DE2122298C3 - Verfahren zur Gewinnung von Creatininamidohydrolase - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von CreatininamidohydrolaseInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Gewinnung des Enzyms Creatinin-amidohydrolase
aus Mikroorganismen.
In der klinischen Chemie, besonders für die Funktionsdiagnostik der Niere, spielt die Bestimmung
der Zwischen- und Endprodukte des Eiweißstoffwechsels eine wichtige Roile. Hierzu zählen auch Creatinin
und Creatin. Die Bestimmung von Creatinin wurde daher schon wiederholt beschrieben. Die meisten der
bekannten Methoden basieren auf der nichtenzymatischen Jaffe-Reaktion, die jedoch den Nachteil hat,
unspezifisch zu sein.
Weiter wurde bereits eine spezifische mikrobiologische Bestimmungsmethode mit isolierten Bakterien
beschrieben, wobei gewaschene Zellsuspensionen zur Creatinin-Messung verwendet wurden und die Bildung
von Harnstoff und Ammoniak als Maß der Enzymwirkung herangezogen wurde. Lösliche, zum Creatininabbau
befähigte Enzymextrakte konnten dabei jedoch nicht erhalten werden. Voraussetzung für die Schaffung
einer spezifischen Creatinin-Bestimmung mit Hilfe von
Enzymer war jedoch die Auffindung von geeigneten, löslichen Enzymen, welche spezifische und meßbare
Umsetzungen des Creatinine katalysieren können.
Roche, Lacombe und Girard (BBA 6, 210,
1950) charakterisierten in zwei Pseudomonas-Arten Creatinase, Creatininase und eine Glycocyaminase als
spezifische Enzyme, die aus ihren Substraten aus der Guanidinogruppe Harnstoff in Freiheit setzten. Weiter
wurde von Akamatsu und Mitarbeiter (Enzymologie, 15, Seiten 122,158,173,1951) in Erdbakterien ein als
Creatinmutase bezeichnetes Enzym, welches die Gleichgewichtseinstellung
zwischen Creatinin und Creatin bewirken soll. Hierbei wird folgender Abbauweg des
Creatinins vermutet:
Creatbin
und
Sarcosin
Creatin
Glycin
Harnstoff
NH3
Nunmehr ist es gelungen, den hier vermuteten Weg des Creatinin-Abbaus zu bestätigen und erstmals ein
Enzym in Mikroorganismen aufzufinden und in hoher Reinheit zu isolieren, welches an diesem Abbauweg
entscheidend beteiligt ist.
Gegenstand der Erfindung ist die Isolierung und Reinigung dieses Enzymes.
jo Das eiTinduingsgemäße Verfahren zur Gewinnung
von Creatininamidohydrolase aus Mikroorganismen besteht darin, daß ein in einem creatininhaltigen
Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der wasserlöslichen Aufschiußfraktion nach an sich
r, bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten biochemisichen Reinigungs- bzw. Fraklionierungsmethoden
unter Anwendung eines Testes, bei dem aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich
bekannter Weise bestimmt wird, die Creatininamidohy-
4(i drolase gereinigt wird.
Durch das erfindungsgemäß erhältliche Enzym wird folgende Reaktion katalysiert:
Creatinin + H2O
Creatinin-amidohydrolase
Creatin
Da es sich bei der Gleichung um eine Gleichgewichtsreaktion unter Wasseraufnahme oder -abgabe handelt,
wurde da s hier wirksame Enzym als Creatinin-amidohydrolase bezeichnet.
Als Ausgangsmaterial für die Gewinnung des neuen I nzyms eignen sich Mikroorganismen allgemein, in
denen das gewünschte Enzym adaptativ angereichert ist, was gewöhnlich dadurch geschieht, daß in Gegenwart
oder unter Zusatz von Creatinin gezüchtet wird.
Aus den so gewonnenen Mikroorganismen wird durch Aufschluß die wasserlösliche Fraktion gewonnen.
Als Aufschlußmethoden eignen sich die üblichen Methoden je nach der Festigkeit oder Widerstandsfähigkeit
der Zellhaut des verwendeten Mikroorganismus. Besonders geeignet erwiesen sich die Hochdruckdispersion
sowie der Ultraschallaufschluß. Weitere Beispiele für geeignete Aufschlußmethoden sind Desintegrationsmühlen, a:. B. nach B a I u t i η i und Schloßmann
und auf ähnlicher Basis arbeitende Aufschiußmethoden. Auch chemische oder enzymatisch^ AufschluBmethoden
sind anwendbar.
Aus der so erhaltenen wasserlöslichen Fraktion läßt sich die Creatinin-amidohydrolase anreichern, indem
man ihre Eigenschaft, Creatinin in Creatin zu überführen, ausnützt Gebildetes Creatin läßt sich nach
bekannten Methoden bestimmen, beispielsweise durch Zusatz von ATP und Messung von so gebildetem ADP
in üblicher Weise. Es ist jedoch erforderlich, bei pH-Werten über 7 zu arbeiten und die jeweils
angewendeten Reinigungsmethoden nach ihrer Anwendbarkeit bei diesen pH-Werten auszuwählen.
Eine weitere Methode, den Fortschritt des Anreicherungsverfahrens zu verfolgen, besteht darin, mit
Creatin-amidinohydrolase das gebildete Creatin zu spalten unter Bildung von Sarcosin und Harnstoff und
dann den Harnstoff in üblicher Weise, beispielsweise mittels der bekannten Reaktion unter Verwendung von
Urease zu bestimmen.
Das Ausmaß der durchgeführten Reinigung hängt vom beabsichtigten Verwendungszweck des Enzyms
bzw. der Enzyme ab. Falls ein zur enzymatischen Creatinin-Bestimmung geeignetes Präparat gewünscht
ist, genügt bereits ein einziger Reinigungsschritt. Geeignete Reinigungsschritte sind beispielsweise PoIyanionenbehandlung.
Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln oder Chromatographie. Unter Anwendung
der obenerwähnten Bestimmungsmethoden ist es hierbei auf einfache Weise möglich, jeweils den Verbleib
der gewünschten Enzyme festzustellen und diese in einem einzigen Schritt in erheblichem Maße anzureichern.
Da bei einer längeren Lagerung der geernteten und eingefrorenen Mikroorganismen eine Aktivitätsabnahme
der gewünschten Enzyme zu befürchten ist, werden vorzugsweise die Zellen nach der Ernte möglichst rasch
weiter aufgearbeitet. Zwei für das Verfahren der Erfindung bevorzugte Mikroorganismen sind Alcaligenes
spec. WS 51400 ( = DSM 717) aus der Familie Achromo bactericeae und Penicillum WS 90001
( = DSM 718)(Weihenstephan = WS).
Da Creatinin-amidohydrolase bei pH-Werten von 6 und darunter schnell an Aktivität verlieren, bei
pH-Werten um 8,0 die größte Stabilität aufweisen, erfolgt der Aufschluß vorzugsweise zweckmäßig mit
alkalischem Puffer. Vorzugsweise wird 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 verwendet. Die Wahl des Puffers
und der Pufferkonzentration sollte zweckmäßig je nach dem vorgesehenen weiteren Anreicherungsschritt so
erfolgen, daß in dem für den Aufschluß verwendeten Puffer auch die weitere Anreicherung durchgeführt
werden kann. Bei Aufschluß in der Hochdruckdispersion, üblicherweise bei etwa 700 bis 800 atü, kann die
weitere Reinigung bei Anwendung einer Polyanionenbehandlung ohne vorherige Abtrennung der Zellrückstände
durchgeführt werden. Geeignete Polyanionen sind beispielsweise Protaminsulfat oder wasserlösliches
Polyäthylenimin. Bevorzugt wird ein Zusatz von wasserlöslichem Polyäthylenimin, beispielsweise in
Form einer 10%igen Lösung von pH 8. Bei einer Lösung dieser Konzentration sind etwa 5% Zusatz, bezogen auf
Aufschlußvolumen, erforderlich, bis kein weiterer Niederschlag mehr auftritt. Der Niederschlag wird
durch physikalische Mittel, beispielsweise Filtrieren oder Zentrifugieren, abgetrennt. Die gewünschten
Enzyme verbleiben im Überstand.
Anstelle einer Polyanionenfällung erwies sich auch
eine Fällung mit organischem Lösungsmittel als vorteilhaft. Vorzugsweise wird hierbei Isopropanol
verwendet. In diesem Fall werden die Zellriickständc nach dem Aufschluß zuerst entfernt, und dann wird bei
Zimmertemperatur das organische Lösungsmittel zugesetzt. Die Isopropanol-Fraktionierung wird vorzugsweise
so durchgeführt, daß bei 25° C pro Liter Aufschiußlösung 800 ml 90%iges Isopropanol zugesetzt und der
Niederschlag abgetrennt wird. Der erhaltene Überstand wird erneut mit 500 mi Isopropanol je Liter versetzt und
dir Niederschlag, der die beiden gewünschten Enzyme
enthält, abgetrennt.
ίο Besonders bevorzugt ist eine kombinierte Anwendung
der beiden obenerwähnten Methoden, nämlich Polyansonenfällung und anschließend Fraktionierung
mit organischem Lösungsmittel.
Sowohl die mit einem einzigen Anreicherungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten erhaltenen Produkte sind bereits zur Verwendung in einer spezifischen Creatinin-Bestimmung geeigneL Die Enzyme Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an.
Sowohl die mit einem einzigen Anreicherungsschritt als auch mit den beiden kombinierten Schritten erhaltenen Produkte sind bereits zur Verwendung in einer spezifischen Creatinin-Bestimmung geeigneL Die Enzyme Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase fallen hierbei jedoch stets gemeinsam an.
Falls eine Trennung der Enzyme gewünscht wird, werden die so erhaltenen Präparate anschließend durch
Austauscherchromatographie getrennt. Als besonders geeigneter Austauscher erwies sich dabei ein schwach
basischer Ionenaustauscher wie DEAE-Sephadex oder
>-> DEAE-Cellulose.
Bei Verwendung von DEAE-Sephadex werden die Enzyme bei geringer Ionenkonzentration, vorzugsweise
etwa 0,01 bis 0,05 M, auf dem Austauscher adsorbiert. Anschließend v/ird der Austauscher mit einer lonenkonzentration
von etwa 0,1 M gewaschen, wobei nichtaktive Begleitproteine entfernt werden. Creatinin-amidohydrolase
läßt sich mit 0,2 M Pufferlösung eluieren. Die Creatin-amidinohydrolase verbleibt hierbei noch am
Austauscher.
j-, Die oben beschriebene bevorzugte Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens durch Kombination einer Isopropanol-Fraktionierung und einer Austauscherchromatographie
führt zu einer etwa 100- bis 150fachen Anreicherung und ergibt ein Creatinin-amidohydrolase-präparat
mit einer spezifischen Aktivität über 200 U/mg.
Gemäß einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann eine sehr einfache
Feinreinigung.des gewünschten Enzyms ohne Trennung
4r! erhalten werden, indem im Batch-Verfahren so viel
Austauscher zugesetzt wird, bis beide Enzyme adsorbiert sind. Der Austauscher wird dann abgetrennt und,
wie oben beschrieben, gewaschen und anschließend eluiert.
Eine weitere Möglichkeit zur Reinigung und Anreicherung des Enzyms besteht in der Salzfällung bzw.
Salzfraktionierung, beispielsweise unter Verwendung von Ammoniumsulfat. Bei der Verwendung von
Ammoniumsulfat fällt Creatinin-amidohydrolase bei einer Konzentration von 2,2 M.
Die Salzfällung eignet sich auch zur Gewinnung des Enzyms aus seinen Lösungen, wie sie beispielsweise bei
der Elution des Austauschers erhalten werden. Durch Dialyse bei 4°C, zweckmäßig gegen verdünnten Puffer,
bo beispielsweise 0,02 M Diäthanolamin-puffer, pH 8,0,
kann das Enzym von Salzen und anderen niedrigmolekularen Begleitstoffen befreit werden.
Die so erhaltenen Präparate können in eingefrorenem Zustand monatelang ohne Aktivitätsverlust gela-
dr, gen werden.
Eine weitere Rcinigungs- und Anreicherungsmethode besteht in einem Hitzeschritt bei 600C. Eine derartige
Erhitzung während 5 Minuten führt zu keiner
merklichen Verringerung der Creatinin-amidohydrolase-Alctivität
Im Gegensatz dabei verliert die Creatinamidohydrolase unter diesen Bedingungen ihre Aktivität
Das erfindungsgemäß erhältliche neue Enzym kann für wissenschaftliche Zwecke sowie zur spezifischen
Bestimmung des Creatinins und Creatins verwendet werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
a) Isolierung hochgereinigter
Creatinin-amidohydrolase
Creatinin-amidohydrolase
Aus einem in Gegenwart von Creatinin gezüchteten Kulturansatz Alcaligenes spec. WS 51400 werden die
Zellen (1 kg Trockengewicht) abgetrennt, mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 auf 201 aufgenommen
und ohne Kühlung in der Hochdruckdispersion bei ca. 800 atü aufgeschlossen. Der Extrakt wird mit 5 Vol.-%
einer 10%igen Polyäthylenimin-Lösung (Mol-Gewicht ca. 1800) von pH 8,0 (ca. 1 1) versetzt Nach Zugabe von
KCl (0,01 M Endmolarität) und NH4Cl (0,1 M Endmolarität)
werden pro Liter Extrakt innerhalb von 10 Minuten 0,8 Volumen 90%iges wäßriges Isopropanol
zugesetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt.
Der reichliche Niederschlag wird abzentrifugieru
Dem Überstand werden pro Liter weitere 0,45 Volumen 9O°/oiges Isopropanol zugegeben.
Der so gebildete Niederschlag, welcher Creaiininamidohydrolase
und Creatin-amidinohydrolase enthält, wird abgetrennt und in 400 ml 0,02 M Kaiiumphosphatpuffer
pH 8,0 aufgenommen. Ein ungelöster Rückstand
ίο wird abgetrennt und der Obersland auf eine mit dem
gleichen Puffer äquilibrierte Säule mit DiäthylaminoäthanoI-Gruppen
enthaltenden vernetzten Dextran (3,5 cm χ 1 m) gegeben. Nach dem Aufziehen wird die
Säule mit 1 Vol. 0,1 M Kaliumphosphatpuffer pH 8,0 gewaschen und dann mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer
pH 8,0 eluiert. Die Creatinin-amidohydrolase-haltigen Fraktionen werden vereinigt, bei pH 8,0 mit Ammoniumsulfat
auf 2,2 M eingestellt, das ausgefallene Enzym abzentrifugiert und in 0,02 M Diälhanolaminpuffer pH
8,0 auf 100 ml gelöst und 4 Stunden bei +40C gegen gleichen Puffer dialysiert Man erhält so in einer
Gesamtausbeute von 64% ein Präparat mit einer spezifischen Aktivität von 303 U/mg. Die nachstehende
Tabelle zeigt zusammenfassend die in den einzelnen Stufen dieses Verfahrens erhaltenen Aktivitäten und
Ausbeuten.
Schritt | U (25 C) | Protein in g | U/mg | Ausbeute % |
Dispersionsaufschluß | 2,8 · 105 | 98,6 | 2,8 | 100 |
Polyäthylenimin-Überstand | 2,6 · 105 | 66,2 | 3,9 | 93 |
1. Isopropanolzusatz (Überstand) | 2,16 ■ 105 | 32,6 | 6,6 | 77 |
2. Isopropanolzusatz (Niederschi.) | 1,97 ■ 105 | 6,9 | 28,5 | 71 |
Chrom, in mit Diäthylaminoäthanol- | 1,8 ■ I05 | 0,59 | 303 | 64 |
Gruppen enthaltendem vernetzten Dextran | ||||
(Eluate) |
Bei Aufschluß mit Hilfe von Ultraschall anstelle der Hochdruckdispersion konnte der Gehalt an Creatininamidohydrolase
bei etwa gleicher spezifischer Aktivität auf das 2,5fache, bezogen auf eingesetzte Mikroorganismen,
Trockengewicht erhöht werden.
Die wie oben beschrieben erhaltene Creatinin-amidohydrolase weist eine Gleichgewichtskonstante
[Creatin]
[Creatinin]
[Creatinin]
K = 1,27
(370C; pH 8,0) auf.
Die Michaelis-Konstante für Creatinin als Substrat KM = 3,3 · 10-2M(37°C;pH8,0).
Es wird wie in Beispiel 1 beschrieben vorgegangen, jedoch wird die Chromatographie mit Diäthyiaminoäthanol-gruppen
enthaltendem vernetzten! Dextran durch ein Batch-Verfahren mit Diäthylaminoäthanolgruppen
enthaltendem vernetztem Dextran ersetzt.
Ausgehend von 100 g Alcaligenes spec. WS 51 400 werden 100 ml des in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH
8.0, gelösten zweiten Isopropanol-niederschlags mit so viel Diäihyiaminoäthanolgruppen enthaltendem vernetztem
Dextran versetzt, bis im Überstand etwa je 5% des Enzyms verbleiben (etwa 20 g feucht abgepreßter
Austauscher). Der Austauscher wird abfiltriert mit ca 100 ml 0,08 M Kaliumphosphatpuffer. pH 8,0 gewaschen
und mit 100 ml 0,2 M Kaliumphosphatpuffer, pH 8.0, enthaltend 0,3 M KCl, 15 Minuten bei +4°C gerührt und
anschließend filtriert. Im Eluat findet sich das Enzym.
Durch Fällung mit Ammoniumsulfat kann ein Präparat mit 31,5 U/mg Creatinin-amidohydrolase gewonnen
werden, wie die nachstehende Tabelle zeigL
Isolierung von Creatinin-amidohydrolase aus 100 g
(Trockengewicht) Alcaligenes spec. WS 51400
Schritt | Protein | Creatinin-amido- | U/mg |
in g | hydroiase | 0,92 | |
U | 13.9 | ||
Aufschluß | 26.1 | ZA ' O4 | |
2. isopropanolzusalz | i.43 | ! QS · ! 0J | 31.5 |
(Niederschlag) | |||
Chromatogr. | U.37Ö | 1,16- 10" | |
Eluat 0.5 M pH 8.0 | |||
7 g (Trockengewicht) eines in Gegenwart von Crealinin gewachsenen Aijüügenes spec. WS 51400
wurden geerntet und bei dH 8,0 mit Ultraschall iHjfgpschlosscn. Die erhaltene Suspension wurde, wie in
Beispiel 1 beschrieben, mit 0,8 Volumen Isopropanol versetzt, 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und
zentrifugiert. Der Überst?r>d wird mit weiteren 0,4'
Volumen Isopropanol versetzt und erneui zentrifugiert Der Niederschlag wird, wie in Beispiel 1 beschrieb_τ
aufgenommen und über eine Säule mit Diäthylamino äthanol-Gruppen enthaltendem vernetztem Dextrai
Chromatographien, wobei lediglich die Creatinin-ami dohydroiasc eiüiert wird. Die nachstehende Tabelli
zeigt die Pinzelheiten dieses Verfahrens. Das erhalten! Präparat war zur Creatinin-Bestiinmung geeignet.
Schritt
U (25 C) Protein U/mg Ausbeute
i» g
i» g
Uitralischaii- i,5 · i03 l,7S0 0,85 10Ü
Aufschluß
2. Isopropanol- 1,2 ■ 103 0,119 10,1 80
zusatz (Niederschlag)
Chromatogr. 0,7 103 0,028 25 47
Eluat
Bei den in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Versuchen wurde aus Creatinin in Gegenwart von
Creatinin-amidohydrolase gebildetes Creatin bestimmt durch Zusatz von Adenosintriphosphat (ATP), welches
in Gegenwart von Creatinphosphokinase (CPK) in Creatinphosphat und Adenosindiphosphat (ADP) überführt
wird. Gebildetes ATP wird mit Pyruvat-Kinasf (PK) und Lactatdehydrogenase (LDH) sowie Phospho
enolpyruvat (PEP) unter NADH-Verbrauch in ATF überführt und der Verbrauch an NADH optisch
gemessen. Diese bekannten Schritte lassen sich wie folgi
darstellen:
(1) Creatin +ATP ► Creatinphosphat + ADP
PK
(2) ADP + PEP -i-^-» Pyruvat + ATP
(3) Pyruvat + NADH + H+ Lactat + NAD +
Claims (7)
1. Verfahren zur Gewinnung von Creatinin-amidohydrolase, dadurch gekennzeichnet,
daß ein in einem creatininhaltigen Medium gezüchteter Mikroorganismus aufgeschlossen, aus der
wasserlöslichen Aufschlußfraktion nach an sich bekannten, bei pH-Werten über 7,0 durchgeführten
biochemischen Reinigungs- bzw. Fraktionierungsmethoden unter Anwendung eines Testes, bei dem
aus zugesetztem Creatinin gebildetes Creatin in an sich bekannter Weise bestimmt wird, die Creatininamidohydrolase
gereinigt und anschließend ggf. die Creatin-amidinohydrolase von so gewonnener Creatinin-amidohydrolase
durch Austauscherchromatographie abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein mechanischer Aufschluß durchgeführt
wird, insbesondere unter Anwendung von Hochdruckdispersion, Ultraschall oder Desintegrationsmühle.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyanionenfraktionierung
durchgeführt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine Polyäthylenimin- Fällung bei einer
Pufferkonzentration von etwa 0,1 M durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine
zweistufige Fällung mit Isopropanol durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzyme
an einen schwach basischen Ionenaustauscher bei einer lonenkonzeniralion unter 0,1 M adsorbiert,
der Austauscher mit etwa 0,1 M Puffer gewaschen und die Creatinin-amidohydrolase und Creatin-amidinohydrolase
mit einer Ionenkonzentration von 0,2 M bzw. 0,5 M eluiert werden.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Alcaligenes spec. WS 51400 oder
Penicillium WS 90001 verwendet wird.
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