EP0413777A1 - TYP II-RESTRIKTIONSENDONUKLEASE MamI - Google Patents

TYP II-RESTRIKTIONSENDONUKLEASE MamI

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Publication number
EP0413777A1
EP0413777A1 EP90900137A EP90900137A EP0413777A1 EP 0413777 A1 EP0413777 A1 EP 0413777A1 EP 90900137 A EP90900137 A EP 90900137A EP 90900137 A EP90900137 A EP 90900137A EP 0413777 A1 EP0413777 A1 EP 0413777A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
restriction endonuclease
type
mami
recognition sequence
mmol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP90900137A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus Kaluza
Gudrun Schmitz
Michael Jarsch
Christoph Kessler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0413777A1 publication Critical patent/EP0413777A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales

Definitions

  • the invention relates to the new type II restriction endonuclease MamI, a process for its production and its use.
  • Type II restriction endonucleases are endodeoxyribonucleases which are able to recognize and cleave certain DNA sequences. In the process, phosphodiester bridges are hydrolyzed in the target sequence, one in each strand of polymicotide. Type II restriction endonucleases are therefore valuable for the analysis of DNA molecules. Although there are already specific type II restriction endonucleases known for numerous DNA sequences, there is still a need to create further type II restriction endonucleases which are specific for DNA sequences and which have hitherto not been recognized by any of the known restriction endonucleases. The invention is therefore based on the object of providing a new restriction endonuclease which is able to specifically recognize and cleave a sequence which has hitherto not been recognized by any such enzyme.
  • this object is achieved by a type II restriction endonuclease with the recognition sequence and the cleavage site defined by the label
  • the new restriction endonuclease according to the invention which is referred to below as MamI, has an optimum temperature at about 37 ° C.
  • the enzyme has a good activity between pH 8.5 and pH 9.0 in 33 mmol / 1 Tris / HCl buffer with 0.5 mmol / 1 DTE (dithioerythritol), 10 mmol Mg acetate and 66 mmol K acetate .
  • the pH optimum is around pH 8.8.
  • An enzyme that is isizizomeric to MamI is not known.
  • the recognition sequence can be confirmed by completely digesting the DNAs of the SV40 and Adeno 2 viruses, the phage lambda, phiX1174, the phage derivatives M13mp8 and the plasmids pBR322 and pBR328. These DNA molecules are treated with MamI.
  • Table 1 shows a comparison of the experimentally observed interface specificity with a computer-determined interface specificity for an enzyme which recognizes the sequence GATNNNNATC.
  • the cleavage position within the recognition sequence of the enzyme can be found in an M13 derivative which is located at a distance of approximately 30-200 bases from the binding site of the universal sequencing primer (Messing, J. et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 309 - 321) carries this recognition sequence. Sequence reactions are first carried out on the single-stranded DNA of the M13 derivative using the universal sequencing primer using the dideoxy chain termination method
  • the sequencing primer is radiolabelled with T4 polynucleotide kinase and [ ⁇ - 32 P] ATP at the 5 'end.
  • T4 polynucleotide kinase and [ ⁇ - 32 P] ATP at the 5 'end.
  • a partially double-stranded DNA is produced in a replenishment reaction with DNA polymerase I, Klenow fragment, and a deoxynucleotide triphosphate mixture of dATP, dCTP, dGTP and dTTP.
  • This DNA whose newly synthesized strand is radioactively labeled at the 5 'end, is now cleaved with the restriction endonuclease MamI.
  • Half of the cleavage mixture is additionally treated with T4 DNA polymerase in the presence of a mixture of all four deoxynucleotide triphosphates in order to obtain smooth DNA ends.
  • the reaction products are analyzed by electrophoresis on 8 mol / 1 urea, 5% polyacrylamide sequence gels and subsequent autoradiography. The results are interpreted according to Brown, NL and Smith, M. (Methods in Enzymology 65 (1980) 391-401).
  • the position of the cleavage site is determined by comparing the running distances of the radioactively labeled fragments with the sequence ladder.
  • the samples additionally treated with T4 DNA polymerase show identical bands' running distances compared to the MamI-cleaved sample only. This shows that MamI produces a DNA end that is not overhanging but smooth.
  • the MamI cleavage occurs within the recognition sequence with the following specificity:
  • MamI is preferably obtained by cultivating microorganisms of the Microbacterium genus and extracting the enzyme from the cells.
  • Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 is preferably used.
  • the usual biochemical purification methods can be used for the recovery, the presence of the enzyme in the fractions obtained in each case being able to be easily detected by cleaving its recognition sequence.
  • Lambda DNA for example, is suitable as a substrate.
  • the DNA fragments obtained are electrophoresed in agarose gels in the buffer systems customary for fragment separation in the presence of ethidium bromide.
  • the microorganisms used to obtain the enzyme grow aerobically in Merck Standard I medium.
  • the microorganism is deposited with the German Collection of Microorganisms, Deutschen für biotechntreu Anlagen mbH, Mascheroder Weg 16, 3300 Braunschweig, FRG, and has the accession number DSM 20156.
  • the optimal growth rate conditions are at 25 ° C, pH 7.2 - 7.8.
  • the doubling time is about 2 hours.
  • the enzyme is isolated and purified by the usual chemical and mechanical methods, for example by high pressure dispersion, ultrasound or enzymatic digestion.
  • the cells are exposed to an excess pressure of 5 bar.
  • the resulting cell mass is resuspended in Tris HCl buffer, pH 8.0, which contains protease inhibitors.
  • the cells are then opened using a French press.
  • the further purification of the supernatant is preferably carried out via affinity chromatography, molecular sieve chromatography and ion exchange chromatography.
  • Heparin-Sepharose CL-6B for example, is suitable as a material for affinity chromatography
  • a suitable molecular sieve is, for example, Ultrogel ACA54 (LKB).
  • Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 is grown for 5 hours at 30 ° C and harvested in the late logarithmic or stationary phase.
  • Merck Standard Medium I is used as the culture medium.
  • the cell paste (30 g wet weight) is placed in 2.4 volumes of buffer A (40 mmol / l Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mmol / l EDTA, 7 mmol / 1 2-mercaptoethanol), which contains protease inhibitors, resuspended. On the cells then close by passing three times
  • the active fractions are pooled and dialyzed against storage buffer (20 mmol / l Tris-HCl, pH 8.0, 10 mmol / l 2-mercaptoethanol and 100 mmol / l NaCl, 50% (v / v) glycerol).
  • the solution is incubated for one hour at 37 ° C., cooled on ice and with 5 ⁇ l of a stopping reagent consisting of 7 mmol / l urea, 20% (w / v) sucrose, 60 mmol / l EDTA and 0.01% (w / v) bromophenol blue added. Then there is a separation performed by electrophoresis in 0.6% agarose gels for 3-4 hours at 100 V. The bands obtained are identified by comparison with a DNA length standard.

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Description

TYP II-Restriktionsendonuklease MamI
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die neue Typ II-Restriktionsendonuklease MamI, ein Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung.
Typ II-Restriktionsendonukleasen sind Endodesoxyribonukleasen, welche bestimmte DNA-Sequenzen zu erkennen und zu spalten vermögen. Dabei werden Phosphodiesterbrücken in der Zielsequenz hydrolysiert und zwar in jedem Polymikleotidstrang eine. Typ II- Restriktionsendonukleasen sind daher wertvoll für die Analyse von DNA-Molekülen. Es sind zwar bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen bekannt, jedoch besteht immer noch Bedarf an der Schaffung weiterer Typ II- Restriktionsendonukleasen, die für DNA-Sequenzen spezifisch sind und die bisher von keiner der bekannten Restriktionsendonukleasen erkannt werden. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung zu stellen, welche eine bisher von keinem derartigen Enzym erkannte Sequenz spezifisch zu erkennen und zu spalten vermag.
Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß durch eine Typ-II- Restriktionsendonuklease mit der Erkennungssequenz und der durch die Markierung definierten Spaltstelle
5'-GAT NNINNATC-3'
3'-CTA NN NNTAG-5' Die erfindungsgemäße neue Restriktionsendonuklease, die im folgenden als MamI bezeichnet: wird, hat ein Temperaturoptimum bei ca. 37°C. Das Enzym besitzt eine gute Aktivität zwischen pH 8,5 und pH 9,0 in 33 mmol/1 Tris/HCl Puffer mit 0,5 mmol/1 DTE (Dithioery- thritol), 10 mmol Mg-acetat und 66 mmol K-acetat. Das pH-Optimum liegt bei ca. pH 8,8. Ein Enzym, das isoschizomer zu MamI ist, ist nicht bekannt.
Die Erkennungssequenz läßt sich durch vollständigen Verdau der DNAs der Viren SV40 und Adeno 2, der Phagen Lambda, phiX1174, den Phagenderivaten M13mp8 und den Plasmiden pBR322 und pBR328 bestätigen. Diese DNA-Moleküle werden mit MamI behandelt.
Tabelle 1 zeigt einen Vergleich der experimentell beobachteten Schnittstellenspezifität mit einer computerermittelten Schnittstellenspezifität für ein Enzym, welches die Sequenz GATNNNNATC erkennt.
Die Spaltposition innerhalb der Erkennungssequenz des Enzyms läßt sich an einem M13-Derivat, das im Abstand von ca. 30 - 200 Basen zur Bindungsstelle des universalen Sequenzierprimers (Messing, J. et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 309 - 321) diese Erkennungssequenz trägt, bestimmen. An einzelsträngiger DNS des M13-Derivates werden zunächst mit dem universalen Sequenzierprimer Sequenzreaktionen nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode durchgeführt
(Sanger, F., et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560 - 564, Messing, J. et al. (1981) Nucl. Acids Res. 9, 309 -321).
Parallel dazu wird der Sequenzierprimer mit T4-Polynukleotid- Kinase und [γ-32P]ATP am 5' -Ende radioaktiv markiert. Nach Anhybridisieren dieses 5'-endmarkierten Sequenzierprimers an die einzelsträngige M13-DNS wird in einer Auffüllreaktion mit DNS-Poly- merase I, Klenow-fragment, und einer Desoxynukleotidtriphosphat- mischung aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP eine partiell doppelsträngige DNS hergestellt. Diese DNS, deren neusynthetisierter Strang am 5' -Ende radioaktiv markiert ist, wird nun mit der Restriktionsendonuklease MamI gespalten. Die Hälfte des Spaltansatzes wird zusätzlich noch mit T4-DNS-Polymerase in Gegenwart einer Mischung aller vier Desoxynukleotidtriphosphate behandelt, um glatte DNS- Enden zu erhalten.
Die Analyse der Reaktionsprodukte erfolgt durch Elektrophorese auf 8 mol/1 Harnstoff, 5 % Polyacrylamid-Sequenzgelen und anschließende Autoradiographie. Die Interpretation der Ergebnisse wird nach Brown, N.L. und Smith, M. (Methods in Enzymology 65 (1980) 391 - 401) durchgeführt. Durch Vergleich der Laufstrecken der radioaktiv markierten Fragmente mit der Sequenzleiter wird die Lage der Spaltstelle bestimmt. Die zusätzlich T4-DNS-Polymerase behandelten Proben zeigen im Vergleich zu der lediglich MamI-gespaltenen Probe identische Laufstrecken der Banden. Damit ist gezeigt, daß MamI ein keine überhängenden, sondern glatte DNS-Enden erzeugt. Die Spaltung von MamI erfolgt innerhalb der Erkennungssequenz daher mit folgender Spezifität:
5' ... G..ATNN NNATC....3.'
3' ......CTANN NNTAG.....5. '
Die experimentell bestimmte Anzahl der Schnittstellen ist identisch mit der Anzahl der Schnittstellen, die durch Computeranalyse mit den verschiedenen DNAs für die Sequenz GATNNNNATC erhalten wurde (Tabelle I). Zusätzlich wurden diese Daten noch mit den Tabellen aus Gene 10 (1980) 357 - 370, verglichen.
Vorzugsweise wird MamI gewonnen, indem man Mikroorganismen der Gattung Microbacterium züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt. Vorzugsweise wird Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 veirwendet. Zur Gewinnung können die üblichen biochemischen Aufreinigungsmethoden verwendet werden, wobei in den jeweils erhaltenen Fraktionen das Vorhandensein des Enzyms anhand der Spaltung seiner Erkennungssequenz leicht nachgewiesen werden kann. Als Substrat eignet sich beispielsweise Lambda-DNA. Die erhaltenen DNA-Fragmente werden in Agarosegelen in den für die Fragmentauftrennung üblichen Puffersystemen, in Gegenwart von Ethidiumbromid, elektro- phoretisch aufgetrennt.
Die für die Gewinnung des Enzyms verwendeten Microorganismen wachsen aerob in Merck Standard I Medium.
Der Mikroorganismus ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen, Gesellschaft für biotechnologische Forschung mbH, Mascheroder Weg 16, 3300 Braunschweig, BRD, hinterlegt und trägt die Hinterlegungsnummer DSM 20156. Die optimalen Wachstumsbe- dingungen sind bei 25°C, pH 7,2 - 7,8. Die Verdoppelungszeit beträgt etwa 2 Stunden.
Das Enzym wird isoliert und gereinigt durch die üblichen chemischen und mechanischen Methoden, beispielsweise durch Hochdruckdispersion, Ultraschall oder enzymatischen Aufschluß. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die Zellen einem Überdruck von 5 bar ausgesetzt. Die hierbei entstandene Zellenmasse wird in Tris HCl Puffer, pH 8,0, welcher Protease-Inhibitoren enthält, resuspendiert. Anschließend werden die Zellen über eine French-Presse aufgeschlossen. Die weitere Reinigung des Überstands wird vorzugsweise über Affinitätschromatographie, Molekularsiebchromatographie und IonentauscherChromatographie durchgeführt. Als Material für die Affinitätschromatographie geeignet ist beispielsweise Heparin-Sepharose CL-6B
(Pharmacia). Ein geeignetes Molekularsieb ist beispielsweise Ultrogel ACA54 (LKB) .
Als Anionentauseher geeignet ist das unter dem Namen DEAE Sepharose Fast FlowR (Pharmacia) erhältliche Produkt. Aber auch andere Chromatographiematerialien, die dem Fachmann bekannt sind, sind geeignet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter.
Beispiel 1
Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 wird bei 30°C 5 Stunden gezüchtet und in der späten logarithmischen bzw. stationären Phase geerntet. Als Kulturmedium wird Merck Standardmedium I verwendet.
Die Zellpaste (30 g Naßgewicht) wird in 2,4 Volumen Puffer A (40 mmol/l Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mmol/l EDTA, 7 mmol/1 2-Mercaptoethanol), welcher Proteaseinhibitoren enthält, resuspendiert. An schließend werden die Zellen durch dreimalige Passage einer
French-Presse bei 23.000 lb/inch2 aufgeschlossen und der Niederschlag abgetrennt. Der Überstand wird anschließend an einer mit NH4Cl/Puffer B vorgewaschenen Heparin-Sepharose-Säule fraktioniert. Zur Elution wird ein Gradient von 0 - 1 mol/l NH4CI verwendet. MamI wird in den Fraktionen zwischen 0,4 und 0,8 mol/l NH4CI gefunden. Die aktiven Fraktionen werden mit 50 % Ammonium- sulfat behandelt und der Niederschlag wird an einer UltrogelR AcA54-Säule fraktioniert, welche zuvor mit Puffer B, dem 0,5 mmol/l NaCl zugesetzt wird, equilibriert ist. Die aktiven Fraktionen werden gegen Puffer B dialysiert. Anschließend werden sie auf eine Q-SepharoseR Fast Flow-Säule, welche mit Puffer B equilibriert wurde, aufgegeben. Zur Elution wird ein Gradient von 0 - 1,0 mol/1 NaCl in Puffer B verwendet. MamI wird in den Fraktionen zwischen 0,4 und 0,6 mol/l NaCl gefunden.
Die aktiven Fraktionen werden zusammengegeben und gegen Lagerpuffer (20 mmol/l Tris-HCl, pH 8,0, 10 mmol/l 2-Mercaptoethanol und 100 mmol/l NaCl, 50% (v/v) Glycerin) dialysiert.
Beispiel 2
Bestimmung der Aktivität
Definition der Enzymeinheiten: 1 U MamI spaltet 1 μg Lambda-DNA innerhalb 1 Stunde bei 37°C in 25 μl Endvolumen.
Zu einer Mischung von 2,5 μl Inkubationspuffer (330 mmol/l Tris- HCl, pH 7,5/37°C, 100 mmol/l Magnesiumacetat, 660 mmol/l K-Acetat, und 5 mmol/l DTE) werden 17,9 μl Wasser und 3,6 μl Lambda DNA (optische Dichte: 5,6 OD/ml) sowie 1 μl Maml-Lösung (1 U/μl) zugegeben. Die Lösung wird eine Stunde bei 37°C inkubiert, auf Eis gekühlt und mit 5 μl eines Abstopp-Reagenses, bestehend aus 7 mmol/l Harnstoff, 20 % (w/v) Saccharose, 60 mmol/l EDTA und 0,01 % (w/v) Bromphenolblau versetzt. Anschließend wird eine Trennung durch Elektrophorese in 0,6 % Agarose-Gelen für 3 - 4 Stunden bei 100 V durchgeführt. Die erhaltenen Banden werden über Vergleich mit einem DNA-Längenstandard identifiziert.

Claims

Patentansprüche
1. Typ II -Restriktionsendonuklease mit der Erkennungssequenz und der durch die Markierung charakterisierten Schnittstelle
5 ' -GATNN NNATC-3 '
3 ' -CTANN NNTAG-5 '
2. Typ II-Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Mikroorganismen der Gattung Microbacterium erhältlich ist.
3. Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1 oder 2 dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 erhältlich ist.
4. Restriktionsendonuklease nach den Ansprüchen 1 bis 3, gekennzeichnet durch ein Temperatur-Optimum bei ca. 37°C und ein pH- Optimum zwischen 8,5 und 9,0.
5. Verfahren zur Gewinnung einer TypII-Restriktionsendonuklease mit der Erkennungssequenz und der durch die Markierung charakterisierten Spaltstelle
5'-GATNN NNATC-3'
3'-CTANN NNTAG-5' dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattung Microbacterium züchtet und das Enzym aus den Zellen gewinnt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Microbacterium ammoniaphilum DSM 20156 züchtet.
7. Verfahren nach den Ansprüchen 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zellen aufschließt und den Zeilüberstand gewinnt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Feinreinigung den Zeilüberstand einer Affinitätschromatographie, einer Molekularsiebchromatographie und einer Anionenaustauschchro- matographie unterwirft.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Affinitätschromatographie trägerfixiertes Heparin verwendet.
10. Verwendung einer TypII-Restriktionsendonuklease mit der Erkennungssequenz und der durch die Markierung charakterisierten
Schnittstelle
5'-GATNN NNATG-3'
3'-CTANN NNTAG-5' zur Erkennung und Spaltung der komplementären doppeisträngigen DNA-Sequenz 5 ' -GATNNNNATC-3 '.
EP90900137A 1988-11-30 1989-11-25 TYP II-RESTRIKTIONSENDONUKLEASE MamI Withdrawn EP0413777A1 (de)

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JPS6163286A (ja) * 1984-08-31 1986-04-01 Takara Shuzo Co Ltd 新規制限酵素及びその製造法

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