Erfindung zweckmäßig verwendbare Substrate sind Glucosepolymere, die modifizierte reduzierende endständige Glucosereste aufweisen, Oligosaccharide, die reduzierende endständige Zuckerketten besitzen, die sich durch Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) nicht hydrolysieren lassen, oder cyclische Glucosepolymere, vorzugsweise solche mit einem Polymerisationsgrad von rnshr als 1, besonders vorteilhaft von mehr als 4.

Beispiele für Glucosepolymere mit modifizierten, reduzierenden endständigen Glucoseresten sind Maltote tr aose , Maltopentaose, Maltohexaose, Maltoheptaose, Amylose, Amylopektin, Stärke und Stärkhydrolysate, wie beispielsweise lösliche Stärke (sogenanntes Dextrin) , in denen der reduzierende endständige Glucoserest des Glucosepolymeren modifiziert ist. ~

Der erfindungsgemäße modifizierte reduzierende endständige Glucoserest ist ein Rest, der keine reduzierende Wirkung mehr hat, oder ein Substrat, das nicht für Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) als Substrat brauchbar ist.

Beispiele sind verätherte oder veresterte reduzierende endständige Gruppen, die in üblicher Waise produziert worden sind, oder reduzierende endständige Gruppen kombiniert mit Fructose, Inosit, Sorbit oder Gluconsä ure resten von oxidiertem Glucoserest oder deren veresterte. Derivate.

Beispiele für diese Modifikationen sind die folgenden: Eine Lösung von Polysacchariden, wie beispielsweise löslicher Stärke oder Dextrin, wird 4 Stunden lang bei 70 C mit 4%iger methanolischer Salzsäure umgesetzt, dann neutralisiert, und es wird mittels Gelfiltration Säulenchromatographie eine Fraktion mit verschiedenem Polymerisationsgrad gesammeltund so methyl-veräthertes Olisaccharid gewonnen. Die lösliche Stärke wird zu Essigsaäureanhydrid (3,5 ml) in trockenem Pyridin zugegeben, und man läßt über Nacht bei 0 C reagieren. Danach wird durch Zugabe von Aceton ausgefällt, und es wird mittels Gelfiltration Säulenchromatographie eine Fraktion mit verschiedenem Polymsrisationsgrad gesammelt und so acetyliertes Oligosaccharid gewonnen.

Es wird lösliche Stärke in Fehlings's Reagenz während einer Zeitspanne von 5 Minuten bis 20 Stunden gekocht, konzentriert,

nach Zugabe von Methanol die unlöslichen Bestandteile entfernt und die verschiedenartigen Polyinerisationsgrad aufweisende Fraktion gesammelt. So wurde eine Zusammensetzung erhalten, in der die reduzierenden endständigen Glucosereste zu Gluconsäureresten oxidiert waren, die vorteilhaft verestert sein können. Oder es ist die Carboxylgruppe im GIuconsäurerest zu einem reduzierten endständigen alkoholartigen Rest reduziert.

Diese Modifikationen der Glucosereste sind nicht auf die zuvor beschriebenen Arten begrenzt, vielmehr kann man sie auch gemäß sonstigen zum Fachwissen gehörenden konventionellen Methoden durchführen. Beispielsweise läßt sich anstelle einer Methylverätherung eine Alkylierung mit niedriger Alkylgruppe , beispielsweise eine Ethylverä the rung oder I s op r op yl ve rät he rung oder eine Verätherung mit substituiertem Phenylrest, beispielsweise Phenyl verätherung, p-Nltrophenylverätherung, 2 ,4-Dinitrophenylverätherung, p-Aminophenylverätherung, 2,6-Dibrom-4-aminophenylverätherung oder 2,4-Dichlorphenylverätherung durchführen. Ähnlich läßt sich anstelle der Acetylie rungsre aktion eine Propionylierungsreaktion, eine Phosphorylie rungsre aktion oder eine (^^-Veresterung vornehmen. Man kann weiterhin anstelle von Gluconsäureresten Anhydride, beispielsweise solche vom Typ des GIuconolactons benutzen.

Die Synthese solcher Glucosepolymeren ist beispielsweise beschrieben in US-PS 4,145,527, US-PS 4,147,860, in der ungap ruf te η Japanischen Patentpublikation No. 54-51892 und in der ungeprüften Japanischen Patentpublikation No. 5 7-6 879 8. Es ist nicht erforderlich, den Polyinerisationsgrad der Glucose auf einen gleichförmigen Polyinerisationsgrad einzuengen, vielmehr kann man mit Produkten mit breiten Polymerisationsgrad-Bereichen arbeiten. Beispiele für cyclische Glucosepolymere sind Dextrine mit mehr als sechs Glucose-Einheiten, wie man sie aus Stärken erhalten kann, beispielsweise U-, ß-, y ί - oder ^.-Cyclodextrin.

Beispiele für Enzyme ,die Saccharid freisetzen, und die von Glucosidase, wie beispielsweise Amylase , verschieden sind, sind Phosphatas und Esterase. Beispiele für Substrate für Phosphatase, beispielsweise alkalische Phosphatase, Glucose-6-phosphatase, Glucose-1-phosphatase oder Fructose-1,6-diphosphatase, sind phosphorylierte Saccharide, wie beispielsweise Glucose-l-phosphaty—Glucose-l,6-aiphosphat und Fructose-1,6-diphosphat. Diese Enzyme kann man zur Untersuchung einer Oxido-Reduktase, die auf phosphory lie rte Saccharide einzuwirken vermag, beispielsweise zur Untersuchung der Aktivität von Glucose -De hy droge nase verwenden, und dabei wird das bei einer enzymatischen Reaktion von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase mit dem Substrat Glucose-6-phosphat verbleibende Glucose-6-phosphat meßtechnisch ermittelt. Weiterhin lassen sich diese Enzyme verwenden zur Untersuchung der Kinaseaktivität bei der enzymatischen Synthese von phosphory lie rtem Saccharid in Anwesenheit von ATP. Beispiele für Substrate, die für die Untersuchung von Esterase aktivität eingesetzt werden können, sind C[._2_O~^Acyl⁽3e^ri^vat^{e von} Sacchariden. Diese Substrate werden durch s ac char idf reiset ze nde s Enzym, zum Beispiel einer Glucosidase, wie einer Amylase, einer Phosphatase oder einer Esterase in einer auf pH 6-8 abgepufferten Probe bei 37 C hydrolysiert, und es bilden sich dabei Zersetzungsprodukte der Substrate, wie beispielsweise Glucose, Maltose oder sonstige Oligosaccharide, wie beispielsweise Maltotrlose, Maltote traose, Maltopentaose und Maltohexaose.

Die Inkubationszeit sollte so ausreichend sein, daß das Saccharid aus dem Substrat freigesetzt werden kann; sie liegt gebräuchlicherweise bei mähr als einer Minute. Man kann durch maßtechnische Ermittlung von zersetztem Substrat die Aktivität des s acch aridfrei set ze nde η Enzyms, wie beispielsweise der Glycosidase, ein die Glykosidbindung im Zucker hydrolysierendes Enzym, prüfen. Die Reaktion kann weitergeführt werden in der Weise, daß man das zersetzte Substrat mit Maltose-

Dehydrogenase (Akzeptor) und einem Wasserstoff-Akzeptor während einer Zeitspanne von mehr als 30 Sekunden, vorzugsweise 1 bis 60 Minuten, bei 37°C inkubiert.

Die quantitative Bestimmung von Saccharid in einer Untersuchungsprobe kann so erfolgen, daß man anstelle des zuvor beschriebenen zersetzten Substrats ein Saccharid, wie beispielsweise Xylose, Glucose, Galaktose, Maltose, Fructose, Mannose, Lactose, MaltotrioseΓ, Maltotetraose , Maltopentaose , Maltohexaose oder Maltoheptaose benutzt.

Wie zuvor erläutert kann man das zersetzte Substrat durch die Einwirkung eines saccharidfrei setzende η Enzyms, wie beispielsweise einer Glykosidase, wie -^-Amylase, ß-Amylase, d. -Glucosidase oder Glucoamylase, Phosphatase oder Esterase odar das zu prüfende Saccharid mit erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) in Anwesenheit eines Wasserstoff-Akzeptors, wie beispielsweise PMS, MPMS, l-Acetamidphenazinmethosulfat, Meldolablau oder 2 ,6-Dichlorphenolindophenol behandeln und so die reduzierte Form des Wasserstoff-Akzeptors gewinnen.

Dan Wasserstoff-Akzeptor setzt man in einer das 0,05 bis 10-fache ausmachenden Uberschußmenge, verglichen mit dem zersetzten Substrat oder dem zu untersuchenden Saccharid ein. Wenn die Arbeitsbedingungen so ausgewählt sind, daß eine unterhalb der äquimolaren Menge liegende geringere Menga an Wasserstoff-Akzeptor vorhanden ist, läßt sich die reduzierte Form des Wasserstoff-Akzeptors mittels einer cyclisch geführten Reaktion in dem System ermitteln, in dem die reduzierte Form des Akzeptors mit Hilfe eines wasserstoffübertragenden Reaktionsmittels in einer reduzierten Form oder Sauerstoff regeneriert wird. Dabei liegt die bevorzugt benutzte Menge an Maltose-Dehydroganase (Akzeptor) im allgemeinen bei einer Untersuchung generell im Bereich von 0,01 - 100 Einheiten (U) .

Danach werden e rke nnb are fade runge η meßte chnisch erfaßt. Beispielsweise läßt sich die bei der Reaktion gebildete reduzierte Form des Wasserstoff-Akzeptors quantitativ bestimmen, wobei vorteilhaft^der—Wasserstoff-Akzeptor in reduzierter Form mit einem wasserstoffübertragenden Reaktionsreagenz in reduzierter Form zur Reaktion gebracht wird, wobei die Änderungen in Form von Absorbans-A'nderungen meßte chnisch erfaßt werden.

Beispiele für wasse rstoffübe rtr age nde Reaktlonsreagentien in reduzierter Form sind Tetrazoliumsalze , wie beispielsweise 3-(p-Jodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H*tetrazoliumchlorid, 3-(4,5-Dimethyl-2,4-azolyl)-2,5-diphenyl-2H«tetrazoliumbromid, 3,3'-(4,4'-Biphenylen)-bis(2,5-diphenyl-2H'tetrazoliumchlorid), 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis/~2-(p-nitrophenyl)-5~phenyl-2H*tetrazoliumchlorid_7 (Nitrotetrazoliumblau) und 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen) -bis (2 ,5-diphenyl-2H· tetrazoliumchlorid) , 2,6-Dichlorphenolindophenol oder Methylenblau. Diese wasserstoff übertrage nde η Reaktionsreagentien in reduzierter Form können in äquimolarer Menge oder im Überschuß, bezogen auf die Menge an gebildeter reduzierter Form von Wasserstoff-Akzeptor zugesetzt werden. Das kann im einzelnen bestimmt werden abhängig von der für die cyclische Reaktion für Wasserstoff-Akzeptor notwendigerweise benötigten Zeit und der Reaktionszeit, und es wird vorzugsweise eine 10 - 1000-fach äquimolafe Menge benutzt.

Das resultierende Reaktionsprodukt läßt sich colorimetrisch bestimmten. Alternativ kann man die reduzierte Form des Wasserstoff-Akzeptors mit gelöstem Sauerstoff umsetzen und die verbrauchte Menge an Sauerstoff mittels einer Sauerstoff-Elektrode meßtechnisch ermitteln.

3U2856

Eine Untersuchungsprobe, wie beispielsweise eine Urin-, Speichel- oder Blutprobe, wird zweckmäßig vorbehandelt mit einer Hexose-Oxidase, wie beispielsweise Glucose-Oxidase oder Katalase, oder mittels einer Kinase, wie beispielsweise Hexokinase, Mg und ATP. Dadurch vermeidet man eine zu Meßfehlern Anlaß gebende schädigende Einwirkung von Glucose. Eine solche Vorbehandlung kann zusammen mit der Reaktion mit Glucosidase und Substrat vorgenommen werden. Man kann die Glucose in solchen Untersuchungsproben durch Vorbehandlung von Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor und Wasserstoff-Akzeptor in Anwesenheit von gelöstem Sauerstoff oder mittels Hindurchperlenlassen von Sauerstoff oder Luft entfernen.

In den nachfolgenden Beispielen ist die Erfindung weiterhin veranschaulicht. Im Zusammenhang damit stehen die Abbildungen der Figuren 6 bis 17 der beigefügten Zeichnung. Darin zeigen:

Fig. 1 in grafischer Darstellung das pH-Optimum von erfindungsgemäßer Maltose-De hydroge nase (Akzeptor) ,

Fig. 2 in grafischer Darstellung das Temperatur-Optimum der Maltose-De hydroge nase (Akzeptor) ,

Fig. 3 in grafischer Darstellung die pH-Stabilität der Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor),

Fig. 4 in grafischer Darstellung die Wärmestabilität der Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 5 in grafischer Darstellung die Einwirkung von Substratkonzentration auf die Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 6 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer quantitativen Bestimmung von Mono- und Oligosaccharid unter Verwendung der Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 7 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung der Aktivität von Speiche 1-Amyläse unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor,

Fig. 8 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von Urin-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-De hy droge nase (Akzeptor),

Fig. 9 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prü— fung von Se rum-Amy läse unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-De hy droge nase (Akzeptor) , zeitabhängig,

Fig. 10 in grafischer Darstellung die Ergebnisse der Prüfung von Serum-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) , verdünnungsabhängig,

Fig. 11 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer weiteren Prüfung von Serum-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 12 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von Urin-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 13 die auf einem Ag arose -Trägermate rial bei der Untersuchung auf Serum-Aktivität unter Verwendung erfin-. dungs gemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) elektrophoretisch gewonnen Banden,

Fig. 14 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von Amylase unter eC-Glucosidase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase ^-— ~.,.„ (Akzeptor) ,

Fig. 15 in grafischer. Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von alkalischer Phosphatase unter Verwendung von erf indungsgemäßel: Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) ,

Fig. 16 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von menschlichem Serum und Urin-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor, und

Fig. 17 in grafischer Darstellung die Ergebnisse einer Prüfung von Serum-Amylase unter Verwendung von erfindungsgemäßer Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) .

Beispiel 1

Ein wässriges Medium.(100 ml) mit 1,0% Pepton, 1,0% Bonito-Extrakt und 0,3% NaCl (20 Minuten lang bei 120°C sterilisiert, pH 7,2) in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolbe η wurde mit einer öse voll Staphylococcus sp. B-0875 FERM BP-385 von Bouillonschrägagar überimpft, und es wurde unter Schütteln 24 Stunden lang" bei 28 C gezüchtet. Die so hergestellte Saatkultur wurde übertragen in ein anderes (zuvor 20 Minuten lang bei 120°C sterilisiertes, einen pH-Wert von 7,2 aufweisende) wässriges Medium (20 Liter) mit 1% Pepton, 0,1% K₂HPO₄, 0,3% NaCl, 0,1% MgSO.· 7H-0 und einem Schaumverhütungsmittel (Handelsprodukt mit der Bezeichnung silicon SA G-471) in einer Menge von 0,1%, das sich in einem 30 Liter Rüttelfermenter (Tank) "befand, und dann wurde unter Belüftung mit 20 Liter/Min, und Umrühren mit 300 U.p.M. 18 Stunden lang bei 30°C submers gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden 10 Minuten lang mit 5000 UpM abzentrifugiert und gesammelt. Die feuchten Zellen wurden 60 Minuten lang bei 37°C mit einer Lösung von 0,1% Lysozym und 5 mM EDTA in Phosphatpuffer (pH 7,0, 1,5 Liter) be — handelt. Die Lösung der solubilisierten Zellen wurde zentrifugiert (5000 UpM, 10 Minuten) , und es wurde die überstehende Flüssigkeit abgetrennt (11,8 U/ml, 3,2 Liter). Zu der überstehenden Lösung wurde Ammoniumsulfat hinzugegeben, bis eine 28%ige Sättigung erreicht war, dann wurde zentrifugiert (5000 UpM, 20 Minuten) und die überstehende Lösung wurde gesammelt. Zu der überstehenden Lösung wurde bis zu einer Sättigung von 72% weiteres Ämmoniumsulfat zugesetzt. Die Ausfällung wurde abzentrifugiert (5000 UpM, 20 Minuten) und gesammalt. Sie wurde in 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 220 ml) gelöst, dann wurde zentrifugiert (15000 UpM, 10 Minuten) , und es wurde die überstehende Lösung gewonnen (200 ml, .123,5 U/ml). Die überstehende Lösung wurde dialysiert, sie wurde auf eine aus Ionenaustauscherharz (Handelsprodukt mit der Bezeichnung CM-Sepharose CL-6B) bestehende Säule (Bett-Volumen 80 ml) aufgebracht

und durch abgestufte Eluierung mit KCl O - 0,5 M eluiert. Dabei wurde die Maltose -De hy droge nase (Akzeptor) enthaltende Fraktion erhalten. Die Fraktion wurde mittels Ultrafiltration mit Membran XM-30 konzentriert" (6 ml) , durch eine aus Ionenaustauscherharz (Handelsprodukt Sephacryl S-200) bestehende Säule chromatografisch gereinigt, und durch eine aus Ionenaustauscherharz (Handelsprodukt Sephadex G-25) bestehende Säule entsalzt. Das Eluat in 1% Saccharin-Lösung wurde lyophilisiart, und es wurde so gereinigte Maltose-De hy droge nase (Akzeptor) gewonnen (160 mg, 38 U/mg).

Beispiel 2

Es wurde ein Gemisch hergestellt aus

80 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,0

0,1% Rinderserum-Albumin

0,05% Nitrotetrazoliumblau (NTB)

0,2% Tensid (Handelsprodukt mit der Bezeichnung Triton X-IOO)

Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) (10 U/ml).

Zu diesem Re akt ions ge mi sch, das in schmale Prüfröhrchen abgefüllt worden war, wurden Glucose, Maltose, Maltotriose , MaI-totetraose, Maltopentaose bzw. Maltohexaose (20 ,ul, Endkonzentration 0,05 - 0,25% (W/V)) hinzugefügt, und es wurde 10 Minuten lang bei 37 C inkubiert. Nach der Reaktion wurde 0,1 η HCl (2 ml) hinzugegeben, und die Gemische wurden colorimetrisch bei 550 nm ausgemessen.

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Konzentration in den Proben in %, (W/V) , und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Parameter sind

·-·: Glucose, o-o: Maltose, o-o: Maltotriose, a-a :Maltotetraose, Δ—Δ :Maltopentaose , O—Q' :Maltohexaose . Man erkennt, daß gute Linearität erhalten wurde.

Baispiel 3

Das Reaktionsgemisch (je 1 ml) , dem 5 mM p-Nitrophenylpentaosid oder p-Nitrophenylheptaosid zugegeben worden war, und das im übrigen dem im Beispiel J>e schrie be ne η Reaktionsgemisch entsprach, wurde in schmalen Prüfröhrchen bei 37°C vorbebrütet. 500-fach verdünnter Speichel (eine Untersuchungsproba, die Amylase enthielt, 20 ,ul) wurde zugegeben, und es wurde 5 bzw. 10 bzw. 15 Minuten lang gezüchtet. Dia Ergebnisse sind in Fig. 7 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Parameter sind: o-o: p-Nitrophenylmaltoheptaose, o-o: p-Nltrophenylmaltopentao£ Man erkennt, daß gute quantitative Ergebnisse erhalten wurden. Für p-Nitrophenylheptaosid wurde, verglichen mit p-Nitrophenylpentaosid, eine dreimal stärkere Aktivität gefunden. Es konnte keine deutliche Verzögerungszeit beobachtet werden.

Beispiel 4

Ein Reaktionsgemisch, das in seiner Zusammensetzung dem in Beispiel 2 beschriebenen entsprach, dem jedoch noch zusätzlich 5 mM p-Nitrophenylheptaosid, Methylpheptaosid bzw. <? -GIuconolactonheptaosid zugesetzt worden war, wurde (zu je 1,0 ml) in schmalen Teströhrchen bei 37 C vorbebrütet. Dazu wurde menschlicher Urin (20 »ul) gegeben, und es wurde 5 bzw. 10 bzw. 15 Minuten lang inkubiert.

Die Ergebnisse sind in Fig. 8 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Parameter sind: ©-©: p-Nitrophenylmaltoheptaose, β-·: 1-Methylmaltoheptaose, Δ—Δ: ο-Gluconolactonmaltoheptaose.
Wie erkennbar wurde gute Quantitativität erhalten.

COPY

Beispiel 5

Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt aus 50 mM Phosphatpuffer pH 7,5
0,1 % Se rum-Albumin"

0,2 % Tensid (Handelsprodukt mit der Bezeichnung Triton X-IOO)

1 % -Cyclodextrin
0,05 % NTB

0,2 mM PMS

2 mM MgCl₂
Hexokinase (25 U/ml)
2 mM ATP

Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) (10 U/ml) 5 mM p-Nitrophenylmaltoheptaose.

Dieses Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in Spektrophotometer-Kuvetten eingefüllt. Es wurde menschliches Serum (20 ,ul, Amy läse enthaltende Untersuchungsproben in den Verdünnungen 1/1 bzw. 3/4 bzw. 1/2 bzw. 1/4) hinzu gegeben, dann wurde bei 37 C bebrütet, und die Änderungen der optischen Dichte wurden kontinuierlich bei .550 nm gemessen.

Die Ergebnisse sind in den Figuren 9 und 10 veranschaulicht. In Fig. 9 sind auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen, in Fig. 10 sind auf der Abszisse die Verdünnung und auf der Ordinate die optische Dichte pro 2 Minuten bei 550 nm abgetragen. Parameter in Fig. 9 sind:

Kurven 1: ohne Hexokinase; Kurven. 2: Serumverdünnung 1/1; Kurven 3: Serumverdünnung 3/4; Kurven 4: Serumverdünnung 2/4; Kurven 5: Serumverdünnung 1/4. Die jeweils ausgezogenen Linien (la - 5a) gelten für die ohne p-Nitrophenylmaltoheptaose untersuchten Proben; die jeweils gestrichelten Linien (Ib - 5b) zeigen die Ergebnisse an Zusatz von p-Nitrophenylmaltoheptaose aufweisenden Proben.

Die Änderung der Absorbans pro 2 Minuten, die in Fig. 10 veranschaulicht ist, wurde im Zeitraum von 5 bis 7 Minuten ermittelt. Man erkennt, daß die Se rum-Verdünnung umgekehrt proportional zur Absorbans in optischer Dichte verläuft.

Beispiel 6

Es wurden die folgenden Reaktionsmischungen zubereitet: Reaktionsgamisch I:

50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,0

Glucose-Oxidase (100 U/ml)

Katalase (1500 U/ml)
Reaktionsgamisch II:'

Das in Beispiel 2 beschriebene Reaktionsgemisc!

zusätzlich 5 mM p-Nitrophenylheptaosid

Das Re ak ti ons ge mi sch I (0,2 ml) wurde in eine Spektrophotomate: Küvette eingefüllt, es wurde Serum (20 ,ul) hinzu gegeben, und dann wurde 5 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Änderungen der Absorbans in optischer Dichte wurden kontinuierlich aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 (2) veranschaulicht. Als Kontrolle wurde ein gleiches Reaktionsgemisch, aus dem Glucose-Oxidase entfernt worden war, in gleicher Wei— se geprüft. Die Ergebnisse sind in Fig. 11 (1) veranschaulicht. In Fig. 11 ist auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf dej Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen.

Beispiel 7

Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt mit

40 mM BES Puffer pH 7,0

0,02% PMS

5 mM p-Nitrophenylheptaosid.

Das Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in einen mit einer Sauerstoff-Elektrode ausgerüsteten Reaktionsbehälter eingefüllt und bei 37 C vorbebrütet. Es wurde verdünntes menschliches Urin (in Verdünnungsverhältnissen von 1/8 bzw. 1/4 bzw. 1/2 bzw. 3/4 bzw. 1/1) hinzu gegeben, und es wurde die Amylaseaktivität in dem Urin gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 12 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse das Verdünnungsverhältnis und auf der Ordinate der Sauerstoff-Verbrauch innerhalb 10 Minuten in % abgetragen. Es wurden, wie ersichtlich, gute quantitative Ergebnisse erhalten.

COPY

Beispiel 8

Zu einem wie in Beispiel 2 beschriebnen Reaktionsgemisch wurde bis zu einer Konzentration von 5 mM p-Nitrophenylheptaosid zugegeben. Die Lösung des Gemisches (20 ,ul) wurde in ein Plattengefäß eingefüllt. Es wurde darin elektrophoriertes Serum auf Agarose-Platte eingetaucht, die aktive Fraktion wurde 30 Minuten lang bei Zimmertemperatur ausgefärbt, und dann wurde die Reaktion durch Eintauchen der Platte in 0,1 η HCl abgestoppt. Das Ergebnis ist in Fig. 13 veranschaulicht. Die Amylaseaktivität konnte einfach durch Färbung ermittelt werden, und man erkennt, daß die ausgefärbten Banden deutlich getrennt vorliegen und keine Diffusion zeigen.

Beispiel 9

Zu einem wie in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionsgemisch wurden in einer Konzentration von 1% Dextrin mit mathylierter reduzierender Endgruppe (Fraktion mit Molekulargewicht von mehr als 1000) bzw. Fractosyl-maltoheptaosid (C^-Fructose) hinzugefügt.

Diese Reaktionsgemische ( 10 ml) wurden in schmale Prüfröhrchen eingefüllt, es wurde H. -Amylase (verdünnter menschlicher Pankreassaft in Mengen von 0 bzw. 5 bzw. 10 bzw. 20 bzw. 30 bzw. 40 bzw. 50 /Ul) zugesetzt, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 0,1 η HCl (2 ml) wurde die Reaktion abgestoppt, und dann wurde colorimetrisch bei 550 nm der Meßwert ermittelt.

Es wurde in der gleichen Weise wie zuvor beschrieben gearbeitet, jedoch wurde anstelle von methyliertem Dextrin Phenyl- <k-D-glucopyranosid (2 mM) und danach<£-Glucosidase (aus Hefe, Produkt von SIGMA CHEM.) zugesetzt. Die Ergebnisse sind in Fig. veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse der Sauerstoff-Verbrauch in .ul und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Parameter sind:

o-o: G_-Fructose; Δ—Λ : itethyliertes Dextrin; •-es Phenyl-<Κ -D-glucopyranosid.

Wie ersichtlich wurde eine gute lineare Relation zwischen der Menge an Enzym und der Absorbans in optischer Dichte erhalten.

Beispiel 10 .._._

Es wurde eine wie in Beispiel 2 beschriebene Re ak tionsmi sch un< hergestellt, jedoch wurden anstelle der dort verwendeten Pufferlösung 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) und anstelle des dort verwendeten Substrats 2 mM Glucose-6-phosphat eingesetzt Das Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in schmalen Teströhrchen bei 37°C vorbebrütet. Es wurde eine Lösung von alkalischer Phosphatase (10 ,ul, E.coli) hinzu gefügt, und dann wurde 10 Minuten lang bei 37 C bebrütet. Durch Zugabe von 0,1 η HCl (2,0 ml) wurde die Reaktions abgestoppt, und es wurde colorinetrlsch bei 550 nm der Meßwert bestimmt. Die Ergebnisse sin in Fig. 15 veranschaulicht. Darin sind auf der Abszisse die Verdünnung der alkalischen Phosphatase und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Man erkennt, daß gute Linearität erreicht wurde.

Beispiel 11

Folgende Reaktionsgemische wurden hergestellt: Reaktionsgemisch I mit

50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,0

0,2 mM PMS " -

Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) (13 U/ml)

2 mM CaCl₂
Reaktionsgemisch II mit

50 mM Tris-HCl-Puffer pH 7,0

2 mM NTB

5 ,0 mM p-Nitrophenylheptaosid

2 mM

Das Reaktionsgemisch I (0,5 ml) wurde in Spektrophotomater-Zellen eingefüllt und darin bei 30°C vorbebrütet. Es wurde menschliches Serum bzw. Urin (20 ,ul) hinzu gegeben, und dann wurde 5 Minuten lang bei 37^⁰C bebrütet. Anschließend . wurde Reaktionsgemisch II (1,5 ml) , vorbebrütet bei 37 C, hinzugefügt, und es wurde bei 37°C die Änderung der Absorbans bei 550 nm kontinuierlich gemessen.

Eine Kontrollösung wurde wie folgt zubereitet: Das Reaktionsgemisch I (0,5 ml) und das Reaktionsgemisch II (1,5 ml) wurden zunächst vermischt, bei 37 C vorbabrütet, dann wurde Serum bzw. Urin (20 ,ul) zugegeben, und es wurde bei 37°C bebrütet.

Die Ergebnisse sind in Fig. 16 veranschaulicht. Darin ist auf der Abszisse die Zeit in Minuten und auf der Ordinate die optische Dichte bei 550 nm abgetragen. Parameter sind: ·-·: Se rum-Kontrollprobe; o-o: vorbehandeltes Serum; A-A: Urin-Kontrollprobe; Δ-&: vorbehandeltes Urin. Es ist erkennbar, daß in der vorbehandelten Lösung mit dem Reaktionsgemisch I eine Einwirkung von ursprünglich vorhandenen Sacchariden ausgeschaltet werden konnte.

Beispiel 12

Es wurden hergestellt

Reaktionsgemisch I mit:

40 mM Phosphatpuffer pH 7,0

33 mM ATP

0,002% Wasserstoff-Akzeptor

4,17 mM MgCl₂

Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) (16,7 U/ml)

Hexokinase (11,7 U/ml) Reaktionsgemisch II mit:

12,6 mM CaCl₂

15,0 mM EDTA

0,013% NTB

0,5% Tensid (Handelsprodukt mit der Bezeichnung

Triton X-IOO) -

2,5% reduziertes Dextrin. COPY

Zu dem zuvor angegebenen Reaktionsgemisch I (mit jeweils den in Tabelle 6 angegebenen Wasserstoff-Akzeptoren) wurde menschliches Serum (20 ,ul) hinzu gegeben, und dann wurde 5 Minu-

o
ten lang bei 37 C inkubiert. Dazu wurde Reaktionsgemisch II (0,4 ml) gegeben, und es wurde bei 37°C bebrütet. Die Änderungen der Absorbans bei 550 nm wurden gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben. Man ersieht daraus, daß Se rum-Amy läse ermittelt werden kann, wobei die Werte im wesentlichen unabhängig sind von der Verschiedenheit der Wasserstoff-Akzeptoren.

Tabelle 6

Wasserstoff-Akzeptor Relative Amylaseaktivität

PMS 100%

MPMS 102%

1-Acetamidphenazinme thosulf at 103%

Meldolablau 97,4%

Beispiel 13

Es wurde ein Reaktionsgemisch hergestellt mit:._

40 mM Phosphatpuffer

20 mM ATP

2,5 mM MgCl₂

Hexokinase (5 U/ml)

Maltose-Dehydrogenase (Akzeptor) (10 u/ml)

2% reduziertes Dextrin

0,2 mM 2 ,6-Dichlorphenolindophenol.

Dieses Reaktionsgemisch (1,0 ml) wurde in Spektrophotometer-ZeHeη eingefüllt und bei 37°C vorbebrütet. Dann wurde menschliches Serum ( 5 bzw. 10 bzw. 20 bzw. 30 bzw. 50 ,ul) hinzu gegeben, und es wurde 5 Minuten lang bei 37 C bebrütet. Nachdem die Reaktion fertig abgelaufen war, wurde die Änderung der Absorbans bei 600 nm kontinuierlich gems ssen. Die

Ergebnisse sind in Fig. 17 veranschaulicht. Auf der Abszisse ist die Mange an menschlichem Serum in ,ul und auf der Ordinate die Abnahmageschwindigkeit der optischen Dichte bei 600 nm in Δα 600/Min. abgetragen. Man erkennt, daß gute Quantitativität erhalten wurde.

Claims

Priorität: Japan Pat.Anm.Nr. 58-219792 vom 22. November 1983 Toyo Zlozo Kabushiki Kaisha ^ Λ Δ ? R S R 632-1, Flifuku, Ohito-cho °HH*-u°u Tagata-gun, Shizuoka-ken Japan ^- P ate nt ansp rvi ehe

1. Enzym, dadurch gekennzeichnet, daß es ohne Anwesenheit von NAD oder NADP auf reduzierende Endgruppen von Monosacchariden oder Oligosacchariden einzuwirken vermag und die folgende Reaktion katalysiert.

CH₂OH '

0+ nAH 0Γ AHn

worin R einen Saccharidkettenrest oder Wasserstoff, A einen Wasserstoff-Akzeptor, ausgenommen NAD und NADP, AH und AHn die reduzierte Form des Akzeptors und η eine der ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten.

2. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens auf Maltose, D-Glucose, Xylose, Mannose, Galaktose , Fructose, Lactose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose , Maltohexaose und Maltoheptaose als Substrat einzuwirken vermag.

3. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens mit Phenazinmethosulfat, l-Methoxyphenazinmethosulfat, Meldolablau, 2,6-Dichlorphenolindophenol und Phenolindophenol als Wasserstoff-Akzeptor zu wirken vermag.

4. Enzym nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine Maltose-Dehydrogenase handelt.

5. Enzym nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die folgenden physikochemischen und biochemischen Eigenschaften: Molekulargewicht: 80000 - 10000 (mittels Gelfiltration

unter Verwendung von Ionenaus tauscher harz (Handelsbezeichnung Saphacryl S-200) ermittelt) .

Isoelektrischer Punkt: annähernd pH 9,5 Km-Wert: annähernd 3,8 mM (für Maltose) Temperatur-Optimum: annähernd 35 °C pH-Stabilität: stabil bei annähernd pH 7,5 bis 8,5 Wärmestabilität: stabil unterhalb annähernd 40°C

6. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß man einen dieses Maltose-Dehydrogenase genannte Enzym produzierenden Mikroorganismus der Gattung Staphylococcus züchtet und die Maltose-Dehydrogenase daraus isoliert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als die Maltose-Dahydrogenase produzierenden Mikroorganismus des Genus Staphylococcus die Art Staphylococcus sp. B-0875 FERM BP-385 einsetzt.

8. Verwendung des Enzyms nach Anspruch 1 - 5 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung von Saccharid oder einer saccharidfreisetzenden Enzymaktivität, dadurch gekennzeichnet, daß man die die nachstehenden Eigenschaften

3U2856

■- 3 -

_ Katalysierung der Reaktion

CH₂OH CH₂OH

rVohua;»rhoJuh ur⁺ ^{nAH or AHn}

oh

worin R einen Saccharidkettenrest oder Wasserstoff/ A einen Wasserstoff-Akzeptor, ausgenommen NAD oder NADP, AH oder AHn die reduzierte Form des Akzeptors, und η eine der ganzen Zahlen 1 oder 2 bedeuten, Substratspezifizität für wenigstens Maltose, D-Glucose , Xylose, Mannose, Galaktose, Fructose, Lactose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose und Maltoheptaose,

Wirksamkeit mit Wasserstoff-Akzeptoren wie Phenazinmethosulfat, 1-Methoxyphenazinmethosulfat, Meldolablau, 2 ,6-Dichlorphenolindophenol und Phenolindophenol, jedoch Unwirksamkeit mit NAD und NADP

aufweisende Maltose-Dehydrogenase mit einem Substrat in Anwesenheit des Wasserstoff-Akzeptors umsetzt und erkennbare Änderungen mengenmäßig ermittelt.

9. Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung von Monosaccharid oder Oligosaccharid oder eines durch die Wirkung eines saccharidfreisetzenden Enzyms freigesetzten Saccharids.

10. Verwendung nach Anspruch 9 für eine Untersvchungsmethode zur Bestimmung von Xylose, Glucose, Galaktose, Fructose, Maltose, Lactose, Maltot riose , Maltotetraose, Maltopentaose, Maltohexaose oder Maltoheptaose.

COPY

11. Verwendung nach Anspruch 9 für eine Untersuchungsrnethode zur Bestimmung eines durch die Wirkung von Glykosidase, Phosphatase oder Esterase freigesetzten Saccharids.

12. Verwendung nach Anspruch. 11 für eine Untersuchungsmathode zur Bestimmung von durch (X -Amyläse , ß-Amylase , ά -Glykosidase oder Glucoamyläse freigesetzten Saccharids.

13. Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung der Aktivität eines saccharidfreisetzenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymaktivität, anhand des durch die enzymatische Reaktion zersetzten Substrats unter Verwendung von einen modifizierten reduzierenden endständigen Glucoserest aufweisendem Glucosepolymer oder cyclischem Glucosepolymer als Substrat bestimmt wird.

14. Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung der Aktivität eines saccharidfreisetzenden Enzyms, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymaktivität bestimmt wird anhand des zersetzten Substrats durch eine enzymatische Reaktion unter Benutzung von Monosaccharid oder Oligosaccharid mit einer modifizierten reduzierenden Endgruppe oder durch mit der in Anspruch 8 spezifizierten Maltose-De hy droge nase nicht zu zersetzendem Oligosaccharid als Substrat.

15. Verwendung nach Anspruch 13, wobei als Substrat ein Glucosepolymer benutzt wird, das Amylose, Amylopektin, Stärke oder Stärkehydrolysat als modifizierten reduzierenden endständigen Glucoserest aufweist.

16. Verwendung nach Anspruch 13, wobei es sich bei dem modifizierten reduzierenden endständigen Glucoserest um eine verätherte reduzierende Endgruppe, eine veresterte reduzierende Endgruppe , Gluconolacton oder Gluconsäurerest oder einem solchen Rest in reduzierter Form handelt.

COPY

17. - Verwendung nach Anspruch 13, wobei als Meßwert die Menge an gebildeter-reduzierter Form des Wasserstoff-Akzeptors bestimmt wird.

18. Verwendung nach Anspruch 13, wobei als Maßwert die Änderung der Absorbens bestimmt wird, die beim Umsatz der reduzierten Form des Wasserstoff-Akzeptors mit einem farbgebenden Reaktionsreagenz, auf welches der Wasserstoff der reduzierten Form des Akzeptors überzugehen vermag, auftritt.

19. Verwendung nach Anspruch 8, wobei als Wasserstoff-Akzeptor wenigstens -Phenazinmethosulfat, 1-Methoxyphenazinmethosulfat, Meldolablau, 2 ,6-Dichlorphenolindophenol oder Phenolindophenol benutzt wird.

20. Verwendung nach Anspruch 17, wobei die reduzierte Form des Wasserstoff-Akzeptors durch Bestimmung von Sauerstoff unter Benutzung einer Sauerstoff-Elektrode meßtechnisch ermittelt wird.

21. Verwendung nach Anspruch 18, wobei als farbgebendes Reaktionsreagenz Tetrazoliumsalz, 2,6-Dichlorphenolindophenol oder Mathylenblau eingesetzt wird.

22. Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung der Aktivität eines saccharidfreisetzenden Enzyms in einer Untersuchungsprobe, dadurch gekennzeichnet, daß Glykosidaseaktivität durch vorhergehende oder gleichzeitige Behandlung der Untersuchungsprobe mit Hexose-Oxidase und Katalase bestimmt wird.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die eingesetzte Hexose-Oxidase eine Glucose-Oxidase enthält.

24. -Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung—der^Aktivität eines s acchari df reiset ze nde η Enzyms, wobei man die üntersuchungsprobe zuvor oder gleichzeii
ΛΤΡ behandelt.

oder gleichzeitig mit Kinase in Anwesenheit von Mg und

25. Verwendung nach Anspruch 24, wobei als Kinase Hexokinase eingesetzt wird. _

26. Verwendung nach Anspruch 8 für eine Untersuchungsmethode zur Bestimmung der Aktivität eines saccharidfreir setzenden Enzyms in einer ünte rsuchungsp robe , dadurch gekennzeichnet, daß man die Untersuchungsprobe vorab mit der in Anspruch 8 spezifizierten Maltose-De hy droge nase in Anwesenheit von Sauerstoff-Akzeptor und Wasserstoff-Akzeptor vorbehandelt.

27. Verwendung nach Anspruch 8, wobei eine Maltose-Dehydrogenase eingesetzt wird, die folgende Eigenschaften aufweist:

Molekulargewicht: 80000 t 10000 (mittels Gelfiltration

unter Verwendung von Ionenaustauscherharz (Händelsbe ze i chnung Sephacryl S-IOO) ermittelt)

Isoelektrischer Punkt: annähernd pH 9,5 Km-We.rt: annähernd 3,8 itiM (für Maltose) Temperatur-Optimum: annähernd 35 C pH-Optimum: annähernd 7,0 - 8,0 pH-Stabilität: stabil bei annähernd pH 7,5 bis 8,5

Wärme Stabilität: stabil unterhalb annähernd 40°C.

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