JP3040544B2 - シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）から得ることができる新規なタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼとその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【産業上の利用分野】本発明はシュードモナス・アルカ
リゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ）から得られる新規なタイプＩＩ制限エンドヌク
レアーゼＰａｃＩとその製法に関するものである。

【従来の技術】多くの細菌は外来のＤＮＡの侵入に対抗
して身を守る機構をもっている。細菌の細胞は、外部か
ら侵入したＤＮＡが通例それに適切に対応したＤＮＡメ
チラーゼにより事前に修飾されていないならばその侵入
したＤＮＡの二本鎖を切断する特異的なエンドヌクレア
ーゼをもっている。エンドヌクレアーゼとそれに付随す
るメチラーゼは制限−修飾系（以下「Ｒ−Ｍ系」と略
す）とよばれている。このようにＲ−Ｍ系の主要な機能
は防御的である。即ち、それらの系により、これがなけ
れば細菌に寄生し得るバクテリオファージやプラスミド
のＤＮＡ分子による感染に対して、細菌細胞が抵抗する
ことが可能になる。細菌は、通例種（ｓｐｅｃｉｅｓ）
あたり僅かな数の制限エンドヌクレアーゼしかもってい
ない。エンドヌクレアーゼはそれらが由来した細菌に因
んで命名される。例えばＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ａｅ
ｇｙｐｔｉｕｓ は三つの異なる制限エンドヌクレアー
ゼを生合成しており、それらはＨａｅＩ，ＨａｅＩＩ，
そしてＨａｅＩＩＩと命名されている。これらの酵素は
配列（ＡＴ）ＧＧＣＣ（ＡＴ），ＰｕＧＣＧＣＰｙそし
てＧＧＣＣを夫々認識して切断する。一方、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＲＹ１３は僅かに一つの制限エ
ンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩのみを生合成し、それは配
列ＧＡＡＴＴＣを認識する。Ｒ−Ｍ系の第一番目の構成
要素である制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の切
断に利用するという実用的理由から、主として、それら
が認識する塩基配列と、切断の特異性によって特徴付け
られている。制限エンドヌクレアーゼの大多数はヌクレ
オチド４〜６個の長さの塩基配列を認識する。最近にな
って、ヌクレオチド７〜８個の長さの塩基配列を認識す
る制限エンドヌクレアーゼが発見されている。すべてで
はないが、大多数の認識部位は二回（回転）対称軸をも
っており、たいていの場合、その部位内のすべての塩基
その種類・組合せ・配列がただ一つだけに規定される。
制限エンドヌクレアーゼの認識配列におけるこの対称関
係は「パリンドローム」と呼ばれている。一方、制限エ
ンドヌクレアーゼによっては、同一の位置において複数
種の塩基を認識することが出来るという意味で、特異性
が低下していたり緩くなっていたりするものがある。塩
基配列ＧＧＣＣを認識するＨａｅＩＩＩは対称性をもつ
制限エンドヌクレアーゼの一例であり、一方、配列Ｐｕ
ＧＣＧＣＰｙを認識するＨａｅＩＩは特異性が低下ある
いは緩和されている制限エンドヌクレアーゼの一つの典
型である。対称の認識部位をもつエンドヌクレアーゼは
一般に認識部位内あるいはその近辺で対称的に切断する
が、非対称部位を認識するエンドヌクレアーゼは認識部
位から多少離れて、典型的にはその部位から約１〜１８
塩基対離れた所を切断する傾向がある。細菌のＲ−Ｍ系
の第二の構成要素は、修飾メチラーゼである。これらの
酵素は制限エンドヌクレアーゼに対して補足的であり、
細菌が自分自身のＤＮＡを防御すると共に外来の感染性
ＤＮＡから自身のＤＮＡを区別することができるように
する手段を提供する。修飾メチラーゼはその対応する制
限エンドヌクレアーゼと同一のヌクレオチドからなる認
識配列を認識して結合するが、そのＤＮＡを切断する代
りに、その塩基配列内のヌクレオチドのどれか一つにメ
チル基を付加することにより化学的に修飾する。メチル
化がなされると、対応する制限エンドヌクレアーゼはも
はやその認識配列に結合しないし切断もしない。細菌細
胞のＤＮＡは常にその修飾メチラーゼの働きのおかげで
完全に修飾されており、それ故に、内因性の制限エンド
ヌクレアーゼの存在に対して感受性を全くもたない。制
限エンドヌクレアーゼの認識と攻撃に対して感受性があ
るのは未修飾のＤＮＡ、すなわち外来として識別できる
ＤＮＡだけである。１０００以上の異なる制限エンドヌ
クレアーゼが細菌株から単離されており、多くのものは
共通の特異性を共有している。同一の塩基配列を認識す
る制限エンドヌクレアーゼは「アイソシゾマー」と呼ば
れている。アイソシゾマーが認識する塩基配列は同一で
あるけれども、切断の部位は異なっていることがあり
（例えば、ＸｍａＩとＳｍａＩ。Ｅｎｄｏｗ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１２：５２１，（１９
７７）；Ｗａａｌ ｗｉｊｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５：３２３１，（１９７
８））、またいろいろな部位における切断の割合が異な
ることがある（ＸｈｏＩとＰａｅＲ７Ｉ。Ｇｉｎｇｅｒ
ａｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４０２，（１９８３））。
既に、数多くのＤＮＡ配列に対して特異的なタイプＩＩ
制限エンドヌクレアーゼが知られている。けれども遺伝
子操作を成功させるためには、多様な酵素特性をもった
沢山の制限酵素が必要である。特に、認識配列中に８つ
の特異的ヌクレオチドを必要とする制限エンドヌクレア
ーゼは全く稀である。事実、今日までに同定されている
のは僅かに３つのみである。それらはＮｏｔＩ（ＧＣＧ
ＧＣＣＧＣ）、ＳｆｉＩ（ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣ
Ｃ）、そして、ＦｓｅＩ（ＧＧＣＣＧＧＣＣ）である。
それ故、新規なＤＮＡ配列を認識するタイプＩＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ、特に８つのヌクレオチドからなる配
列を認識するタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼに対す
る必要性が継続して存在している。

【発明の概要】本発明に従って、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓから得られる新規な制限エ
ンドヌクレアーゼが提供される。本明細書中では、この
エンドヌクレアーゼを“ＰａｃＩ”と呼ぶ。このエンド
ヌクレアーゼは次の特性をもつ。 （１）二本鎖ＤＮＡ分子内の下記の塩基配列を認識す
る。 （Ａはアデニン、Ｔはチミンを意味する）。 （２）垂直な矢印で示した如くＴとＴの間のホスホジエ
ステル結合において、その配列を切断する。 （３）Ａｄｅｎｏ２，Ｔ７そしてＭ１３ｍｐ１８の二本
鎖ＤＮＡを一つの位置で切断するが、一方、ｐＢＲ３２
２，φＸ１７４，ｐＵＣ１９，ＳＶ４０あるいはλＤＮ
Ａは切断しない。本発明は更に、この新規な制限エンド
ヌクレアーゼＰａｃＩの製法に関する。この方法は、Ｐ
ａｃＩの発現に好適な条件下でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ａｌｃ ａｌｉｇｅｎｅｓ を培養し、菌体細胞を収集
し、菌体細胞から無細胞抽出物を得、無細胞抽出物から
制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩを分離・収集すること
からなる。本発明によると、ＰａｃＩはＰｓｅｕｄｏｍ
ｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＮＥＢ５８５株を
培養し、その細胞から酵素を回収することによって得ら
れる。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ＮＥＢ５８５株は１９８９年にルイジアナ州のバイ
ユーから採取した水の試料から単離したものである。試
料の水をＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓへ持
ち帰り、ＬＢ寒天培地上で平板培養した。選択されたコ
ロニーを採取し、平板培養で精製した。精製した検体
は、Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎｕｍ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，６巻，１１７頁，１９８４
年，編集者Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．その他にＳｃｈｉｌ
ｄｋｒａｕｔにより記述された方法に従ってエンドヌク
レアーゼ活性を測定した。この文献はここで引用したこ
とにより、その開示内容が本明細書中に含まれているも
のとする。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅ
ｎｅｓ ＮＥＢ５８５株と命名した１つの検体が新規な
制限エンドヌクレアーゼＰａｃＩをもっていた。Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ＮＥＢ５
８５株のサンプルは１９９０年５月７日付でＡｍｅｒｉ
ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ
ｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄託されており、受託番号は５５０
４４である。本発明の酵素を得るためには、適切な技術
のいずれかを使用してＰ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓを増
殖させればよい。Ｐ．ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓはトリプ
トファン、酵母エキスおよびＮａＣｌ（ｐＨ７．２）か
らなる培地で成長させることが出来、撹拌と通気をしな
がら３０℃で培養することが出来る。対数増殖期の後期
に遠心分離により細胞を集め、−７０℃で凍結して保存
する。細胞を収穫して凍結させた後、従来の酵素精製法
を使用して凍結細胞ペーストから酵素を単離・精製する
ことが出来る。例えば、得られた細胞ペーストを解凍
し、緩衝液に懸濁させ、緩衝液により酵素を抽出処理す
る。このような処理としては超音波処理、高圧分散、あ
るいは酵素消化がある。次に細胞残渣を遠心分離により
取り除き、本発明の新規な酵素を含む上澄液を精製す
る。この精製は、例えばホスホセルロースまたはＤＥＡ
Ｅ−セルロースを使用するイオン交換クロマトグラフィ
ー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、そして例
えばヘパリンアガロースまたはＤＮＡ−セルロースを使
用するアフィニティークロマトグラフィー、あるいはこ
れらの方法の組み合せにより実施することができる。こ
うして、本発明の酵素が得られる。本発明の酵素はま
た、Ｗｉｌｓｏｎ等によりＥＰＯ公開第０１９４１３号
に開示されたメチラーゼ選択法のような組換えＤＮＡ技
術を使用して、対応するＤＮＡメチラーゼと一緒に得る
ことも出来る。該ＥＰＯはここで引用したことによりそ
の開示内容が本明細書に含まれているものとする。例え
ばメチラーゼ選択法は、次の３つのステップで実施する
ことができる。まず、Ｒ−Ｍ系をコードしているＤＮＡ
を菌株から精製し、クローニング用エンドヌクレアーゼ
で部分的に消化した後、切断し脱リン酸化したプラスミ
ドベクターへ連結する。連結したＤＮＡでＥ．ｃｏｌｉ
を形質転換し、その形質転換株をプールし、プラスミド
の集団を精製してライブラリーを作成する。次に、それ
らのライブラリーを、目的とするメチラーゼの特異的修
飾によってブロックすることができる選択エンドヌクレ
アーゼで消化する。その消化物を用いて、未消化の分子
を再生するために再度Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換する。こ
の形質転換株はそのままスクリーニングすることもでき
るし、あるいはプールして、プラスミドをさらに精製・
選択することも出来る。最後に個々の形質転換株を集
め、そのプラスミドから分析用のサンプル（ｍｉｎｉ−
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を調製する。それらのプラス
ミドを、目的とするエンドヌクレアーゼによる消化に対
する抵抗性および共通の挿入物をもっているかどうか分
析する。（メチラーゼ遺伝子は少くとも一つの断片によ
ってコードされており、この断片は一般にすべての真正
なメチラーゼクローン中に存在する。）陽性のものから
細胞抽出物を調製し、メチルトランスフェラーゼ活性と
エンドヌクレアーゼ活性についてｉｎ ｖｉｔｒｏで検
査する。しかしながら、多くのＲ−Ｍ系はより複雑であ
り、それ故、組換えＤＮＡ技術を使用して得ることはよ
り一層困難であり、Ｒ−Ｍ系をクローニングするための
上述の方法を修正する必要があることが判明している。
Ｌｕｎｎｅｎ等，Ｇｅｎｅ ７４：２５−３２，１９８
８参照（引用により開示内容が本明細書に含まれている
ものとする）。例えば、ある系においては、メチラーゼ
遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とは連結していない
かもしれないし、あるいは細菌のＤＮＡを断片化するた
めに使用するエンドヌクレアーゼがＲ−Ｍ遺伝子のいず
れか、あるいは両方を切断するかもしれない。また、Ｂ
ａｍＨＩとＤｄｅＩのような他の系においては、形質転
換宿主における不十分な発現のため、あるいはメチラー
ゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現に対する固
有の制御機構のため、あるいは未知の理由で、対応する
エンドヌクレアーゼによる消化に対するメチラーゼの保
護が十分でないことがある。一方、修正はまた形質転換
用に選択された宿主細胞に対して有害であることが判明
している。Ｒ−Ｍ系をクローニングする際の他の難点
は、クローン化しようとするエンドヌクレアーゼがメチ
ラーゼ選択に十分な純度または量で入手出来ないことが
あるという点である。最後に、多くの系において、異な
る種の細菌の形質転換宿主細胞でエンドヌクレアーゼ遺
伝子を発現させるのは困難である。本発明のエンドヌク
レアーゼＰａｃＩの認識配列は、本発明の制限エンドヌ
クレアーゼと、供試ＤＮＡを既知の部位で切断する制限
酵素とを使用して、Ａｄｅｎｏ２、Ｔ７およびＭ１３ｍ
ｐ１８のＤＮＡを二重に消化することによって決定する
ことが出来る。得られたＤＮＡ制限断片の大きさはアガ
ロースゲル電気泳動により決定することが出来る。この
方法を使用して、下記の結果が得られた。 （ａ） ＣｌａＩ，ＮｄｅＩおよびＳｐｅＩで切断した
Ａｄｅｎｏ２のＤＮＡに対する分析によると、ＰａｃＩ
のただ一つの認識配列は、Ａｄｅｎｏ２のＤＮＡ上でお
よそ２８，５００塩基対のところに位置していた。５′
ＴＴＡＡＴＴＡＡ３′の配列は２８，６１８塩基対の僅
か一カ所の位置のみに見出される。 （ｂ） ＡｌｗＩ，ＢａｎＩＩ，ＢｃｌＩ，ＢｇｌＩ
Ｉ、ＢｓｓＨＩＩ，ＢｓｔＥＩＩ、ＥｃｏＮＩ，Ｍｌｕ
Ｉ，ＮｃｏＩ，ＮｈｅＩ，ＳｆｉＩおよびＳｔｕＩで切
断したＴ７のＤＮＡに対する分析によると、ＰａｃＩの
ただ一つの認識配列は、Ｔ７のＤＮＡ上でおよそ２７，
０００塩基対のところに位置していた。５′ＴＴＡＡＴ
ＴＡＡ３′の配列は２７，２２２塩基対の僅か１カ所の
みに見いだされる。 （ｃ） ＳｎａＢＩ，ＢｓｍＩおよびＢｇｌＩＩで切断
されたＭ１３ｍＰ１８のＤＮＡに対する分析によると、
ＰａｃＩのただ一つの認識配列は、Ｍ１３ｍＰ１８のＤ
ＮＡ上でおよそ４０９６塩基対のところに位置してい
た。５′ＴＴＡＡＴＴＡＡ３′の配列は４１３２塩基対
の僅か１カ所にのみ見いだされる。 （ｄ） ｐＢＲ３２２のＤＮＡ、ｐＵＣ１９のＤＮＡ、
φＸ１７４のＤＮＡ、ＳＶ４０のＤＮＡあるいはλＤＮ
Ａには切断は観察されなかった。５′ＴＴＡＡＴＴＡＡ
３′の配列はこれらの分子の配列の内部には見いだされ
ない。下記の表１に示されているように、８つのＤＮＡ
分子に対するＰａｃＩ消化により生成した断片の数と大
きさは、５′ＴＴＡＡＴＴＡＡ３′の配列の位置での切
断により生成するはずの断片のコンピューターで予測さ
れた数と大きさに一致する。

【表１】 それ故、上記のデータから、ＰａｃＩは５′ＴＴＡＡＴ
ＴＡＡ３′の配列を認識するという結論が得られた。本
発明のエンドヌクレアーゼの認識配列上の切断点は、ｐ
ＢＲ３２２由来の２本鎖プラスミドｐｖＰＡＣＩ−１１
Ｂを本発明の酵素で切断して得られる末端の塩基配列を
ジデオキシ配列決定法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，ＰＮＡＳ，７４：５４６３−５４６７，１９７
７）で解析することによって決定出来る。このｐｖＰＡ
ＣＩ−１１ＢはＰａｃＩの認識配列である５′ＴＴＡＡ
ＴＴＡＡ３′からなるヌクレオチド８個のリンカーを、
標準法によってｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ＃３７０１７）
のＰｖｕＩＩ部位へ挿入して作られる。上述の方法（以
下の実施例ＩＩでさらに詳述する）を使用して、Ｐａｃ
Ｉの切断点は、その認識配列中の第５番目と第６番目の
ヌクレオチドであるＴとＴの間であると結論づけられ
た。 切断点は垂直な矢印で明示されている。本発明の酵素は
次の附加的性状を持っている。 （ａ） ＮａＣｌ濃度：最適の塩濃度はＯｍＭ ＮａＣ
ｌである。１００ｍＭと１５０ｍＭ ＮａＣｌにおける
相対活性は３３％である。活性は１５０ｍＭＮａＣｌに
おけるよりも０〜５ｍＭ ＮａＣｌの濃度においてより
高い値を示した。 （ｂ） 温度：活性は２５℃におけるよりも３７℃にお
いて高かった。 （ｃ） ｐＨ：活性はｐＨ８．０におけるよりもｐＨ
７．０においてより高かった。

【実施例】現在のところ好ましいと思われる実施態様と
して以下に実施例を挙げて本発明を例示する。以下の実
施例は単なる例示であり、本発明は特許請求の範囲によ
って定義されるものと理解されたい。実施例Ｉ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ Ｎ
ＥＢ５８５株（ＡＴＣＣ＃５５０４４）を１０ｇ／ｌの
トリプトン，５ｇ／ｌの酵母エキス，５ｇ／ｌのＮａＣ
ｌ（ｐＨ７．２に調整）からなる培地で増殖させた。通
気・撹拌しながら対数増殖期の後期まで３０℃で細胞を
培養した。遠心分離により細胞を採取し、−７０℃で凍
結保存した。上で得られた１１０ｇの細胞を３容量の緩
衝液Ａ（０．３ ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＫＰＯ_４，０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ，１０ｍＭβ−ＭＥ，ｐＨ６．０）に
懸濁させた。フェニルメチルスルホニルフルオライドを
２５μｇ／ｍｌの濃度になるように加え、細胞１ｇ当た
りおよそ４６ｍｇのタンパク質が放出されるまで超音波
で細胞を破砕した。その溶解物を４℃で７０分間、１
７，０００ｒｐｍ（ＢｅｃｋｍａｎＪＡ１７ローター）
で遠心分離した。得られた上澄液を４℃で１時間、４
０，０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｔｉ５０．２ロー
ター）で超遠心した。その上澄液をＤＥＡＥ−ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅカラム（１３８ｍｌｓ）にかけた。流出液を
集め、グリセロールを５％になるまで加えた。その溶液
を４時間、４リットルの緩衝液Ｂ（０．１５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭ ＫＰＯ_４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０
ｍＭβ−ＭＥ、５％ ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ６．０）
に対して透析した。その透析物をｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅカラム（９３ｍｌｓ）にかけた。次に、
カラムを２００ｍｌの緩衝液Ｂで洗い、緩衝液Ｂ中０．
１５〜１．０ＭのＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。
溶出した画分のＰａｃＩ活性（１０分培養）とエキソヌ
クレアーゼ活性を下記に述べるようにして検査した。
０．５ｍｏｌ／ｌのＮａＣｌで溶出した画分がＰａｃＩ
活性をもっていたのでこれを集めた。エキソヌクレアー
ゼ活性はＰａｃＩ活性の直前と頂部（ｔｏｐ）に検出さ
れた。ＰａｃＩ活性をもった画分に、塩を含有しない緩
衝液Ｂを電気伝導率が０．１５Ｍ ＮａＣｌの電気伝導
率と等しくなるまで加えた。その容量は１２５ｍｌｓで
あった。この溶液をｐｈｏｓｐｈｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ
カラム（２７ｍｌｓ）にかけ、カラムを５０ｍｌｓの緩
衝液Ｂで洗い、緩衝液Ｂ中０．１５〜１．０ＭＮａＣｌ
の濃度勾配２７０ｍｌで酵素を溶出した。得られた画分
のＰａｃＩ活性とエキソヌクレアーゼ活性を後述のよう
にして検査した。エキソヌクレアーゼ活性はＰａｃＩ活
性のｔｏｐに溶出された。０．４〜０．４５ｍｏｌ／ｌ
のＮａＣｌで溶出されたピークのＰａｃＩ活性を有する
画分をプールし、直ちにＧ−７５Ｓｅｐｈａｄｅｘカラ
ム（２．５×９６ｃｍ）にかけ、緩衝液Ｃ（０．１５Ｍ
ＮａＣｌ、５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、１０ｍＭ β−Ｍ
Ｅ、１０ｍＭ ＫＰＯ_４、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，ｐＨ
６．０）でゆっくりと溶出した（１滴／１５秒）。得ら
れた画分のＰａｃＩ活性とエキソヌクレアーゼ活性を検
査した。エキソヌクレアーゼ活性はＰａｃＩ活性と一緒
に溶出された。それらの画分を集めて検査し、２２０〜
２４５ｍｌｓの間で溶出するＰａｃＩ活性を含む画分を
プールし、４リットルの緩衝液Ｄ（５％ｇｌｙｃｅｒｏ
ｌ，１０ｍＭ β−ＭＥ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍ
Ｍ ＫＰＯ_４、ｐＨ６．０）に対して４時間透析した。
この透析物をｈｅｐａｒｉｎ−ＴＳＫ ＨＰＬＣカラム
にかけた。酵素活性は緩衝液Ｄ中５０ｍＭ ＮａＣｌか
ら０．６Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配５２ｍｌで溶出さ
れた。これらの画分を集め、各々の画分２μｌのＰａｃ
Ｉ活性（１５分培養）とエキソヌクレアーゼ活性を検査
した。ＰａｃＩ活性のピークは０．３７〜０・４ｍｏｌ
／ｌ ＮａＣｌで溶出する画分で見出された。ピークの
エキソヌクレアーゼ活性は０．４〜０．４３ｍｏｌ／ｌ
ＮａＣｌで溶出する画分で見出された。ピークのＰａ
ｃＩ活性を有する画分をプールした。プールした画分に
等量の１００％ｇｌｙｃｅｒｏｌを加え、ＢＳＡを２０
０μｇ／ｍｌの濃度になるように加えた。得られた酵素
は実質上純粋であり、また非特異的なエンドヌクレアー
ゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を実質的にもたなかっ
た。該酵素は５０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ，１０ｍＭ β−
ＭＥ、１９０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ ＫＰＯ_４、ｐ
Ｈ６．０中に−２０℃で凍結保存した。酵素活性の決定法 ＰａｃＩ活性：試験する画分のサンプル２μｌを２５μ
ｌの基質溶液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡ、ｐＨ６．０で、ＰｓｔＩで線状にしたｐｖＰＡＣ
Ｉ−ＩＩＢ ＤＮＡを０．５μｇ含んでいる）へ加え
た。この酵素反応液を１０分あるいは１５分間の所定時
間３７℃で培養した。７．０μｌの停止溶液（５０％ｇ
ｌｙｓｅｒｏｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、
０．０２％ＢｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌＢｌｕｅ）を添加す
ることにより反応を停止した。該反応混合物を１．０％
ａｇｒｏｓｅ ｇｅｌを使って電気泳動した。得られた
バンドはＤＮＡ標品と比較して同定した。エキソヌクレ
アーゼ活性：蛋白溶液のサンプル２μｌを、２５μｇ／
ｍｌの^３Ｈ−ＤＮＡを含む５０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、
１００μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ｐＨ６．０へ加えた。反応
は３７℃で一時間行った。 単位の定義：１単位のＰａｃＩは、１μｇのｐｖＰＡＣ
Ｉ−ＩＩＢのＤＮＡを３７℃で１時間以内に完全に切断
する。 緩衝液の最適条件：最高のＰａｃＩ活性を得るために次
の緩衝液を使用した。１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１
０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、１００μｇ／ｍ
ｌ ＢＳＡ、ｐＨ７。実施例ＩＩ ＰａｃＩの切断部位の決定ｐｖＰＡＣＩ−１１Ｂの変性 ｐｖＰＡＣ−１１Ｂから精製したプラスミドＤＮＡ３μ
ｇを１．５ｍｌのｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管の中で、全体で
２０μｌのｄＨ_２Ｏに溶解した。２μｌの２ＭＮａＯＨ
と２ｍＭ ＥＤＴＡを加え、溶液を室温で５分間培養し
た。７μｌのｄＨ_２Ｏ（４℃）、６μｌの３Ｍ酢酸Ｎａ
ｐＨ５．０（４℃）および７５μｌのＥＴＯＨ（４
℃）を迅速に加えた。直ちに溶液をドライアイス／２−
ｐｒｏｐａｎｏｌ浴に入れて１５分間ＤＮＡを沈殿させ
た。そのＤＮＡをｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心管で１０分間
遠心沈殿することによりペレットにし、上澄液の９５％
を吸引により取除き、３００μｌの７０％ＥＴＯＨ／３
０％ｄＨ_２Ｏを加え、溶液を５分間遠心分離した後、上
澄液のおよそ９５％を除去した。次に、ＤＮＡのペレッ
トを１０分間 ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ 装置で完全に乾燥
した。配列決定反応 ｐｖＰＡＣＩ−１１ＢのＰａｃＩ部位の配列を決定する
ために、標準法を使用してオリゴヌクレオチドプライマ
ー（５′ＣＧＣＴＴＡＣＡＧＡＣＡＡＧＣＴＧＴＧ
３′）を合成した乾燥したペレットに１３．５μｌのｄ
Ｈ_２Ｏと、２．２５μｌの１０Ｘ配列決定用緩衝液（７
５ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、５５ｍＭ ＤＴＴ、５
０ｍＭＭｇＣｌ_２）、そして１．５μｌの１．０μｍプ
ライマー溶液を加えた。溶液を３７℃で３０分間培養し
た。３μｌの［α−^３５Ｓ］ｄＡＴＰ（８００Ｃｉ／ｍ
ｍｏｌｅ、１０ｍＣｉ／ｍｌを加えた。１．５μｌ
（７．５単位）のＫｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｄ
ＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手）を加えた。この
溶液をＴＰＫ混合物と呼ぶ。３．２μｌのＴＰＫ混合物
を、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの配列決定反応用の３μｌのデ
オキシ／ジデオキシヌクレオチド反応混合物（Ｎｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手）に
加えた。残りのＴＰＫ混合物を、ジデオキシヌクレオチ
ドを含まない９μｌのＡ配列決定用反応混合物に加え
て、ＰａｃＩ認識部位をこえて伸びる標識ＤＮＡストラ
ンドを創造した。反応は３７℃で１５分間行った。１μ
ｌのｄＮＴＰ ｃｈａｓｅ溶液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．から入手）をＡ、Ｃ、Ｇお
よびＴ反応液へ加えた。３μｌのｃｈａｓｅ溶液を上記
延長反応液に加えた。反応を３７℃で更に１５分間継続
した。６μｌの反応停止液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ
Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃから入手）をＡ、Ｃ、Ｇおよび
Ｔ配列決定用反応液に加え、配列決定用ゲルで分離する
まで−２０℃で保存した。延長反応液を７０℃で２５分
間培養してＤＮＡポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ）を不活
化した後室温で１０分間培養した。９μｌの延長反応液
を１つの０．５ｍｌｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管に入れ、２番
目の管には６μｌを入れた。９μｌの延長反応液を入れ
た１番目の管に１μｌ（およそ０．７５単位）のＰａｃ
Ｉエンドヌクレアーゼを加えた。混合後、その２μｌを
２番目の管に移した。この酵素反応液を３７℃で３０分
間培養した。酵素による消化後、その反応液の４μｌを
取出して、５μｌの反応停止液と混合した。残りの４μ
ｌへ０．２５μｌ（１．２５単位）のＫｌｅｎｏｗ ｆ
ｒａｇｍｅｎｔを加え、反応液を室温で１２分培養した
後５μｌの反応停止液を加えた。この酵素で消化した反
応液もゲルで分離するまで−２０℃で保存した。これら
の反応生成物を８％ｂｉｓ−ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ配列
決定用ゲル上で電気泳動させた。結果を図１に示す。図
１では、同じプライマーから生成した一組の配列決定用
反応の場合の横に、延長反応後にＰａｃＩで消化した場
合も示す。ＰａｃＩエンドヌクレアーゼで延長反応生成
物を消化すると、ＰａｃＩの認識配列５′ＴＴＡＡＴＴ
ＡＡ３′の３番目のＴと共に移動するバンドが生成し
た。ＰａｃＩ消化後Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔで
処理すると、ＰａｃＩの認識配列５′ＴＴＡＡＴＴＡＡ
３′中の５′Ａと共に移動する断片が生成した。これら
の実験結果は、ＰａｃＩの切断部位が、その認識配列
５′ＴＴＡＡＴ／ＴＡＡ３′中の５番目と６番目のヌク
レオチドであるＴとＴの間であり、それ故塩基２個の
３′延長部が生成することを示していた。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＰａｃＩの切断部位を決定するために行なった
電気泳動分析の結果を表わす写真である。

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シュードモナス・アルカリゲネス（Ｐｓ
   ｅｕｄｏｍｏｎａｓａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）から得る
   ことができ、二本鎖デオキシリボ核酸分子 矢印で示された切断位置を有する実質的に純粋なタイプ
   ＩＩ制限エンドヌクレアーゼ。
2. 【請求項２】 ２５℃におけるよりも３７℃において高
   い活性をもつ請求項１記載のタイプＩＩ制限エンドヌク
   レアーゼ。
3. 【請求項３】 二本鎖デオキシリボ核酸Ａｄｅｎｏ２，
   Ｔ７およびＭ１３ｍｐ１８を１つの位置で切断する請求
   項１記載のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ。
4. 【請求項４】 ｐＨ８．０におけるよりもｐＨ７．０に
   おいて高い活性をもつ請求項１記載のタイプＩＩ制限エ
   ンドヌクレアーゼ。
5. 【請求項５】 ＮａＣｌの濃度が１５０ｍＭであるとき
   よりも０〜５ｍＭであるときに高い活性をもつ請求項１
   記載のタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼ。
6. 【請求項６】 請求項１記載のタイプＩＩ制限エンドヌ
   クレアーゼの産生に好適な条件下でシュードモナス・ア
   ルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｌｃａｌｉ
   ｇｅｎｅｓ）を培養し、当該エンドヌクレアーゼを分離
   することからなる、請求項１記載のタイプＩＩ制限エン
   ドヌクレアーゼを得るための方法。