DE2659878C3

DE2659878C3 - Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase

Info

Publication number: DE2659878C3
Application number: DE19762659878
Authority: DE
Inventors: Narimasa Noda Saito
Original assignee: Noda Institute for Scientific Research
Current assignee: Noda Institute for Scientific Research
Priority date: 1975-04-05
Filing date: 1976-04-01
Publication date: 1981-07-02
Also published as: DE2659878B2; JPS51118884A; DE2659878A1; JPS528395B2

Description

35

Temperatur von 25 bis 37° C durchführt

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Kultivierung während 10 bis 48 Stunden durchführt

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Kultivierung durch Inokulierung eines der beiden Bakterienstämme in ein Nährmedium durchführt, welches zuvor mit Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man Kreatinin, Kreatin oder ein Gemisch hiervon zu dem Nährmedium zu einer Zeit zugibt die nicht später als 5 Stunden nach Beginn der Kultivierung durch Inokulierung eines der beiden Bakterienstämme in das Nährmedium liegt

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man Kreatinamidinohydrolase in Form einer Rohenzymlösung durch Abtrennung und Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Kultivierungslösung oder in Form eines rohen Enzympulvers durch weitere Lyophilisierung der Rohenzymlösung gewinnt

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet daß man die Rohenzymlösung oder das Rohenzympulver zu reiner Kreatinamidinohydrolase reinigt

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet daß man die Reinigung durch die Adsorptions-Elutionsmethodik unter Verwendung eines Ionenaustauschermaterials durchführt

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung Kreatinamidinohydrolase zu erzeugen,

von Kreatinamidinohydrolase hoher Wirksamkeit unter 40 Kreatinamidinohydrolase stellt ein Enzym dar.

Verwendung eines Stammes, der zu der Gattung welches als Katalysator in der folgenden Reaktion Flavobacterium gehörig ist und die Fähigkeit aufweist teilnimmt:

ν .- ,,n Kreatinamidinohydrolase „ _ _ , . Kreatin + H₂O - » Harnstoff + Sarkosin

Derzeit wird in der klinischen Medizin die Diagnose von Muskel· und Nierenerkrankungen durch Bestimmung des Kreatins vorgenommen, welches im Serum und Urin vorliegt

Derzeit wird die Kreatinbestimmung üblicherweise durch Analyse von Kreatinin mit Hilfe der nicht enzymaiischen Jaffe-Reaktion auf Grundlage der charakteristischen Eigenschaft von Kreatin vorgenommen, daß Kreatin bei Erhitzung in saurem Medium eine SS Dehydratisierung zu Kreatinin erfährt.

Die vorstehend erwähnte Methodik der Bestimmung von Kreatin ist dadurch nachteilig, daß die Jaffe-Reaktion nicht spezifisch ist, und daß das Serum und der Urin eine erhebliche Menge anderer Substanzen enthält; die «» das Versuchsergebnis fehlerhaft gestalten können und hierdurch die Zuverlässigkeit des Meßergebnisses beeinträchtigen. Es ist daher wünschenswert, ein Verfahren der enzymatischen Bestimmung von Kreatin unter Verwendung eines Enzyms zu entwickeln, welches Kreatin spezifisch zersetzen kann.

Es ist bekannt, daß Enzyme mit der Fähigkeit der Zersetzung von Kreatin in Mikroorganismen vorliegen, die zu der Gattung Pseudomonas (Journal of General Microbiology, Band 14, S. 351 [1957], Gattung Arthrobacter (Molecular und Cellttb/ Biochemisty, Band 3, S. 9,1974) und Gattung Alcaligenes (US-Patentschriften 38 06 416 und 38 06 420) zugehörig sind.

Jedoch ist die Verwendung von Kreatin-zersetzenden Enzymen, die aus den vorstehend erwähnten Mikroorganismen gewonnen werden, nachteilig, da diese im allgemeinen gegenüber Umwelteinflüssen, wie Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff und dergleichen, labil sind und weiter, weil sie alle in Mikroorganismen aufgefunden werden, so daß ihre Gewinnung ein Zweistufenverfahren erfordert Dieses Zweistufenverfahren umfaßt einerseits eine Stufe des Anwachsens und der Kultivierung von Mikroorganismen und andererseits eine Stufe der Gewinnung der kultivierten Bakterien und der Extraktion der Enzyme aus den Zellen durch Vermahlung, chemische oder enzymatische Aufarbeitung, wodurch das Reinigungsverfahren ziemlich kompliziert gestaltet und die Produktausbeute verringert wird.

Angesichts dieses Sachverhaltes wurde eine umfang-

reiche Suche nach Stämmen durchgeführt, die zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolase in hoher Ausbeute befähigt sind. Als Ergebnis wurde gefunden, daß die Kultivierung von Mikroorganismen, die induktive Produktion von Enzym und die Anreicherung des Enzyms in der Kulturlösung gleichzeitig erreicht werden kann, und deshalb Kreatinamidinohydrolase in hohen Ausbeuten in nur einer Stufe ohne Extraktion der Enzyme aus den kultivierten Zellen dadurch gewonnen werden können, daß man einen Stamm, der zu der Gattung Flavobacterium gehörig ist, in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon kultiviert. Die Erfindung baut auf dieser Erkenntnis auf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase zu schaffen.

Die Erfindung ist in den Ansprüchen definiert

Das Enzym kann isoliert werden, indem man es auf eine DiäthyJaminoäthylcellulosesäule, die zuvor mit einer 0,05 m Phospjiat-Pufferlösung (pH 8,0) equilibriert worden ist, aufbringt, wobei Kreatinamidinohydrolase hindurchtritt und aus dem unadsorbierten Teil gewonnen wird.

Flavobacterium U-188, auf das vorstehend Bezug genommen worden ist (nachstehend Stamm U-188 genannt), stellt einen Stamm dar, der irs Humuserde neu gefunden wurde. Seine bakteriologischen Eigenschaften sind nachstehend aufgeführt Die Beschreibung der bakteriologischen Eigenschaften wird gemäß der Weise des »Manual of Microbiological Methods« (1957 durch McGraw-Hill-Book ,Company, Inc. veröffentlicht) vorgenommen.

a Morphologie

Mikroskopische Beobachtungen (kultiviert in einem Bouillon- Agar-Medium bei 30° C während 48 Stunden)

(1) Form und Größe der Zellen:

Stäbchen einer Größe von 0,5 bis 0,7 χ 1,5 bis 1,7 μ (Micron).

(2) Polymorphisms der Zelle:

Während des Lebenszyklus kann kein Polymorphismus beobachtet werden, und die Zellen treten allein oder zu zweit auf.

(3) Motilität:

Motil, mit Hilfe von 3 bis 7 Peritrichous Flagella.

(4) Sporen: Es bildet keine Sporen aus.

(5) Gram-Färbung: Negativ.

(6) Säurefestigkeit: Negativ.

b Wachstumszustand in verschiedenen
Nährlösungen:

(1) Boullion-Agar-Plattenkultur (2 Tage bei 30" C).
Die kreisförmigen Kolonien sind uneben, konvex, mit gewelltem Rand, schwachocker; Durchmesser von 2 bis 3 mm.

(2) Bouillon-Agar-Schrägkultur (2 Tage bei 30⁰C).
Gutes Wachstum, Ausbreitung, matter Glanz, Erzeugung eines wasserunlöslichen gelbbraunen Pigmentes.

(3) Eingetauchte Bouillon-Kultur (1 Tag bei 30° C).
Mcnibranigc Pellikeln mit schwerem Sediment.

(4) Bouillon-Gelatine-Stabkultur (1 bis 40 Tage bei 20⁰C).

Gutes Wachstum auf der Oberfläche und in der oberen Schicht, keine Verflüssigung.

(5) Uekmusmilch (t bis l4Tage bei30^pC),
Unverändert (pH 6,8), Keine Reduktion des Lackmus, keine Koagulation, keine Peptonisierung.

(6) Kartoffel-Kultur (2 Tage bei 30" C).
Kein sichtbares Wachstum.

c Physiologische Eigenschaften

(I) Reduktion von Nitraten: Stark festgestellt
Ό (2) Stickstoffentzugsreaktion: Nicht festgestellt

(3) MR-Versuch: Negativ.

(4) VP-Versuch: Negativ.

(5) Indolbildung: Nicht festgestellt

(6) Bildung von Schwefelwasserstoff: Nicht festgestellt

(7) Stärkehydrolyse: Nicht festgestellt

(8) Verwendung von Citronensäure: Nicht festgestellt (Koser- und Christensen-Medium werden in Kombination verwendet)

(9) Anorganische Stickstoffquelle: Nicht verwendet (Ammoniumsalze, Nitrate.)

(10) Pigmentbildung: Es wird ein wasserunlösliches, ockergefärbtes Pigment gebildet

(II) Urease: Nicht gebildet
(12) Oxidase: Gebildet

(13) Katalase: Gebildet

(14) Bedingungen des Wachstumsbereiches.
Optimale Wachstumsbedingungen: 25 bis 35° C, pH 7 bis 9, aerob.

Bedingungen, die das Wachstum erlauben: Es kann

unter aeroben bis geringfügig fakultativer anaerober Bedingung bei Temperaturen zwischen 5 und 40° C wachsen, wenngleich es bei 50° C (Bouillon-Schüttelkultur) kaum wächst Der pH-Bereich, der ein Wachstum erlaubt liegt zwischen 6 und 11. Bei Erhitzung auf 80° C während 30 Minuten wird dieses ausgelöscht

(15) Verhalten gegenüber Sauerstoff: Aerob.

(16) O-F-Versuch (nach der Hugh Lehson-Methodik): Negativ.

(17) Koagulation der Milch: Keine Milchkoagulation.

(18) Ausnutzung von Kohlenstoffquellen: Weder Säure noch Gas wird aus Kohlenstoffquellen, wie L-Arabinose, D-Glukose, D-Mannose, D-Fruktose, D-Galaktose, Maltose, Sukrose (Saccharose), Laktose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, Inosit, Glycerin, Stärke, Raffinose, Dextrin, Inulin, Glykogen. Cellulose und dergleichen gebildet

d Physiologische Charakteristika

St^mm U-188 besitzt eine hohe Aktivität zur Erzeugung von Kreatinamidinohydrolyse in Gegenwart von Kreatinin und/oder Kreatin. Im Verlauf der Kultivierungszeit wird Harnstoff gebildet und in der Kulturlösung angesammelt Das Medium wird unter Ammoniakerzeugung alkalisch. Die Erzeugung der Enzyme und die Bildung von Harnstoff und Ammoniak werden in üblichem Nährmedium, das weder Kreatinin noch Kreatin enthalt, nicht festgestellt

Durch Vergleich der vorstehend angeführten charakteristischen Eigenschaften des Stammes U-188 mit der Klassifikation, die in »Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. Aufl. (1974)«, erwähnt ist, kann festgestellt werden, daß Stamm U-188 zu der Gattung Flavobacterium zugehörig ist. Hinsichtlich der Spezies wird jedoch festgestellt, daß Stamm IJ-188 keinem der bisher bekannten bakteriellen Spezies

entspricht Daher kann Stamm U-188 aus den folgenden Gründen als neue Bakterienspezies angesehen werden: Stamm U-188 ist ein gram-negatives, aerobes, nicht sporenbildendes, stäbchenförmiges Bakterium, das ein ockergefärbtes Pigment (wasserunlöslich) in üblichem Nährmedium ausbildet Es ist mit Hilfe von Peritrichous Flagella motil. Darüber hinaus erzeugt es weder Säure noch Gas aus Kohienstoffquellen und verändert Lackmusinüch nicht Es gehört daher 2ur Gattung Flavobacterium. Es wird als analog zu Flavobacterium rigense angesehen, da es nicht aus Seewasser, sondern

Tabelle 1

aus Erde gewonnen wird, da es motil ist und bei 37° C gut wächst weil es kein NaCI erfordert und weil es Nitrate zu Nitriten reduziert

Wie in Tabelle 1 gezeigt ist gehört es jedoch zu einem unterschiedlichen Spezies von Flavobacterium rigense, weil das durch Stamm U-188 erzeugte Pigment eine Ocker-Farbe, unabhängig von den Kulturbedingungen aufweist und wasserunlöslich ist weil es Gelatine nicht verflüssigt weil es weder Säure noch Gas aus Glukose und anderen Kohlenstoffquellen erzeugt und weil es auf Kartoffel nicht wächst

Art des Stammes

Flavobacterium U-188

Flavobacterium rigense

1. Pigmentbildung

2. Wachstum bei 37°C

3. Verflüssigung auf Gelatine

4. Peptonisierung von Casein

5. Ausnutzung von Zucker
(Bildung von Säure)

Glukose
Sukrose
Maltose

6. Bildung von Schwefelwasserstoff

7. Reduktion von Nitraten

8. Wachstum auf Kartoffel

Ocker (wasserunlöslich)

gut

nicht festgestellt

nicht festgestellt nicht festgestellt nicht festgestellt festgestellt
festgestellt
nicht festgestellt anfänglich gelb, was später zu orange
umgewandelt wird (löslich)

gut

trichterförmige Verflüssigung

nicht festgestellt

festgestellt

unbekannt

nicht festgestellt

festgestellt

gut

Flavobacterium U-188 ist im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, als FERM-P Nr. 2922 und in American Type Culture Collection (USA) als ATCC 31200 hinterlegt

Das ia der Erfindung verwendete Kulturmedium ist derart zusammengesetzt daß eine oder mehrere Arten von Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt Pepton, Fleischextrakt Mais-Einweichflüssigkeit oder wäßrige Extrakte von Sojabohnen oder Weizenkleie mit einer oder mehreren Arten von anorganischem Salz, wie primärem Kaliun;phosphat sekundärem Kjliumphosphat Magnesiumsulfat Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat oder Mangansulfat und, sofern erforderlich, weiter mit einem Zucker, wie Stärke, Vitaminen und dergleichen, in geeigneter Weise eingebracht wird bzw. werden.

Bei der Erfindung wird der vorstehend erwähnte Stamm in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon kultiviert Die Kultivierung kann beispielsweise durch Inokulierung des Stammes in das vorstehend erwähnte Medium, das zuvor mit Kreatinin, Kreatin oder einem Gemisch hiervon versetzt worden ist, durchgeführt werden. In alternativer Weise kann sie auch durch Zufügung von Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon zu der Kultur innerhalb von 5 Stunden, nachdem die Kultivie* rung begonnen worden ist, nämlich nachdem der Stamm in das Medium inokuliert worden ist, durchgeführt werden.

Die Menge an Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon, die zu dem vorstehend erwähnten Kulturmedium hinzugefügt werden soll, liegt im Bereich von 0,01 bis 5,0% (Gewicht/Volumen [G/V]), vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 1,0% (G/V), bezogen auf

das Gesamtgewicht des Mediums.

Es ist wünschenswert den anfänglichen pH-Wert des Mediums auf 7 bis 9 einzustellen. Die Kultivierung wird in einem aeroben Zustand mittels dner belüfteten, bewegten Eintauchkultur oder mittels einer Schüttelkultur bei einer Temperatur zwischen 25 und 37° C, vorzugsweise etwa 30⁰C, während eines Zeitraumes von 10 bis 48 Stunden, vorzugsweise 15 bis 36 Stunden, durchgeführt Durch den vorstehend erwähnten Stamm kann die Erzeugung und Ansammlung einer großen Menge an Kreatinamidinohydrolase in der Kulturlösung mit hoher Effizienz durch eine einstufige Kultivierung erreicht werden.

Zur Gewinnung von Kreatinamidinohydrolase aus der Kulturbrühe nach der Beendigung der Kultivierung gemäß der Erfindung können herkömmliche Verfahren der Enzymgew'innung herangezogen werden.

Da das in Betracht gezogene Enzym in freier Form in der Kulturlösung vorliegt kann eine Rohflüssigkeit die aas Enzym enthält durch Entfernung der Zellen und unlöslichen Materialien aus der Ku!tivierungs)ösung erhalten werden. Die Rohflüssigkeit kann entweder direkt oder nach deren Umwandlung zu einem rohen Enzympulver mit Hilfe der Gefriertrocknung in Gebrauch genommen werden.

Kreatinamidinohydrolase wird aus der rohen Enzym' zubereitung isoliert entweder durch Adsorptions-Elutions-Methodiken mittels Ionenaustauschern, wie Diäthylaminoäthylcellulose, oder durch geeignete Kombination einiger der Gelfiltrationsmethodiken, der Adsorptions-ElutioiiJ-Methodik mittels Hydroxylapatit, und Elektrophorese-Methodik mittels Polyacrylamidgel und dergleichen. Dabei erhält man das hoch gereinigte Enzym.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften der reinen Kreatinamidinohydrolase, die durch die vorstehend erwähnten Reinigungsverfahren erhalten wurden, sind nachstehend aufgeführt:

(1) Aktions- und Substratsspezifität '

Dieses Enzym besitzt eine Fähigkeit, Kreatin zu Harnstoff und Sarkosin zu hydrolisieren. Der K_m-Wert (Michaelis-Konstante) beträgt für Kreatin 4,0x10 ² Mol (37⁰C. pH 7.7). Gegenüber Kreatinin übt es keine ι» Wirkung aus.

(2) Optimaler pH- und stabiler pH-Bereich

Der optimale pH-Wert beträgt 7,7 und der stabile pH-Bereich beträgt 5,0bis9.0. ,,

(3) Verfahren der Messung der en/ymatischen Aktivität

Zu 0.8 ml 0,1 m Kreatinlösung werden 0,1 ml 0.3 m Phosphat-Puffer (pH 7,7) und 0,1 ml einer Lösung dieses jo Enzyms, die eine geeignete Konzentration aufweist, hinzugegeben und das resultierende Gemisch wird bei 37"C während 10 Minuten umgesetzt. Sodann werden 2 ml einer 2%igen (G/V) p-Dimethylaminobenzaldehydlösung (hergestellt durch Auflösung von 2 g >·, p-Dimethylaminobenzaldehyd in 100 ml 99,5%igem Äthanol, Zugabe von 15 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und Verdünnung des Gemisches mit destilliertem Wasser auf eine zweifach größere Menge) hinzugefügt und das resultierende Gemisch wird bei κι 25°C während 30 Minuten stehengelassen. Sodann wird seine Absorption (O.D.-Wert) bei 435 Γημ mittels eines fotoelektrischen Colorimeters gemessen. Die Menge des gebildeten Harnstoffes wird durch Vergleich mit einer Kalibrierungskurve für Harnstoff, die zuvor π ermittelt wurde, abgeschätzt. Die Menge an Enzym, die erforderlich ist. um I Mikromol Harnstoff pro Minute bei 37"C zu erzeugen, wird als Einheit herangezogen.

(4) Bereich der optimalen Temperatur

Fr liegt im Bereich von 20 bis 45°C. Eine Temperatur von etwa 37° C ist besonders bevorzugt.

(5) Thermische und pH-Stabilität

Es verliert die Aktivität bei einem pH-Wert oberhalb . 10. Es verliert seine Aktivität vollständig bei 50⁰C in 10 Minuten.

(6) Inhibierung, Aktivierung und

Stabilisierung

Es wird durch p-CMB und Quecksilberschlorid inhibiert. Es wird durch Glutathion (reduzierte Form), L-Cysteinhydrochlorid und 2-Mercaptoäthanol stabilisiert.

(7) Reinigungsmethodik

Nucleinsäure und Bakterien werden aus der Kühlflüssigkeit durch Zufügung von Mangansulfat und Hyflow-Super-Cel und Filtration des resultierenden Gemisches eliminiert. Das Filtrat wird gegenüber Puffer A dialysiert, wonach die dialysierte Lösung auf eine Säule aufgebracht wird, die mit DEAE-CeHulose (DEAE= Diäthylaminoäthyl) gefüllt ist welche zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Das unadsorbierte Enzym, das eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität aufweist wird an DEAE-CeHulose adsorbiert, welches zuvor mittels des vorstehend erwähnten Puffers A eauilibriert worden ist und sodann unter Ausnutzung eines linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 0,5 m eluiert, wobei das Enzym bei einer NaCI-Konzentration von 0,1 bis 0,3 m eluiert wird. Sodann wird das Eluat konzentriert, durch eine Scpharose öBSäule geführt und mit Puffer A unter Gewinnung der Fraktion eluiert, die die Enzymaktivität aufweist. Die Fraktion wird konzentriert und lyophilisiert. wobei ein gereinigtes Enzympulver erhalten wird.

(8) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht dieses Enzyms wird durch Gelfiltration nach der Andrew's Methodik (P. Andrews, Biochem. )., 96, 595 [1965]) bestimmt. Es wird zu etwa 60 000 ermittelt. Die Säule wird mil 0,05 m Phosphatpuffer(pH 8,0) equilibriert, welcher 0.1 m NaCI und 1 Millimol 2-Mercaptoäthanol enthalt und die F.lution wird bei 5°C vorgenommen.

tiT, GczcnSuiz hierzu weisen Krs2ti"2nv^/^!P'*h^w^r^r*!^asen. die bereits früher beschrieben worden sind, beispielsweise in (i) Journal of Genral Microbiology. Band 14, S. 351 bis 365 (1956) und (ii) US-Patentschriften 38 06 416 und 38 06 420, die vorstehend erwähnt worden sind, die folgenden physikalischen und chemischen Eigenschaften auf:

K_m-Wer für Kreatin:	(i)	(i)	2,3x 10-²	m
			(30⁰CpH	7,8)
	(ü)	(')	5,OxIO-²	m
		(i)	(25° C. pH	7.6)
Relative Aktivität für Kreatin:	(ü)
	etwa 0,1 I	Einheiten/mg-
	Protein
Optimale Temperatur:	30° C
Optimaler pH;	7.8
	7.6

Darüber hinaus werden die Inhibitoreneffekte für Kreatinamidinohydrolase, die durch den Stand der Technik K«^hri«"h»»n wnrripn «ind mit fienpn der vorliegenden Erfindung nachstehend verglichen:

Inhibitor

Hndkonzentration an
Inhibitor

(m)

Prozentuale Inhibition
der Kreatinentfernung

gemäß d.
Erfindung

Stand der
Techn^

Ii)

Borat (pH 9.1)

Jodoacetat

5X

2X

10 ^:

10
10

40
0
0

80
18
20

Wie vorstehend erwähnt wurde, wird dieses Enzym angesichts seiner enzymologischen und physiko-chemischen Eigenschaften als neue Kreatinamidinohydrolase angesehen, die sich von jeder der bekannten Kreatinamidinohydrolasen unterscheidet

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter, ohne diese einzuschränken. Die Einheil der Enzymaktivität, auf die in den Beispielen Bezug genommen worden ist ist jene, die die Normaireaktion in Gegenwart von Kreatin als Substrat betrifft.

Beispiel

I I eines Nährmediums (pH 7,6), welches 0,5% (G/V) Kreatinin, 0,5% (Ü/V) Hefeexlrakt, 0,36% (G/V) sekundäres Kaliumphosphat. 0,04% (G/V) primäres Kaliumphosphat. 0,02% (G/V) Magnesiumsulfat, O.OOi^b (G/V) Mangansulfat und 0,001% (G/V) Eisensulfat enthielt, wurde in eine Kulturvorrichtung geringer Größe eingebracht, die mit einem Rührer (hergestellt durch Iwashiya Co., |apan) ausgestattet war. und bei hohem Druck sterilisiert. Sodann wurde das Medium mit 20 ml einer bakteriellen Samenlösung inokuliert, die durch Vorkultivierung von Flavobacterium IJ-i88 (ATCC 31200. FERM-P Nr. 2922) in einem Nährmedium, das die gleiche Zusammensetzung, wie sie vorstehend angegeben worden ist, aufwies, hergestellt worden war. und einer belüfteten-bewegten Eintauchkultur bei 30"C unterworfen. Nach Kuiimcmnf; während 24 Stunden wurde eine Kulturlösung erhalten, die 2,2 Einheiten/ml Kreatinamidinohydrolase enthielt.

Die Kulturlösung wurde von Bakterien durch Zugabe von 15 ml einer 23.6%igen (G/V) Mangansulfatlösung unter Rühren, weiterer Zugabe von 15 g Hyflow Super CeI und Filtration des resultierenden Gemisches befreit. Somit wurden 970 ml einer rohen Enzymlösung erhalten, die 2.1 Einheiten/ml Kreatinamidinohydrolase enthielt.

Die hierdurch erhaltene rohe Enzymlösung wurde auf ein Volumen von 95 ml konzentriert. Das Konzentrat wui-de gegenüber 5 I 0,05 m Phosphat-Puffer (pH 8,0) welcher ein Millimol 2-Mercapto-äthanol (nachstehend als Pulver A bezeichnet) aufwies während 24 Stunden dialysiert und sodann auf eine Säule (2 χ 30 cm) mit DEAE-Cellulose aufgebracht, welche zuvor mit Puffer A equilibriert worden war. Der nicht adsorbierte Teil wies eine Kreatinamidinohydrolase-Aktivität auf.

Kreatinamidinohydrolase wird dadurch erhalten, daß man den unadsorbierten Teil, der in der vorstehend angeführten DEAE-Celluiose-Säulenehromatografie erhalten worden war. an einer DEAE-Sephadex A-50-Säule. die zuvor mit dem gleichen erwähnten Puffer equilibriert worden war, absorbiert, und mit einem linearen NaCI-Gradienten von 0 bis 0,5 m eluieri. Kreatinamidinohydrolase wurde bei einer NaCl-Konzentration von 0,1 bis 0,3 m eluieri. Die aktive Fraktion des Eluates besaß eine spezifische Aktivität von 8,5 F.inheiten/mg-Protein und eine Gesamtaktivität von 1530 Einheiten.

Nachfolgend wurde die vorstehend erwähnte aktive Fraktion auf ein Volumen von 2.0 ml mittels eines Collodiumsackes konzentriert und das Konzentral durch eine Sepharose 6B-.Säule (2 χ 108 cm) geführt, weiche t.uvui iiiii uciVi gleichen Puffer Λ cquüibricr; worden war. Sodann wurde mit dem gleichen Puffer eluiert und die Fraktionen, die die Kreatinamidinohy· drolase-Aktivität aufwiesen, wurden gesammelt. Die Fraktionen wurden unter Erhalt eines ge^r(>inigten Kreatinamidinohydrolasepulvers konzentriert und lyopholisiert. Die hierdurch erhaltene gereinigte Kreatinamidinohydrolase besaß eine spezifische Aktivität von 11,3 Einheiten/mg-Protein und eine Gesamtaktivität von 1050 Einheiten. Die Ausbeute betrug 51,6%.

Die Einheit der Kreatinamidinohydrolase-Aktivität. auf die hier Bezug genommen ist. wurde derart definiert, daß die Enzymmenge, die für die Zersetzung von I Mikromol Kreatin zu Harnstoff pro Minute in einem Phosphat-Puffer (pH 7,7) bei 37°C erforderlich war. als eine Einheit herangezogen wurde.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Kreatinamidinohydrolase, dadurchgekennzeichnet.daß man Flavobacterium U-188 (ATCC 31200, FERM-P No. 2922) in einem Nährmedium in Gegenwart von Kreatinin, Kreatin oder einer Mischung daraus unter Belüftung durch eine Belüftungs-Bewegungs-Eintauchkultur kultiviert und Kreatinamidinohydrolase aus der Kulturflüssigkeit gewinnt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Nährmedium zumindest eine der Substanzen Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Mais-Weichflüssigkeit und wäßriges Sojabohnen- und Weizenkleieextrakt als Stickstoffquelle und zumindest eine Substanz, die unter primärem Kaliumphosphat, sekundärem Kaliumphosphat, Magnesiumsulfat, Magnesiumchlorid, Ferrichlorid, Ferrisulfat und Mangansulfat als anorganisches Salz ausgewählt ist, enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Zuckermaterial oder Vitamin in das Nährmedium eingebracht wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge an Kreatinin, Kreatin oder eines Gemisches hiervon im Bereich von 0,01 bis 5,0% (G/V), bezogen auf das gesamte Nährmedium beträgt

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß der Ausgangs-pH-Wert des Nährmediums 7 bis 9 beträgt

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Kultivierung bei einer