DE69402563T2

DE69402563T2 - Für die Not I Restriktionsendonuklease kodierende, isolierte DNA und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE69402563T2
Application number: DE69402563T
Authority: DE
Inventors: Jack Stanley Benner; Toby Elizabeth Claus; Richard David Morgan
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1993-01-11
Filing date: 1994-01-11
Publication date: 1997-12-18
Anticipated expiration: 2014-01-12
Also published as: US5371006A; JPH06277070A; EP0607005A3; JP2005046153A; EP0607005A2; DE69402563D1; DE607005T1; EP0607005B1; JP4040112B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, welche die Not I-Restriktionsendonuklease und -Modifikationsmethylase codiert, sowie die Herstellung dieser Enzyme aus der rekombinanten DNA.
Restriktionsendonukleasen sind eine Klasse von Enzymen, welche natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen verunreinigenden bakteriellen Bestandteilen gereinigt werden, können Restriktionsendonukleasen im Labor verwendet werden, um DNA-Moleküle in präzise Fragmente zu zertrennen. Diese Fähigkeit ermöglicht DNA-Molekülen, eindeutig identifiziert zu werden und in ihre aufbauenden Gene fraktioniert zu werden. Restriktionsendonukleasen haben sich als unentbehrliche Werkzeuge der modernen genetischen Forschung erwiesen. Sie sind die biochemischen "Scheren", mittels derer Gentechnologie und -analyse durchgeführt werden.
Restriktionsendonukleasen wirken, indem sie bestimmte Nukleotidsequenzen (die "Erkennungssequenz") entlang des DNA-Moleküls erkennen und daran binden. Wenn sie gebunden sind, spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite der Erkennungssequenz. Verschiedene Restriktionsendonukleasen haben eine Affinität für verschiedene Erkennungssequenzen. Mehr als einhundert verschiedene Restriktionsendonukleasen sind unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies, die bis heute untersucht wurden, identifiziert worden.
Bakterien neigen dazu, nur eine kleine Anzahl von Restriktionsendonukleasen pro Spezies zu besitzen. Die Endonukleasen werden typischerweise nach den Bakterien benannt, aus welchen sie stammen. So synthetisiert beispielsweise die Spezies Neisseria lactamica vier verschiedene Restriktionsendonukleasen, welche NlaI, NlaII, NlaIII und NlaIV genannt werden. Diese Enzyme erkennen und spalten die Sequenzen GGCC, GATC, CATG bzw. GGNNCC. Andererseits synthetisiert Escherichia coli RY13 nur ein Enzym, EcoRI, welches die Sequenz GAATTC erkennt.
Während man nicht durch eine Theorie gebunden werden möchte, wird angenommen, daß Restriktionsendonukleasen in der Natur eine schützende Rolle für das Wohlergehen der Bakterienzelle spielen. Sie ermöglichen Bakterien, einer Infektion durch fremde DNA-Moleküle wie Viren und Plasmide zu widerstehen, welche sie andernfalls zerstören oder parasitieren würden. Sie verleihen eine Resistenz, indem sie die Länge des infizierenden DNA-Moleküls abtasten und dieses jedesmal spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Die Spaltung, welche stattfindet, zerstört viele der infizierenden Gene und macht die DNA anfällig für einen weiteren Abbau durch nichtspezifische Nukleasen.
Ein zweiter Bestandteil von bakteriellen Schutzsystemen sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonukleasen und stellen das Mittel zur Verfügung, durch welches Bakterien in der Lage sind, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden an dieselbe Nukleotiderkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuklease, aber anstatt die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das eine oder andere der Nukleotide innerhalb der Sequenz durch die Zufügung einer Methylgruppe. Nach der Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht länger durch die Restriktionsendonuklease gebunden oder gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle ist mittels der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase vollständig modifiziert und ist daher unempfindlich gegenüber der Gegenwart der endogenen Restriktionsendonuklease. Es ist nur unmodifizierte, und daher identifizierbar fremde DNA, welche gegenüber einer Erkennung und Spaltung der Restriktionsendonuklease empfindlich ist.
Mit dem Aufkommen der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine, welche sie codieren, in größeren Mengen herzustellen, als sie durch herkömmliche Reinigungstechniken erhältlich waren. Der Standardansatz, um interessierende Klone (Restriktionsendonukleasegene) zu isolieren, ist es, ein einfaches und verläßliches Verfahren zu entwickeln, um solche Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, welche durch "Schrotschuß"-Verfahren abgeleitet wurden, zu identifizieren, wenn sie mit Häufigkeiten auftreten, welche so niedrig wie 10&supmin;³ bis 10&supmin;&sup4; sind. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so daß die unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die gewünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme von Typ II werden mit wachsender Häufigkeit kloniert. Bei den ersten klonierten Systemen verwendete man eine Bakteriophageninfektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektionieren von Restriktionsendonukleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178: 717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503-1507 (1981)). Da die Gegenwart von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diesen ermöglicht, einer Infektion durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, welche klonierte Restriktionsmodifikationsgene tragen, im Prinzip selektiv als Überlebende aus Bibliotheken isoliert werden, welche einem Phagen ausgesetzt wurden. Es wurde jedoch gefunden, daß dieses Verfahren nur einen begrenzten Wert hat. Insbesondere wurde gefunden, daß klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer eine ausreichende Phagenresistenz verleihen, um ein selektives Überleben zu ermöglichen.
Ein anderer Klonierungsansatz umfaßt ein Übertragen von Systemen, welche anfänglich als plasmidgetragen charakterisiert wurden, in E. coli-Klonierungsplasmide (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501-509 (1985)).
Ein dritter Ansatz, welcher verwendet wird, um eine wachsende Anzahl von Systemen zu klonieren, umfaßt die Selektion auf ein aktives Methylasegen (siehe z.B. EPA Nr.: 193,413, veröffentlicht am 3. September 1986, und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13: 6403-6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng verknüpft sind, können beide Gene oft gleichzeitig kloniert werden. Diese Selektion ergibt jedoch nicht immer ein vollständiges Restriktionssystem, sondern liefert stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235-1241 (1983)).
Bei einigen Systemen können Probleme entstehen, wenn versucht wird, das Endonukleasegen in einen Wirt einzuführen, welcher noch nicht durch Modifikation geschützt ist. Wenn das Methylasegen und das Endonukleasegen auf einem gemeinsamen DNA-Fragment eingeführt werden, muß das Methylasegen den Wirt modifizieren oder schützen, bevor das Endonukleasegen das Genom des Wirts spaltet.
Ein weiteres Hindernis beim Klonieren von Restriktionsmodifikationssystemen in E. coli wurde im Verlauf des Klonierens von verschiedenen Methylasen entdeckt. Viele E. coli-Stämme (einschließlich jener, welche normalerweise beim Klonieren verwendet werden) haben Systeme, die sich der Einführung von DNA, welche eine Cytosinmethylierung aufweist, widersetzen. (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9074 (1986)). Daher ist es ebenfalls nötig, sorgfältig zu erwägen, welcher E. coli-Stamm (Stämme) beim Klonieren verwendet wird.
Ein anderes potentielles Problem ist, daß einige Restriktionsendonuklease- und Methylasegene aufgrund von Unterschieden in der Transkriptionsmaschinerie des Ursprungsorganismus und E. coli, wie z.B. Unterschieden bei Promotoren und Ribosomenbindungsstellen, nicht exprimieren. Die Methylaseselektionstechnik erfordert, daß die Methylase ausreichend gut in E. coli exprimiert wird, um wenigstens einige der Plasmide, welche das Gen tragen, vollständig zu schützen.
Da gereinigte Restriktionsendonukleasen, und in einem geringeren Ausmaß Modifikationsmethylasen, nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren und Umordnen von DNA im Labor sind, besteht ein kommerzieller Ansporn, Bakterienstämme durch rekombinante DNA-Techniken zu erhalten, welche diese Enzyme im Überschuß synthetisieren. Solche Stämme wären nützlich, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen würden, wie auch das Mittel zur Produktion in kommerziell nützlichen Mengen zur Verfügung stellen würden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, welche die Gene für die NotI-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase, welche aus Nocardia otitidis-caviarum (ATCC 14630) erhältlich sind, codiert, sowie entsprechende Verfahren zur Herstellung dieser Enzyme aus der rekombinanten DNA. Die bekannten Verfahren zur Klonierung von Restriktionsendonukleasegenen waren beim Klonieren der NotI-Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylasegene nicht erfolgreich. Zahlreiche Versuche wurden mit dem sehr erfolgreichen Verfahren des Selektionierens nach einem aktiven Methylasegen wie auch dem Phagenselektionsverfahren unternommen. Es ist jetzt bekannt, daß diese Verfahren nicht funktionieren, da weder das Methylase- noch das Endonukleasegen exprimiert wird, wenn die obigen Verfahren verwendet werden. Daher war ein neuer Ansatz nötig, um die NotI-Endonuklease- und Methylasegene zu klonieren. Das neue Verfahren umfaßt ein Reinigen der NotI-Restriktionsendonuklease bis zur Homogenität und ein Bestimmen der Aminosäuresequenz des N-terminalen Endes und von inneren Fragmenten des Proteins aus einem Cyanbromid-Abbau. Die Aminosäuresequenz wird verwendet, um PCR-Primer herzustellen, um einen Teil der Endonuklease direkt aus dem N. otitidis- caviarum-Genom zu amplifizieren, welcher dann als eine Sonde dient, um Klone zu identifizieren, welche das gesamte Gen enthalten.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls einen transformierten Wirt, welcher die Restriktionsendonuklease NotI exprimiert, ein Enzym, welches die DNA-Sequenz 5'-GCGGCCGC-3' erkennt und in der Erkennungssequenz zwischen dem ersten CG-Paar spaltet, wobei ein 5'-Überhang von 4 Basen zurückbleibt (Roberts, R., Nucl. Acid Res., Ergänzung 13: 165 (1985)). Die NotI-Restriktionsendonuklease, welche gemäß der vorliegenden Erfindung erzeugt wird, ist im wesentlichen rein und frei von Verunreinigungen, welche normalerweise in Restriktionsendonukleasepräparationen gefunden werden, die durch herkömmliche Techniken erhalten wurden, wie in Schritt 2 von Beispiel 1 beschrieben ist. Ein bevorzugtes Verfahren zum Klonieren des NotI-Restriktionsmodifikationssystems umfaßt: Reinigen der Endonuklease aus N. otitidis-caviarum fast bis zur Homogenität, Bestimmen der Aminosäuresequenz des N-Terminus und innerer Cyanbromidabbaufragmente, Erzeugen von degenerierten DNA-Primern basierend auf den Aminosäuresequezen, Amplifizieren eines Bereichs der Endonuklease aus der genomischen N. otitidis- caviarum-DNA mit den degenerierten Primern, Auswählen eines geeigneten Vektors, Bilden einer Bibliothek, welche DNA aus N. otitidis-caviarum enthält, Isolieren jener Klone, welche DNA enthalten, die mit der amplifizierten DNA, die einem Teil der Endonuklease entspricht, hybridisiert, Sequenzieren der klonierten DNA, um die DNA-Sequenz am Anfang der Endonuklease zu bestimmen und um die benachbarte Methylase (die NotI-Methylase) zu identifizieren, Amplifizieren der gesamten Endonuklease durch PCR und Ligieren von dieser in einen Expressionsvektor, beginnend mit dem Noll-AUG-Startcodon, Vormodifizieren einer geeigneten Wirtzelle mit EagI- Methylase ( -CGGCCG- ) auf einem separaten kompatiblen Vektor, Einführen des obigen ligierten Expressionsvektors, welcher das NotI-Endonukleasegen enthält, in den vormodifizierten Wirt, Kultivieren des Wirtes und Induzieren mit den geeigneten Expressionsbedingungen, Ernten der Zellen und Reinigen der NotI-Endonuklease.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 stellt das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und Produzieren der NotI-Restriktionsendonuklease dar. Zu Beginn des Klonierungsprojektes war nicht bekannt, welche Strategien oder Bedingungen beim Klonieren des NotI- Restriktionsmodifikationssystems erfolgreich sein würden. Tatsächlich ergab der Methylaseselektionsansatz keine NotI- Methylase- (oder Endonuklease-)klone. Die Proteinsequenzierung, DNA-Amplifikation und die Klonierungsergebnisse, sowie die nachfolgende DNA-Sequenzierung, Kartierung und Charakterisierung der Klone, welche in Figur 1 und Beispiel 1 beschrieben sind, zeigen den vorher unbekannten direkten Weg zum Klonieren und Exprimieren des NotI-Restriktionsmodifikationssystems.
Figur 2 ist eine Restriktionskarte des 14,5 kb-BamHI- Fragmentes aus N. otitidis-caviarum-DNA, welches durch die Hybridisierung des amplifizierten Teils des NotI-Endonukleasegens mit der BamHI-Lambda Dash II-Bibliothek erhalten wurde. Die Lage und Orientierung der NotI-Endonuklease- und Methylasegene sind angegeben.
Figur 3 ist eine Restriktionskarte des überexprimierenden Klons pRM189-1.
Figur 4 ist die DNA-Sequenz des 5'-Endes des NotI- Restriktionsendonukleasegens.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, welche die NotI-Restriktionsendonuklease codiert, wie auch das Enzym, das mit einer solchen rekombinanten DNA hergestellt wird.
Das Klonieren des NotI-Restriktionsendonukleasegens aus Nocardia otitidis-caviarum erwies sich als ungewöhnlich schwierig. Durch das Standardmethylaseselektionsverfahren wurden keine Methylaseklone erhalten, obwohl sogar viele verschiedene Bibliotheken konstruiert und gescreent wurden. Dieses scheint auf einem Versagen der NotI-Methylase zu beruhen, in E. coli auf einem Niveau exprimiert zu werden, welches einen Schutz verleihen würde. Der Phagenselektionsansatz wurde ebenfalls ohne Erfolg versucht. Diese Ergebnisse sind konsistent mit den beobachteten Unterschieden bei der Transkriptionsmaschinerie zwischen Nocardia und E. coli. Ein Klonieren der NotI-Endonuklease erforderte daher einen neuen Ansatz.
Das Endonukleaseprotein wurde fast bis zur Homogenität gereinigt und verwendet, um die Aminosäuresequenz von Teilen des Proteins zu bestimmen. Die N-terminale Aminosäuresequenz wurde bestimmt, und die Endonuklease wurde mit Cyanbromid verdaut, was vier größere Peptidfragmente mit ungefähr 24 kD, 10 kD, 4 kD und 3 kD in der Größe erzeugte. Eine zweifelsfreie Aminosäuresequenz wurde für die Fragmente mit 24 kD, 10 kD und 4 kD bestimmt, während das 3 kD- Peptid ein gemischtes Signal ergab. Es wurde gefunden, daß das 24 kD-Peptid das N-terminale Fragment der Endonuklease ist. Es wurden degenerierte DNA-Primer auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs und des 10 kD-Fragmentes synthetisiert und verwendet, um diesen Teil des Endonukleasegens aus der genomischen N. otitidis-caviarum-DNA durch PCR zu amplifizieren. Das amplifizierte DNA- Fragment mit ungefähr 680 bp wurde in pUC19 subkloniert und sequenziert. Die Aminosäuresequenz, welche von der DNA- Sequenz dieses PCR-Fragmentes abgeleitet wurde, stimmte mit der Aminosäuresequenz der NotI-Endonuklease überein, welche aus dem N-terminalem (24 kD), dem 10 kD- und 4 kD-Peptid bestimmt wurde, was bestätigte, daß dieses DNA-Fragment einen Teil des NotI-Endonukleasegens darstellt. Eine Bibliothek der N. otitidis-caviarum-DNA wurde in einem Lambda Dash-Vektorsystem konstruiert, um Klone zu erzeugen, welche 9 bis 23 kb-Inserts der N. otitidis-caviarum-DNA enthielten. Das 680 bp-Fragment des Endonukleasegens wurde als eine Sonde verwendet, um Lambda Dash-Klone zu identifizieren, welche diesen Teil des Endonukleasegens enthielten. Diese Lambda-Klone wurden gereinigt und es wurde gefunden, daß alle ein 14,5 kb-BamHI-Fragment enthielten. Die Lage der Sonde wurde auf dem BamHI-Fragment ungefähr bei Position 8200 bis 8900 kartiert. Dieses Ergebnis zeigte, daß möglicherweise das gesamte Endonukleasegen vorhanden war, da die Klone ungefähr 8200 bp auf einer Seite der Sonde und ungefähr 5600 bp auf der anderen Seite enthielten. Das 14,5 kb-BamHI-Fragment wurde in pUC19 subkloniert und auf NotI- Endonuklease und Methylase hin getestet; es wurde aber keine Aktivität nachgewiesen. Dieses Ergebnis legt nahe, daß die Endonuklease- und Methylasegene nicht in E. ccli exprimiert werden, wenn die ursprüngliche Nocardia-DNA stromaufwärts der Gene an Ort und Stelle bleibt. Die DNA, welche an den Seiten der Sonde lag, wurde sequenziert, und die genaue Nukleotidsequenz am N-Terminus des Endonukleasegens wurde bestimmt. DNA-Primer wurden entworfen, um das gesamte NotI-Endonukleasegen zu amplifizieren, ausgehend von dem N-terminalen Ende des NotI-Gens, wobei eine NdeI- Stelle an dem ATG-Startcodon (-CATATG-) eingeführt wurde, bis zu einer SalI-Stelle ungefähr 500 bp 3' von dem Ende des NotI-Gens. Das gesamte Gen wurde sowohl von dem 14,5 kb-BamHI-Plasmid als auch von der genomischen N. otitidis- caviarum-DNA amplifiziert. Die amplifizierte DNA wurde durch NdeI- und SalI-Endonukleasen gespalten und in den T7- Expressionsvektor pSYX22 ligiert, welcher vorher mit SalI und NdeI gespalten worden war. Die Ligationsreaktion wurde in kompetente ER2169-Zellen transformiert, welche mit der EagI-Methylase (-CGGCCG-) auf dem kompatiblen Plasmid pACYC184 vormodifiziert worden waren. Vektoren, welche Inserts der gewünschten Größe enthielten, wurden durch Miniprepverfahren identifiziert. Diese Klone wurden bis zu der mittleren logarithmischen Phase kultiviert und mit IPTG induziert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet, in Beschallungspuffer resuspendiert und durch Beschallung lysiert. Der Extrakt wurde aufgeklart und auf NotI-Endonukleaseaktivität hin getestet. Klone, die von der genomischen N. otitidis-caviarum-DNA und von dem Plasmid mit dem 14,5 kb-BamHI-Fragment abgeleitet worden waren, erzeugten NotI-Aktivität mit 5.000.000 Einheiten pro Gramm an Zellen (Naßgewicht).
Das hierin beschriebene Verfahren, durch welches das NotI-Restriktionsgen vorzugsweise kloniert und exprimiert wird, ist in Figur 1 dargestellt und umfaßt die folgenden Schritte:
1. Die DNA von Nocardia otitidis-caviarum wird gereinigt.
2. Das NotI-Restriktionsendonukleaseprotein wird durch Standardproteinreinigungstechniken bis zur Homogenität gereinigt.
3. Die N-terminale Aminosäuresequenz der gereinigten NotI-Endonuklease wird bestimmt. Die gereinigte NotI-Endonuklease wird mit Cyanbromid verdaut, um innere Peptidfragmente zu erzeugen, und die Aminosäuresequenz dieser Fragmente wird bestimmt.
4. Degenerierte DNA-Primer werden auf der Grundlage der Aminosäuresequenz des N-Terminus und eines inneren Peptidfragmentes synthetisiert. Diese Primer werden verwendet, um einen Teil des Endonukleasegens aus der N. otitidis-caviarum-DNA durch PCR-Techniken zu amplifizeren.
5. Die N. otitidis-caviarum-DNA wird vollständig und/oder teilweise mit einer Restriktionsendonuklease wie beispielsweise BamHI oder irgendeiner ihrer Isoschizomere verdaut, welche so spaltet, daß ein Fragment (Fragmente) erzeugt wird, das in Lambda Dash II oder einen ähnlichen Vektor klonierbar ist, welches das gesamte NotI-Endonukleasegen enthält.
6. Die verdauten DNAs werden in den Lambdaphagen-Klonierungsvektor ligiert. Die resultierenden Mischungen werden in vitro verpackt und verwendet, um einen geeigneten Wirt, wie z.B. den E. coli-Stamm ER1458 (erhältlich von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) zu infizieren. Der Titer des infektiösen Phagen wird bestimmt, indem ein Teil des verpackten Phagen plattiert wird und die resultierenden Plaques gezählt werden.
7. Der in vitro verpackte Phage wird vorzugsweise mit unterschiedlichen Dichten auf einem Weichagarrasen eines geeigneten E. coli-Wirts wie z.B. ER1458 auf Vollmedium plattiert. Nach einer Inkubation werden Phagen, die das NotI-Endonukleasegen enthalten, durch eine Benton-Davis- Southernhybridisierung identifiziert, indem der durch PCR abgeleitete Teil der NotI-Endonuklease als eine Sonde gegenüber Nitrocellulosefilteranhebungen (lifts) der Plaques verwendet wird. Positive Plaques werden von den Platten entfernt und durch mehrere aufeinanderfolgende Runden von Plattierung und Hybridisierung gereinigt.
8. Um die Lage des NotI-Endonukleasegens auf den obigen Klonen zu bestimmen, und damit, ob die Klone genügend DNA enthalten, um das gesamte Endonukleasegen und ebenso irgendein benachbartes Methylasegen zu codieren, wird das klonierte Fragment restriktionskartiert, und die Lage des N-terminalen Teils des Endonukleasegens wird durch Southernhybridisierung mit verschiedenen Restriktionsverdaus der Klone bestimmt, indem dieselbe Sonde wie oben verwendet wird. Wenn genügend DNA vorliegt, um das gesamte Restriktionsgen zu codieren, geht es mit Schritt 9 weiter. Wenn nicht genügend DNA auf der 3'-Seite der Sonde vorhanden ist, um das vollständige Restriktionsgen zu codieren, werden weitere Klone gescreent und/oder eine andere Bibliothek von Klonen hergestellt.
Die N. otitidis-caviarum-DNA-Inserts in den Lambda Dash-Vektoren können in einen Plasmidvektor wie beispielsweise pUC19 (ATCC Nr. 37254) subkloniert werden, um ein Kartieren und eine genetische Manipulation des Inserts zu vereinfachen und um zu bestimmen, ob die Klone entweder NotI-Endonuklease oder Methylase produzieren. Bei der vorliegenden Erfindung produzierten die Klone des 14,5 kb- BamHI-Fragmentes in vitro in keiner Orientierung in pUC19 nachweisbare Mengen an NotI-Endonuklease. Das Fragment enthielt ebenfalls 4 NotI-Stellen, welche in vitro alle vollständig durch NotI gespalten wurden, was zeigt, daß es keine in vivo-NotI-Methylaseaktivität gab.
9. Die DNA einschließlich und benachbart zu dem N-Terminus bis zu der inneren 10 kD-Cyanbromidfragmentsonde wird sequenziert, um die Orientierung des Gens und die genaue DNA-Sequenz an dem N-Terminus des Gens zu bestimmen und dieses auf die Gegenwart eines Cytosinmethylasegens benachbart zu dem NotI-Endonukleasegen hin zu prüfen.
10. Überexprimieren des NotI-Endonukleasegens: Es gibt eine Anzahl von Wegen, auf welchen der Klon, der das Restriktionsgen enthält, überexprimiert werden kann. Die DNA-Sequenz und eine detaillierte Kartierung hilft bei der Bestimmung des besten Ansatzes zur Überexpression des Restriktionsendonukleasegens. Ein Ansatz zur Überexpression umfaßt ein Entwerfen von Primern, welche direkt an dem N- Terminus des Restriktionsendonukleasegens und irgendwo stromabwärts des Restriktionsendonukleasegens hybridisieren, um die Polymerasekettenreaktion zu verwenden, um das gesamte Restriktionsendonukleasegen zu amplifizieren. Das resultierende DNA-Fragment kann gespalten werden, um die gesamte Nocardia-DNA, welche vor dem Endonukleasegen liegt, zu entfernen, und kann unmittelbar stromabwärts eines induzierbaren Promotors wie beispielsweise T7 in einen Expressionsvektor wie beispielsweise pSYX22 eingefügt werden. Alternativ kann eine Überexpression erreicht werden, indem ein Promotor unmittelbar vor dem Anfang des Restriktionsendonukleasegens eingefügt wird, welcher in hohem Maße durch E. coli erkannt wird, wie beispielsweise Ptac in pAGR3 (erhältlich von New England Biolabs). Dieses kann erreicht werden, indem geeignete Restriktionsstellen nahe dem Anfang und Ende des Restriktionsendonukleasegens und kompatible Restriktionsstellen nahe dem Promotor von pAGR3 gefunden werden und das Restriktionsgen in gleicher Ausrichtung wie der Ptac-Promotor in pAGR3 übertragen wird. Andere regulierbare Promotoren, welche verwendet werden können, sind PlacUV5 (Fuller, Gene 19: 43-54 (1982)) und λPL (Shimatake und Rosenberg, Nature 254: 128 (1981)) in pUC19- und pBR322-Derivaten. Zusätzliche kann eine starke Ribosomenbindungsstelle (Shine & Dalgarno, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 1342-1346 (1974)) vor dem Gen angeordnet werden, um die Expression zu erhöhen.
11. Um einen stabilen Klon zu erhalten, welcher die Restriktionsendonuklease überexprimiert, wird gemäß der vorliegenden Erfindung vorher der Wirt vor dem Restriktionsendonukleaseverdau geschützt. Dieses wird erreicht, indem entweder die NotI-Methylase oder eine heterologe Methylase wie beispielsweise EagI, welche vor NotI-Verdau schützt indem sie Stellen modifiziert, die mit den NotI- Restriktionsstellen überlappen, auf einem separaten Plasmid kloniert wird. Das verwendete Plasmid muß mit dem Expressionsvektor kompatibel sein. Die Methylase muß ebenfalls auf einem Niveau produziert werden, welches das Genom des Wirtes vor einem Verdau durch das überexprimierte Restriktionsendonukleasegen schützt. Bei der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, daß das EagI-Methylasegen, welches auf einem Plasmid mit geringer Kopienanzahl wie z.B. pACYCIB4 (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134: 1131 (1978)) kloniert wurde, einen angemessenen Schutz des Wirtsgenoms vor einem NotI-Verdau ergab.
Die DNA-Sequenz des Gens kann durch gezielte Mutagenese oder durch ein Resynthetisieren des Gens selbst geändert werden, um Codons zu verwenden, die in E. coli effizienter benutzt werden (Ikemura, J. Mol. Biol. 151: 389-409 (1981)). Bei der vorliegenden Erfindung wurden die zweiten und dritten Codons des Endonukleasegens durch den PCR- Amplifikationsprozeß zu den Codons geändert, welche am häufigsten von E. coli verwendet werden.
12. Herstellung: Die NotI-Endonuklease kann aus Klonen hergestellt werden, die das EagI-Methylasegen (oder das NotI-Methylasegen) und das überexprimierte NotI-Restriktionsendonukleasegen tragen, indem in einem Fermenter in einem Vollmedium mit der geeigneten antibiotischen Selektion und Induktion vermehrt wird. Die Zellen werden danach durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung aufgebrochen, um einen rohen Zellextrakt zu erzeugen, welcher die NotI-Restriktionsendonukleaseaktivität enthält.
13. Reinigung: Der rohe Zellextrakt, welcher die NotI- Endonuklease enthält, wird durch Standardproteinreinigungstechniken wie beispielsweise Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie gereinigt.
Obwohl die oben beschriebenen Schritte die bevorzugte Weise zur Ausführung der vorliegenden Erfindung darstellen, wird es den Fachleuten klar sein, daß der oben beschriebene Ansatz gemäß im Stand der Technik bekannter Techniken abgeändert werden kann.
Das folgende Beispiel wird angegeben, um Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darzustellen, wie sie derzeit bevorzugt praktiziert wird. Man wird verstehen, daß dieses Beispiel zur Veranschaulichung dient und daß die Erfindung, außer wie in den angefügten Ansprüchen angegeben, nicht darauf beschränkt werden soll.

BEISPIEL 1

Klonieren der NotI-Modifikationsmethylase- und Restriktionsendonukleasegene

1. DNA-Reinigung: Um die DNA von Nocardia otitidis- caviarum zu präparieren, wurden 6 g Zellpaste durch leichtes Schütteln für 10 Minuten in 20 ml 25% Sucrose, 0,05 M Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0 resuspendiert. 10 ml 0,25 M EDTA pH 8,0 und 6 ml frisch hergestelltes Lysozym mit 10 mg/ml in 0,25 M Tris-HCl pH 8,0 wurden zugegeben, und die Lösung wurde 16 Stunden lang bei 4ºC inkubiert. Die Suspension wurde dann schnell in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann dreimal in einem Wasserbad mit 37ºC aufgetaut. Proteinase K wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml zugegeben und 16 Stunden lang bei 50ºC inkubiert. Die Lösung wurde mit 50 ml äquilibriertem Phenol extrahiert, die wäßrige Phase wurde zurückgewonnen und mit 50 ml Chloroform zweimal extrahiert. Die DNA wurde durch die Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 6,0 und 1 Volumen 2- Propanol gefällt und durch Zentrifugation gesammelt. Das DNA-Pellet wurde 1 Stunde lang an der Luft getrocknet, dann in 3 ml DNA-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 8,0), welcher 100 µg/ml RNase enthielt, resuspendiert und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. 5 M NaCl wurde dann bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M zugegeben und die DNA wurde durch die Zugabe von 1 Volumen 2-Propanol gefällt. Der DNA- Niederschlag wurde an einem Glasstab aus der Lösung gehoben, an der Luft getrocknet und in 1,5 ml DNA-Puffer bis zu einer Endkonzentration von ungefähr 200 µg/ml gelöst.
2. Reinigung der NotI-Restriktionsendonuklease aus Nocardia otitidis-caviarum: Das NotI-Restriktionsenzym kann aus Nocardia otitidis-caviarum durch Vermehrung bis zu der mittleren logarithmischen Phase in einem Fermenter, welcher Vollmedium enthält, hergestellt werden. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet. Sämtliche der folgenden Vorgänge wurden auf Eis oder bei 4ºC durchgeführt. 384 g Zellen wurden in 770 ml Puffer A (10 mM KPO&sub4;, pH 6,8, 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerol) resuspendiert und aufgebrochen, indem sie 5 mal bei 11.500 PSIG durch einen Gaulon- Homogenisator geführt wurden. Der Extrakt wurde 40 Minuten lang bei 4ºC und 12.000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde auf eine Phosphocellulosesäule (5 x 12 cm) geladen, welche mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 200 ml Puffer A gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten von NaCl, welcher aus 1100 ml Puffer A und 1100 ml Puffer A plus NaCl, welches bis auf 1,5 M zugegeben wurde, gebildet war. Es wurden 25 ml-Fraktionen gesammelt. Der Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte zwischen 0,4 und 0,6 M NaCl von der Säule und wurde gepoolt. Der P-Zellenpool wurde über Nacht gegen Puffer B (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 50 mM NH&sub4;SO&sub4;, 5% Glycerol und 0,15% Natriumazid) dialysiert. Der Pool wurde dann auf eine Baker-bond Wide-pore PEI (NH) -Säule (1,5 x 16 cm) geladen, welche mit Puffer B äquilibriert war. Die Säule wurde mit 30 ml Puffer B gewaschen und dann wurde ein linearer 400 ml-Gradient aus Puffer B von 0,1 M NaCl bis 1,6 M NaCl angelegt. Der Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,6 bis 0,8 M NaCl und wurde gepoolt. Der PEI-Pool wurde über Nacht gegen Puffer C (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 5% Glycerol) dialysiert und dann auf eine Mono-Q -Säule (Pharmacia) geladen, welche mit Puffer C äquilibiert war. Es wurde ein linearer 40 ml-Gradient von 0,1 M NaCl bis 0,6 M NaCl angelegt. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,3 M NaCl und wurde gepoolt. Der Mono-Q -Pool wurde mit 3 Volumen Puffer D (20 mM KPO&sub4;, pH 6,8, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerol) verdünnt und mit 50 mM NaCl auf eine Mono-S -Säule (Pharmacia) geladen. Ein linearer 40 ml-Gradient in Puffer D von 50 mM NaCl bis 0,5 M NaCl wurde angelegt. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,25 M NaCl und wurde gepoolt. Ein Lauf auf einer zweiten Mono-Q -Säule wurde wie vorher beschrieben durchgeführt, um die Homogenität des Endonukleaseproteins sicherzustellen. Die endgültige NotI-Restriktionsendonukleasepräparation ergab auf einem 10-20% SDS-PAGE-Gel, welches mit Coomassie Blue R-250 gefärbt war, eine Hauptbande von ungefähr 42 kD.
3. Die NotI-Restriktionsendonuklease, welche wie in Abschnitt 2 oben beschrieben hergestellt wurde, wurde einer Elektrophorese unterworfen und gemäß dem Verfahren von Matsudaira (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262: 10035- 10038, 1987) mit Modifikationen wie früher beschrieben (Looney, M. C., Moran, L. S., Jack, W. E., Feehery, G. R., Benner, J. S., Slatko, B. E. & Wilson G. G., Gene 80: 193- 208, 1989) elektrogeblottet. Die Membran wurde mit Coomassie Blue R-250 gefärbt und die Proteinbande mit ungefähr 42 kD wurde ausgeschnitten und einem sequentiellen Abbau (Waite-Rees, P. A., Keating, C. J., Moran, L. S., Slatko, B. E., Hornstra, L. J. und Benner, J. S., J. Bacteriol. 173: 5207-5219, 1991) unterworfen.
Die ersten 15 Reste des 42 kD-Proteins entsprachen Met- Arg-Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile, SEQ ID:1. Eine weitere Probe der NotI-Endonuklease, 20 µg in 20 µl, wurde 24 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 2 mg Cyanbromid (Sigma) behandelt, welches in 200 µl 88%-iger destillierter Ameisensäure gelöst war. Diese Reaktionsmischung wurde bis zur Trockene verdunstet und bei 100ºC 5 Minuten lang in 20 µl Ladepuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,5, 12% Glycerol, 4% SDS, 0,95% Serva Blue G, 0,05% Phenolrot) resuspendiert. Diese Probe wurde drei Stunden lang einer Elektrophorese auf einem Tris-Tricin-10-20% Polyacrylamid-Gradientengel (Novex) unterworfen und dann für 18 Stunden bei 200 Volt in einem Wannen-Elektroblotter (TE52, Hoeffer) auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Problott, Applied Biosystems Inc.) übertragen, indem 10 mM CAPS-Puffer (10 mM 3-[Cyclohexylamino]-1-propansulfonsäure, 10% Methanol, 0,05% SDS, 0,005% Dithiotheritiol, mit NaOH auf pH 11,0 eingestellt) verwendet wurde. Die Membran wurde mit Coomassie Blue R-250 gefärbt und Hauptbanden mit 24 kD, 10 kD, 4 kD und 3 kD wurden beobachtet. Diese gefärbten Proteinbanden wurden aus der Membran ausgeschnitten und jeweils einem sequentiellen Abbau (2) unterworfen. Die ersten 27 Reste des 24 kD-Peptids entsprachen Met-Arg- Ser-Asp-Thr-Ser-Val-Glu-Pro-Glu-Gly-Ala-Asn-Phe-Ile-Ala- Glu-Phe-Phe-Gly-X-X-Val-Tyr-Pro-Glu-Val, SEQ ID: 2. Die Reste 21 und 22 wurden nicht identifiziert. Es wurde daher bestimmt, daß dieses Fragment von dem N-Terminus der Endonuklase abgeleitet werden sollte. Alle anderen Fragmente sind von der inneren Spaltung durch Cyanbromid an Met- Resten innerhalb des Proteins abgeleitet und diesen sollte somit ein Met vorangehen. Die ersten 9 Reste des 10 kD-Peptids entsprachen Ala-Tyr-Lys-Phe-Ala-Leu-Ser-Gly-Arg, SEQ ID:3. Die ersten 36 Reste des 4 kD-Peptids entsprachen Asp- Phe-His-Gly-Ser-Tyr-Lys-His-Ala-Val-Gly-Ala-Ile-Asp-Ile- Ala-Leu-Val-Glu-Gly-Ile-Asp-Phe-His-Gly-X-Leu-Pro-Thr-Pro- Ala-Gly-(Tyr oder Arg)-Ala-Ala-(Lys oder Leu), SEQ ID:4, wobei der Rest 26 nicht bestimmt wurde und die Reste 33 und 36 etwas zweideutig waren. Die 3 kD-Peptidbande erzeugte in den meisten Zyklen zwei Signale und schien eine Mischung aus zwei Peptiden zu sein.
4. Die Peptidsequenzdaten der intakten NotI-Endonuklease, der 24 kD- und 10 kD-Peptide sowie ihre bekannten Orientierungen wurden verwendet, um eine Serie von acht PCR-Primern zu konstruieren:
1) GA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer, SEQ ID 5
2) AA NGC RAA YTT RTA NGC CAT 20-mer, SEQ ID:6
3) GA SGC GAA CTT GTA SGC CAT 20-mer, SEQ ID:7
4) GAR CCN GAR GGN GCN AAR TTY AT 23-mer, SEQ ID:8
5) GAG CCS GAG GGS GCS AAG TTC AT 23-mer, SEQ ID:9
6) AAR TTY ATH GCN GAR TTY TTY GG 23-mer, SEQ ID:10
7) AAG TTC ATC GCS GAG TTC TTC GG 23-mer, SEQ ID:11
8) GTN TAY CCN GAR GT 14-mer, SEQ ID:12
wobei
Y = T, C
R = A, G
H = A, T, C
S = G, C
N + A, C, G, T
Die Primer 1 bis 3 sind von dem NotI-10 kD-CNBR-Peptid abgeleitet und wurden hergestellt, um zum 5'-Ende des Gens hin zu primen. Die Primer 4 bis 8 sind von dem NotI-24 kD- CNBr-Peptid abgeleitet und wurden hergestellt, um zum 3'- Ende des Gens hin zu primen. Die Primer 31 5 und 7 enthalten an den "Wobble"-Positionen keine A- oder T-Reste.
5. Die Primer 3, 5, 7 und 8 wurden verwendet, um den Teil des Endonukleasegens zwischen dem N-terminalen Bereich (Primer 5, 7 und 8) und dem Aminoende des 10 kD-Cyanbromidfragments (Primer 3) zu amplifizieren. Drei verschiedene Mg&spplus;&spplus;-Konzentrationen und vier verschiedene Reassoziationstemperaturen wurden ausprobiert. Eine Stammreaktionsmischung wurde hergestellt, welche 65 µl 10x Vent -Reaktionspuffer, 7 µl 10 mg/ml BSA, 40 µl 4 mM DNTP-Lösung, 33 µl DMSO, 3,5 µl (700 ng) Nocardia otitidis-caviarum-DNA, 408 µl dH&sub2;O, 13 µl (650 ng) Primer 3, 13 µl (650 ng) Primer 5 und 20 µl (40 u) Vent-Exo -polymerase enthielt. Die Mischung wurde in drei 200 µl-Aliquots aufgeteilt; zu dem ersten wurden 16 µl dH&sub2;O (Endkonzentration Mg&spplus;&spplus; = 2 mM) zugegeben, und zu dem zweiten wurden 6 µl 100 mM MgSO&sub4; und 10 µl dH&sub2;O ([Mg&spplus;&spplus;] = 5 mM) zugegeben und zu dem dritten wurden 16 µl 100 mM MgSO&sub4; ([Mg&spplus;&spplus;] = 10 nM) zugegeben. Diese Reaktionsmischungen wurden in Viertel unterteilt und unter Verwendung von vier verschiedenen Reassoziationstemperaturen amplifiziert. Die Reaktionen unter Verwendung von Primer 3 und Primer 7 und die Reaktionen unter Verwendung von Primer 3 und Primer 8 wurden auf dieselbe Weise durchgeführt. Die PCR-Amplifikationsbedingungen waren 95ºC für 1 Minute, 45ºC (oder 50ºC, 55ºC, 60ºC) für 1 Minute und 72ºC für 1,5 Minuten, für 35 Zyklen. 15 µl des PCR-Reaktionsprodukts wurden durch Elektrophorese auf einem 1%-igen Agarosegel analysiert. Eine Bande der gewünschten Größe wurde in allen Reaktionen von Primer 3 und Primer 5, außer der 2 mM Mg&spplus;&spplus;/60º-Reassoziationsreaktion beobachtet. Die Reaktionen mit Primer 3 und Primer 7 ergaben eine Bande der gewünschten Größe bei allen drei Reaktionen, die bei 45ºC reassoziiert wurden, und bei den 5 mM und 10 mM Mg&spplus;&spplus;-Reaktionen bei 50ºC- und 55ºC-Reassoziation, nicht aber bei den Reaktionen bei anderen Bedingungen. Die Kombination von Primer 3 und Primer 8 ergab eine Bande der gewünschten Größe nur bei den Reaktionen bei 45ºC-Reassoziation mit 5 mM und 10 mM Mg&spplus;&spplus; und der 50ºC-Reassoziation mit 10 mM Mg&spplus;&spplus;. Die Banden der gewünschten Größe wurden in 1%-iger LMP-Agarose einer Elektrophorese unterzogen, aus dem Gel ausgeschnitten, 5 Minuten lang bei 65ºC geschmolzen, 5 Minuten lang auf 40ºC abgekühlt, und die Agarose wurde durch die Zugabe von 1 µl (1 u) β-Agarase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) bei einer Inkubation für 1 Stunde bei 40ºC verdaut.
6. Partieller Verdau: Die gereinigte DNA wurde mit BamHI gespalten, um wie folgt einen partiellen Verdau zu erreichen: 500 µl Nocardia otitidis-caviarum-DNA bei 50 µg/ml in NEBuffer BamHI (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT, pH 7,9 bei 25ºC) wurden in ein 100 µl-Aliquot und sieben 50 µl-Aliquots aufgeteilt. Zu dem 100 µl- Röhrchen wurden 20 Einheiten BamHI zugegeben, um 4 Einheiten Enzym pro µg DNA zu erreichen. 50 µl wurden aus dem ersten Röhrchen entnommen und auf das zweite Röhrchen übertragen, um 2 Einheiten BamHI/µg zu erhalten, usw., wobei jedes nachfolgende Röhrchen die Hälfte der vorigen Menge an BamHI erhielt. Die Röhrchen wurden eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert, dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit 2 Volumen Ethanol gefällt, getrocknet und in 20 µl TE (TE = 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0) resuspendiert, und 3 µl von jedem wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. Die Röhrchen, welche einen Grenzverdau und einen mäßigen, aber unvollständigen Verdau zeigten, wurden als die Quelle für Fragmente zum Klonieren ausgewählt. Die getrennten Reaktionen wurden zusammengemischt und wie in Schritt 7 unten beschrieben verwendet.
7. BamHI-Bibliothek: Eine genomische BamHI-Bibliothek wurde konstruiert, indem der Vektor Lambda Dash II (Stratagene) verwendet wurde. Lambda Dash II ist ein Lambda-Substitutionsvektor, welcher verwendet werden kann, um DNA-Fragmente mit 9-23 kb zu klonieren. 250 ng (2 µl) mit BamHI vollständig und teilweise verdaute Nocardia otitidis-caviarum-DNA, wie sie oben beschrieben ist, wurden mit 500 ng mit BamHI gespaltenen Lambda Dash II-Armen (0,5 µl) gemischt. 2,5 µl 2x-Ligationsmischung (100 mM Tris pH 7,8, 20 mM MgCl&sub2;, 20 mM DTT, 2 mM ATP), welche 1 x 10³ Einheiten T4-DNA-Ligase enthielt, wurden zugegeben, und die Mischung wurde 16 Stunden lang bei 17ºC inkubiert. 2,5 µl der Ligationsreaktion wurden in vitro in infektiöse Phagenpartikel verpackt, indem Gigapack II Plus (Stratagene) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Nach einer Inkubation für zwei Stunden bei Raumtemperatur wurde der verpackte Phage in 500 µl SM (SM = 100 mM NaCl, 8 mM MgSO&sub4;, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,01% Gelatine) plus drei Tropfen Chloroform verdünnt. Der Titer der infektiösen Phagenpartikel wurde wie folgt bestimmt. 2 µl der Lösung des verpackten Phagen wurden in 198 µl SM verdünnt. 1 µl-, 10 µl- und 100 µl-Aliquots des verdünnten Phagen wurden zu 100 µl einer frischen Suspension von ER1458-Zellen (in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, O.D.&sub6;&sub0;&sub0; = 2,0) zugegeben, 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, dann bei 40ºC mit 3 ml Top-Agar gemischt und auf Platten mit Vollmedium ausgestrichen. Nachdem der Top-Agar festgeworden war wurden die Platten über Nacht bei 37ºC inkubiert. Am nächtsten Tag wurden die Plaques gezählt und der Titer der Phagenstammlösung, die in den nachfolgenden Experimenten verwendet wurde, wurde auf 2,8 x 10&sup5; pfu/ml berechnet.
8. Die in vitro verpackten Phagen wurden wie oben beschrieben plattiert, um auf Rasen aus E. coli ER1458 gut getrennte Plaques zu bilden. Platten mit ungefähr 600, 1500, 3000 und 5000 Phagen wurden hergestellt. Nitrocellulosefilter-Plaqueanhebungen dieser Klone aus der Lambda DASH II-BamHI-Bibliothek wurden mit radioaktiv markiertem (Random Priming System I, New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) gelgereinigtem PCR-Produkt der Primer 3-bis-Primer 5-Amplifikationsreaktion (oben) sondiert (Benton-Davis-Verfahren, in: Molecular Cloning, a Laboratory manual von T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982, Seiten 320 ff). 17 positive Plaques wurden identifiziert und alle wurden aus den Plaques gereinigt. DNA wurde aus konfluenten Plattenlysaten (in Top- Agarose) von 6 Phagen präpariert und mit BamHI verdaut. Alle 6 enthielten ein gemeinsames 14,5 kb-BamHI-Fragment, an welches die Primer 3-bis-Primer 5-Sonde hybridisierte.
9. Kartieren des 14,5 kb-BamHI-Fragmentes: Das 14,5 kb- BamHI-Fragment der Nocardia otitidis-caviarum-DNA, welches in Lambda Dash II-Klonen identifiziert wurde, wurde für ein leichteres Kartieren in pUC19 subkloniert, was den Klon pNOTB14.5 erzeugte. Der pNOTB14.5-Klon wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen gemäß den Anweisungen der Hersteller verdaut, und eine Restriktionskarte des Fragments wurde bestimmt (Fig. 2). Die Lage des NotI-Endonukleasegens auf diesem Klon wurde durch Southernhybridisierung (Southern, E. 1975, J. Mol. Biol. 98: 503) der Primer 3- bis-Primer 5-Sonde (oben) mit Restriktionsverdaus des Klons bestimmt, wobei die HindIII-, PflMI-, XbaI-, ClaI- und BstBI-Verdaus beim Lokalisieren der Sonde auf dem 14,5 kb- BamHI-Fragment (Fig. 2) besonders nützlich waren. Die Sonde hybridisierte nahe der Mitte des BamHI-Fragmentes, mit ungefähr 8200 bp auf einer Seite und 5600 auf der anderen, was zeigt, daß genügend DNA vorhanden war, um die gesamten Restriktions- und Modifikationsgene zu enthalten. Der pNOTB14.5-Klon wurde kultiviert und auf NotI-Restriktionsaktivität hin getestet; es wurde aber keine nachgewiesen. Keine in vivo-Methylaseaktivität wurde nachgewiesen, wie durch die Fähigkeit des NotI-Enzyms, die 4 Stellen in der klonierten DNA vollständig zu spalten, getestet wurde.
Um das Sequenzieren des Bereichs des Klons nahe der Sonde zu vereinfachen, wurden zahlreiche Subklone von pNOTB14.5 konstruiert. Subklone wurden hergestellt, indem Bereiche des Klons deletiert wurden oder indem mit einem Restriktionsenzym(en) gespalten wurde, das gewünschte Fragment aus dem Gel präpariert wurde und in einen geeignet gespaltenen und dephosphorylierten pUC19-Vektor ligiert wurde. Klone des gewünschten Konstruktes wurden identifiziert, indem Minipreps durchgeführt wurden, die gereinigte DNA verdaut wurde und diese durch Agarosegelelektrophorese analysiert wurde.
Analyse der Plasmidklone: Einzelne Transformanten wurden in 10 ml-Kulturen in L-Nährlösung, welche Ampicillin enthielt, angeimpft, und die Plasmide, welche sie trugen, wurden durch das folgende Miniprep-Plasmidreinigungsverfahren präpariert, welches ausgehend von dem Verfahren von Birnboin und Doly (Nucleic Acids Res. 7: 1513, 1979) angepaßt wurde.

Minipredverfahren:

Jede Kultur wurde 5 Minuten lang bei 8000 Upm zentrifugiert; der Überstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde in 1,0 ml 25 mM Tris, 10 mM EDTA, 50 mM Glucose, pH 8,0, welcher 1 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden 2,0 ml 0,2 M NaOH, 1% SDS zu jedem Röhrchen zugegeben und die Röhrchen wurden geschüttelt, um die Zellen zu lysieren, und dann auf Eis gestellt. Wenn die Lösungen aufgeklart waren, wurden 1,5 ml 3 M Natriumacetat pH 4,8 zu jedem zugegeben und geschüttelt. Die Niederschläge, welche sich bildeten, wurden 10 Minuten lang bei 4ºC und 15000 Upm abzentrifugiert. Jeder Überstand wurde in ein Zentrifugenröhrchen gegossen, welches 3 ml Isopropanol enthielt, und gemischt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen 10 Minuten lang bei 15000 Upm zentrifugiert, um die ausgefällten Nukleinsäuren zu pelletieren. Die Überstände wurden verworfen und die Pellets wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet. Wenn sie trocken waren, wurden die Pellets in 500 µl 10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA, welche 50 µg/ml Rnase enthielten, gelöst und 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert, um die RNA zu verdauen. Die DNA wurde durch die Zugabe von 50 µl 5 M NaCl, gefolgt von 350 µl Isopropanol gefällt. Nach 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die DNA durch 5 Minuten lange Zentrifugation abzentrifugiert, die Überstände wurden verworfen, die Pellets wurden getrocknet und dann in einer Endlösung von 150 µl 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 gelöst. Die Plasmidminipreps wurden nachfolgend durch Verdau mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen analysiert.
10. DNA-Sequenzierung: Eine DNA-Sequenzierung wurde durchgeführt, indem das Circumvent -DNA-Sequenzierungskit (New England Biolabs) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wurde. Miniprep-DNA-Präparationen wurden als Matrizen verwendet. Die DNA-Sequenz lieferte Daten, die als Grundlage für nachfolgende Manipulationen verwendet werden konnten, um das gesamte Restriktionsendonukleasegen zu klonieren und um eine Expression des klonierten Gens in E. coli zu induzieren. Die Aminosäuresequenz, welche von der DNA-Sequenz abgeleitet wurde, stimmte mit der Proteinsequenz des N-Terminus (24 kD-Peptid), des 10 kD- und 4 kD- Peptids und, nach Deduktion, der zwei kleinen Peptide (um 3 kD) überein, und zeigte, daß die Reihenfolge der Peptidfragmente 24 kD, 4 kD, 3(A) kD, 10 kD, 3(B) kD war. Die exakte DNA-Sequenz an dem N-Terminus des Proteins wurde verwendet, um einen PCR-Amplifikationsprimer zur Expression des NotI-Gens zu entwerfen. Die Sequenz um eine SalI-Stelle herum, die stromabwärts des Endonukleasegens vorlag, wurde verwendet, um den zweiten PCR-Expressionsprimer zu entwerfen. Die Sequenz stromaufwärts des Endonukleasegens enthielt keine typischen E. coli-Transkriptionsfaktoren, was mit dem Fehlen einer Expression bei pNOTB14.5 konsistent ist. Übereinstimmende Motive für ein N4-Methylcytosin- Methylasegen vom β-Typ, Motiv IV = Ile-Thr-Ser-Pro-Pro-Tyr- Trp-Gly-Met-Arg-Thr-Tyr, SEQ ID:13, und Motiv I = Gly-Gly- Leu-Val-Leu-Asp-Pro-Phe-Ala-Gly-Thr-Gly-Arg-Ala, SEQ ID:14 (Wilson, G.G., in: Method in Enzymology, 216: Recombinant DNA Teil G, Herausgeber Wu, R., Academic Press, 1992, Seiten 259-279) wurden in einem Leseraster gefunden, das vor dem NotI-Endonukleasegen lag und dieselbe Orientierung aufwies, welches von dem Anfang der Endonuklease durch 44 Nukleotide getrennt war. Diese Daten sind mit einem verknüpften R-M-System konsistent.
11. Überexpression der NotI-Restriktionsendonuklease: Das Restriktionsendonukleasegen wurde überexprimiert, indem das Gen unmittelbar stromabwärts eines induzierbaren Promotors (T7) und einer stark erkannten Ribosomenbindungsstelle in einen Expressionsvektor, pSYX22, eingefügt wurde. Um dieses zu erreichen, wurden zwei Oligonukleotidprimer hergestellt, indem die DNA- und Proteinsequenzdaten verwendet wurden. Der erste Oligonukleotidprimer enthielt die Sequenz, welche mit dem ATG-Codon überlappte, von welchem durch Proteinsequenzierung gezeigt wurde, daß es der Beginn des Endonukleasegens ist, wobei drei Basen verändert wurden, um eine NdeI-Stelle zu erzeugen, und die Base an der dritten Position des zweiten und dritten Codons der Endonuklease zu der von E. coli bevorzugten Codonverwendung geändert wurde: 5, GACG CAT ATG CGT TCC GAT ACG TCG GTG GAG CCA GAG 3' SEQ ID NR:15 (NdeI-Stelle unterstrichen, Nukleotide, welche in der N. otitidis-caviarum-Sequenz geändert wurden, fett). Der zweite Oligonukleotidprimer enthielt eine Sequenz ungefähr 500 Nukleotide 3' von dem Ende des NotI-Endonukleasegens mit einer SalI-Stelle, welche in der N. otitidis-caviarum-DNA vorhanden ist, die in den Primer eingeschlossen ist, um das Klonieren des Fragmentes, wenn es einmal amplifiziert ist, zu erleichtern: 5' GAAT GTC GAC CAT CTC CAC CCA CG 3' SEQ ID NR:16 (SalI-Stelle unterstrichen). Diese zwei Primer wurden mit genomischer N. otitidis-caviarum-DNA und dem pNOTB14.5-Plasmid als der Matrize in PCR-Reaktionen unter Verwendung von Vent -DNA-Polymerase verwendet (95ºC - 1 Minute, 56ºC - 1 Minute, 72ºC - 2 Minuten; 10 Zyklen mit pNOTB14.5 und 20 Zyklen mit der genomischen DNA), um ein 1,7 kb-DNA-Fragment zu amplifizieren, welches das NotI-Endonukleasegen enthielt. Die Bande wurde wie in Schritt 5 beschrieben geireinigt. Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit 20 U NdeI und 20 U SalI 1 Stunde lang in 1x-NEBuffer 3 verdaut. Nach einer Inkubation wurde der Verdau einmal mit einer 1:1-Mischung von Phenol:Chloroform, einmal mit Chloroform extrahiert und mit 2 Volumen Ethanol gefällt. Die DNA wurde durch Zentrifugation pelletiert, einmal in 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 µl TE resuspendiert. 3 µl des gereinigten Fragmentes ( 0,1 µg) wurden bei 17ºC 4 Stunden lang in einem Gesamtvolumen von 20 µl mit 400 U T4-DNA-Ligase in den T7-Expressionsvektor pSYX22 (von S. Xu, New England Biolabs) ligiert, welcher mit NdeI und SalI ( 0,05 µg) verdaut worden war. [Abstammung von pSYX22: pET-11a ist ein T7-Expressionsvektor, der von p8R322 abgeleitet ist, welcher einen lac-Operator 4 bp stromabwärts des T7-Promotors (dieser T7- Promotor plus lac-Operator wird T7-lac-Promotor genannt), das lacIq-Gen und zwei Restriktionstellen, NdeI und BamHI, zum Klonieren enthält (Dubendorff, J.W. und Studier, F.W., J. Mol. Biol. 219: 45-59, 1991). Ein pET-11a-Derivat, pAII17, wurde konstruiert, das vier Kopien des rrnB-Transkriptionsterminators stromaufwärts des T7-Promotors enthält (pAII17 wurde konstruiert von William Jack bei New England Biolabs, Beverly, MA). Der Transkriptionsterminator stromaufwärts des T7-Promotors vermindert weiter das Grundniveau der Expression des Zielgens. Zur Erleichterung der Klonierung wurde die BamHI-Stelle in dem Vektor mit Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I aufgefüllt und ein SalI- Linker wurde eingefügt, um die BamHi-Stelle zu ersetzen. Dieses Plasmid wurde pSYX22 genannt.] 10 µl der Ligation wurden verwendet, um kompetente E. coli ER2169 (erhältlich von New England Biolabs, Inc., Beverly, MA), vormodifiziert mit dem EagI-Methylasegen auf pEagM184-A, zu transformieren. [Die EagI-Methylierungserkennungsstelle, CGGCCG, überlappt mit der NotI-Restriktionsendonuklease-Erkennungsstelle und schützt so den Wirt vor NotI-Verdau. pEagM184-A ist abgeleitet von pACYC184, einem Plasmid mit geringer Kopienzahl, welches camr- und Tcr-Gene mit einem p15A-Replikationsursprung trägt. Ein Methylasegen, welches in das Tcr-Gen eingefügt ist, kann konstitutiv durch den Tc-Promotor exprimiert werden.] Die transformierten Zellen wurden auf L-Agar mit Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (35 µg/ml) plattiert. Plasmide wurden aus 14 einzelnen Kolonien isoliert, sowohl von der genomischen DNA als auch der von pNOTB14.5 abgeleiteten amplifizierten DNA, indem das in Schritt 9 beschriebene Plasmidminiprep-Verfahren verwendet wurde. Doppelverdaus mit NdeI und SalI von 5 µl jedes Minipreps wurden mit Doppelverdaus mit NdeI und SalI von pAII17 verglichen. Einer der 14 genomisch abgeleiteten Klone und 2 der 14 von pNOTB14.5 abgeleiteten Klone enthielten ein Insert von ungefähr 1,7 kb. Alle drei dieser Klone wurden für eine weitere Charakterisierung ausgewählt. Diese 3 Klone wurden in 200 ml L-Nährlösung mit Ampicillin und Chloramphenicol bis zu einem Klett-Wert von 80 (mittlere logarithmische Phase) kultiviert und mit 1 mM IPTG induziert. 2 Stunden nach der Induktion wurden die Zellen (ungefähr 0,8 g) durch Zentrifugation geerntet, einmal in kaltem Beschallungspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA) gewaschen, in 3 ml Beschallungspuffer resuspendiert und auf Eis beschallt. Der beschallte Zellextrakt wurde 20 Minuten lang bei 16.000 Upm zentrifugiert. 4,5 µl jedes Extraktes wurden mit 75 µl einer DNA-Testmischung (die 1 µg Adeno2-DNA pro 50 µl in NEBuffer NotI enthielt) gemischt. 25 µl aus diesem Röhrchen wurden mit 50 µl der DNA-Mischung gemischt, eine 1:2-Verdünnung. 3 weitere aufeinander folgende 1:2-Verdünnungen wurden durchgeführt. Die Reaktionen wurden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert. 20 µl der Reaktionen wurden auf einem 1%-igen Agarosegel laufen gelassen. Alle 3 Klone erzeugten zuviel NotI-Restriktionsendonukleaseaktivität, als daß sie in diesem Test genau hätte titriert werden können; es wurde jedoch geschätzt, daß der Enzymtiter größer war als 2,5 x 10&sup5; Einheiten/g an Zellen. Weitere Titrationen ergaben einen Titer der NotI- Restriktionsendonukleaseaktivität um 5 x 10&sup6; Einheiten/g an Zellen. Dieses Niveau ist ungefähr 1.000 mal höher als die NotI-Restriktionsendonukleaseaktivität pro Gramm an Zellen, die in Rohextrakten von Nocardia otitidis-caviarum beobachtet wird. Einer dieser Klone wurde für die weitere Charakterisierung ausgewählt und diesem wurde eine Stammbezeichnung NEB Nr. 816 gegeben, wobei das Plasmid pRM189-1 genannt wurde. Eine Probe von NEB Nr. 816 wurde gemäß dem Budapester Vertrag am 3. Dezember 1992 bei der American Type Culture Collection in Rockville, Maryland unter der Zugriffsnr. 69139 hinterlegt.
12. Die NotI-Restriktionsendonuklease kann aus NEB Nr. 816 durch Vermehrung bis zu der späten logarithmischen Phase in einem Fermenter, welcher Vollmedium mit Ampicillin (100 µg/ml) und Chloramphenicol (35 µg/ml) enthält, hergestellt werden. Die Kultur wird dann durch die Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert und für weitere 2 Stunden wachsen gelassen. Die Zellen werden dann durch Zentrifugation geerntet.
13. Reinigung der NotI-Restriktionsendonuklease aus NEB Nr. 816: All die folgenden Vorgänge wurden entweder auf Eis oder bei 4ºC durchgeführt. 18 Gramm Zellen wurden in 70 ml Puffer A (10 mM Kaliumphosphat pH 6,9, 0,1 M NaCl, 0,1 mM EDTA, 5% Glycerol) resuspendiert und durch Beschallung für 1 Minute bei voller Stärke zu einer O.D. 260 von 0,13 aufgebrochen. Der Extrakt wurde 30 Minuten lang bei 4ºC und 10.000 Upm zentrifugiert und der resultierende Überstand wurde auf eine Phosphocellulosesäule (2,5 x 15 cm) geladen, welche mit Puffer A äquilibriert war. Die Säule wurde mit 60 ml Puffer A gewaschen und dann wurde ein linearer 900 ml-Gradient von 0,1 M NaC1 bis 1,0 M NaCl angelegt. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,2 bis 0,3 M NaCl und wurde gepoolt. Der P-Zellenpool wurde gegen Puffer B (0,1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl&sub2;, 5% Glycerol und 0,15% Natriumazid) über Nacht dialysiert und auf eine Heparinsepharosesäule (1,5 x 17 cm) geladen, welche mit Puffer B äquilibriert war. Die Säule wurde mit 30 ml Puffer B gewaschen, und ein linearer 400 ml-Gradient von 0,1 M NaCl bis 1,2 M NaCl wurde angelegt. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte zwischen 0,5 M und 0,6 M NaCl von der Heparinsäule und wurde gepoolt. Der Pool wurde mit Puffer B ohne NaCl 1:1 verdünnt und über eine DEAE-Sepharosesule (1,5 x 16 cm) geführt, welche mit Puffer B bei 0,3 M NaCl äquilibriert war. Die Restriktionsenzymaktivität floß durch die Säule durch. Der Durchfluß wurde gesammelt, 1:1 mit Puffer B ohne NaCl verdünnt und auf eine PEI-Säule (1,5 x 10 cm) geladen, welche mit Puffer B bei 0,15 M NaCl äquilibriert war. Die Säule wurde mit 20 ml Puffer B gewaschen und ein linearer 300 ml-Gradient von 0,15 M bis 1,8 M NaCl wurde angelegt. Die Restriktionsenzymaktivität eluierte bei 0,6 M bis 0,8 M NaCl und wurde gepoolt. BSA (Rinderserumalbumin) wurde zu dem Pool bis zu einer Endkonzentration von 100 µg/ml zugegeben. Der Pool wurde gegen Aufbewahrungspuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mM DTT, 0,15% Triton-X 100 und 50% v/v Glycerol) dialysiert. Dieses Reinigungsschema ergab 53.000.000 Einheiten NotI-Restriktionsendonuklease.
Die NotI-Restriktionsendonuklease, welche durch diese Reinigung erhalten wurde, war im wesentlichen rein und frei von nichtspezifischer Endonuklease und Exonuklease. Die Reinheit der NotI-Restriktionsendonukleasepräparation wurde überprüft, indem die folgenden Kriterien betrachtet wurden: 1) Ligation: Nach einem 25-fachen Überverdau von Adeno2-DNA wurden mehr als 95% der erzeugten DNA-Fragmente mit T4-DNA- Ligase ligiert (bei einer 5'-Termini-Konzentration von 1 - 2 µM bei 16ºC). Von diesen ligierten Fragmenten konnten 95% erneut geschnitten werden. 2) Verlängerter Verdau: Nach Inkubieren für 16 Stunden einer 50 µl-Reaktion, die 1 µg Adeno2-DNA und 200 Einheiten Enzym enthielt, wurde dasselbe Muster an DNA-Banden erzeugt wie bei einer Reaktion, die in einer Stunde mit einer Einheit Enzym durchgeführt wurde. 3) Exonukleaseaktivität: Nach einer Inkubation von 200 Einheiten Enzym für 4 Stunden bei 37ºC in einer 50 µl-Reaktion, die 1 µg beschallte ³H-DNA (10&sup5; cpm/µg) enthielt, wurde weniger als 0,03% Radioaktivität freigesetzt. 4) Endonukleaseverunreinigung: Nach einer Inkubation von 200 Einheiten Enzym für 4 Stunden bei 37ºC in einer 50 µl-Reaktion, die 1 µg ΦX174-RFI-DNA enthielt, wurden weniger als 5% zu RF II umgewandelt. 5) Genomischer Megabasenverdau: Der Verdau von einem Mikrogramm genomischer E. coli-DNA, die in 0,5% Agarose eingebettet war, unter Inkubation mit 200 u NotI für 16 Stunden in 100 µl NEBuffer Nr. 3, führte zu denselben Grenzverdau-Bandenmustern wie 5 u in 4 Stunden, wie durch PFG-Elektrophorese bestimmt wurde. Alle Tests wurden in dem folgenden Reaktionspuffer durchgeführt: NEBuffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT pH 7,9 bei 25ºC), ergänzt mit 100 µg/ml BSA.

Claims

1. Isoliertes DNA-Segment, welches für Not I-Restriktionsendonuklease codiert, wobei die isolierte DNA aus Nocardia otitidis-caviarum erhältlich ist.

2. Rekombinanter Vektor, welcher einen Vektor umfaßt, in welchen ein DNA-Segment, das für Not I-Restriktionsendonuklease codiert, eingefügt wurde.

3. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 2, welcher das isolierte DNA-Segment nach Anspruch 1 umfaßt.

4. Rekombinanter Vektor gemäß Anspruch 3, wobei der Vektor das Plasmid pRM189-1 (ATCC 69139) umfaßt.

5. Wirtszelle, welche mit dem rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 2, 3 oder 4 transformiert wurde.

6. Verfahren zum Herstellen von Not I-Restriktionsendonuklease, welches das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor gemäß Anspruch 2, 3 oder 4 transformiert wurde, unter Bedingungen für eine Expression der Endonuklease umfaßt.

7. Das isolierte DNA-Segment nach Anspruch 1, wobei das isolierte DNA-Segment die SEQ ID NO:17 umfaßt.