JP3003117B2 - ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製法 - Google Patents
ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製法Info
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- JP3003117B2 JP3003117B2 JP2275156A JP27515690A JP3003117B2 JP 3003117 B2 JP3003117 B2 JP 3003117B2 JP 2275156 A JP2275156 A JP 2275156A JP 27515690 A JP27515690 A JP 27515690A JP 3003117 B2 JP3003117 B2 JP 3003117B2
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- dna
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- restriction endonuclease
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
- C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
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Description
【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ 本発明は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メ
チラーゼをコードする組換えDNA、並びに組換えDNAから
のこれら酵素の製造に関する。
チラーゼをコードする組換えDNA、並びに組換えDNAから
のこれら酵素の製造に関する。
制限エンドヌクレアーゼは細菌中に天然に存在する種
類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼを精製して他
の混在細菌成分を除去すると、実験室内でDNA分子を正
確な断片に分断するために使用できる。この性質により
DNA分子を単一的に固定し、構成遺伝子に分けることが
できる。制限エンドヌクレアーゼは近年の遺伝子研究に
なくてはならない道具であることは明かである。制限エ
ンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実施するための
生化学的「はさみ」である。
類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼを精製して他
の混在細菌成分を除去すると、実験室内でDNA分子を正
確な断片に分断するために使用できる。この性質により
DNA分子を単一的に固定し、構成遺伝子に分けることが
できる。制限エンドヌクレアーゼは近年の遺伝子研究に
なくてはならない道具であることは明かである。制限エ
ンドヌクレアーゼは遺伝子工学や分析を実施するための
生化学的「はさみ」である。
制限エンドヌクレアーゼはDNA分子に沿ってヌクレオ
チドの特定配列（「認識配列」）を認識し、それと結合
することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼは一
度結合すると配列内または配列の一端の分子を切断す
る。制限エンドヌクレアーゼによって認識配列は異な
る。今日までに調査された数百種の細菌から100以上の
異なる制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
チドの特定配列（「認識配列」）を認識し、それと結合
することにより作用する。制限エンドヌクレアーゼは一
度結合すると配列内または配列の一端の分子を切断す
る。制限エンドヌクレアーゼによって認識配列は異な
る。今日までに調査された数百種の細菌から100以上の
異なる制限エンドヌクレアーゼが同定されている。
一種の細菌が有する制限エンドヌクレアーゼは通常ほ
んの僅かな数に過ぎない。エンドヌクレアーゼは由来す
る細菌から命名する。従って、Haemophilus aegyptius
は例えば３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成
し、これらはHae I,Hae II及びHae IIIと命名されてい
る。これらの酵素は各々配列（AT）GGCC（AT）、PuGCGC
Py及びGGCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escher
ichia coli）Ry13は配列GAATTCを認識する酵素EcoR Iの
みを合成する。
んの僅かな数に過ぎない。エンドヌクレアーゼは由来す
る細菌から命名する。従って、Haemophilus aegyptius
は例えば３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成
し、これらはHae I,Hae II及びHae IIIと命名されてい
る。これらの酵素は各々配列（AT）GGCC（AT）、PuGCGC
Py及びGGCCを認識し、切断する。一方、大腸菌（Escher
ichia coli）Ry13は配列GAATTCを認識する酵素EcoR Iの
みを合成する。
理論に拘束されることを望むわけではないが、実際に
制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖を保護する役
割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアー
ゼがあるために細菌はウィルスやプラスミドのような外
来DNA分子の感染に抵抗することができ、これがなけれ
ば破壊されるか寄生されてしまう。制限エンドヌクレア
ーゼは感染したDNA分子に結合し、認識配列がある毎に
切断することによって耐性を付与する。その結果のDNA
分子の分解により感染遺伝子の多くは不活性化され、エ
クソヌクレアーゼによるその後の分解に対するDNAの感
受性が増す。
制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の増殖を保護する役
割を果たしていると考えられる。制限エンドヌクレアー
ゼがあるために細菌はウィルスやプラスミドのような外
来DNA分子の感染に抵抗することができ、これがなけれ
ば破壊されるか寄生されてしまう。制限エンドヌクレア
ーゼは感染したDNA分子に結合し、認識配列がある毎に
切断することによって耐性を付与する。その結果のDNA
分子の分解により感染遺伝子の多くは不活性化され、エ
クソヌクレアーゼによるその後の分解に対するDNAの感
受性が増す。
細菌の防御系の第二の成分は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌
が自分自身のDNAを保護し、外来の感染DNAから識別しう
る手段を提供している。修飾メチラーゼは対応の制限エ
ンドヌクレアーゼと同じヌクレオチドに認識配列を認識
し、これに結合するが、DNAを破壊する代わりに、メチ
ル基を添加して配列内の１つ以上のヌクレオチドを化学
的に修飾する。メチル化された認識配列には制限エンド
ヌクレアーゼを結合せず、切断もしない。細菌細胞のDN
Aは修飾メチラーゼ活性で常に完全に修飾されており、
そのため内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して
は全く感受性がない。未修飾の従って完全に外来のDNA
のみが制限エンドヌクレアーゼの認識と攻撃に感受性を
持つ。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌
が自分自身のDNAを保護し、外来の感染DNAから識別しう
る手段を提供している。修飾メチラーゼは対応の制限エ
ンドヌクレアーゼと同じヌクレオチドに認識配列を認識
し、これに結合するが、DNAを破壊する代わりに、メチ
ル基を添加して配列内の１つ以上のヌクレオチドを化学
的に修飾する。メチル化された認識配列には制限エンド
ヌクレアーゼを結合せず、切断もしない。細菌細胞のDN
Aは修飾メチラーゼ活性で常に完全に修飾されており、
そのため内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して
は全く感受性がない。未修飾の従って完全に外来のDNA
のみが制限エンドヌクレアーゼの認識と攻撃に感受性を
持つ。
遺伝子工学技術の進歩により、現在では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質や酵素を
従来の精製法より大量に製造することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを端離する鍵となる
ものは、10-3〜10-4程度の低頻度でクローンが発生する
場合に複雑な「ライブラリー」すなわち「ショットガ
ン」法で得たクローン群内でこのようなクローンを同定
する簡単で信頼のおける方法を開発することである。所
望ではない大部分のクローンは破壊され、所望の小量の
クローンが生存するような選択的方法が好ましい。
ローニングし、その遺伝子がコードする蛋白質や酵素を
従来の精製法より大量に製造することができる。制限エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを端離する鍵となる
ものは、10-3〜10-4程度の低頻度でクローンが発生する
場合に複雑な「ライブラリー」すなわち「ショットガ
ン」法で得たクローン群内でこのようなクローンを同定
する簡単で信頼のおける方法を開発することである。所
望ではない大部分のクローンは破壊され、所望の小量の
クローンが生存するような選択的方法が好ましい。
第II型の制限−修飾系はより高頻度にクローン化され
ている。第一のクローン化した系は制限エンドヌクレア
ーゼクローンを同定し、選択する手段としてバクテリオ
ファージ感染を使用していた（Hha II:Mannら、Gene3:9
7−112,（1978）;EcoR II:Kosykhら,Molec.Gen.Genet17
8:717−719,（1980）;Pst I:Walderら,Proc.Nat.Acad.S
ci.USA78:1503−1507,（1981））。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファージ感染に対して
耐性となり、そのため、原則的にはクローン化した制限
−修飾遺伝子を有する細胞はファージに露出したライブ
ラリーから生存細胞として選択的に単離できる。しか
し、この方法にはほんの限られた価値しかないことが判
明した。特に、クローン化した制限−修飾遺伝子は選択
的に生存する充分なファージ耐性を常に示すのではない
ことが明かとなった。
ている。第一のクローン化した系は制限エンドヌクレア
ーゼクローンを同定し、選択する手段としてバクテリオ
ファージ感染を使用していた（Hha II:Mannら、Gene3:9
7−112,（1978）;EcoR II:Kosykhら,Molec.Gen.Genet17
8:717−719,（1980）;Pst I:Walderら,Proc.Nat.Acad.S
ci.USA78:1503−1507,（1981））。細菌中に制限−修飾
系が存在すると細菌はバクテリオファージ感染に対して
耐性となり、そのため、原則的にはクローン化した制限
−修飾遺伝子を有する細胞はファージに露出したライブ
ラリーから生存細胞として選択的に単離できる。しか
し、この方法にはほんの限られた価値しかないことが判
明した。特に、クローン化した制限−修飾遺伝子は選択
的に生存する充分なファージ耐性を常に示すのではない
ことが明かとなった。
もう一つのクローニング法は、大腸菌（E.coli）クロ
ーニングプラスミドへのプラスミド担持物（plasmid−b
orne）として最初に特性化された転移系を使用している
（EcoR V:Bougueleretら,Nucleic Acid Res.12:3659−3
676,（1984）;PaeR7:Gingeras及びBrooks,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA80:402−406,（1983）;Theriault及びRoy,Ge
ne19:355−359,（1982）;Pvu II:Blumenthalら,J.Bacte
riol.164:504−509,（1985））。
ーニングプラスミドへのプラスミド担持物（plasmid−b
orne）として最初に特性化された転移系を使用している
（EcoR V:Bougueleretら,Nucleic Acid Res.12:3659−3
676,（1984）;PaeR7:Gingeras及びBrooks,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA80:402−406,（1983）;Theriault及びRoy,Ge
ne19:355−359,（1982）;Pvu II:Blumenthalら,J.Bacte
riol.164:504−509,（1985））。
第三の方法であり、多くの系のクローン化に使用され
ている方法は活性メチラーゼ遺伝子の選択を含んでいる
（例えば、1986年９月３日発行の欧州特許第193,413号
及びBsuR I:Kissら,Nucleic Acids Res.13:6403−6421,
（1985）参照）。制限遺伝子と修飾遺伝子は密接に関連
する傾向にあるため、両遺伝子を含有するクローンは１
つの遺伝子についての選択により単離できることが多
い。メチル化活性について選択すると完全な制限−修飾
系が常に得られるわけではなく、その代わりにメチラー
ゼ遺伝子のみが得られることもある（BspR I:Szomolany
iら,Gene10:219−225,（1980）;Bcn I:Janulaitisら,Ge
ne20:197−204,（1982）;BauR I:Kiss及びBaldauf,Gene
21:111−119,（1983）；及びMsp I:Walderら,J.Biol.Ch
em.258:1235−1241,（1983））。制限−修飾系のクロー
ニングの概説としては例えばLunnenら,Gene74:25−32
（1988）及びWilson G.G.,Gene74:281−285（1988）を
参照されたい。
ている方法は活性メチラーゼ遺伝子の選択を含んでいる
（例えば、1986年９月３日発行の欧州特許第193,413号
及びBsuR I:Kissら,Nucleic Acids Res.13:6403−6421,
（1985）参照）。制限遺伝子と修飾遺伝子は密接に関連
する傾向にあるため、両遺伝子を含有するクローンは１
つの遺伝子についての選択により単離できることが多
い。メチル化活性について選択すると完全な制限−修飾
系が常に得られるわけではなく、その代わりにメチラー
ゼ遺伝子のみが得られることもある（BspR I:Szomolany
iら,Gene10:219−225,（1980）;Bcn I:Janulaitisら,Ge
ne20:197−204,（1982）;BauR I:Kiss及びBaldauf,Gene
21:111−119,（1983）；及びMsp I:Walderら,J.Biol.Ch
em.258:1235−1241,（1983））。制限−修飾系のクロー
ニングの概説としては例えばLunnenら,Gene74:25−32
（1988）及びWilson G.G.,Gene74:281−285（1988）を
参照されたい。
制限−修飾遺伝子のクローニングの大きな障害は、修
飾によって既に保護されているわけではない宿主にエン
ドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。
メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを同時
に一つのクローンに導入するときには、エンドヌクレア
ーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前にメチラーゼが
宿主DNAを保護するように修飾しなければならない。従
って、最初にメチラーゼ遺伝子次にエンドヌクレアーゼ
遺伝子と順にクローニングすることのみが可能な場合も
ある。制限−修飾系のクローニングのもう一つの障害
は、大腸菌株の中にはシトシンまたはアデニン修飾に不
利な作用を持つものがあること、すなわち、メチル化シ
トシン含有DNA（Raleigh及びWilson,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA83:9070−9074,（1986））及びメチル化アデニン
含有DNA（Heitman及びModel,J.Bact.,196:3243−3250,
（1987）;Raleigh,Trimarchi及びRevel,Genetics,122:2
79−296,（1989））を破壊する系を有しているものがあ
るとの発見である。シトシン特異性またはアデニン特異
性のメチラーゼ遺伝子はそれ自身のみでも対応のエンド
ヌクレアーゼ遺伝子と一緒にもこれらの株には容易にク
ローニングすることはできない。この問題を避けるため
には、これらの系を欠く大腸菌変異株（McrA-及びMcrB-
またはMrr-）を使用することが必要である。
飾によって既に保護されているわけではない宿主にエン
ドヌクレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。
メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを同時
に一つのクローンに導入するときには、エンドヌクレア
ーゼが宿主DNAを切断する機会を得る前にメチラーゼが
宿主DNAを保護するように修飾しなければならない。従
って、最初にメチラーゼ遺伝子次にエンドヌクレアーゼ
遺伝子と順にクローニングすることのみが可能な場合も
ある。制限−修飾系のクローニングのもう一つの障害
は、大腸菌株の中にはシトシンまたはアデニン修飾に不
利な作用を持つものがあること、すなわち、メチル化シ
トシン含有DNA（Raleigh及びWilson,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA83:9070−9074,（1986））及びメチル化アデニン
含有DNA（Heitman及びModel,J.Bact.,196:3243−3250,
（1987）;Raleigh,Trimarchi及びRevel,Genetics,122:2
79−296,（1989））を破壊する系を有しているものがあ
るとの発見である。シトシン特異性またはアデニン特異
性のメチラーゼ遺伝子はそれ自身のみでも対応のエンド
ヌクレアーゼ遺伝子と一緒にもこれらの株には容易にク
ローニングすることはできない。この問題を避けるため
には、これらの系を欠く大腸菌変異株（McrA-及びMcrB-
またはMrr-）を使用することが必要である。
精製した制限エンドヌクレアーゼそして少し程度は落
ちるが修飾メチラーゼは実験室中でDNAを特性化し、再
配列させるための有用な手段であるため、これらの酵素
を大量に合成する組換えDNA法で細菌株を得ることは工
業的に意味のあることである。このような菌株は、精製
を簡略化し、同時に工業的有用量を製造する手段も提供
するため有用であろう。
ちるが修飾メチラーゼは実験室中でDNAを特性化し、再
配列させるための有用な手段であるため、これらの酵素
を大量に合成する組換えDNA法で細菌株を得ることは工
業的に意味のあることである。このような菌株は、精製
を簡略化し、同時に工業的有用量を製造する手段も提供
するため有用であろう。
［発明の概要］ 本発明は、パラインフルエンザ菌Haemophilus parain
fluenzae（NEB株＃127、このサンプルは受託番号＃5391
3としてATCCに寄託した）由来のHpa I制限エンドヌクレ
アーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子を含有する入手可能な
組換えDNA、並びに組換えDNAからのこれら酵素の製法に
関する。本発明は、DNA配列GGT▼AACを認識し、第二の
５′Ｔと第一の５′Ａの間に矢印で示したように切断す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼHpa Iを発現する
形質転換した宿主にも係る。Hines,J.L.,Chauncey,T.R.
及びAgarwal,K.L.,Methods in Enzymology,65:153−16
3,（1960）を参照のこと。また、これらの開示内容は参
考として本明細書に含むものとする。
fluenzae（NEB株＃127、このサンプルは受託番号＃5391
3としてATCCに寄託した）由来のHpa I制限エンドヌクレ
アーゼ及び修飾メチラーゼ遺伝子を含有する入手可能な
組換えDNA、並びに組換えDNAからのこれら酵素の製法に
関する。本発明は、DNA配列GGT▼AACを認識し、第二の
５′Ｔと第一の５′Ａの間に矢印で示したように切断す
る酵素である制限エンドヌクレアーゼHpa Iを発現する
形質転換した宿主にも係る。Hines,J.L.,Chauncey,T.R.
及びAgarwal,K.L.,Methods in Enzymology,65:153−16
3,（1960）を参照のこと。また、これらの開示内容は参
考として本明細書に含むものとする。
Hpa Iをクローニングする好適な方法は、パラインフ
ルエンザ菌由来のDNAを含有する充分量のライブラリー
を作成し；適当な制限エンドヌクレアーゼすなわちメチ
ル化されていない時には認識配列を切断する酵素と共に
ライブラリーDNAをインキュベートすることにより対応
のメチラーゼを発現するクローンを選出し；そして制限
エンドヌクレアーゼと共にインキュベートすることによ
り切断されなかった組換えDNAで宿主を再度形質転換
し、得られた形質転換体を生存細胞の中の陽性クローン
についてスクリーニングすることからなる。
ルエンザ菌由来のDNAを含有する充分量のライブラリー
を作成し；適当な制限エンドヌクレアーゼすなわちメチ
ル化されていない時には認識配列を切断する酵素と共に
ライブラリーDNAをインキュベートすることにより対応
のメチラーゼを発現するクローンを選出し；そして制限
エンドヌクレアーゼと共にインキュベートすることによ
り切断されなかった組換えDNAで宿主を再度形質転換
し、得られた形質転換体を生存細胞の中の陽性クローン
についてスクリーニングすることからなる。
［発明の詳細な説明］ 本発明は制限Hpa Iエンドヌクレアーゼ及び修飾メチ
ラーゼをコードする組換えDNA、並びにこのような組換
えDNAから産生される酵素に関する。
ラーゼをコードする組換えDNA、並びにこのような組換
えDNAから産生される酵素に関する。
Hpa I制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を好ましくク
ローニングし、発現させる本明細書に記載の方法は第１
図に示すが、次のステップを含んでいる： I.Hpa I メチラーゼのクローニング A.ライブラリーの作成 Ａ−1.New England Biolabsのヘモフィリス属増殖用
標準プロトコールに従ってパラインフルエンザ菌を増殖
させ、細胞を溶解し、Brooksら,Nucleic Acid Research
17:979−997,（1989）に記載の方法でゲノムDNAを精製
する。これは実施例に詳細に述べる。
ローニングし、発現させる本明細書に記載の方法は第１
図に示すが、次のステップを含んでいる： I.Hpa I メチラーゼのクローニング A.ライブラリーの作成 Ａ−1.New England Biolabsのヘモフィリス属増殖用
標準プロトコールに従ってパラインフルエンザ菌を増殖
させ、細胞を溶解し、Brooksら,Nucleic Acid Research
17:979−997,（1989）に記載の方法でゲノムDNAを精製
する。これは実施例に詳細に述べる。
Ａ−2.制限エンドヌクレアーゼ:Hind III,EcoR I,Bgl
II,BamH I及びCla IでゲノムDNAを完全に消化する。
II,BamH I及びCla IでゲノムDNAを完全に消化する。
Ａ−3.これら制限酵素断片を、クローニングベクタ
ー、理想的には、Hpa I部位を１、２または３つとクロ
ーニング部位を有するもの例えばpBIIHI.2（ATCC6790
2）またはpBIIHI.2KIまたはpACYC177（ATCC37031）の対
応のクローニング部位に連結し（すなわち、例えばHind
IIIにより生成したフラグメントはHind IIIクローニン
グ部位に連結する）、混合物を使用して適切な宿主細胞
例えばmrr-である大腸菌RR1またはmrr-及び／またはMcr
A-である他の任意の大腸菌株を形質転換する。
ー、理想的には、Hpa I部位を１、２または３つとクロ
ーニング部位を有するもの例えばpBIIHI.2（ATCC6790
2）またはpBIIHI.2KIまたはpACYC177（ATCC37031）の対
応のクローニング部位に連結し（すなわち、例えばHind
IIIにより生成したフラグメントはHind IIIクローニン
グ部位に連結する）、混合物を使用して適切な宿主細胞
例えばmrr-である大腸菌RR1またはmrr-及び／またはMcr
A-である他の任意の大腸菌株を形質転換する。
Ａ−4.形質転換した混合物を形質転換した細胞用に選
択的な地例えば抗生物質アピシリン、テトラサイクリン
またはクロラムフェニコール上にプレーティングする。
インキュベーション後、形質転換したコロニーを一つの
培養物、細胞ライブラリー中に集める。
択的な地例えば抗生物質アピシリン、テトラサイクリン
またはクロラムフェニコール上にプレーティングする。
インキュベーション後、形質転換したコロニーを一つの
培養物、細胞ライブラリー中に集める。
Ａ−5.細胞ライブラリーから組換えプラスミドを完全
に精製しプラスミドライブラリーを作成する。
に精製しプラスミドライブラリーを作成する。
B.ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−1.Watsonら（上記）に記載と同様の方法により、
パラインフルエンザ菌から調製したHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを使用してプラスミドライブラリーをin vit
roで完全に消化する。Hpa Iメチラーゼクローンの相対
頻度が増すにつれ、Hpa I消化は未修飾のメチラーゼ非
含有クローンを段階的に破壊する。
パラインフルエンザ菌から調製したHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを使用してプラスミドライブラリーをin vit
roで完全に消化する。Hpa Iメチラーゼクローンの相対
頻度が増すにつれ、Hpa I消化は未修飾のメチラーゼ非
含有クローンを段階的に破壊する。
Ｂ−2.選択したDNAを大腸菌RR1のような適当な宿主に
形質転換して戻し、選択培地にプレーティングすること
によって形質転換体を回収する。コロニーを採り、その
DNAをHpa I修飾遺伝子の存在について分析する。それ等
が有するプラスミドを精製し、Hpa I制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートして消化に耐性であるかを
決定する。全細胞DNA（染色体及びプラスミド）も精製
し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベー
トする。Hpa I修飾遺伝子を含有するクローンのDNAは完
全に修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全D
NAの両者は実質的に消化に耐性であるべきである。C.Hp
a Iエンドヌクレアーゼ蛋白質の製造、Hpa Iエンドヌク
レアーゼの蛋白質配列決定、エンドヌクレアーゼの位置
のマッピング Ｃ−1.Hpa I制限エンドヌクレアーゼをHpa I制限遺伝
子及び修飾遺伝子を含有するパラインフルエンザ菌から
製造する。高栄養培地中、培養器内で細胞を繁殖させ
る。遠心分離により細胞を集める。細胞をガリンミルで
破壊してHpa I制限エンドヌクレアーゼ活性を有する粗
製細胞抽出物を作成する。Hpa I制限エンドヌクレアー
ゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を標準のイオン交換及
びアフィニティークロマトグラフィー手法で精製する。
形質転換して戻し、選択培地にプレーティングすること
によって形質転換体を回収する。コロニーを採り、その
DNAをHpa I修飾遺伝子の存在について分析する。それ等
が有するプラスミドを精製し、Hpa I制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートして消化に耐性であるかを
決定する。全細胞DNA（染色体及びプラスミド）も精製
し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベー
トする。Hpa I修飾遺伝子を含有するクローンのDNAは完
全に修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全D
NAの両者は実質的に消化に耐性であるべきである。C.Hp
a Iエンドヌクレアーゼ蛋白質の製造、Hpa Iエンドヌク
レアーゼの蛋白質配列決定、エンドヌクレアーゼの位置
のマッピング Ｃ−1.Hpa I制限エンドヌクレアーゼをHpa I制限遺伝
子及び修飾遺伝子を含有するパラインフルエンザ菌から
製造する。高栄養培地中、培養器内で細胞を繁殖させ
る。遠心分離により細胞を集める。細胞をガリンミルで
破壊してHpa I制限エンドヌクレアーゼ活性を有する粗
製細胞抽出物を作成する。Hpa I制限エンドヌクレアー
ゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を標準のイオン交換及
びアフィニティークロマトグラフィー手法で精製する。
Ｃ−2.そのように精製したエンドヌクレアーゼはSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子量
30,000ダルトン、比活性はλDNAに滴定して約250,000単
位/mg蛋白質である。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子量
30,000ダルトン、比活性はλDNAに滴定して約250,000単
位/mg蛋白質である。
Ｃ−3.Applied Biosystems470A Protein Sequencer
（Brooksら,Nucleic Acid Research,17:979−997,（198
9））を使用してエンドヌクレアーゼのアミノ末端配列
を得て、蛋白質配列を基にDNAオリゴヌクレオチドプロ
ーブを作成する。
（Brooksら,Nucleic Acid Research,17:979−997,（198
9））を使用してエンドヌクレアーゼのアミノ末端配列
を得て、蛋白質配列を基にDNAオリゴヌクレオチドプロ
ーブを作成する。
Ｃ−4.プローブを使用してメチラーゼクローン上の及
びパラインフルエンザ菌ゲノムに対してのエンドヌクレ
アーゼの位置をマッピングする。
びパラインフルエンザ菌ゲノムに対してのエンドヌクレ
アーゼの位置をマッピングする。
II.Hpa I制限−修飾系のクローニング A.ライブラリーの作成 Ａ−1.I（Ａ−１）に記載のように調製したパライン
フルエンザ菌ゲノムDNAをKpn I制限エンドヌクレアーゼ
のような制限エンドヌクレアーゼで完全に消化する。
フルエンザ菌ゲノムDNAをKpn I制限エンドヌクレアーゼ
のような制限エンドヌクレアーゼで完全に消化する。
Ａ−2.得られたKpn I断片を、理想的には１、２また
は３個のHpa I部位と１つのKpn Iクローニング部位を持
つクローニングベクター例えばpBIIHI.2KIのKpn Iクロ
ーニング部位に連結し、混合物を使用して大腸菌RR1細
胞のような適当な宿主を形質転換する。
は３個のHpa I部位と１つのKpn Iクローニング部位を持
つクローニングベクター例えばpBIIHI.2KIのKpn Iクロ
ーニング部位に連結し、混合物を使用して大腸菌RR1細
胞のような適当な宿主を形質転換する。
Ａ−3.形質転換した混合物を、抗生物質アンピシリ
ン、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールの
ような形質転換細胞に選択的な培地上にプレーティング
する。インキュベートした後、形質転換したコロニーを
一つの培養物、細胞ライブラリーに集める。
ン、ストレプトマイシンまたはクロラムフェニコールの
ような形質転換細胞に選択的な培地上にプレーティング
する。インキュベートした後、形質転換したコロニーを
一つの培養物、細胞ライブラリーに集める。
Ａ−4.組換えプラスミドを細胞ライブラリーから完全
に精製してプラスミドライブラリーを作成する。
に精製してプラスミドライブラリーを作成する。
B.ライブラリーの選択とスクリーニング Ｂ−1.Watsonら（上記）に記載と同様の方法により、
パラインフルエンザ菌から調製したHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを使用してプラスミドライブラリーを完全に
消化する。Hpa Iメチラーゼクローンの相対頻度の増加
に応じて、Hap I消化は未修飾のメチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊する。
パラインフルエンザ菌から調製したHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを使用してプラスミドライブラリーを完全に
消化する。Hpa Iメチラーゼクローンの相対頻度の増加
に応じて、Hap I消化は未修飾のメチラーゼ非含有クロ
ーンを特異的に破壊する。
Ｂ−2.選択したDNAを大腸菌RR1のような適当な宿主に
形質転換して戻し、選択培地にプレーティングすること
によって形質転換体を回収する。コロニーを採り、その
DNAをHpa I修飾遺伝子の存在について分析する。それ等
が有するプラスミドを精製し、Hpa I制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートして消化に耐性であるかを
決定する。全細胞DNA（染色体及びプラスミド）も精製
し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベー
トする。Hpa I修飾遺伝子を含有するクローンのDNAは完
全に修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全D
NAの両者の実質的に消化に耐性であるべきである。
形質転換して戻し、選択培地にプレーティングすること
によって形質転換体を回収する。コロニーを採り、その
DNAをHpa I修飾遺伝子の存在について分析する。それ等
が有するプラスミドを精製し、Hpa I制限エンドヌクレ
アーゼと共にインキュベートして消化に耐性であるかを
決定する。全細胞DNA（染色体及びプラスミド）も精製
し、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと共にインキュベー
トする。Hpa I修飾遺伝子を含有するクローンのDNAは完
全に修飾されているべきであり、プラスミドDNA及び全D
NAの両者の実質的に消化に耐性であるべきである。
Ｂ−3.Hpa Iメチラーゼ遺伝子を有することが判明し
ているクローンの粗製抽出物を調製し、Hpa I制限エン
ドヌクレアーゼ活性について粗製抽出物をアッセイする
ことによって、Hpa I制限エンドヌクレアーゼを含有す
るクローンを同定する。粗製細胞抽出物中のHpa I活性
のレベルを測定する。
ているクローンの粗製抽出物を調製し、Hpa I制限エン
ドヌクレアーゼ活性について粗製抽出物をアッセイする
ことによって、Hpa I制限エンドヌクレアーゼを含有す
るクローンを同定する。粗製細胞抽出物中のHpa I活性
のレベルを測定する。
C.Hpa I制限−修飾クローンの制限マッピング及び欠損
サブクローンの調製 Ｃ−1.Hpa I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラ
ーゼを含有することが同定されているクローン上でいく
つかの制限エンドヌクレアーゼ部位をマッピングし、欠
損サブクローニングとプローブとしてDNAオリゴマーを
使用するサザンハイブリダイゼーションによるマッピン
グにより遺伝子の位置を決定した。
サブクローンの調製 Ｃ−1.Hpa I制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラ
ーゼを含有することが同定されているクローン上でいく
つかの制限エンドヌクレアーゼ部位をマッピングし、欠
損サブクローニングとプローブとしてDNAオリゴマーを
使用するサザンハイブリダイゼーションによるマッピン
グにより遺伝子の位置を決定した。
Ｃ−2.より多くのHpa Iエンドヌクレアーゼを産生す
るクローンを作る試みの中で種々のサブクローンを作成
する。
るクローンを作る試みの中で種々のサブクローンを作成
する。
Ｃ−3.Hpa I制限エンドヌクレアーゼはHpa I制限及び
修飾遺伝子を含有する細胞から産生される。細胞を、ア
ンピシリン含有の高栄養培地中、培養器内で細胞を増殖
させる。遠心分離により細胞を採集する。細胞を超音波
処理で破壊してHpa I制限エンドヌクレアーゼ活性を有
する粗製細胞抽出物を作成する。Hpa I制限エンドヌク
レアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を標準のイオン
交換及びアフィニティークロマトグラフィー手法で精製
する。
修飾遺伝子を含有する細胞から産生される。細胞を、ア
ンピシリン含有の高栄養培地中、培養器内で細胞を増殖
させる。遠心分離により細胞を採集する。細胞を超音波
処理で破壊してHpa I制限エンドヌクレアーゼ活性を有
する粗製細胞抽出物を作成する。Hpa I制限エンドヌク
レアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物を標準のイオン
交換及びアフィニティークロマトグラフィー手法で精製
する。
Ｃ−4.そのように精製したエンドヌクレアーゼはSDS
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子量
30,000ダルトン、比活性λDNAに滴定して約250,000単位
/mg蛋白質であることが判った。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で均一であり、分子量
30,000ダルトン、比活性λDNAに滴定して約250,000単位
/mg蛋白質であることが判った。
上記に概説したステップは本発明の好適な実施法を現
わしたものであり、公知の手法により上記方法を変化し
得ることは当業者には明かであろう。
わしたものであり、公知の手法により上記方法を変化し
得ることは当業者には明かであろう。
以下の実施例は現在のところ実施するに好ましい実施
態様を説明している。本実施例は説明のためのものであ
り、添付の特許請求の範囲に示すものは除き本発明が実
施例に限定されないことは理解されよう。
態様を説明している。本実施例は説明のためのものであ
り、添付の特許請求の範囲に示すものは除き本発明が実
施例に限定されないことは理解されよう。
［実施例］ Hpa I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング I.Hpa I メチラーゼのクローニング A.ライブラリーの作成 Ａ−1.ゲノムDNAの精製：約5gのパラインフルエンザ
菌細胞を解凍し、コーニングプラスティック管（50ml）
中の0.1M トリス−HCl（pH7.1）、0.1M EDTA（25ml）
中に再懸濁させた。上記バッファ35ml中リゾチーム60mg
の溶液を２本の50mlプラスチック管に分け、等量（15m
l）の細胞懸濁液を各管に加えた。溶液を37℃で15分間
インキュベートした。20％保存溶液からSDSを加え、SDS
の最終濃度が１％となるように調整した。プロテイナー
ゼＫ（20mg/ml保存溶液）200μｌを加え、37℃で１時間
インキュベートした。溶液はこの時点で粘性となり拡散
したが、透明ではなかった。管（各1ml）に10％SDS/8％
サルコシル2mlを加え、55℃に２時間加熱した。サンプ
ルは粘性のままであったが、全体的には透明ではなかっ
た。サンプルをTE（10mMトリス−HCl、pH7.1、1mM EDT
A）（２ １）に対して16時間透析した。透析液は１回
替えた。透析後、等量のTE（pH8.0）を加えてCsCl勾配
用の溶液（98ml）を調製し、これを２つに分けて、各々
にCsCl98.0g及び5mg/ml臭化エチジウム1mlを加えた。20
本の管をTi70ローター、44,000rpmで48時間回転させ
た。バンドを取り出し、CsCl−水−飽和イソプロパノー
ルで抽出した。溶液を前記と同じバッファ（４ １）に
対して透析し、次いで、フェノール及びクロロホルムで
（各１回）抽出した。この溶液を再度透析してフェノー
ルを除去し、次ぎに電気泳動にかけた。
菌細胞を解凍し、コーニングプラスティック管（50ml）
中の0.1M トリス−HCl（pH7.1）、0.1M EDTA（25ml）
中に再懸濁させた。上記バッファ35ml中リゾチーム60mg
の溶液を２本の50mlプラスチック管に分け、等量（15m
l）の細胞懸濁液を各管に加えた。溶液を37℃で15分間
インキュベートした。20％保存溶液からSDSを加え、SDS
の最終濃度が１％となるように調整した。プロテイナー
ゼＫ（20mg/ml保存溶液）200μｌを加え、37℃で１時間
インキュベートした。溶液はこの時点で粘性となり拡散
したが、透明ではなかった。管（各1ml）に10％SDS/8％
サルコシル2mlを加え、55℃に２時間加熱した。サンプ
ルは粘性のままであったが、全体的には透明ではなかっ
た。サンプルをTE（10mMトリス−HCl、pH7.1、1mM EDT
A）（２ １）に対して16時間透析した。透析液は１回
替えた。透析後、等量のTE（pH8.0）を加えてCsCl勾配
用の溶液（98ml）を調製し、これを２つに分けて、各々
にCsCl98.0g及び5mg/ml臭化エチジウム1mlを加えた。20
本の管をTi70ローター、44,000rpmで48時間回転させ
た。バンドを取り出し、CsCl−水−飽和イソプロパノー
ルで抽出した。溶液を前記と同じバッファ（４ １）に
対して透析し、次いで、フェノール及びクロロホルムで
（各１回）抽出した。この溶液を再度透析してフェノー
ルを除去し、次ぎに電気泳動にかけた。
Ａ−2.限定消化：精製したDNAをHind III,EcoR I,Bam
H I,Bgl II及びCla Iで切断し次のように完全消化した:
10mMトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaCl、10m
Mメルカプトエタノールバッファ中100μg/mlのDNA300μ
ｌを３本の試験管に分けた。試験管にHind III50単位を
加えた。試験管を37℃で１時間インキュベートし、次ぎ
にフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた。10mMトリス−HCl、1mM EDTA（pH8.0）の300
μｌ中にぺレットを再懸濁し、その各10μｌをアガロー
スゲル電気泳動で分析した。
H I,Bgl II及びCla Iで切断し次のように完全消化した:
10mMトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaCl、10m
Mメルカプトエタノールバッファ中100μg/mlのDNA300μ
ｌを３本の試験管に分けた。試験管にHind III50単位を
加えた。試験管を37℃で１時間インキュベートし、次ぎ
にフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈
澱させた。10mMトリス−HCl、1mM EDTA（pH8.0）の300
μｌ中にぺレットを再懸濁し、その各10μｌをアガロー
スゲル電気泳動で分析した。
Ａ−3.連結：断片に切断したDNAを次のようにpBIIHI.
2（Pvu II部位にHpa Iリンカーを挿入し、EcoR I部位に
Bal IIリンカーを挿入したpNO1523）に連結した:Hind I
II,EcoR I,BamH I,Bal IIまたはCla Iで消化したパライ
ンフルエンザ菌DNA（100μｌ）10.μｇを、Hind III,Ec
oR I,BamH I,Bal IIまたはCla Iで切断し、脱燐酸化し
たpBIIHI.2（20.0μｌ）2.0μｇと混合し、エタノール
沈澱させた。DNAを４℃、12,000gで15分間遠心分離し、
70℃エタノール100μｌで１度洗った。DNAを1x連結バッ
ファ（50mMトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、10mM DT
T、0.5mM ATP）99μｌに再懸濁し、T4 DNAリガーゼ１
μｌを加え、混合物を16℃で16時間インキュベートし
た。2.5μｌ及び5.0μｌのアリコートを使用して次のよ
うに大腸菌株RR1を形質転換した：各アリコートを氷冷
したコンピテント大腸菌RR1細胞200μｌと混合し、氷上
に30分間置いた。42℃の２分間加熱ショック後、細胞を
ルリアーブロス（Ｌ−ブロス）1mlで希釈し、37℃で１
時間増殖させた。
2（Pvu II部位にHpa Iリンカーを挿入し、EcoR I部位に
Bal IIリンカーを挿入したpNO1523）に連結した:Hind I
II,EcoR I,BamH I,Bal IIまたはCla Iで消化したパライ
ンフルエンザ菌DNA（100μｌ）10.μｇを、Hind III,Ec
oR I,BamH I,Bal IIまたはCla Iで切断し、脱燐酸化し
たpBIIHI.2（20.0μｌ）2.0μｇと混合し、エタノール
沈澱させた。DNAを４℃、12,000gで15分間遠心分離し、
70℃エタノール100μｌで１度洗った。DNAを1x連結バッ
ファ（50mMトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、10mM DT
T、0.5mM ATP）99μｌに再懸濁し、T4 DNAリガーゼ１
μｌを加え、混合物を16℃で16時間インキュベートし
た。2.5μｌ及び5.0μｌのアリコートを使用して次のよ
うに大腸菌株RR1を形質転換した：各アリコートを氷冷
したコンピテント大腸菌RR1細胞200μｌと混合し、氷上
に30分間置いた。42℃の２分間加熱ショック後、細胞を
ルリアーブロス（Ｌ−ブロス）1mlで希釈し、37℃で１
時間増殖させた。
Ａ−4.一時細胞ライブラリー：形質転換細胞培養物を
遠心分離し、250μｌに再懸濁し、100μg/mlのアンピシ
リンを含有するルリアー寒天（Ｌ−寒天）板上にプレー
ティングした。37℃で一晩インキュベートした後、寒天
板を取り出し、約8000個のコロニーを掻き取って抗生物
質含有LB25mlに入れた。これらの細胞からプラスミドDN
Aを次のように調製した：細胞を遠心分離によりペレッ
トとし、細胞ペースト3gを25mMトリス−HCl、10mM EDT
A（pH8.0）及び50mMグルコース14mlに再懸濁した。懸濁
液はリゾチーム中4.0mg/mlとし、25℃で５分間インキュ
ベートした。１％ドデシル硫酸ナトリウム及び0.2N Na
OHのアリコート27mlを加え、溶液を混合し、０℃で５分
間インキュベートした。氷冷した3M酢酸カリウム（pH4.
8）20mlを加えてゲノムDNAを沈澱させ、これを10秒間緩
かに撹拌し、氷上に５分間置き、12,000xgで10分間遠心
分離した。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロ
ホルム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心分離
して層を分離した。上層を取り出し、等量のクロロホル
ムで抽出した。10,000gで５分間遠心分離し層を分離し
た。上層を取り出し、２倍量のエタノールを添加して核
酸を沈澱させた。12,000xgで20分間遠心分離して沈澱を
集めた。ペレットを70％エタノールで１回洗い、前記と
同様に再度ペレット化した。ペレットを真空下で乾燥さ
せ、10mMトリス−HCl、1mM EDTA（pH8.0）8mlに再懸濁
した。塩化セシウム8.9g及び臭化エチジウム溶液（5mg/
ml）0.9mlを加えて、塩化セシウム−臭化エチジウム平
衡密度遠心分離用にDNA溶液を調製した。DNA溶液を44,0
00rpmで48時間遠心分離し、得られたDNAのプラスミドバ
ンドをシリンジと18g針で取り出した。等量のCsCl−水
−飽和イソプロパノールで抽出して臭化エチジウムを除
去した。塩化セシウムは透析で除去した。DNAは等量の
フェノール／クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。得られたDNAペレットを10mMトリス−H
Cl、1mM EDTA（pH8.0）1.0mlに再懸濁した。
遠心分離し、250μｌに再懸濁し、100μg/mlのアンピシ
リンを含有するルリアー寒天（Ｌ−寒天）板上にプレー
ティングした。37℃で一晩インキュベートした後、寒天
板を取り出し、約8000個のコロニーを掻き取って抗生物
質含有LB25mlに入れた。これらの細胞からプラスミドDN
Aを次のように調製した：細胞を遠心分離によりペレッ
トとし、細胞ペースト3gを25mMトリス−HCl、10mM EDT
A（pH8.0）及び50mMグルコース14mlに再懸濁した。懸濁
液はリゾチーム中4.0mg/mlとし、25℃で５分間インキュ
ベートした。１％ドデシル硫酸ナトリウム及び0.2N Na
OHのアリコート27mlを加え、溶液を混合し、０℃で５分
間インキュベートした。氷冷した3M酢酸カリウム（pH4.
8）20mlを加えてゲノムDNAを沈澱させ、これを10秒間緩
かに撹拌し、氷上に５分間置き、12,000xgで10分間遠心
分離した。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロ
ホルム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心分離
して層を分離した。上層を取り出し、等量のクロロホル
ムで抽出した。10,000gで５分間遠心分離し層を分離し
た。上層を取り出し、２倍量のエタノールを添加して核
酸を沈澱させた。12,000xgで20分間遠心分離して沈澱を
集めた。ペレットを70％エタノールで１回洗い、前記と
同様に再度ペレット化した。ペレットを真空下で乾燥さ
せ、10mMトリス−HCl、1mM EDTA（pH8.0）8mlに再懸濁
した。塩化セシウム8.9g及び臭化エチジウム溶液（5mg/
ml）0.9mlを加えて、塩化セシウム−臭化エチジウム平
衡密度遠心分離用にDNA溶液を調製した。DNA溶液を44,0
00rpmで48時間遠心分離し、得られたDNAのプラスミドバ
ンドをシリンジと18g針で取り出した。等量のCsCl−水
−飽和イソプロパノールで抽出して臭化エチジウムを除
去した。塩化セシウムは透析で除去した。DNAは等量の
フェノール／クロロホルム（1:1）で抽出し、エタノー
ルで沈澱させた。得られたDNAペレットを10mMトリス−H
Cl、1mM EDTA（pH8.0）1.0mlに再懸濁した。
B.ライブラリーの選択及びスクリーニング Ｂ−1.一次選択及び選択ライブラリー:Hind III,EcoR
I,BamH I,Bgl II及びCla Iプラスミドライブラリー２
μｇ（30.0μｌ）を制限エンドヌクレアーゼ消化バッフ
ァ（10mMトリスpH7.5、10mM MgCl2、10mMメルカプトエ
タノール、100mM NaCl及び牛血清アルブミン100μｇ）
60μｌに希釈した。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ100単
位（３μｌ）を加え、試験管を37℃で２時間インキュベ
ートした。そのときに子牛小腸ホスファターゼ7U（１μ
ｌ）を加え、反応混合物をさらに30分間インキュベート
した。一次ライブラリーと同様に、この反応混合物のア
リコート２μｌ及び４μｌを氷冷したコンピテント大腸
菌RR1細胞200μｌと混合し、形質転換させ、プレーティ
ングし、一晩増殖させた。
I,BamH I,Bgl II及びCla Iプラスミドライブラリー２
μｇ（30.0μｌ）を制限エンドヌクレアーゼ消化バッフ
ァ（10mMトリスpH7.5、10mM MgCl2、10mMメルカプトエ
タノール、100mM NaCl及び牛血清アルブミン100μｇ）
60μｌに希釈した。Hpa I制限エンドヌクレアーゼ100単
位（３μｌ）を加え、試験管を37℃で２時間インキュベ
ートした。そのときに子牛小腸ホスファターゼ7U（１μ
ｌ）を加え、反応混合物をさらに30分間インキュベート
した。一次ライブラリーと同様に、この反応混合物のア
リコート２μｌ及び４μｌを氷冷したコンピテント大腸
菌RR1細胞200μｌと混合し、形質転換させ、プレーティ
ングし、一晩増殖させた。
Ｂ−2.個々の分析：上記形質転換からのコロニーを採
り、アンピシリン含有LB寒天板及びアンピシリン及びス
トレプトマイシン含有LB寒天板上にプレーティングし
た。ampR及びstrepRのHind IIIライブラリーからの８個
のコロニーを10mlの培養物中で増殖させ、コロニーが有
するプラスミドをBirnboim及びDoly（Nucleic Acids Re
s.7:1513（1979））の方法から採用した次の微少製造
（miniprep）精製法により製造した。
り、アンピシリン含有LB寒天板及びアンピシリン及びス
トレプトマイシン含有LB寒天板上にプレーティングし
た。ampR及びstrepRのHind IIIライブラリーからの８個
のコロニーを10mlの培養物中で増殖させ、コロニーが有
するプラスミドをBirnboim及びDoly（Nucleic Acids Re
s.7:1513（1979））の方法から採用した次の微少製造
（miniprep）精製法により製造した。
微少製造法：各培養物を次のように処理した：一晩培
養した培養部1.5mlを6,000xg、５分でペレットにした。
上清を流し捨て、リゾチーム1mg/mlを含有する25mMトリ
ス、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）150μｌに再
懸濁した。室温に５分間置いた後、0.2M NaOH、１％SD
S200μｌを加え、試験管を振とうして細胞を溶解し、氷
上に置いた。５分後、3M酢酸ナトリウム（pH4.8）150μ
ｌを加え、振とうし、さらに５分間氷上に置いた。形成
された沈澱を４℃、12,000xgで10分間回転させて沈澱さ
せた。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロホル
ム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間層を遠心分離
した。エタノール880μｌ含有する遠心管に上清を注ぎ
入れ混合した。室温に10分間置いた後、遠心管を12,000
xgで10分間回転させて沈澱した核酸をペレットにした。
上清を捨て、ペレットを再度1mlの70％エタノール−水
で洗い、再度ペレット化し、真空下、室温で30分間乾燥
させた。一度乾燥させた後、20μg/mlのRNアーゼを含有
する10mMトリス、1mM EDTA（pH8.0）50μｌに再懸濁
し、37℃で１時間インキュベートしてRNAを消去した。
養した培養部1.5mlを6,000xg、５分でペレットにした。
上清を流し捨て、リゾチーム1mg/mlを含有する25mMトリ
ス、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）150μｌに再
懸濁した。室温に５分間置いた後、0.2M NaOH、１％SD
S200μｌを加え、試験管を振とうして細胞を溶解し、氷
上に置いた。５分後、3M酢酸ナトリウム（pH4.8）150μ
ｌを加え、振とうし、さらに５分間氷上に置いた。形成
された沈澱を４℃、12,000xgで10分間回転させて沈澱さ
せた。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロホル
ム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間層を遠心分離
した。エタノール880μｌ含有する遠心管に上清を注ぎ
入れ混合した。室温に10分間置いた後、遠心管を12,000
xgで10分間回転させて沈澱した核酸をペレットにした。
上清を捨て、ペレットを再度1mlの70％エタノール−水
で洗い、再度ペレット化し、真空下、室温で30分間乾燥
させた。一度乾燥させた後、20μg/mlのRNアーゼを含有
する10mMトリス、1mM EDTA（pH8.0）50μｌに再懸濁
し、37℃で１時間インキュベートしてRNAを消去した。
次に、プラスミド微少調製物をHpa I及びHind III消
化により分析した。
化により分析した。
Ｂ−3.メチラーゼ遺伝子クローン：分析してプラスミ
ドの75％はHpa Iに耐性であり、約2.3kb長のHind III断
片を有していることが判明した。さらに、これらのプラ
スミドはHpa I修飾メチラーゼ遺伝子のみを含有し、制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含有していないことが判
明した。調べたプラスミドの他の25％はHpa Iに耐性で
はなく、疑似断片を含有するかまたは再連結したベクタ
ーであった。Hpa Iエンドヌクレアーゼ切断に耐性な他
の４個のライブラリーEcoR I,BamH I,Bgl II及びCla I
にはクローンは認められず、従ってこれ等のライブラリ
ーはそれ以上調査しなかった。
ドの75％はHpa Iに耐性であり、約2.3kb長のHind III断
片を有していることが判明した。さらに、これらのプラ
スミドはHpa I修飾メチラーゼ遺伝子のみを含有し、制
限エンドヌクレアーゼ遺伝子は含有していないことが判
明した。調べたプラスミドの他の25％はHpa Iに耐性で
はなく、疑似断片を含有するかまたは再連結したベクタ
ーであった。Hpa Iエンドヌクレアーゼ切断に耐性な他
の４個のライブラリーEcoR I,BamH I,Bgl II及びCla I
にはクローンは認められず、従ってこれ等のライブラリ
ーはそれ以上調査しなかった。
Ｂ−4.制限遺伝子クローン:Hpa I修飾メチラーゼ遺伝
子を含有すると上記（Ｉ（Ｂ−３））で同定されたクロ
ーンをHpa I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子についても
調べた。操作は次の通りであった。：一晩培養物の残部
を使用してエンドヌクレアーゼ活性を調べた。これは次
のように実施した： エンドヌクレアーゼアッセイ： 10X制限エンドヌクレアーゼバッファ:100mMトリス（p
H7.5）、100mM MgCl2、100mM ２−メルカプトエタノ
ール、1M NaCl。
子を含有すると上記（Ｉ（Ｂ−３））で同定されたクロ
ーンをHpa I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子についても
調べた。操作は次の通りであった。：一晩培養物の残部
を使用してエンドヌクレアーゼ活性を調べた。これは次
のように実施した： エンドヌクレアーゼアッセイ： 10X制限エンドヌクレアーゼバッファ:100mMトリス（p
H7.5）、100mM MgCl2、100mM ２−メルカプトエタノ
ール、1M NaCl。
細胞抽出物は次のように調製した:4,000rpmで５分間
遠心分離して、1mlから細胞をペレット化した。上清を
捨て、ペレットを超音波処理バッファ（50mMトリス（pH
8.0）、5mM DTT、５％グリセロール）1mlに再懸濁し、
10秒ずつ２回緩かに超音波処理して細胞を破壊した。試
験管を４℃で10分間マイクロ遠心分離にかけ、上清を細
胞抽出物として使用した。抽出物１μｌ及び10μｌを、
1X制限エンドヌクレアーゼバッファ50μｌ中のλDNA1μ
ｇと共に37℃で15分間インキュベートした。テストした
クローンのいずれもエンドヌクレアーゼ活性を有してい
なかった。
遠心分離して、1mlから細胞をペレット化した。上清を
捨て、ペレットを超音波処理バッファ（50mMトリス（pH
8.0）、5mM DTT、５％グリセロール）1mlに再懸濁し、
10秒ずつ２回緩かに超音波処理して細胞を破壊した。試
験管を４℃で10分間マイクロ遠心分離にかけ、上清を細
胞抽出物として使用した。抽出物１μｌ及び10μｌを、
1X制限エンドヌクレアーゼバッファ50μｌ中のλDNA1μ
ｇと共に37℃で15分間インキュベートした。テストした
クローンのいずれもエンドヌクレアーゼ活性を有してい
なかった。
C. Hpa Iエンドヌクレアーゼ蛋白質の製造、Hpa Iエン
ドヌクレアーゼの蛋白質配列決定、Hpa Iエンドヌクレ
アーゼ位置のマッピング及びHpa Iエンドヌクレアーゼ
の領域のDNA配列決定 Ｃ−1.37℃の培養器内で、下記のものからなるTRY−Y
Eブロス培地中で、NEB＃127と表すパラインフルエンザ
菌由来のHpa Iエンドヌクレアーゼを増殖させた：トリ
プトン10.0g/l;酵母抽出物5.0g/l;NaCl2.0g/l;K2HPO44.
4g/l;グルコース2.0g/l;牛ヘミン10mg/l;NAD;DPN2.0mg/
l。遠心分離して細胞を集め、細胞ペーストをすぐに使
用するか−70℃で保存した。
ドヌクレアーゼの蛋白質配列決定、Hpa Iエンドヌクレ
アーゼ位置のマッピング及びHpa Iエンドヌクレアーゼ
の領域のDNA配列決定 Ｃ−1.37℃の培養器内で、下記のものからなるTRY−Y
Eブロス培地中で、NEB＃127と表すパラインフルエンザ
菌由来のHpa Iエンドヌクレアーゼを増殖させた：トリ
プトン10.0g/l;酵母抽出物5.0g/l;NaCl2.0g/l;K2HPO44.
4g/l;グルコース2.0g/l;牛ヘミン10mg/l;NAD;DPN2.0mg/
l。遠心分離して細胞を集め、細胞ペーストをすぐに使
用するか−70℃で保存した。
Ｃ−2.以下の全ステップは４℃で実施した。
Ｃ−3.細胞ペースト（362g）を解凍し、細胞を超音波
処理バッファ（50mMトリス（pH8.0）、5mM DTT、５％
グリセロール）1000mlに再懸濁した。
処理バッファ（50mMトリス（pH8.0）、5mM DTT、５％
グリセロール）1000mlに再懸濁した。
Ｃ−4.ガウリンミルで細胞を破壊し、懸濁細胞1ml当
り約50mgの可溶性蛋白質を放出させた。
り約50mgの可溶性蛋白質を放出させた。
Ｃ−5.15,000xgで40分間遠心分離して不溶性の細胞残
渣を除去した。
渣を除去した。
Ｃ−6.次のように、上清の液体を硫酸ストレプトマイ
シン沈澱（容量当り５重量％）させた：硫酸ストレプト
マイシン17.35gを超音波処理バッファ347mlに加え、こ
の溶液を４℃で45分かけてゆっくりと上清に加えた。溶
液をさらに30分間撹拌し、４℃、21,000xgで30分間遠心
分離して、上清を集めた。
シン沈澱（容量当り５重量％）させた：硫酸ストレプト
マイシン17.35gを超音波処理バッファ347mlに加え、こ
の溶液を４℃で45分かけてゆっくりと上清に加えた。溶
液をさらに30分間撹拌し、４℃、21,000xgで30分間遠心
分離して、上清を集めた。
Ｃ−7.上清液を次のように硫酸アンモニウム（70％）
沈澱させた： 45分かけて上清1.4lに硫酸アンモニウム660gを加え
た。溶液をさらに30分撹拌し、４℃、21,000xgで30分間
遠心分離して、沈澱物を集めた。
沈澱させた： 45分かけて上清1.4lに硫酸アンモニウム660gを加え
た。溶液をさらに30分撹拌し、４℃、21,000xgで30分間
遠心分離して、沈澱物を集めた。
硫酸アンモニウム溶液の40％飽和溶液（超音波バッフ
ァ中で調製）600mlに沈澱別を再懸濁した。硫酸アンモ
ニウムをさらに97g加えて、溶液の飽和度を55％とし
た。溶液を４℃で30分間撹拌し、４℃、21,000xgで30分
間遠心分離した。
ァ中で調製）600mlに沈澱別を再懸濁した。硫酸アンモ
ニウムをさらに97g加えて、溶液の飽和度を55％とし
た。溶液を４℃で30分間撹拌し、４℃、21,000xgで30分
間遠心分離した。
沈澱を集め、20mM K2HPO4（pH6.9）、0.1m MEDTA、
5mM DTT、10％グリセロール300mlに再懸濁した。同じ
バッファに対して透析した。次に２倍量の同じバッファ
で希釈した。
5mM DTT、10％グリセロール300mlに再懸濁した。同じ
バッファに対して透析した。次に２倍量の同じバッファ
で希釈した。
Ｃ−8.20mM K2HPO4（pH6.9）、50mM NaCl、5mM DT
T及び10％グリセロールで平衡化したホスホセルロース
カラム（５×35cm）（Whatman p−11）に上清液をかけ
る。カラム容量の２倍の上記バッファでカラムを洗う。
カラムからの流出を１つのフラスコに集めた。Hpa Iエ
ンドヌクレアーゼはカラムに保持され、0.3及び0.6M N
aClの間で溶出された。最大活性の画分を集め、20mM K
2HPO4（pH7.4）、0.5mM EDTA、5mM DTT、10％グリセ
ロール及び0.05MKClに対して透析する。
T及び10％グリセロールで平衡化したホスホセルロース
カラム（５×35cm）（Whatman p−11）に上清液をかけ
る。カラム容量の２倍の上記バッファでカラムを洗う。
カラムからの流出を１つのフラスコに集めた。Hpa Iエ
ンドヌクレアーゼはカラムに保持され、0.3及び0.6M N
aClの間で溶出された。最大活性の画分を集め、20mM K
2HPO4（pH7.4）、0.5mM EDTA、5mM DTT、10％グリセ
ロール及び0.05MKClに対して透析する。
Ｃ−9.ホスホセルロースカラムからのプールを、20mM
K2HPO4（pH7.4）、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.05M K
Cl及び10％グリセロールで平衡化したヘパリン−セファ
ロースCL−6Bカラム（2.5×25cm）にかけ、カラム容量
の２倍量の同じバッファで洗う。0.05Mから1.0MのKCl
（全量700ml）を直線勾配とし、カラムにかける。10ml
の画分を集める。λDNAに対するHpa I制限エンドヌクレ
アーゼ活性の存在について画分をアッセイする。活性画
分を集め、バッファＳ（20mM K2HPO4（pH6.9）、0.1mM
EDTA、5mM DTT、0.05M KCl、10％グリセロール）10
0容に対して透析する。
K2HPO4（pH7.4）、0.5mM EDTA、5mM DTT、0.05M K
Cl及び10％グリセロールで平衡化したヘパリン−セファ
ロースCL−6Bカラム（2.5×25cm）にかけ、カラム容量
の２倍量の同じバッファで洗う。0.05Mから1.0MのKCl
（全量700ml）を直線勾配とし、カラムにかける。10ml
の画分を集める。λDNAに対するHpa I制限エンドヌクレ
アーゼ活性の存在について画分をアッセイする。活性画
分を集め、バッファＳ（20mM K2HPO4（pH6.9）、0.1mM
EDTA、5mM DTT、0.05M KCl、10％グリセロール）10
0容に対して透析する。
Ｃ−10.Hpa I活性画分の透析プール（50ml）を1mlのM
ono S FPLCカラム（Pharmacia）にかけ、バッファＳ（2
0mM K2HPO4（pH6.9）、5mM DTT、10％グリセロール、
0.05M KCl、0.1mM EDTA）で洗い、Ｓバッファ中で50m
Mから1.0MのKCl40mlの直線勾配を作り、カラムにかけ
る。1mlの画分を集め、Hpa I制限エンドヌクレアーゼ活
性の存在についてアッセイする。４つの活性の最強の画
分は均質であり、比活性約250,000単位/mg蛋白質、SDS
−ポリアクリルアミドゲル上での分子量は30,000ダルト
ンであることが判った。
ono S FPLCカラム（Pharmacia）にかけ、バッファＳ（2
0mM K2HPO4（pH6.9）、5mM DTT、10％グリセロール、
0.05M KCl、0.1mM EDTA）で洗い、Ｓバッファ中で50m
Mから1.0MのKCl40mlの直線勾配を作り、カラムにかけ
る。1mlの画分を集め、Hpa I制限エンドヌクレアーゼ活
性の存在についてアッセイする。４つの活性の最強の画
分は均質であり、比活性約250,000単位/mg蛋白質、SDS
−ポリアクリルアミドゲル上での分子量は30,000ダルト
ンであることが判った。
Ｃ−11.均質なHpa Iエンドヌクレアーゼ10μｇを、Ap
plied Biosystems470A型気相蛋白質シークエンサーでの
アミノ末端蛋白質配列決定にかける（Brooksら,Nucleic
Acids Research,17:979−997,（1989））。最初の20残
基が分解された。得られた最初の11残基の配列は:X K V
/Y E E I N W K V/Y P（蛋白質配列に関する一文字コー
ドの説明は第１表を参照のこと）であった。
plied Biosystems470A型気相蛋白質シークエンサーでの
アミノ末端蛋白質配列決定にかける（Brooksら,Nucleic
Acids Research,17:979−997,（1989））。最初の20残
基が分解された。得られた最初の11残基の配列は:X K V
/Y E E I N W K V/Y P（蛋白質配列に関する一文字コー
ドの説明は第１表を参照のこと）であった。
Ｃ−12.蛋白質配列に基づき、配列:5′TT CCA RTT DA
T YTC YTC3′（Ｙ＝T,C;D＝A,G;T;R＝ＡまたはＧ）の17
−マーを作成し、ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M7.5−A10上の
エンドヌクレアーゼアミノ末端位置マッピングに使用し
た。DNA配列が得られ、これとプローブハイブリダイゼ
ーションの結果とからエンドヌクレアーゼの方向を決定
した。得られたDNA配列は であった。17−マーオリゴマー及びHind IIIライブラリ
ー（ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M−7.5−A10）から得られた
メチラーゼクローンを使用して、パラインフルエンザ菌
ゲノムの種々の制限断片に対してエンドヌクレアーゼ遺
伝子とメチラーゼ遺伝子をマッピングした。ｐ（pBIIH
I.2）Hpa I M10.5−A10の制限地図及びエンドヌクレア
ーゼプローブがメチラーゼクローンにハイブリダイズし
ている位置については第３図参照のこと。
T YTC YTC3′（Ｙ＝T,C;D＝A,G;T;R＝ＡまたはＧ）の17
−マーを作成し、ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M7.5−A10上の
エンドヌクレアーゼアミノ末端位置マッピングに使用し
た。DNA配列が得られ、これとプローブハイブリダイゼ
ーションの結果とからエンドヌクレアーゼの方向を決定
した。得られたDNA配列は であった。17−マーオリゴマー及びHind IIIライブラリ
ー（ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M−7.5−A10）から得られた
メチラーゼクローンを使用して、パラインフルエンザ菌
ゲノムの種々の制限断片に対してエンドヌクレアーゼ遺
伝子とメチラーゼ遺伝子をマッピングした。ｐ（pBIIH
I.2）Hpa I M10.5−A10の制限地図及びエンドヌクレア
ーゼプローブがメチラーゼクローンにハイブリダイズし
ている位置については第３図参照のこと。
II.Hpa I制限−修飾系のクローニング A.ライブラリーの作成 Ａ−1.I（Ｃ−11）で得たデータに基づき、次のよう
にＩ（Ａ−１）で調製した精製パラインフルエンザ菌ゲ
ノムDNAを、Kpn Iで限定消化した:10mMトリス（pH7.
5）、10mMMgCl2、0mM NaCl、10mMメルカプトエタノー
ルバッファ中に100μg/mlのDNA300μｌ試験管１本に入
れた。この試験管にKpn I50単位を加えた。試験管を37
℃で１時間インキュベートし、次いでフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱させた。10mMトリス−
HCl、1mM EDTA（pH8.0）300μｌにペレットを再度溶解
し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
にＩ（Ａ−１）で調製した精製パラインフルエンザ菌ゲ
ノムDNAを、Kpn Iで限定消化した:10mMトリス（pH7.
5）、10mMMgCl2、0mM NaCl、10mMメルカプトエタノー
ルバッファ中に100μg/mlのDNA300μｌ試験管１本に入
れた。この試験管にKpn I50単位を加えた。試験管を37
℃で１時間インキュベートし、次いでフェノール／クロ
ロホルム抽出し、エタノール沈澱させた。10mMトリス−
HCl、1mM EDTA（pH8.0）300μｌにペレットを再度溶解
し、各10μｌをアガロースゲル電気泳動で分析した。
Ａ−2.連結：次のようにして、pBIIHI.2KI（Pve II部
位に挿入したHpa Iリンカー、EcoR I部位に挿入したBgl
IIリンカー及びEcoR V部位に挿入したKpn Iリンカーを
有するpNO1523）に断片化したDNAを連結した:Kpn Iで消
化したパラインフルエンザ菌DNA10.0μｇ（100μｌ）
を、Kpn Iで切断し脱燐酸化したpBIIHI.2KI2.0μｇ（20
μｌ）と混合し、エタノール沈澱させた。DNAを４℃、1
2,000gで15分間遠心分離し、70％エタノール100μｌで
１回洗った。DNAを1x連結バッファ（50mMトリス（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）99μｌに
再懸濁し、T4 DNAリガーゼ１μｌを加え、混合物を16
℃で16時間インキュベートした。アリコート2.5及び5.0
μｌを使用して次のように大腸菌株RR1を形質転換し
た：各アリコートを氷冷したコンピテント大腸菌RR1細
胞200μｌと混合し、氷上に30分間置いた。42℃で２分
間加熱ショックを行った後、細胞をルリアーブロス（Ｌ
−ブロス）1mlで希釈し、37℃で１時間増殖させた。
位に挿入したHpa Iリンカー、EcoR I部位に挿入したBgl
IIリンカー及びEcoR V部位に挿入したKpn Iリンカーを
有するpNO1523）に断片化したDNAを連結した:Kpn Iで消
化したパラインフルエンザ菌DNA10.0μｇ（100μｌ）
を、Kpn Iで切断し脱燐酸化したpBIIHI.2KI2.0μｇ（20
μｌ）と混合し、エタノール沈澱させた。DNAを４℃、1
2,000gで15分間遠心分離し、70％エタノール100μｌで
１回洗った。DNAを1x連結バッファ（50mMトリス（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）99μｌに
再懸濁し、T4 DNAリガーゼ１μｌを加え、混合物を16
℃で16時間インキュベートした。アリコート2.5及び5.0
μｌを使用して次のように大腸菌株RR1を形質転換し
た：各アリコートを氷冷したコンピテント大腸菌RR1細
胞200μｌと混合し、氷上に30分間置いた。42℃で２分
間加熱ショックを行った後、細胞をルリアーブロス（Ｌ
−ブロス）1mlで希釈し、37℃で１時間増殖させた。
Ａ−3.一次細胞ライブラリー：ステップＩ（Ａ−４）
にもう一つのステップを追加して製造した：ステップＩ
（Ｃ−10）で得たデータに基づき、（サザンハイブリダ
イゼーションを介して）ライブラリーを、Hpa Iメチラ
ーゼ全体とエンドヌクレアーゼのアミノ末端とを含有す
る（ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M−7.5−A10から単離した）H
ind III断片とのプローブとし、エンドヌクレアーゼ及
びメチラーゼを含有すると思われる適当な大きさのKpn
I断片を捜した。この断片は一次細胞ライブラリー中に
存在した。
にもう一つのステップを追加して製造した：ステップＩ
（Ｃ−10）で得たデータに基づき、（サザンハイブリダ
イゼーションを介して）ライブラリーを、Hpa Iメチラ
ーゼ全体とエンドヌクレアーゼのアミノ末端とを含有す
る（ｐ（pBIIHI.2）Hpa I M−7.5−A10から単離した）H
ind III断片とのプローブとし、エンドヌクレアーゼ及
びメチラーゼを含有すると思われる適当な大きさのKpn
I断片を捜した。この断片は一次細胞ライブラリー中に
存在した。
B.ライブラリーの選択とスクリーニング Ｂ−1.一次選択と選択ライブラリー：ステップＩ（Ｂ
−１）と同様に調製した。選択ライブラリーはステップ
II（Ａ−２）に記載のようにプローブ化した。
−１）と同様に調製した。選択ライブラリーはステップ
II（Ａ−２）に記載のようにプローブ化した。
Ｂ−2.個々の分析：上記形質転換からのコロニーを取
り、アンピシリン含有LB−寒天板及びアンピシリン及び
ストレプトマイシン含有LB−寒天板上にプレーティング
した。約90％がストレプトマイシンＳであった。
り、アンピシリン含有LB−寒天板及びアンピシリン及び
ストレプトマイシン含有LB−寒天板上にプレーティング
した。約90％がストレプトマイシンＳであった。
Ｂ−3.100μg/mlアンピシリン含有LBを使用して板か
ら96群のコロニーを掻き取り、次のように微少製造し
た： 細胞ペレットを、リゾチーム1mg/ml含有した25mMトリ
ス、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）2.0mLlに再
懸濁した。室温に５分間置いた後、0.2M NaOH、１％SD
S4.0mlを加え、試験管を振とうして細胞を溶解し、次に
氷上に置いた。５分後に、3M酢酸ナトリウム（pH4.8）
3.0mlを加え、振とうし、さらに５分間氷上に置いた。
形成された沈澱を４℃、12,000xgで10分間回転し、沈澱
させた。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロホ
ルム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心分離し
層を分離した。上清を取り出し、等量のクロロホルム
（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心して層を分
離した。エタノール18.0ml含有する遠心管に上清を注ぎ
入れ、混合した。室温に２分間置いた後、遠心管を12,0
00xgで20分間回転させて、沈澱した核酸をペレット化し
た。上清を捨て、ペレットを70％エタノール−水5mlで
再度洗い、再度ペレット化し、真空下室温で30分間乾燥
させた。一度乾燥させてから、ペレットをRAアーゼ20μ
g/ml含有10mMトリス、1mM EDTA（pH8.0）500μｌに再
懸濁し、37℃で１時間インキュベートしてRNAを消化し
た。
ら96群のコロニーを掻き取り、次のように微少製造し
た： 細胞ペレットを、リゾチーム1mg/ml含有した25mMトリ
ス、10mM EDTA、50mMグルコース（pH8.0）2.0mLlに再
懸濁した。室温に５分間置いた後、0.2M NaOH、１％SD
S4.0mlを加え、試験管を振とうして細胞を溶解し、次に
氷上に置いた。５分後に、3M酢酸ナトリウム（pH4.8）
3.0mlを加え、振とうし、さらに５分間氷上に置いた。
形成された沈澱を４℃、12,000xgで10分間回転し、沈澱
させた。上清を取り出し、等量のフェノール／クロロホ
ルム（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心分離し
層を分離した。上清を取り出し、等量のクロロホルム
（1:1）で抽出した。10,000xgで５分間遠心して層を分
離した。エタノール18.0ml含有する遠心管に上清を注ぎ
入れ、混合した。室温に２分間置いた後、遠心管を12,0
00xgで20分間回転させて、沈澱した核酸をペレット化し
た。上清を捨て、ペレットを70％エタノール−水5mlで
再度洗い、再度ペレット化し、真空下室温で30分間乾燥
させた。一度乾燥させてから、ペレットをRAアーゼ20μ
g/ml含有10mMトリス、1mM EDTA（pH8.0）500μｌに再
懸濁し、37℃で１時間インキュベートしてRNAを消化し
た。
Ｂ−4.ステップII（Ｂ−３）のプレートからの掻き取
り物からプラスミドDNAをメチラーゼ遺伝子含有Hind II
I断片についてプローブ化し（ステップII（Ａ−３）参
照）、１つのプレートは正しい大きさのKpn I断片を含
有していることが判明した。
り物からプラスミドDNAをメチラーゼ遺伝子含有Hind II
I断片についてプローブ化し（ステップII（Ａ−３）参
照）、１つのプレートは正しい大きさのKpn I断片を含
有していることが判明した。
Ｂ−5.「陽性」のプレート（II（Ｂ−４）参照）から
８群のコロニーを掻き取り、ステップＩ（Ｂ−４）と同
様にエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。８
群の内１群はHpa I活性を有していた。
８群のコロニーを掻き取り、ステップＩ（Ｂ−４）と同
様にエンドヌクレアーゼ活性についてアッセイした。８
群の内１群はHpa I活性を有していた。
Ｂ−6.8群のコロニー（II（Ｂ−５）参照）を微少製
造し（Ｉ（Ｂ−２）参照）、１つは正しい大きさのKpn
I断片を有し、Hpa Iエンドヌクレアーゼ消化に耐性であ
ることが判った。
造し（Ｉ（Ｂ−２）参照）、１つは正しい大きさのKpn
I断片を有し、Hpa Iエンドヌクレアーゼ消化に耐性であ
ることが判った。
Ｂ−7.制限遺伝子クローン:Hpa I修飾メチラーゼ遺伝
子を含有することが上記（II（Ｂ−６））で同定された
クローンをHpa I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子につい
ても調べた。これはステップ８と同様に行った。このク
ローンはHpa Iエンドヌクレアーゼ活性を有し、湿った
細胞ペースト1g当り約40,000単位のHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを合成することが判った。
子を含有することが上記（II（Ｂ−６））で同定された
クローンをHpa I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子につい
ても調べた。これはステップ８と同様に行った。このク
ローンはHpa Iエンドヌクレアーゼ活性を有し、湿った
細胞ペースト1g当り約40,000単位のHpa I制限エンドヌ
クレアーゼを合成することが判った。
C.Hpa I制限−修飾クローンの制限地図作成と欠損サブ
クローンの調製 Ｃ−1.p（pBIIHI.2KI）Hpa I RM−10.5−45を使用し
て同質遺伝子型の大腸菌株を形質転換し、MrcA、McrBま
たはmrr表現型のいずれかによる強力な作用を捜した。
このRMクローンはどのmrr+株中にも形質転換できず、従
って増殖できないことが発見された。
クローンの調製 Ｃ−1.p（pBIIHI.2KI）Hpa I RM−10.5−45を使用し
て同質遺伝子型の大腸菌株を形質転換し、MrcA、McrBま
たはmrr表現型のいずれかによる強力な作用を捜した。
このRMクローンはどのmrr+株中にも形質転換できず、従
って増殖できないことが発見された。
Ｃ−2.いくらかの変更を加えステップ９−16に記載の
ように、ｐ（pBIIHI.2）Hpa I RM10.5−A10含有大腸菌R
R1細胞からHpa Iエンドヌクレアーゼを調製した：カゼ
イン加水分解物10g/l;酵母抽出物5g/l;NaCl 10g/l;塩
化マグネシウム六水塩1g/l;グルコース1g/l;アンピシリ
ン100mg/lを含有し、pHをNaOHDEで7.2に調整したLBブロ
ス培地中で細胞を増殖させた。細胞を超音波処理して融
解させた。硫酸ストプレトマイシン及び硫酸アンモニウ
ム沈澱ステップは実施しなかった。精製したエンドヌク
レアーゼは細胞1g当り40,000単位のHpa Iエンドヌクレ
アーゼを産生し、比活性約250,000単位/mg蛋白質である
ことが判った。
ように、ｐ（pBIIHI.2）Hpa I RM10.5−A10含有大腸菌R
R1細胞からHpa Iエンドヌクレアーゼを調製した：カゼ
イン加水分解物10g/l;酵母抽出物5g/l;NaCl 10g/l;塩
化マグネシウム六水塩1g/l;グルコース1g/l;アンピシリ
ン100mg/lを含有し、pHをNaOHDEで7.2に調整したLBブロ
ス培地中で細胞を増殖させた。細胞を超音波処理して融
解させた。硫酸ストプレトマイシン及び硫酸アンモニウ
ム沈澱ステップは実施しなかった。精製したエンドヌク
レアーゼは細胞1g当り40,000単位のHpa Iエンドヌクレ
アーゼを産生し、比活性約250,000単位/mg蛋白質である
ことが判った。
Ｃ−3.次のようにEcoR I制限エンドヌクレアーゼでｐ
（pBIIHI.2）Hpa I RM10.5−A10 30μｇを消化した:10m
Mトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaCl、10mMメ
ルカプトエタノール中100μg/mlの濃度のDNA300μｌを
１本の管に入れた。管にはEcoR Iエンドヌクレアーゼ10
0単位を加え、反応混合物を37℃で２時間インキュベー
トした。全消化物を製造用0.7％アガロースゲルにかけ
た。全メチラーゼ遺伝子を含有することが判明してお
り、全エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有すると考えられ
る選択すべき約2.3kbのEcoR I断片をゲルから切り出し
た。ゲル画分を21ゲージの針で押しだし、また凍結させ
た。これを３回繰り返した。得られた混合物を４℃、10
0,000xgで１時間遠心分離しアガロースをペレット化し
た。残りの水溶液をNaCl濃度0.4Mとし、２倍量のイソプ
ロパノールで沈澱させた。12,000xgで20分間遠心分離し
てDNAをペレット化し、70％冷エタノールで１回洗っ
た。DNAペレットを2mlTEに再懸濁し、等量のフェノール
で抽出した。10,000xg、10分間遠心分離して層を分離し
た。上層を取り出し、等量のフェノール／クロロホルム
（1:1）で抽出し、10.000xgで10分間遠心分離して層を
分離した。上層を取り出して、等量のクロロホルムで抽
出し、10,000xgで遠心分離して層を分離した。水層を取
り出し、2.75M酢酸ナトリウム1/10容（0.2ml）及び冷エ
タノール２容を加えてDNAを沈澱させた。12,000xgで20
分間遠心分離してDNAをペレットし、70％の冷エタノー
ルで１回洗った。DNAを0.5mlTEに再懸濁した。
（pBIIHI.2）Hpa I RM10.5−A10 30μｇを消化した:10m
Mトリス（pH7.5）、10mM MgCl2、100mM NaCl、10mMメ
ルカプトエタノール中100μg/mlの濃度のDNA300μｌを
１本の管に入れた。管にはEcoR Iエンドヌクレアーゼ10
0単位を加え、反応混合物を37℃で２時間インキュベー
トした。全消化物を製造用0.7％アガロースゲルにかけ
た。全メチラーゼ遺伝子を含有することが判明してお
り、全エンドヌクレアーゼ遺伝子を含有すると考えられ
る選択すべき約2.3kbのEcoR I断片をゲルから切り出し
た。ゲル画分を21ゲージの針で押しだし、また凍結させ
た。これを３回繰り返した。得られた混合物を４℃、10
0,000xgで１時間遠心分離しアガロースをペレット化し
た。残りの水溶液をNaCl濃度0.4Mとし、２倍量のイソプ
ロパノールで沈澱させた。12,000xgで20分間遠心分離し
てDNAをペレット化し、70％冷エタノールで１回洗っ
た。DNAペレットを2mlTEに再懸濁し、等量のフェノール
で抽出した。10,000xg、10分間遠心分離して層を分離し
た。上層を取り出し、等量のフェノール／クロロホルム
（1:1）で抽出し、10.000xgで10分間遠心分離して層を
分離した。上層を取り出して、等量のクロロホルムで抽
出し、10,000xgで遠心分離して層を分離した。水層を取
り出し、2.75M酢酸ナトリウム1/10容（0.2ml）及び冷エ
タノール２容を加えてDNAを沈澱させた。12,000xgで20
分間遠心分離してDNAをペレットし、70％の冷エタノー
ルで１回洗った。DNAを0.5mlTEに再懸濁した。
Ｃ−4.次のようにして、pBIIHI.2のEcoR I部位にゲル
調整したEcoR I断片を連結した：ゲル調製したEcoR I断
片60μｌ（0.5μｇ）を、EcoR I切断し、脱燐酸化したp
BIIHI.2 5μｌ（0.5μｇ）と混合した。これに酢酸ナト
リウム1/10容（10μｌ）、TE35μｌ及び冷エタノール２
容（200μｌ）を加えた。４℃、12,000xgで15分間遠心
分離してDNAをペレット化し、70％エタノール100μｌで
１回洗った。DNAを1x連結バッファ（50mMトリス（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）に再懸濁
し、T4DNAリガーゼ１μｌを加え、混合物を16℃で16時
間インキュベートした。１、２及び３μｌのアリコート
を使用して22に記載のように大腸菌RR1株を形質転換し
た。形質転換した細胞培養物を遠心分離し、250μｌ容
に再懸濁し、アンピシリン100μg/ml含有Ｌ−寒天上に
プレーティングした。寒天プレート上の培養物を37℃で
一晩インキュベートした。
調整したEcoR I断片を連結した：ゲル調製したEcoR I断
片60μｌ（0.5μｇ）を、EcoR I切断し、脱燐酸化したp
BIIHI.2 5μｌ（0.5μｇ）と混合した。これに酢酸ナト
リウム1/10容（10μｌ）、TE35μｌ及び冷エタノール２
容（200μｌ）を加えた。４℃、12,000xgで15分間遠心
分離してDNAをペレット化し、70％エタノール100μｌで
１回洗った。DNAを1x連結バッファ（50mMトリス（pH7.
5）、10mM MgCl2、10mM DTT、0.5mM ATP）に再懸濁
し、T4DNAリガーゼ１μｌを加え、混合物を16℃で16時
間インキュベートした。１、２及び３μｌのアリコート
を使用して22に記載のように大腸菌RR1株を形質転換し
た。形質転換した細胞培養物を遠心分離し、250μｌ容
に再懸濁し、アンピシリン100μg/ml含有Ｌ−寒天上に
プレーティングした。寒天プレート上の培養物を37℃で
一晩インキュベートした。
Ｃ−5.上記形質転換からのコロニーを採り、アンピシ
リン含有LB寒天プレート及びアンピシリン及びストレプ
トマイシン含有LB寒天プレート上にプレーティングし
た。
リン含有LB寒天プレート及びアンピシリン及びストレプ
トマイシン含有LB寒天プレート上にプレーティングし
た。
Ｃ−6.アンピシリンＲ及びストレプトマイシンＲであ
る18個のコロニーをＩ（Ｂ−２）及びＩ（Ｃ−３）に記
載のように微少製造すると、正しい大きさのEcoR I断片
を有し、Hpa Iエンドヌクレアーゼ消化に耐性であるこ
とが判った。
る18個のコロニーをＩ（Ｂ−２）及びＩ（Ｃ−３）に記
載のように微少製造すると、正しい大きさのEcoR I断片
を有し、Hpa Iエンドヌクレアーゼ消化に耐性であるこ
とが判った。
Ｃ−7.制限遺伝子クローン:Hpa I修飾メチラーゼを有
する上記で同定されたクローンをHpa I制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子についても調べた。これはステップＩ
（Ｂ−４）に記載のように実施した。調べた11個の内、
ｐ（pBIIHI.2）Hpa I RM−7.4−13は細胞1g当りHpa Iエ
ンドヌクレアーゼ155,000単位を産生し、他の10個はｐ
（pBIIHI.2）Hpa I RM−7.4−２と同様であり、細胞1g
当りHpa Iエンドヌクレアーゼ10,000単位を産生するこ
とが判った。
する上記で同定されたクローンをHpa I制限エンドヌク
レアーゼ遺伝子についても調べた。これはステップＩ
（Ｂ−４）に記載のように実施した。調べた11個の内、
ｐ（pBIIHI.2）Hpa I RM−7.4−13は細胞1g当りHpa Iエ
ンドヌクレアーゼ155,000単位を産生し、他の10個はｐ
（pBIIHI.2）Hpa I RM−7.4−２と同様であり、細胞1g
当りHpa Iエンドヌクレアーゼ10,000単位を産生するこ
とが判った。
Ｃ−8.p（pBIIHI.2）Hpa I RM−7.4−13及びｐ（pBII
HI.2）Hpa I RM−7.4−２を使用して同質遺伝子型の大
腸菌株を形質転換し、強力なMcrA、McrBまたはmrr表現
型を捜した。II（Ｃ−４）に記載したように、これらRM
クローンの両者も、どのmrr+株中にも形質転換できず、
従って増殖できなかった。
HI.2）Hpa I RM−7.4−２を使用して同質遺伝子型の大
腸菌株を形質転換し、強力なMcrA、McrBまたはmrr表現
型を捜した。II（Ｃ−４）に記載したように、これらRM
クローンの両者も、どのmrr+株中にも形質転換できず、
従って増殖できなかった。
Ｃ−9.II（Ｃ−２）に記載のように、ｐ（pBIIHI.2）
Hpa I RM−7.4−13含有大腸菌RR1細胞からHpa Iエンド
ヌクレアーゼを調製した。精製したエンドヌクレアーゼ
は比活性約250,000単位/mg蛋白質であることが判った。
Hpa I RM−7.4−13含有大腸菌RR1細胞からHpa Iエンド
ヌクレアーゼを調製した。精製したエンドヌクレアーゼ
は比活性約250,000単位/mg蛋白質であることが判った。
第１図は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼのクローニン
グの概要を示す。 第２図は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼの製造の概要
を示す。 第３図は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと修飾メチラ
ーゼをコードするパラインフルエンザ菌由来の5.5Kb Kp
n Iの制限地図である。pBIIHI.2KI（NEB＃560、このサ
ンプルは受託番号68002としてATCCに寄託してある）のK
pn I部位にその断片をクローニングし、ｐ（pBIIHI.2K
I）Hpa I RM−10.5−45を生成した。 第４図は、ｐ（pBIIHI.2KI）Hpa I RM−10.5−45を含有
する大腸菌RR1（ATCC31343）の細胞抽出物中のHpa I制
限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの粒子
構造の写真である。 第５図は、調製した各ライブラリーについて得られた形
質転換体の数、各ライブラリーから得られるHpa Iメチ
ラーゼクローンもしくはHpa I制限−修飾クローンの数
を示す図である。 第６図は、本明細書に記載されているHpa I制限−修飾
クローンの図である。
グの概要を示す。 第２図は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼの製造の概要
を示す。 第３図は、Hpa I制限エンドヌクレアーゼと修飾メチラ
ーゼをコードするパラインフルエンザ菌由来の5.5Kb Kp
n Iの制限地図である。pBIIHI.2KI（NEB＃560、このサ
ンプルは受託番号68002としてATCCに寄託してある）のK
pn I部位にその断片をクローニングし、ｐ（pBIIHI.2K
I）Hpa I RM−10.5−45を生成した。 第４図は、ｐ（pBIIHI.2KI）Hpa I RM−10.5−45を含有
する大腸菌RR1（ATCC31343）の細胞抽出物中のHpa I制
限エンドヌクレアーゼ活性を示すアガロースゲルの粒子
構造の写真である。 第５図は、調製した各ライブラリーについて得られた形
質転換体の数、各ライブラリーから得られるHpa Iメチ
ラーゼクローンもしくはHpa I制限−修飾クローンの数
を示す図である。 第６図は、本明細書に記載されているHpa I制限−修飾
クローンの図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:21） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎｅＳｅｑ
Claims (6)
- 【請求項１】Hpa I制限エンドヌクレアーゼをコードし
ていて、Haemophilus parainfluenzae（ATCC No.5391
3）から得られる5.5kb Kpn Iフラグメント中に見出され
うる、単離されたDNA。 - 【請求項２】上記Hpa I制限エンドヌクレアーゼをコー
ドしているDNAセグメントが挿入されているベクターを
有する組み換えDNAベクター。 - 【請求項３】Hpa I制限エンドヌクレアーゼおよびメチ
ラーゼをコードしていて、Haemophilus parainfluenzae
（ATCC No.53913）から得られる5.5kb Kpn Iフラグメ
ント中に見出されうる、単離されたDNA。 - 【請求項４】請求項３に記載の単離されたDNAセグメン
トを有するクローニングベクター。 - 【請求項５】請求項２または４のベクターにより形質転
換された宿主細胞。 - 【請求項６】請求項２または４に記載のベクターにより
形質転換された宿主細胞を、下記制限エンドヌクレアー
ゼの発現に適した条件下に培養することを含む、Hpa I
制限エンドヌクレアーゼを製造する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/421,272 US5298404A (en) | 1989-10-13 | 1989-10-13 | Method for producing the Hpa I restriction endonuclease and methylase |
| US421272 | 1995-04-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03224488A JPH03224488A (ja) | 1991-10-03 |
| JP3003117B2 true JP3003117B2 (ja) | 2000-01-24 |
Family
ID=23669879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2275156A Expired - Lifetime JP3003117B2 (ja) | 1989-10-13 | 1990-10-12 | ＨｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼの製法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5298404A (ja) |
| EP (1) | EP0422951B1 (ja) |
| JP (1) | JP3003117B2 (ja) |
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| US5731185A (en) * | 1995-07-21 | 1998-03-24 | New England Biolabs, Inc. | Isolated DNA encoding the hphi restriction endonuclease and related methods for producing the same |
| EP2548953A1 (en) | 2005-08-04 | 2013-01-23 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, DNA encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN166864B (ja) * | 1985-03-01 | 1990-07-28 | New England Biolabs Inc | |
| ATE113653T1 (de) * | 1986-06-06 | 1994-11-15 | New England Biolabs Inc | Verfahren zur klonierung eines restriktionsmodifizierungssystems. |
| US5030569A (en) * | 1987-10-15 | 1991-07-09 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the AFL II restriction endonuclease and methylase |
| US4983522A (en) * | 1987-12-17 | 1991-01-08 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HinPI restriction endonuclease and methylase |
| US4987074A (en) * | 1987-12-17 | 1991-01-22 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HgiAI restriction endonuclease and methylase |
| US4999294A (en) * | 1987-12-17 | 1991-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the FokI restriction endonuclease and methylase |
| US4999293A (en) * | 1987-12-17 | 1991-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the HhaI restriction endonuclease and methylase |
| US4988620A (en) * | 1987-12-17 | 1991-01-29 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the FnuDI restriction endonuclease and methylase |
| US4983542A (en) * | 1987-12-21 | 1991-01-08 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the XbaI restriction endonuclease and methylase |
| JPH02216708A (ja) * | 1988-04-11 | 1990-08-29 | Fuji Photo Film Co Ltd | 導電性皮膜 |
| US4996151A (en) * | 1988-05-19 | 1991-02-26 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Eag I restriction endonuclease and methylase |
| US5015581A (en) * | 1989-03-15 | 1991-05-14 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the Hinc II restriction endonuclease and methylase |
| US5002882A (en) * | 1989-04-27 | 1991-03-26 | New England Biolabs, Inc. | Method for producing the XmaI restriction endonuclease and methylase |
-
1989
- 1989-10-13 US US07/421,272 patent/US5298404A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-12 DE DE69018189T patent/DE69018189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 JP JP2275156A patent/JP3003117B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 EP EP90311190A patent/EP0422951B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-12 DE DE90311190T patent/DE422951T1/de active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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| JPH03224488A (ja) | 1991-10-03 |
| EP0422951B1 (en) | 1995-03-29 |
| DE422951T1 (de) | 1994-02-03 |
| US5298404A (en) | 1994-03-29 |
| EP0422951A1 (en) | 1991-04-17 |
| DE69018189T2 (de) | 1995-11-09 |
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| ENDONUCLEASE | Van Cott et al.[45] Date of Patent: Jan. 29, 1991 |
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