DE69104262T2

DE69104262T2 - Typ II Restriktionsendonuklease aus Pseudomonas alcaligenes und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Info

Publication number: DE69104262T2
Application number: DE69104262T
Authority: DE
Inventors: Carol Polisson
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1990-05-10
Filing date: 1991-04-16
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-04-17
Also published as: DE456356T1; JPH06335388A; JP3040544B2; DE69104262D1; EP0456356A3; EP0456356A2; EP0456356B1; US5098839A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Typ II-Restriktionsendonuklease, Pac I, erhältlich aus Pseudomonas alcaligenes, und ein Verfahren zu deren Herstellung.
Viele Bakterien enthalten Systeme, welche gegen das Eindringen von Fremd-DNA schützen. Bakterielle Zellen enthalten spezifische Endonukleasen, welche Doppelstrangeinschnitte in eindringende DNA machen, es sei denn, daß die DNA zuvor modifiziert wurde, gewöhnlich durch die geeignete entsprechende DNA-Methylase. Die Endonuklease mit ihrer begleitenden Methylase wird Restriktions-Modifikationssystem (im folgenden "R-M-System") genannt. Die prinzipielle Funktion von R-M-Systemen ist somit defensiv: Sie befähigen bakterielle Zellen, Infektionen mit Bakteriophagen und Plasmid-DNA-Molekülen zu widerstehen, welche ansonsten parasitieren können.
Bakterien besitzen gewöhnlich lediglich eine kleine Anzahl an Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen werden nach den Bakterien benannt, von welchen sie abgeleitet sind. So synthetisiert die Spezies Haemophilus aegyptius beispielsweise drei unterschiedliche Restriktionsendonukleasen, welche Hae I, Hae II und Hae III genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY 13 lediglich eine Restriktionsendonuklease, Eco RI, welche die Sequenz GAATTC erkennen.
Restriktionsendonukleasen, die erste Komponente der R-M-Systeme, wurden zuallererst bezüglich ihrer Erkennungssequenz und Spaltungsspezifität wegen ihres praktischen Nutzens zum molekularen Zerschneiden von DNA charakterisiert. Die Mehrzahl der Restriktionsendonukleasen erkennen Sequenzen mit einer Länge von 4-6 Nukleotiden. Kürzlich wurden Endonukleasen gefunden, welche Erkennungssequenzen mit einer Länge von 7-8 Nukleotiden aufweisen. Die meisten, jedoch nicht alle Erkennungsstellen, enthalten eine dyadische Symmetrieachse (dyad axis of symmetry) und in den meisten Fällen sind die Basen innerhalb der Stelle einzigartig spezifiziert. Diese symmetrische Beziehung in der Erkennungssequenz von Restriktionsendonukleasen wurde "Palindrome" genannt. Manche Restriktionsendonukleasen haben degenerierte oder relaxierte Spezifitäten insoweit, als sie mehrere Basen an denselben Positionen erkennen. Hae III, welches die Sequenz GGCC erkennt, ist ein Beispiel für eine Restriktionsendonuklease mit einer symmetrischen Beziehung, während Hae II, welches die Sequenz PuGCGCPy erkennt, Restriktionsendonukleasen typifiziert, welche eine degenerative oder relaxierte Spezifität aufweisen. Endonukleasen mit symmetrischen Erkennungsstellen spalten im allgemeinen symmetrisch innerhalb oder benachbart der Erkennungsstelle, während jene, die asymmetrische Stellen erkennen, dazu tendieren, in einem Abstand von der Erkennungsstelle, typischerweise von ungefähr 1-18 Basenpaaren von der Stelle weg, schneiden.
Die zweite Komponente der bakteriellen R-M-Systeme sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und stellen die Mittel zur Verfügung, durch welche Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und von fremder infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen dieselbe und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die korrespondierenden Restriktionsendonukleasen, jedoch anstatt die DNA aufzubrechen, modifizieren sie das eine oder andere Nukleotid innerhalb der Sequenz chemisch durch die Addition einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die korrespondierende Restrikionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA aus einer Bakterienzelle ist immer vollständig modifiziert aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase und ist daher vollständig unempfindlich gegenüber dem Vorliegen der endogenen Restriktionsendonuklease. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbar fremde DNA ist gegenüber Restriktionsendonukleaseerkennung und -angriff empfindlich.
Mehr als 1000 unterschiedliche Restriktionsendonukleasen wurden aus Bakterienstämmen isoliert und teilen gemeinsame Spezifitäten. Restriktionsendonukleasen, welche identische Sequenzen erkennen, werden "Isoschizomere" genannt. Obwohl die Erkennungssequenzen der Isoschizomere dieselben sind, können sie in bezug auf ihre Spaltungsstelle (z.B. Xma I V. Sma I Endow, et al., J.Mol.Biol. 112:521 (1977); Waalwijk, et al., Nucleic Acids Res. 5:3231 (1978)) und in der Spaltungsgeschwindigkeit an unterschiedlichen Stellen (XhoI v. Pae R7I Gingeras, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:402 (1983)) variieren.
Spezifische Typ II-Restriktionsendonukleasen sind bereits für zahlreiche DNA-Sequenzen bekannt, jedoch sind eine große Anzahl an Restriktionsenzymen mit diversifizierten enzymatischen Charakteristiken für eine erfolgreiche genetische Manipulation notwendig. Insbesondere sind Restriktionsendonukleasen, welche acht spezifische Nukleotide in ihren Erkennungssequenzen erfordern, sehr selten. Tatsächlich wurden bis heute lediglich drei identifiziert, Not I (GCGGCCGC), Sfi I (GGCCNNNNNGGCC) und Fse I (GGCCGGCC).
Demzufolge besteht ein anhaltender Bedarf für Typ II-Restriktionsendonukleasen, welche neue DNA-Sequenzen erkennen und insbesondere jene, welche Erkennungssequenzen mit acht Nukleotiden erkennen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine neue Restriktionsendonuklease zur Verfügung gestellt, welche erhältlich ist aus dem Bakterium Pseudomonas alcaligenes Endonuklease, welche im folgenden mit "Pac I" bezeichnet ist, wobei die Endonuklease:
(1) die Basensequenz in einem doppelsträngigen DNA-Molekül wie unten gezeigt erkennt,
5'-TTAAT TAA-3'
3'-AAT TAATT-5'
(worin A und T Adenin bzw. Thymin darstellen);
(2) die Sequenz in den Phosphodiesterbindungen zwischen T und T, wie mit den senkrechten Pfeilen bezeichnet, spaltet; und
(3) doppelsträngige Adeno 2, T7 und M13mp18-DNA in einer Position spaltet, wogegen pBR322, phiX174, pUC19, SV40 oder Lambda-DNAs nicht gespalten werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der neuen Restriktionsendonuklease Pac I, welches das Kultivieren von Pseudomonas alcaligenes unter Bedingungen umfaßt, welche für die Expression von Pac I geeignet sind, Sammeln der Zellen, Erhalten eines zellfreien Extraktes daraus und Trennen und Sammeln der Restriktionsendonuklease Pac I aus dem zellfreien Extrakt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 - Bestimmung der Spaltungsstelle für Pac I.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird Pac I erhalten durch Kultivieren vom Pseudomonas alcaligenes-Stamm NEB 585 und Gewinnen des Enzyms aus den Zellen.
Pseudomonas alcaligenes-Stamm NEB 585 wurde isoliert aus einer Wasserprobe aus einem in Louisiana gelegenen Ausfluß aus einem See (bayou) 1989. Die Probe wurde zu New England Biolabs gebracht und auf einem LB Agar plattiert. Ausgewählte Kolonien wurden genommen und plattengereinigt. Gereinigte Proben wurden auf Endonuklease-Aktivität untersucht gemäß den Techniken, welchen bei Schildkraut Genetic Engineering Principles and Methods, (1984) Setlow, J.K. et al., eds. Plenum Publishing, Vol. 6, S. 117, dessen Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Eine Probe, welche identifiziert ist als Pseudomonas alcaligenes NEB 585 enthielt die neue Restriktionsendonuklease Pac I.
Eine Probe des Pseudomonas alcaligenes-Stammes NEB 585 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 7. Mai 1990 hinterlegt und trägt die Zugriffsnummer 55044.
Zum Gewinnen des Enzymes der vorliegenden Erfindung kann man P. alcaligenes unter Verwendung jeglicher geeigneter Technik wachsen lassen, z.B. kann man P. alcaligenes in einem Medium, welches Trypton, Hefeextrakt und NaCl (pH 7,2) umfaßt, wachsen lassen und bei 30ºC unter Bewegung und Belüftung inkubieren. Die Zellen werden in dem späten logarithmischen Stadium unter Verwendung von Zentrifugation gesammelt und bei -70ºC gefriergelagert.
Nachdem die Zellen geerntet und gefroren wurden, kann das Enzym aus der gefrorenen Zellpaste unter Verwendung herkömmlicher Enzymreinigungsverfahren isoliert und gereinigt werden. Beispielsweise wird die erhaltene Zellpaste aufgetaut und in einer Pufferlösung suspendiert, und einer Behandlung ausgesetzt, welche die Extraktion des Enzyms durch die Pufferlösung erlaubt, wobei eine derartige Behandlung Beschallung, Hochdruckdispersion oder enzymatische Verdauung einschließt. Der Zellrest wird dann durch Zentrifugation entfernt und der Überstand, welcher das neue Enzym enthält, kann durch Ionenaustauschchromatographie, beispielsweise unter Verwendung von Phosphocellulose oder DEAE-Cellulose, Molekularsiebchromatographie und Affinitätschromatographie, beispielsweise unter Verwendung von Heparinagarose oder DNA- Cellulose oder einer Kombination dieser Verfahren gereinigt werden, um das Enzym der vorliegenden Erfindung herzustellen.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung, zusammen mit seiner korrespondierenden DNA-Methylase, kann ebenfalls durch Verwendung rekombinanter DNA-Techniken, wie beispielsweise der Methylaseselektionstechnik, bei Wilson et al., EPO-Veröffentlichungsnummer 019413, deren Offenbarung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist, erhalten werden. Zum Beispiel kann die Methylaseselektionstechnik in drei Schritten durchgeführt werden. Zuerst wird DNA aus einem Bakterienstamm, welcher ein R-M-System codiert, gereinigt, teilweise mit Klonierungsendonukleasen verdaut und dann mit einem gespaltenen dephosphorylierten Plasmidvektor ligiert. Die ligierte DNA wird dann in E.coli übertragen, die Transformanten werden zusammengegeben und die Plasmidpopulationen werden gereinigt, um Bibliotheken zu bilden. Als nächstes werden die Bibliotheken mit einer Selektionsendonuklease verdaut, eine solche, welche durch die spezifische Modifikation, welche die Methylase verleiht, blockiert werden kann. Die Verdaus werden in E.coli zurückübertragen, um unverdaute Moleküle zu gewinnen. Die Transformanten können sofort gescreent werden oder zusammengegeben werden und die Plasmide können durch weitere Reinigungs- und Selektionsrunden cycliert werden. Schlußendlich werden einzelne Transformanten gesammelt und Minipräparationen ihrer Plasmide werden durchgeführt. Die Plasmide werden auf Widerstandsfähigkeit gegenüber Verdauung mit der interessierenden Endonuklease und auf das Beinhalten von gemeinsamen Inserts analysiert. (Das Methylasegen wird durch wenigstens ein Fragment codiert, welches im allgemeinen in sämtlichen echten Methylaseklonen vorliegt). Zellextrakte werden hergestellt aus positiven Kandidaten und in vitro auf Methyltransferaseaktivität und Endonukleaseaktivität untersucht.
Es wurden jedoch eine Anzahl von R-M-Systemen gefunden, welche komplizierter sind und daher schwieriger unter Verwendung von rekombinanten DNA-Techniken zu erhalten sind und eine Modifikation des oben beschriebenen Versuches zur Klonierung von R-M-Systemen erfordern. Siehe Lunnen et al., (1988) Gene 74:25-32, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist. So können beispielsweise in manchen Systemen die Methylase und Endonukleasegene nicht verknüpft werden oder die Endonuklease, welche zum Fragmentieren der bakteriellen DNA benutzt wird, kann entweder eines oder beide R-M-Gene schneiden. in anderen Systemen, wie beispielsweise BamH I oder Dde I kann die Methylase nicht hinreichend gegen die Verdauung mit der korrespondierenden Endonuklease geschützt werden, entweder aufgrund der ineffizienten Expression in dem Transformationswirt oder aufgrund von inhärenten Kontrollmechanismen für die Expression der Methylase- und Endonukleasegene oder aus unbekannten Gründen. Es wurde ebenfalls herausgefunden, daß Modifikation für die Wirtszelle, welche für die Transformation ausgewählt wird, schädlich ist. Eine andere Schwierigkeit beim Klonieren von R-M-Systemen ist, daß die Endonuklease, welche geklont werden soll, nicht in genügender Reinheit oder Menge für eine Methylaseselektion verfügbar ist. Schließlich liegen in vielen Systemen Schwierigkeiten im Exprimieren des Endonukleasegenes in einer Transformationswirtszelle einer unterschiedlichen bakteriellen Spezies.
Die Erkennungssequenz der Endonuklease der vorliegenden Erfindung Pac I kann bestimmt werden durch Doppel-Verdauen von Adeno 2, T7 und M13mp18 DNA mit der erfindungsgemäßen Restriktionsendonuklease und einem Restriktionsenzym, welches die Test-DNA an bekannten Stellen spaltet. Die Größe des erhaltenen DNA-Restriktionsfragmentes kann unter Verwendung von Agarosegel-Elektrophorese bestimmt werden. Unter Verwendung dieser Technik wurden die folgenden Resultate erhalten:
(a) Die Einzelerkennungssequenz von Pac I auf Adeno2-DNA wurde bei ungefähr 28500 Basenpaaren kartiert durch Analyse gegen Cla I, Nde I und Spe I gespaltene Adeno2-DNA. Die Sequenz 5'TTAATTAA3' tritt lediglich an nur einer Position 28618 Basenpaare auf.
(b) Die Einzelerkennungssequenz von Pac I auf T7-DNA wurde auf ungefähr 27000 Basenpaare kartiert durch Analyse gegen AlwI, Ban II, Bcl I, Bgl II, BssH II, BstE II, EcoN I, Mlu I, Nco I, Nhe I, Sfi I und Stu I gespaltene T7-DNA. Die Sequenz 5'TTAATTAA3' tritt bei nur einer Position 27222 Basenpaare auf.
(c) Die Einzelerkennungssequenz von Pac I auf M13mp18 DNA wurde bei ungefähr Position 4096 Basenpaare kartiert durch Analyse gegen SnaB I, Bsm I und Bgl II gespaltene M13mp18 DNA. Die Sequenz 5'TTAATTAA3' tritt lediglich bei einer Position 4132 Basenpaaren auf.
(d) Es wurde keine Spaltung von pBR322-DNA, pUC19-DNA, phiX174-DNA, SV40-DNA oder Lambda-DNA beobachtet. Die Sequenz 5'TTAATTAA3' tritt innerhalb der Sequenz dieser Moleküle nicht auf.
Wie unten in Tabelle 1 gezeigt ist, stimmen die Anzahl und Größe der durch Verdau mit Pac I an acht DNA-Molekülen erzeugten Fragmente mit der Computer-vorhergesagten Anzahl und Größen der Fragmente, welche durch eine Spaltung bei der Sequenz 5'TTAATTAA3' erzeugt würden, überein.
Aus den obigen Daten wurde daher geschlossen, daß Pac I die Sequenz 5'TTAATTAA3' erkennt.
Der Spaltungspunkt an der Erkennungssequenz der Endonuklease der vorliegenden Erfindung kann bestimmt werden unter Verwendung der Dideoxysequenzierung (Sanger, F. et al.PNAS (1977) 74:5463-5467), um die terminale Basensequenz zu analysieren, welche erhalten wird durch Spalten von pvPAC I- 11B, einem pBR322 abgeleiteten doppelsträngigen Plasmid, mit dem Enzym der vorliegenden Erfindung. pvPAC I-11B wird gebildet unter Verwendung von Standardtechniken, um einen 8- Nukleotidlinker, welcher die Pac I-Erkennungssequenz 5'TTAATTAA3' umfaßt, in die PVU II-Stelle von pBR322 (ATCG Nr. 37017) zu insertieren. Unter Verwendung der oben beschriebenen Technik und weiter beispielhaft in Beispiel II dargestellt, wurde geschlossen, daß die Pac I- Spaltungsposition zwischen den fünften und sechsten Nukleotiden T und T in ihrer Erkennungssequenz liegt, woraus sich eine 3' Zweibasenausdehnung wie unten gezeigt ergibt
5'TTAAT TAA-3'
3'AAT TAATT-5'
wobei die Spaltungsposition durch die vertikalen Pfeile definiert ist.
Das erfindungsgemäße Enzym weist die folgenden zusätzlichen Eigenschaften auf:

(a) NaCl-Konzentration:

Die optimale Salzkonzentration betrug 0 mM NaCl, die relative Aktivität beträgt 33% für 100 und 150 mM NaCl. Die Aktivität war höher bei einer Konzentration von 0 bis 5 mM NaCl als bei einer Konzentration von 150 mM NaCl.

(b) Temperatur:

Die Aktivität war höher bei 37ºC als bei 25ºC.

(c) pH:

Die Aktivität war bei pH 7,0 als bei pH 8,0. Tabelle 1 Anzahl der experimentell erhaltenen Spaltungsstellen Anzahl der Computersuche erhaltenen Spaltungsstellen Experimentell abgeleitete Lokalisierung der Erkennungssequenz Lokalisierung von TTAATTAA, erhalten durch Computersuche Adeno 2 T7 M13mp18 pBR322 PhiX174 pUC19 SV40 Lambda
Die folgenden Beispiele werden gegeben, um die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung zu illustrieren, wie sie derzeit bevorzugt ausgeführt werden. Es wird verständlich sein, daß die Beispiele verdeutlichend sind und daß die Erfindung nicht als eingeschränkt gedacht ist, mit Ausnahme wie in den angehängten Ansprüchen angezeigt.

Beispiel I

Pseudomonas alcaligenes-Stamm NEB 585 (ATCC Nr. 55044) wurde im Medium gezüchtet, welches aus 10g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl (auf pH 7,2 eingestellt) bestand. Die Zellen wurden bei 30ºC inkubiert, bis zum späten logarithmischen Stadium unter Belüftung und Bewegung. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und bei -70ºC gefroren gelagert.
110 g der Zellen, welche oben erhalten wurden, wurden in 3 Volumina Puffer A (0,3 NaCL, 10 mM KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, 10mM β-ME, pH 6,0) suspendiert. Es wurden 25 ug/ml Phenylmethylsulfonylfluorid zugegeben und die Zellen wurden beschallt bis ungefähr 46 mg Protein/g Zelle freigesetzt waren. Das Lysat wurde bei 4ºC 70 Minuten bei 17000 UPM (Beckman JA17-Rotor) zentrifugiert.
Der erhaltene Überstand wurde bei 4ºC eine Stunde bei 40000 UPM (Beckman Ti50.2-Rotor) ultrazentrifugiert. Die Überstandslösung wurde auf eine DEAE-Sepharosesäule (138 ml) gebracht. Der Durchfluß wurde gesammelt und Glycerin wurde auf 5% zugegeben. Die Lösung wurde für vier Stunden gegen 4 Liter Puffer B (0,15 M NaCl, 10 mM KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-ME, 5% Glycerin, pH 6,0) dialysiert.
Das Dialysat wurde auf eine Heparin-Sepharosesäule (93 ml) aufgetragen. Die Säule wurde dann mit 200 ml Puffer B gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0,15 bis 1,0 M NaCl in Puffer B eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf Pac I-Aktivität (10 Minuten Inkubation) und Exonukleaseaktivität, wie unten beschrieben, getestet. Fraktionen, die bei 0,5 mol/l NaCl eluierten, besaßen Pac I-Aktivität und wurden gesammelt. Die Exonukleaseaktivität wurde sofort vor und auf der Spitze der Pac I-Aktivität bestimmt.
Zu den Fraktionen mit Pac I-Aktivität wurde Puffer B ohne Salz zugegeben, bis die Leitfähigkeit derjenigen von 0,15 N NaCl gleich war, das Volumen betrug 125 ml. Diese Lösung wurde auf eine Phosphocellulosesäule (27 ml) gegeben und die Säule wurde mit 50 ml Puffer B gewaschen und das Enzym wurde mit einem 250 ml-Gradienten von 0,15 bis 1,0 M NaCl in Puffer B eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf Pac I und Exonukleaseaktivität, wie unten beschrieben, getestet. Die Exonukleaseaktivität eluierte auf der Höhe der Pac I- Aktivität.
Die Fraktionen, welche Pac I-Peakaktivität besitzen und welche zwischen 0,4 und 0,45 mol/l NaCl eluierten, wurden gesammelt und sofort auf eine G-75 Sephadexsäule (2,5 x 96 cm) gegeben. Die Säule wurde langsam (ein Tropfen/15 Sekunden) mit Puffer C (0,15 M NaCl, 5% Glycerin, 10 mM β-Me, 10 mM KPO&sub4;, 0,1 mM EDTA, pH 6,0) eluiert. Die erhaltenen Fraktionen wurden auf Pac I- und Exonuklease-aktivität untersucht. Die Exonukleaseaktivität eluierte mit der Pac I-Aktivität.
Die Fraktionen wurden gesammelt, untersucht und Fraktionen, die zwischen 220 und 245 ml eluierten und Pac I-Aktivität enthielten, wurden zusammengegeben und gegen 4 Liter Puffer D (5% Glycerin, 10 mM β-Me, 50 mM NaCl, 20 mM KPO&sub4;, pH 6,0) für vier Stunden dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Heparin- TSK-HPLC-Säule gegeben. Die Enzymaktivität wurde mit einem 52 ml linearen Gradienten von 50 mM NaCl bis 0,6 N NaCl in Puffer D eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt und 2 ul jeder Fraktion wurde auf Pac I-Aktivität (15 Minuten Inkubation) und Exonukleaseaktivität untersucht. Die Pac I- Peakaktivität fand sich in Fraktionen, welche zwischen 0,37 und 0,4 mol/l NaCl eluierten. Die Exonuklease-Peakaktivität fand sich bei Fraktionen, welche zwischen 0,4 und 0,43 mol/l NaCl eluierten.
Fraktionen, welche Pac I-Peakaktivität besitzen, wurden zusammengegeben. Gleiche Mengen an 100% Glycerin wurden zu den zusammengegebenen Fraktionen gegeben und BSA wurde zu 200 ug/ml zugegeben. Das erhaltene Enzym war im wesentlichen rein und im wesentlichen frei von irgendwelcher unspezifischer Endonuklease und Exonukleaseaktivität. Das Enzym wurde in 50% Glycerin, 10 mM 10 mM β-Me, 190 mM NaCl, 20 mM KPO&sub4;, pH 6,0 bei -20ºC gelagert.

Aktivitätsbestimmung

Pac I-Aktivität:

Eine 2 ul-Probe der zu testenden Fraktion wurde zu 25 ul der Substratlösung (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 100 ug/ml BSA, pH 6,0, enthaltend 0,5 ug Pst I linearisierte pvPac I-IIB-DNA) gegeben. Die enzymatische Reaktion wurde bei 37ºC für die angezeigte Zeit, 10 oder 15 Minuten, inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch Zugeben von 7,0 ul einer Stoplösung (50% Glycerin, 50 mM EDTA pH 8,0 und 0,02% Bromphenolblau). Die Reaktionsmischung wurde auf ein 1,0% Agarosegel aufgetragen und elektrophoretisiert. Die erhaltenen Banden wurden identifiziert im Vergleich mit DNA- Längenstandards.

Exonukleaseaktivität:

Eine 2 ul-Probe der Proteinlösung wurde zu 50 ul von 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 100 ug/ml BSA, pH 6,0, enthaltend 25 ug/ml ³H-DNA gegeben. Die Reaktion wurde eine Stunde bei 37ºC inkubiert.

Einheitsdefinition:

Eine Pac I-Einheit spaltet 1 ug pvPac I- IIB-DNA vollständig innerhalb einer Stunde bei 37ºC.

Optimale Pufferbedingungen:

Für optimale Pac I-Aktivität wurde der folgende Puffer verwendet: 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, 100 kg/ml BSA, pH 7.

Beispiel 2

Bestimmen der Pac I-Spaltungsstelle

Denaturieren von pvPac I-IIB

3 ug pvPac I-IIB gereinigte Plasmid-DNA wurde aufgelöst in einer Gesamtmenge von 20 ul dH&sub2;O in einem 1,5 ml-Eppendorf- Röhrchen. 2 ul 2M NaOH, 2 mM EDTA wurden zugegeben und die Lösung 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 7 ul dH&sub2;O (4ºC), 6 ul 3M Na-Acetat pH 5,0 (4ºC) und 75 ul ETOH (4ºC) wurden schnell zugegeben. Die Lösung wurde sofort in ein Trockeneis/2-Propanol-Bad für 15 Minuten gebracht, um die DNA zu fällen. Die DNA wurde durch Zentrifugation für 10 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge pelletiert, 95% des Überstandes wurden durch Aspiration entfernt, 300 ul 70% ETOH/30% dH&sub2;O wurde zugegeben und die Lösung für 5 Minuten zentrifugiert, gefolgt von Entfernen von ca. 95% des Überstandes. Das DNA- Pellet wurde dann vollständig für 10 Minuten in einem Speed- Vac-Gerät getrocknet.

Sequenzierungsreaktionen

Es wurde ein Oligonukleotidprimer (5'CGCTTACAGACAAGGTGTG3') synthetisiert unter Verwendung von Standardtechniken, um durch die Pac I-Stelle von pvPac I-IIB zu sequenzieren.
Zu dem getrockneten Pellet wurden 13,5 ul dH&sub2;O, 2,25 ul 10X- Sequenzierpuffer (75 mM Tris pH 7,6, 55 MM DTT, 50 mM MgCl&sub2;) und 1,5 ul einer 1,0 um Primerlösung hinzugefügt. Die Lösung wurde bei 37ºC 30 Minuten inkubiert. 3 ul [alpha-³&sup5;S] dATP mit 800 Ci/mmol, 10 mci/ml wurden hinzugegeben. 1,5 ul (7,5 Einheiten) Klenow-Fragment-DNA-Polymerase (erhalten von New England Biolabs, Inc.) wurden hinzugegeben. Diese Lösung wurde TPK-Mischung genannt. 3,2 ul der TPK-Mischung wurden aliquotiert in 3 ul von Deoxy-/Dideoxynukleotidreaktionsmischungen (erhalten von New England Biolabs, Inc.) für die A, C, G und T-Sequenzierungsreaktionen. Die verbleibende TPK- Mischung wurde zu 9 ul des A-Sequenzierungsreaktionmixes gegeben, welcher keine Dideoxynukleotide enthielt, um einen markierten Strang von DNA zu erzeugen, der sich durch die Pac I-Erkennungsstelle erstreckt. Die Reaktionen werden 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. 1 ul der dNTP-Chase-Lösung (erhalten von New England Biolabs, Inc.) wurde zu den A, C, G und T- Reaktionen gegeben. 3 ul Chase wurde zu der Extensionsreaktion gegeben. Die Reaktionen wurden weitere 15 Minuten bei 37ºC inkubiert. 6 ul Stoplösung (erhalten von New England Biolabs, Inc.) wurden zu den A, C, G und T-Sequenzierungsreaktionen gegeben und diese wurden bei -20ºC gelagert, bis man sie auf einem Sequenzierungsgel laufen ließ. Die Extensionsreaktion wurde 25 Minuten bei 70ºC inkubiert, um die DNA-Polymerase (Klenow) zu inaktivieren, dann bei Raumtemperatur 10 Minuten inkubiert. 9 ul der Extensionsreaktion wurden in ein 0,5 ml Eppendorf-Röhrchen gebracht und 6 ul wurden in ein zweites Röhrchen gebracht. Zu dem 9 ul-Röhrchen wurde 1 ul (ungefähr 0,75 Einheiten) Pac I-Endonuklease gegeben. Die Reaktion wurde gemischt und 2 ul wurden zu dem zweiten Röhrchen übertragen. Die Enzymreaktionen wurden 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Nach dem Verdau wurden 4 ul der Reaktionen entfernt und mit 5 ul Stoplösung gemischt. Zu den verbleibenden 4 ul wurden 0,25 ul (1,25 Einheiten) Klenow-Fragment gegeben und die Reaktion wurde 12 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, nach welchen 5 ul Stoplösung zugegeben wurden. Die Enzymverdauungsreaktionen wurden ebenfalls bei -20ºC gelagert, bevor man das Gel laufen ließ. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 8% bis-Acrylamidsequenzierungsgel elektrophoretisiert mit dem Pac I-Verdau der Extensionsreaktion neben der Reihe von Sequenziensreaktionen, welche aus demselben Primer (s. Fig. 1) hergestellt wurden.
Der Verdau des Extensionsreaktionsproduktes mit Pac I-Endonuklease erzeugte eine Bande, welche mit dem dritten T der Pac I-Erkennungssequenz 5'TTAA TAA3' comigrierte. Die Behandlung mit Klenow-Fragment im Anschluß an Pac I-Verdau erzeugte ein Fragment, welches mit dem 5'A in der Pac I Erkennungssequenz von 5'TT ATTAA3' comigrierte. Diese Ergebnisse zeigten, daß die Pac I-Spaltungsstelle zwischen dem fünften und sechsten Nukleotiden T und T in der Erkennungssequenz 5'TTAAT/TAA3' lag und demzufolge eine Zweibasen-3'-Extension erzeugten.

Claims

1. Eine im wesentlichen reine Restriktionsendonuklease vom Typ II, erhältlich aus Pseudomonas alcaligenes, welche die folgende Basensequenz in doppelsträngigen Desoxyribonucleinsäuremolekülen erkennt:

5'-TTAATTAA-3'

3'-AAT TAATT-5',

welche eine Spaltungsstelle aufweisen, welche durch die Pfeile definiert ist.

2. Die Typ II Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, welche eine höhere Aktivität bei 37ºC als bei 25ºC aufweist.

3. Die Typ II Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, welche doppelsträngige Desoxyribonucleinsäure Adeno2, T7 und M13mp18 in einer Position spaltet.

4. Die Typ II Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, welche bei pH 7.0 eine höhere Aktivität als bei pH 8.0 aufweist.

5. Die TypII Restriktionsendonuklease nach Anspruch 1, welche eine höhere Aktivität bei einer NaCl Konzentration von 0 bis 5 mM als bei einer Konzentration von 150 mM aufweist.

6. Ein Verfahren zum Erhalten der Typ II Restriktionsendonuklease gemäß Anspruch 1, welches umfaßt:

Kultivieren einer Probe aus Pseudomonas alcaligenes unter Bedingungen, welche die Herstellung der Endonuklease begünstigen und Trennen der Endonuklease davon.