DE60308934T2 - Verfahren zur Klonierung und Exprimierung von Bsal Restriktionsendonuklease und Bsal Methylase in E. coli - Google Patents

Verfahren zur Klonierung und Exprimierung von Bsal Restriktionsendonuklease und Bsal Methylase in E. coli Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BsaI Restriktionsendonuclease (BsaI Endonuclease oder BsaI) sowie BsaI Methyltransferasen (BsaI Methylasen, M.BsaIA und M.BsaIB oder M.BsaIAB) kodiert, sowie die Expression der BsaI Endonuclease und Methylase in E. coli Zellen, die rekombinante DNA enthalten.
  • BsaI Endonuclease ist im Stamm von Bacillus stearothermophilus 6-55 (New England Biolabs' Stammsammlung Nr. 481; Beverly, MA)) zu finden. Sie bindet sich an die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'GGTCTC3' N1/N5 und spaltet die stromabwärtige Sequenz bei N1 (oberer Strang) und N5 (unterer Strang), um einen 4-Basen-Überhang am 5' Ende zu erzeugen (/ gibt die Spaltung einer Phosphodiesterbindung an). BsaI Methylasen (M.BsaIA und M.BsaIB)) sind ebenfalls in demselben Stamm zu finden. M.BsaIA ist eine Adeninmethylase, die vermutlich das Adenin am unteren Strang (5'GAGACC3') modifiziert. M.BsaIB ist eine C5 Methylase, die vermutlich den oberen Strang des BsaI Ortes modifiziert.
  • Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien und in einigen Viren vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterien/Virenproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
  • Restriktionsendonucleasen erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") auf DNA-Molekülen. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb (z.B. BamHI), auf einer Seite (z.B. SapI) oder auf beiden Seiten (z.B. TspRI) der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertundelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen hundert bisher untersuchten Bakterienspezies identifiziert (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27: 312–313 (1999)).
  • Restriktionsendonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien, bei denen sie entdeckt werden, benannt. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit den Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTT/AAA3', 5'PuG/GNCCPy3' und 5'CACNNN/GTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G/AATTC3' erkennt.
  • Eine zweite Komponente von bakteriellen/viralen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methylasen. Diese Enzyme koexistieren mit Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich. Während und nach der DNA-Replikation ist gewöhnlich auch die halbmethylierte DNA (auf einem Strang methylierte DNA) gegen den kognaten Restriktionsverdau resistent.
  • Mit dem Fortschritt der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines effizienten Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10–3 bis 10–9 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschten Klone mit Nicht-Methylase-Inserts zerstört werden, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
  • Es wurde eine große Zahl von Restriktions-Modifikationssystemen des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717–719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507 (1981)). Da die Expression von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur begrenzt Erfolg hat. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand verleihen, um selektives Überleben zu gewähren.
  • Ein weiterer Klonierungsansatz beinhaltet das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsvektoren (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501–509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202: 83–88 (1997)).
  • Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da Restriktionsmodifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
  • Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von thermostabilen Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (US-Patent Nr. 5,498,535; Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an einen DNA-Schaden genutzt, der durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht wird. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535). Der Nachteil dieses Verfahrens ist, dass sich einige positive blaue Klone, die ein Restriktionsendonucleasegen enthalten, infolge des Fehlens des zugehörigen Methylasegens schwer kultivieren lassen.
  • Es gibt drei Hauptgruppen von DNA-Methylasen auf der Basis der Position und der modifizierten Base (C5 Cytosinmethylasen, N4 Cytosinmethylasen und N6 Adeninmethylasen). N4 Cytosin und N6 Adeninmethylasen sind Aminomethyltransferasen (Malone et al. J. Mol. Biol. 253–618–632 (1995)). Wird ein Restriktionsort auf der DNA durch die Methylase modifiziert (methyliert), dann ist er gegen einen Verdau durch die zugehörige Restriktionsendonuclease resistent. Manchmal kann eine Methylierung durch eine nicht zugehörige Methylase dem DNA-Ort ebenfalls Resistenz gegen einen Restriktionsverdau verleihen. Eine Dcm Methylasenmodifikation von 5'CCWGG3' (W = A oder T) kann die DNA z.B. auch gegen einen PspGI Restriktionsverdau resistent machen. Ein weiteres Beispiel ist, dass CpG Methylase das CG Dinucleotid modifizieren und den NotI Ort (5'GCGGCCGC3') gegen NotI Verdau widerstandsfähig machen kann (New England Biolabs' Katalog, 2000-01, Seite 220; Beverly, MA). Folglich können Methylasen als ein Werkzeug zum Modifizieren bestimmter DNA-Sequenzen verwendet werden, damit sie von Restriktionsenzymen nicht gespalten werden können.
  • Methylasegene des Typs II wurden in vielen sequenzierten bakteriellen Genomen gefunden (GenBank, http://www.ncbi.nlm.nih.gov; und Rebase, http://rebase.neb.com/rebase). Eine direkte Klonierung und Überexpression von ORFs neben den Methylasegenen brachte Restriktionsenzyme mit neuartigen Spezifitäten hervor (Kong et al. Nucl. Acids Res. 28: 3216–3223 (2000)). Somit entstand mikrobielles „Genome-Mining" als eine neue Möglichkeit zum Screenen/Klonieren von neuen Restriktionsenzymen des Typs II und Methylasen und ihren Isoschizomeren.
  • Informationen bezüglich der BsaI Restriktionsendonuclease sind in der REBASE Datenbank unter Enzym Nr. 313 zu finden. Informationen bezüglich BsaIA und BsaIB Methylasen sind in der REBASE Datenbank jeweils unter Enzym Nr. 5671 und 4777 zu finden (http//:rebase.NEB.COM).
  • Lepikhov et al. beschreiben in Nucleic Acids Research, 2001, Band 29, Nr. 22, Seiten 4691–4698 die Charakterisierung des Restriktionsmodifikationssystems des Typs IV BspLU11III von Bacillus sp. LU11. Dieses System besteht aus zwei Methyltransferasen und einer Endonuclease, wobei eine der Methyltransferasen cytosinspezifisch ist. Die drei Gene des Restriktionsmodifikationssystems sind eng miteinander verbunden und tandemartig angeordnet.
  • Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es ein starkes kommerzielles Interesse daran, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren des BsaI Endonucleasegens (bsaIR) von Bacillus stearothermophilus 6-55 in E. coli durch inverse PCR und direkte PCR-Amplifikation von genomischer DNA. Die inversen PCR Primersequenzen basieren auf der BsaI Methylasegen(bsaIMB)-Sequenz, die von der Methylaseselektion stammt.
  • Die Klonierung der bsaIM Gene durch das standardmäßige Methylaseselektionsverfahren erwies sich als schwierig. ApoI-, Sau3AI- und NlaIII-partielle genomische DNA- Bibliotheken wurden mit einem modifizierten Klonierungsvektor pRRS (ApR) konstruiert. Im Anschluss an einen BsaI Kontakt und eine Methylaseselektion wurden keine methylasepositiven Klone identifiziert. Zum Erhöhen der Selektionseffizienz wurde ein zweiter Schritt einer Mungbohnen-Nucleasebehandlung nach dem BsaI Verdau eingeschlossen, wodurch die DNA-Enden zerstört und das β-Lactamasegen inaktiviert wurde(n). Durch diesen zusätzlichen Schritt wurde die Methylaseselektionseffizienz erhöht und es wurden 20 BsaI resistente Klone erzeugt.
  • Da das Restriktionsgen gewöhnlich in unmittelbarer Nähe zum zugehörigen Methylasegen in einem speziellen R-M-System gelegen ist, wurde eine inverse PCR zum Klonieren der das bsaIMB Gen umgebenden angrenzenden DNA durchgeführt. Offene Leseraster (ORF) wurden auf beiden Seiten des bsaIMB Gens identifiziert. Ein zweites Methylasegen wurde stromaufwärts gefunden und das Restriktionsgen wurde stromabwärts gefunden.
  • Der BsmAI Ort (5'GTCTC) überlappt den BsaI Ort (5'GGTCTC) und M.BsmAI schützt die E. coli Chromosomen-DNA vor BsaI Verdau. Zum Exprimieren des bsaIR Gens in E. coli wurde ein nicht zugehöriges Methylasegen, bsmAIM Gen (M1::M2 Fusion) zuerst in pBR322 kloniert, um den T7 Expressionswirt ER2566 zuvor zu modifizieren. Das bsaIR Gen wurde durch PCR amplifiziert, mit pACYC-T7ter mit kompatiblen Enden ligiert und in den zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR322-BsmAIM] transformiert. Transformanten wurden kultiviert und BsaI Endonucleaseaktivität wurde in IPTG-induzierten Zellextrakten nachgewiesen. Drei Klone mit hoher BsaI Aktivität wurden sequenziert und es wurde bestätigt, dass Klon Nr. 5 die Wildtypsequenz enthielt.
  • Zwei weitere Expressionsstämme wurden unter Verwendung der zugehörigen Methylasegene konstruiert, ER2566 [pBR-BSaIMA&B, pACYC-T7ter-BsaIR] oder ER2683 [pACYC-BsaIMA&B, pUC19-BsaIR]. Keiner der Stämme erzeugte mehr BsaI Einheiten je Gramm nasser Zellen. Folglich wurde der nicht zugehörige methylasemodifizierte Stamm ER 2566 [pBR322-BsmAIM1M2, pACYC-T7ter-BsaI] als der BsaI Produktionsstamm verwendet.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1: Genorganisation des BsaI Restriktionsmodifikationssystems. bsaIMA, BsaI Methylase 1 Gen; bsaIMB, BsaI Methylase 2 Gen; bsaIR, bsaI Restriktionsendonucleasegen.
  • 2: DNA-Sequenz vom M.BsaIA Gen (bsaIMA, 1710 bp) (SEQ ID Nr. 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
  • 3: DNA-Sequenz vom M.BsaB Gen (bsaIMB, 1188 bp) SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
  • 4: DNA-Sequenz vom BsaI Endonucleasegen (bsaIR, 1635 bp) (SEQ ID Nr. 5) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
  • 5: Assay im Hinblick auf rekombinante BsaI Restriktionsendonucleaseaktivität unter Verwendung von Zellextrakt. Bahn 1, positive Kontrolle, T7 DNA verdaut mit gereinigtem nativem BsaI, Bahn 2 bis 11, T7 DNA behandelt mit verdünntem Zellextrakt, der rekombinante BsaI Endonuclease enthält. Die Verdünnungsfaktoren in den Bahnen 2 bis 11 waren: 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200, 1:6400, 1:12800, 1:25600, 1:51200. Bahn 12, 1 kb DNA Größenmarker.
  • 6: Gereinigtes rekombinantes BsaI Endonucleaseprotein auf SDS-PAGE Gel. Bahn 1, Broad Range Proteingrößenmarker; Bahn 2, gereinigte rekombinante BsaI Endonuclease. Scheinbare Größe der BsaI Endonuclease = 61 kDA; vorhergesagte Größe = 63,7 kDa.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Isolierung M.BsaI positiver Klone von den ApoI, Sau3AI und NlaIII DNA-Genombibliotheken war schwierig. Nach einem BsaI Kontakt der ApoI, Sau3AI und NlaIII Plasmid-DNA-Bibliotheken wurde die verdaute DNA in ER2502 übertragen, um M.BsaI-positive Klone zu screenen. Nach dem Screenen von 36 ApR Überlebenden wurden jedoch keine M.BsaI-positiven Klone identifiziert. Zum Erhöhen der BsaI Kontakteffizient und Reduzieren des Transformationshintergrunds wurde die BsaI-verdaute DNA weiter mit Mungbohnen-Nuclease behandelt. Diese Nuclease entfernt die 4-Basen-Enden und bewirkt eine Verlagerung des offenen Leserasters im β-Lactamasegen, wodurch das ApR Gen inaktiviert wird. Diese Strategie erwies sich bei der Klonierung des bsaIMB Gens als erfolgreich.
  • Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem die bsaIMA, bsaIMB und bsaIR Gene bevorzugt kloniert und exprimiert werden in E. Coli, beinhaltet die folgenden Schritte:
  • 1. Konstruktion genomischer DNA-Bibliotheken und Methylaseselektion
  • Genomische DNA wurde von Bacillus stearothermophilus 6-55 präpariert und mit den Restriktionsenzymen ApoI, Sau3AI und NlaIII verdaut. Genomische DNA-Bibliotheken wurden unter Verwendung eines modifizierten pRRS Vektors mit zwei BsaI Orten konstruiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente Restriktion-minus-E.coli-Zellen ER2502 durch Transformation übertragen. Etwa 104 Transformanten wurden gepoolt und über Nacht in einer 0,5-l-Kultur amplifiziert. Primärplasmid-DNA-Bibliotheken wurden durch das Qiagen Maxi-Säulenverfahren präpariert und mit BsaI und Mungbohnen-Nuclease in Kontakt gebracht. Nach dem Verdau wurden die Plasmide in ER2502 transformiert. Plasmide wurden von ApR Überlebenden präpariert und im Hinblick auf Resistenz gegen BsaI Verdau gescreent. Die resistenten Klone wurden als echte methylasepositive Klone durch DNA- Sequenzierung identifiziert. Das gesamte Insert wurde mit pUC19 Primern und maßgeschneiderten Primern sequenziert. Es wurde ein ORF mit 1188 bp gefunden, das die Bezeichnung bsaIMB erhielt und ein 395-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 44,4 kDa kodierte. M.BsaIB weist eine hohe Homologie zu anderen C5 Methylasen auf. Die konservierten Motive IX und X befinden sich jedoch am N-Terminus und nicht am C-Terminus. Eine inverse PCR wurde zum Amplifizieren der angrenzenden DNA-Sequenz verwendet. Nach fünf Runden der inversen PCR wurden zwei weitere Gene identifiziert. Das stromaufwärtige Gen bsaIMA umfasst 1710 bp und kodiert eine Aminomethyltransferase (569-aa Protein) mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 65,7 kDa.
  • 2. Klonierung des bsaIR Gens durch inverse PCR
  • Inverse PCR-Primer wurden auf der Basis der DNA-Sequenz des bsaIMB Gens hergestellt. Genomische DNA wurde mit Restriktionsenzymen mit 4–6 Basen Erkennungssequenzen verdaut und selbstligiert. Die zirkulären DNA-Moleküle wurden als Matrizen für die inverse PCR verwendet. Es wurden inverse PCR-Produkte stromabwärts von bsaIMB erhalten, gelgereinigt und sequenziert. Ein ORF von 1635 bp wurde stromabwärts des bsaIMB Gens gefunden. Dieses ORF wurde bsaIR Gen genannt. Es kodiert ein 544-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 63,7 kDa.
  • 3. Klonierung des bsmAIM Gens in pBR322 zur Konstruktion eines zuvor modifizierten Wirts
  • Da die BsmAI Erkennungssequenz (5'GTCTC') die BsaI Erkennungssequenz (5'GGTCTC3') überlappt, bietet M.BsmAI der E. coli Chromosomen-DNA und Plasmid-DNA Querschutz (Cross-Protection) vor BsaI Verdau. Man bemühte sich, M.BsmAI zuerst überzuexprimieren und einen zuvor modifizierten Expressionswirt zu konstruieren.
  • Das bsmAIM Gen wurde von der genomischen DNA durch PCR unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Die PCR DNA wurde mit NheI und SphI verdaut und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Der zuvor modifizierte Wirt ER2566 [pBR322-BsmAIM] wurde zum Überexprimieren des bsaIR Gens in E. coli verwendet.
  • 4. Expression des bsaIR Gens im T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter
  • Ein BamHI Fragment, das das bsaIR enthielt, wurde in den pACYC-T7ter Expressionsvektor kloniert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR322-BsmAIM] transformiert. ApR CMR Transformanten wurden kultiviert und mit IPTG induziert. Rekombinante BsaI Aktivität wurde im Überstand IPTG-induzierter Zellextrakte nachgewiesen. Plasmide wurden von Klonen mit hoher BsaI Aktivität extrahiert. Nach dem Sequenzieren des Inserts wurde der Klon mit Wildtypsequenz für eine Stabilitätsstudie und Reinigung der BsaI Endonculease verwendet.
  • 5. Expression des bsaIR Gens im zugehörigen methylasemodifizierten Wirt
  • Ein zweiter Expressionsstamm wurde mit den zugehörigen Methylasegenen konstruiert, ER2566 [pBR-BsaIMA&B, pACYC-T7ter-BsaIR]. Die Ausbeute an rekombinanter BsaI von diesem Expressionsklon wurde mit 0,7 – 1,4 × 106 Einheiten BsaI/g nasser Zellen geschätzt. Der erste Expressionsstamm ER2566 [pBR322-BsmAIM1M2, pACYC-T7ter-BsaIR] produziert 1,0 – 2,0 106 Einheiten BsaI/g nasser Zellen. Außerdem wurde ein dritter Expressionsstamm konstruiert, in dem die bsaIMA und bsaIMB Gene von pACYC184 exprimiert wurden und das basIR Gen von pUC19 exprimiert wurde, ER2683 [pACYC-BsaIMA&B, pUC19-BsaIR]. Dieser Stamm erzeugte auch weniger BsaI Einheiten je Gramm nasser Zellen. Folglich wurde der im Abschnitt 4 beschriebene Stamm ER2566 [pBR322-BsmAIM 1M2, pACYC-T7ter-BsaI] als BsaI Produktionsstamm verwendet.
  • 6. Reinigung der BsaI Restriktionsendonuclease IPTG-induzierte Zellextrakte, die rekombinante BsaI
  • Endonuclease enthielten, wurden durch Wärmebehandlung bei 55°C eine Stunde lang gereinigt, um E. coli Proteine zu denaturieren. Die hitzedenaturierten Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand mit BsaI Aktivität wurde weiter durch Chromatographie durch Heparin-Sepharose- und DEAE-Sepharose-Säulen gereinigt. Das gereinigte BsaI Protein wurde auf SDS-PAGE analysiert und der N-Terminus des rekombinanten BsaI Proteins wurde sequenziert, um die ersten 20 aa-Reste zu erhalten. Die tatsächliche aa-Sequenz stimmte völlig mit der vorhergesagten aa-Sequenz auf der Basis der DNA-Kodierungssequenz überein.
  • Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand des folgenden Beispiels erläutert. Dieses Beispiel soll dem Verständnis der Erfindung dienen und ist nicht als diese begrenzend anzusehen.
  • 1. BEISPIEL
  • Klonierung des BsaI Restriktionsmodifikationssystems in E. coli
  • 1. Herstellung genomischer DNA und Restriktionsverdau genomischer DNA und Konstruktion genomischer DNA-Bibliotheken
    • 1. Genomische DNA wurde von Bacillus stearothermophilus 6-55 (New England Biolabs' Sammlung Nr. 481; Beverly, MA) mit dem Standardverfahren präpariert, das die folgenden Schritte beinhaltet: (a) Zelllyse durch Zugabe von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1 % Endkonz.) und 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0; (b) Zelllyse durch Zugabe von 10 % SDS (Endkonzentration 0,1 %); (c) weitere Zelllyse durch Zugabe von 1 % Triton X-100 und 62 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; (d) Phenol-CHCl3-Extraktion von DNA, dreimal (gleiches Volumen), und CHCl3-Extraktion, einmal; (e) DNA-Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, dreimal Wechsel; und (f) RNA-Entfernung durch RNase-A-Behandlung und Präzipitation genomischer DNA in 95%igem Ethanol, Wäsche mit 70%igem Ethanol, Vakuumtrocknung und Resuspension in TE-Puffer.
  • Das Restriktionsenzym ApoI wurde durch 2fache Reihenverdünnungen verdünnt. Neun μg genomische DNA wurden teilweise mit unterschiedlichen Mengen von ApoI (2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,061 Einheiten) bei 50°C 30 min lang verdaut. Es wurde ein guter teilweiser Verdau bei 0,5, 0,25 und 0,125 Einheiten von ApoI erreicht. Die mit ApoI teilweise verdauten genomischen DNA-Fragmente im Bereich von 3 bis 10 kb wurden gelgereinigt und mit CIP-behandeltem pRRS Vektor mit kompatiblen Enden ligiert. Der pRRS Vektor wurde durch Einfügen eines BsaI Linkers am SspI Ort modifiziert. Zweck dieser Modifikation war die Steigerung der Effizienz der Methylaseselektion. Teilverdaus fanden außerdem mit Sau3AI und NlaIII auf genomischer DNA statt (2, 1, 0,5, 0,25, 0,125, 0,061 Einheiten Sau3AI; 0,12, 0,06, 0,03, 0,015, 0,0075 Einheiten NlaIII). Wieder wurden die DNA-Fragmente im Bereich von 3 bis 10 kb gelgereinigt und jeweils mit BamHI- und SphI-verdautem pRRS ligiert. Die ligierte DNA wurde zum Transformieren elektrokompetenter ER2502 Zellen durch Elektroporation verwendet. ApR Transformanten wurden auf Ap-Platten selektiert (100 μg/ml Ap).
  • 2. Klonierung von bsaIMB per Methylaseselektionsverfahren
  • Mehr als 10.000 ApR Transformanten wurden von ApoI, NlaIII und Sau3AI Bibliotheken erhalten. Alle Kolonien wurden gepoolt und amplifiziert in einer 1 Liter LB + AP Übernachtkultur. Plasmid-DNA wurde mit dem Qiagen Maxi- Prep-Kit präpariert. 0,8 ng – 0,2 μg der Bibliothek-DNA wurden mit 100 Einheiten BsaI bei 50°C 2 Stunden lang in Kontakt gebracht. Die in Kontakt gebrachte Plasmid-DNA wurde zur Retransformation in ER2502 verwendet und auf Ap-Platten plattiert. Überlebende ApR Transformanten wurden selektiert. Sechsunddreißig Kolonien wurden in 2 ml LB + Ap inokuliert und über Nacht kultiviert. Plasmid-DNA wurde mit Qiagen Spin-Säulen präpariert und im Hinblick auf Resistenz gegen BsaI Verdau gescreent. Keines der 36 Plasmide wies Resistenz gegen BsaI Verdau auf.
  • Zum Erhöhen der Methylaseselektionseffizienz nach dem BsaI Verdau der Plasmid-Bibliothek wurden die verdauten Plasmide mit 100 Einheiten Mungbohnen-Nuclease bei 37°C 1 Stunde lang weiter behandelt. Die Mungbohnen-Nuclease entfernte den 4-Basen-Überhang und zerstörte das ApR resistente Gen (4-Basen-Deletion innerhalb des β-Lactamasegens inaktiviert dieses Gen). Dieselbe Plasmidbibliothek wurde mit BsaI in Kontakt gebracht und in zwei Hälften unterteilt. Eine Hälfte der DNA wurde mit Mungbohnen-Nuclease weiter behandelt. Beide DNA-Proben wurden zum Transformieren kompetenter ER2502 Zellen verwendet. Es wurde gefunden, dass die mit Mungbohnen-Nuclease behandelte DNA 5 Mal weniger Transformanten hervorbrachte als unbehandelte DNA. Sechsunddreißig individuelle Transformanten von der mit Mungbohnen-Nuclease behandelten DNA wurden aufgenommen und in 2 ml LB + Ap inokuliert und über Nacht kultiviert. Plasmid-DNA wurde präpariert und durch BsaI Verdau und Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Zwanzig von 36 gescreenten wiesen Resistenz auf. Die Isolate Nr. 7, 8, 10, 12 und 13 haben ein gemeinsames 1,3 kb HindIII Fragment durch HindIII Verdau. Dieses gemeinsame HindIII Fragment wurde in pUC19 subkloniert und sequenziert und man stellte fest, dass es eine C5 Methylase kodierte. Dieses Gen umfasst 1188 bp und wurde bsaIMB Gen genannt, wobei M.BsaIB kodiert wird, da die BsaI Erkennungssequenz asymmetrisch ist, und es wurde vorhergesagt, dass eine zweite Methylase in diesem R-M-System vorliegen müsste.
  • 3. Inverse PCR-Amplifikation und Sequenzierung angrenzender DNA und Identifikation des bsaIR Gens
  • Da sich R-M Gene des Typs II normalerweise in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wurden Anstrengungen unternommen, um die DNA-Sequenz neben dem bsaIMB Gen zu amplifizieren. Genomische B. stearothermophilus 6-55 DNA wurde mit Restriktionsenzymen mit 4 bis 6 bp Erkennungssequenz verdaut, um DNA-Fragmente zu identifizieren, die das bsaIMB Gen und die flankierende DNA umfassen. Genomische B. stearothermophilus DNA wurde jeweils mit AatII, AseI, BamHI, BssHII, DraI, HaeII, MfeI, NcoI, NdeI, NspI, PstI, SacI, SpeI, SspI, XbaI und XhoI verdaut. Die genomischen DNA-Fragmente wurden in einer geringen Konzentration (2 μg/ml) selbstligiert und die ligierten zirkulären Moleküle wurden als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die inversen PCR-Primer haben die folgende Sequenz:
    5' agataaattagctcttacttgagcttc 3' (258-98) (SEQ ID Nr. 7)
    5' ggagagcacatataccgaagttag 3' (258-99) (SEQ ID Nr. 8)
  • Die Bedingungen der inversen PCR waren wie folgt: 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec, 72°C für 3 min, 30 Zyklen mit Vent®(exo–) DNA-Polymerase. Ein 1,2 kb inverses PCR-Produkt wurde in der NdeI Matrize gefunden. Das 1,2 kb Fragment wurde gelgereinigt und direkt mit Primern 258-98 und 99 sequenziert, wodurch etwa 700 bp neue DNA-Sequenz erzeugt wurden.
  • Es wurde ein zweiter Satz inverser PCR-Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
    5' gctcttcagtgtattttgtatctc 3' (259-137) (SEQ ID Nr. 9)
    5' tgagaattggattcgaagcactta 3' (259-138) (SEQ ID Nr. 10)
  • Mit AatII, AseI, BamHI, BssHII, DraI, NaeII, MfeI, NCoI, NdeI, NspI, PstI, SacI, SpeI, SspI, XbaI und XhoI verdaute und selbstligierte DNA-Moleküle wurden als Matrize für inverse PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren wie folgt: 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec, 72°C für 3 min, 30 Zyklen mit Deep Vent®(exo–) DNA-Polymerase. Ein 600 bp inverses PCR-Produkt wurde in der DraI Matrize gefunden. Das 600-bp-Fragment wurde gelgereinigt und direkt mit Primern 259-137 und 138 sequenziert, wobei etwa 200 bp neue DNA-Sequenz erzeugt wurden.
  • Es wurde ein dritter Satz inverser PCR-Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
    5' gagatagagtatattgaaatacta 3' (259-139) (SEQ ID Nr. 11)
    5' ttacccatggcgggtttgtaatac 3' (259-140) (SEQ ID Nr. 12)
  • Mit AatII, AseI, BamHI, BssHII, DraI, HaeII, MfeI, NcoI, NdeI, NspI, PsrI, SacI, SpeI, SspI, XbaI und XhoI verdaute und selbstligierte DNA-Moleküle wurden als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren wie folgt: 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec, 72°C für 3 min, 30 Zyklen mit Deep Vent®(exo ) DNA-Polymerase. Ein 650 bp inverses PCR-Produkt wurde in der AseI Matrize gefunden. Das 650-bp-Fragment wurde gelgereinigt und direkt mit Primern 259-139 und 140 sequenziert, wobei etwa 400 bp neue DNA-Sequenz erzeugt wurden.
  • Es wurde ein vierter Satz inverser PCR-Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
    5' tctgcagaacaagggcctgggtgg 3' (264-210) (SEQ ID Nr. 13)
    5' catattggtcctatttcccttggt 3' (264-211) (SEQ ID Nr. 14)
  • Genomische B. stearothermophilus DNA wurde jeweils mit AciI, ApoI, BsaWI, BspHI, BstBI, HincII, HindIII, NlaIII, RsaI, SpeI, SspI, TaqI, TfiI, Tsp45I und XmnI verdaut. Die genomischen DNA-Fragmente wurden bei niedriger Konzentration (2 μg/ml) selbstligiert und die ligierten zirkulären Moleküle wurden als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren wie folgt: 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec, 72°C für 3 min, 30 Zyklen mit jeweils Vent®(exo) DNA-Polymerase und Taq DNA-Polymerase. Ein 1,2 kb inverses PCR-Produkt wurde in der SspI Matrize gefunden. Das 1,2-kb-Fragment wurde gelgereinigt und direkt mit Primern 264-210 und 211 sequenziert, wobei etwa 540 bp neue DNA-Sequenz erzeugt wurden.
  • Es wurde ein fünfter Satz inverser PCR-Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
    5' caatttaaccaagtatctaaatcg (270-223) (SEQ ID Nr. 15)
    5' ttctgtttatattccgagtgaacc (270-224) (SEQ ID Nr. 16)
  • Mit AciI, ApoI, BsaWI, BspHI, BstBI, HincII, HindIII, NIaIII, RsaI, SpeI, SspI, TaqI, TfiI, Tsp45I und XmnI verdaute und selbstligierte zirkuläre Moleküle wurden als Matrize für eine inverse PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren wie folgt: 94°C für 30 sec, 55°C für 30 sec, 72°C für 3 min, 30 Zyklen mit Vent®(exo) DNA-Polymerase. 0,9, 1,6 und 1,2 kb inverse PCR-Produkte wurden jeweils in den ApoI, RsaI und TaqI Matrizen gefunden. Das 1,2-kb-Fragment wurde gelgereinigt und direkt mit Primern 270-223 und 224 sequenziert, wobei etwa 600 bp neue DNA-Sequenz erzeugt wurden.
  • Nach fünf Runden der inversen PCR und einer Sequenzierung der ursprünglichen methylasepositiven Klone wurden zwei zusätzliche ORFs stromaufwärts und stromabwärts gefunden. Das stromaufwärtige ORF wurde bsaIMA genannt und kodierte M.BsaIA, eine Adeninmethyltransferase. Auf der Basis eines Aminosäuresequenzvergleichs mit anderen Aminomethylasen gehört die M.BsaA Methylase zum γ-Typ der N6A Methylase.
  • Von den C5 Methylasen befinden sich die konservierten Aminosäureblöcke IX und X am C-Terminus des Proteins. Konservierte Blöcke I bis VIII und die variable Region befinden sich vor den Blöcken IX und X. In M.BsaIB befinden sich die C5 Methylaseblöcke IX und X jedoch am N-Terminus und zeigen eine zirkuläre Permutation der beiden Blöcke. Eine solche zirkuläre Permutation wurde in der BssHII Methylase gefunden.
  • Ein ORF mit 1635 bp wurde stromabwärts der bsaIMA und bsaIMB Gene gefunden. Dieses ORF wurde bsaIR Gen genannt. Es kodiert ein 544-aa Protein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 63,7 kDa (4). Wie im Folgenden demonstriert wird, ist es das bona fide R-Gen, das die BsaI Restriktionsendonuclease kodiert.
  • 4. Klonierung der bsmAIM1M2 Gene in pBR322 und Konstruktion eines zuvor modifizierten Wirts
  • Da die BsmAI Erkennungssequenz (5'GTCTC') mit der BsaI Erkennungssequenz (5'GGTCTC3') überlappt, bietet M.BsmAI der E. coli Chromosomen-DNA vor BsaI Verdau einen Querschutz (Cross-Protection). Man bmühte sich, M.BsmAI zuerst überzuexprimieren und einen zuvor modifizierten Expressionswirt zu konstruieren. M.BsmAI ist eine Fusion von M1 und M2.
  • Es wurden zwei Primer mit der folgenden Sequenz synthetisiert:
    5' GGTGGTGCTAGCGGAGGTAAATAAATGAAAGAAAACACAGAAATT AATATAGAT 3' (253-245, unterstrichene nt, NheI Ort) (SEQ ID Nr. 17)
    5' GGTGGTGCATGCCTAATATATTTCTTGGTACGTCATTTT 3' (253-246, unterstrichene nt, SphI Ort) (SEQ ID Nr. 18)
  • Das bsmAIM Gen wurde von der genomischen DNA in PCR unter Verwendung der Primer 253-245 und 253-246 unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert: 95°C für 1 min, 55°C für 1 min, 72°C für 4 min, 25 Zyklen. Die PCR DNA wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit NheI und SphI verdaut. Das PCR-Fragment wurde wieder in leicht schmelzendem Agarosegel gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Ligiertes Plasmid wurde in ER2566 (T7 Expressionsstamm, NEB's Sammlung) transformiert. Die APR Transformanten wurden gepoolt und Plasmid-DNA wurde präpariert. Das Plasmidgemisch wurde mit BsmAI Endonuclease in Kontakt gebracht und zurück in ER2566 Zellen retransformiert. Man stellte fest, dass vier von sechs Klonen das Insert mit der richtigen Größe aufwiesen und gegen BsmAI Verdau resistent waren. Der zuvor modifizierte Wirt ER2566 [pBR322-BsmAIM] wurde zur Expression des bsaIR Gens in E. coli verwendet.
  • 5. Expression des bsaIR Gens im T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter
  • Zum Konstruieren eines stabilen Expressionsklons wurde das bsmAIM Gen von einem Vektor pBR322 mittlerer Kopienzahl exprimiert und das bsaIR Gen wurde von einem Vektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl exprimiert. Der Vektor pACYC-T7ter enthält einen T7 Promotor, ein CmR Gen, ein lacI Gen, einen p15A Replikationsstartpunkt und vier Kopien von Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des T7 Promotors, um die Run-off Transkription von kryptischen E. coli Promotoren zu reduzieren.
  • NdeI und BamHI Restriktionsorte wurden jeweils in die Vorwärts- und Rückwärts-PCR-Primer zur Amplifikation des bsaIR Gens durch PCR eingebaut. Die Primer haben die folgende Sequenz:
    5' GGTGGTCATATGGGAAAAAAAGCTGAATATGGA 3' (271-161, unterstrichene nt, NdeI Ort) (SEQ ID Nr. 19)
    5'- GGTGGTGGATCCTCATTAATCTAAATCTGCAAATGT 3' (271-162, unterstrichene nt, BamHI Ort) (SEQ ID Nr. 20)
  • Das bsaIR Gen wurde durch PCR mit Vent® DNA-Polymerase und den Primern 271-161 und 162 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C für 1 min, 50°C für 1,5 min, 72°C für 1,5 min, 25 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde mit einer Qiagen Spin-Säule gereinigt und über Nacht mit NdeI und BamHI verdaut. Nach der Reinigung von leicht schmelzendem Agarosegel und einer β-Agarasebehandlung wurde die DNA mit Ethanol und NaOAc präzipitiert. Die PCR DNA wurde mit CIP-behandeltem pACYC-T7ter mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in den zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR322-BsmAIM] transformiert und im Hinblick auf ApR CMR Transformanten selektiert. Individuelle Transformanten wurden dann aufgenommen und in 10 ml LB plus AP (100 μg/ml) und Cm (33 μg/ml) bis zur späten log-Phase kultiviert und mit IPTG (0,5 mM Endkonz.) 3 Stunden lang induziert. Sechsunddreißig Zellextrakte wurden im Hinblick auf BsaI Aktivität geprüft. Sieben Klone (Nr. 2, 3, 5, 18, 21, 25 und 32) wiesen eine hohe BsaI Aktivität auf. Drei Plasmide (Nr. 2, 3, 5) von hoch aktiven Klonen wurden sequenziert; man stellte fest, dass Nr. 5 die Wildtypsequenz enthielt, und es wurde in der anschließenden großtechnischen Reinigung des BsaI Endonucleaseproteins verwendet.
  • 6. Klonierung des bsaIMA und bsaIMB Gens in pBR322, um einen zuvor modifizierten Wirt zu konstruieren
  • Es wurden zwei Primer mit den folgenden Sequenzen synthetisiert:
    5' GGTGGTGGATCCGGAGGTAAATAAATGAGTAATGCTAAAAGTTTCTCT3' (270-148, unterstrichene nt, BamHI Ort) (SEQ ID Nr. 21)
    5' GGTGGTGCATGCTTATATTATCGCTAAACTGCTCAA 3' (270-150, unterstrichene nt, SphI Ort) (SEQ ID Nr. 22)
  • Die bsaIMA und bsaIMB Gene wurden durch Vent® DNA-Polymerase von genomischer DNA in PCR unter Verwendung der Primer 270-148 und 270-150 unter den folgenden PCR-Bedingungen amplifiziert: 95°C für 1 min, 55°C für 1,5 min, 72°C für 4 min, 25 Zyklen. Die PCR DNA wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gelgereinigt und mit BamHI und SphI verdaut. Das PCR-Fragment wurde wieder in leicht schmelzendem Agarosegel gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Ligiertes Plasmid wurde in ER2566 (T7 Expressionsstamm, NEB's-Stammsammlung) transformiert. Die ApR Transformanten wurden gepoolt und Plasmid-DNA wurde präpariert. Das Plasmidgemisch wurde mit BsaI Endonuclease in Kontakt gebracht und zurück in ER2566 Zellen retransformiert. Plasmid-DNA wurde wieder präpariert und mit BsaI Endonuclease verdaut. Man stellte fest, dass einer von drei Klonen das Insert mit der richtigen Größe hatte und gegen BsaI Verdau resistent war. Der zuvor modifizierte Wirt ER2566 [pBR322-BsaIMA&B] wurde zur Expression des bsaIR Gens in E. coli verwendet.
  • Das im Abschnitt 4 isolierte Plasmid pACYC-T7ter wurde in ER2566 [pBR322-BsaIMA&B] durch Transformation übertragen. ApR und CmR Kolonien wurden selektiert und Transformanten wurden in 10 ml LB plus Ap und Cm über Nacht kultiviert. Die 10 ml Zellen wurden in 500 ml LB plus Ap und Cm inokuliert und fünf Stunden lang kultiviert. Nach der Zugabe von 0,5 mM IPTG (Endkonzentration) wurde das Zellwachstum 3 Stunden lang fortgesetzt. Zellen wurden geerntet und in einem Beschallungspuffer resuspendiert. Die Zelllyse wurde durch Beschallung vervollständigt und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Zellextrakt wurde verdünnt und auf T7 DNA geprüft. Die Ausbeute von rekombinantem BsaI von diesem Expressionsklon wurde auf 0,7 – 1,4 × 106 Einheiten BsaI/g nasser Zellen geschätzt. Die rekombinante BsaI Aktivität vom vorherigen Expressionsstamm ER2566 [pBR322-BsmAIM1M2, pACYC-T7ter-BsaIR] lag bei 1,0 – 2,0 × 106 Einheiten BsaI/g nasser Zellen. Außerdem wurde ein dritter Expressionsstamm konstruiert, in dem die bsaIMA und bsaIMB Gene von pACYC184 und das bsaIR Gen von pUC19 exprimiert wurden. Dieser Stamm erzeugte auch weniger BsaI Einheiten je Gramm nasser Zellen. Folglich wurde der Stamm 2566 [pBR322-BsmAIM1M2, pACYC-T7ter-BsaI] als BsaI Produktionsstamm verwendet.
  • 7. Reinigung der BsaI Endonuclease
  • Zellextrakt wurde durch Beschallung von 4 Gramm IPTG-induzierten Zellen präpariert, die in 20 ml Beschallungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert waren. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 15.000 rpm 30 min lang entfernt. Die BsaI Aktivität wurde gemessen. Der Zellextrakt wurde eine Stunde lang auf 55°C erhitzt, um thermolabile E. coli Proteine zu denaturieren. Denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Der Überstand wurde auf eine 20 ml Heparin Sepharose-Säule geladen. Nach einer gründlichen Wäsche mit einem salzarmen Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) wurden Fraktionen mit einem NaCl-Gradient von 0,05 M–1 M eluiert. Fraktionen, die BsaI Endonuclease enthielten, wie durch einen Aktivitätsassy auf λ DNA bestimmt wurde, wurden gepoolt und über Nacht in DEAE-Sepharose Ladepuffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA) dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Proteingemisch auf eine DEAE Sepharose-Säule geladen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde. Fraktionen wurden mit einem Gradient von 0,05 M – 1 M NaCl eluiert und Fraktionen mit gereinigtem BsaI wurden gepoolt. Rekombinante BsaI wurde auf SDS-PAGE analysiert. Die Homogenität lag schätzungsweise bei >92% (6). Es wurden insgesamt 106 Einheiten an funktionell gereinigter BsaI erhalten. Die scheinbare Molekülgröße des BsaI Proteins auf dem Gel schien bei 61 kDa zu liegen, was etwas geringer als die vorhergesagte Größe von 63,7 kDa war. Zum Bestimmen der exakten Startaminosäure der rekombinanten BsaI Endonuclease wurde das gereinigte Protein einer N-terminalen Sequenzierungsanalyse unterzogen. Es wurde bestätigt, dass das Protein die korrekte N-terminale Aminosäuresequenz enthielt.
    (M) GKKAEYGQGHPIFLEYAEQ (SEQ ID Nr. 23).
  • Die Migrationsdifferenz rührt möglicherweise von Faktoren wie der aa-Rest-Zusammensetzung und Seitenkettenladungen her.
  • Der Stamm ER2566 [pBR322-BsmAIM, pACYC-T7ter-BsaIR] wurde am 26. März 2002 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt und erhielt die ATCC Akzessions-Nr. PTA-4181.
  • SEQUENZAUFLISTUNG
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001
  • Figure 00260001
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  • Figure 00300001
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  • Figure 00330001
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  • Figure 00370001
  • Figure 00380001
  • Figure 00390001
  • Figure 00400001

Claims (6)

  1. Isoliertes DNA-Segment, das die BsaI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-4181 erhältlich ist.
  2. Rekombinanter DNA-Vektor, der ein DNA-Segment aus Anspruch 1 umfasst, das das BsaI Restriktionsendonucleasegen kodiert.
  3. Isoliertes DNA-Segment, das die BsaI Restriktionsendonuclease und BsaI Methylase kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-4181 erhältlich ist.
  4. Vektor, der die isolierte DNA aus Anspruch 3 umfasst.
  5. Wirtszelle, die durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert ist.
  6. Verfahren zur Herstellung von rekombinanter BsaI Restriktionsendonuclease, das das Kultivieren einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease und Methylase beinhaltet.
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