DE3600563C2

DE3600563C2 -

Info

Publication number: DE3600563C2
Application number: DE3600563A
Authority: DE
Inventors: Masaru Kashiwa Jp Suzuki
Original assignee: NODA INSTITUTE FOR SCIENTIFIC RESEARCH NODA CHIBA JP
Current assignee: NODA INSTITUTE FOR SCIENTIFIC RESEARCH NODA CHIBA JP
Priority date: 1985-01-11
Filing date: 1986-01-10
Publication date: 1987-07-23
Also published as: US4740465A; JPH0134035B2; DE3600563A1; JPS61162174A

Description

Die Erfindung betrifft eine neue wärmebeständige Sarcosinoxidase N und ein Verfahren zur Herstellung derselben.

Sarcosinoxidase ist ein Enzym, das die folgende Reaktion katalysiert:

Sarcosin + H₂O + O₂ → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.

Sarcosinoxidase ist bekannt und wird z. B. in US-PS 42 16 292 und J. Biochem. 89, 599 (1981), Japan, beschrieben.

Auf dem Gebiet der klinischen Medizin erfolgt die quantitative Bestimmung von Creatinin oder Creatin, welche im Serum und Urin vorliegen, gegenwärtig zur Untersuchung von Nierenstörungen, Muskelstörungen, etc. Zur Durchführung dieser Bestimmung kennt man die sogenannte Jaff´-Methode, nach welcher Creatinin mit alkalischer Picrinsäure umgesetzt und die erhaltene orange Färbung gemessen wird. Diese Reaktion der Farbentwicklung wird durch verschiedene Substanzen, die im Serum und Urin vorliegen, nachteilig beeinflußt und stellt somit eine nicht-spezifische Reaktion dar. Aus diesem Grunde ist der nach der Jaff´-Methode erhaltene Wert nicht besonders verläßlich.

Da außerdem in vielen Fällen ein Schritt der Proteinentfernung erforderlich ist, ist das Verfahren in seiner Ausführung schwierig.

In letzter Zeit wurde von einem Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin berichtet (Clinical Science Symposium No. 19, 196 [1979]). Nach diesem Verfahren verwendet man Sarcosinoxidase, wie dies nachfolgend gezeigt wird. In den folgenden Formeln werden die eingesetzten Enzyme in Klammern angegeben.

Creatinin + H₂O ⇄ Creatin (Creatinin-amidohydrolase)

Creatin + H₂O → Sarcosin + Harnstoff (Creatin-amidinohydrolase)

Sarcosin + H₂O + O₂ → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂ (Sarcosinoxidase)

Da jedoch die Menge an Creatinin oder Creatin, die im Serum und Urin vorliegt, sehr klein ist, war es erforderlich, ein hoch sensitives Verfahren zur enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin zu entwickeln.

Kürzlich wurde ein Färbemittel entwickelt, welches eine hoch sensitive Färbung bildet, wenn Wasserstoffperoxid (H₂O₂) im neutralen oder leicht sauren Bereich mit einer aus Meerrettich erhaltenen Peroxidase behandelt wird. Diese Farbe ist blau oder grün und unterscheidet sich von dem Gelb oder Rot, das von Serumkomponenten herrührt; aus diesem Grunde ist keine Blindmessung für Serum notwendig, was vorteilhaft ist. Die vorstehend genannte Färbung ist jedoch instabil und verschwindet bei pH 7,5 oder darüber. Aus diesem Grunde ist es erforderlich, die enzymatische Reaktion/Farbentwicklungsreaktion im neutralen oder leicht sauren Bereich durchzuführen, um eine stabile Farbentwicklungsreaktion zu erhalten. Da außerdem das pH-Optimum von Peroxidase bei oder um 6,5 liegt (leicht sauer), ist es erforderlich, daß die gekoppelten Enzyme auch im leicht sauren Bereich eine befriedigende enzymatische Reaktion ergeben.

Schließlich wird in DE-OS 28 42 940 ein Verfahren zur Herstellung von Sarcosinoxidgas offenbart, wonach das Enzym mit Hilfe von Mikroorganismen der Gattung Bacillus sp., insbesondere Bacillus sp. B-0618, FERM-P Nr. 4049 (DSM 1383) erzeugt wird.

Es ist erforderlich, daß die Enzyme zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin in einem hochreinen Zustand vorliegen und frei von Begleitenzymen sind. Aus diesem Grunde ist es wünschenswert, Enzyme mit hoher relativer Aktivität und hoher Reinheit zu entwickeln, die bei einem Massenreinigungsschritt erhalten werden, wobei andere begleitende Enzyme (z. B. Katalase und Urikase) durch eine Wärmebehandlung vollständig inaktiviert werden.

Da die im Serum und Urin enthaltene Menge an Creatinin oder Creatin gering ist, ist auch die bei der enzymatischen Zersetzung von Creatinin oder Creatin gebildete Menge an Sarcosin gering. Aus diesem Grunde ist vom industriellen Standpunkt her die Entwicklung eines Enzymes wünschenswert, das auch in Anwesenheit derart geringer Mengen an Sarcosin reagiert und einen niederen K _m-Wert (Michaelis-Konstante) aufweist.

Von den Erfindern wurden ausgedehnte Untersuchungen durchgeführt, um eine neue Sarcosinoxidase zur Verfügung zu stellen, die zur hochempfindlichen enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin geeignet ist, die auch im leicht sauren pH-Bereich eine befriedigende enzymatische Aktivität aufweist, wärmestabil ist und für Sarcosin einen niederen K _m-Wert besitzt. Als Ergebnis dieser Untersuchungen wurde gefunden, daß beim Kultivieren eines zur Gattung Bacillus gehörenden Stammes, der aus Erde neu isoliert wurde, eine neue Sarcosinoxidase erhalten werden kann, die auch im leicht Sauren eine befriedigende enzymatische Aktivität aufweist, wärmebeständig ist und für Sarcosin einen niedrigen K _m-Wert besitzt. Diese Befunde haben zur vorliegenden Erfindung geführt.

Die vorstehende Aufgabe wird gemäß der Erfindung durch eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N gelöst, die über die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften verfügt:

(a) Aktivität
Sarcosinoxidase N katalysiert die folgende Enzymreaktion, bei welcher Sarcosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird: Sarcosin + H₂O + O₂ → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂;
(b) Substratspezifität
Sarcosinoxidase besitzt einen K _m-Wert (Michaelis- Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einem pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung);
(c) pH-Optimum und stabiler pH-Bereich
der optimale pH von Sarcosinoxidase N liegt bei 6,7 bis 10,0, wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird; der stabile pH-Bereich reicht von 6,5 bis 11,5;
(d) optimaler Temperaturbereich
45 bis 60°C gemäß Fig. 2,
(e) Wärmestabilität
Sarcosinoxidase N behält nach 10minütigem Behandeln bei 55°C zu 98% und nach 10minütigem Behandeln bei 60°C zu 75% ihre enzymatische Aktivität bei;
(f) Molekulargewicht
ca. 49 000 bei Bestimmung nach der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex G-150;
(g) Flavinenzymprotein
Sarcosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent gebundenes Flavin-adenin-dinucleotid (FAD) pro Mol Enzym.

Die Erfindung umfaßt im weiteren ein Verfahren zur Herstellung einer wärmebeständigen Sarcosinoxidase N, das gekennzeichnet ist durch das Züchten eines zur Gattung Bacillus gehörenden Mikroorganismus, der in der Lage ist, eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N zu bilden, nämlich Bacillus sp. FERM BP-671, in einem Medium und Sammeln der in diesem Kulturmedium gebildeten wärmebeständigen Sarcosinoxidase N.

In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 den optimalen pH des erfindungsgemäßen Enzyms;

Fig. 2 gibt den optimalen Temperaturbereich des Enyms gemäß der Erfindung wieder;

Fig. 3 zeigt die Wärmestabilität des erfindungsgemäßen Enzyms, und

Fig. 4 gibt die pH-Stabilität des Enzyms gemäß der Erfindung wieder.

Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Enzyms (wärmebeständige Sarcosinoxidase N), wenn dieses gereinigt ist, werden nachfolgend näher beschrieben.

(1) Aktivität

Das erfindungsgemäße Enzym katalysiert die folgende enzymatische Reaktion, bei welcher Sarcosin unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid oxidativ zersetzt wird:

Sarcosin + H₂O + O₂ → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂.

(2) Substratspezifität

Die Substratspezifität des vorliegenden Enzyms wurde unter den folgenden Reaktionsbedingungen untersucht.

Zu 0,5 ml einer 0,2-M-Substratlösung, 0,1 ml einer 0,3-M- Phosphatpufferlösung von pH 7,7, 0,1 ml einer 0,2%igen 2,4-Dichlorphenolsulfonat-Lösung, 0,1 ml einer 4-Aminotipyrin (70 mg/dl)-Lösung und 0,1 ml einer Peroxidase (70 Einheiten/ml)-Lösung wurden 0,1 ml einer Lösung zugegeben, welche 17 Einheiten/ml (sofern dies erforderlich war, erfolgte eine entsprechende Verdünnung mit einer 0,3-M-Phosphatpufferlösung von pH 7,7) des vorliegenden Enzyms (wärmebeständige Sarcosinoxidase N) zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 2 ml 0,5- N-Essigsäure gestoppt. Die Extinktion des Reaktionsgemisches wurde bei 510 nm gemessen, wobei als Kontrolle das gleiche Reaktionsgemisch mit der Reaktionszeit 0 eingesetzt wurde. Die relative Aktivität für ein Substrat wurde ausgedrückt als Prozent der Extinktion bei 510 nm, wenn das Substrat bei 510 nm der vorstehenden Enzymreaktion unterworfen wurde, bezogen auf N-Methylglycin (Sarcosin), welches der gleichen Enzymreaktion unterworfen wurde.

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt einen K _m-Wert (Michaelis-Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einen pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung).

(3) Optimaler pH

Der optimale pH des erfindungsgemäßen Enzyms liegt bei 6,7 bis 10,0 wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird. Dies ist Fig. 1 zu entnehmen. In Fig. 1 bedeuten:
○ ○ PIPES-Pufferlösung (pH 6,0 bis 6,7);
⚫-⚫ eine 2,2-Dimethylglutarat-Pufferlösung (pH 6,0 bis 7,0);
∆-∆ eine Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0 bis 8,5);
▲-▲ eine Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5 bis 9,0);
- eine Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,0); und
× × eine Glycin-NaCl-NaOH-Pufferlösung (pH 10,0 bis 12,0).

(4) Enzymbestimmung

Erstes Verfahren: Sarcosin wird durch Einwirkung des erfindungsgemäßen Enzyms oxidativ zersetzt und das erhaltene Formaldehyd kolorimetrisch bestimmt.

Zu 0,3 ml einer 0,2-M-Sarcosinlösung wurden 0,1 ml einer 0,3-M-Phosphatpufferlösung (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung, welche eine geeignete Konzentration des erfindungsgemäßen Enzyms enthielt, gegeben. Das Ganze wurde 10 Minuten bei 37°C umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 ml einer 1,0-N-Essigsäurelösung gestoppt. Es wurden 3 ml eines Farbreagens (pH 6,5), welches 0,02% (V/V) Acetylaceton und 10% (G/V) Diammoniumhydrogenphosphat enthielt, zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 40 Minuten bei 37°C zur Farbentwicklung stehen gelassen. Die Extinktion der erhaltenen Färbung wurde bei 410 nm unter Verwendung eines fotoelektrischen Fotometers gemessen.

Unter Verwendung einer Kalibrationskurve zwischen Menge Formaldehyd und Extinktion, die vorweg aufgestellt worden war, wurde die zur vorstehend bestimmten Extinktion gehörige Menge Formaldehyd erhalten. Aus dieser Menge wurde die Menge des erfindungsgemäßen Enzyms berechnet, die zur Bildung von 1 µMol Formaldehyd pro Minute bei 37°C erforderlich ist. Diese Menge des erfindungsgemäßen Enzyms wurde als eine Einheit bezeichnet.

Zweites Verfahren: Sarcosin wird unter Einwirkung des erfindungsgemäßen Enzyms oxidativ zersetzt und das erhaltene Wasserstoffperoxid (H₂O₂) kolorimetrisch bestimmt.

0,1 ml einer Lösung, welche eine geeignete Konzentration des erfindungsgemäßen Enzyms enthielt, wurde zu einem Gemisch aus 0,5 ml einer 0,2-M-Sarcosinlösung, 0,1 ml einer 0,3-M- Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), 0,1 ml einer 0,2%igen 2,4-Dichlorphenolsulfonat-Lösung, 0,1 ml einer 70-mg/100-ml- 4-Aminoantipyrin-Lösung und 0,1 ml einer 70 Einheiten/ml enthaltenden Peroxidase-Lösung gegeben. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von 2 ml 0,5-N- Essigsäurelösung wurde die Reaktion gestoppt. Die Extinktion der erhaltenen Färbung bei 510 nm wurde unter Verwendung eines fotoelektrischen Fotometers gemessen.

Unter Verwendung einer Kalibrationskurve Wasserstoffperoxidmenge/Extinktion, die vorher aufgestellt worden war, wurde die der erhaltenen Extinktion entsprechende Menge an Wasserstoffperoxid ermittelt. Aus dieser Menge wurde die Menge an erfindungsgemäßem Enzym berechnet, die zur Bildung von 1 µMol Wasserstoffperoxid pro Minute bei 37°C erforderlich ist. Diese Menge des erfindungsgemäßen Enzyms wurde als eine Einheit definiert.

(5) Optimaler Temperaturbereich

Der optimale Temperaturbereich des erfindungsgemäßen Enzyms liegt bei 45°C bis 60°C, wie dies aus Fig. 2 hervorgeht.

(6) Wärmestabilität

0,1 ml einer 0,3-M-Phosphat-Pufferlösung (pH 7,7), welche 0,1 Einheiten des erfindungsgemäßen Enzyms enthielt, wurde 10 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen belassen und dann jeweils die verbleibenden enzymatischen Aktivitäten bestimmt. Die Ergebnisse sind Fig. 3 zu entnehmen. Aus Fig. 3 ist klar zu ersehen, daß das erfindungsgemäße, gereinigte Enzym selbst nach Inkubation bei 60°C eine Restaktivität von 75% aufwies. Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms nahm nach einer Behandlung bei 50°C für 30 Minuten überhaupt nicht ab. Nach einer 10minütigen Behandlung bei 55°C behielt das Enzym 98% seiner Aktivität.

(7) pH-Stabilität

0,5 ml einer jeden Pufferlösung, welche 0,19 Einheiten des erfindungsgemäßen Enzyms enthielt, wurden 48 Stunden bei 5°C stehen gelassen und dann die verbleibende enzymatische Aktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Fig. 4 ist zu entnehmen, daß das erfindungsgemäße Enzym im pH-Bereich von 6,5 bis 11,5 stabil ist. In Fig. 4 bedeuten:
○-○ eine PIPES-Pufferlösung (pH 6,0 bis 6,7);
⚫-⚫ eine Phosphat-Pufferlösung (pH 6,0 bis 8,5);
∆-∆ eine Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0 bis 9,0);
▲-▲ eine Glycin-NaOH-Pufferlösung (pH 9,0 bis 10,0); und
- eine Glycin-NaCl-NaOH-Pufferlösung (pH 10,0 bis 12,0).

(8) Inhibierung, Aktivierung und Stabilisierung

Das erfindungsgemäße Enzym wird jeweils durch 2 mM Cu²⁺, Zn²⁺, Ag⁺, Hg²⁺, Monojodessigsäure, Kaliumcyanid und N-Ethylmaleimid stark inhibiert.

Es gibt keinen speziellen Aktivator oder Stabilisator.

(9) Reinigung

Das erfindungsgemäße Enzym kann nach einem Reinigungsverfahren gereinigt werden, wie es später beschrieben wird.

(10) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms wurde mittels einem Säulen-Gel-Filtrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150 (hergestellt von Pharmacia Co., Schweden) in Übereinstimmung mit dem Verfahren von Andrews (P. Andrews, Biochem. J., 96, 595 [1965]) bestimmt. Dabei zeigte sich, das das erfindungsgemäße Enzym ein Molekulargewicht von 49 000 in einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung, welche 0,1-M- Natriumchlorid enthielt, besitzt.

(11) Isoelektrischer Punkt

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt einen isoelektrischen Punkt (pI) von 5,30, bestimmt mit Hilfe der Discelektrophorese-Methode.

(12) Discelektrophorese

Das erfindungsgemäße Enzym wurde einer Discelektrophorese (3 mA/Gel, 5°C, 65 Minuten [Migrationszeit des Trenngels]) unter Verwendung eines Gels von pH 9,4 gemäß Davis (B. J. Davis, Ann. New York Acad. Sci., 121, 404 [1964]) unterworfen und dann mit Coomassie Brilliant Blau G-250 angefärbt. Es zeigte sich eine einzige Bande in einer Entfernung von 3,9 cm vom Ausgangspunkt gegen die Anode (Bromphenol-Blau wanderte 4,0 cm), wenn der Acrylamidgehalt in dem Gel 7,5% betrug. Wenn der Acrylamidgehalt 15% betrug, konnte man eine einzige Bande in einer Entfernung von 1,3 cm vom Ausgangspunkt in Richtung auf die Anode beobachten.

(13) Flavinenzym

Das erfindungsgemäße Enzym ist gelb; ein Mol des Enzymproteins enthält 1 Mol Flavin-adenin-dinucleotid (FAD), welches kovalent an das genannte Enzymprotein gebunden ist.

Das erfindungsgemäße Enzym mit den vorstehend genannten physikalisch-chemischen Eigenschaften wird in Tabelle 1 mit konventionellen Sarcosinoxidasen verglichen.

Tabelle 1

Wie vorstehend erwähnt, unterscheidet sich das erfindungsgemäße Enzym von sämtlichen bekannten Sarcosinoxidasen in der Enzymchemie und den physikalisch-chemischen Eigenschaften, und insbesondere dadurch, daß es im Vergleich zu konventionellen Sarcosinoxidasen eine sehr hohe Wärmestabilität besitzt. Das erfindungsgemäße Enzym wird daher bei Verwendung bei hohen Temperaturen nicht inaktiviert, was vorteilhaft ist. Bei der Reinigung des erfindungsgemäßen Enzyms im großen Maßstab können außerdem andere, begleitende Enzyme (z. B. Katalase, die H₂O₂ zersetzt) vollständig inaktiviert werden, wodurch das erfindungsgemäße Enzym in einfacher Weise in einer hohen Reinheit erhalten wird.

Das erfindungsgemäße Enzym besitzt außerdem selbst unter leicht sauren Bedingungen eine ausreichende enzymatische Aktivität, was bei konventionellen Sarcosinoxidasen nicht der Fall ist. Dies ist besonders dann von Vorteil, wenn ein hochempfindliches Farbreagens, das die Bestimmung einer kleinen Menge Creatinin oder Creatin erlaubt, verwendet wird. Der Grund hierfür ist folgender: Das genannte Farbreagens, welches im langwelligen Bereich (600 bis 750 nm) ein Extinktionsmaximum besitzt, entwickelt eine Färbung hoher Empfindlichkeit, ist jedoch bei pH 7,2 oder darüber instabil; der optimale pH der verwendeten Peroxidase in den gekoppelten Reaktionen zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin liegt um 6,5; somit ist es erforderlich, die Enzymreaktion zur Bestimmung von Creatinin oder Creatin bei pH 6,5 bis 7,2 auszuführen; im Hinblick darauf ist das erfindungsgemäße Enzym weit besser geeignet als irgendwelche konventionellen Enzyme.

Im folgenden wird das Verfahren zur Herstellung wärmebeständiger Sarcosinoxidase N gemäß der Erfindung beschrieben.

Der gemäß der Erfindung verwendete Mikroorganismus stellt einen Stamm dar, der zur Gattung Bacillus gehört und in der Lage ist, die erfindungsgemäße neue Sarcosinoxidase N zu produzieren. Es ist der Stamm Bacillus sp. NS-129. Bacillus sp. NS-129 ist ein Stamm, der von den Erfindern aus der Erde isoliert wurde und die folgenden taxonomischen Eigenschaften besitzt.

(a) Morphologie

Mikroskopische Beobachtung beim Züchten bei 30°C für 1 bis 3 Tage in einem Bouillon-Agar-Medium.

(1) Größe der Zellen: Bacillus mit 1,3-1,9 × 3,8 -6,4 µm.
(2) Polymorphismus der Zellen: keiner.
(3) Motilität: Peritriktische Lokomotion.
(4) Spore: Bildet Endosporen in 2 bis 3 Tagen im Mittelpunkt oder nahe dem Rand der Zelle. Die Gestalt der Sporen ist elliptisch. Ihre Größe ist 1,5 × 2,3 µm. Die Zellen sind von den Sporen gequollen.
(5) Gram-Färbung: Positiv.
(6) Säurefeste Färbung: Negativ.

(b) Wachstum in verschiedenen Medien

(1) Bouillon-Agar-Plattenkultur: Bildung leicht grau-brauner Kolonien nach 24 h bei 30°C. Diese Kolonien haben eine glatte Oberfläche und einen matten Glanz und sind opak. Keine Pigmentbildung.
(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur: Gutes Wachstum. Ebenso wie in (1).
(3) Bouillon-Flüssigkultur: In stationärer Kultur ist das Wachstum schlecht; die gezüchteten Bakterienzellen präzipitieren.
(4) Bouillon-Gelatine-Stichkultur: Selbst beim Züchten bei 25°C oder 30°C erfolgt keine Verflüssigung. Das Bakterium wächst auch in Schüttelkultur, es tritt jedoch keine Verflüssigung auf.
(5) Lakmusmilch: Keine Veränderung.

(c) Physiologische Eigenschaften

(1) Nitratreduktion: positiv
(2) Denitrifikationsreaktion: negativ
(3) MP-Test: negativ
(4) VP-Test: negativ
(5) Indol-Bildung: negativ
(6) Schwefelwasserstoffbildung: positiv
(7) Stärkehydrolyse: negativ
(8) Kasein-Hydrolyse: negativ
(9) Zersetzung von Harnsäure (Produktion von Urikase): negativ
(10) Zersetzung von Tyrosin: negativ
(11) Hydrolyse von Cellulose: negativ
(12) Verwertung von Citronensäure: negativ im Simons-Medium und positiv im Christensen-Medium
(13) Verwertung von anorganischem Stickstoff: Verwertet Ammoniak, jedoch schwach. Verwertet Nitrate kaum.
(14) Urease: negativ
(15) Oxidase: positiv
(16) Katalase: positiv
(17) Pigmentbildung: negativ
(18) Salzresistenz: wächst bis zu 5% NaCl
(19) Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob
(20) Wachstumsbereiche: der pH-Bereich für das Wachstum beträgt 6,0 bis 9,0. Der Temperaturbereich für das Wachstum liegt zwischen 25° und 45°C.
(21) Extinktionstemperatur: keine Extinktion bei einer Behandlung bei 80°C für 30 Minuten. Vollständige Extinktion bei einer Behandlung bei 85°C für 30 Minuten.
(22) O-F-Test: keine Reaktion. Keine Veränderung in einem Agarmedium, welches Glycerin oder Glucose verwendet. In einer aeroben Schüttelkultur wächst das Bakterium in einem Pepton-Hefeextrakt-Medium gut, jedoch keine Säurebildung.
(23) Bildung von Säuren und Basen aus Sacchariden: Die Säurebildung wurde in einer stationären Kultur wie auch in einer Schüttelkultur untersucht. Die Gasbildung wurde in einer stationären Kultur untersucht. Es ergab sich, daß weder Säure noch Gas aus den folgenden eingesetzten Sacchariden gebildet wurde: Inosit, D-Galactose, D-Mannose, D-Ribose, Trehalose, L-Arabinose, D-Xylose, Erythrit, L-Rhamnose, Mannit, Saccharose, Maltose, Fructose, Lactose, D-Arabinose, L-Sorbose, L-Rhamnose, Dextrin, Sorbit, D-(+)-Raffinose, Salicin, Inulin, D-(+)-Melibiose, Glycerin, Glucose, Cellobiose, Melezitose, Xylit.

(d) Weitere Eigenschaften

Die Bakterien wachsen gut in einem Medium, welches Vitamin-freie-Casaminsäure, Kaliumphosphat und MgSO₄ · 7 H₂O enthält.

Wenn man die taxonomischen Eigenschaften des erfindungsgemäß eingesetzten Stammes mit der Klassifizierung in Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Ausgabe (1974), vergleicht, so wird man folgern, daß er der Gattung Bacillus angehört, da er einen Bacillus mit einer positiven Gram-Färbung darstellt und aerobe Endosporen bildet; außerdem folgert man, daß der vorliegende Stamm entweder von Bacillus firmus, Bacillus brevis, Bacillus fastidiosus, Bacillus freudenreichii, Bacillus badius, etc. herrührt, da die von dem Stamm gebildeten Sporen elliptisch bis oval sind und um das Zentrum der Bakterienzelle lokalisiert sind, und der Stamm weder Säure noch Gas aus Glucose bildet, kein Acetoin bildet, sehr aerob ist und bei 3°C nicht wächst. Da jedoch Bacillus oxidativ aus Glucose Säuren bildet und Biotin erfordert, Bacillus fastidiosus Harnsäure kräftig zersetzt und alkalisch wird, und salpetrige Säure nicht reduziert, Bacillus freudenreichii Harnstoff verwertet und alkalisch wird, und Bacillus badius wurzelförmige oder wollartige Kolonien in seinem Wachstum ausbildet, unterscheidet sich der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm von diesen Bacilli. Er gleicht am ehesten Bacillus brevis in seinen Eigenschaften, unterscheidet sich jedoch von demselben durch Hydrolyse von Tyrosin und Wachstum in 5%iger NaCl. Aus diesem Grunde wurde der erfindungsgemäß eingesetzte Stamm als Bacillus sp. NS-129 bezeichnet. Mit Wirkung von 3. Dezember 1984 wurde Bacillus sp. NS-129 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, in Übereinstimmung mit dem Budapester Vertrag zur internationalen Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Patentzwecke hinterlegt; er erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-671.

Das gemäß der Erfindung verwendete Kulturmedium kann jedes beliebige synthetische oder natürliche Medium darstellen, so lange es eine geeignete Kombination einer Kohlenstoffquelle, einer Stickstoffquelle, anorganischer Salze und anderer Nährstoffe enthält. Als Kohlenstoffquelle kann z. B. verwendet werden: Creatinin, Creatin, Sarcosin, Citronensäure und Fettsäuren. Als Stickstoffquelle können vorzugsweise z. B. verwendet werden: Substanzen vom Proteintyp und deren Abbauprodukte, wie Pepton, Casein-Digest und Sojabohnenpulver, sowie auch stickstoffhaltige organische Substanzen, wie z. B. Hefeextrakt. Als anorganische Salze können z. B. verwendet werden: Salze von Natrium, Kalium, Mangan, Magnesium, Calcium, Eisen, Kobalt und dergleichen.

Gemäß der Erfindung kann wärmebeständige Sarcosinoxidase N in höchster Ausbeute erhalten werden, wenn der vorliegende Stamm in einem creatinin-, creatin- oder sarcosinhaltigen Medium gezüchtet wird. Als bevorzugtes Beispiel eines solchen Kulturmediums ist z. B. zu nennen: ein Medium von pH 6,5, welches 0,8% Sarcosin, 0,8% Hefeextrakt, 2% Polypepton, 0,05% Kaliumbiphosphat, 0,05% Kaliumdiphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat und 0,005% Eisensulfat enthält.

Das Züchten des Stammes wird üblicherweise bei 25° bis 40°C durchgeführt, vorzugsweise bei oder um 30°C. Der Ausgangs-pH des Kulturmediums beträgt gewöhnlich 6 bis 8, vorzugsweise um 6,5. Beim Durchführen einer Schüttelkultur oder einer Submers-Rührkultur für 16 bis 24 h unter den entsprechenden Bedingungen wird die erfindungsgemäße Sarcosinoxidase N gebildet und in effizienter Weise in dem Kulturmedium akkumuliert.

Gelegentlich führen lange Kultivierungszeiten zu einer Bakteriolyse des Stammes, wodurch sich eine Produktion des Enzyms außerhalb der Zellen ergibt. Üblicherweise befindet sich jedoch das Enzym innerhalb der Zellen. Aus diesem Grunde unterwirft man das Kulturmedium einer Zentrifugation, Filtration oder dergleichen, um die Bakterienzellen zu sammeln. Die gesammelten Zellen werden in einer geeigneten Menge einer Pufferlösung zerstört, und zwar mittels der Ultraschall-Methode, einer Methode unter Verwendung eines bakteriologischen Enzyms, einer chemischen Selbst-Abbau-Methode oder irgendeiner anderen geeigneten Methode, wobei das Enzym in Lösung geht. Aus der so erhaltenen enzymhaltigen Lösung entfernt man Nucleinsäure und Zellwände mit Hilfe eines üblichen Verfahrens. Unlösliches wird durch Filtration oder Zentrifugation entfernt, wobei die erfindungsgemäße wärmebeständige Sarcosinoxidase N erhalten wird.

Das erhaltene Enzym wird, sofern dies erforderlich ist, einem üblichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Enzymen unterworfen. Zum Beispiel durch:

(1) Säulenchromatografie unter Verwendung von DEAE-Cellulose,
(2) Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat,
(3) Säulenchromatografie mittels QAE-Sephadex,
(4) hydrophober Chromatografie mittels TSK-Gel Butyl Toyo Pearl 650C,
(5) Gelfiltration mittels Sephadex oder
(6) einer geeigneten Kombination derselben, wodurch das Enzym in gereinigter Form erhalten werden kann.

Ein Beispiel zur Reinigung des Enzyms wird nachfolgend beschrieben.

Die aus dem Kulturmedium gesammelten Bakterienzellen werden in einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0 suspendiert. Dazu wird ein Lysozym in einem Anteil von 50 mg/l gegeben und die Bakteriolyse 30 Minuten bei 37°C durchgeführt. Dann gibt man hierzu ein Agens zur Entfernung von Nucleinsäuren, wie z. B. Magnesiumsulfat, Polyethylimin, Protaminsulfat, Streptomycin oder dergleichen. Der gebildete Niederschlag wird durch Cellulosefiltration entfernt. Die erhaltene Enzymlösung wird 1 bis 2 h bei 50°C behandelt; daraufhin wird die Lösung erneut einer Cellulosefiltration unterworfen. Das Filtrat läßt man an QAE-Sephadex A-50 (gepackt in einer Säule) adsorbieren, welches vorher mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0 gepuffert worden war; wäscht mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0, welche 0,1 M Natriumchlorid enthält, und führt dann eine Eluierung mittels Konzentrationsgradient unter Verwendung von 0,1- bis 0,6-M-NaCl-Lösungen durch. Die eluierten aktiven Fraktionen werden vereinigt. In diesem Eluat löst man Ammoniumsulfat in einem Anteil von 20 g/100 ml auf. Die erhaltene Lösung adsorbiert man an TSK-Gel Butyl-Toyo Pearl 650C, gepackt in einer Säule, welche vorher mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0, welche 20% Ammoniumsulfat enthielt, gepuffert worden war, wäscht mit der gleichen Pufferlösung und eluiert dann unter Verwendung von 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0, welche 10%iges Ammoniumsulfat enthält, wobei ein gelbes Enzym eluiert wird. Diese aktive Fraktion unterwirft man einer Säulenchromatografie mittels Sephadex G-150, welches vorher mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung von pH 8,0, welcher 0,1 M NaCl enthielt, gepuffert worden war, wobei man eine Fraktion erhält, die das Enzym enthält. Die Fraktion wird konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man das Enzym als gereinigtes Enzympulver erhält.

Die vorliegende Erfindung stellt eine wärmebeständige Sarcosinoxidase N zur Verfügung, die als diagnostisches Enzym zur Bestimmung von Nierenstörungen, Muskelstörungen, etc. sehr geeignet ist. Außerdem wird ein Verfahren zur effizienten Herstellung dieses Enzyms geschaffen.

Beispiel

Bacillus sp. NS-129 (FERM BP-671) wurde in 100 ml eines Bouillon-Mediums, welches sich in einem 500-ml- Erlenmeyer-Kolben befand, inokuliert; die Kultivierung erfolgte 16 h bei 30°C. Das erhaltene Impfkulturmedium wurde in 200 ml eines Mediums von pH 6,5 inokuliert, welches enthielt: 0,8% Sarcosin, 2% eines Polypeptons, 8% Hefeextrakt, 0,05% Kaliumbiphosphat, 0,05% Dikaliumphosphat, 0,01% Magnesiumsulfat und 0,005% Eisensulfat; die Kultur befand sich in einem Fermenter mit einem 30-Liter-Kolben. Die Kultivierung erfolgte 18 h bei 30°C unter folgenden Bedingungen: Luftströmung 20 l/Min., Rühren bei 350 UpM. Das erhaltene Kulturmedium wurde zum Sammeln der Bakterienzellen zentrifugiert.

Zu einem Teil (110 g) dieser Bakterienzellen wurden 1,5 l einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0) zugegeben und die Zellen gründlich in der Lösung dispergiert. Dazu wurden 100 mg Lysozym, das aus Eiweiß erhalten worden war, gegeben und die Bakteriolyse 1 h bei 37°C durchgeführt; daraufhin wurde 2 h auf 50°C erwärmt, um andere begleitende Proteine zu denaturieren. Daraufhin wurde eine gesättigte Lösung (pH 7,5) Protaminsulfat zugegeben, bis sich kein Niederschlag mehr bildete. Nacheinander wurden 5 g Cellulosepulver zugegeben und, nach gründlichem Rühren, wurde das Gemisch durch ein Filterpapier filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde auf eine QAE-Sephadex-A-50-Säule 3 cm Durchmesser × 50 cm), welche vorher mit einer 0,01-M- Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0)) welche 0,05 M NaCl enthielt, gepuffert worden war, gegeben. Gründliches Waschen erfolgte mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,1 M NaCl enthielt. Daraufhin wurde das Enzym mit einem linearen NaCl-Gradienten von 0,1 bis 0,5 M eluiert. In den aktiven Fraktionen des Eluats wurde Ammoniumsulfat in einem Anteil von 20 g/100 l aufgelöst. Diese Lösung wurde an TSK-Gel Butyl-Toyo Pearl 650C, gepackt in einer Säule (3 cm Durchmesser × 10 cm), welche vorher mit 0,01 M Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welcher 20% Ammoniumsulfat enthielt, gepuffert worden war, adsorbiert, mit der gleichen, ammoniumsulfathaltigen Pufferlösung gewaschen und dann mit 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung, welche 10% Ammoniumsulfat enthielt, eluiert. Die erhaltenen aktiven Fraktionen wurden mittels einer Ultra-Filtrations-Vorrichtung (Fraktionierungsmembran 10 000) konzentriert. Das Konzentrat wurde einer Gelfiltration mittels Sephadex G-150, gepackt in einer Säule (1,2 cm Durchmesser × 100 cm), welche vorher mit einer 0,01-M-Phosphat-Pufferlösung (pH 8,0), welche 0,1 M NaCl enthielt, gepuffert worden war, unterworfen. Die erhaltene aktive Fraktion wurde auf ca. 3 ml mittels einer Ultra-Filtrations-Vorrichtung konzentriert und dann gefriergetrocknet, wobei 90,9 mg eines gereinigten gelben Enzympulvers erhalten wurde. Dieses wies eine relative Aktivität von 30,1 Einheiten/mg auf; die Ausbeute betrug 17,1%.

Claims

1. Wärmebeständige Sarcosinoxidase N, gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften:

(a) Aktivität
Sarcosinoxidase N katalysiert die folgende Enzymreaktion, bei welcher Sarcosin oxidativ unter Bildung von Glycin, Formaldehyd und Wasserstoffperoxid zersetzt wird: Sarcosin + H₂O + O₂ → Glycin + Formaldehyd + H₂O₂;
(b) Substratspezifität
Sarcosinoxidase N besitzt einen K _m-Wert (Michaelis- Konstante) für Sarcosin von 4,7 mM bei 37°C und einem pH von 7,7 (Phosphatpufferlösung);
(c) pH-Optimum und stabiler pH-Bereich
der optimale pH von Sarcosinoxidase N liegt bei 6,7 bis 10,0, wenn Sarcosin als Substrat verwendet wird; der stabile pH-Bereich reicht von 6,5 bis 11,5;
(d) optimaler Temperaturbereich
45 bis 60°C gemäß Fig. 2, die Bestandteil dieses Anspruches ist;
(e) Wärmestabilität
Sarcosinoxidase N behält nach 10minütigem Behandeln bei 55°C zu 98% und nach 10minütigem Behandeln bei 60°C zu 75% ihre enzymatische Aktivität bei;
(f) Molekulargewicht
ca. 49 000 bei Bestimmung nach der Gelfiltrationsmethode unter Verwendung von Sephadex G-150;
(g) Flavinenzymprotein
Sarcosinoxidase N enthält 1 Mol kovalent gebundenes Flavin-adenin-dinucleotid (FAD) pro Mol Enzym.

2. Verfahren zur Herstellung der wärmebeständigen Sarcosinoxidase N des Anspruchs 1, gekennzeichnet durch Kultivieren von Bacillus sp. FERM BP-671 in einem Medium und Sammeln der in dem Kulturmedium gebildeten Sarcosinoxidase N.

3. Verwendung der Sarcosinoxidase N des Anspruchs 1 zur enzymatischen Bestimmung von Creatinin oder Creatin.