JP3217409B2

JP3217409B2 - ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼ及びメチラーゼのクローニング法及び製造法

Info

Publication number: JP3217409B2
Application number: JP31355591A
Authority: JP
Inventors: エリザベス・メリル・バンコツト
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド
Priority date: 1990-11-02
Filing date: 1991-11-01
Publication date: 2001-10-09
Anticipated expiration: 2016-10-09
Also published as: EP0483797A1; US5202248A; DE483797T1; EP0483797B1; JPH05192166A; DE69113390D1; DE69113390T2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮcoＩ制限エンドヌク
レアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ
に関し、また、これらの酵素を、その組換えＤＮＡから
製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】多くの
細菌は、外来のＤＮＡの侵入にたいして身を守る系を含
んでいる。細菌細胞は、侵入するＤＮＡにたいして、も
しもそのＤＮＡがあらかじめ修飾されていないならば、
その二重鎖を切断する特定のエンドヌクレアーゼを含ん
でいる。この修飾は、通常、対応するＤＮＡメチラーゼ
によって行なわれる。そのようなメチラーゼを伴うエン
ドヌクレアーゼを、制限・修飾系（以後「Ｒ−Ｍ系」と
する）と呼ぶ。したがって、Ｒ−Ｍ系の主な機能は、防
御的なものである。すなわち、この系は、細菌細胞に、
もし、この能力がなければ、細菌細胞に寄生するであろ
うバクテリオファージやプラスミドＤＮＡ分子による感
染にたいして抵抗する能力をあたえる。

【０００３】Ｒ−Ｍ系の三つの異なるタイプが、サブユ
ニット組成、補助因子要求性、ＤＮＡ開裂の型にもとづ
いて区分されている。タイプＩＲ−Ｍ系がその中でも
っとも複雑である。通常、エンドヌクレアーゼは、三つ
の異なるタイプのサブユニットを含んでおり、ＤＮＡ開
裂には、Ｍｇ⁺⁺、ＡＴＰ、Ｓ−アデノシル・メチオニン
を必要とする。その認識部位は複雑で、ＤＮＡ開裂は、
認識部位から４００ないし７０００塩基対までの間の、
任意の、非特異的部位に起こる。

【０００４】タイプIII Ｒ−Ｍ系は、それよりやや複雑
性が少ない。タイプIII Ｒ−Ｍ系のエンドヌクレアーゼ
は、たった２種類のサブユニットしか含んでおらず、ま
た、ＤＮＡ開裂にはＭｇ⁺⁺，ＡＴＰが必要であるけれど
も、Ｓ−アデノシル・メチオニンは、酵素活性を刺激は
するものの、不可欠要素ではない。ＤＮＡ開裂は、認識
部位より、約２５−２７塩基対ほど遠位で起こる。

【０００５】タイプ II Ｒ−Ｍ系は、タイプＩ、タイプ
III いずれよりもずっと単純である。エンドヌクレアー
ゼは、ただ１個のサブユニットを含むだけであり、ＤＮ
Ａ開裂には、Ｍｇ⁺⁺が必要とされるだけである。さら
に、ＤＮＡ開裂部位は、当該酵素の認識部位の内部、ま
たはその近傍で起こる。分子生物学者たちにとってもっ
とも有用なのは、この種類の制限エンドヌクレアーゼで
ある。

【０００６】通常、細菌は、種当り、ごく小数の制限エ
ンドヌクレアーゼを有しているにすぎない。エンドヌク
レアーゼは、得られた細菌にしたがって命名される。し
たがって、例えば、Haemophilus aegyptius 種は三つの
異なる制限エンドヌクレアーゼを合成するが、それら
は、ＨａｅＩ、ＨａｅII，ＨａｅIII と命名されてい
る。これらの酵素は、それぞれ、(AT)GGCC(AT), PuGCGC
Py, GGCCという配列を認識・分割する。一方、Escheri c
hia coli RY13 はただ１個の酵素しか合成しない。すな
わち、EcoR Iであって、これは、GAATTC配列を認識す
る。

【０００７】Ｒ−Ｍ系の第１構成要素である、制限エン
ドヌクレアーゼは、主に、その認識配列と開裂特異性に
よって特徴づけられる。これは、実用的にＤＮＡの分子
開裂に用いるためである。

【０００８】制限エンドヌクレアーゼの大部分は、４−
６ヌクレオチド長の配列を認識する。さらに近年、７−
８ヌクレオチド長の認識配列を持つ認識エンドクレアー
ゼが発見された。全部がというわけではないが、多くの
認識部位は、対称の２回軸を含んでおり、多くの場合、
部位内のすべての塩基は、一意的に特定される。制限エ
ンドヌクレアーゼの認識部位におけるこの対称関係は、
「パリンドローム」と名付けられている。ある種の制限
エンドヌクレアーゼは、同一位置で複数塩基を認識する
ことができるという点で、縮重または寛容特異性を有す
ることがある。配列 GAATTC を認識する EcoRIは、対称
関係を有する制限エンドヌクレアーゼの一例であるが、
一方、配列 PuGCGCPy を認識するHaeII は、縮重または
寛容特異性を持つ制限エンドヌクレアーゼを代表するも
のである。対称的な認識部位を有するエンドヌクレアー
ゼは、一般に、認識部位内、または、その近傍を対称的
に分割するが、非対称的部位を認識するものは、認識部
位から離れたところを切断する傾向があり、通常、認識
部位から１−１３塩基対離れた所がそれに当たる。

【０００９】細菌Ｒ−Ｍ系の第２構成要素は、修飾メチ
ラーゼである。この酵素は、制限エンドクレアーゼにた
いする相補的なものであり、これを用いて、細菌は、自
らのＤＮＡを保護し、そのＤＮＡを、外来の、感染性Ｄ
ＮＡから区別することができる。修飾メチラーゼは、対
応する制限エンドクヌクレアーゼが認識するのと同じヌ
クレオチド認識配列を認識し、それに結合するが、その
ＤＮＡを破断するのではなく、その配列内の１個以上の
ヌクレオチドにメチル基を加えることによって、これを
化学的に修飾する。メチル化後、この認識配列は、対応
する制限エンドヌクレアーゼによって、もはや結合され
ないし、開裂もされない。ある細菌細胞のＤＮＡは、常
に、その修飾メチラーゼの活性によって修飾されてお
り、したがって、内在性の制限エンドヌクレアーゼにた
いしては感受性でない。制限エンドヌクレアーゼの認識
・攻撃にたいして感受性なのは、ただ修飾されていな
い、したがって、外来であると特定され得るＤＮＡだけ
である。

【００１０】これまで、１０００個以上の異なる制限エ
ンドヌクレアーゼが、細菌株から単離されているが、多
くは、共通の特異性を有している。同一の配列を認識す
る制限エンドヌクレアーゼ同士を「アイソシゾマー」と
呼ぶ。アイソシゾマーの認識配列は同一であるけれど
も、開裂部位（例えば、Xma I 対Sma I, Endow et al.,
J. Mol. Biol., 112:521(1977); Waalwijk et al., Nuc
leic Acids Res., 5:3231(1978)）や、様々な部位にお
ける開裂率（例えば、Xho I 対Pae R7I, Gingeras et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 80:402(1983)）に
おいては異なることがある。

【００１１】遺伝子工学の到来によって、現在では、遺
伝子をクローンして、その遺伝子がコードする蛋白質や
酵素を、天然資源から従来の精製法を用いて得るより
も、もっと大量に生産することができる。

【００１２】タイプ II 制限・修飾系のクローン例も次
第にその数を増している。Ｒ−Ｍ系をE. coli でクロー
ンするのに、現在、四つの方法が用いられている。
（１）天然プラスミドのサブクローニング、（２）ファ
ージ制限による選択、（３）ベクター修飾による選択、
及び（４）多段階単離である。

【００１３】最初にクローンされた系は、制限エンドヌ
クレアーゼ・クローンを特定ないし選択する手段とし
て、バクテリオファージの感染を用いた（Hha II: Mann
et al., Gene 3:97-112(1978); EcoRII: Kosykh et a
l., Molec. Gen. Genet. 178:717-719 (1980); Pst I:
Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA,78: 1503-
1507(1981) ）。細菌の中にＲ−Ｍ系があると、それに
よって、細菌は、バクテリオファージの感染に抵抗する
ことができるわけであるから、クローンされたＲ−Ｍ遺
伝子を担持する細胞は、原則的には、ファージに暴露し
たライブラリーの内の生存個体として選択的に単離され
る。しかしながら、この方法の価値はごく限られたもの
であることが判明している。細かく言うと、クローンさ
れたＲ−Ｍ遺伝子は、選択的な生存を許すほど十分な、
ファージにたいする抵抗性を、必ずしも発揮しない。

【００１４】天然プラスミドのサブクローニングにおい
ては、最初プラスミド性のものと特定された系を、E. c
oli のクローニング・プラスミドに移さなければならな
い（EcoRV: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res.
12:3659-3676(1984); PaeR7:Gingeras and Brooks, Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 402-406 (1983); Theri
ault and Roy, Gene 19:355-359(1982); PvuII: Blumen
thal et al., J. Bacteriol. 164:501-509(1985)）。
この方法では、消化・結合前に、プラスミドを精製す
る。これによってＤＮＡ原体の複雑性を減らすためであ
る。目的の系を単離するには、サブクローンし、ライブ
ラリーの特性を定め、選択を実行しなければならない。
この方法にはさらにいくつかの限界がある。その中には
例えば、多くのＲ−Ｍ系は、プラスミドではなく、細菌
の染色体に存在するということがある。

【００１５】現在までのところもっとも成功した方法で
ある、ベクター修飾法は、ある特定のタイプ II 系の制
限・修飾遺伝子は、メチラーゼ、次にエンドヌクレアー
ゼという順番に結合し、発現されるという仮定にもとづ
く。したがって、あるメチラーゼ陽性クローンの集団の
中には、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子を担持する
クローンもある筈である。この方法は、メチラーゼ選択
法という名で知られているが、Wilson, EPO Publicatio
n No.0193413が、Hae II, Taq I, Ban I, HindIII, Hin
f I及びMsp I Ｒ−Ｍ系をクローンするのにこれを用い
て、初めて成功を収めた。

【００１６】しかしながら、いくつかのＲ−Ｍ系には、
多段階クローン法が必要であった。例えば、新しいＲ−
Ｍ系を得るさいに、いくつかの細胞においては確立問題
が起こることが分かった。もし、メチラーゼが、エンド
ヌクレアーゼに先んじてスタートを切らなければ、細胞
は、自らの細胞性ＤＮＡを開裂する危険に陥る。 E. co
liは、この問題にたいして、そのＤＮＡを修復すること
によって対処しているようで、外見上傷害もなく、クロ
ーンされたたくさんのＲ−Ｍ系を同化することができ
る。しかしながら、かならずしも全ての系が、簡単に同
化できるものではない。例えば、Dde I 及び BamH I の
Ｒ−Ｍ系は、１段階では、クローンすることができず、
３段階が必要である（Howard et al., Nucleic Acids R
es., 14:7939-7951 (1988)）。事実、メチラーゼ遺伝
子だけしかクローンされていない系はたくさんある。こ
の種の系は、BamH Iや Dde Iと同じかもしれず、同様の
方法が必要なのかもしれない。

【００１７】前述の方法を一つ以上用いて、いくつかの
クローンがこれまでに得られているが（Wilson, Gene
74: 281-289(1988) 参照）、タイプ II Ｒ−Ｍ系のクロ
ーニングに困難がないわけではない。特に、多くのＲ−
Ｍ系の遺伝形式は、より複雑であることが判明してお
り、例えば、ベクター修飾によって得られたメチラーゼ
陽性クローンは、対応するエンドヌクレアーゼ遺伝子を
生み出していない。Wilson, Trends in Genetics, 4:
314-318 (1988); Lunnen et al., Gene,74: 25-32(198
8) を参照のこと。事実、ベクター修飾を用いるＲ−Ｍ
クローンの過程では多くの障害がある。例えば、ある系
では、メチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子と
が結合していなかったり、細菌性ＤＮＡを断片化するの
に用いたエンドヌクレアーゼが、Ｒ−Ｍ遺伝子のどちら
か、または、両方を切断したりすることがある。別の
系、例えば、BamH I及び Dde Iでは、メチラーゼが、対
応するエンドヌクレアーゼによる消化にたいして、十分
な保護作用を持たないことがある。これは，形質転換宿
主における発現が不十分なためか、メチラーゼ遺伝子及
びエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現にたいする内部のコ
ントロール機構によるか、または未知の理由によって起
こる。修飾はまた、形質転換に選ばれた宿主細胞にとっ
て有害であることもある。クローンしようとするエンド
ヌクレアーゼが、メチラーゼ選択に用いることができる
ほど、十分な純度、または十分な量として調製されてい
ないこともある。多くの系において、異なる細菌種であ
る形質転換宿主細胞中で、エンドヌクレアーゼ遺伝子を
発現するさいにも、困難がある。

【００１８】比較的複雑な、タイプ II Ｒ−Ｍ系をクロ
ーンするには困難が伴うものであるが、それでも、ベク
ター修飾選択法（Lunnen et al.,前述）に修正を加える
ことによって、及び／または、多段階クローン法を用い
て、いくつかのエンドヌクレアーゼを得ることができ
た。例えば、多数ライブラリーの形成、新しいクローニ
ング・ベクターの構築、メチラーゼ選択段階でのアイソ
シゾマーの使用、ハイブリダイゼーション・プローブと
して使用できるよう、対応するＤＮＡ配列を決めるため
のメチラーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼ遺伝子の
マッピング、及び前述の方法にたいするその他の変法に
よって、いくつかの扱いにくい組換えＲ−Ｍ系が生成さ
れた。

【００１９】しかしながら、いずれのタイプ II Ｒ−Ｍ
クローニング計画においても、その開始に当たって、あ
る特定のＲ−Ｍ系をクローンするには、従来法にたいし
て、候補があればどちらの、または、どの変法ないし修
正法が必要なのかがまったく分からない。例えば、特定
の系の詳細な遺伝形式は、通常、不明である。タイプII
Ｒ及びＭ遺伝子は、ゲノムの、四つの可能な組合せの
いずれにもある可能性がある。Wilson, Trends in Gene
tics, 前述。酵素及び対応する遺伝子の大きさは、ＤＮ
Ａやアミノ酸配列と同様、Ｒ−Ｍ系によってまちまちで
ある。実際、アイソシゾマー制限エンドヌクレアーゼで
さえ、ほとんど類似性を示さないことが分かっている。
同上、３１８ページ。また、Chandrasegeran et al., S
tructureand Expression, Vol. I, pp 149-156, Adenin
e Press (1988) を参照。

【００２０】Ｒ及びＭ遺伝子発現のコントロール・メカ
ニズムも、タイプII系の中で大きく変動している。例え
ば、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は、修飾依存性で
あることがある。例えば、Ava II，Hae II, Hinf I, Ps
tI, Xba I 系の場合がそうである。あるいは、エンドヌ
クレアーゼ遺伝子が、対応するメチラーゼ遺伝子に比べ
て、たくさんの、独自の認識部位を含んでいることもあ
る。例えば、Taq I 系の場合がそうである。

【００２１】目的とするＲ−Ｍ系を担持するクローンを
得るために、細胞を形質転換するさい、細胞ＤＮＡは最
初は修飾されないので、目的とするエンドヌクレアーゼ
によって消化される危険性がある。形質転換宿主細胞
は、ＤＮＡ修復系を含んでいるか、または、修飾が完了
するまで、標的エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を遅ら
せることができなければならない。このメカニズムのど
ちらかを、形質転換宿主が利用できなければ、宿主中に
クローン遺伝子を確立するに当たって、問題が生ずる。
前述したように、Dde I 及び BamH I 系をクローンする
とき、確立問題が生じた場合、メチラーゼ遺伝子と、エ
ンドヌクレアーゼ遺伝子を、形質転換宿主細胞のＤＮＡ
を保護するために順番に導入しなければならなかった。
（Howard,K.A. et al.,前出、Brooks et al., Gene 74:
13 (1988)）。しかしながら、いくつかのＲ−Ｍ系で
は、クローンしようというすべての試みが失敗し、また
別のあるものでは、メチラーゼ遺伝子だけが得られた。
これは、恐らく、確立にともなう困難のせいであろう。
Wilson, Trends in Genetics, 4，317 。

【００２２】形質転換宿主細胞はさらに、外来性の修飾
を制限する系を含んでいることが判明した。例えば、E.
coli においては、修飾ＤＮＡを制限する二つの系が特
定されている。すなわち、mcr 系は、メチル・シトシン
を含むＤＮＡを制限し、mrr系は、メチルアデニンを含
むＤＮＡを制限する。したがって、通常は、これらの系
を欠くE. coli 株を用いることが必要になる。宿主細胞
に、これ以外の制限系のあることが、また、Ｒ−Ｍ系を
クローンするさいに経験される困難の原因となっている
のであろう。

【００２３】精製した制限エンドヌクレアーゼ、及び、
それより程度は落ちるが、修飾メチラーゼは、実験室
で、ＤＮＡの特性を明かにし、それを再編成するのに有
用な道具となるものであるから、組換えＤＮＡ技術によ
って、これらの酵素を多量に合成することのできる細菌
株を得ることについては、商業的見地からの積極的関心
がある。このような菌株が得られれば、それは、商業的
に有効な量を生産する手段を与えるという意味からも、
精製作業を単純化するという意味からも、有用なもので
あろう。

【００２４】

【課題を解決するための手段】本発明は、Nocardia co
rallina （ATCC 19070）から得られる、ＮcoＩ制限エン
ドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼの遺伝子をコードす
る組換えＤＮＡ、及び、それに関連して、これらの酵素
を、組換えＤＮＡから生産する方法に関わる。本発明は
また、制限エンドヌクレアーゼＮcoＩを発現する形質転
換宿主に関わる。この制限エンドヌクレアーゼは、 5′
-CCATGG-3 ′というＤＮＡ配列を認識し、二つのＣ残基
の間で開裂し、４個の塩基の５′突出端を後に残す酵素
である（Langdale,J.A., Myers,P.A., and Roberts，R.
J., 未発表所見）。

【００２５】本発明によって生産されたＮcoＩメチラー
ゼ、または、制限エンドヌクレアーゼは、実質的に純粋
であって、従来の方法、例えば、実施例１、手順１５に
記載されたような方法で生産された制限エンドヌクレア
ーゼ調製物に通常見られるような汚染物を含まない。

【００２６】本発明は、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ
及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、及び、
そのような組換えＤＮＡから生産される酵素に関わる。
本クローニング計画の開始時には、ＮcoＩ制限・修飾系
をクローンするには、どの条件が好結果を生むのか、ま
た、その制限遺伝子及び修飾遺伝子は、そのようなクロ
ーンのどこに位置するのか、不明であった。第１Ａ図及
び実施例１に記載したクローンのクローニング結果、そ
れに続くＤＮＡ配列決定、マッピング、クローンの特徴
決定によって、ＮcoＩ制限・修飾系をクローンし、発現
させるための、従来未知の直接経路が明らかになった。

【００２７】もっと細かく言うと、N. corallinaからの
ＮcoＩ制限・修飾遺伝子を、E.coli中にクローンするの
は、他の、多くの制限・修飾系と違って、ＮcoＩ遺伝子
は、E. coli 中では十分に発現しないという発見により
複雑であることが分かった。メチラーゼ選択（メチラー
ゼ・クローンを、ＮcoＩ消化にたいする抵抗能力・生存
能力によって特定する方法）は、メチラーゼ発現に依存
するものであるから、ＮcoＩメチラーゼにたいする選択
は必ずしもうまくいかない。本発明においては、調製し
た、いくつかのＤＮＡライブラリーの内、Bcl I と Sau
3Aライブラリーだけが成功をもたらした。さらに、Sau3
A ライブラリーでは、２度目の試行だけが成功を収め
た。

【００２８】ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子にと
っては、発現も問題であることが分かった。他の、多く
の制限・修飾系のメチラーゼ・クローンについては、制
限エンドヌクレアーゼの有無を、インビトロ試験法でス
クリーニングすることができる。ところが、ＮcoＩ制限
・修飾クローンのいずれも、インビトロ試験法、例え
ば、前述の EPO 0193413に記載してあるようなもので検
出されるようなエンドヌクレアーゼ活性を発現しなかっ
た。これは、細胞の粗抽出物を、ホスホセルロース・カ
ラムで濃縮した後でテストを行なってもそうであった。
Ｒ遺伝子が、Ｍクローン中にあるかどうかを決めるに
は、その他にたくさんの手順が必要である。その手順と
しては、ａ）Ｍ遺伝子両側の N. corallina 染色体ＤＮ
Ａのクローニング、ｂ） N. corallina から、ＮcoＩ
の、純度のきわめて高い試料を調製すること、ｃ）この
精製された制限エンドヌクレアーゼ蛋白のアミノ末端の
配列を決定すること、ｄ）対応するＤＮＡオリゴマーを
設計すること、及びｅ）メチラーゼクローンのＤＮＡに
ついて、このオリゴマーとのハイブリダイゼーションが
あるかどうかをチェックすることがある。このようにし
て、Bcl I メチラーゼ・クローン及び、おそらく Pvu I
I または Claクローン（これらは、Ｍ遺伝子の下流にあ
って、Bcl I クローンのサブセットであるにすぎない）
がＲ遺伝子を担持することが判明した。一方、他のメチ
ラーゼ・クローンのいずれもＲ遺伝子を担持していなか
った。ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を得るため
に、Ｒ遺伝子の配列を決め、遺伝子の開始部分を再構築
した。

【００２９】ＮcoＩ制限遺伝子及びメチラーゼ遺伝子を
クローンし、発現させるのに好ましいここに記載する方
法は、第１Ａ図及び第１Ｂ図に示してあり、次の諸手順
を含む。

【００３０】１．N. corall inaのＤＮＡを精製する。

【００３１】２．そのＤＮＡを、 BclI のような制限エ
ンドヌクレアーゼによって完全に、また、部分的に消化
する。消化及び手順２−７には、BamHI, BglII, EcoRI,
PstI, Sau3A及び XhoIIも用いられたが、BclIライブラ
リーがＲＭクローンを生成する唯一のライブラリーであ
ったので、 BclI 作業の詳細のみを記載することにす
る。

【００３２】３．消化されたＤＮＡを、それぞれ、クロ
ラムフェニコール遺伝子内にＮcoＩ部位を含む、例え
ば、 pBR328 のようなクローン・ベクターに結合する。
それによって生じた混合物を、適当な宿主を形質転換す
るのに用いる。この宿主としては、E. coli RRI及びK8
02株の細胞がある（それぞれ、ATCC 31343, ATCC 3352
6）。RR1 は、宿主細胞として好ましい。

【００３３】４．ＤＮＡ・細胞混合物は、好ましくは、
形質転換細胞にたいして選択的であるような抗生物質性
培地にプレートする。抗生物質としては、例えば、アン
ピシリンまたはクロラムフェニコールがある。インキュ
ベーション後、形質転換細胞コロニーを収集し、第１次
細胞ライブラリーを形成する。

【００３４】５．組換えプラスミドを、第１次細胞ライ
ブラリー全体から精製し、第１次プラスミド・ライブラ
リーを形成する。

【００３５】６．次に、このプラスミド・ライブラリー
を、インビトロで、N. corallinaから調製したＮcoＩ制
限エンドヌクレアーゼによって完全に消化する。ＮcoＩ
制限エンドヌクレアーゼによる消化によって、非修飾、
すなわちメチラーゼ非含有クローンは選択的に破壊さ
れ、その結果、ＮcoＩメチラーゼ担持クローンの相対的
頻度が増す。非メチラーゼ・クローンの破壊を促進する
ために、消化物に、エキソヌクレアーゼ及び／またはホ
スファターゼを加えてもよい。

【００３６】７．ＮcoＩメチラーゼ・クローンの特定。
消化されたプラスミド・ライブラリーＤＮＡを、適当な
宿主にもどして形質転換させる。この宿主としては、例
えば、E. coli 株 RR1または K802 がある。形質転換さ
れたコロニーは、再び、抗生物質性プレートにプレート
することによって得る。個々のコロニーから得たＤＮＡ
を、次のようにして、ＮcoＩ修飾遺伝子の有無について
分析する。そのコロニーの担持するプラスミドＤＮＡを
精製し、インビトロで、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ
とインキュベートし、それが、ＮcoＩによる消化にたい
して抵抗性を持つかどうかを調べる。プラスミドＤＮＡ
は、完全に、または、実質上、消化にたいして耐性でな
ければならない。そのクローンの全細胞ＤＮＡ（染色体
性のものと、プラスミド性のもの）についても、精製
し、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼとともにインキュベ
ートする。メチラーゼ遺伝子がクローンされたことをさ
らに証拠立てるには、挿入体を除き、残余のベクターに
ついて、無傷のＮcoＩ部位が有るかどうかをチェックす
ればよい。

【００３７】８．一旦、メチラーゼ遺伝子がクローンさ
れていることが確定したら、そのクローンについて、Ｎ
coＩ制限エンドヌクレアーゼ活性を測定する。もし活性
が検出されたなら、そのＮcoＩ制限遺伝子は、メチラー
ゼ遺伝子に結合し、かつ、そのクローン中にあることに
なる。このような場合なら、次に、下記の手順１２に跳
ぶことができる。しかしながら、本発明によれば、存在
したとしても、下記に述べるように、さらに遺伝的操作
を加えなければ、その制限遺伝子は発現されないことが
分かった。制限活性の欠如は、その制限遺伝子がメチラ
ーゼ遺伝子に結合していないか、あるいは、結合しては
いるが、メチラーゼ遺伝子と無傷のままクローンされて
いないか、あるいは、無傷でクローンされてはいるが、
発現されないかのいずれかであることを示している。上
記三つの可能性の内のいずれが実態であるかを決めるた
めに、クローンされたフラグメントについて制限酵素に
よるマッピングを行い、そのクローンされたフラグメン
トの中のどこにメチラーゼ遺伝子が位置するかを決める
ために、欠失を作成する。つぎにこの情報を用いて、メ
チラーゼ遺伝子の両側に、もし制限遺伝子を結合してい
ると仮定した場合、その制限遺伝子をコードするのに十
分なＤＮＡがあるかどうかを調べる。もし十分な余地が
あるならば、その制限遺伝子は、結合していないか、ま
たは、クローン中にはあるが、発現されていないと考え
られる（かつ、手順１０に跳ぶことができる）。もし、
クローンされたＤＮＡ内のメチラーゼ遺伝子の両側に、
結合制限遺伝子をコードするのに十分な余地がなけれ
ば、例えば、本発明の BclI クローンがそうであるが、
その場合、メチラーゼ遺伝子の一部を用いて、ＮcoＩ染
色体の消化物のプローブとし、現存のクローンＤＮＡの
境界を越えた領域について、ゲノム・マップを作成する
ことができる。このデータは、制限・修飾領域を、メチ
ラーゼ遺伝子及びより大量の近傍ＤＮＡを含む個々のフ
ラグメントに開裂するある種のエンドヌクレアーゼを特
定するのに役立つ。このようなエンドヌクレアーゼによ
って生成されるフラグメントの正確な大きさも、このデ
ータから分かる。恐らく、制限遺伝子と修飾遺伝子が結
合していることが判明している場合、そのようなフラグ
メントはまた、制限遺伝子をもコードしていることが考
えられる。

【００３８】９．濃縮ライブラリーを、手順８に記載し
たフラグメントをゲル精製し、 pBR328 のような適当な
ベクターに結合させることによって構築する。小量（2k
b 以下）のＤＮＡを、メチラーゼ遺伝子の左に担持する
クローンは、メチラーゼ選択によって単離することがで
きる。また、左にもっと多量のＤＮＡを担持するクロー
ンは、メチラーゼ選択にたいしてあまり生存性が高いよ
うには見えない。

【００３９】１０．制限遺伝子クローンの特定。本発明
によれば、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を担持
するクローンは、通常の、細胞粗抽出物のアッセイによ
っては特定されないことが判明した。これは、E. coli
における当該遺伝子の発現が低レベルであるためであ
る。したがって、ＮcoＩエンドヌクレアーゼを、N. cor
allin aからできるだけ均質に精製し、最初の、２０−４
０アミノ酸配列を決定する。この配列情報に基づき、縮
重オリゴマーＤＮＡプローブを設計し放射性標識する。
同時に制限エンドヌクレアーゼのサイズは蛋白質ゲルに
よって約３２ｋｂと測定される。これは、このエンドヌ
クレアーゼ遺伝子をコードするのに必要なＤＮＡの量
は、ＮcoＩにたいしては、約 1 kb であることを示して
いる。ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼを担持するクロー
ンは、制限遺伝子ＤＮＡプローブにハイブリダイズし、
かつ、このハイブリダイゼーション位置の隣に少なくと
も 1kbのＤＮＡを担持するものと特定された。

【００４０】１１．この領域のＤＮＡ配列を決定するこ
とによって、制限遺伝子の存在が確認され、その方向性
が明らかにされ、その後、組換えプラスミドを、E. col
i 中でこのクローンされた制限遺伝子の発現が誘発され
るように操作するさいの基礎となるデータが得られた。

【００４１】１２．生産。ある好ましい態様として、Ｎ
coＩメチラーゼまたはエンドヌクレアーゼを、次のよう
にして形質転換した、形質転換宿主細胞から生産しても
よい。すなわち、ＮcoＩ修飾遺伝子及び過度に発現させ
た制限遺伝子を担持する１個以上のプラスミド・クロー
ンにより、アンピシリンとクロラムフェニコールを含む
富裕培養液中で、培養器により増殖させて形質転換す
る。その後、細胞を、遠心分離によって収集し、超音波
によって破壊し、ＮcoＩメチラーゼ、制限エンドヌクレ
アーゼ活性を含む細胞粗抽出物を生産する。もう一つの
好ましい態様としては、宿主細胞を、メチラーゼ遺伝子
を持つプラスミドによる形質転換であらかじめ保護して
おき、次に、そのエンドヌクレアーゼ遺伝子を持つ１個
以上のプラスミドを導入してもよい。

【００４２】１３．精製。ＮcoＩメチラーゼ及びエンド
ヌクレアーゼを含む細胞粗抽出物を、標準生産物精製
法、例えば、アフィニティー・クロマトグラフィー、ま
たは、イオン交換クロマトグラフィーによって精製す
る。

【００４３】上に概略を示した諸手順は、本発明を実行
するにあたっての好ましい様式を表わしたものではある
けれども、当業者にとって、前述の方法は、本技術分野
に既知の技術にしたがって変化させ得ることは明かであ
ろう。

【００４４】下記の例は、現在実施するのが好ましいも
のとしての、本発明の具体例を示すものである。この例
は、例示であり、本発明が、付属の請求項に示されたも
のを除いて、これのみに限定されるべきものでないこと
は、了解されるであろう。

【００４５】

【実施例】実施例１ＮcoＩ修飾メチラーゼと制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローニング１．ＤＮＡ精製N. corallina のＤＮＡを調製するために、2gの細胞ペー
ストを、5ml の 0.1MTris-HCl, 0.1M EDTA pH 8に再懸
濁した。この懸濁液を、二つの、2.5ml 部分に分割し
た。0.1M Tris-HCl, 0.1M EDTA pH 7.6 に溶解した、1.
7mg/mlリゾチーム3.5mlを、各部分に加え、その各々
を、３７℃で１５分間インキュベートした。ＳＤＳを１
％に加え、プロテナーゼＫを 0.13mg/mlに加えた。次
に、両部分を、３７℃で１時間インキュベートした。１
０％ＳＤＳ及び８％サルコシルからなる溶液 0.4mlを各
部分に加え、インキュベーションを５５℃で２時間続け
た。溶解性混合物 6mlを加え（50mM Tris, 62.5mM EDT
A, 1% Triton-X-100, pH 8 ）、その混合物を、３７℃
で１時間インキュベートした。次に、混合物を、フェノ
ール抽出し、次いで、フェノール・クロロホルム抽出
し、その後に、ＤＮＡバッファー（10mM Tris-HCl, 1mM
EDTA pH8 ）を４回交換して、２４時間透析した。リボ
ヌクレアーゼを、200 μg/mlに加え、３７℃で１時間イ
ンキュベートした。次に、NaClを 0.5M に加え、0.55容
量のイソプロピル・アルコールを表面に重層して、ＤＮ
Ａを沈澱させた。沈澱したＤＮＡを、ガラス棒に巻取っ
た。このＤＮＡを、 1ml 10mM Tris, 1mM EDTA (pH 8)
に、最終濃度が約400 μg/mlになるように溶解した。

【００４６】手順２−１０に関する注釈前述したように、７個の異なるエンドヌクレアーゼそれ
ぞれを用いて、Nco 染色体を消化し、ライブラリーを構
築し、スクリーニングする。メチラーゼ遺伝子は、BclI
（と Sau3Aであるが、このクローンは、BclIクローンの
サブセットであった）を除いては、いずれの場合でも、
選択に生き残れるほど十分に発現しなかったので、BclI
ライブラリーの詳細のみを呈示することにする。他のラ
イブラリーは、下記に略述するものと同様の方法によっ
て調製した。

【００４７】２．完全及び部分消化精製ＤＮＡを BclI によって開裂し、下記のように部分
消化を実施する。10mMTris pH7.5, 10mM MgCl₂, 50mM
NaCl, 10mM メルカプトエタノール・バッファーに、400
μg/ml濃度に溶解したＤＮＡ46.5μl を含む 375μl
を、一つの150μl 分液及び三つの75μl 分液に分割し
た。150 μl の入った試験管に、BclIの１０ユニットを
加え、ＤＮＡ1 μg あたり酵素１．３ユニットとなるよ
うにした。第１の試験管から75μl を取り、第２の試験
管に移し、 1μg あたり０．６５ユニットの BclI にな
るようにした。以下、後続の試験管が、先行の BclI の
半量を受け取るように続けた。この試験管群を３７℃で
１時間インキュベートし、次に、７２℃で１５分熱処理
し、各々から15μl を取り出し、アガロース・ゲル電気
泳動によって分析した。試験管３、４は、完全消化ＤＮ
Ａも、やや不完全消化ＤＮＡも示した。この二つの試験
管を混ぜ、下記の手順３に記載するように用いた。

【００４８】３．結合断片化したＤＮＡを、下記のようにして、pBR328に結合
させた。 BclI 完全・部分消化N. corallina ＤＮＡ 2
μg (40 μl)を、 BamHI開裂及び脱リン酸された pBR32
8 (2.5μl)と混合した。１０Ｘ結合用混合物（500mM Tr
is, pH7.5, 100mM MgCl ₂, 100mM DTT, 5mM ATP）20μ
l を加え、さらに、滅菌蒸留水 137.5μl を加え、最終
容量を 200μl とした。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（400 ｕ
／μl ）7.5μl を加え、混合液を１６℃で４時間イン
キュベートした。結合ＤＮＡの約125μl を用いて、下
記のようにしてE. coli RR1株を形質転換した。ＤＮＡ
を、1.0ml の SSC／CaCl₂（50mM NaCl, 5mM Na₃クエ
ン酸、 67 mM CaCl₂）と、氷上で混合し、氷冷下受容
能力を持つE. coli RRI(hsd R^- M^-, ATCC No. 3134
3) 2.0ml に加えた。４２℃で５分間インキュベーショ
ン後、細胞を、Luria-ブロス（Ｌ−ブロス） 8mlを加え
て希釈し、次に、３７℃で１時間インキュベートした。

【００４９】４．第１次細胞ライブラリー形質転換された培養細胞を短時間遠心分離し、上清を捨
て、細胞を、0.6ml のＬ−ブロスで再懸濁した。 200μ
l 分液を 100μg/mlのアンピシリンを含むLuria-寒天
（Ｌ−寒天）プレートにプレートした。３７℃で一晩イ
ンキュベートした後、プレートをそれぞれ 10mM Tris,
pH 7.5, 10mM MgCl₂で噴流 (flood)し、形質転換コロ
ニーを一緒に掻き取って、プールし、第１次細胞ライブ
ラリーを形成した。

【００５０】５．第１次プラスミド・ライブラリー第１次プラスミド・ライブラリーを下記のように調製し
た。第１次細胞ライブラリー 2.5mlを、 100μg/mlのア
ンピシリンを含むＬ−ブロス 500mlに接種した。培養物
を３７℃で一晩振とうし、次に、 4000 rpm で５分間遠
心した。上清を捨て、細胞ペレットを、２５％蔗糖、50
mM Tris, pH 8.0 10ml中に、室温で再懸濁した。0.25M
EDTA, pH 8.0, 5ml を加え、その後、0.25M Tris, pH8.
0 に溶解した 10 mg/ml リゾチーム 3mlを加えた。溶液
を氷上に３時間放置し、次に、溶解性混合物（1% Trito
n X-100, 50mM Tris, pH 8.0, 67mM EDTA ）12mlを激し
くピペットで注入し、この細胞懸濁液をゆるやかに撹拌
して、溶解させる。溶解後、混合液を、50 ml のプラス
チック遠心管に移し、 17000 rpm、４℃で、４５分間遠
心した。上清を、ピペットで除いた。固体状の CsCl 2
0.0g を秤量し、50mlの、プラスチックの、ねじ蓋付き
管に入れ、上清 22.0gをその管にピペットで注入し、混
ぜ合わせた。臭化エチジウム溶液（10mM Tris, pH 8.0,
1mM EDTA, 100mM NaCl に臭化エチジウムが 5 mg/ml）
1.0ml をこの混合液に加えた。この溶液を、２個の、５
／８インチ×３インチの、ポリアロマー遠心管に移し、
密封した。次に、この管を、Beckman Ti70ローターで、
44000 rpm, １７℃で、４２時間回転させた。プラスミ
ドを収集するため、管の頂上を、メスで貫き、二つの蛍
光性ＤＮＡバンドの内、下の方を、紫外線の下で、注射
器を用いて収集した。二つの管の下方バンドを混ぜ合わ
せ、ねじ蓋付きガラス管に入れ、等量の、水で飽和させ
た氷冷Ｎ−ブタノールで４回抽出して臭化エチジウムを
除去した。

【００５１】抽出溶液は、透析用チューブに移し、ＤＮ
Ａバッファーを４回換えて、２４時間、透析した。次
に、透析されたＤＮＡ溶液は、あらかじめ重量を測定し
ておいた50mlの滅菌遠心管に移し、その容量を測定し
た。5M NaCl を、最終濃度が0.4Mになるように加え、次
に、２倍容量のイソプロパノールを加え、混合した。こ
の溶液を、−２０℃で一晩保存し、ＤＮＡを沈澱させ
た。沈澱後、溶液を、15000rpm 、０℃で、１５分間回
転させ、上清を捨てた。この管を実験台に放置して、１
５分間空気乾燥し、次に、このＤＮＡペレットを、 500
μl のＤＮＡバッファーに溶解し、−２０℃に保存し
た。このようにして調製されたプラスミドのＤＮＡ濃度
は、200 から 300μg/mlであった。

【００５２】６．プラスミド・プールの消化第１次プラスミド・プールは、下記のように消化して、
非ＮcoＩメチラーゼ・クローンを破壊した。すなわち、
このプラスミドＤＮＡを、10mM Tris pH 8.0,10mM MgC
l₂, 150mM NaCl中で、33μg/mlに希釈した。全容量で
900μl を調製した。 450μl を、管１に、 225μl
を、管２と３の各々に入れた。8 ｕ／μgのＮcoＩ（120
ユニット）を、管１に加え、混合した。 225μl を、
管２に移し、4 ｕ／μg となるようにした。管３にはＮ
coＩを加えなかった。管１は、３７℃で、３．５時間イ
ンキュベートし、次に、ラムダ・エキソヌクレアーゼに
よって処理した。管２と３は、１時間インキュベートし
た。

【００５３】７．形質転換各管から12.5μl のサンプルを取り、これを用いて、E.
coli RR1を形質転換した。３分間の加熱工程、３７℃
で、１時間の luria−ブロス培養の後、細胞・ＤＮＡ混
合体を、200 μg/mlクロラムフェニコールを含むＬ−寒
天プレートにプレートした。３７℃で一晩保温し、プレ
ートを調べた。各コロニーを、クロラムフェニコールを
含むＬ−ブロス10 ml に接種し、微小培養を調製した。
また、クロラムフェニコールを含むＬ−寒天プレート上
に画線し、マスター保存株を調製した。

【００５４】８．生き残り個体の分析手順７で得た生き残りコロニーの２０個を 10ml 培養液
（手順７）で増殖させ、その担持するプラスミドを、下
記の微小調製（miniprep）精製法を用いて調製した。こ
れは、Birnboimと Doly(Nucleic Acids Res. 7:1513(19
79))の方法に倣ったものである。

【００５５】微小調製（miniprep）法各培養物を、8000 rpmで、５分間遠心した。上清を捨
て、細胞ペレットを、 1mg/mlリゾチームを含む25mM Tr
is, 10mM EDTA, 50mMグルコース、pH 8.0の 1.0ml中に
再懸濁した。室温で１０分間放置後、0.2M NaOH, 1% SD
S の 2.0 ml を各管に加え、管を振とうし、細胞を溶解
し、次に氷上に置いた。溶液が透明になったら、 3M 酢
酸ナトリウム、pH 4.8の 1.5mlを各々に加え、振とうし
た。かくして形成された沈澱を、15000 rpm,４℃で、１
０分間回転して落下させた。各上清を、3ml のイソプロ
パノールを含む遠心管に注ぎ、混合した。室温で１０分
間放置した後、管を、15000 rpm で、１０分間回転さ
せ、沈澱した核酸をペレット状にした。上清を捨て、ペ
レットを、室温で、３０分間空気乾燥した。乾いたら、
ペレットを、10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0 の 850μl
に再懸濁した。5M NaClの75μl を各々に加え、この溶
液を、 575μl のイソプロパノールを含むEppendorf 管
に移し、再び、室温で１０分間沈澱させた。次に、この
管を、微細遠心器（microfuge ）にて４５分間回転し、
上清を捨て、ペレットを空気乾燥した。次に、ペレット
を、100 μg/mlのＲＮＡ分解酵素を含む 10mM Tris, 1m
M EDTA, pH8.0の 500μl に溶かし、３７℃で１時間イ
ンキュベートし、ＲＮＡを消化した。5M NaCl の50μl
を加え、次に、 350μl のイソプロパノールを加えて、
もう一度ＤＮＡを沈澱させた。室温で１０分間放置後、
ＤＮＡを、４５秒間遠心して落下させ、上清をすて、ペ
レットを、10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8.0 の 150μlと
いう最終溶液に再び溶解した。次に、このプラスミドの
微小調製物を、ＮcoＩによる消化によって分析した。

【００５６】９．メチラーゼ遺伝子クローン（pEV190RM
612-22C ） 4 つのプラスミド（4 ｕ／μg プレート由来）が、Ｎco
Ｉにたいして耐性を持つこと、大きさ1.5kb, 5.1kbの２
個の BclI フラグメントから成る 6.6kbフラグメントを
担持すること（第２図参照）が明らかになった。いずれ
の場合においても、6.6kb フラグメントは、プラスミド
のテトラサイクリン耐性遺伝子プロモーターにたいし
て、同じ方向性を持っていた。次に、この４つのプラス
ミドは、ＮcoＩ修飾メチラーゼ遺伝子を担持することが
明らかになった。これは、 BclI 挿入体を削除し、残余
のベクターについて、無傷で、分断可能なＮcoＩ部位が
あるかどうかをチェックすることによって、また、クロ
ーンからの染色体ＤＮＡを精製し、それが、ＮcoＩによ
って修飾されること、すなわち、ＮcoＩ消化にたいして
耐性を持つことを証明することによって、確定されたも
のである。二つの BclI フラグメント（1.5, 5.1kb）
は、メチル化に必要なことが判明した。

【００５７】１０．この抽出物について、制限エンドヌ
クレアーゼ活性を測定した。何も検出されなかった。細
胞粗抽出物を、ホスホセルロース・カラムで濃縮した
が、やはり、活性は検出されなかった。

【００５８】１１．6.6kb BclI挿入体におけるメチラー
ゼ遺伝子の位置ＮcoＩメチラーゼクローンを、多数の制限エンドヌクレ
アーゼによって消化し、クローンされたＤＮＡの制限マ
ップを得た。このマップを用いて、挿入体内部の様々の
領域を欠失させ、それによって生じた、メチル化への影
響を調べた。そして、6.6kb 挿入体内の 1kbメチラーゼ
遺伝子の位置が正確に決定され、遺伝子の両側のクロー
ンされたＤＮＡの長さは約１及び4 kbであることが判明
した。このＭ遺伝子の右の 4kbは、結合した遺伝子をコ
ードするのに十分な余地であると考えられたが、左側の
1kbは、結合した制限エンドヌクレアーゼ遺伝子をコー
ドするのに十分な余地ではないと考えられた。この時点
では、両遺伝子間の距離、両遺伝子の正確な大きさ、両
遺伝子が結合しているか否かは不明であった。このクロ
ーンにＮcoＩエンドヌクレアーゼ活性が見られないとい
うことは、制限遺伝子が、クローン内にないか、また
は、あるが発現されないのかのどちらかであることが明
かである。制限遺伝子があるが、発現されない場合は、
メチラーゼ・クローンのＤＮＡ配列及び蛋白配列を決め
て、制限遺伝子の一部か、全部がクローン内に存在する
のか、それとも全然存在しないのかを調べた（手順１５
−１６）。制限遺伝子全体が存在しない場合には、メチ
ラーゼ遺伝子に近接するＤＮＡの大きい方の領域のクロ
ーニングを下記の要領で実施した（手順１２−１４）。

【００５９】１２．近接領域のゲノム・マップを、サザ
ン・ブロット法（Southern,E., J.Mol. Biol.,98: 503
(1975)）によって、メチラーゼ・クローンの一部、特
に、ゲル精製し、アルファ³⁵Ｓ−ＡＴＰで標識した約 1
kb BamHI-ScaI フラグメントをプローブとして用いて決
定した。ゲル精製は、下記の手順１３に述べられている
（ただし、二つの変更を加えた。すなわち、最終容量が
20μl であること及び滴下透析（drop-dialysis ）は行
なわなかったことである）。ゲル精製したプローブは、
Pharmacia のオリゴ標識キット（ロットQE106638）を用
いて標識した。30μl のdH₂0 に溶解した 2μl フラグ
メント（0.1 μg ）を１５分間９０℃に加熱し、次に、
３７℃に５分間置いた。試薬混合液10μl ，BSA 2μl
，³⁵Ｓ (50μCi) 4 μl 及びクレノウ 2μl を加え、
混合液を、室温で、一晩インキュベートした。20μl 停
止バッファー及びdH₂O 180μl を加えた。次に、混合
液を１０分間ボイルし、直ちに氷上に置いた。

【００６０】サザン・ブロットは次のようにして調製し
た。N. corallina ＤＮＡを、制限エンドヌクレアー
ゼ、 AccI, BamHI, BglII, ClaI, EcoRI, EcoRV, FspI,
HindIII, NruI, PstI, PvuII, SalI及び SspI によっ
て別々に消化した。消化物を、１．０％アガロース・ゲ
ルで電気泳動した。このゲルを、0.25M HCl に１０分
間、0.4M NaOH, 0.8M NaClに３０分間、次に、0.5M Tri
s. HCl pH 7.5, 1.5M NaClに３０分間浸した。ニトロセ
ルロース・シートを短時間水に浸し、次に、 5×SSC
(0.75M NaCl, 75mM クエン酸Na₃）に浸した。このゲル
を、3M NaCl, 0.3M クエン酸Na₃の 300mlに浸した、１
／２インチ積層したクロマトグラフィー・ペーパー（Wh
atman ）の上に置いた。この時、バッファーのレベル
は、積層ペーパーの高さの直下にあった。ニトロセルロ
ース・シートをゲルの上に置き、クロマトグラフィー・
ペーパー（Whatman ）を重ねて、ウィック（wick）とし
た。このサンドイッチに、重しをかけ、ゲル内容のニト
ロセルロース・シートへの移動を、室温で一晩行なっ
た。次に、このシートを、 0.15M NaCl, 15mM クエン酸
Na₃で１０分間すすぎ、真空オーブン中で、８０℃で
２．５時間ベークし、移動したＤＮＡをニトロセルロー
ス上に固着させた。このシートを、5ml のバッファー
（0.03M Tris, 0.001M EDTA, pH 7.5,滅菌），25mlの20
×SSC (3M NaCl, 0.3Mクエン酸Na₃) ，50mlのホルムア
ミド、10mlの 10% SDS, 10mlの 100×Denhardt′s （20
g/L Ficoll，20g/L ポリビニルピロリドン、20g/L 牛血
清アルブミン）から成る溶液 100mlを含むトレーに移し
た。牛胸腺ＤＮＡを１０分間ボイルし、次に氷冷し、そ
れを、先の混合液に、 0.05mg/mlに加えた。振とうしな
がら３７℃で５時間インキュベートして、ブロットをプ
レハイブリダイズした。放射性プローブ240μl をトレ
ーに加え、振とうしながら、３７℃で一晩インキュベー
ションを続けた。次に、ニトロセルロース・シートを、
0.015M NaCl, 1.5mMクエン酸Na₃, 0.1% SDSで、５分間
ずつ、室温で４回洗浄し、同バッファーで５５℃で２０
分間、１回洗浄した。さらに、0.15M NaCl, 15mMクエン
酸Na₃で、２０分間、室温で、１回洗浄した。シート
は、空気乾燥し、真空オーブンで、８０℃で、１時間乾
燥し、５日間、オートラジオグラフィーを行なった。

【００６１】サザン・ブロット・データから、８個のメ
チラーゼ・コード・フラグメントの大きさが分かった。
5.5kb ClaI, 3.8kb FspI, 6kb PvuII, 8kb PstI 及び 3
kb SalI フラグメントをクローンする試みを行なった。
他の、三つの、既知のフラグメント（BamHI, NruI, Acc
I ）については行なわなかった。また、残余のバンド
は、クローンするには長すぎると判断した。

【００６２】１３．最初に、３種のライブラリー（Cla
I, FspI及びPvuII ）を、手順１−８と同じ操作によっ
て、構築・選択した。ただし、手順２と３については次
のような変更を加えた。ＮcoＩ染色体ＤＮＡ 60 μl
（30μg ）を、 ClaI ７５ユニット、 FspI ３８ユニッ
ト、またはPvuII １５０ユニットを含む、10mM Tris pH
7.5, 10mM MgCl₂, 50mM NaCl, 10mM メルカプトエタ
ノールの 300μl 中で、３７℃で２時間完全に消化し
た。全容量を、0.01% SDS を含む１％アガロース・ゲル
で、５時間電気泳動した。ゲルを視像化するために、長
波長のＵＶを用いて、メチラーゼ遺伝子担持フラグメン
トの既知の大きさの大きさ範囲にあるフラグメントを、
そのゲルから切り出し、クリーンな剃刀の刃で細切し
た。この混合物を、２２ゲージ注射針から、0.01% SDS
含有の、１×アガロースゲルバッファー（５ml）中に押
しだし、17 krpm で、４５分間遠心分離した。上清に 5
M NaCl 0.5mlと、イソプロパノール 1.1mlを加えて、−
２０℃で一晩沈澱させた。このＤＮＡを、15 krpm 、１
５分でペレットとした。このペレットを、10mM Tris pH
8, 1mMEDTA, 500μl に再懸濁し、フェノール／クロロ
ホルム抽出し、クロロホルム抽出を３度行い、再び、5M
NaCl 48μl とイソプロパノール1100μl を加えて、−
２０℃で３時間置いて沈澱させた。このペレットを、７
０％イソプロパノールですすぎ、空気乾燥し、10mM Tri
s pH 8, 1mM EDTA中に、最終容量が 100μl となるよう
に再懸濁した。フラグメントをさらに精製するために、
この 100μl を、10mM Tris, 1mM EDTA, pH 8 の表面に
浮かばせたミリポア VS 0.025 μM フィルター上で、３
０分間、滴下透析（drop-dialysis ）した。

【００６３】FspIまたはPvuII ＤＮＡフラグメントの15
μl (0.5μg)を、EcoRV で開裂し脱リン酸化した pBR32
8 の 1.2μl(0.25μg)に、濃縮 T4 DNA リガーゼ（６０
００ユニット）を含む、１×ライゲーションバッファー
70μl 中、１６℃で４時間結合した。 ClaI DNA の40μ
l(1 μg)を、ClaIで開裂した pBR328 の1.8 μl(0.5μ
g)に、濃縮リガーゼ1.8 μl(0.5 μg)を含む１×ライゲ
ーションバッファ70μl 中、１６℃で４時間、次に、室
温で一晩放置して結合した。70μl すべてでRR1 を形質
転換した。

【００６４】１４．メチラーゼ遺伝子より上流の、より
大きなＤＮＡ領域を担持する、新しいClaI, FspI, PvuI
Iメチラーゼ・クローンの特定手順１３における唯一の
ClaI 生き残り体は、5.5kb ClaIメチラーゼ・コード
（Ｍ⁺）フラグメントを担持することが判明した。８個
の FspI 生き残り体のうち７個が、3.8kb FspI M⁺フラ
グメントを担持することが判明し、１２個の PvuII生き
残り体のうち９個が、 6kb PvuII M⁺フラグメントを担
持することが判明した。これらのクローンは、第３図に
示すとおり、もとの BclI クローンと重複しており、プ
ラスミド・プロモーターに従うと、完全に修飾されるこ
とが判明した。制限エンドヌクレアーゼ活性は検出され
なかった。

【００６５】Ｍ遺伝子の上流の 1.3kbを越えるＤＮＡを
担持する新しいクローンは、恐らく、1kb の制限エンド
ヌクレアーゼ遺伝子をコードするのに十分なＤＮＡであ
ると、もしそれがメチラーゼ遺伝子の上流に結合してい
るならば、考えられるが、確実ではない。したがって、
SalI及びPstIクローンの方がもっと多量の上流ＤＮＡを
担持するであろうから3kb SalI及び8kb PstIフラグメン
トをクローンする試みを行った。これらのフラグメント
をクローンするために、これらフラグメントはＭ遺伝子
の半分しか担持していないので、特別なベクターを構築
しなければならなかった。ベクターは他の半分を担持
し、目的のフラグメントをクローニング・ベクターに結
合したとき、Ｍ遺伝子が再形成され、プラスミドが自体
を修飾することができ、メチラーゼ選択に生き残れるよ
うに設計した。

【００６６】Ｍ遺伝子の上流に 2kb以上のＤＮＡを担持
する SalI クローンは、ただ部分的にしか修飾されない
ことが分かった。これは、Ｍ遺伝子のプラスミド・プロ
モーターからの距離が増したためだと考えられる。この
仮定は、PstIフラグメントがクローンされなかったとい
う所見と一致する。これは、恐らく、PstIフラグメント
が約 7kbの上流ＤＮＡを担持しており、そのため、Ｍ遺
伝子を、プラスミド・プロモーターからさらに遠ざけた
ためである。このようなプラスミドは、恐らく、自体を
修飾することができるほど十分にＭ遺伝子を発現せず、
したがって、メチラーゼ選択にも簡単には生き残れない
のであろう。しかし、PstIフラグメントをクローンしよ
うという試みは実行しなかった。 SalI クローンが、も
しＭ遺伝子の上流で結合しているならば、Ｒ遺伝子をコ
ードするのに十分な余地（≧2kb）を担持すると考えら
れたからである。

【００６７】１５．新しいクローンを回収することによ
って、メチラーゼ遺伝子の両側には、制限遺伝子が結合
されていれば、その結合遺伝子がどちらの側にコードさ
れているかにはかかわらず、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子をコードするのに十分なＤＮＡがクローンされた。
しかしながら、いずれのクローンも制限エンドヌクレア
ーゼ活性を発現しなかった。２個のＮcoＩ制限・修飾遺
伝子が結合しているという証拠は依然としてなかったの
で、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼを、下記にしたがっ
て、できるだけ均質になるまで精製した。

【００６８】５６６ｇのN. coral linaをフレンチ・プレ
スで破壊した後、２．２ｌの上清を、次の順序でクロマ
トグラフィー・カラムにかけた。DEAE- セルロース、ヘ
パリン・セファロース、ホスホセルロース、DEAE- セル
ロース、ホスホセルロース、ポリCAT A EPLC，モノQ FP
LC及びモノS FPLCである。得られた調製物は、９５％を
越える純度の、ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼで、 SDS
-PAGE 電気泳動で調べたところ、約 32,000 ダルトンの
大きさであった。

【００６９】精製したＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼ約
33μl (1.5μg, 50pmol)を、ポリアクリルアミド１０−
２０％勾配ゲルの３レーンに与え、１００ボルトで、３
時間、電気泳動した。次に、このゲルを、 PVDF 膜（Im
mobilon, Millipore）にたいして、200mA で、１２時間
エレクトロブロットした（Matsudaira, 1987）。この膜
を、Coomassie Blue R-250で染め、ＮcoＩ制限エンドヌ
クレアーゼに相当する真ん中のバンドを、剃刀で切りと
った。このバンドを、０．５mm間隔で、櫛の歯のように
切り刻んだ。これは、配列決定装置の試薬の浸潤効率を
最大にするためである。このバンドを、ＰＴＨ検出に12
0AオンラインＨＰＬＣを用いたAppliedBiosystems Mode
l 470A 気相蛋白配列決定装置での配列決定に用いた。
３０個のアミノ酸残基の配列が下記のように決定され
た。

【００７０】アラニン−スレオニン−アラニン−プロリ
ン−グリシン−ヒスチジン−ロイシン−ロイシン−グリ
シン−グルタミン−イソロイシン−イソロイシン−グリ
シン−アスパラギン−バリン−メチオニン−グルタミン
酸−グルタミン酸−アラニン−ロイシン−リジン−プロ
リン−バリン−ロイシン−グルタミン−グルタミン酸−
メチオニン−アラニン−アスパラギン酸−アルギニン。

【００７１】１６．制限遺伝子クローンの特定前記配列に基づき、３２倍縮重を持つ、１７量体ＤＮＡ
オリゴ・プローブを、New England Biolabsの有機合成
部で構築した。すなわち、AA(C,T)GTNATGGA(G,A)GA(G,
A)GC であり、 N＝G,A,T または Cである。

【００７２】ＤＮＡ配列への翻訳には、数種のアミノ酸
残基だけを選んだ。そのＤＮＡ配列がもっとも縮重が少
なかったからである。

【００７３】Ｍ遺伝子下流に約 4kb DNAを担持する、も
との BclI クローン、及び、Ｍ遺伝子の上流に約 2kb D
NAを担持する、その後の SalI クローンを、様々の制限
エンドヌクレアーゼで消化し、前述の操作（手順１２）
のようにして、ニトロセルロースの上にブロットした。
ＤＮＡ１７量体は、 2.5μl 10×キナーゼ・バッファー
（700mM Tris-HCl, pH 7.6, 100mM MgCl₂, 50mM DDT,
2.6mM 5′- ヒドロキシル末端鮭精子ＤＮＡ），5 μl
１４量体(1 O.D./ml) 、12.5μl dH₂O, 5μl ガンマ P
32ATP(50uCi), 及び 1μl キナーゼ（１０ユニット）の
２６μl 中で、室温で、１．３時間キナーゼ処理した。
全容量を、プレハイブリダイズさせておいたブロットに
加え、室温で一晩振とうした。このブロットを洗浄し、
手順１２に記述した通りに暴露させた。その結果、この
オリゴマーは、BclI及びSalIクローンの特定位置にハイ
ブリダイズし、それによって、ＮcoＩ制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子の起始位置を、クローンされたＤＮＡの、
特定の３００塩基対領域内にまで特定することができる
ことが判明した（第２図参照−NruI及びMscI部位の間
にハイブリダイズしたオリゴマー）。これは、ＮcoＩ制
限・修飾遺伝子が結合しており、かつ、BclIクローンに
は共に完全に、SalIクローンには部分的にクローンされ
ていることを示す、間接的ではあるが、堅固な証拠であ
る。

【００７４】１７．ＤＮＡ配列決定によって、Ｒ遺伝子
の存在が確かめられ、それが、第２図及び第３図にしめ
したような方向性を持つことが明らかにされた。

【００７５】１８．過度の発現強力なプロモーター PL を、制限遺伝子の前 500bpに置
いても、発現に至らなかった。したがって、制限エンド
ヌクレアーゼの開始部のＤＮＡの配列は決定されたわけ
であり、この情報を用いて、Ｒ遺伝子の起始部を再構築
し、天然のＧＴＣ開始を、ＡＴＧ開始に変更した。これ
は、ＡＴＧの方が、E. coli によって利用されやすいか
らである。ＲＢＳとプロモーターも、E. c oli によって
認識されるものに置き代えた。再構築されたＲ遺伝子 p
EV190R 612-22C-29 は、AP1 200細胞（この細胞は、Ｒ
遺伝子が発現すると、X-gal の存在下で、青くなること
が判明した）の形質転換によって特定された。次に、こ
のプラスミドで、 pEV190M302, 325-1を含む ER1451 株
を形質転換した。pEV190M302,325-1プラスミドは、Ｎco
Ｉメチラーゼ遺伝子を含み、 ER1451 を前修飾する。両
プラスミドを含むER1451の試料は、 American Type Cul
ture Collection に、１９９０年１１月１日付けで寄託
した（ＡＴＣＣ受託番号６８４５７）。ER1451において
は、ＩＰＴＧを加えると、最大活性が（１ｇ当り 500,0
00ユニット）得られた。過度に発現したＲ遺伝子は、Ｒ
Ｒ１株を形質転換できないことが見いだされた。これ
は、たとえ、あらかじめ、ＮcoＩメチラーゼで修飾され
ていてもそうであった。なぜなら、ＲＲ１は、ＩＰＴＧ
で制御されておらず、その活性レベルは有毒だからであ
る。

【００７６】なお、再構築された制限遺伝子を含むクロ
ーン中のＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼの活性測定は以
下のように行った。

【００７７】１×ＮcoＩバッファー（10mM Tris, pH 8,
150mM NaCl, 10mM MgCl₂) 中50μg/mlの HindIII消化
ラムダＤＮＡを 650μl 調製した。150 μl を一本の管
に、50μl を６本の管のそれぞれに入れた。さらに、50
μl を４本の管の各々に入れ、コントロールとして用い
た。細胞粗抽出物の 7.5μl （クローンを含む細胞から
得たもの）を、 150μl を入れた管に加え、混合した。
16.6μl を、50μl を入れた管に移し、混合し、次にそ
の管から16.6μl をもう一つの管（50μl を含む）に移
し、混合した。この操作を次々に続け、最初の６本の管
を用いて、このような１：４希釈を５つ得た。６番目の
管から 8.3μl を７番目の管に移し、混合した。すなわ
ち、１：７希釈である。コントロールには、 1μl
（３．５ユニット）ＮcoＩエンドヌクレアーゼを、最初
のコントロールの管に加え、３つの１：３希釈（25μl
を移す）を、４本のコントロールの管を用いて実施し
た。管はすべて３７℃で１時間インキュベートした。各
管から 1.5μl 取り、これを、ゲル電気泳動によって分
析した（第４図）。

【００７８】コントロールとクローンの細胞粗抽出物と
を比較すると、クローン細胞１ｇ当り、推定、500,000
ユニットのＮcoＩ活性が見られた。

【００７９】１９．ＮcoＩ修飾メチラーゼまたはエンド
ヌクレアーゼは、ＮcoＩ修飾遺伝子と過度に発現した制
限遺伝子を担持するクローンから生産してもよい。この
場合、アンピシリンとクロラムフェニコールを含む富裕
培養液中で、培養器により増殖させる。その後、細胞
を、遠心分離によって収穫し、超音波によって破壊し、
ＮcoＩメチラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ活性を含む
細胞粗抽出物を生産する。

【００８０】２０．ＮcoＩメチラーゼとエンドヌクレア
ーゼを含む、この細胞粗抽出物を、アフィニティー・ク
ロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィー
のような、標準的生産物精製法を用いて精製する。

【図面の簡単な説明】

【図１】第１Ａ図−ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼの
クローン・生産法を示す模式図。第１Ａ図は、ＮcoＩ制
限エンドヌクレアーゼをクローン、生産するのに好まし
い方法を決めるのに用いられる操作を図解したものであ
る。

【図２】第１Ｂ図−ＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼの
クローン・生産法を示す模式図。第１Ｂ図は、第１Ａ図
に示した実際の成績に基づいて、ＮcoＩ制限エンドヌク
レアーゼをクローン、生産するのに好ましい方法を図解
したものである。

【図３】第２図−ｐＢＲ３２８にクローンされた、Ｎ
coＩ制限及び修飾遺伝子を担持する２つのＢｃｌＩフラ
グメント（１．５及び５．１ｋｂ）から成る６．６ｋｂ
フラグメント。第２図は、ＮcoＩメチラーゼ及びエンド
ヌクレアーゼをコードする、もとの1.5kb 及び 5.1kb B
cl I挿入体の制限マップである。

【図４】第３図−Nocardia corallinaのＮcoＩのＲ及
びＭ遺伝子領域の、クローンされた全フラグメントを示
すゲノムマップ。第３図は、クローンされたN. coralli
na ＤＮＡの、８ｋｂ全部の制限マップである。

【図５】第４図−再構築された制限遺伝子を含むクロ
ーン中のＮcoＩ制限エンドヌクレアーゼの活性測定。第
４図は、電気泳動したアガロース・ゲルの写真で、pEV1
90R612-22C-29 と、pEV190M302,325-1 を含むE. coli
ER1451 の細胞抽出物から得た、ＮcoＩ制限エンドヌク
レアーゼ活性を示すものである。pEV190R612-22C-29
は、クローンされ、再構築されたエンドヌクレアーゼ遺
伝子を担持するプラスミドであり、 pEV190M302,325-1
は、クローンされたメチラーゼ遺伝子を担持するプラス
ミドである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:365）Ｃ１２Ｒ 1:365） (56)参考文献欧州特許出願公開388212（ＥＰ，Ａ１) Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．74，Ｐ．55−59 （1988) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 C12N 1/21 C12N 9/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ＥＲ１４５１ＡＴＣＣＮｏ．６８４
５７から得られ得る分子量約３２，０００ダルトンのＮ
ｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡフラ
グメント。
【請求項２】プラスミドｐＥＶ１９０Ｒ６１２−２２
Ｃ−２９から得られ得る請求項１に記載のＤＮＡフラグ
メント。
【請求項３】ＥＲ１４５１ＡＴＣＣＮｏ．６８４
５７から得られ得る分子量約３２，０００ダルトンのＮ
ｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡフラ
グメントが挿入されたベクターからなる組換えベクタ
ー。
【請求項４】請求項１に記載のＤＮＡフラグメントを
挿入したベクターからなる組換えベクター。
【請求項５】請求項３または請求項４に記載の組換え
ベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項６】請求項３に記載のＤＮＡによって形質転
換されたＥＲ１４５１のようなＥ．ｃｏｌｉ宿主から得
られ、天然のＮｃｏＩ調製物に見られる汚染物を含まな
い、ＤＮＡ配列ＣＣＡＴＧＧを認識する組換えＮｃｏＩ
制限エンドヌクレアーゼの製造方法。
【請求項７】ＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
に適当な条件の下で、請求項３または請求項４に記載の
ベクターによって形質転換された宿主細胞を培養するこ
とからなるＮｃｏＩ制限エンドヌクレアーゼの製造法。