DE69113390T2

DE69113390T2 - Verfahren zur Klonierung und Herstellung von Restriktionsendonuklease Nco I.

Info

Publication number: DE69113390T2
Application number: DE69113390T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth Merrill Vancott
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1990-11-02
Filing date: 1991-10-30
Publication date: 1996-05-15
Anticipated expiration: 2011-10-31
Also published as: EP0483797A1; JP3217409B2; US5202248A; DE69113390D1; DE483797T1; JPH05192166A; EP0483797B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert.
Viele Bakterien enthalten Systeme, welche gegen ein Eindringen von fremder DNA schützen. Bakterienzellen enthalten spezifische Endonukleasen, welche doppelsträngige Einschnitte in eindringender DNA erzeugen, wenn nicht die DNA vorher, gewöhnlich durch die entsprechende DNA-Methylase, modifiziert wurde. Die Endonuklease mit ihrer begleitenden Methylase wird ein Restriktions-Modifikations-System (im folgenden "R-MM-System") genannt. Die Hauptfunktion von R-M- Systemen ist somit eine defensive: sie ermöglichen Bakterienzellen, Infektionen durch Bakteriophagen und Plasmid- DNA-Moleküle zu widerstehen, welche sie andernfalls parasitieren würden.
Drei verschiedene Typen von R-M-Systemen sind auf der Grundlage der Zusammensetzung der Untereinheiten, der Kofaktorbedürfnisse und des DNA-Spaltungstyps charakterisiert worden. R-M-Systeme vom Typ I sind die komplexesten. Die Endonuklease enthält typischerweise drei verschiedene Typen von Untereinheiten und benötigt Mg&spplus;&spplus;, ATP und S-Adenosylmethionin zur DNA-Spaltung. Ihre Erkennungsstellen sind komplex und die DNA-Spaltung tritt an nicht spezifischen Stellen, irgendwo 400 - 7000 Basenpaare von der Erkennungsstelle entfernt auf.
R-M-Systeme vom Typ III sind etwas weniger komplex. Die Endonuklease von R-M-Systemen vom Typ III enthält nur zwei Typen von Untereinheiten, und obwohl Mg&spplus;&spplus; und ATP zur DNA- Spaltung benötigt werden stimuliert S-Adenosylmethionin die enzymatische Aktivität ohne ein absolutes Erfordernisdarzustellen. Die DNA-Spaltung tritt ca. 25 - 27 Basenpaare distal von der Erkennungsstelle auf.
R-M-Systeme vom Typ II sind viel einfacher als die entweder vom Typ I oder III. Die Endonuklease enthält nur eine Untereinheit und nur Mg&spplus;&spplus; wird zur DNA-Spaltung benötigt. Darüber hinaus liegt die DNA-Spaltungsstelle innerhalb oder benachbart zu der Erkennungsstelle des Enzyms. Es ist diese Klasse von Restriktionsendonukleasen, welche sich für Molekularbiologen als am nützlichsten erwiesen hat.
Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen werden gemäß den Bakterien benannt, aus welchen sie stammen. Somit synthetisiert z.B. die Spezies Haemophilus aegyptius drei verschiedene Restriktionsendonukleasen, welche Hae I, Hae II und Hae III genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy bzw. GGCC. Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Restriktionsendonukleasen, der erste Bestandteil von R-M- Systemen, sind aufgrund ihrer praktischen Verwendung zur molekularen Zerlegung von DNA hauptsächlich bezüglich ihrer Erkennungssequenz und Spaltungsspezifität charakterisiert worden. Die Mehrheit der Restriktionsendonukleasen erkennt Sequenzen mit 4 - 6 Nukleotiden in der Länge. Vor kurzem sind Restriktionsendonukleasen gefunden worden, welche Erkennungssequenzen von 7 - 8 Nukleotiden in der Länge aufwiesen. Die meisten, aber nicht alle Erkennungsstellen enthalten eine zweifache Symmetrieachse und in den meisten Fällen sind alle Basen innerhalb der Stelle eindeutig spezifiziert. Diese symmetrische Beziehung in der Erkennungssequenz von Restriktionsendonukleasen wurde mit dem Begriff Palindrome bezeichnet. Manche Restriktionsendonukleasen haben degenerierte oder abgeschwächte Spezifitäten, indem sie mehrere Basen an denselben Positionen erkennen können.
EcoR I, welche die Sequenz GAATTC erkennt, ist ein Beispiel einer Restriktionsendonuklease mit einer symmetrischen Beziehung, während Hae II, welche die Sequenz PuGCGCPy erkennt, für Restriktionsendonukleasen mit einer degenerierten oder abgeschwächten Spezifität steht. Endonukleasen mit symmetrischen Erkennungsstellen spalten im allgemeinen symmetrisch innerhalb oder benachbart zu der Erkennungsstelle, während jene, die asymmetrische Stellen erkennen, dazu neigen in einem Abstand von der Erkennungsstelle, typischerweise ca. 1 - 13 Basenpaare entfernt von dieser Stelle, zu schneiden.
Der zweite Bestandteil von bakteriellen R-M-Systemen sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu den Restriktionsendonukleasen und stellen das Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotid-Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstelle die DNA zu zertrennen modifizieren sie chemisch eines oder mehrere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Zufügung einer Methylgruppe. Gefolgt auf die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die entsprechende Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist mittels der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase immer modifiziert und ist daher unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte, und daher identifizierbar fremde DNA, die empfindlich gegenüber einer Erkennung und einem Angriff einer Restriktionsendonuklease ist.
Mehr als 1000 verschiedene Restriktionsendonukleasen sind aus Bakterienstämmen isoliert worden und viele teilen sich gemeinsame Spezifitäten. Restriktionsendonukleasen, welche identische Sequenzen erkennen, werden "Isoschizomere" genannt. Obwohl die Erkennungssequenzen von Isoschizomeren dieselben sind, können sie bezüglich der Spaltungsstelle (z.B. Xma I v. Sma I, Endow et al., J. Mol. Biol. 112: 521 (1977), Waalwijk et al., Nucleic Acids Res. 5: 3231 (1978)) und der Spaltungsgeschwindigkeit an verschiedenen Stellen (Xho I v. Pae R7I, Gingeras et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 402 (1983)) variieren.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche sie codieren, in größeren Mengen zu produzieren, als aus ihren natürlichen Quellen durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich sind.
Restriktions-Modifikations-Systeme vom Typ II werden mit wachsender Häufigkeit kloniert. Vier Verfahren werden verwendet, um R-M-Systeme in E. coli zu klonieren: (1) Subklonieren von natürlichen Plasmiden; (2) Selektion basierend auf Phagenrestriktion; (3) Selektion basierend auf Vektormodifikation; und (4) Mehrschritt-Isolierung.
Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine Bakteriophageninfektion als ein Mittel zum Identifizieren oder zur Selektion von Restriktionsendonukleaseklonen (Hha II: Mann et al., Gene 3: 97 - 112 (1978); EcoR II: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178: 717 - 719 (1980); Pst I: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 1503 - 1507 (1981)). Da die Gegenwart von R-M-Systemen in Bakterien diesen ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche klonierte R-M-Gene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, welche Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses Verfahren nur einen beschränkten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte R-M-Gene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz verleihen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen.
Ein Subklonieren von natürlichen Plasmiden umfaßt ein Übertragen von Systemen, welche anfangs als plasmidgetragen charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (Ecor V: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12: 3659 -53676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402 - 406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355 - 359 (1982); Pvu II: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501 - 509 (1985)). In diesem Ansatz werden die Plasmide vor Verdau und Ligation gereinigt, womit die Komplexität der Ursprungs-DNA vermindert wird. Ein Isolieren des Systems umfaßt dann ein Subklonieren und Charakterisieren von Bibliotheken und ein Durchführen von Selektionen. Dieser Ansatz hat ebenfalls eine Anzahl von Beschränkungen, einschließlich der, daß die meisten R-M-Systeme auf dem Bakterienchromosom und nicht auf den Plasmiden lokalisiert sind.
Die Vektormodifikation, bis heute der erfolgreichste Ansatz, beruht auf der Annahme, daß die Restriktions- und Modifikationsgene eines bestimmten Systems vom Typ II verbunden sind und aufeinanderfolgend exprimiert werden, Methylase und dann Endonuklease. Somit sollten in einer Population von methylasepositiven Klonen einige Klone ebenfalls das entsprechende Endonukleasegen tragen. Dieser Ansatz, welcher als Methylaseselektion bekannt ist, wurde erstmals erfolgreich von Wilson, EPA-Veröffentlichung Nr. 0193413, verwendet, um die Hae II, Taq I, Ban I, Hind III, Hinf I und Msp I R-M-Systeme zu klonieren.
Für eine Anzahl von R-M-Systemen war jedoch ein Mehrschritt-Klonierungsansatz nötig. Beispielsweise wurde während der Erfassung eines neuen R-M-Systems gefunden, daß eine Anzahl von Zellen einem Etablierungsproblem gegenübersteht. Wenn die Methylase gegenüber der Endonuklease keinen Vorsprung hat, ist die Zelle in Gefahr, ihre eigene zelluläre DNA zu spalten. E. coli scheint mit diesem Problem fertig zu werden, indem es seine DNA repariert, und es ist in der Lage, viele klonierte R-M-Systeme ohne sichtbare Schädigung aufzunehmen. Jedoch werden nicht alle Systeme leicht aufgenommen. Die Dde I und BamH I R-M-Systeme konnten beispielsweise nicht in einem einzigen Schritt kloniert werden; sondern es wurden drei Schritte benötigt (Howard et al., Nucleic Acids Res. 14: 7939 - 7951 (1988)). Es gibt tatsächlich viele Systeme, für welche nur das Methylasegen kloniert wurde. Diese Systeme könnten ähnlich zu BamH I und Dde I sein und können ähnliche Ansätze nötig machen.
Während eine Anzahl von Klonen durch eines oder mehrere der oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, siehe Wilson, Gene L4, 281 - 289 (1988), ist das Klonieren von R-M-Systemen vom Typ II nicht ohne Schwierigkeiten. Insbesondere wurde gefunden, daß die Genetik von vielen R-M-Systemen komplexer ist, und methylasepositive Klone, welche beispielsweise durch Vektormodifikation erhalten wurden, ergaben nicht das entsprechende Endonukleasegen. Siehe Wilson, Trends in Genetics 4, 314 - 318 (1988); Lunnen et al., Gene 74, 25 - 32 (1988). Tatsächlich werden bei dem Verfahren des Klonierens von R-M-Systemen unter Verwendung von Vektormodifikation zahlreiche Hindernisse angetroffen. Beispielsweise können in manchen Systemen die Methylase- und Endonukleasegene nicht verbunden sein, oder die Endonuklease, welche verwendet wurde, um die bakterielle DNA zu fragmentieren, kann entweder eines oder beide der R-M-Gene schneiden. In anderen Systemen, wie z.B. BamH I und Dde I, kann die Methylase nicht ausreichend gegen einen Verdau durch die entsprechende Endonuklease schützen, entweder aufgrund von ineffizienter Expression in dem Transformationswirt, oder aufgrund des inhärenten Kontrollmechanismus für die Expression der Methylase- und Endonukleasegene, oder aus unbekannten Gründen. Eine Modifikation kann ebenfalls schädlich für die Wirtszelle sein, welche für die Transformation ausgewählt wurde. Die Endonuklease, welche kloniert werden soll, kann für die Methylaseselektion nicht in ausreichender Reinheit oder Menge zur Verfügung stehen. Bei vielen Systemen werden ebenfalls Schwierigkeiten beim Exprimieren des Endonukleasegens in einer Transformationswirtszelle einer anderen Bakterienspezies angetroffen.
Trotz der Schwierigkeiten beim Klonieren der komplexeren R- M-Systeme vom Typ II war es möglich, einige Endonukleasegene durch Modifizieren des Vektormodifikations-Selektions- Verfahren (siehe Lunnen et al., op. cit.) und/oder durch Verwendung eines Mehrschritt-Klonierungsansatzes zu erhalten. Beispielsweise haben die Bildung von multiplen Bibliotheken, die Konstruktion von neuen Klonierungsvektoren, die Verwendung von Isoschizomeren für den Methylase-Selektionsschritt, das Kartieren von Methylase- und/oder Endonukleasegenen, um die entsprechenden DNA-Sequenzen für eine Verwendung als Hybridisierungssonden zu bestimmen, und andere Variationen der oben beschriebenen Ansätze eine Anzahl von schwer zugänglichen rekombinanten R-M-Systemen ergeben.
Jedoch weiß man am Anfang eines Typ II-R-M-Klonierungsprojektes einfach nicht, ob irgendwelche und welche Variationen oder Modifikationen zu vorhergehenden Ansätzen benötigt werden könnten, um irgendein bestimmtes R-M-System zu klonieren. Beispielsweise ist die genaue Genetik eines bestimmten Systems gewöhnlich unbekannt. Typ II-R-M-Gene können in einer von vier möglichen Anordnungen in dem Genom vorhanden sein. Wilson, Trends in Genetics, supra. Die Größen der Enzyme und der entsprechenden Gene variieren zwischen einem R-M-System und einem anderen in großem Maße, wie dieses ebenfalls die DNA- und Aminosäuresequenzen tun. Tatsächlich wurde selbst bei isoschizomeren Restriktionsendonukleasen gefunden, daß sie wenige Ähnlichkeiten zeigen. Id, auf 318, siehe ebenfalls Chandrasegeran et al., Structure and Expression, Bd. I, Seiten 149 - 156, Adenine Press (1988).
Die Kontrollmechanismen der R- und M-Genexpression variieren bei den Systemen vom Typ II ebenfalls stark. Beispielsweise kann die Expression des Endonukleasegens modifikationsabhängig sein, wie es bei den Ava II, Hae II, Hinf I, Pst I und Xba I Systemen gezeigt wird. Alternativ kann das Endonukleasegen, verglichen mit dem entsprechenden Methylasegen, eine große Anzahl seiner eigenen Erkennungsstellen enthalten, wie in dem Taq I-System.
Während der Transformation von Zellen, um Klone zu erhalten, welche das Ziel-R-M-System enthalten, ist die zelluläre DNA anfangs unmodifiziert und folglich in Gefahr, durch die Zielendonuklease verdaut zu werden. Die Transformationswirtszellen müssen entweder DNA-Reparatursysteme enthalten oder in der Lage sein, die Expression des Zielendonukleasegens zu verzögern, bis die Modifikation vollständig ist. Wenn keiner dieser Mechanismen dem Transformationswirt zur Verfügung steht, wird beim Etablieren der Klongene in dem Wirt ein Problem angetroffen. Wie oben angemerkt, war es, wenn beim Klonieren der Dde I und BamH I Systeme Etablierungsprobleme angetroffen wurden, nötig, die Methylase- und Endonukleasegene aufeinanderfolgend einzuführen, um die DNA der Transformationswirtszellen zu schützen (Howard, K.A. et al., supra, Brooks et al., Gene 74: 13 (1988)). Jedoch haben einige R-M-Systeme allen Versuchen, sie zu klonieren, widerstanden, und andere haben, möglicherweise aufgrund von Etablierungsschwierigkeiten, nur das Methylasegen ergeben. Wilson, Trends in Genetics 4, 317.
Es wurde gefunden, daß Transformationswirtszellen ebenfalls Systeme enthalten können, welche fremde Modifikationstypen spalten. Beispielsweise sind in E. coli zwei Systeme identifiziert worden, welche modifizierte DNAs spalten: das mcr-System spaltet DNA, welche Methylcytosin enthält, und das mrr-System spaltet DNA, welche Methyladenin enthält. Es ist daher gewöhnlich nötig, E. coli-Stämme zu verwenden, bei welchen diese Systeme defekt sind. Die Gegenwart von zusätzlichen Wirtszellen-Restriktionssystemen kann ebenfalls für die Schwierigkeiten verantwortlich sein, welche beim Klonieren von R-M-Systemen angetroffen werden.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem geringeren Ausmaß, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Ansporn, Stämme von Bakterien durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese Enzyme im Überfluß synthetisieren. Solche Stämme wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden und ebenfalls das Mittel zur Produktion in kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die für Nco I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA-Sequenz aus Nocardia corallina (ATCC 19070) erhältlich ist, sowie ein Verfahren für die Herstellung dieser Endonuklease. Diese Erfindung betrifft ebenfalls einen transformierten Wirt, welcher die Restriktionsendonuklease Nco I exprimiert, ein Enzym, welches die DNA-Sequenz 5'-CCATGG-3' erkennt und zwischen den zwei C-Resten spaltet, wobei ein 5'-Überhang von vier Basen zurückbleibt (Langdale, J.A., Myers, P.A. und Roberts, R.J., unveröffentlichte Beobachtungen).
Die Nco I-Methylase oder Restriktionsendonuklease, welche gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist im wesentlichen rein und frei von den Verunreinigungen, die normalerweise in Restriktionsendonuklease-Präparationen gefunden werden, welche durch herkömmliche Techniken erzeugt werden, wie z.B. in Schritt 15 von Beispiel 1 beschrieben ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Figuren 1A und 1B: Schema zum Klonieren und Produzieren der Nco I-Restriktionsendonuklease:
Figur 1A stellt die Verfahren zur Bestimmung des bevorzugten Verfahrens zum Klonieren und Produzieren der Nco I- Restriktionsendonuklease dar.
Figur 1B stellt das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und Produzieren der Nco I-Restriktionsendonuklease, basierend auf den tatsächlichen Ergebnissen, welche in Figur 1A gezeigt sind, dar.
Figur 2 ist eine Restriktionskarte der ursprünglichen 1,5 und 5,1 kb Bcl I-Inserts, welche die Nco I-Methylase und Endonuklease codieren.
Figur 3 ist eine Restriktionskarte der gesamten 8 kb der N. corallina-DNA, welche kloniert wurde.
Figur 4 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welches die Nco I-Restriktionsendonukleaseaktivität zeigt, die aus dem Zellextrakt von E. coli ER1451 erhalten wurde, das pEV190R612-22C-29, welches ein Plasmid ist, das das klonierte und rekonstruierte Endonukleasegen trägt, und pEV190M302,325-1, welches ein Plasmid ist, das das klonierte Methylasegen trägt, enthält.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor, welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert, der eine DNA-Sequenz umf aßt, welche für Nco I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA-Sequenz aus N. corallina ATCC Nr. 19070 erhältlich ist, und wobei der Expressionsvektor erhältlich ist, indem die endogenen regulatorischen Sequenzen des Endonukleasegens, welche direkt stromabwärts von der das Nco I-Modifikationsenzym codierenden DNA gefunden werden, durch einen exogenen Promotor und eine Ribosomenbindungsstelle ersetzt werden. Die Erfindung umfaßt ebenfalls eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert wurde, und ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Nco I-Restriktionsendonuklease durch Kultivieren der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen für eine Expression der Endonuklease. Am Anfang des Klonierungsprojektes war es nicht bekannt, welche Bedingungen beim Klonieren des Nco I- Restriktions-Modifikations-Systems erfolgreich sein würden, noch waren die Restriktions- und Modifikationsgene innerhalb solcher Klone lokalisiert. Die Klonierungsergebnisse und die nachfolgende DNA-Sequenzierung, Kartierung und Charakterisierung der Klone, welche in Figur 1A und Beispiel 1 beschrieben ist, zeigen den vorher unbekannten direkten Weg zum Klonieren und Exprimieren des Nco I-Restriktions-Modifikationssystems.
Insbesondere erwies sich das Klonieren der Nco 1-Restriktions-Modifikationsgene von N. corallina in E. coli durch die Entdeckung, daß im Unterschied zu vielen anderen Restriktions-Modifikations-Systemen, Nco I-Gene in E. coli nicht gut exprimieren, als kompliziert. Da die Methylase-Selektion (die Identifizierung von Methylaseklonen durch ihre Fähigkeit einem Nco I-Verdau zu widerstehen und diesen zu überleben) auf einer Methylase-Expression beruht, ist eine Selektion auf die Nco I-Methylase nicht immer erfolgreich. In der vorliegenden Erfindung waren aus einer Anzahl von hergestellten DNA-Bibliotheken nur die Bcl I- und die Sau3A-Bibliotheken erfolgreich. Darüber hinaus war die Sau3A-Bibliothek erst beim zweiten Versuch erfolgreich.
Es wurde ebenfalls gefunden, daß für das Nco I-Restriktionsendonukleasegen die Expression ein Problem war. Methylaseklone von vielen anderen Restriktions-Modifikations- Systemen können mit in vitro-Tests auf eine Restriktionsendonukleaseaktivität hin gescreent werden. Jedoch exprimierte keiner der Nco I-Restriktions-Modifikationsklone eine Endonukleaseaktivität, die durch in vitro-Tests wie jene, welche in der oben erwähnten EP 0193413 beschrieben sind, nachweisbar war, selbst nachdem die rohen Zellextrakte über Phosphocellulosesäulen konzentriert wurden. Um zu bestimmen, ob das R-Gen in den M-Klonen vorhanden war, wurden zahlreiche zusätzliche Schritte benötigt. Die Schritte umfaßten: a) Klonieren von chromosomaler N. corallina-DNA auf beiden Seiten des M-Gens (Pvu II, Cla I, Fsp I, Sal I-Klone), b) Herstellen einer extrem reinen Probe von Nco I aus N. corallina, c) Sequenzieren des Aminoterminus des gereinigten Restriktionsendonukleaseproteins, d) Entwerfen eines entsprechenden DNA-Oligomers, und e) Überprüfen der DNA der Methylaseklone auf eine Hybridisierung mit dem Oligomer. Auf diese Weise wurde gefunden, daß die Bcl I-Methylaseklone und möglicherweise die Pvu II oder Cla-Klone, die auf der stromabwärtigen Seite des M- Gens nur Untergruppen des Bcl I-Klons sind, das R-Gen trugen, wogegen bei keinem der anderen Methylaseklone gefunden wurde, daß er das R-Gen trug. Um Nco I-Restriktionsendonukleaseaktivität zu erhalten, wurde das R-Gen sequenziert und der Anfang des Gens wurde rekonstruiert.
Das hierin beschriebene Verfahren, durch welches das Nco I- Restriktionsgen und das Methylasegen vorzugsweise kloniert und exprimiert wurden, ist in den Figuren 1A und 1B dargestellt und umfaßt die folgenden Schritte:
1. Die DNA von N. corallina wird gereinigt.
2. Die DNA wird vollständig und teilweise mit einer Restriktionsendonuklease wie z.B. Bcl I verdaut. BamH I, Bgl II, EcoR I, Pst I, Sau3A und Xho II wurden ebenfalls für den Verdau und für die Schritte 2 - 7 verwendet, aber da die Bcl I-Bibliothek die einzige Bibliothek war, welche einen RM-Klon ergab, werden nur die Details für die Arbeit mit Bcl I beschrieben.
3. Die verdauten DNAs werden jeweils in einen Klonierungsvektor, wie z.B. pBR328, ligiert, welcher in seinem Chloramphenicolgen eine Nco I-Stelle enthält. Die resultierenden Mischungen werden verwendet, um einen geeigneten Wirt, wie z.B. Zellen der E. coli-Stämme RR1 oder K802 (ATCC 31343 bzw. ATCC 33526) zu transformieren. RR1 ist die bevorzugte Wirtszelle.
4. Die DNA/Zellmischungen werden vorzugsweise auf antibiotischen Medien plattiert, die selektiv für transformierte Zellen sind, wie z.B. Ampicillin oder Chloramphenicol. Nach der Inkubation werden die transformierten Zellkolonien zusammengesammelt, um die primären Zellbibliotheken zu bilden.
5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus den primären Zellbibliotheken gereinigt, um primäre Plasmidbibliotheken herzustellen.
6. Die Plasmidbibliotheken werden dann in vitro vollständig mit der Nco I-Restriktionsendonuklease verdaut, welche aus N. corallina-Zellen hergestellt wird. Der Nco I- Restriktionsendonuklease-Verdau bewirkt die selektive Zerstörung von unmodifizierten, nicht methylasehaltigen Klonen, was zu einer Erhöhung der relativen Häufigkeit von Nco I-Methylase-tragenden Klonen führt. Exonuklease und/oder Phosphatase können ebenfalls zu dem Verdau zugegeben werden, um die Zerstörung von nicht-Methylaseklonen zu verstärken.
7. Identifizierung von Nco I-Methylaseklonen: Die verdauten DNAS der Plasmidbibliothek werden in einen geeigneten Wirt, wie z.B. E. coli-Stamm RR1 oder K802, zurücktransformiert und transformierte Kolonien werden wieder durch Plattieren auf antibiotischen Platten erhalten. DNA aus einzelnen Kolonien wird auf die folgende Weise auf die Gegenwart des Nco I-Modifikationsgens hin analysiert: Die Plasmid-DNA, welche sie enthalten, wird gereinigt und in vitro mit Nco I-Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu bestimmen, ob sie gegenüber einem Verdau durch Nco I beständig ist. Die Plasmid-DNA sollte vollständig oder im wesentlichen beständig gegenüber einem Verdau sein. Die gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) des Klons wird ebenfalls gereinigt und mit Nco I-Restriktionsendonuklease inkubiert. Ein weiterer Beweis, daß das Methylasegen kloniert wurde, umf aßt ein Deletieren des Inserts und ein Überprüfen des verbleibenden Vektors auf die Gegenwart von intakten Nco I-Stellen.
8. Wenn festgestellt wurde, daß das Methylasegen kloniert war, wird der Klon auf Nco I-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Wenn eine Aktivität nachgewiesen wird, dann ist das Nco I-Restriktionsgen mit dem Methylasegen verbunden und ist in dem Klon vorhanden. In einem solchen Fall könnte man dann zu Schritt 12 unten weitergehen. Jedoch wurde gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, daß selbst wenn es vorhanden war, das Restriktionsgen nicht ohne eine weitere genetische Manipulation exprimiert wird, wie nachfolgend diskutiert wird. Das Fehlen von Restriktionsaktivität zeigt, daß entweder das Restriktionsgen nicht mit dem Methylasegen verbunden ist, oder daß es verbunden ist, aber nicht intakt mit dem Methylasegen kloniert wurde, oder daß es intakt kloniert wurde, aber nicht exprimiert wird. Um zu bestimmen, welche der obigen drei Möglichkeiten die wirkliche Situation ist, wird das klonierte Fragment restriktionskartiert und Deletionen werden durchgeführt, um zu bestimmen, wo das Methylasegen innerhalb des klonierten Fragmentes liegt. Die Information wird dann verwendet, um zu bestimmen, ob genügend DNA auf jeder Seite des Methylasegens vorhanden ist, um ein Restriktionsgen zu codieren, wenn es verbunden wäre. Wenn genügend Platz vorhanden ist, wird angenommen, daß das Restriktionsgen nicht verbunden ist, oder daß es in dem Klon vorhanden ist aber nicht exprimiert wird (und man könnte zu Schritt 10 weitergehen). Wenn nicht genügend Platz auf beiden Seiten des Methylasegens in der klonierten DNA vorhanden ist, um ein verbundenes Restriktionsgen zu codieren, wie es für den Bcl I-Klon der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, wird ein Teil des Methylasegens verwendet, um Verdaus des Nco I-Chromosoms zu sondieren, um eine genomische Karte des Bereichs zu erzeugen, welcher über die Grenzen der existierenden klonierten DNA hinausgeht. Diese Daten helfen, gewisse Endonukleasen zu identifizieren, welche den Restriktions-Modifikationsbereich in einzelne Fragmente spalten, die das Methylasegen wie auch größere Mengen benachbarter DNA enthalten. Die exakten Größen der durch solche Endonukleasen erzeugten Fragmente sind aus den Daten ebenfalls bekannt. Wenn gefunden würde, daß die Restriktions- und Modifikationsgene verbunden sind, würden solche Fragmente vermutlich ebenfalls das Restriktionsgen codieren.
9. Angereicherte Bibliotheken werden konstruiert, indem die in Schritt 8 beschriebenen Fragmente gelgereinigt werden und sie in einen geeigneten Vektor, wie z.B. pBR328, ligiert werden. Die Klone, welche eine kleine Menge (2 kb oder weniger) an DNA auf der linken Seite des Methylasegens enthalten, können durch Methylase-Selektion isoliert werden; die Klone, welche mehr DNA auf der linken Seite enthalten, scheinen eine Methylase-Selektion nicht sehr gut zu überleben.
10. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß Klone, welche das Nco I-Restriktionsendonukleasegen tragen, aufgrund der niedrigen Expression des Gens in E. coli nicht durch den üblichen Test mit rohem Zellextrakt identifiziert werden können. Daher wird die Nco I-Endonuklease so homogen wie möglich aus N. corallina gereinigt, und die Sequenz der ersten 20 - 40 Aminosäuren wird bestimmt. Aus der Sequenzinformation wird eine degenerierte oligomere DNA-Sonde entworfen und radioaktiv markiert. Gleichzeitig wird die Größe des Restriktionsendonukleaseproteins über Proteingele auf ca. 32 kD bestimmt, was zeigt, daß die Menge an DNA, die nötig ist, um das Endonukleasegen zu codieren, für Nco I ungefähr 1 kb ist. Die Klone, welche die Nco I-Restriktionsendonuklease tragen, werden als jene identifiziert, die mit der Restriktionsgen-DNA-Sonde hybridisieren, und wenigstens 1 kb an DNA neben der Hybridisierungsstelle tragen.
11. Die DNA-Sequenzierung des Bereichs bestätigt die Gegenwart des Restriktionsgens, zeigt seine Orientierung und stellt Daten zur Verfügung, die als eine Grundlage für nachfolgende Manipulationen des rekombinanten Plasmides verwendet werden können, um eine Expression des klonierten Restriktionsgens in E. coli zu induzieren.
12. Herstellung: In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Nco I-Methylase oder Endonuklease aus transformierten Wirtszellen, die mit einem oder mehreren Plasmidklonen, welche das Nco I-Modifikationsgen und das überexprimierte Restriktionsgen enthalten, transformiert wurden, durch Vermehrung in einem Fermenter in einem Vollmedium, das Ampicillin und Chloramphenicol enthält, hergestellt werden. Die Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt zu erzeugen, welcher Nco I-Methylase- und Restriktionsendonukleaseaktivität enthält. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Wirtszelle vorher durch Transformation mit Plasmiden, welche das Methylasegen tragen, geschützt werden, gefolgt von einer Einführung von einem oder mehreren Plasmiden, die das Endonukleasegen tragen.
13. Reinigung: Der rohe Zellextrakt, welcher die Nco I- Methylase und Endonuklease enthält, wird durch Standard- Produktreinigungstechniken, wie z .B. Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte Weise zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß den im Stand der Technik bekannten Techniken variieren kann.
Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit bevorzugt praktiziert wird. Man wird verstehen, daß dieses Beispiel zur Anschauung dient und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als darauf beschränkt angesehen werden soll.

BEISPIEL I

Klonieren von Nco I-Modifikationsmethylase- und Restriktionsendonukleasegenen

1. DNA-Reinigung: Um die DNA von N. corallina zu präparieren, wurden 2 g Zellpaste in 5 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA pH 8 resuspendiert. Die Suspension wurde in zwei 2,5 ml-Portionen aufgeteilt. 3,5 ml 1,7 mg/ml Lysozym in 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M EDTA pH 7,6 wurden zu jeder Portion zugegeben und jede wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. SDS wurde bis zu 1 % zugegeben und Proteinase K wurde bis zu 0,13 mg/ml zugegeben, und dann wurden die Portionen 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. 0,4 ml einer Lösung von 10 % SDS und 8 % Sarcosyl wurden zu jeder zugegeben und die Inkubation wurde 2 Stunden lang bei 55ºC fortgesetzt. 6 ml einer lytischen Mischung wurden zugegeben (50 mM Tris, 62,5 mM EDTA, 1 % Triton-X-100, pH 8) und die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Mischung wurde dann mit Phenol extrahiert und danach mit Phenol-Chloroform extrahiert, gefolgt von einer Dialyse gegen vier Wechsel DNA- Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0) für 24 Stunden. RNAse wurde bis zu 200 ug/ml zugegeben und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde dann durch Zugeben von NaCl bis zu 0,5 M und Überschichten mit 0,55 Volumen Isopropylalkohol gefällt. Die gefällte DNA wurde auf einen Glasstab aufgewickelt. Die DNA wurde in 1 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA (pH 8) bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 400 ug/ml gelöst.
ANMERKUNG FÜR DIE SCHRITTE 2 - 10: Wie oben angemerkt wurden jeweils 7 verschiedene Endonukleasen verwendet, um das Nco-Chromosom zu verdauen, um Bibliotheken zu konstruieren und zu screenen. Da das Methylasegen nicht gut genug exprimierte, um in allen Fällen außer Bcl I (und Sau3A, welcher Klon eine Untergruppe des Bcl I-Klons war) zu überleben, werden nur die Details für die Bcl I-Bibliothek zur Verfügung gestellt. Die anderen Bibliotheken wurden durch Verfahren, welche mit den unten beschriebenen ähnlich waren, hergestellt.
2. Vollständiger und teilweiser Verdau: Die gereinigte DNA wurde mit Bcl I gespalten, um wie folgt einen teilweisen Verdau zu erreichen: 375 ul, die 46,5 ul DNA mit 400 ug/ml in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol-Puffer enthielten, wurden in ein 150 ul- Aliquot und drei 75 ul-Aliquots aufgeteilt. Zu dem 150 ul- Röhrchen wurden 10 Einheiten Bcl I zugegeben, um 1,3 Einheiten Enzym pro ug DNA zu erreichen. 75 ul wurden aus dem ersten Röhrchen entnommen und auf das zweite Röhrchen übertragen, um 0,65 Einheiten Bcl I/ug zu erreichen, usw., wobei jedes nachfolgende Röhrchen die Hälfte der vorhergehenden Menge an Bcl I empfing. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann 15 Minuten lang bei 72ºC wärmebehandelt, und 15 ul von jedem wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Röhrchen 3 und 4 zeigten mäßig unvollständig wie auch vollständig verdaute DNA; diese zwei Röhrchen wurden vereinigt und verwendet, wie in Schritt 3 unten beschrieben ist.
3. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde wie folgt in pBR328 ligiert: 2 ug mit Bcl I vollständig und teilweise verdauter N. corallina-DNA (40 ul) wurden mit 1 ug mit BamH I-gespaltenem und dephosphoryliertem pBR328 (2,5 ul) gemischt. 20 ul 10X-Ligationsmischung (500 mM Tris, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP) wurden zugegeben, plus 137,5 ul steriles destilliertes Wasser, um das Endvolumen auf 200 ul zu bringen. 7,5 ul T4-DNA-Ligase (400 u/ul) wurden zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei 16ºC inkubiert. Ungefähr 125 ul der ligierten DNA wurden verwendet, um den E. coli-Stamm RR1 wie folgt zu transformieren: Die DNA wurde mit 1,0 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5 mM Na&sub3;Citrat, 67 mM CaCl&sub2;) auf Eis gemischt und 2,0 ml eiskalte kompetente E. coli RR1-Zellen (hsd R&supmin;M&supmin;, ATCC Nr. 31343) wurden zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 42ºC wurden die Zellen durch die Zugabe von 8 ml Luria- Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und dann 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert.
4. Primäre Zellbibliothek: Die transformierte Zellkultur wurde kurz zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 0,6 ml L-Nährlösung resuspendiert. 200 ul-Portionen wurden auf Luria-Agar(L-Agar)-Platten, welche 100 ug/ml Amipicillin enthielten, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten mit jeweils mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet und die transformierten Kolonien wurden zusammen gekratzt und gepoolt, um die primäre Zellbibliothek zu bilden.
5. Primäre Plasmidbibliothek: Die primäre Plasmidbibliothek wurde wie folgt hergestellt: 2,5 ml der primären Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährlösung, welche 100 ug/ml Ampicillin enthielt, angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht bei 37ºC geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei 4000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 10 ml 25 % Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 bei Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0, wurden zugegeben, gefolgt von 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25 M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde 3 Stunden lang auf Eis gelassen, dann wurden 12 ml einer lytischen Mischung (1 % Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) kräftig hineinpipettiert und die Zellsuspension wurde leicht verwirbelt, um eine Lyse zu erreichen. Nach der Lyse wurde die Mischung auf ein 50 ml-Plastik-Zentrifugenröhrchen übertragen und bei 17000 UpM und 4ºC 45 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0 g festes CsCl wurden in einem 50 ml Plastikröhrchen mit Schraubdeckel eingewogen und 22,0 g des Überstandes wurden in das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) wurde zu der Mischung zugegeben. Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Zoll x 3 Zoll Polyallomer- Zentrifugenröhrchen übertragen und abgedichtet. Diese Röhrchen wurden dann in einem Beckmann Ti70-Rotor 42 Stunden lang bei 44000 UpM und 17ºC zentrifugiert. Um die Plasmide zu sammeln, wurden die oberen Enden der Röhrchen mit einem Skalpell angestochen und die untere der zwei fluoreszierenden DNA-Banden wurde unter ultraviolettem Licht mit einer Spritze gesammelt. Die unteren Banden von beiden Röhrchen wurden in einem Glasröhrchen mit Schraubdeckel vereinigt und das Ethidiumbromid wurde durch viermaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen an wassergesättigtem eiskaltem N-Butanol entfernt.
Die extrahierte Lösung wurde auf einen Dialyseschlauch übertragen und 24 Stunden lang gegen 4 Wechsel an DNA-Puffer dialysiert. Die dialysierte DNA-Lösung wurde dann auf ein vorher gewogenes steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen übertragen und ihr Volumen wurde gemessen. 5 M NaCl wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben, dann wurden 2 Volumen Isopropanol zugegeben und gemischt. Die Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert, um die DNA zu fällen. Nach der Fällung wurde die Lösung 15 Minuten lang bei 15000 UpM und 0ºC zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Röhrchen wurde auf dem Labortisch gelassen, um 15 Minuten lang an der Luft zu trocknen, dann wurde das DNA-Pellet in 500 ul DNA-Puffer gelöst und bei -20ºC gelagert. Es wurde gefunden, daß die DNA-Konzentration von Plasmiden, welche auf diesem Wege hergestellt wurden, 200 bis 300 ug/ml betrug.
6. Verdau des Plasmidpools: Der primäre Plasmidpool wurde wie folgt verdaut, um nicht-Nco I-Methylaseklone zu zerstören: Die Plasmid-DNA wurde in 10 mM Tris pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 150 mM NaCl auf 33 ug/ml verdünnt. Eine Gesamtmenge von 900 ul wurde hergestellt. 450 ul wurden in das Röhrchen 1 gegeben, und jeweils 225 ul in die Röhrchen 2 und 3. 8 u/ug Nco I (120 Einheiten) wurden zu dem Röhrchen 1 zugegeben und gemischt; 225 ul wurden auf das Röhrchen 2 übertragen, um 4 u/ug zu erreichen. Das Röhrchen 3 erhielt kein Nco I. Das Röhrchen 1 wurde 3,5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert, dann mit Lambda-Exonuklease behandelt, die Röhrchen 2 und 3 wurden 1 Stunde lang inkubiert.
7. Transformation: Eine 12,5 ul Probe aus jedem Röhrchen wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transforrnieren. Nach dem 3-minütigen Wärmeschritt und 1 Stunde Wachstum in Luria- Nährlösung bei 37ºC wurden die Zell/DNA-Mischungen auf L- Agarplatten, welche 200 ug/ml Chloramphenicol enthielten, plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten untersucht. Zehn einzelne Kolonien wurden von jeder der 8 und 4 u/ug Platten gepickt. Jede Kolonie wurde in 10 ml L-Nährlösung, welche Chloramphenicol enthielt, angeimpft, um eine Minikultur herzustellen, und wurde ebenfalls auf L-Agarplatten, welche Chloramphenicol enthielten, ausgestrichen, um eine Vorratskultur (master stock) herzustellen.
8. Analyse von überlebenden Individuen: 20 der überlebenden Kolonien, welche in Schritt 7 erhalten wurden, wurden in 10 ml-Kulturen (Schritt 7) kultiviert und die Plasmide, welche sie enthielten, wurden durch das folgende Miniprep- Reinigungsverfahren hergestellt, welches ausgehend von dem Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513 (1979)) angepaßt wurde.
Miniprepverfahren: Jede Kultur wurde 5 Minuten lang bei 8000 UpM zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren und dann auf Eis gestellt. Wenn sich die Lösungen aufgeklart hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, welche sich bildeten, wurden 10 Minuten lang bei 15000 UpM und 4ºC abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 15000 UpM zentrifugiert, um die ausgefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Wenn sie trocken waren wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jedem zugegeben und die Lösungen wurden auf Eppendorf-Röhrchen, welche 575 ul Isopropanol enthielten, übertragen und wieder 10 Minuten lang bei Raumtemperatur gefällt. Die Röhrchen wurden dann 45 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden an der Luft getrocknet. Die Pellets wurden dann in 500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche 100 ug/ml RNAse enthielten, gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde erneut durch die Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul Isopropanol, gefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch eine 45 Sekunden lange Zentrifugation abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden erneut in einer Endlösung von 150 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0 gelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit Nco I analysiert.
9. Methylasegenklone (pEV190RM612-22C): Es wurde gefunden, daß 4 Plasmide (von der 4 u/ug Platte) resistent gegenüber Nco I waren und ein 6,6 kb-Fragment enthielten, welches zwei Bcl I-Fragmente, mit 1,5 und 5,1 kb in der Größe, umfaßte (siehe Figur 2). In jedem Fall hatte das 6,6 kb-Fragment, bezogen auf den Tetracyclinresistenzgen-Promotor des Plasmides, dieselbe Orientierung. Es wurde nachfolgend gezeigt, daß diese 4 Plasmide das Nco I-Modifikationsmethylasegen enthielten. Dieses wurde bestätigt, indem die Bcl I-Inserts deletiert wurden und der verbleibende Vektor auf eine intakte, spaltbare Nco I-Stelle hin überprüft wurde, und indem die chromosomale DNA aus dem Klon gereinigt wurde und bewiesen wurde, daß sie durch Nco I modifiziert war, d.h., resistent gegenüber einem Verdau durch Nco I war. Es wurde gefunden, daß beide Bcl I-Fragmente (1,5 und 5,1 kb) zur Methylierung benötigt wurden.
10. Der Extrakt wurde auf Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet; es wurde keine nachgewiesen. Der rohe Zellextrakt wurde über eine Phosphocellulosesäule konzentriert aber es wurde immer noch keine Aktivität nachgewiesen.
11. Lokalisierung des Methylasegens innerhalb des 6,6 kb Bcl I-Inserts: Der Nco I-Methylaseklon wurde mit zahlreichen Restriktionsendonukleasen verdaut, um eine Restriktionskarte der klonierten DNA zur Verfügung zu stellen. Unter Verwendung der Karte wurden verschiedene Bereiche innerhalb des Inserts deletiert, um die resultierende Auswirkung auf die Methylierung zu bestimmen. Die Lage des 1 kb-Methylasegens innerhalb des 6,6 kb-Inserts wurde dann genau bestimmt und es wurde gefunden, daß die Länge von klonierter DNA auf jeder Seite des Gens zwischen ca. 1 und 4 kb lag. Es wurde angenommen, daß die 4 kb auf der rechten Seite des M-Gens genügend Platz darstellten, um ein verbundenes R-Gen zu codieren, daß aber die 1 kb auf der linken Seite nicht ausreichend Platz darstellten, um ein verbundenes Restriktionsendonukleasegen zu codieren. An diesem Punkt war der Abstand zwischen den zwei Genen, die genaue Größe der Gene und ob sie verbunden waren oder nicht unbekannt. Das Fehlen von Nco I-Endonukleaseaktivität in dem Klon zeigte, daß das Restriktionsgen entweder nicht in dem Klon vorhanden war, oder vorhanden war, aber nicht exprimiert wurde. Für den Fall, daß das Restriktionsgen vorhanden war und nicht exprimierte, wurden eine DNA-Sequenzierung und eine Proteinsequenzierung der Methylaseklone durchgeführt, um zu bestimmen, welcher Teil, alles oder nichts von dem Restriktionsgen, in den Klonen vorhanden war (Schritte 15 - 16). Für den Fall, daß nicht das gesamte Restriktionsgen vorhanden war, wurde das Klonieren von größeren DNA-Bereichen, die zu dem Methylasegen benachbart waren, wie folgt erreicht (Schritte 12 - 14).
12. Eine Genkarte der benachbarten Regionen wurde bestimmt, indem die Southern-Blot-Technik (Southern, E. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503) verwendet wurde und ein Teil des Methylaseklons, insbesondere ein Bamh I-Sca I-Fragment von ungefähr 1 kb, welches gelgereinigt und mit alpha ³&sup5;S- ATP markiert wurde, als eine Sonde diente. Die Gelreinigung ist unten in Schritt 13 beschrieben (mit zwei Modifikationen: das Endvolumen betrug 20 ul; und es wurde keine Tropfendialyse durchgeführt). Die gelgereinigte Sonde wurde unter Verweridung des Oligomarkierungskits von Pharmacia (Charge QE106638) markiert: 2 ul Fragment (0,1 ug) in 30 ul dH&sub2;O wurden 15 Minuten lang auf 90ºC erwärmt, dann 5 Minuten lang bei 37ºC. 10 ul Reagenzmischung, 2 ul BSA, 4 ul ³&sup5;S (50 uCi) und 2 ul Klenow wurden zugegeben, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. 20 ul Stoppuffer und 180 ul dH&sub2;O wurden zugegeben. Die Mischung wurde dann 10 Minuten lang gekocht und sofort auf Eis gestellt.
Der Southern Blot wurde wie folgt hergestellt: N. corallina-DNA wurde separat mit den Restriktionsendonukleasen Acc I, BamH I, Bgl II, Cla I, EcoR I, EcoR V, Fsp I, Hind III, Nru I, Pst I, Pvu II, Sal I und Ssp I verdaut. Mit den Verdaus wurde auf einem 1,0 %igen Agarosegel eine Elektrophorese durchgeführt. Das Gel wurde 10 Minuten lang in 0,25 M HCl; 30 Minuten lang in 0,4 M NaOH, 0,8 M NaCl; und dann 30 Minuten lang in 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl getränkt. Ein Nitrocelluloseblatt wurde kurz in Wasser, dann in 5 X SSC (0,75 M NaCl, 75 mM Na&sub3;Citrat) getränkt. Das Gel wurde auf das obere Ende eines 1/2 Zoll dicken Chromatographiepapier(Whatman)-Stapels in 300 ml 3 M NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat- Puffer gelegt, wobei das Pufferniveau gerade unterhalb der Höhe des gestapelten Papiers lag. Das Nitrocelluloseblatt wurde oben auf das Gel gelegt und mit Chromatographiepapier (Whatman) abgedeckt, um als ein Docht zu wirken. Das Sandwich wurde beschwert und es wurde erlaubt, daß die Übertragung des Gelinhaltes auf das Nitrocelluloseblatt über Nacht bei Raumtemperatur fortschritt. Das Blatt wurde dann zehn Minuten lang in 0,15 M NaCl, 15 mM Na&sub3;Citrat gespült und 2,5 Stunden lang bei 80ºC in einem Vakuumofen gebrannt, um die übertragenen DNA-Fragmente auf der Nitrocellulose zu fixieren. Das Blatt wurde in eine flache Schale übertragen, welche 100 ml einer Lösung enthielt, die aus 5 ml 0,03 M Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,5, steril; 25 ml 20 X SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat), 50 ml Formamid, 10 ml 10 % SDS, 10 ml 100 X Denhardt's (20 g/l Ficoll, 20 g/l Polyvinylpyrrolidon, 20 g/l Rinderserumalbumin) zusammengesetzt war. Kalbsthymus-DNA wurde 10 Minuten lang gekocht, dann auf Eis gekühlt und dann mit 0,05 mg/ml zu der Mischung zugegeben. Der Blot wurde vorhybridisiert, indem 5 Stunden lang unter Schütteln bei 37ºC inkubiert wurde. 240 ul radioaktive Sonde wurden zu der flachen Schale zugegeben und die Inkubation wurde unter Schütteln über Nacht bei 37ºC fortgesetzt. Das Nitrocelluloseblatt wurde dann viermal jeweils 5 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,015 M NaCl, 1,5 mM Na&sub3;Citrat, 0,1 % SDS; einmal 20 Minuten lang bei 55ºC in demselben Puffer; und einmal 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in 0,15 M NaCl, 15 mM Na&sub3;Citrat gewaschen. Das Blatt wurde dann an der Luft getrocknet, 1 Stunde lang in einem Vakuumofen bei 80ºC getrocknet und fünf Tage lang autoradiographiert.
Aus den Southern Blot-Daten waren die Größen von acht Methylase-codierenden Fragmenten bekannt. Es wurden Versuche unternommen, um das 5,5 kb Cla I-, das 3,8 kb Fsp I-, das 6 kb Pvu II-, das 8 kb Pst I- und das 3 kb Sal I-Fragment zu klonieren. Die anderen drei bekannten Fragmente (Bamh I, Nru I, Acc I) wurden nicht weiterverfolgt und die verbleibenden Banden wurden als zu groß beurteilt, um kloniert zu werden.
13. Anfangs wurden drei Bibliotheken (Cla I, Fsp I und Pvu II) konstruiert und durch dieselben Verfahren wie in den Schritten 1 - 8 selektiert, mit den folgenden Modifikationen bei den Schritten 2 & 3: 60 ul (30 ug) chromosomale Nco I-DNA wurden in 300 ul 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol, welche 75 Einheiten Cla I, 38 Einheiten Fsp I oder 150 Einheiten Pvu II enthielten, 2 Stunden lang bei 37ºC vollständig verdaut. Mit dem gesamten Volumen wurde 5 Stunden lang in einem 1 %igen Agarosegel, das 0,01 % SDS enthielt, eine Elektrophorese durchgeführt. Unter Verwendung von langwelligem UV-Licht, um das Gel anzuschauen, wurden die Fragmente innerhalb des Größenbereichs der bekannten Größe des Methylasegen-enthaltenden Fragmentes aus dem Gel ausgeschnitten und mit einer sauberen Rasierklinge zerstückelt. Die Mischung wurde durch eine 22 Gage-Spritze in 5 ml 1 x Agarosegel-Puffer, welcher 0,01 % SDS enthielt, gepreßt und 45 Minuten lang bei 17 K UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,5 ml 5 M NaCl und 1,1 ml Isopropanol über Nacht bei -20ºC gefällt. Die DNA wurde 15 Minuten lang bei 15 K UpM pellettiert. Das Pellet wurde in 500 ul 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA resuspendiert, mit Phenol/Chloroform extrahiert, dreimal mit Chloroform extrahiert und wieder mit 48 ul 5 M NaCl und 1100 ul Isopropanol drei Stunden lang bei -20ºC gefällt. Das Pellet wurde mit 70 %igem Isopropanol gespült und an der Luft getrocknet und in einem Endvolumen von 100 ul 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA resuspendiert. Um die Fragmente weiter zu reinigen wurden die 100 ul 30 Minuten lang auf einem Millipore VS 0,025 mM Filter, welcher oben auf 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8 schwamm, einer Tropfendialyse unterworfen.
15 ul (0,5 ug) Fsp I oder Pvu II DNA-Fragmente wurden mit 1,2 ul (0,25 ug) mit EcoR V gespaltenem und dephosphoryliertem pBR328 in 70 ul 1 X Ligationspuffer, welcher 3 ul konzentrierte T4-DNA-Ligase (6000 Einheiten) enthielt, 4 Stunden lang bei 16ºC ligiert. 40 ul (1 ug) Cla I-DNA wurde mit 1,8 ul (0,5 ug) mit Cla 1 gespaltenem pBR328 in 70 ul 1 X Ligationspuffer, welcher 1,2 ul (2400 Einheiten) konzentrierte Ligase enthielt, 4 Stunden lang bei 16ºC und dann über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Alle 70 ul wurden in RR1 transformiert.
14. Identifizierung von neuen Cla I-, Fsp I- und Pvu II- Methylaseklonen, welche einen größeren Bereich an DNA stromaufwärts des Methylasegens enthielten: Es wurde gefunden, daß der einzige Cla I-Überlebende aus Schritt 13 das Methylase-codierende (M+) 5,5 kb Cla I-Fragment enthielt; es wurde gefunden, daß 7 von 8 Fsp I-Überlebenden das 3,8 kb Fsp I M+-Fragment enthielten und es wurde gefunden, daß 9 von 12 Pvu II-Überlebenden das 6 kb Pvu II M+-Fragment enthielten. Diese Klone überlappten mit dem ursprünglichen Bcl I-Klon, wie in Figur 3 gezeigt, und es wurde gefunden, daß sie, wenn sie mit dem Promotor des Plasmides übereinstimmend ausgerichtet (in line) waren, vollständig modifiziert waren. Es wurde keine Restriktionsendonukleaseaktivität nachgewiesen.
Von den neuen Klonen, welche > 1,3 kb DNA stromaufwärts des M-Gens enthielten, wurde angenommen, daß sie möglicherweise, aber nicht sicher, genügend DNA enthielten, um ein 1 kb Restriktionsendonukleasegen zu codieren, wenn es stromaufwärts des Methylasegens mit diesem verbunden wäre. Daher wurden Versuche unternommen, das 3 kb Sal I- und das 8 kb Pst I-Fragment zu klonieren, da die Sal I- und Pst I-Klone größere Mengen an stromaufwärts liegender DNA enthalten würden. Spezielle Vektoren mußten entworfen werden, um diese Fragmente zu klonieren, da sie nur die Hälfte des M- Gens enthielten. Die Vektoren wurden so entworfen, daß sie die andere Hälfte enthielten, so daß das M-Gen zurückgebildet wurde, wenn das gewünschte Fragment in den Klonierungsvektor ligiert wurde, und das Plasmid war in der Lage, sich selbst zu modifizieren und eine Methylaseselektion zu überleben.
Es wurde gefunden, daß der Sal I-Klon, welcher ≥ 2 kb DNA stromaufwärts des M-Gens enthält, nur teilweise modifiziert war. Man nimmt an, daß dieses auf einem erhöhten Abstand des M-Gens von dem Promotor des Plasmides beruht. Übereinstimmend mit dieser Annahme ist die Beobachtung, daß das Pst I-Fragment nicht kloniert wurde, vermutlich da das Pst I-Fragment ca. 7 kb stromaufwärts liegende DNA enthält, was das M-Gen sogar noch weiter von dem Promotor des Plasmides entfernt. Ein solches Plasmid würde möglicherweise das M- Gen nicht gut genug exprimieren, um sich selbst zu modifizieren und würde nicht leicht eine Methylaseselektion überleben. Nichtsdestotrotz wurden keine Versuche unternommen, das Pst I-Fragment zu klonieren, da angenommen wurde, daß der Sal I-Klon genügend Platz enthielt (≥ 2 kb), um das R- Gen zu codieren, wenn es stromaufwärts des M-Gens mit diesem verbunden wäre.
15. Mit der Gewinnung dieser neuen Klone war nun genügend DNA auf beiden Seiten des Methylasegens kloniert, um ein Restriktionsendonukleasegen, wenn es damit verbunden wäre, zu codieren, unabhängig davon welche Seite das verbundene Gen codierte. Jedoch exprimierte keiner dieser Klone irgendeine Restriktionsendonukleaseaktivität. Mit immer noch keinem Beweis, daß die zwei Nco I-Restriktions-Modifikationsgene verbunden waren, wurde die Nco I-Restriktionsendonuklease wie folgt so homogen wie möglich gereinigt:
Nach Aufbrechen von 566 Gramm N. corallina durch eine French-Presse wurden die 2,2 Liter Überstand in der folgenden Reihenfolge auf Chromatographiesäulen aufgetragen: DEAE-Cellulose, Heparin-Sepharose, Phosphocellulose, DEAE- Cellulose, Phosphocellulose, polyCAT A-FPLC, mono Q-FPLC und mono S-FPLC. Die resultierende Präparation wies über 95 % reine Nco I-Restriktionsendonuklease mit einer Größe von ca. 32.000 Dalton auf, wie durch SDS-PAGE-Elektrophorese bestimmt wurde.
Ungefähr 33 ul (1,5 ug, 50 pmol) der gereinigten Nco I- Restriktionsendonuklease wurden auf drei Bahnen eines SDS- 10 - 20 % Polyacrylamid-Gradientengels aufgetragen und 3 Stunden lang bei 100 Volt einer Elektrophorese unterworfen. Das Gel wurde dann 12 Stunden lang bei 200 mA durch Elektroblot auf eine PVDF (Immobilon, Millipore) Membran übertragen (Matsudaira, 1987). Die Membran wurde mit Coomassie Blue R-250 gefärbt und die mittlere Bande, welche der Nco I-Restriktionsendonuklease entsprach, wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten. Die Banden wurden in 0,5 mm- Intervallen bis zu einem kammähnlichen Aussehen mehrfach eingeschnitten, um die Effizienz des Anfeuchtens durch die Sequenator-Reagenzien zu maximieren. Die Banden wurden zum Sequenzieren auf einem Applied Biosystems Modell 470A Gasphasen-Proteinsequenziergerät, welches zum PTH-Nachweis eine Online-HPLC 120a benutzte, verwendet. Dreißig Aminosäurereste wurden wie folgt sequenziert:
Alanin - Threonin - Alanin - Prolin - Glycin- Histidin - Leucin - Leucin - Glycin - Glutamin - Isoleucin - Isoleucin - Glycin - Asparagin - Valin - Methionin - Glutaminsäure - Glutaminsäure - Alanin - Leucin - Lysin - Prolin - Valin - Leucin - Glutamin - Glutaminsäure - Methionin - Alanin - Asparaginsäure - Arginin.
16. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Basierend auf der obigen Sequenz wurde durch die organische Syntheseabteilung von New England Biolabs eine 17-mer DNA-Oligosonde mit 32-facher Entartung konstruiert:
AA(C,T)GTNATGGA(G,A)GA(G,A)GC, wobei N = G, A, T oder C war
Nur einige Aminosäurereste wurden zur Translation in eine DNA-Sequenz ausgewählt, da ihre DNA-Sequenz die geringste Entartung aufwies.
Der ursprüngliche Bcl I-Klon, welcher ca. 4 kb DNA stromabwärts des M-Gens enthielt, und der nachfolgende Sal I-Klon, welcher ca. 2 kb DNA stromaufwärts des M-Gens enthielt, wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut und ähnlich wie in dem oben beschriebenen Verfahren (Schritt 12) auf Nitrocellulose geblottet. Das DNA-17-mer wurde in 26 ul wie folgt kinasiert: 2,5 ul 10 X Kinasepuffer (700 mm Tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 2,6 mM 5'-hydroxylterminierte Lachssperma-DNA), 5 ul 14-mer (1 O.D./ml), 12,5 ul dH&sub2;O, 5 ul gamma P³²ATP (50 uCi) und 1 ul Kinase (10 Einheiten) 1,3 Stunden bei Raumtemperatur. Das gesamte Volumen wurde zu dem vorhybridisierten Blot zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Blot wurde gewaschen und wie in Schritt 12 beschrieben exponiert. Die Ergebnisse zeigten, daß das Oligomer mit einer bestimmten Stelle auf den Bcl I- und Sal I-Klonen hybridisierte, was erlaubte, daß die Lage des Anfangs des Nco I- Restriktionsendonukleasegens innerhalb einer bestimmten 300 Basenpaar-Region in der klonierten DNA genau festgelegt wurde (siehe Figur 2: das Oligomer hybridisierte zwischen der Nru I- und der Msc I-Stelle). Dieses war ein indirekter aber stichhaltiger Beweis, daß die Nco I-Restriktions-Modifikationsgene verbunden sind und vollständig auf dem Bcl I- Klon und teilweise auf dem Sal I-Klon zusammen kloniert sind.
17. Eine DNA-Sequenzierung bestätigte die Gegenwart des R- Gens und zeigte, daß es so orientiert ist, wie in den Figuren 2 und 3 gezeigt ist.
18. Überexpression: ein Anordnen des starken Promotors pL 500 bp vor dem Restriktionsgen führte nicht zu einer Expression. Daher wurde die DNA am Anfang der Restriktionsendonuklease sequenziert und die Information wurde verwendet, um den Anfang des R-Gens zu rekonstruieren, um seinen natürlicherweise vorkommenden GTG-Start zu einem ATG-Start zu verändern, da ATG von E. coli leichter benutzt wird. Die RBS und der Promotor wurden ebenfalls durch solche ersetzt, die von E. coli erkannt werden. Das rekonstruierte R-Gen pEV190R 612-22C-29 wurde durch Transformation in API 200- Zellen identifiziert (es wurde gefunden, daß diese Zellen in der Gegenwart von X-Gal blau werden, wenn das R-Gen exprimiert). Das Plasmid wurde dann in den Stamm ER1451 transformiert, welcher pEV190M302,325-1 enthielt. Das Plasmid pEV190M302,325-1 enthält das klonierte Nco I-Methylasegen und prämodifiziert ER1451. Ein Probe von ER1451, welche beide Plasmide enthält, wurde am 1. November 1990 bei der American Type Cultur Collection unter der ATCC-Zugriffsnr. 68457 hinterlegt. In ER1451 wird eine maximale Aktivität (500.000 Einheiten pro Gramm) erhalten, wenn IPTG zugegeben wird. Es wurde entdeckt, daß das überexprimierte R-Gen nicht in den Stamm RR1 transformiert werden kann, selbst wenn dieser durch die Nco I-Methylase vormodifiziert wurde, da RR1 nicht durch IPTG reguliert wird und die Aktivitätsniveaus toxisch sind.
19. Die Nco I-Modifikationsmethylase oder Endonuklease kann durch Vermehrung in einem Fermenter in einem Vollmedium, welches Ampicillin und Chloramphenicol enthält, aus Klonen hergestellt werden, die das Nco I-Modifikationsgen und das überexprimierte Restriktionsgen enthalten. Die Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt zu erzeugen, welcher Nco I-Methylase- und Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
20. Der rohe Zellextrakt, welcher die Nco I-Methylase und Endonuklease enthält, wird durch Standard-Produktreinigungstechniken, wie z.B. Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.

Claims

1. Expressionsvektor, welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert, der eine DNA-Sequenz umfaßt, die für Nco I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA- Sequenz aus N. corallina ATCC-Nr. 19070 erhältlich ist, und wobei der Expressionsvektor durch Ersetzen der endogenen regulatorischen Sequenzen des Endonukleasegens, welche direkt stromabwärts von der das Nco I- Modifikationsenzym codierenden DNA gefunden werden, durch einen exogenen Promotor und eine ribosomale Bindungsstelle, erhältlich ist.

2. Wirtszelle, welche mit dem Vektor aus Anspruch 1 transformiert ist.

3. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter Nco I- Restriktionsendonuklease, welches ein Kultivieren der transformierten Wirtszelle aus Anspruch 2 unter Bedingungen für die Expression der Endonuklease umfaßt.