DE3425957C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine neue Typ II-Restriktionsendonuklease, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung (vgl. die Patentansprüche 1, 3 und 7).

Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert, und zwar in jedem Polynukleotidstrang eine. Typ II-Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen.

Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ II-Restriktionsendonukleasen, die für DNA-Sequenzen spezifisch sind, die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Typ II-Restriktionsendonuklease, welche gekennzeichnet ist durch die palindrome Erkennungssequenz

Vorzugsweise weist dieses Enzym die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle auf:

Auch andere Spaltstellen innerhalb dieser Sequenz sind möglich.

Die erfindungsgemäße neue Typ-II-Restriktionsendonuklease, die im folgenden als Dra III bezeichnet wird, besitzt ein Temperaturoptimum bei 37°C und ein pH-Optimum bei 8,4. Weitere optimale Reaktionsparameter sind 75 bis 150 mM NaCl, 8 mM Mg²⁺ und 6 mM β-Merkaptoethanol. Die Anwesenheit von Mg²⁺ ist für die Aktivität des Enzyms notwendig.

Ein zu Dra III isoschizomeres Enzym ist nicht bekannt.

Das Enzym wirkt, wie oben erwähnt, an palindromischen Strukturen, es erkennt also eine selbstkomplementäre Nukleinsäuresequenz, bei der der Komplementärstrang des Doppelstrangs die identische Sequenz in gegenläufiger Richtung aufweist.

Die Erkennungssequenz läßt sich durch vollständigen Verdau der DNAs des Virus SV40 und der Phagen Lambda, fd 109, X174 und M13mp7 mit Dra III bestätigen.

Dra III spaltet Lambda-DNA an den Positionen 2959, 5618, 6640, 9004, 14482, 30370, 31914, 41484, 47317 und 48439. Dadurch entstehen Fragmente der Länge 2959, 2659, 1022, 2364, 5478, 15888, 1544, 9570, 5833, 1122 und 63 Basenpaare (bp).

Dra III spaltet SV40-DNA an Position 2721, fd109RF-DNA an Position 7598, X174RF-DNA an Position 5815 und M13mp7-DNA an Position 5721.

Die durch Dra III-Verdau der analysierten DNAs spezifisch erhaltenen und in Agarose- und Polyacrylamidgelen eindeutig nachgewiesenen Fragmente zeigen, daß Dra III die Spaltstelle 5′-CACNNNGTG-3′ erkennt.

Die Schnittstelle innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms läßt sich wie folgt feststellen:

Die DNA des modifizierten Phagen fd109RF wird mit Bam HI durch Spaltungen an den Positionen 2220 und 7521 (Positionen bezogen auf den (+)-Strang) in zwei Fragmente gespalten. Beide Stränge des kleineren 2983 bp langen Fragmentes werden in zwei parallelen unterschiedlichen Reaktionen terminal markiert. Der (+)-Strang wird am 5′ Ende an Position 7522 mit gamma (³²P)ATP und T4 Polynucleotidkinase phosphoryliert. In der zweiten Reaktion wird der komplementäre (-)-Strang am 3′ Ende, an Position 7526 mit alpha (³²P) dGTP und Klenow-Polymerase um 1 Nucleotid verlängert. Der verlängerte (-)-Strang endet somit an Position 7525. Beide unterschiedlich markierten DNA's werden anschließend jeweils mit Acc I an Position 7968 nachgespalten.

Aus den jeweils entstehenden 5′- und 3′-terminal markierten Fragmenten (447(5′)/446(3′) und 2536(5′)/2535(3′); Länge der markierten Einzelstränge) wird das 447(5′) bzw. 446(3′) Fragment (Position 7522 bis einschließlich Position 7968(5′), Position 7525 bis einschließlich 7970 (3′) isoliert. Das 3′-terminal markierte Fragment wird sequenziert. Zusätzlich wird jeweils ein Aliquot der isolierten 447(5′) bzw. 446(3′) Fragmente mit dem erfindungsgemäßen Enzym gespalten und die Länge der 5′- bzw. 3′-markierten Einzelstränge in dem Sequenzgel durch Vergleich mit der 3′ Sequenzleiter bestimmt. Dabei ergibt sich auf dem 5′-terminal markierten Strang die Spaltposition 7595 und auf dem 3′-terminal markierten Strang die Spaltposition 7599.

Die Längenbestimmung des 5′-markierten (+)-Einzelstranges des Bam HI-Dra III-Fragmentes erfolgt folgendermaßen: Der an Position 7522 5′ markierte (+)-Einzelstrang läuft identisch mit dem C an Position 7602 der 3′ Sequenzleiter, welches dem ersten Nucleotid 5′ ständig neben der Erkennungssequenz 3′-GTGCATCACC-5′ entspricht. Der 5′-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid A des (+)-Stranges an Position 7598 (entspricht dem 3′-ständigen N innerhalb der Erkennungssequenz 5′-CACNNNGTG-3′). Die Schnittstelle von Dra III auf dem 5′-markierten (+)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden A an Position 7598 und G an Position 7599.

Analog wird die Länge des komplementären 3′-markierten (-)-Einzelstranges des Bam HI-Dra III-Fragmentes bestimmt. Der an Position 7523 3′-markierte (-)-Einzelstrang läuft identisch mit dem Nucleotid C an Positiion 7596 der 3′Sequenzleiter innerhalb der Erkennungssequenz 3′-GTGCATCAC-5′ (entspricht dem 3′-ständigen N innerhalb der Erkennungssequenz 3′-GTGNNNCAC-5′. Der 3′-markierte Einzelstrang endet deshalb mit dem Nucleotid G des (-)-Stranges an Position 7595 der Erkennungssequenz. Die Schnittstelle von Dra III auf dem 3′ markierten (-)-Strang ist also zwischen den Nucleotiden G an Position 7595 und C an Position 7596.

Erfindungsgemäß wird Dra III gewonnen, indem man Deinococcus radiophilus DSM 20551 züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt. Zur Gewinnung werden die üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz leicht nachgewiesen werden kann. Als Substrat eignet sich beispielsweise Lambda DNA. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen in Gegenwart von Ethidiumbromid elektrophoretisch aufgetrennt.

Der für die Gewinnung des Enzyms verwendete Mikroorganismus Deinococcus radiophilus DSM 20551 wächst aerob im TGYM-Medium ATCC 679. Die Zellen kommen einzeln oder paarweise, in uneinheitlichen Tetraedern oder kubischen Verbänden in mehr als einer Ebene vor. Der Durchmesser der Zellen liegt bei 1,0 bis 2,5 μm. Auf Agar werden rosa bis rote, glatte, schwach konvexe Kolonien mit gleichmäßigem Rand gebildeet. Der Organismus ist grampositiv. Die Zellwand besteht aus Galaktose, Glucose, Mannose, Alanin, Glutaminsäure, Lysin, Glucosamin und Muraminsäure. Der Hauptbestandteil ist ein Peptidoglycan.

Optimale Wachstumsbedingungen 10 bis 30°C, pH 7,0, die Verdoppelungszeit beträgt etwa 2 Stunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen aufgeschlossen, der Extrakt wird bei 13 000 Upm für 45 Minuten zentrifugiert. Für den Aufschluß eignen sich die üblichen mechanischen Methoden, wie z. B. Hochdruckdispersion oder Ultraschall. Fachreinigung der das neue Enzym enthaltenden Ammonsulfatfraktion kann zweckmäßig durch Affinitätschromatographie, Chromatographie an einem Molekularsieb und abschließende Chromatographie über einen Kationenaustauscher erfolgen.

Für die Affinitätschromatographie hat sich besonders trägerfixiertes Heparin bewährt, z. B. Heparin-Sepharose. Als Molekularsiebmaterial hat sich Ultrogel ACA 54 (LKB), ein Acrylamid/Agarose Heteropolymerisat aus 5% Acrylamid und 4% Agarose bewährt. Als Kationenaustauscher eignen sich beispielsweise Phosphat- oder Sulfonatgruppen enthaltende Kohlehydrate und Polystyrole, beispielsweise Cellulosephosphat, Polystyrolsulfonat und dergleichen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.

Beispiel 1

Deinococcus radiophilus DSM 20551 wird in TGYM-Medium (ATCC 679) bei 30°C 20 Stunden gezüchtet und in der späten Log- bzw. stationären Phase geerntet.

TGYM-Medium hat folgende Zusammensetzung: Trypton 5,0 g, Glucose 1,0 g, Hefeextrakt 3,0 g, DL-Methionin 0,5 g ad 1 l mit H₂O dest. Ausbeute ca. 150 g Trockenmasse/100 l Medium.

50 g Zellpaste werden in 100 ml Aufschlußpuffer (= TEMG-Puffer: 40 mmol/l Tris/HCl, pH 8,0/4°C; 0,1 mmol/l EDTA, 7 mmol/1 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin) suspendiert. Dann werden die Zellen mit Ultraschall aufgeschlossen (OD₅₇₈-Abnahme ca. 40%). Aktivität etwa 50 000 U Dra III. Die Aufschlußsuspension wird anschließend für 45 Minuten bei 13000 Upm und 4°C zentrifugiert. Der Niederschlag wird verworfen. Das Enzym befindet sich im Überstand.

Beispiel 2

Der nach Beispiel 1 erhaltene Überstand wird über eine Heparin-Sepharose-Säule (3 × 10 cm) chromatographiert. Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird das Enzym mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 1,0 mol/l NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen mit 0,5 bis 0,65 mol/l NaCl. Die Fraktionen werden vereinigt und mit festem Ammoniumsulfat (AS, Endkonzentration 80% Sättigung/4°C) gefällt.

Nach Fällung über Nacht wird der AS-Niederschlag abzentrifugiert (4°C, 1 Stunde bei 13 000 Upm) und in ca. 5 ml TEMG-Puffer + 0,5 M NaCl aufgenommen. Anschließend wird über eine Ultrogel ACA 54-Säule (2 × 100 cm) in TEMG + 0,5 M NaCl chromatographiert. Die Fraktionen mit reiner Dra III-Aktivität (d. h. bei einstündiger Inkubation tritt nur das Dra III-spezifische Spaltmuster an Lambda-DNA auf) werden vereinigt und gegen TEMG-Puffer dialysiert. Das Dialysat wird über eine Phosphocellulosesäule (1 x 10 cm) chromatographiert.

Nach Waschen mit 5 Volumina TEMG-Puffer wird mit einem linearen Gradienten mit 0 bis 0,1 mol/l NaCl eluiert. Das Enzym erscheint in den Fraktionen mit 0,35 bis 0,5 mol/l NaCl. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und gegen 20 mmol/l Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,1 mmol/l EDTA, 10 mmol/l 2-Mercaptoethanol, 100 mmol/l NaCl, 50% Glycerin, 0,01% Thesit, dialysiert.

Man erhält so ca. 5 000 U Dra III.

Aktivitätsbestimmung: Einheitendefinition

1 U Dra III spaltet 1 μg Lambda-DNA innerhalb 1 Stunde bei 37°C in 25 μl vollständig.

In eine Mischung aus 13 μl Inkubationspuffer, enthaltend 0,02 mol/l Tris HCl pH 8,4/37°C, 0,02 MgCl₂, 0,2 mol/l NaCl und 0,012 mol/l 2-Mercaptoethanol, werden 7 μl H₂O und 5 μl Lambda-DNA (4 OD/ml Extinktion (Optical Density) sowie 1 μl DraIII Lösung (1U/μl)) gegeben. Die Lösung wird eine Stunde bei 37°C gehalten, auf Eis abgekühlt und mit 5 ml kalter Stoplösung, enthaltend 7 mol/l Harnstoff, 20 Gew.-/V-% Saccharose, 0,06 mol/l EDTA und 0,01 Gew.-/Vol.-% Bromphenolblau, versetzt. Dann wird auf 1%igem Agarosegel 3 bis 4 Stunden bei 100 V elektrophoretisch aufgetrennt. Die erhaltenen Banden werden gegenüber DNA-Längenstandard identifiziert.

Claims (7)

1. Typ-II-Restriktionsendonuklease, gekennzeichnet durch die palindrome Erkennungssequenz

2. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die durch den Pfeil definierte Spaltungsstelle

3. Verfahren zur Gewinnung der Restriktionsendonuclease des Anspruchs 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Deinococcus radiophilus DSM 20551 züchtet und das Enzym aus den Zellen durch übliche biochemische Aufreinigungsmethoden gewinnt, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz nachweisbar ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen aufschließt, den Extrakt bei 13 000 Upm für 45′ zentrifugiert und den Überstand gewinnt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feinreinigung den Überstand einer Affinitätschromatographie, einer Chromatographie über Molekularsieb und einer abschließenden Chromatographie über einen Kationenaustauscher unterzieht.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.

7. Verwendung der Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 oder 2 zur Erkennung und Spaltung der DNA-Sequenz 5′-CACNNNGTG-3′ bei Anwesenheit von Mg²⁺.