HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor,
welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert.
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Viele Bakterien enthalten Systeme, welche gegen ein
Eindringen von fremder DNA schützen. Bakterienzellen enthalten
spezifische Endonukleasen, welche doppelsträngige
Einschnitte in eindringender DNA erzeugen, wenn nicht die DNA
vorher, gewöhnlich durch die entsprechende DNA-Methylase,
modifiziert wurde. Die Endonuklease mit ihrer begleitenden
Methylase wird ein Restriktions-Modifikations-System (im
folgenden "R-MM-System") genannt. Die Hauptfunktion von R-M-
Systemen ist somit eine defensive: sie ermöglichen
Bakterienzellen, Infektionen durch Bakteriophagen und Plasmid-
DNA-Moleküle zu widerstehen, welche sie andernfalls
parasitieren würden.
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Drei verschiedene Typen von R-M-Systemen sind auf der
Grundlage der Zusammensetzung der Untereinheiten, der
Kofaktorbedürfnisse und des DNA-Spaltungstyps
charakterisiert worden. R-M-Systeme vom Typ I sind die komplexesten.
Die Endonuklease enthält typischerweise drei verschiedene
Typen von Untereinheiten und benötigt Mg&spplus;&spplus;, ATP und
S-Adenosylmethionin zur DNA-Spaltung. Ihre Erkennungsstellen
sind komplex und die DNA-Spaltung tritt an nicht
spezifischen Stellen, irgendwo 400 - 7000 Basenpaare von der
Erkennungsstelle entfernt auf.
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R-M-Systeme vom Typ III sind etwas weniger komplex. Die
Endonuklease von R-M-Systemen vom Typ III enthält nur zwei
Typen von Untereinheiten, und obwohl Mg&spplus;&spplus; und ATP zur DNA-
Spaltung benötigt werden stimuliert S-Adenosylmethionin die
enzymatische Aktivität ohne ein absolutes
Erfordernisdarzustellen.
Die DNA-Spaltung tritt ca. 25 - 27 Basenpaare
distal von der Erkennungsstelle auf.
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R-M-Systeme vom Typ II sind viel einfacher als die entweder
vom Typ I oder III. Die Endonuklease enthält nur eine
Untereinheit und nur Mg&spplus;&spplus; wird zur DNA-Spaltung benötigt.
Darüber hinaus liegt die DNA-Spaltungsstelle innerhalb oder
benachbart zu der Erkennungsstelle des Enzyms. Es ist diese
Klasse von Restriktionsendonukleasen, welche sich für
Molekularbiologen als am nützlichsten erwiesen hat.
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Bakterien besitzen gewöhnlich nur eine kleine Anzahl von
Restriktionsendonukleasen pro Spezies. Die Endonukleasen
werden gemäß den Bakterien benannt, aus welchen sie
stammen. Somit synthetisiert z.B. die Spezies Haemophilus
aegyptius drei verschiedene Restriktionsendonukleasen,
welche Hae I, Hae II und Hae III genannt werden. Diese Enzyme
erkennen und spalten die Sequenzen (AT)GGCC(AT), PuGCGCPy
bzw. GGCC. Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY13
nur ein Enzym, EcoR I, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
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Restriktionsendonukleasen, der erste Bestandteil von R-M-
Systemen, sind aufgrund ihrer praktischen Verwendung zur
molekularen Zerlegung von DNA hauptsächlich bezüglich ihrer
Erkennungssequenz und Spaltungsspezifität charakterisiert
worden. Die Mehrheit der Restriktionsendonukleasen erkennt
Sequenzen mit 4 - 6 Nukleotiden in der Länge. Vor kurzem
sind Restriktionsendonukleasen gefunden worden, welche
Erkennungssequenzen von 7 - 8 Nukleotiden in der Länge
aufwiesen. Die meisten, aber nicht alle Erkennungsstellen
enthalten eine zweifache Symmetrieachse und in den meisten
Fällen sind alle Basen innerhalb der Stelle eindeutig
spezifiziert. Diese symmetrische Beziehung in der
Erkennungssequenz von Restriktionsendonukleasen wurde mit dem Begriff
Palindrome bezeichnet. Manche Restriktionsendonukleasen
haben degenerierte oder abgeschwächte Spezifitäten, indem
sie mehrere Basen an denselben Positionen erkennen können.
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EcoR I, welche die Sequenz GAATTC erkennt, ist ein Beispiel
einer Restriktionsendonuklease mit einer symmetrischen
Beziehung, während Hae II, welche die Sequenz PuGCGCPy
erkennt, für Restriktionsendonukleasen mit einer
degenerierten oder abgeschwächten Spezifität steht. Endonukleasen
mit symmetrischen Erkennungsstellen spalten im allgemeinen
symmetrisch innerhalb oder benachbart zu der
Erkennungsstelle, während jene, die asymmetrische Stellen erkennen,
dazu neigen in einem Abstand von der Erkennungsstelle,
typischerweise ca. 1 - 13 Basenpaare entfernt von dieser
Stelle, zu schneiden.
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Der zweite Bestandteil von bakteriellen R-M-Systemen sind
die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär
zu den Restriktionsendonukleasen und stellen das Mittel zur
Verfügung, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre
eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender
DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und
binden an dieselbe Nukleotid-Erkennungssequenz wie die
entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstelle die DNA
zu zertrennen modifizieren sie chemisch eines oder mehrere
der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Zufügung
einer Methylgruppe. Gefolgt auf die Methylierung wird die
Erkennungssequenz nicht länger durch die entsprechende
Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA
einer Bakterienzelle ist mittels der Aktivität ihrer
Modifikationsmethylase immer modifiziert und ist daher
unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen
Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte, und daher
identifizierbar fremde DNA, die empfindlich gegenüber einer
Erkennung und einem Angriff einer Restriktionsendonuklease
ist.
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Mehr als 1000 verschiedene Restriktionsendonukleasen sind
aus Bakterienstämmen isoliert worden und viele teilen sich
gemeinsame Spezifitäten. Restriktionsendonukleasen, welche
identische Sequenzen erkennen, werden "Isoschizomere"
genannt. Obwohl die Erkennungssequenzen von Isoschizomeren
dieselben sind, können sie bezüglich der Spaltungsstelle
(z.B. Xma I v. Sma I, Endow et al., J. Mol. Biol. 112: 521
(1977), Waalwijk et al., Nucleic Acids Res. 5: 3231 (1978))
und der Spaltungsgeschwindigkeit an verschiedenen Stellen
(Xho I v. Pae R7I, Gingeras et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A. 80: 402 (1983)) variieren.
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Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich,
Gene zu klonieren und die Proteine und Enzyme, welche sie
codieren, in größeren Mengen zu produzieren, als aus ihren
natürlichen Quellen durch herkömmliche Reinigungstechniken
erhältlich sind.
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Restriktions-Modifikations-Systeme vom Typ II werden mit
wachsender Häufigkeit kloniert. Vier Verfahren werden
verwendet, um R-M-Systeme in E. coli zu klonieren: (1)
Subklonieren von natürlichen Plasmiden; (2) Selektion basierend
auf Phagenrestriktion; (3) Selektion basierend auf
Vektormodifikation; und (4) Mehrschritt-Isolierung.
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Die ersten klonierten Systeme verwendeten eine
Bakteriophageninfektion als ein Mittel zum Identifizieren oder zur
Selektion von Restriktionsendonukleaseklonen (Hha II: Mann
et al., Gene 3: 97 - 112 (1978); EcoR II: Kosykh et al.,
Molec. Gen. Genet. 178: 717 - 719 (1980); Pst I: Walder et
al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 1503 - 1507 (1981)). Da
die Gegenwart von R-M-Systemen in Bakterien diesen
ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen,
können Zellen, welche klonierte R-M-Gene tragen, im Prinzip
selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden,
welche Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden,
daß dieses Verfahren nur einen beschränkten Wert hat.
Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte R-M-Gene nicht
immer eine ausreichende Phagenresistenz verleihen, um ein
selektives Überleben zu ermöglichen.
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Ein Subklonieren von natürlichen Plasmiden umfaßt ein
Übertragen von Systemen, welche anfangs als plasmidgetragen
charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide
(Ecor V: Bougueleret et al., Nucleic Acids Res. 12:
3659 -53676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 80: 402 - 406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19:
355 - 359 (1982); Pvu II: Blumenthal et al., J. Bacteriol.
164: 501 - 509 (1985)). In diesem Ansatz werden die
Plasmide vor Verdau und Ligation gereinigt, womit die Komplexität
der Ursprungs-DNA vermindert wird. Ein Isolieren des
Systems umfaßt dann ein Subklonieren und Charakterisieren
von Bibliotheken und ein Durchführen von Selektionen.
Dieser Ansatz hat ebenfalls eine Anzahl von Beschränkungen,
einschließlich der, daß die meisten R-M-Systeme auf dem
Bakterienchromosom und nicht auf den Plasmiden lokalisiert
sind.
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Die Vektormodifikation, bis heute der erfolgreichste
Ansatz, beruht auf der Annahme, daß die Restriktions- und
Modifikationsgene eines bestimmten Systems vom Typ II
verbunden sind und aufeinanderfolgend exprimiert werden,
Methylase und dann Endonuklease. Somit sollten in einer
Population von methylasepositiven Klonen einige Klone
ebenfalls das entsprechende Endonukleasegen tragen. Dieser
Ansatz, welcher als Methylaseselektion bekannt ist, wurde
erstmals erfolgreich von Wilson, EPA-Veröffentlichung Nr.
0193413, verwendet, um die Hae II, Taq I, Ban I, Hind III,
Hinf I und Msp I R-M-Systeme zu klonieren.
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Für eine Anzahl von R-M-Systemen war jedoch ein
Mehrschritt-Klonierungsansatz nötig. Beispielsweise wurde
während der Erfassung eines neuen R-M-Systems gefunden, daß
eine Anzahl von Zellen einem Etablierungsproblem
gegenübersteht. Wenn die Methylase gegenüber der Endonuklease keinen
Vorsprung hat, ist die Zelle in Gefahr, ihre eigene
zelluläre DNA zu spalten. E. coli scheint mit diesem Problem
fertig zu werden, indem es seine DNA repariert, und es ist
in der Lage, viele klonierte R-M-Systeme ohne sichtbare
Schädigung aufzunehmen. Jedoch werden nicht alle Systeme
leicht aufgenommen. Die Dde I und BamH I R-M-Systeme
konnten beispielsweise nicht in einem einzigen Schritt kloniert
werden; sondern es wurden drei Schritte benötigt (Howard et
al., Nucleic Acids Res. 14: 7939 - 7951 (1988)). Es gibt
tatsächlich viele Systeme, für welche nur das Methylasegen
kloniert wurde. Diese Systeme könnten ähnlich zu BamH I und
Dde I sein und können ähnliche Ansätze nötig machen.
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Während eine Anzahl von Klonen durch eines oder mehrere der
oben beschriebenen Verfahren erhalten wurde, siehe Wilson,
Gene L4, 281 - 289 (1988), ist das Klonieren von
R-M-Systemen vom Typ II nicht ohne Schwierigkeiten. Insbesondere
wurde gefunden, daß die Genetik von vielen R-M-Systemen
komplexer ist, und methylasepositive Klone, welche
beispielsweise durch Vektormodifikation erhalten wurden,
ergaben nicht das entsprechende Endonukleasegen. Siehe Wilson,
Trends in Genetics 4, 314 - 318 (1988); Lunnen et al., Gene
74, 25 - 32 (1988). Tatsächlich werden bei dem Verfahren
des Klonierens von R-M-Systemen unter Verwendung von
Vektormodifikation zahlreiche Hindernisse angetroffen.
Beispielsweise können in manchen Systemen die Methylase- und
Endonukleasegene nicht verbunden sein, oder die
Endonuklease, welche verwendet wurde, um die bakterielle DNA zu
fragmentieren, kann entweder eines oder beide der R-M-Gene
schneiden. In anderen Systemen, wie z.B. BamH I und Dde I,
kann die Methylase nicht ausreichend gegen einen Verdau
durch die entsprechende Endonuklease schützen, entweder
aufgrund von ineffizienter Expression in dem
Transformationswirt, oder aufgrund des inhärenten Kontrollmechanismus
für die Expression der Methylase- und Endonukleasegene,
oder aus unbekannten Gründen. Eine Modifikation kann
ebenfalls schädlich für die Wirtszelle sein, welche für die
Transformation ausgewählt wurde. Die Endonuklease, welche
kloniert werden soll, kann für die Methylaseselektion nicht
in ausreichender Reinheit oder Menge zur Verfügung stehen.
Bei vielen Systemen werden ebenfalls Schwierigkeiten beim
Exprimieren des Endonukleasegens in einer
Transformationswirtszelle einer anderen Bakterienspezies angetroffen.
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Trotz der Schwierigkeiten beim Klonieren der komplexeren R-
M-Systeme vom Typ II war es möglich, einige
Endonukleasegene durch Modifizieren des Vektormodifikations-Selektions-
Verfahren (siehe Lunnen et al., op. cit.) und/oder durch
Verwendung eines Mehrschritt-Klonierungsansatzes zu
erhalten. Beispielsweise haben die Bildung von multiplen
Bibliotheken, die Konstruktion von neuen Klonierungsvektoren, die
Verwendung von Isoschizomeren für den
Methylase-Selektionsschritt, das Kartieren von Methylase- und/oder
Endonukleasegenen, um die entsprechenden DNA-Sequenzen für eine
Verwendung als Hybridisierungssonden zu bestimmen, und andere
Variationen der oben beschriebenen Ansätze eine Anzahl von
schwer zugänglichen rekombinanten R-M-Systemen ergeben.
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Jedoch weiß man am Anfang eines Typ
II-R-M-Klonierungsprojektes einfach nicht, ob irgendwelche und welche
Variationen oder Modifikationen zu vorhergehenden Ansätzen benötigt
werden könnten, um irgendein bestimmtes R-M-System zu
klonieren. Beispielsweise ist die genaue Genetik eines
bestimmten Systems gewöhnlich unbekannt. Typ II-R-M-Gene
können in einer von vier möglichen Anordnungen in dem Genom
vorhanden sein. Wilson, Trends in Genetics, supra. Die
Größen der Enzyme und der entsprechenden Gene variieren
zwischen einem R-M-System und einem anderen in großem Maße,
wie dieses ebenfalls die DNA- und Aminosäuresequenzen tun.
Tatsächlich wurde selbst bei isoschizomeren
Restriktionsendonukleasen gefunden, daß sie wenige Ähnlichkeiten
zeigen. Id, auf 318, siehe ebenfalls Chandrasegeran et al.,
Structure and Expression, Bd. I, Seiten 149 - 156, Adenine
Press (1988).
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Die Kontrollmechanismen der R- und M-Genexpression
variieren bei den Systemen vom Typ II ebenfalls stark.
Beispielsweise
kann die Expression des Endonukleasegens
modifikationsabhängig sein, wie es bei den Ava II, Hae II, Hinf I,
Pst I und Xba I Systemen gezeigt wird. Alternativ kann das
Endonukleasegen, verglichen mit dem entsprechenden
Methylasegen, eine große Anzahl seiner eigenen Erkennungsstellen
enthalten, wie in dem Taq I-System.
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Während der Transformation von Zellen, um Klone zu
erhalten, welche das Ziel-R-M-System enthalten, ist die
zelluläre DNA anfangs unmodifiziert und folglich in Gefahr,
durch die Zielendonuklease verdaut zu werden. Die
Transformationswirtszellen müssen entweder DNA-Reparatursysteme
enthalten oder in der Lage sein, die Expression des
Zielendonukleasegens zu verzögern, bis die Modifikation
vollständig ist. Wenn keiner dieser Mechanismen dem
Transformationswirt zur Verfügung steht, wird beim Etablieren der
Klongene in dem Wirt ein Problem angetroffen. Wie oben
angemerkt, war es, wenn beim Klonieren der Dde I und BamH I
Systeme Etablierungsprobleme angetroffen wurden, nötig, die
Methylase- und Endonukleasegene aufeinanderfolgend
einzuführen, um die DNA der Transformationswirtszellen zu
schützen (Howard, K.A. et al., supra, Brooks et al., Gene 74: 13
(1988)). Jedoch haben einige R-M-Systeme allen Versuchen,
sie zu klonieren, widerstanden, und andere haben,
möglicherweise aufgrund von Etablierungsschwierigkeiten, nur das
Methylasegen ergeben. Wilson, Trends in Genetics 4, 317.
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Es wurde gefunden, daß Transformationswirtszellen ebenfalls
Systeme enthalten können, welche fremde Modifikationstypen
spalten. Beispielsweise sind in E. coli zwei Systeme
identifiziert worden, welche modifizierte DNAs spalten: das
mcr-System spaltet DNA, welche Methylcytosin enthält, und
das mrr-System spaltet DNA, welche Methyladenin enthält. Es
ist daher gewöhnlich nötig, E. coli-Stämme zu verwenden,
bei welchen diese Systeme defekt sind. Die Gegenwart von
zusätzlichen Wirtszellen-Restriktionssystemen kann
ebenfalls
für die Schwierigkeiten verantwortlich sein, welche
beim Klonieren von R-M-Systemen angetroffen werden.
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Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem
geringeren Ausmaß, Modifikationsmethylasen nützliche
Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor
sind, besteht ein kommerzieller Ansporn, Stämme von
Bakterien durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche
diese Enzyme im Überfluß synthetisieren. Solche Stämme
wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung
vereinfachen würden und ebenfalls das Mittel zur Produktion in
kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor,
welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert, der
eine DNA-Sequenz umfaßt, die für Nco
I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA-Sequenz aus Nocardia
corallina (ATCC 19070) erhältlich ist, sowie ein Verfahren
für die Herstellung dieser Endonuklease. Diese Erfindung
betrifft ebenfalls einen transformierten Wirt, welcher die
Restriktionsendonuklease Nco I exprimiert, ein Enzym,
welches die DNA-Sequenz 5'-CCATGG-3' erkennt und zwischen den
zwei C-Resten spaltet, wobei ein 5'-Überhang von vier Basen
zurückbleibt (Langdale, J.A., Myers, P.A. und Roberts,
R.J., unveröffentlichte Beobachtungen).
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Die Nco I-Methylase oder Restriktionsendonuklease, welche
gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, ist im
wesentlichen rein und frei von den Verunreinigungen, die
normalerweise in Restriktionsendonuklease-Präparationen
gefunden werden, welche durch herkömmliche Techniken
erzeugt werden, wie z.B. in Schritt 15 von Beispiel 1
beschrieben ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Figuren 1A und 1B: Schema zum Klonieren und Produzieren der
Nco I-Restriktionsendonuklease:
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Figur 1A stellt die Verfahren zur Bestimmung des
bevorzugten Verfahrens zum Klonieren und Produzieren der Nco I-
Restriktionsendonuklease dar.
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Figur 1B stellt das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und
Produzieren der Nco I-Restriktionsendonuklease, basierend
auf den tatsächlichen Ergebnissen, welche in Figur 1A
gezeigt sind, dar.
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Figur 2 ist eine Restriktionskarte der ursprünglichen 1,5
und 5,1 kb Bcl I-Inserts, welche die Nco I-Methylase und
Endonuklease codieren.
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Figur 3 ist eine Restriktionskarte der gesamten 8 kb der N.
corallina-DNA, welche kloniert wurde.
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Figur 4 ist eine Fotografie eines Agarosegels, welches die
Nco I-Restriktionsendonukleaseaktivität zeigt, die aus dem
Zellextrakt von E. coli ER1451 erhalten wurde, das
pEV190R612-22C-29, welches ein Plasmid ist, das das
klonierte und rekonstruierte Endonukleasegen trägt, und
pEV190M302,325-1, welches ein Plasmid ist, das das
klonierte Methylasegen trägt, enthält.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung betrifft einen Expressionsvektor,
welcher rekombinante Nco I-Endonuklease exprimiert, der
eine DNA-Sequenz umf aßt, welche für Nco
I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die DNA-Sequenz aus N. corallina
ATCC Nr. 19070 erhältlich ist, und wobei der
Expressionsvektor erhältlich ist, indem die endogenen regulatorischen
Sequenzen des Endonukleasegens, welche direkt stromabwärts
von der das Nco I-Modifikationsenzym codierenden DNA
gefunden werden, durch einen exogenen Promotor und eine
Ribosomenbindungsstelle ersetzt werden. Die Erfindung umfaßt
ebenfalls eine Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert
wurde, und ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten
Nco I-Restriktionsendonuklease durch Kultivieren der
transformierten Wirtszelle unter Bedingungen für eine Expression
der Endonuklease. Am Anfang des Klonierungsprojektes war es
nicht bekannt, welche Bedingungen beim Klonieren des Nco I-
Restriktions-Modifikations-Systems erfolgreich sein würden,
noch waren die Restriktions- und Modifikationsgene
innerhalb solcher Klone lokalisiert. Die Klonierungsergebnisse
und die nachfolgende DNA-Sequenzierung, Kartierung und
Charakterisierung der Klone, welche in Figur 1A und Beispiel 1
beschrieben ist, zeigen den vorher unbekannten direkten Weg
zum Klonieren und Exprimieren des Nco
I-Restriktions-Modifikationssystems.
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Insbesondere erwies sich das Klonieren der Nco
1-Restriktions-Modifikationsgene von N. corallina in E. coli durch die
Entdeckung, daß im Unterschied zu vielen anderen
Restriktions-Modifikations-Systemen, Nco I-Gene in E. coli nicht gut
exprimieren, als kompliziert. Da die Methylase-Selektion
(die Identifizierung von Methylaseklonen durch ihre
Fähigkeit einem Nco I-Verdau zu widerstehen und diesen zu
überleben) auf einer Methylase-Expression beruht, ist eine
Selektion auf die Nco I-Methylase nicht immer erfolgreich.
In der vorliegenden Erfindung waren aus einer Anzahl von
hergestellten DNA-Bibliotheken nur die Bcl I- und die
Sau3A-Bibliotheken erfolgreich. Darüber hinaus war die
Sau3A-Bibliothek erst beim zweiten Versuch erfolgreich.
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Es wurde ebenfalls gefunden, daß für das Nco
I-Restriktionsendonukleasegen die Expression ein Problem war.
Methylaseklone von vielen anderen Restriktions-Modifikations-
Systemen können mit in vitro-Tests auf eine
Restriktionsendonukleaseaktivität
hin gescreent werden. Jedoch
exprimierte keiner der Nco I-Restriktions-Modifikationsklone
eine Endonukleaseaktivität, die durch in vitro-Tests wie
jene, welche in der oben erwähnten EP 0193413 beschrieben
sind, nachweisbar war, selbst nachdem die rohen
Zellextrakte über Phosphocellulosesäulen konzentriert wurden. Um
zu bestimmen, ob das R-Gen in den M-Klonen vorhanden war,
wurden zahlreiche zusätzliche Schritte benötigt. Die
Schritte umfaßten: a) Klonieren von chromosomaler N.
corallina-DNA auf beiden Seiten des M-Gens (Pvu II, Cla I,
Fsp I, Sal I-Klone), b) Herstellen einer extrem reinen
Probe von Nco I aus N. corallina, c) Sequenzieren des
Aminoterminus des gereinigten
Restriktionsendonukleaseproteins, d) Entwerfen eines entsprechenden DNA-Oligomers, und
e) Überprüfen der DNA der Methylaseklone auf eine
Hybridisierung mit dem Oligomer. Auf diese Weise wurde gefunden,
daß die Bcl I-Methylaseklone und möglicherweise die Pvu II
oder Cla-Klone, die auf der stromabwärtigen Seite des M-
Gens nur Untergruppen des Bcl I-Klons sind, das R-Gen
trugen, wogegen bei keinem der anderen Methylaseklone gefunden
wurde, daß er das R-Gen trug. Um Nco
I-Restriktionsendonukleaseaktivität zu erhalten, wurde das R-Gen sequenziert
und der Anfang des Gens wurde rekonstruiert.
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Das hierin beschriebene Verfahren, durch welches das Nco I-
Restriktionsgen und das Methylasegen vorzugsweise kloniert
und exprimiert wurden, ist in den Figuren 1A und 1B
dargestellt und umfaßt die folgenden Schritte:
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1. Die DNA von N. corallina wird gereinigt.
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2. Die DNA wird vollständig und teilweise mit einer
Restriktionsendonuklease wie z.B. Bcl I verdaut. BamH I,
Bgl II, EcoR I, Pst I, Sau3A und Xho II wurden ebenfalls
für den Verdau und für die Schritte 2 - 7 verwendet, aber
da die Bcl I-Bibliothek die einzige Bibliothek war, welche
einen RM-Klon ergab, werden nur die Details für die Arbeit
mit Bcl I beschrieben.
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3. Die verdauten DNAs werden jeweils in einen
Klonierungsvektor, wie z.B. pBR328, ligiert, welcher in seinem
Chloramphenicolgen eine Nco I-Stelle enthält. Die
resultierenden Mischungen werden verwendet, um einen geeigneten
Wirt, wie z.B. Zellen der E. coli-Stämme RR1 oder K802
(ATCC 31343 bzw. ATCC 33526) zu transformieren. RR1 ist die
bevorzugte Wirtszelle.
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4. Die DNA/Zellmischungen werden vorzugsweise auf
antibiotischen Medien plattiert, die selektiv für
transformierte Zellen sind, wie z.B. Ampicillin oder Chloramphenicol.
Nach der Inkubation werden die transformierten Zellkolonien
zusammengesammelt, um die primären Zellbibliotheken zu
bilden.
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5. Die rekombinanten Plasmide werden in toto aus den
primären Zellbibliotheken gereinigt, um primäre
Plasmidbibliotheken herzustellen.
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6. Die Plasmidbibliotheken werden dann in vitro
vollständig mit der Nco I-Restriktionsendonuklease verdaut, welche
aus N. corallina-Zellen hergestellt wird. Der Nco I-
Restriktionsendonuklease-Verdau bewirkt die selektive
Zerstörung von unmodifizierten, nicht methylasehaltigen
Klonen, was zu einer Erhöhung der relativen Häufigkeit von Nco
I-Methylase-tragenden Klonen führt. Exonuklease und/oder
Phosphatase können ebenfalls zu dem Verdau zugegeben
werden, um die Zerstörung von nicht-Methylaseklonen zu
verstärken.
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7. Identifizierung von Nco I-Methylaseklonen: Die
verdauten DNAS der Plasmidbibliothek werden in einen geeigneten
Wirt, wie z.B. E. coli-Stamm RR1 oder K802,
zurücktransformiert und transformierte Kolonien werden wieder durch
Plattieren auf antibiotischen Platten erhalten. DNA aus
einzelnen Kolonien wird auf die folgende Weise auf die
Gegenwart des Nco I-Modifikationsgens hin analysiert: Die
Plasmid-DNA, welche sie enthalten, wird gereinigt und in
vitro mit Nco I-Restriktionsendonuklease inkubiert, um zu
bestimmen, ob sie gegenüber einem Verdau durch Nco I
beständig ist. Die Plasmid-DNA sollte vollständig oder im
wesentlichen beständig gegenüber einem Verdau sein. Die
gesamte zelluläre DNA (chromosomale und Plasmid-) des Klons
wird ebenfalls gereinigt und mit Nco
I-Restriktionsendonuklease inkubiert. Ein weiterer Beweis, daß das Methylasegen
kloniert wurde, umf aßt ein Deletieren des Inserts und ein
Überprüfen des verbleibenden Vektors auf die Gegenwart von
intakten Nco I-Stellen.
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8. Wenn festgestellt wurde, daß das Methylasegen kloniert
war, wird der Klon auf Nco
I-Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet. Wenn eine Aktivität nachgewiesen wird,
dann ist das Nco I-Restriktionsgen mit dem Methylasegen
verbunden und ist in dem Klon vorhanden. In einem solchen
Fall könnte man dann zu Schritt 12 unten weitergehen.
Jedoch wurde gemäß der vorliegenden Erfindung gefunden, daß
selbst wenn es vorhanden war, das Restriktionsgen nicht
ohne eine weitere genetische Manipulation exprimiert wird,
wie nachfolgend diskutiert wird. Das Fehlen von
Restriktionsaktivität zeigt, daß entweder das Restriktionsgen nicht
mit dem Methylasegen verbunden ist, oder daß es verbunden
ist, aber nicht intakt mit dem Methylasegen kloniert wurde,
oder daß es intakt kloniert wurde, aber nicht exprimiert
wird. Um zu bestimmen, welche der obigen drei Möglichkeiten
die wirkliche Situation ist, wird das klonierte Fragment
restriktionskartiert und Deletionen werden durchgeführt, um
zu bestimmen, wo das Methylasegen innerhalb des klonierten
Fragmentes liegt. Die Information wird dann verwendet, um
zu bestimmen, ob genügend DNA auf jeder Seite des
Methylasegens vorhanden ist, um ein Restriktionsgen zu codieren,
wenn es verbunden wäre. Wenn genügend Platz vorhanden ist,
wird angenommen, daß das Restriktionsgen nicht verbunden
ist, oder daß es in dem Klon vorhanden ist aber nicht
exprimiert wird (und man könnte zu Schritt 10 weitergehen).
Wenn nicht genügend Platz auf beiden Seiten des
Methylasegens in der klonierten DNA vorhanden ist, um ein
verbundenes Restriktionsgen zu codieren, wie es für den Bcl I-Klon
der vorliegenden Erfindung gefunden wurde, wird ein Teil
des Methylasegens verwendet, um Verdaus des Nco
I-Chromosoms zu sondieren, um eine genomische Karte des Bereichs zu
erzeugen, welcher über die Grenzen der existierenden
klonierten DNA hinausgeht. Diese Daten helfen, gewisse
Endonukleasen zu identifizieren, welche den
Restriktions-Modifikationsbereich in einzelne Fragmente spalten, die das
Methylasegen wie auch größere Mengen benachbarter DNA
enthalten. Die exakten Größen der durch solche Endonukleasen
erzeugten Fragmente sind aus den Daten ebenfalls bekannt.
Wenn gefunden würde, daß die Restriktions- und
Modifikationsgene verbunden sind, würden solche Fragmente vermutlich
ebenfalls das Restriktionsgen codieren.
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9. Angereicherte Bibliotheken werden konstruiert, indem
die in Schritt 8 beschriebenen Fragmente gelgereinigt
werden und sie in einen geeigneten Vektor, wie z.B. pBR328,
ligiert werden. Die Klone, welche eine kleine Menge (2 kb
oder weniger) an DNA auf der linken Seite des Methylasegens
enthalten, können durch Methylase-Selektion isoliert
werden; die Klone, welche mehr DNA auf der linken Seite
enthalten, scheinen eine Methylase-Selektion nicht sehr gut zu
überleben.
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10. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Gemäß der
vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß Klone, welche
das Nco I-Restriktionsendonukleasegen tragen, aufgrund der
niedrigen Expression des Gens in E. coli nicht durch den
üblichen Test mit rohem Zellextrakt identifiziert werden
können. Daher wird die Nco I-Endonuklease so homogen wie
möglich aus N. corallina gereinigt, und die Sequenz der
ersten 20 - 40 Aminosäuren wird bestimmt. Aus der
Sequenzinformation wird eine degenerierte oligomere DNA-Sonde
entworfen und radioaktiv markiert. Gleichzeitig wird die Größe
des Restriktionsendonukleaseproteins über Proteingele auf
ca. 32 kD bestimmt, was zeigt, daß die Menge an DNA, die
nötig ist, um das Endonukleasegen zu codieren, für Nco I
ungefähr 1 kb ist. Die Klone, welche die Nco
I-Restriktionsendonuklease tragen, werden als jene identifiziert, die
mit der Restriktionsgen-DNA-Sonde hybridisieren, und
wenigstens 1 kb an DNA neben der Hybridisierungsstelle tragen.
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11. Die DNA-Sequenzierung des Bereichs bestätigt die
Gegenwart des Restriktionsgens, zeigt seine Orientierung
und stellt Daten zur Verfügung, die als eine Grundlage für
nachfolgende Manipulationen des rekombinanten Plasmides
verwendet werden können, um eine Expression des klonierten
Restriktionsgens in E. coli zu induzieren.
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12. Herstellung: In einer bevorzugten Ausführungsform kann
die Nco I-Methylase oder Endonuklease aus transformierten
Wirtszellen, die mit einem oder mehreren Plasmidklonen,
welche das Nco I-Modifikationsgen und das überexprimierte
Restriktionsgen enthalten, transformiert wurden, durch
Vermehrung in einem Fermenter in einem Vollmedium, das
Ampicillin und Chloramphenicol enthält, hergestellt werden. Die
Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und
durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt
zu erzeugen, welcher Nco I-Methylase- und
Restriktionsendonukleaseaktivität enthält. In einer anderen bevorzugten
Ausführungsform kann die Wirtszelle vorher durch
Transformation mit Plasmiden, welche das Methylasegen tragen,
geschützt werden, gefolgt von einer Einführung von einem
oder mehreren Plasmiden, die das Endonukleasegen tragen.
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13. Reinigung: Der rohe Zellextrakt, welcher die Nco I-
Methylase und Endonuklease enthält, wird durch Standard-
Produktreinigungstechniken, wie z .B.
Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
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Obwohl die oben ausgeführten Schritte die bevorzugte Weise
zum Praktizieren der vorliegenden Erfindung darstellen,
wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene
Ansatz gemäß den im Stand der Technik bekannten Techniken
variieren kann.
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Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit
bevorzugt praktiziert wird. Man wird verstehen, daß dieses
Beispiel zur Anschauung dient und daß die Erfindung, außer
wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht als
darauf beschränkt angesehen werden soll.
BEISPIEL I
Klonieren von Nco I-Modifikationsmethylase- und
Restriktionsendonukleasegenen
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1. DNA-Reinigung: Um die DNA von N. corallina zu
präparieren, wurden 2 g Zellpaste in 5 ml 0,1 M Tris-HCl, 0,1 M
EDTA pH 8 resuspendiert. Die Suspension wurde in zwei 2,5
ml-Portionen aufgeteilt. 3,5 ml 1,7 mg/ml Lysozym in 0,1 M
Tris-HCl, 0,1 M EDTA pH 7,6 wurden zu jeder Portion
zugegeben und jede wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. SDS
wurde bis zu 1 % zugegeben und Proteinase K wurde bis zu
0,13 mg/ml zugegeben, und dann wurden die Portionen 1
Stunde lang bei 37ºC inkubiert. 0,4 ml einer Lösung von 10 %
SDS und 8 % Sarcosyl wurden zu jeder zugegeben und die
Inkubation wurde 2 Stunden lang bei 55ºC fortgesetzt. 6 ml
einer lytischen Mischung wurden zugegeben (50 mM Tris, 62,5
mM EDTA, 1 % Triton-X-100, pH 8) und die Mischung wurde 1
Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Die Mischung wurde dann mit
Phenol extrahiert und danach mit Phenol-Chloroform
extrahiert, gefolgt von einer Dialyse gegen vier Wechsel DNA-
Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0) für 24 Stunden.
RNAse wurde bis zu 200 ug/ml zugegeben und 1 Stunde lang
bei 37ºC inkubiert. Die DNA wurde dann durch Zugeben von
NaCl bis zu 0,5 M und Überschichten mit 0,55 Volumen
Isopropylalkohol gefällt. Die gefällte DNA wurde auf einen
Glasstab aufgewickelt. Die DNA wurde in 1 ml 10 mM Tris, 1
mM EDTA (pH 8) bis zu einer Endkonzentration von ungefähr
400 ug/ml gelöst.
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ANMERKUNG FÜR DIE SCHRITTE 2 - 10: Wie oben angemerkt
wurden jeweils 7 verschiedene Endonukleasen verwendet, um das
Nco-Chromosom zu verdauen, um Bibliotheken zu konstruieren
und zu screenen. Da das Methylasegen nicht gut genug
exprimierte, um in allen Fällen außer Bcl I (und Sau3A, welcher
Klon eine Untergruppe des Bcl I-Klons war) zu überleben,
werden nur die Details für die Bcl I-Bibliothek zur
Verfügung gestellt. Die anderen Bibliotheken wurden durch
Verfahren, welche mit den unten beschriebenen ähnlich waren,
hergestellt.
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2. Vollständiger und teilweiser Verdau: Die gereinigte
DNA wurde mit Bcl I gespalten, um wie folgt einen
teilweisen Verdau zu erreichen: 375 ul, die 46,5 ul DNA mit 400
ug/ml in 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl, 10 mM
Mercaptoethanol-Puffer enthielten, wurden in ein 150 ul-
Aliquot und drei 75 ul-Aliquots aufgeteilt. Zu dem 150 ul-
Röhrchen wurden 10 Einheiten Bcl I zugegeben, um 1,3
Einheiten Enzym pro ug DNA zu erreichen. 75 ul wurden aus dem
ersten Röhrchen entnommen und auf das zweite Röhrchen
übertragen, um 0,65 Einheiten Bcl I/ug zu erreichen, usw.,
wobei jedes nachfolgende Röhrchen die Hälfte der
vorhergehenden Menge an Bcl I empfing. Die Röhrchen wurden eine
Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann 15 Minuten lang bei
72ºC wärmebehandelt, und 15 ul von jedem wurden durch
Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Röhrchen 3 und 4
zeigten mäßig unvollständig wie auch vollständig verdaute
DNA; diese zwei Röhrchen wurden vereinigt und verwendet,
wie in Schritt 3 unten beschrieben ist.
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3. Ligation: Die fragmentierte DNA wurde wie folgt in
pBR328 ligiert: 2 ug mit Bcl I vollständig und teilweise
verdauter N. corallina-DNA (40 ul) wurden mit 1 ug mit BamH
I-gespaltenem und dephosphoryliertem pBR328 (2,5 ul)
gemischt. 20 ul 10X-Ligationsmischung (500 mM Tris, pH 7,5,
100 mM MgCl&sub2;, 100 mM DTT, 5 mM ATP) wurden zugegeben, plus
137,5 ul steriles destilliertes Wasser, um das Endvolumen
auf 200 ul zu bringen. 7,5 ul T4-DNA-Ligase (400 u/ul)
wurden zugegeben und die Mischung wurde 4 Stunden lang bei
16ºC inkubiert. Ungefähr 125 ul der ligierten DNA wurden
verwendet, um den E. coli-Stamm RR1 wie folgt zu
transformieren: Die DNA wurde mit 1,0 ml SSC/CaCl&sub2; (50 mM NaCl, 5
mM Na&sub3;Citrat, 67 mM CaCl&sub2;) auf Eis gemischt und 2,0 ml
eiskalte kompetente E. coli RR1-Zellen (hsd R&supmin;M&supmin;, ATCC Nr.
31343) wurden zugegeben. Nach einer 5-minütigen Inkubation
bei 42ºC wurden die Zellen durch die Zugabe von 8 ml Luria-
Nährlösung (L-Nährlösung) verdünnt und dann 1 Stunde lang
bei 37ºC inkubiert.
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4. Primäre Zellbibliothek: Die transformierte Zellkultur
wurde kurz zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen und
die Zellen wurden in 0,6 ml L-Nährlösung resuspendiert. 200
ul-Portionen wurden auf Luria-Agar(L-Agar)-Platten, welche
100 ug/ml Amipicillin enthielten, plattiert. Nach einer
Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden die Platten mit
jeweils mit 2,5 ml 10 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2; geflutet
und die transformierten Kolonien wurden zusammen gekratzt
und gepoolt, um die primäre Zellbibliothek zu bilden.
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5. Primäre Plasmidbibliothek: Die primäre
Plasmidbibliothek wurde wie folgt hergestellt: 2,5 ml der primären
Zellbibliothek wurden in 500 ml L-Nährlösung, welche 100 ug/ml
Ampicillin enthielt, angeimpft. Die Kultur wurde über Nacht
bei 37ºC geschüttelt und dann 5 Minuten lang bei 4000 UpM
zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellpellet wurde in 10 ml 25 % Sucrose, 50 mM Tris, pH 8,0 bei
Raumtemperatur resuspendiert. 5 ml 0,25 M EDTA, pH 8,0,
wurden zugegeben, gefolgt von 3 ml 10 mg/ml Lysozym in 0,25
M Tris, pH 8,0. Die Lösung wurde 3 Stunden lang auf Eis
gelassen, dann wurden 12 ml einer lytischen Mischung (1 %
Triton X-100, 50 mM Tris, pH 8,0, 67 mM EDTA) kräftig
hineinpipettiert und die Zellsuspension wurde leicht
verwirbelt, um eine Lyse zu erreichen. Nach der Lyse wurde die
Mischung auf ein 50 ml-Plastik-Zentrifugenröhrchen
übertragen und bei 17000 UpM und 4ºC 45 Minuten lang
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit einer Pipette entfernt. 20,0
g festes CsCl wurden in einem 50 ml Plastikröhrchen mit
Schraubdeckel eingewogen und 22,0 g des Überstandes wurden
in das Röhrchen pipettiert und gemischt. 1,0 ml
Ethidiumbromidlösung (5 mg/ml Ethidiumbromid in 10 mM Tris, pH 8,0,
1 mM EDTA, 100 mM NaCl) wurde zu der Mischung zugegeben.
Die Lösung wurde auf zwei 5/8 Zoll x 3 Zoll Polyallomer-
Zentrifugenröhrchen übertragen und abgedichtet. Diese
Röhrchen wurden dann in einem Beckmann Ti70-Rotor 42
Stunden lang bei 44000 UpM und 17ºC zentrifugiert. Um die
Plasmide zu sammeln, wurden die oberen Enden der Röhrchen mit
einem Skalpell angestochen und die untere der zwei
fluoreszierenden DNA-Banden wurde unter ultraviolettem Licht mit
einer Spritze gesammelt. Die unteren Banden von beiden
Röhrchen wurden in einem Glasröhrchen mit Schraubdeckel
vereinigt und das Ethidiumbromid wurde durch viermaliges
Extrahieren mit einem gleichen Volumen an wassergesättigtem
eiskaltem N-Butanol entfernt.
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Die extrahierte Lösung wurde auf einen Dialyseschlauch
übertragen und 24 Stunden lang gegen 4 Wechsel an
DNA-Puffer dialysiert. Die dialysierte DNA-Lösung wurde dann auf
ein vorher gewogenes steriles 50 ml-Zentrifugenröhrchen
übertragen und ihr Volumen wurde gemessen. 5 M NaCl wurde
bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben, dann
wurden 2 Volumen Isopropanol zugegeben und gemischt. Die
Lösung wurde über Nacht bei -20ºC gelagert, um die DNA zu
fällen. Nach der Fällung wurde die Lösung 15 Minuten lang
bei 15000 UpM und 0ºC zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Röhrchen wurde auf dem Labortisch gelassen, um
15 Minuten lang an der Luft zu trocknen, dann wurde das
DNA-Pellet in 500 ul DNA-Puffer gelöst und bei -20ºC
gelagert. Es wurde gefunden, daß die DNA-Konzentration von
Plasmiden, welche auf diesem Wege hergestellt wurden, 200
bis 300 ug/ml betrug.
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6. Verdau des Plasmidpools: Der primäre Plasmidpool wurde
wie folgt verdaut, um nicht-Nco I-Methylaseklone zu
zerstören: Die Plasmid-DNA wurde in 10 mM Tris pH 8,0, 10 mM
MgCl&sub2;, 150 mM NaCl auf 33 ug/ml verdünnt. Eine Gesamtmenge
von 900 ul wurde hergestellt. 450 ul wurden in das Röhrchen
1 gegeben, und jeweils 225 ul in die Röhrchen 2 und 3. 8
u/ug Nco I (120 Einheiten) wurden zu dem Röhrchen 1 zugegeben
und gemischt; 225 ul wurden auf das Röhrchen 2 übertragen,
um 4 u/ug zu erreichen. Das Röhrchen 3 erhielt kein Nco I.
Das Röhrchen 1 wurde 3,5 Stunden lang bei 37ºC inkubiert,
dann mit Lambda-Exonuklease behandelt, die Röhrchen 2 und 3
wurden 1 Stunde lang inkubiert.
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7. Transformation: Eine 12,5 ul Probe aus jedem Röhrchen
wurde verwendet, um E. coli RR1 zu transforrnieren. Nach dem
3-minütigen Wärmeschritt und 1 Stunde Wachstum in Luria-
Nährlösung bei 37ºC wurden die Zell/DNA-Mischungen auf L-
Agarplatten, welche 200 ug/ml Chloramphenicol enthielten,
plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37ºC wurden
die Platten untersucht. Zehn einzelne Kolonien wurden von
jeder der 8 und 4 u/ug Platten gepickt. Jede Kolonie wurde
in 10 ml L-Nährlösung, welche Chloramphenicol enthielt,
angeimpft, um eine Minikultur herzustellen, und wurde
ebenfalls auf L-Agarplatten, welche Chloramphenicol enthielten,
ausgestrichen, um eine Vorratskultur (master stock)
herzustellen.
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8. Analyse von überlebenden Individuen: 20 der
überlebenden Kolonien, welche in Schritt 7 erhalten wurden, wurden
in 10 ml-Kulturen (Schritt 7) kultiviert und die Plasmide,
welche sie enthielten, wurden durch das folgende Miniprep-
Reinigungsverfahren hergestellt, welches ausgehend von dem
Verfahren von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513
(1979)) angepaßt wurde.
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Miniprepverfahren: Jede Kultur wurde 5 Minuten lang bei
8000 UpM zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und
das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50
mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt,
resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden
2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben und
die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren
und dann auf Eis gestellt. Wenn sich die Lösungen
aufgeklart hatten, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat, pH 4,8, zu
jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, welche
sich bildeten, wurden 10 Minuten lang bei 15000 UpM und 4ºC
abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein
Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, und
gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die
Röhrchen 10 Minuten lang bei 15000 UpM zentrifugiert, um
die ausgefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die
Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden bei
Raumtemperatur 30 Minuten lang an der Luft getrocknet. Wenn sie
trocken waren wurden die Pellets in 850 ul 10 mM Tris, 1 mM
EDTA, pH 8,0, resuspendiert. 75 ul 5 M NaCl wurden zu jedem
zugegeben und die Lösungen wurden auf Eppendorf-Röhrchen,
welche 575 ul Isopropanol enthielten, übertragen und wieder
10 Minuten lang bei Raumtemperatur gefällt. Die Röhrchen
wurden dann 45 Sekunden lang in einer Mikrozentrifuge
zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets
wurden an der Luft getrocknet. Die Pellets wurden dann in
500 ul 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, welche 100 ug/ml
RNAse enthielten, gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC
inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde erneut durch
die Zugabe von 50 ul 5 M NaCl, gefolgt von 350 ul
Isopropanol, gefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde
die DNA durch eine 45 Sekunden lange Zentrifugation
abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Pellets
wurden erneut in einer Endlösung von 150 ul 10 mM Tris, 1
mM EDTA, pH 8,0 gelöst. Die Plasmid-Minipreps wurden
nachfolgend durch Verdau mit Nco I analysiert.
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9. Methylasegenklone (pEV190RM612-22C): Es wurde
gefunden, daß 4 Plasmide (von der 4 u/ug Platte) resistent
gegenüber Nco I waren und ein 6,6 kb-Fragment enthielten,
welches zwei Bcl I-Fragmente, mit 1,5 und 5,1 kb in der
Größe, umfaßte (siehe Figur 2). In jedem Fall hatte das 6,6
kb-Fragment, bezogen auf den
Tetracyclinresistenzgen-Promotor des Plasmides, dieselbe Orientierung. Es wurde
nachfolgend gezeigt, daß diese 4 Plasmide das Nco
I-Modifikationsmethylasegen enthielten. Dieses wurde bestätigt, indem die
Bcl I-Inserts deletiert wurden und der verbleibende Vektor
auf eine intakte, spaltbare Nco I-Stelle hin überprüft
wurde, und indem die chromosomale DNA aus dem Klon
gereinigt wurde und bewiesen wurde, daß sie durch Nco I
modifiziert war, d.h., resistent gegenüber einem Verdau durch Nco
I war. Es wurde gefunden, daß beide Bcl I-Fragmente (1,5
und 5,1 kb) zur Methylierung benötigt wurden.
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10. Der Extrakt wurde auf
Restriktionsendonukleaseaktivität hin getestet; es wurde keine nachgewiesen. Der rohe
Zellextrakt wurde über eine Phosphocellulosesäule
konzentriert aber es wurde immer noch keine Aktivität
nachgewiesen.
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11. Lokalisierung des Methylasegens innerhalb des 6,6 kb
Bcl I-Inserts: Der Nco I-Methylaseklon wurde mit
zahlreichen Restriktionsendonukleasen verdaut, um eine
Restriktionskarte der klonierten DNA zur Verfügung zu stellen. Unter
Verwendung der Karte wurden verschiedene Bereiche innerhalb
des Inserts deletiert, um die resultierende Auswirkung auf
die Methylierung zu bestimmen. Die Lage des 1
kb-Methylasegens innerhalb des 6,6 kb-Inserts wurde dann genau bestimmt
und es wurde gefunden, daß die Länge von klonierter DNA auf
jeder Seite des Gens zwischen ca. 1 und 4 kb lag. Es wurde
angenommen, daß die 4 kb auf der rechten Seite des M-Gens
genügend Platz darstellten, um ein verbundenes R-Gen zu
codieren, daß aber die 1 kb auf der linken Seite nicht
ausreichend Platz darstellten, um ein verbundenes
Restriktionsendonukleasegen zu codieren. An diesem Punkt war der
Abstand zwischen den zwei Genen, die genaue Größe der Gene
und ob sie verbunden waren oder nicht unbekannt. Das Fehlen
von Nco I-Endonukleaseaktivität in dem Klon zeigte, daß das
Restriktionsgen entweder nicht in dem Klon vorhanden war,
oder vorhanden war, aber nicht exprimiert wurde. Für den
Fall, daß das Restriktionsgen vorhanden war und nicht
exprimierte, wurden eine DNA-Sequenzierung und eine
Proteinsequenzierung der Methylaseklone durchgeführt, um zu
bestimmen, welcher Teil, alles oder nichts von dem
Restriktionsgen, in den Klonen vorhanden war (Schritte 15 - 16).
Für den Fall, daß nicht das gesamte Restriktionsgen
vorhanden war, wurde das Klonieren von größeren DNA-Bereichen,
die zu dem Methylasegen benachbart waren, wie folgt
erreicht (Schritte 12 - 14).
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12. Eine Genkarte der benachbarten Regionen wurde
bestimmt, indem die Southern-Blot-Technik (Southern, E.
1975, J. Mol. Biol. 98: 503) verwendet wurde und ein Teil
des Methylaseklons, insbesondere ein Bamh I-Sca I-Fragment
von ungefähr 1 kb, welches gelgereinigt und mit alpha ³&sup5;S-
ATP markiert wurde, als eine Sonde diente. Die Gelreinigung
ist unten in Schritt 13 beschrieben (mit zwei
Modifikationen: das Endvolumen betrug 20 ul; und es wurde keine
Tropfendialyse durchgeführt). Die gelgereinigte Sonde wurde
unter Verweridung des Oligomarkierungskits von Pharmacia
(Charge QE106638) markiert: 2 ul Fragment (0,1 ug) in 30 ul
dH&sub2;O wurden 15 Minuten lang auf 90ºC erwärmt, dann 5
Minuten lang bei 37ºC. 10 ul Reagenzmischung, 2 ul BSA, 4 ul
³&sup5;S
(50 uCi) und 2 ul Klenow wurden zugegeben, und die
Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. 20
ul Stoppuffer und 180 ul dH&sub2;O wurden zugegeben. Die
Mischung wurde dann 10 Minuten lang gekocht und sofort auf
Eis gestellt.
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Der Southern Blot wurde wie folgt hergestellt: N.
corallina-DNA wurde separat mit den Restriktionsendonukleasen Acc
I, BamH I, Bgl II, Cla I, EcoR I, EcoR V, Fsp I, Hind III,
Nru I, Pst I, Pvu II, Sal I und Ssp I verdaut. Mit den
Verdaus wurde auf einem 1,0 %igen Agarosegel eine
Elektrophorese durchgeführt. Das Gel wurde 10 Minuten lang in 0,25 M
HCl; 30 Minuten lang in 0,4 M NaOH, 0,8 M NaCl; und dann 30
Minuten lang in 0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl getränkt.
Ein Nitrocelluloseblatt wurde kurz in Wasser, dann in 5 X
SSC (0,75 M NaCl, 75 mM Na&sub3;Citrat) getränkt. Das Gel wurde
auf das obere Ende eines 1/2 Zoll dicken
Chromatographiepapier(Whatman)-Stapels in 300 ml 3 M NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat-
Puffer gelegt, wobei das Pufferniveau gerade unterhalb der
Höhe des gestapelten Papiers lag. Das Nitrocelluloseblatt
wurde oben auf das Gel gelegt und mit Chromatographiepapier
(Whatman) abgedeckt, um als ein Docht zu wirken. Das
Sandwich wurde beschwert und es wurde erlaubt, daß die
Übertragung des Gelinhaltes auf das Nitrocelluloseblatt über Nacht
bei Raumtemperatur fortschritt. Das Blatt wurde dann zehn
Minuten lang in 0,15 M NaCl, 15 mM Na&sub3;Citrat gespült und
2,5 Stunden lang bei 80ºC in einem Vakuumofen gebrannt, um
die übertragenen DNA-Fragmente auf der Nitrocellulose zu
fixieren. Das Blatt wurde in eine flache Schale übertragen,
welche 100 ml einer Lösung enthielt, die aus 5 ml 0,03 M
Tris, 0,001 M EDTA, pH 7,5, steril; 25 ml 20 X SSC (3 M
NaCl, 0,3 M Na&sub3;Citrat), 50 ml Formamid, 10 ml 10 % SDS, 10
ml 100 X Denhardt's (20 g/l Ficoll, 20 g/l
Polyvinylpyrrolidon, 20 g/l Rinderserumalbumin) zusammengesetzt war.
Kalbsthymus-DNA wurde 10 Minuten lang gekocht, dann auf Eis
gekühlt und dann mit 0,05 mg/ml zu der Mischung zugegeben.
Der Blot wurde vorhybridisiert, indem 5 Stunden lang unter
Schütteln bei 37ºC inkubiert wurde. 240 ul radioaktive
Sonde wurden zu der flachen Schale zugegeben und die
Inkubation wurde unter Schütteln über Nacht bei 37ºC
fortgesetzt. Das Nitrocelluloseblatt wurde dann viermal jeweils 5
Minuten lang bei Raumtemperatur mit 0,015 M NaCl, 1,5 mM
Na&sub3;Citrat, 0,1 % SDS; einmal 20 Minuten lang bei 55ºC in
demselben Puffer; und einmal 20 Minuten lang bei
Raumtemperatur in 0,15 M NaCl, 15 mM Na&sub3;Citrat gewaschen. Das Blatt
wurde dann an der Luft getrocknet, 1 Stunde lang in einem
Vakuumofen bei 80ºC getrocknet und fünf Tage lang
autoradiographiert.
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Aus den Southern Blot-Daten waren die Größen von acht
Methylase-codierenden Fragmenten bekannt. Es wurden
Versuche unternommen, um das 5,5 kb Cla I-, das 3,8 kb Fsp I-,
das 6 kb Pvu II-, das 8 kb Pst I- und das 3 kb Sal
I-Fragment zu klonieren. Die anderen drei bekannten Fragmente
(Bamh I, Nru I, Acc I) wurden nicht weiterverfolgt und die
verbleibenden Banden wurden als zu groß beurteilt, um
kloniert zu werden.
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13. Anfangs wurden drei Bibliotheken (Cla I, Fsp I und Pvu
II) konstruiert und durch dieselben Verfahren wie in den
Schritten 1 - 8 selektiert, mit den folgenden
Modifikationen bei den Schritten 2 & 3: 60 ul (30 ug) chromosomale Nco
I-DNA wurden in 300 ul 10 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50
mM NaCl, 10 mM Mercaptoethanol, welche 75 Einheiten Cla I,
38 Einheiten Fsp I oder 150 Einheiten Pvu II enthielten, 2
Stunden lang bei 37ºC vollständig verdaut. Mit dem gesamten
Volumen wurde 5 Stunden lang in einem 1 %igen Agarosegel,
das 0,01 % SDS enthielt, eine Elektrophorese durchgeführt.
Unter Verwendung von langwelligem UV-Licht, um das Gel
anzuschauen, wurden die Fragmente innerhalb des
Größenbereichs der bekannten Größe des Methylasegen-enthaltenden
Fragmentes aus dem Gel ausgeschnitten und mit einer
sauberen Rasierklinge zerstückelt. Die Mischung wurde durch eine
22 Gage-Spritze in 5 ml 1
x Agarosegel-Puffer, welcher 0,01
% SDS enthielt, gepreßt und 45 Minuten lang bei 17 K UpM
zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 0,5 ml 5 M NaCl und
1,1 ml Isopropanol über Nacht bei -20ºC gefällt. Die DNA
wurde 15 Minuten lang bei 15 K UpM pellettiert. Das Pellet
wurde in 500 ul 10 mM Tris pH 8, 1 mM EDTA resuspendiert,
mit Phenol/Chloroform extrahiert, dreimal mit Chloroform
extrahiert und wieder mit 48 ul 5 M NaCl und 1100 ul
Isopropanol drei Stunden lang bei -20ºC gefällt. Das Pellet
wurde mit 70 %igem Isopropanol gespült und an der Luft
getrocknet und in einem Endvolumen von 100 ul 10 mM Tris pH
8, 1 mM EDTA resuspendiert. Um die Fragmente weiter zu
reinigen wurden die 100 ul 30 Minuten lang auf einem Millipore
VS 0,025 mM Filter, welcher oben auf 10 mM Tris, 1 mM EDTA,
pH 8 schwamm, einer Tropfendialyse unterworfen.
-
15 ul (0,5 ug) Fsp I oder Pvu II DNA-Fragmente wurden mit
1,2 ul (0,25 ug) mit EcoR V gespaltenem und
dephosphoryliertem pBR328 in 70 ul 1 X Ligationspuffer, welcher 3 ul
konzentrierte T4-DNA-Ligase (6000 Einheiten) enthielt, 4
Stunden lang bei 16ºC ligiert. 40 ul (1 ug) Cla I-DNA wurde
mit 1,8 ul (0,5 ug) mit Cla 1 gespaltenem pBR328 in 70 ul 1
X Ligationspuffer, welcher 1,2 ul (2400 Einheiten)
konzentrierte Ligase enthielt, 4 Stunden lang bei 16ºC und dann
über Nacht bei Raumtemperatur ligiert. Alle 70 ul wurden in
RR1 transformiert.
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14. Identifizierung von neuen Cla I-, Fsp I- und Pvu II-
Methylaseklonen, welche einen größeren Bereich an DNA
stromaufwärts des Methylasegens enthielten: Es wurde
gefunden, daß der einzige Cla I-Überlebende aus Schritt 13 das
Methylase-codierende (M+) 5,5 kb Cla I-Fragment enthielt;
es wurde gefunden, daß 7 von 8 Fsp I-Überlebenden das 3,8
kb Fsp I M+-Fragment enthielten und es wurde gefunden, daß
9 von 12 Pvu II-Überlebenden das 6 kb Pvu II M+-Fragment
enthielten. Diese Klone überlappten mit dem ursprünglichen
Bcl I-Klon, wie in Figur 3 gezeigt, und es wurde gefunden,
daß sie, wenn sie mit dem Promotor des Plasmides
übereinstimmend
ausgerichtet (in line) waren, vollständig
modifiziert waren. Es wurde keine
Restriktionsendonukleaseaktivität nachgewiesen.
-
Von den neuen Klonen, welche > 1,3 kb DNA stromaufwärts des
M-Gens enthielten, wurde angenommen, daß sie
möglicherweise, aber nicht sicher, genügend DNA enthielten, um ein 1 kb
Restriktionsendonukleasegen zu codieren, wenn es
stromaufwärts des Methylasegens mit diesem verbunden wäre. Daher
wurden Versuche unternommen, das 3 kb Sal I- und das 8 kb
Pst I-Fragment zu klonieren, da die Sal I- und Pst I-Klone
größere Mengen an stromaufwärts liegender DNA enthalten
würden. Spezielle Vektoren mußten entworfen werden, um
diese Fragmente zu klonieren, da sie nur die Hälfte des M-
Gens enthielten. Die Vektoren wurden so entworfen, daß sie
die andere Hälfte enthielten, so daß das M-Gen
zurückgebildet wurde, wenn das gewünschte Fragment in den
Klonierungsvektor ligiert wurde, und das Plasmid war in der Lage, sich
selbst zu modifizieren und eine Methylaseselektion zu
überleben.
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Es wurde gefunden, daß der Sal I-Klon, welcher ≥ 2 kb DNA
stromaufwärts des M-Gens enthält, nur teilweise modifiziert
war. Man nimmt an, daß dieses auf einem erhöhten Abstand
des M-Gens von dem Promotor des Plasmides beruht.
Übereinstimmend mit dieser Annahme ist die Beobachtung, daß das
Pst I-Fragment nicht kloniert wurde, vermutlich da das Pst
I-Fragment ca. 7 kb stromaufwärts liegende DNA enthält, was
das M-Gen sogar noch weiter von dem Promotor des Plasmides
entfernt. Ein solches Plasmid würde möglicherweise das M-
Gen nicht gut genug exprimieren, um sich selbst zu
modifizieren und würde nicht leicht eine Methylaseselektion
überleben. Nichtsdestotrotz wurden keine Versuche unternommen,
das Pst I-Fragment zu klonieren, da angenommen wurde, daß
der Sal I-Klon genügend Platz enthielt (≥ 2 kb), um das R-
Gen zu codieren, wenn es stromaufwärts des M-Gens mit
diesem verbunden wäre.
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15. Mit der Gewinnung dieser neuen Klone war nun genügend
DNA auf beiden Seiten des Methylasegens kloniert, um ein
Restriktionsendonukleasegen, wenn es damit verbunden wäre,
zu codieren, unabhängig davon welche Seite das verbundene
Gen codierte. Jedoch exprimierte keiner dieser Klone
irgendeine Restriktionsendonukleaseaktivität. Mit immer
noch keinem Beweis, daß die zwei Nco
I-Restriktions-Modifikationsgene verbunden waren, wurde die Nco
I-Restriktionsendonuklease wie folgt so homogen wie möglich gereinigt:
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Nach Aufbrechen von 566 Gramm N. corallina durch eine
French-Presse wurden die 2,2 Liter Überstand in der
folgenden Reihenfolge auf Chromatographiesäulen aufgetragen:
DEAE-Cellulose, Heparin-Sepharose, Phosphocellulose, DEAE-
Cellulose, Phosphocellulose, polyCAT A-FPLC, mono Q-FPLC
und mono S-FPLC. Die resultierende Präparation wies über 95
% reine Nco I-Restriktionsendonuklease mit einer Größe von
ca. 32.000 Dalton auf, wie durch SDS-PAGE-Elektrophorese
bestimmt wurde.
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Ungefähr 33 ul (1,5 ug, 50 pmol) der gereinigten Nco I-
Restriktionsendonuklease wurden auf drei Bahnen eines SDS-
10 - 20 % Polyacrylamid-Gradientengels aufgetragen und 3
Stunden lang bei 100 Volt einer Elektrophorese unterworfen.
Das Gel wurde dann 12 Stunden lang bei 200 mA durch
Elektroblot auf eine PVDF (Immobilon, Millipore) Membran
übertragen (Matsudaira, 1987). Die Membran wurde mit Coomassie
Blue R-250 gefärbt und die mittlere Bande, welche der Nco
I-Restriktionsendonuklease entsprach, wurde mit einer
Rasierklinge ausgeschnitten. Die Banden wurden in 0,5 mm-
Intervallen bis zu einem kammähnlichen Aussehen mehrfach
eingeschnitten, um die Effizienz des Anfeuchtens durch die
Sequenator-Reagenzien zu maximieren. Die Banden wurden zum
Sequenzieren auf einem Applied Biosystems Modell 470A
Gasphasen-Proteinsequenziergerät, welches zum PTH-Nachweis
eine Online-HPLC 120a benutzte, verwendet. Dreißig
Aminosäurereste wurden wie folgt sequenziert:
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Alanin - Threonin - Alanin - Prolin - Glycin- Histidin
- Leucin - Leucin - Glycin - Glutamin - Isoleucin - Isoleucin
- Glycin - Asparagin - Valin - Methionin - Glutaminsäure
- Glutaminsäure - Alanin - Leucin - Lysin - Prolin - Valin
- Leucin - Glutamin - Glutaminsäure - Methionin - Alanin
- Asparaginsäure - Arginin.
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16. Identifizierung von Restriktionsgenklonen: Basierend
auf der obigen Sequenz wurde durch die organische
Syntheseabteilung von New England Biolabs eine 17-mer
DNA-Oligosonde mit 32-facher Entartung konstruiert:
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AA(C,T)GTNATGGA(G,A)GA(G,A)GC, wobei N = G, A, T oder C war
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Nur einige Aminosäurereste wurden zur Translation in eine
DNA-Sequenz ausgewählt, da ihre DNA-Sequenz die geringste
Entartung aufwies.
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Der ursprüngliche Bcl I-Klon, welcher ca. 4 kb DNA
stromabwärts des M-Gens enthielt, und der nachfolgende Sal I-Klon,
welcher ca. 2 kb DNA stromaufwärts des M-Gens enthielt,
wurden mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen verdaut
und ähnlich wie in dem oben beschriebenen Verfahren
(Schritt 12) auf Nitrocellulose geblottet. Das DNA-17-mer
wurde in 26 ul wie folgt kinasiert: 2,5 ul 10 X
Kinasepuffer (700 mm Tris-HCl pH 7,6, 100 mM MgCl&sub2;, 50 mM DTT, 2,6
mM 5'-hydroxylterminierte Lachssperma-DNA), 5 ul 14-mer (1
O.D./ml), 12,5 ul dH&sub2;O, 5 ul gamma P³²ATP (50 uCi) und 1 ul
Kinase (10 Einheiten) 1,3 Stunden bei Raumtemperatur. Das
gesamte Volumen wurde zu dem vorhybridisierten Blot
zugegeben und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Der Blot
wurde gewaschen und wie in Schritt 12 beschrieben
exponiert. Die Ergebnisse zeigten, daß das Oligomer mit einer
bestimmten Stelle auf den Bcl I- und Sal I-Klonen
hybridisierte,
was erlaubte, daß die Lage des Anfangs des Nco I-
Restriktionsendonukleasegens innerhalb einer bestimmten 300
Basenpaar-Region in der klonierten DNA genau festgelegt
wurde (siehe Figur 2: das Oligomer hybridisierte zwischen
der Nru I- und der Msc I-Stelle). Dieses war ein indirekter
aber stichhaltiger Beweis, daß die Nco
I-Restriktions-Modifikationsgene verbunden sind und vollständig auf dem Bcl I-
Klon und teilweise auf dem Sal I-Klon zusammen kloniert
sind.
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17. Eine DNA-Sequenzierung bestätigte die Gegenwart des R-
Gens und zeigte, daß es so orientiert ist, wie in den
Figuren 2 und 3 gezeigt ist.
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18. Überexpression: ein Anordnen des starken Promotors pL
500 bp vor dem Restriktionsgen führte nicht zu einer
Expression. Daher wurde die DNA am Anfang der
Restriktionsendonuklease sequenziert und die Information wurde
verwendet, um den Anfang des R-Gens zu rekonstruieren, um seinen
natürlicherweise vorkommenden GTG-Start zu einem ATG-Start
zu verändern, da ATG von E. coli leichter benutzt wird. Die
RBS und der Promotor wurden ebenfalls durch solche ersetzt,
die von E. coli erkannt werden. Das rekonstruierte R-Gen
pEV190R 612-22C-29 wurde durch Transformation in API 200-
Zellen identifiziert (es wurde gefunden, daß diese Zellen
in der Gegenwart von X-Gal blau werden, wenn das R-Gen
exprimiert). Das Plasmid wurde dann in den Stamm ER1451
transformiert, welcher pEV190M302,325-1 enthielt. Das
Plasmid pEV190M302,325-1 enthält das klonierte Nco
I-Methylasegen und prämodifiziert ER1451. Ein Probe von ER1451, welche
beide Plasmide enthält, wurde am 1. November 1990 bei der
American Type Cultur Collection unter der ATCC-Zugriffsnr.
68457 hinterlegt. In ER1451 wird eine maximale Aktivität
(500.000 Einheiten pro Gramm) erhalten, wenn IPTG zugegeben
wird. Es wurde entdeckt, daß das überexprimierte R-Gen
nicht in den Stamm RR1 transformiert werden kann, selbst
wenn dieser durch die Nco I-Methylase vormodifiziert wurde,
da RR1 nicht durch IPTG reguliert wird und die
Aktivitätsniveaus toxisch sind.
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19. Die Nco I-Modifikationsmethylase oder Endonuklease
kann durch Vermehrung in einem Fermenter in einem
Vollmedium, welches Ampicillin und Chloramphenicol enthält, aus
Klonen hergestellt werden, die das Nco I-Modifikationsgen
und das überexprimierte Restriktionsgen enthalten. Die
Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und durch
Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt zu
erzeugen, welcher Nco I-Methylase- und
Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
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20. Der rohe Zellextrakt, welcher die Nco I-Methylase und
Endonuklease enthält, wird durch
Standard-Produktreinigungstechniken, wie z.B. Affinitätschromatographie oder
Ionenaustauschchromatographie gereinigt.