DE69424592T2

DE69424592T2 - Verfahren zur Klonierung und zur Herstellung der Restriktionsendonuklease und Modifikationsmethylase BglII

Info

Publication number: DE69424592T2
Application number: DE69424592T
Authority: DE
Inventors: Brian P. Anton; Joan E. Brooks; Daniel F. Heiter
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1993-04-09
Filing date: 1994-03-29
Publication date: 2001-01-25
Anticipated expiration: 2014-03-30
Also published as: EP0619373A3; DE69424592D1; EP0619373A2; JP2005237393A; JPH0775582A; JP3741453B2; EP0619373B1; US5434068A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BglII Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, sowie die Herstellung dieser Enzyme von Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
Restriktionsendonucleasen sind heute eines der führenden Instrumente der Molekularbiologie. Sie kommen in vielen verschiedenen Bakterien, wie Eubakterien und Archaebakterien, natürlich vor (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 20 : 2167-2180, (1992)), und im gereinigten Zustand können sie für das sequenzspezifische Zerschneiden von DNA in präzise Fragmente verwendet werden. Mit der großen Anzahl von Restriktionsenzymen, die zur Zeit im Handel erhältlich sind, können DNA-Moleküle eindeutig identifiziert und in Komponentengene fraktioniert werden.
Restriktionsendonucleasen sind ein Bestandteil von Restriktions-Modifikations-(RM)-Systemen, die seit mehr als vierzig Jahren umfangreichen Studien unterzogen werden (Luria und Human, J. Bacteriol. 64: 557-569, (1952); Bertani und Weigle, J. Bacteriol. 65: 113-121, (1953)). Die Systeme enthalten gewöhnlich eine zweite Komponente, die Modifikationsmethylase (Arber und Linn, Ann. Rev. Biochem., 38: 467-500, (1969); Boyer, Ann. Rev. Microbiol. 25: 153- 176, (1971)). Es wird angenommen, dass RM-Systeme in der Natur als "Bakterienimmunsysteme" wirken, die in Zellen eintretende Fremd-DNA zerstören (Smith, PAABS REVISTA 5: 313-318, (1976)). Es ist jedoch bekannt, dass individuelle Bakterien sogar sieben verschiedene RM-Systeme enthalten, und diese offensichtliche Redundanz legt nahe, dass diese Systeme auch noch andere Funktionen haben (Stein et al., J. Bacteriol. 174: 4899-4906, (1992)).
In der Bakterie tastet die Restriktionsendonuclease ankommende DNA in bezug auf eine spezifische Erkennungssequenz ab und produziert doppelsträngige Abspaltungen im DNA-Molekül (Meselson, Ann. Rev. Biochem. 41: 447-466, (1972)). Die Modifikationsmethylase hat die Aufgabe, die eigene DNA der Bakterie vor der Wirkung ihres Restriktions-Pendants zu schützen. Die Methylase erkennt und bindet die gleiche DNA-Sequenz wie die entsprechende Endonuclease; anstatt zu spalten, methyliert sie jedoch einen spezifischen Rest innerhalb der Erkennungssequenz, wodurch eine endonukleolytische Bindung oder Spaltung verhindert wird (Smith, Science 205: 455-462, (1979)). Auf · diese Weise wird die bakterielle Wirts-DNA gegen eine Spaltung durch die Restriktionsendonucleasen in der Zelle vollkommen beständig gemacht.
Zu Beginn wurde der Begriff "RM-System" nur für Systeme verwendet, in denen die Komponenten genetisch definiert worden waren. Der Begriff bezieht sich mittlerweile jedoch auf jede ortsspezifische Endonuclease, die von einer Bakterie isoliert ist. In vielen Fällen wird die Existenz eines Modifikationsmethylasenbestandteils ohne strikten Nachweis angenommen (Roberts, CRC Crit. Rev. Biochem. 4: 123-164, (1976)).
Als offensichtlich wurde, dass eine große Zahl von Restriktionsenzymen von einer Vielzahl von Bakterien isoliert würden, entwickelten Smith und Nathans (J. Mol. Biol. 81: 419-423, (1973)) eine Nomenklatur, die, mit geringfügigen Änderungen, auch heute noch verwendet wird. Der Name eines Restriktionsenzyms umfasst drei Buchstaben, die die Gattung und die Spezies, von der es isoliert wurde, abkürzen. Bei Bedarf kommt noch ein vierter Buchstabe hinzu, um den Stamm zu kennzeichnen (wie z. B. Hind).
Römische Ziffern hinter dem Systemnamen werden zugeordnet, um mehrere Enzyme von derselben Quelle zu unterscheiden. Die Präfixe R und M beziehen sich jeweils auf Restriktionsendonuclease oder Modifikationsmethylase, sind gewöhnlich jedoch nicht enthalten. Wird die Drei- Buchstaben-Bezeichnung ohne Präfix benutzt, so geht man davon aus, dass sie sich auf die Endonuclease bezieht. Restriktionsendonucleasen und, in einem geringeren Maße, DNA-Methylasen, sind in der Gentechnik zu Reagenzien von unschätzbarem Wert geworden. Mit dem Wachstum und der Weiterentwicklung der Biotechnologie ist auch der kommerzielle Anreiz für eine Massenproduktion dieser Enzyme gestiegen. Eine Massenproduktion von Restriktionsenzymen von ihren nativen Organismen ist aus verschiedenen Gründen jedoch oft mit Schwierigkeiten verbunden. Zunächst einmal produzieren viele Organismen verschiedene RM-Systeme, und eine biochemische Trennung der verschiedenen Produkte ist oft problematisch. Zweitens können Bakterien neben multiplen Restriktionssystemen auch andere Nucleasen und DNA-Bindungsproteine produzieren, die biochemisch nur schwer von Restriktionsenzympräparaten entfernt werden können. Drittens kann die Menge eines von einem Organismus produzierten speziellen Enzyms sehr unbeständig sein und mit den Wachstumsbedingungen variieren. Schließlich kann die Vermehrung einiger Bakterien schwierig, kostspielig oder sogar gefährlich sein. Um diese Probleme in den Griff zu bekommen und reproduzierbar Restriktionsenzyme im Überfluss zu erhalten, wurden die Verfahren der Gentechnik zur Erzeugung hochproduktiver Bakterienstämme angewendet. Die Klonierung von RM-Systemen begann in den 70ern, und seither hatten jene, die mit dieser Aufgabe beschäftigt sind, mit zahlreichen Problemen zu kämpfen. Ein für jedes Klonierungsprojekt typisches Problem ist die Identifizierung und Isolierung des/der Gens/Gene von Interesse. Einige RM-Systeme sind im Plasmid enthalten, wodurch es in diesen Fällen relativ einfach ist, die DNA zu isolieren, die sowohl die Methylase- als auch die Endonucleasegene kodiert, und sie auf einen neuen Vektor zu übertragen (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids Res. 12: 3659-3676, (1984); PaeR7: Theriault und Roy, Gene 19: 355- 359, (1982); Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402-406, (1983); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164 : 501-509, (1985)).
Die große Mehrheit von RM-Systemen ist jedoch nicht plasmidkodiert. Sie werden hauptsächlich durch "Shotgun"- Verfahren kloniert, bei denen die chromosomale DNA mit Restriktionsendonucleasen oder anderen Mitteln in kleine Stücke von klonierbarer Größe gespalten wird. Die Stücke werden dann en masse mit einem Klonierungsvektor ligiert und in einen geeigneten bakteriellen Wirt transformiert, der "Bibliotheken" erzeugt, in denen jedes Gen mehrmals repräsentiert ist. Die Schwierigkeit besteht nun darin, selektive Verfahren zu finden, um solche Klone, die die Gene von Interesse tragen, aus den Tausenden von erzeugten Klonen zu identifizieren.
Das erste Selektionsverfahren, das erfolgreich zur Klonierung von RM-Systemen zur Anwendung kam und von den klassischen Eigenschaften der Systeme inspiriert war, beinhaltete die Verwendung von Bakteriophagen; Zellen, die ein RM-System trugen, überlebten einen Phagenangriff, wohingegen solche, die das RM-System nicht ausprägten, nicht überlebten (HhaII: Mann et al., Gene 3: 97-112, (1978); PstI: Walder et ah,-Proc. Natl. Acad Sci. USA 78; 1503-1507, (1981)). Leider hatte dieses Verfahren nur begrenzten Erfolg. Klonierte RM-Systeme sind nicht immer in einer Weise ausgeprägt, die selektives Überleben gewährt.
Sind außerdem multiple RM-Systeme in einer Zelle vorhanden, so kann nicht auf das spezielle RM-System abgezielt werden, das kloniert werden soll. Ferner sind andere klonierte Funktionen neben RM-Systemen in der Lage, die Zellen vor Phagenangriff zu schützen und sie die Selektion überleben zu lassen (Mann et al. Ibid; Howard et al., Nucl. Acids Res. 14: 7939-7951, (1986); Slatko et al., Nucl. Acids Res. 15: 9781-9796, (1987)).
Ein zweites Verfahren mit weiter reichendem Erfolg selektiert hinsichtlich der Expression des Methylasegens: Nach der Transformation methyliert jedes Plasmid in der Bibliothek, das das klonierte Methylasegen enthält und ausprägt, seine zugehörigen Erkennungsstellen. Wird die Bibliothek anschließend durch Spaltung mit einer Endonuclease der angemessenen Spezifität selektiert, dann sollten die modifizierten Plasmide nicht zerschnitten werden und auch nach einem zweiten Transformationsschritt lebensfähig bleiben. Die anderen Plasmide, die das Methylasegen nicht enthalten, sollten von der Endonuclease gespalten werden und folglich mit stark reduzierter Wirksamkeit transformieren (Kiss et al., Nucl. Acids Res. 13: 6403-6421, (1985); Lunnen et al., Gene 74; 25-32, (1988)). In allen bisher untersuchten RM-Systemen befinden sich die Restriktionsendonuclease- und die Modifikationsmethylasegene in unmittelbarer Nähe zueinander (Wilson, Nucl. Acids Res. 19: 2539-2566, (1991)); folglich bringt die Methylase-Selektion oft ein komplettes RM-System hervor. In anderen Fällen bringt die Selektion möglicherweise nur das Methylasegen hervor; es besteht allerdings oft die Möglichkeit, ein größeres oder ein benachbartes Fragment, das das Endonucleasegen enthält, in einem zweiten Schritt zu klonieren (siehe z. B. Kiss et al. Ibid).
Neben der Suche nach einem geeigneten Selektionsverfahren stößt man bei dem Versuch, RM-Systeme zu klonieren, auf eine Reihe anderer Schwierigkeiten. In einigen Systemen kommt es zum Beispiel zu Problemen, wenn das Endonucleasegen in Wirtszellen eingeführt wird, die noch nicht durch Modifikation geschützt sind. Werden beide Gene zusammen auf einem gemeinsamen DNA-Fragment eingeführt, dann schützt die Methylase das Wirtsgenom möglicherweise nicht ausreichend vor der Wirkung der Endonuclease, wenn die Endonuclease z. B. zu schnell oder in zu großen Mengen produziert wird. Seitdem werden Verfahren zur Klonierung der beiden Gene getrennt auf verschiedenen Vektoren entwickelt, um die Zelle vor der Aktivität des · Endonucleasegens zu schützen, bevor letztere eingeführt wird (Howard et al. Ibid). Eine umsichtige Auswahl von Vektoren kann für die Stabilität des Klons sowie für eine ausreichende Produktion von Endonuclease wesentlich sein (Brooks et al., Nucl. Acids Res. 19: 841-850, (1991)). Ein weiteres Hindernis bei der Klonierung von RM- Systemen in E.coli zeigte sich während des Versuchs, diverse Methylasen zu klonieren und auszuprägen. E.coli verfügt über eine Reihe von Systemen, die Fremd-DNA einschränken, die heterologe Cytosin- und/oder Adenin- Methylierung enthält (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9070-9074, (1986); Noyer-Weidner et al., Mol. Gen. Genet. 205: 469-475, (1986); Waite-Rees et al., J. Bacteriol. 173: 5207-5219, (1991)). Diese Systeme wurden erst in Versuchen zur Klonierung einer Vielfalt von Methylasegenen und ihrer Ansiedlung in genetisch markierten E.coli Stämmen offenkundig. Das Problem wurde in einigen Fällen dadurch gelöst, dass E.coli Mutanten erzeugt wurden, denen es an diesen Systemen mangelte. Beim Klonieren von RM-Systemen stößt man noch immer auf Probleme; je mehr Systeme jedoch untersucht werden, desto bessere Klonierungsverfahren werden entwickelt.
BglII, von der grampositiven Bakterie Bacillus globigii, war eines der ersten RM-Systeme, die identifiziert und charakterisiert wurden. (Wilson und Young, in Schlessinger (Hrsg.), Microbiology-1976, American Society for Microbiology, S. 305-357, (1976)). Wie der Name bereits andeutet, existiert noch ein anderes RM-System, Bg/l, das von der gleichen Spezies isoliert ist. Die Systeme BglI und BglII zeigen ein klassisches Verhalten und schützen die Bakterie vor einer Infektion durch unmodifizierte Bakteriophagen. Forscher fanden es sehr schwierig, R. BglI von R. BglII durch biochemische Mittel zu trennen, da die Enzyme eine ähnliche relative Molekülmasse und ähnliche ionische Eigenschaften haben (Pirrotta, Nucl. Acids Res. 3: 1747-1760, (1976)); folglich kamen genetische Verfahren zur Anwendung. B. globigii wurde anhand von Standardmethoden mutagenisiert, und individuelle Isolate wurden hinsichtlich reduzierter Phagenrestriktionsgrade gescreent, unter Verwendung eines unmodifizierten, auf Bacillus subtilis, einem nahe verwandten Stamm, vermehrten Phages. Zwei Mutantenstämme mit der Bezeichnung B. globigii RUB561 und RUB562, die jeweils nur R. BglI oder R. BglII produzieren, wurden auf diese Weise erzeugt (Duncan et al., J. Bacteriol. 134: 338-344, (1978)). Die Mutantenstämme behielten die Methylasefunktionen für BglI und BglII noch immer bei. Die Forscher nahmen an, dass die Anwendung von Mutagenese gekoppelt mit dem Screenen nach Phagenrestriktion ein allgemein anwendbares Verfahren für die Trennung und Reinigung von RM-Systemkomponenten sei. Seither hat die Erforschung von RM-Systemen die Entwicklung genetischer Systeme in diversen Bakterien jedoch bei weitem überholt, und das Verfahren wurde nicht für andere RM- Systeme angewendet. Dennoch werden die beiden B. globigii Stämme kommerziell für die Herstellung von BglI und BglII Endonucleasen verwendet. Darüber hinaus haben sich die beiden Stämme bei der Klonierung des BglII RM-Systems, wie nachfolgend beschrieben, als unentbehrlich erwiesen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die Gene für die BglII Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, erhältlich von Bacillus globigii RUB562 (Duncan et al. Ibid; New England Biolabs Culture Collection), sowie verwandte Verfahren zur Herstellung der Enzyme von Zellen, die die rekombinante DNA enthalten. Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem einen transformierten Wirt, der die Restriktionsendonuclease BglII ausprägt, ein Enzym, das die DNA-Sequenz 5'-AGATCT-3' erkennt und innerhalb der Erkennungssequenz zwischen dem A und dem G spaltet und eine 4 Basen 5' Erweiterung hinterlässt (Pirrotta Ibid). Gemäß der vorliegenden Erfindung produzierte BglII Restriktionsendonuclease ist im wesentlichen rein und frei von Kontaminanten, die normalerweise in Restriktionsendonucleasen zu finden sind, die anhand konventioneller Techniken hergestellt werden, wie in Schritt 19 von Beispiel 1 beschrieben ist.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Klonieren des BglII RM- Systems umfasst die folgenden Schritte: Konstruieren eines geeigneten Vektors, Erzeugen verschiedener Bibliotheken, die DNA von B. globigii RUB561 (RII&supmin; MII&supmin;) enthalten, Isolieren von Klonen, die DNA enthalten, die die BglII Modifikationsmethylase enthält, Reinigen des BglII Restriktionsendonucleaseproteins und Bestimmen seiner Amino-Terminus-Sequenz, Entwerfen einer degenerierten Oligonucleotidsonde speziell für das 5'-Ende des Endonucleasegens, Lokalisieren des Endes und der Orientierung des Endonucleasegens auf dem Plasmid, das die BglII Methylase kodiert, Vergleichen des Restriktionsprofils des Fragmentes, das bglIIM von B. globigii RUB561 kodiert, mit dem entsprechenden Bereich des B. globigii RUBS62 (RII&spplus;MII&spplus;) Chromosoms, Klonieren des entsprechenden Fragmentes von B. globigii RUB562, Screenen der resultierenden Klone nach Endonucleaseaktivität, Klonieren des Endonucleasegens hinter einem regulierten Promotor, Transformieren des regulierten Endonucleasekonstrukts in einen Wirt, der das BglII Methylasegen auf einem Vektor mit mittlerer Kopienzahl trägt, Vermehren der Zellen und Induzieren einer Endonucelaseexpression unter kontrollierten Bedingungen, und Reinigen der BglII Endonuclease mit Standardmethodik.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1 stellt Versuche zum Klonieren des BglII RM- Systems von Bacillus globigii RUB562 (RII&spplus;MII&spplus;) dar. Wie gezeigt wird, erwiesen sich Versuche zum Klonieren des kompletten Systems von diesem Stamm als erfolglos; sie sind daher nicht im Text beschrieben.
Fig. 2 zeigt das bevorzugte Verfahren zum Klonieren und Herstellen von BglII Endonuclease, wie im Text beschrieben.
Fig. 3 zeigt ein schematisches Diagramm des Vektors pAMB3, der zur Herstellung der Bacillus globigii Genombibliotheken verwendet wird. Der Vektor stammt von pBR322; die Figur ist aus der New England Biolabs Katalogkarte dieses Plasmids übertragen (1990-1991, S. 110) und weist ihre Nummerierung auf. Die Karte zeigt die Restriktionsorte der Enzyme, die pBR322 ein- oder zweimal zerschneiden; die einmaligen Orte sind in Fettdruck dargestellt. Ap = Ampicillin-Resistenzgen; Tc = Tetracyclin-Resistenzgen; rop-kodiert ein Protein, das die Aktivität von RNaseI vermittelt; ORI = Replikationsstartpunkt. Die annähernden Orte der 3 eingefügten BglII Linker sind durch Pfeile angedeutet.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung der Kartierung und Subklonierung des bglIIM Gens. In dem Diagramm weist ein dicker schraffierter Stab auf die eingefügte B. globigil RUB561 (RII&supmin; MII&spplus;) DNA hin;
Plasmidvektor-DNA wird durch eine dünne Linie angedeutet. Position und Orientierung von bglIIM werden von einem langen Pfeil angezeigt; die relative Position und Orientierung des lac Promotors (Plac), wenn vorhanden, werden von einem kurzen Pfeil angezeigt. Der in den jeweiligen Konstruktionen verwendete Plasmidvektor wird auf der linken Seite in Klammern gezeigt. Einzelheiten zu den Vektoren pAMB3 und pSYX19 sind jeweils in den Fig. 3 und 5 enthalten. A. 7,5 kb PstI Fragment von bglIIM-tragender Bacillus globigii DNA, das auf pAMB3 übertragen wurde, um pMB05 zu konstruieren. Wichtige Restriktionsorte innerhalb des Inserts sind angedeutet. B. Intakt zum Expressionsvektor pIJ2926 übertragenes PstI Fragment zur Bildung von pMB261. Relevante Restriktionsorte innerhalb des Vektors sind enthalten. C. Insertionsfragment von Plasmid pMB263, gebildet durch eine 1,7 kb Deletion zwischen den EcoRV Stellen von pMB261. D. Insertionsfragment von pMBN2, gebildet durch NdeI Deletion von Plasmid pMB263. Die Deletion entfernte 1350 bp Insert- DNA sowie 220 bp pIJ2926 Vektor. E. Insertionsfragment von pBM1, gebildet durch eine 4,7 kb HincII Deletion von pMBN2. F. Insertionsfragment von pBM1-Bam, erzeugt durch Auffüllen · der Ndel Stelle mit Klenow-Polymerase und Hinzufügen eines BamHI Linkers an dieses Ende. G. Das resultierende 1,8 kb BamHI Fragment mit bglIIM, das in den Vektor pSYX19 eingefügt wurde, um pSYXBglM, das Methylasekonstrukt, das für den R. BglII Überexpressionsklon verwendet wird, zu bilden.
Fig. 5 zeigt ein schematisches Diagramm des Plasmidvektors pSYX19. Das Plasmid, ein Derivat von pWSK129 (Wang und Kushner, Gene 100 : 195-199, (1991)), beinhaltet eine Mutation in seinem Replikationsstartpunkt (pSC101 ori), die seine Kopienzahl erhöht. Ebenfalls im Diagramm zu sehen: fl ori = fl Replikationsstartpunkt; Kan = Kanamycin- Resistenzgen; MCS = Mehrfachklonierungsstelle; und Plac = lac Promoter, dessen Position und Orientierung durch einen kurzen Pfeil angedeutet sind. Der BamHI Ort, in den bglIIM eingefügt wird, befindet sich in der MKS.
Fig. 6 zeigt schematisch das Verfahren, durch das · bglIIR charakterisiert, subkloniert und übermäßig ausgeprägt wurde. Im Diagramm weist der dicke schraffierte Stab auf B. globigii RUB562 (RII&supmin; MII&spplus;) DNA hin, die die bglIIM und bglIIR Gene enthält. Wichtige Restriktionsorte werden angedeutet. Position und Orientierung von bglIIR und bglIIM Genen werden durch lange Pfeile angedeutet. Die Promotoren Plac und Ptac werden durch kurze Pfeile angedeutet. Plasmidvektoren sind in Klammern dargestellt. Das Plasmid pAGR3 wird in Fig. 7 beschrieben. A. Das 7,5 kb PstI Fragment von B. globigii RUB562 mit bglIIM und bglIIR, kloniert in pACYC177 (Chang und Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141-1156, (1978)), um pMRB1 zu bilden. B. Der 3,0 kb PstI- HincII Bereich mit dem kompletten BglII RM-System, dessen Nucleotidsequenz bestimmt wurde. C. Das 2,0 kb PstI-SphI Fragment mit bglIIR, kloniert in pUC18, um pBglR1.8B zu bilden. D. Das durch PCR produzierte 800 bp Fragment mit bglIIR. An den Enden wurden BspHI und BamHI Orte in die Primer eingebaut, so dass das Fragment gerichtet in den Expressionsvektor pAGR3 zwischen den NcoI und BamHI Orten kloniert werden konnte. E. Fragment mit bglIIR, wie in den Expressionsvektor kloniert, um pAGRBglR2 zu bilden.
Fig. 7 zeigt ein schematisches Diagramm des Plasmidvektors pAGR3. Das von W. Jack (New England Biolabs) konstruierte Plasmid ist ein Derivat von pRS415 (Simons et al., Gene 53: 85-96, (1987)), dem das lacIq Repressorgen, ein Transkriptionsterminator (rmb) und der tac Promotor (Ptac) hinzugefügt wurden. Weitere in dem Diagramm gezeigte Merkmale sind der Replikationsstartpunkt (ori), das Ampicillin-Resistenzgen (amp) und die Klonierungsstellen Ncol und BamHI, die zum Einfügen von bglIIR in der richtigen Orientierung verwendet wurden. Das Translationsinitiationscodon (ATG) befindet sich innerhalb des NcoI Ortes und ist optimal hinter der Ribosomen- Bindungsstelle des Vektors gelegen.
Fig. 8 zeigt eine Fotografie eines Agarosegels, die die Titration von BglII Restriktionsendonucleaseaktivität illustriert, erhalten von Zellextrakten von NEB#731. Die Nummerierung der Bahnen auf dem Gel erfolgt von links nach rechts, wobei sich Bahn 1 auf der linken und Bahn 8 auf der rechten Seite befindet. Das von NEB#731 hergestellte Rohzellextrakt wurde jeweils 1 : 100 und 1 : 1000 in Verdünnungspuffer (50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl) verdünnt. Ein ul und 5 ul von jeder verdünnten Lösung wurden für die Verdauung von 0,5 ug pIJ2926 DNA in einem 50 ul Reaktiorisgemisch verwendet, das 10 mM Tris, pH 8,0, 10 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl und 10 Einheiten SspI enthielt. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei 37ºC wurden 30 ul des Reaktionsgemischs von jeder verdünnten Lösung auf ein 0,7%iges TBE Agarosegel geladen, das 1 Stunde lang einwirken gelassen und anschließend fotografiert wurde. In den Bahnen auf dem Gel ist folgendes enthalten: λDNA, zerschnitten mit BstEII als Molekulargewichtsmarker (Bahn 1 und 8); Reaktionsgemisch mit 16 Einheiten gereinigter BglII (positive Kontrolle; Bahn 2); Reaktionsgemisch mit 0,05 ul Rohextrakt (Bahn 3); Reaktionsgemisch mit 0,01 ul Rohextrakt (Bahn 4); Reaktionsgemisch mit 0,005 ul Rohextrakt (Bahn 5); Reaktionsgemisch mit 0,001 ul Rohextrakt (Bahn 6); Reaktionsgemisch ohne BglII (negative Kontrolle; Bahn 7).

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BglII Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, sowie die Enzyme, die von einem Klon mit einer solchen rekominanten DNA produziert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung war die Klonierung des BglII RM-Systems durch verschiedene Faktoren erschwert. Zunächst einmal enthielt keiner der gewöhnlichen Klonierungsvektoren (d. h. pBR322, pUC19, pACYC184, usw.) BglII Orte; es musste ein neuer Vektor konstruiert werden. Zweitens, und noch wichtiger, können die beiden BglII RM- Gene im Gegensatz zu vielen anderen RM-Systemen, die kloniert worden waren, nicht in einem einzigen Schritt zu einem nativen [*1] E.coli Wirt übertragen werden. Versuche zur Herstellung und Selektierung von Bibliotheken in der herkömmlichen Weise blieben ergebnislos (siehe Fig. 1). Glücklicherweise stand uns ein mutierter B. globigii Stamm zur Verfügung, in dem das BglII Endonucleasegen (bglIIR) inaktiviert worden war. Mit von dem Mutantenstamm isolierter DNA waren wir unter Verwendung unseres neuen Vektors mitmultiplen BglII Orten in der Lage, Bibliotheken zu konstruieren, in bezug auf M. BglII Expression zu selektieren und einen Klon zu isolieren, der das BglII Methylasegen auf einem rekombinanten Plasmid trug.
Eine Klonierung von bglIIM vom Mutantenstamm führte zu weiteren Komplikationen bei der Klonierung von bglIIR. Da es nicht möglich war, die aktive bglIIR von der Variantenbibliothek zu klonieren, erwiesen sich zahlreiche zusätzliche Schritte als notwendig. Diese Schritte beinhalteten eine Subklonierung und Überexpression von bglIIM auf einem Vektor mit höherer Kopienzahl, die Herstellung einer extrem reinen Probe von R. BglII von B. globigii RUB562; eine Größenbestimmung des Endonucleaseproteins und eine Sequenzbestimmung seines Amino-Terminus, den Entwurf entsprechender DNA- Oligonucleotid-Sonden und eine Suche nach der Hybridisierung der Sonden mit dem bgIIIM rekombinanten Plasmid. Ferner war die Beurteilung notwendig, ob der mutierte B. globigii RUB561 Stamm, von dem das Methylasegen kloniert worden war, irgendwelche starken chromosomalen Umordnungen im Bereich des Endonucleasegens infolge des Mutageneseverfahrens enthielt. Nachdem ermittelt worden war, dass keine Umordnungen vorhanden waren, wurde der Bereich mit dem 5' Ende von bglIIR auf das bglIIM Plasmid kartiert; mit einer Reihe von PCR-Experimenten wurde die Orientierung des Endonucleasegens ermittelt. Mit diesen Informationen wurde eine zweite Genombibliothek von größenselektierten Restriktionsfragmenten von B. globigii RUB562 DNA generiert, kloniert in pACYC177. Die Bibliothek wurde in E.coli Wirtszellen transformiert, die durch ein bglIIM-haltiges Plasmid geschützt waren. Transformantenkolonien wurden in Gruppen von fünfzig nach R. BglII Aktivität gescreent; von diesen Gruppen wurden individuelle Kolonien identifiziert, die bglIIR trugen und ausprägten. Anschließend war eine weitere Manipulation der Klone notwendig, um einen Überexpressor von R. BglII zu erzeugen.
Das hierin beschriebene Verfahren, anhand dessen bglIIM und bglIIR bevorzugt kloniert und ausgeprägt werden, ist in Fig. 2 dargestellt und umfasst die folgenden Schritte:
1. Konstruktion des Klonierungsvektors: Das Plasmid pAMB3, ein pBR322 Derivat mit drei strategisch plazierten BglII Orten (Fig. 3) wird konstruiert. Seine Konstruktion wird im 1. Beispiel beschrieben.
2. Reinigung der genomischen DNA: Zur Klonierung von bglIIM wird Bacillus globigil RUB561 in LB-Medium vermehrt. Zur Klonierung von bglIIR wird Bacillus globigii RUB562 auf ähnliche Weise vermehrt. Die Zellen werden geerntet und die DNA wird gereinigt.
3. Verdauung genomischer DNA: B. globigii RUB561 DNA wird mit einer Restriktionsendonuclease wie Hindill, EcoRI oder PstI komplett verdaut. Da PstI das einzige Verdauungsmittel war, das einen bglIIM Klon hervorbrachte, werden nur die Einzelheiten dieser Arbeit beschrieben.
4. "Shotgun"-Bibliothekpräparation: Die verdaute genomische DNA wird mit PstI-gespaltenem und dephosphoryliertem pAMB3 Vektor ligiert. Das Ligationsgemisch wird zum Transformieren eines E.coli Wirts wie RR1 oder K802 (jeweils ATCC 31343 und ATCC 33526) verwendet. RR1 ist der bevorzugte Wirtsstamm. Als Transformationsverfahren wird Elektroporation bevorzugt, es können aber auch chemische Verfahren angewendet werden.
5. Zellbibliothekenselektion: Die Transformationsgemische werden auf selektive Antibiotika- Testmedien aufgebracht; in diesem Fall werden Tetracyclin- Platten verwendet. Im Anschluss an eine Inkubation über Nacht werden die Transformanten von den Platten abgeschabt und zur Bildung der Zellbibliothek zusammengefasst. Um eine angemessene Repräsentation des B. globigii Genoms zu gewährleisten, wird nur eine Bibliothek mit mehr als 10.000 Kolonien verwendet.
6. Reinigung von rekombinantem Plasmid: Die rekombinanten Plasmide werden in toto von der Zellbibliothek gereinigt, um die Plasmidbibliothek zu bilden. Vorzugsweise beinhaltet das Reinigungsverfahren eine Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Gradienten- Zentrifugation.
7. Plasmidbibliothekenselektion: Die Plasmidbibliothek wird dann mit einem großen Überschuss an R. BglII, präpariert von B. globigii RUB562 Zellen, komplett verdaut. Die endonukleolytische Verdauung spaltet selektiv unmodifizierte Plasmide (nicht bglIIM ausprägend) auf, wodurch die relative Frequenz von intakten bglIIM-tragenden Plasmiden in der Population erhöht wird. Die aufgespaltenen Plasmide werden dann mit einem großen Überschuss an alkalischer Phosphatase behandelt, die ebenfalls die Transformationleistung von Plasmiden, die bglIIM nicht ausprägen, verringert.
8. Identifizierung von bglIIM Klonen: Die verdauten Plasmidbibliothek-DNAs werden elektrophoretisch in einen geeigneten Wirtsstamm wie RR1 oder K802 transformiert und die Transformanten auf Antibiotika-Testmedium selektiert. DNA wird von individuellen Kolonien isoliert und in bezug auf eine M. BglII-spezifische Modifikation anhand einer Beständigkeit gegen Aufspaltung durch R. BglII analysiert. Die Plasmid-DNA sollte vollständig oder im wesentlichen resistent gegen Verdauung sein. Als eine weitere Bestätigung werden λ-Phagen auf dem vermeintlichen bglIIM Klon vermehrt, und die Phagen-DNA wird gereinigt und hinsichtlich R. BglII Spaltung überprüft. Schließlich wird · der eingefügte Bereich des rekombinanten Plasmids deletiert und der verbleibende Vektor retransformiert, anschließend gereinigt und hinsichtlich der Anwesenheit intakter BglII Orte überprüft.
9. Kartierung und Subklonierung von balIIM: Da das Methylasegen von B. globigii RUB561, einem Mutantenstamm, dem es an Endonucleaseaktivität fehlt, kloniert wird, geht man nicht davon aus, dass die Methylaseklone aktives R. BglII produzieren, was sie auch nicht tun. bglIIR muss in einem separaten Schritt von einem zweiten B. globigil Stamm (d. h. RUB562) kloniert werden. Vor dem Klonieren ist es notwendig, einen Wirt zu konstruieren, der M. BgiII auf einem höheren Niveau produziert. Zu diesem Zweck wird bglIIM innerhalb des Inserts durch Deletionskartierung in Kombination mit Tn5 Transposonmutagenesekartierung plaziert. Das Fragment wird zu pIJ2926, einem pUCl9 Derivat mit BglII Orten innerhalb der Mehrfachklonierungsstelle, übertragen (Janssen und Bibb, Gene 124: 133-134, (1993)). Anhand einer Reihe von Deletionsexperimenten wird ein Subklon konstruiert, der bglIIM auf einem höheren Niveau ausprägt (Fig. 4). Das Plasmid hat die Bezeichnung pMBN2 (Fig. 4D).
10. Southern-Blot-Vergleich von B. globi ciii RUB561 und RUB562 DNA: Das 7,5 kb PstI Fragment mit bglIIM von B. globigii RUB561 wird parallel zu genomischer DNA von jeweils B. globigii RUB561 und RUB562 hybridisiert, um zu bestimmen, ob die Mutagenese der RUB561 oder RUB562 Stämme von starken chromosomalen Umordnungen in diesem Bereich begleitet war. Es werden keine solchen Umordnungen gefunden.
11. Ortsbestimmung von balIIR: R. BglII wird von B. globigii RUB562 Zellen auf annähernde Homogenität gereinigt. Das gereinigte Protein wandert als Einzelbande von etwa 27 kDa auf SDS-Polyacrylamid-Gelen. Es würde daher von einem Gen von etwa 750 bp kodiert.
Es wird die Sequenz der ersten 21 Aminosäuren bestimmt. Eine degenerierte Oligonucleotidsonde, spezifisch für das 5' Ende des Endonucleasegens, wird synthetisiert und zur Verwendung in Hybridisierungsexperimenten radioaktiv markiert. Aus Hybridisierungsexperimenten geht hervor, dass bglIIR am Ende des klonierten PstI Fragmentes proximal zu bglIIM liegt.
Ein Polymerase-Kettenreaktions-(·PCR)-Experiment unter Verwendung von Sinn- und Antisense-bglIIR-Oligonucleotiden in Verbindung mit pBR322-spezifischen Primern wird zum Bestimmen der Orientierung von bglIIR angewendet. Dem PCR- Experiment zufolge verläuft die bglIIR Transkription in Richtung auf bglIIM.
12. bglIIR-Klonierung: Um die Probleme bei der Einstufenklonierung des BglII RM-Systems zu umgehen, wird bglIIR in modifizierte Wirtszellen kloniert. Gereinigte B. globigii RUB 562 DNA wird durch PstI Endonuclease komplett verdaut, und angemessen dimensionierte Fragmente werden gelgereinigt und mit PstI-zerschnittenem pACYC177 ligiert. Das Ligationsgemisch wird durch Elektroporation in E.coli Zellen transformiert, die das bglIIM ausprägende Plasmid pMBN2 tragen; E.coli K802 ist der gewählte Wirt. Es werden Transformanten ausgewählt, die beide Plasmide tragen und folglich gegen zwei Antibiotika (d. h. Ampicillin und Kanamycin) resistent sind.
13. Identifizierung von Klonen, die bcrlIIR tragen: Selektierte Transformanten werden in doppelter Ausführung in Gruppen von fünfzig' auf Antibiotikaplatten aufgetragen und nach Endonucleaseaktivität gescreent. Kolonien von einer Platte jedes Paares werden zusammengefasst, lysiert, und die Rohextrakte werden hinsichtlich R. BglII Aktivität untersucht. Für positiv getestete Gruppen werden individuelle Kolonien gezüchtet und separat hinsichtlich R. BglII Aktivität untersucht. Plasmid-DNA wird von positiven Klonen gereinigt und eingefügte Fragmente werden analysiert, um ihre Identität zu ermitteln. Das pACYC177 Plasmid mit dem bglIIR und bglIIM kodierenden 7,5 kb PstI Fragment wird identifiziert und als pMRBl bezeichnet (Fig. 6A).
14. Kartierung und Charakterisierung von bglIIM und bcflIIR Genen: Das komplette BglII RM-System wird durch Restriktionskartierung und Subklonierung auf einem 3,0 kb PstI-HincII Subfragment des 7,5 kb PstI Originalfragments lokalisiert (Fig. 6B). Die Nucleotidsequenz des 3,0 kb Subfragments wird erzeugt, um die Überexpression der Methylase- und Endonucleasegene zu unterstützen.
15. Erhöhung der Expression von bglIIM: Einleitende Experimente zeigen, dass zur Überexpression von bglIIR zunächst eine Erhöhung der Expression von bglIIM notwendig wäre. Zahlreiche Versuche zur bglIIM Überexpression beinhalteten das Bewegen von bglIIM auf das E.coli Chromosom hinter einer Vielzahl von starken E.coli Promotoren und das Substituieren von bglIIM mit bstYIM von Bacillus stearothermophilus Y, dessen Produkt Stellen methyliert, die die BglII Erkennungssequenz enthalten. Die besten Ergebnisse werden jedoch durch Ausprägen von bgIIIM vom lac Promotor auf dem Plasmid pSYX19 mit mittlerer Kopienzahl erhalten, einem Derivat von pSC101, das mit Plasmiden auf der Basis von pBR322 und pACYC kompatibel ist (Fig. 5; S. Xu, New England Biolabs). Das hergestellte Konstrukt hat die Bezeichnung pSYXBglM (Fig. 4G).
16. Überexpression von bglIIR: Versuche zur Optimierung der Expression von bglIIR beinhalteten die Verwendung von sowohl konstitutiven als auch induzierbaren starken Promotoren auf Plasmiden unterschiedlicher Kopienzahlebenen. bglIIR erwies sich beim Klonieren hinter einem starken konstitutiven Promotor als unstabil. Die besten Ergebnisse werden mit dem Vektor pAGR3, einem pBR322 Derivat, erhalten, wobei die Expression vom tac Promotor gesteuert wird, induzierbar durch Isopropyl-β-Dthiogalactopyranosid (IPTG) (Fig. 7; W. Jack, New England Biolabs). Das bglIIR Gen wird zu pAGR3 übertragen und plasmidintern am Ncoh Ort mit dem tac Promotor fusioniert. Dies wird durch eine Amplifikation eines DNA-Fragments, das bglIIR enthält, durch PCR erreicht. Alternativ kann und wird dieses Konstrukt unter Verwendung von ortsgerichteter Mutagenese anstelle von PCR hergestellt (werden). Das Endonuclease ausprägende Plasmid hat die Bezeichnung pAGRBglR2 (Fig. 6E).
17. Konstruktion eines Überexpressionsstamms: Zur Überexpression wird der E.coli Stamm ER2206 (E. Raleigh, New England Biolabs) als Wirt bevorzugt: ER2206 ist ein Überproduzent des lac Repressors; eine hohe Konzentration von Iac Repressor in der Zelle reduziert die Expression vom tac Promotor vor der Induktion. Das Plasmid pSYXBglM wird durch Elektroporation in den Stamm transformiert, und Transformanten werden in bezug auf Kanamycin-Resistenz selektiert.
In einem zweiten Schritt wird ER2206(pSYXBglM) kompetent gemacht, elektrophoretisch mit pAGRBglR2 transformiert, und Doppeltransformanten werden auf Antibiotika-Testmedium selektiert. Die Transformanten werden nach einer Vermehrung in Flüssigkultur bis zur späten log-Phase, einer Induktion mit IPTG über mehrere Stunden und der Präparation von Rohextrakten hinsichtlich R. BglII-Aktivität getestet.
18. Produktion von R. BglII: R. BglII kann von ER2206 (pSYXBglM; pAGRBglR2) Zellen durch Vermehrung in einem. Fermenter in einem reichhaltigen Medium wie LB produziert werden, das die geeigneten Antibiotika enthält. Nach einer Induktion mit IPTG über mehrere Stunden werden die Zellen durch Zentrifugation geerntet und durch Beschallung gesprengt, so dass ein Rohzellextrakt mit R. BglII-Aktivität erzeugt wird.
19. Reinigung von R. BglII: R. BglII wird von dem in Schritt 18 beschriebenen Rohzellextrakt anhand standardmäßiger Proteinreinigungsverfahren wie Ionenaustauschchromatographie gereinigt, bis das Enzym im wesentlichen frei von anderen kontaminierenden Endo- und Exonucleasen ist.
Zwar repräsentieren die zuvor dargelegten Schritte das bevorzugte Verfahren zur Umsetzung der vorliegenden Erfindung, doch wird dem Fachkundigen offensichtlich sein, dass der zuvor beschriebene Ansatz in Übereinstimmung mit · in Fachkreisen bekannten Techniken variieren kann.
Mit dem folgenden Beispiel werden Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung illustriert, wie sie zur Zeit bevorzugt umgesetzt wird. Es ist zu verstehen, dass dieses Beispiel der Illustration dient und dass die Erfindung nicht als darauf beschränkt anzusehen ist, mit Ausnahme der Angaben in den beiliegenden Ansprüchen.

1. BEISPIEL

Klonieren von BalII Restriktionsendonuclease- und Modifikationsmethylasegenen

{Hinweis: Einzelheiten zu Standardverfahren, die im 1. Beispiel angewendet werden, werden am Ende des Kapitels gegeben.}
1. Konstruktion des Klonierungsvektors: Als Klonierungsvektor wurde pAMB3 verwendet, der von pBR322 durch die Insertion von 3 BglII Linkem wie folgt abgeleitet wurde:
10 ug pBR322 wurden mit 10 Einheiten PvuII (Endonucleasen stammten von New England Bioloabs und die Reaktionen wurden unter empfohlenen Bedingungen mit gelieferten Puffern durchgeführt) in einem Reaktionsvolumen von 50 ul bei 37ºC 2 Stunden lang verdaut. 10 ul des Reaktionsgemischs wurden dann in eine 100 ul Ligationsreaktion mit 2 ug nichtphosphoryliertem BglII Linker (dCAGATCTG; New England Biolabs), 40 Einheiten T4 DNA-Ligase (New England Biolabs) und 20 Einheiten SspI im gelieferten Ligasepuffer (50 mM Tris, pH 7,8, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 ug/ml Rinderserumalbumin) gegeben; das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert; anschließend wurde es einmal mit einem gleichen Volumen von Chloroform extrahiert. Das Ligationsgemisch wurde unter Anwendung des CaCl&sub2;-Verfahrens in E.coli RR1 Zellen transformiert, und die Zellen wurden auf LB-Agarplatten, die Ampicillin enthielten, aufgetragen (1 Liter LB-Medium enthält 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl, 1 g Dextrose, 1 g MgCl&sub2;, einen mit NaOH auf 7,2 eingestellten pH-Wert. LB-Agar ist LB-Medium mit 1,5% Agar). Plasmid-DNA wurde von individuellen Transformanten unter Anwendung des Alkali-Lyse-Miniprep-Verfahrens isoliert, mit BglII verdaut und durch Elektrophorese auf Agarosegel analysiert, um nach linker-haltigen Plasmiden zu screenen. Dieses Konstrukt hatte die Bezeichnung pB2066.
In einer zweiten Experimentenreihe wurde ein nichtphosphorylierter BglII Linker am Sspl Ort von pB2066 durch Wiederholen des zuvor beschriebenen Verfahrens eingefügt. Dieses neue Konstrukt mit der Bezeichnung pAMB2 enthielt 2 BglII-Linker.
In einem separaten Experiment wurden 4 ug pBR322 mit 40 Einheiten Dral verdaut. Nach 30 Minuten bei 37ºC wurde die Reaktion beendet und die DNA mit dem Phenol- /Chloroform-Extraktionsverfahren gereinigt. Die resuspendierte DNA wurde mit einem Überschuss an BglII Linker wie zuvor beschrieben ligiert, mit der Ausnahme, dass phosphorylierter BglII Linker (d(pCAGATCTG); New England Biolabs) verwendet wurde und keine Restriktionsendonuclease zur Ligation hinzugegeben wurde. Nach einer 2-stündigen Ligation bei 16ºC wurde die Reaktion mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die gereinigte DNA wurde dann mit BglII verdaut, um zusätzliche verkettete Linker zu entfernen. Die Endonuclease wurde mit Hitze abgetötet und die Reaktion bei 16ºC 1 Stunde lang religiert. Nach einer Chloroformextraktion wurde das Ligationsgemisch dazu verwendet, E.coli RR1 Zellen unter Anwendung des CaCl&sub2;- Verfahrens zu transformieren, und die aufgetragenen Zellen wurden hinsichtlich Ampicillin-resistenter Kolonien selektiert. Von individuellen Transformanten durch das Alkali-Lyseverfahren isolierte Plasmide wurden mit BglII in Kontakt gebracht und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert, um nach dem korrekten Konstrukt zu screenen. Dieses Konstrukt mit der Bezeichnung pB3232 hat einen BglII Linker anstelle des 19 bp Dral Fragments außerhalb des Ampicillin-Resistenzgens, weist aber noch immer den DraI Ort innerhalb des Ampicillin-Resistenzgens auf, so dass das Gen intakt und funktionsfähig bleibt.
Der Vektor pAMB3 wurde durch die Kombination von pAMB2 und pB3232 in der folgenden Weise erzeugt: 10 ug pAMB2 wurden mit 20 Einheiten von jeweils PstI und NdeI in einer einzigen 150 ul Reaktion verdaut, und 10 ug pB3232 wurden mit 20 Einheiten von jeweils PstI, NdeI und BamHI in einer Parallelreaktion verdaut. Die verdauten DNAs wurden auf einem 0,7%igen Agarosegel (IBI; Molekulargrad) der Elektrophorese unterzogen und das gewünschte 3051 bp PstI- NdeI Fragment von pAMB2 und 1312 bp NdeI-PstI Fragment von pB3232 isoliert. 2 ug von jedem Fragment wurden in einem Ligationsgemisch kombiniert; nach einer Ligation über Nacht bei Raumtemperatur und einer Extraktion mit Chloroform wurde das Ligationsgemisch dazu verwendet, E.coli RR1 Zellen unter Anwendung des CaCl&sub2;-Verfahrens zu transformieren. Transformanten wurden auf LB-Agarplatten selektiert, die sowohl Ampicillin als auch Tetracyclin enthielten, und Plasmide von individuellen Isolaten wurden mit BglII verdaut und durch Elektrophorese analysiert, um das korrekte Konstrukt zu bestimmen. Das pAMB3 Plasmid ist in Fig. 3 dargestellt.
2. Reinigung von genomischer DNA: DNA für Methylase- Selektionsbibliotheken wurde vom Bacillus globigii Stamm RUB561 gereinigt. 10 ml einer Übernacht-Kultur von B. globigii RUB561 wurden zum Inokulieren von 500 ml LB-Medium verwendet und bei 37ºC unter Schütteln bis zur Sättigung vermehrt. Zellen wurden durch eine 10-minütige Zentrifugation mit 5000 UPM in einer Beckman J2-21 Zentrifuge mit einem JA-17-Rotor geerntet; die Zellpellets wurden durch Resuspension in insgesamt 100 ml Tris-EDTA- Puffer (100 mM Tris, pH 8,0, 100 mM EDTA) gewaschen und wie zuvor beschrieben erneut zentrifugiert. Die Pellets wurden dann in insgesamt 10 ml Tris-EDTA-Puffer resuspendiert und zusammengefasst; die Zentrifugenflaschen wurden mit zusätzlichen 10 ml Tris-EDTA-Puffer gewaschen, und die Waschflüssigkeit wurde zum Pool gegeben. Lysozym (Sigma) wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,125 mg/ml zugegeben, die Suspension wurde durch leichte Inversion vermischt und das Gemisch bei 37ºC wenigstens 30 Minuten lang inkubiert. Die Suspension wurde anschließend mit einem gleichen Volumen von Tris-EDTA-Puffer mit einem pH-Wert von 9,0 verdünnt, SDS wurde auf eine Endkonzentration von 1% zugegeben, und die Suspension wurde bei 50ºC 15 Minuten lang inkubiert, um die Lyse zu vervollständigen.
Proteinase K (Boehringer Mannheim GmbH) wurde auf eine Endkonzentration von 0,05 mg/ml zugegeben, und die Inkubation wurde bei 37ºC 1-2 Stunden lang fortgesetzt. Das SDS wurde durch Dialyse mit TE-Puffer (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) entfernt und das Dialysat mit einem Volumen TE verdünnt. Festes CsCl wurde zu 1 g/ml und Ethidiumbromid zu 100 ug/ml zugegeben. Die Lösung wurde 48 Stunden lang einer Ultrazentrifugation in einem Beckman Ti70 Rotor mit 44.000 UPM unterzogen. DNA-Banden wurden mit einer Spritze extrahiert, und Ethidiumbromid wurde durch Extraktion mit Isoamylalkohol entfernt. CsCl wurde wie zuvor durch Dialyse entfernt, das Dialysat wurde mit Phenol und anschließend mit Chloroform extrahiert, und die Lösung wurde ein letztes Mal wie zuvor mit TE dialysiert. Der endgültige Ertrag lag bei 200 ug B. globigii RUB561 DNA von 500 ml gesättigter Kultur.
3. Verdauung von genomischer und Vektor-DNA: Bei dem Versuch, das BglII RM-System zu klonieren, wurden Bibliotheken von zahlreichen Restriktionsverdauungsmitteln hergestellt. Da PstI das einzige Verdauungsmittel war, das einen Klon hervorbrachte, werden nur die Einzelheiten dieser Arbeit beschrieben.
5 ug B. globigii RUB561 DNA wurden mit einem Überschuss an PstI unter Standardbedingungen komplett zerschnitten, und die Reaktion wurde einmal mit Phenol extrahiert. DNA wurde durch die Zugabe von zwei Volumen von 95%igem Ethanol präzipitiert.
5 ug pAMB3 DNA wurden mit PstI bei 37ºC 90 Minuten lang verdaut. Es wurden 22 Einheiten Kälberdarmphosphatase (Boehringer Mannheim GmbH) zugegeben, und die Reaktion wurde bei 37ºC weitere 30 Minuten fortgesetzt. Die Reaktion wurde in ähnlicher Weise wie B. globigii DNA mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert.
4. DNA-Ligation: PstI-verdauter Vektor (pAMB3) und Insert (B. giobigii RUB561 chromosomale DNA) wurden in einer 100 ul Reaktion mit 400 ng Insert-DNA, 100 ng Vektor- DNA und 20 Einheiten T4 DNA-Ligase im empfohlenen Ligationspuffer bei Raumtemperatur über Nacht miteinander ligiert. Das Ligationsgemisch wurde dann mit H&sub2;O auf einem Millipore-VS-Filter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur dialysiert; der Filter wurde mit zusätzlichen 100 ul H&sub2;O gewaschen und die Waschflüssigkeit mit dem Ligationsgemisch kombiniert.
5. Konstruktion einer Primärzellbibliothek: E.coli RR1 Zellen wurden mit dem Standardverfahren für eine Elektroporation vorbereitet. 5 ul des dialysierten Ligationsgemischs von Schritt 4 wurden in E.coli RR1 Zellen elektroporiert. Die transformierten Zellen wurden auf großen (150 mm) LB-Argarplatten, die Tetracyclin enthielten, verteilt. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden insgesamt etwa 12.000 Transformanten von 4 Platten erhalten. Die Platten wurden mit LB überschichtet, und die Kolonien wurden zusammengefasst, um die Primärzellbibliothek zu bilden.
6. Isolierung einer Primärplasmidbibliothek: Plasmide wurden von der Primärzellbibliothek mit dem standardmäßigen Triton-Lyseverfahren isoliert. Nach einer Ultrazentrifugation wurde die gereinigte DNA in einem Endvolumen von 1 ml TE auf eine Endkonzentration von etwa 0,1 mg/ml resuspendiert.
7. Selektion einer Plasmidbibliothek: Etwa 2 ug Primärbibliothek-DNA wurden mit 48 Einheiten BglII Endonuclease in einem 100 ul Reaktionsvolumen bei 37ºC in Kontakt gebracht; nach einer 90-minütigen Verdauung wurden 22 Einheiten Kälberdarmphosphatase und zusätzliche 32 Einheiten BglII zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 60 Minuten fortgesetzt. Die DNA wurde wie zuvor beschrieben gereinigt und in 15 ul TE resuspendiert. Die gesamte Verdauungs- und Dephosphorylierungsreaktion wurde dann an der resuspendierten DNA wiederholt. Die behandelte Plasmid- DNA wurde dann wie zuvor beschrieben mit H&sub2;O dialysiert. 8. Transformation: 5 ul der dialysierten Probe, die 1 : 100 verdünnt worden war und etwa 5 ng DNA enthielt, wurden zum Transformieren von 40 ul E.coli RR1 Zellen durch Elektroporation verwendet. Die transformierten Zellen wurden auf LB-Agarplatten, die Tetracyclin enthielten, aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden im Durchschnitt 8 Transformanten pro Platte von den 5 ng der selektierten Bibliothek-DNA und etwa 8300 pro Platte mit einer vergleichbaren Menge an unselektierter Bibliothek-DNA erhalten. Die Selektion war daher etwa 1000fach.
9. Analyse überlebender Plasmide: 16 der Transformanten, die die Selektion überlebten, wurden in Flüssigkultur vermehrt, und ihre Plasmid-DNA wurde mit dem standardmäßigen Miniprep-Verfahren isoliert. Die Plasmide wurden in Parallelreaktionen jeweils mit PstI und BglII verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. 15 der 16 Plasmide enthielten ein 7,5 kb PstI Insert und waren gegenüber BglII Spaltung völlig resistent. Das letzte Plasmid enthielt kein Insert und war gegenüber BglII Spaltung nicht resistent. Einer der resistenten Klone wurde für eine weitere Charakterisierung ausgewählt und sein Plasmid erhielt die Bezeichnung pMB05 (Fig. 4A).
Das 7,5 kb PstI Insert, von dem man annahm, dass es das bglIIM Gen trug, wurde von einem der BglII-resistenten Klone entfernt, und der Vektor wurde religiert, um zu bestimmen, ob seine BglII-Orte intakt waren. Etwa 1 ug der Klon-DNA wurde mit 20 Einheiten PstI verdaut, und der Vektor wurde über Nacht in einem 1 ml Volumen religiert. Etwa 0,5 ug der DNA wurden dann unter Anwendung des CaCl&sub2;- Verfahrens in E.coli Zellen transformiert, und Transformanten-DNA wurde mit dem Alkali-Lyse-Miniprep- Verfahren isoliert. Die Plasmide wurden dann in Parallelreaktionen mit PstI und BglII wie zuvor verdaut und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Alle getesteten Plasmide hatten das 7,5 kb Insert verloren und waren völlig durch BglII verdaut, was eine Bestätigung dafür war, dass dies eine im 7,5 kb Insert kodierte Funktion war, die ihm Beständigkeit gegen BglII Verdauung verlieh.
10. Konstruktion eines methylaseproduzierenden Wirts: Es wurde eine umfassende Restriktionskarte von pMB05 hergestellt (Fig. 4A), und der annähernde Ort von bglIIM wurde durch Deletionen und Tn5 Insertionsmutagenese bestimmt. Um einen bglIIM Klon mit einem höheren Niveau an Methylaseexpression zu konstruieren [*2], wurde das pMB05 Insert zu einem pUC-stämmigen Vektor mit hoher Kopienzahl übertragen und zwei Bereiche nicht essentieller DNA wurden von dem Insert deletiert.
20 ug pMB05 DNA wurden 3 Stunden lang mit 80 Einheiten PstI in einem 500 ul Volumen bei 37ºC verdaut. Die Verdauungsfragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel separiert, und das 7,5 kb Insert wurde von dem Gel unter Verwendung eines DEAE- Papierelutionsprotokolls isoliert. Das isolierte Fragment wurde mit PstI-gespaltener und dephosphorylierter pIJ2926 Vektor-DNA ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli ED8767 Zellen transformiert (Raleigh et al., Nucl. Acids Res. 16: 1563-1575, (1988)), die durch das RbCl-Verfahren kompetent gemacht wurden, Plasmide wurden mit dem Alkali- Lyseverfahren isoliert, und die Orientierung des Inserts in dem Vektor wurde anhand von Restriktionsverdauungsmitteln bestimmt. Dieses Konstrukt erhielt die Bezeichnung pMB261 (Fig. 4B).
1 ug pMB261 Miniprep-DNA wurde mit 20 Einheiten EcoRV in einer 50 ul Reaktion verdaut. 12,4 des 50 ul Verdauungsmittels (mit 0,25 ug DNA) wurden in einer 600 ul Ligationsreaktion verdünnt. Das Ligationsgemisch wurde einmal mit Phenol und einmal mit Chloroform extrahiert, und DNA wurde durch die Zugabe von 2 Ethanolvolumen präzipitiert und bei -20ºC über Nacht eingefroren. DNA wurde mit dem CaCl&sub2;-Verfahren in kompetente E.coili RR1 Zellen transformiert, und Plasmide wurden von 6 Transformanten isoliert und hinsichtlich des geeigneten Restriktionsmusters überprüft. Das neue Konstrukt erhielt die Bezeichnung pMB263 (Fig. 4C).
4 ug pMB263 Miniprep-DNA wurden vollständig mit NdeI in einem 100 ul Volumen verdaut. Nach einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und einer Präzipitation mit Ethanol wurde 1 ug der resuspendierten DNA über Nacht in einer 500 ul Reaktion bei Raumtemperatur ligiert. Die Ligationsreaktion wurde einmal mit Chloroform extrahiert und dazu verwendet, E.coli ED8767 Zellen zu transformieren, die mit dem CaCl&sub2;-Verfahren kompetent gemacht wurden.
Plasmide von 9 Transformanten wurden isoliert und hinsichtlich des geeigneten Restriktionsmusters überprüft. Das neue Konstrukt erhielt die Bezeichnung pMBN2 (Fig. 4D). E.coli K802 Zellen wurden kompetent gemacht und elektrophoretisch durch pMBN2 mit dem Standardverfahren transformiert. Individuelle Transformantenkolonien wurden hinsichtlich Ampicillin-Resistenz ausgewählt, die Plasmide wurden per Miniprep-Verfahren isoliert und ihre Restriktionsprofile wurden überprüft. E.coli K802(pMBN2) wurde dann als Wirt zum Klonieren des Endonucleasegens verwendet.
11. Reinigung und Analyse von B. globigii RUB562 DNA: DNA von B. globigii RUB562 wurde in der gleichen Weise wie RUB561 DNA gereinigt (siehe Schritt 2).
Eine Southern-Hybridisierungsanalyse (Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1982)) deckte keine starken chromosomalen Differenzen zwischen den Stämmen RUB561 und RUB562 in dem um bglIIM gelegenen Bereich auf.
12. Standort von bglIIR: Standort und Orientierung von bglIIR wurden mit degenerierten Oligonucleotidsonden bestimmt, die von der Amino-Terminus-Sequenz des Endonucleaseproteins stammten.
Zu diesem Zweck wurde BglII Endonuclease mit standardmäßigen Proteinreinigungsverfahren auf annähernde Homogenität von B. globigii RUB562 Zellen gereinigt. Die Proteinsequenz der ersten 16 Aminosäurereste des gereinigten Proteins wurde durch eine sequentielle Verdauung mit einem 470 A Gasphasensequenator von Applied Biosystems wie folgt bestimmt: Met Lys Ile Asp Ile Thr Asp Tyr Asn His Ala Asp Glu Ile Leu Asn (SEQ ID Nr. 1). Auf der Basis der Proteinsequenz wurden eine 21-Basen-Antisense- Oligonucleotidsonde mit Komplexität 256: (ATYTCRTCNGCRTGRTCRTAR, SEQ ID Nr. 2) und eine 17-Basen- Sinnsonde mit Komplexität 36: (ATGAARATHGAYATHAC; SEQ ID Nr. 3) synthetisiert, wobei R = A oder G, Y = C oder T, H = A oder C oder T, N = A oder C oder G oder T.
Anhand einer Southern-Hybridisierungsanalyse des pMB05 Plasmids mit diesen degenerierten endonucleasespezifischen Hybridisierungssonden (Howard et al. Ibid) wurde das 5'- Ende des Endonucleasegens auf einem 1,1 kb PstI-NdeI Fragment innerhalb des pBMOS Inserts plaziert. Außerdem wurde ein PCR-Experiment mit den oben genannten Sinn- und Antisense-Primern in Verbindung mit pBR322 Psti Rechts- und Links-Primern auf pMB05 durchgeführt, um die Orientierung von bglIIR zu bestimmen. Aus diesem Experiment ging eindeutig hervor, dass bglIIR so platziert und orientiert war, dass das klonierte PstI Fragment das gesamte Gen enthalten musste.
13. Klonierung von bglIIR: bglIIR wurde von einer Plasmidbibliothek von 7,5 kb größenselektierten B. globigii RUB562 DNA PstI Fragmenten in pACYC177 kloniert.
25 ug B. globigii RUB562 genomischer DNA wurden 4,5 Stunden lang mit PstI in einem 400 ul Volumen bei 37ºC verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel separiert, und Fragmente mit einer Größe von etwa 6,5 bis 8,5 kb wurden mit DEAE- Papierelution isoliert. Die größenselektierte DNA wurde in 15 ul TE (auf eine Endkonzentration von etwa 80 ug/ml) resuspendiert.
5 ug pACYC177 Vektor-DNA wurden 1,5 Stunden lang mit PstI bei 37ºC verdaut. Kälberdarmphosphatase und zusätzliche PstI wurden an dieser Stelle zugegeben, und die Inkubation wurde weitere 60 Minuten fortgesetzt. Verdaute DNA wurde gereinigt und in 20 ul TE resuspendiert.
Etwa 0,6 ug größenselektierter RUB562 PstI Fragmente wurden mit 0,2 ug PstI-verdautem und dephosporyliertem pACYC177 mit 400 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem 53 ul Reaktionsvolumen ligiert. 50 ng des Ligationsgemischs wurden zum Transformieren von kompetentem E.coli K802(pMBN2) mit dem CaCl&sub2;-Verfahren verwendet.
Transformanten wurden hinsichtlich Carbenicillin- und Kanamycin-Resistenz selektiert.
14. Identifizierung von endonucleaseproduzierenden Klonen: Von den Transformanten der größenselektierten Bibliothek wurden 11 Sätze mit 50 Kolonien in doppelter Ausführung auf LB-Agarplatten überimpft, die mit Carbenicillin und Kanamycin angereichert waren. Von einer Platte von jedem Satz wurden Kolonien in 5 ml LB gesammelt, zusammengefasst, durch Zentrifugation geerntet und in 0,8 ml Beschallungspuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 8,0, 10 mM β-Mercaptoethanol) resuspendiert. 10 ul 0,5 M EDTA und 25 ul 10 mg/ml Lysozym wurden in jedes Zellenröhrchen gegeben, und die Röhrchen wurden bei -70ºC eingefroren. Nach dem Auftauen wurde der Zellextrakt 15 Sekundenlang in einem Heat Systems W-225R Beschaller (Ultrasonics, Inc.) beschallt und 10 Minuten lang zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. Jeweils 1 ul und 7 ul von jedem Rohextrakt wurden hinsichtlich R. BglII Aktivität auf BamHI- linearisierter pBR3232 DNA, die einen einzigen BglII Ort enthielt, in dem für BglII empfohlenen Puffer bei 37ºC 1 Stunde lang untersucht. R. BglII Aktivität wurde in 9 der 11 untersuchten Pools von Rohextrakten beobachtet.
Individuelle Kolonien von einer der positiven Platten wurden über Nacht in 5 ml LB vermehrt, das mit Carbenicillin und Kanamycin angereichert war, und Extrakte wurden präpariert und hinsichtlich R. BglII Aktivität wie zuvor beschrieben untersucht. 2 der 11 untersuchten Extrakte wiesen R. BglII Aktivität auf. Weitere Experimente ergaben, dass beide Klone etwa 100.000 Einheiten an R. BgilII Aktivität pro Gramm Zellen ausprägten, eine etwa dreifache Überexpression gegenüber B. globigii RUB562 Zellen. Das pACYC177 Plasmid, das bglIIR und bglIIM enthielt, hatte die Bezeichnung pMRBl (Fig. 6A).
15. NucleotidsecTuenzbestimmung von bQIIIM und bglIIR: Unter Anwendung von standardmäßigen Restriktionskartierungstechniken wurden bglIIR und bglIIM zu einem 3,0 kb PstI-HincII Fragment kartiert (Fig. 6B). Der Bereich wurde anhand Standardmethoden in mehreren Stücken subkloniert, und die Nucleotidsequenz wurde für den gesamten Bereich durch das Dideoxyverfahren (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, (1977); Sanger und Coulson, FEBS Letters 87; 107-110, (1978)) mit DNA- Polymerase-I-Klenow-Fragment (New England Biolabs) und/oder durch das CircumVent-Sequenzierungsverfahren (New England Biolabs) erzeugt. Die Nucleotidsequenz eines 3188 bp Bereichs, der bglIIM und bglIIR kodiert, wird in SEQ ID Nr. 4 gegeben.
16. Präparation eines übermäßig ausprägenden Methylasekonstrukts:
Um seine Expression zu erhöhen, wurde bglIIM auf pSYXIS kloniert (Fig. 5).
1,6 ug pSYX19 wurden mit 60 Einheiten BamHI in einem Gesamtvolumen von 50 ul verdaut. Die Verdauung fand bei 37ºC über einen Zeitraum von 90 Minuten statt. Es wurden 10 Einheiten Kälberdarmphosphatase zugegeben, und die Reaktion wurde weitere 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in 10 ul TE resuspendiert.
1 ul pMBN2 wurde mit 30 Einheiten HincII in einem Gesamtvolumen von 50 ul bei 37ºC 1 Stunde lang verdaut. Die verdaute DNA wurde wie zuvor beschrieben gereinigt, in 10 ul TE resuspendiert und mit 400 Einheiten T4 DNA Ligase in einem Gesamtvolumen von 50 ul religiert. Die Ligation wurde bei 16ºC über Nacht durchgeführt. E.coli ED8767 Zellen wurden mit 2 ng der ligierten DNA elektroporiert, und die Zellen wurden auf LB-Agarplatten aufgebracht, die Carbenicillin enthielten. Plasmide wurden von Transformanten mit dem Alkali-Lyse-Miniprep-Verfahren isoliert, in Tandern-Reaktionen zuerst mit NdeI und dann mit HincII verdaut und durch Elektrophorese auf einem Agarosegel analysiert. Plasmid von einem der Transformanten mit der gewünschten HincII Deletion wurde anhand des Triton-Lyseverfahrens gereinigtund erhielt die Bezeichnung pBMl (Fig. 4E).
5 ug pBMl wurden mit 60 Einheiten NdeI in einem Gesamtvolumen von 50 ul bei 37ºC 1 Stunde lang verdaut. Die verdaute DNA wurde wie zuvor beschrieben gereinigt und in 20 ul TE resuspendiert. Die resuspendierte DNA wurde in einem 50 ul Reaktionsvolumen mit 10 Einheiten DNA- Polymerase-I-Klenow-Fragment und 0,3 mM von jeweils dATP, dCTP, dGTP und dTTP in dem empfohlenen Puffer behandelt, um die Enden aufzufüllen. Die Reaktion wurde bei 25ºC 30 Minuten lang und dann bei 65ºC 5 Minuten lang inkubiert. 10 ul dieser Reaktion wurden in eine 100 ul Ligationsreaktion gegeben, die 1 ug phosphorylierten BamHI Linker (d(pCGGATCCG); New England Biolabs) und 1200 Einheiten T4 DNA Ligase enthielt. Die Ligation wurde bei 16ºC über Nacht durchgeführt. E.coli ED8767 Zellen wurden mit etwa 5 ng der ligierten DNA elektroporiert, und Zellen wurden auf LB-Agar mit Carbenicillin aufgebracht. Plasmide wurden von Transformanten mit dem Alkali-Lyse-Miniprep-Verfahren isoliert; mit BamHI verdaut und mit Elektrophorese auf einem Agarosegel analysiert. Plasmid von einem der Transformanten mit dem gewünschten BamHI Linker wurde mit dem Triton-Lyseverfahren isoliert und erhielt die Bezeichnung pBM1-Bam (Fig. 4F).
10 ug pBM1-Bam wurden mit 160 Einheiten BamHI in einem Gesamtvolumen von 150 ul verdaut. Die Verdauung fand bei 37ºC über einen Zeitraum von 60 Minuten statt. Die Fragmente von verdautem Plasmid wurden durch Elektrophorese auf einem 0,5%igen Agarosegel separiert. Die 1,8 kb DNA- Bande wurde exzidiert, und DNA wurde mit dem Prep-a-Gene DNA-Reinigungsmatrix-Kit (Bio-Rad Laboratories) gemäß den Herstellerangaben gereinigt. DNA wurde in einem Endvolumen von 75 ul in Prep-a-Gene Elutionspuffer resuspendiert.
0,1 ug BamHI-verdautes pSYX19 wurden mit 0,75 ug bglIIM Fragment mit 400 Einheiten T4 DNA Ligase in einem 50 ul Reaktionsvolumen 18 Stunden lang bei 16ºC ligiert. Die Ligation wurde durch einmaliges Extrahieren mit einem gleichen Volumen von Chloroform unterbrochen und mit H&sub2;O dialysiert.
E.coli ED8767 Zellen wurden mit 10 ul des Ligationsgemischs elektroporiert und Zellen wurden auf LB- Agar mit Kanamycin aufgebracht. Nach einer Inkubation bei 37ºC über Nacht wurden 12 der erzeugten Transformanten in 5 ml Kulturen aus kanamycinhaltiger LB-Nährlösung vermehrt, und ihre Plasmid-DNA wurde unter Anwendung des Alkali-Lyse-Miniprep-Verfahrens isoliert. Plasmid-DNA wurde hinsichtlich angemessener Restriktionsfragmente untersucht; eine Kolonie wurde auch hinsichtlich der Fähigkeit zur Methylierung von λvir Phagen-(New England Biolabs Culture Collection)-DNA in vivo getestet. Dieses neue Konstrukt erhielt die Bezeichnung pSYXBglM (Fig. 4G).
17. Präparation eines induzierbaren Endonucleasekonstrukts: Zum Überexpressionieren des Endonucleasegens wurde der Expressionsvektor pAGR3 (Fig. 7) verwendet. bglIIR wurde anhand von PCR von einem existierenden Klon mit der Bezeichnung pBglR1.8B amplifiziert (Fig. 6C): BspHI und BamHI Orte wurden innerhalb der Oligonucleotid-Primer erzeugt, die in der Reaktion eingesetzt wurden. Primer 1 enthält eine Sequenz, die den Translationsstart von bglIIR enthält, und weist 2 gegenüber der ursprünglichen Sequenz veränderte Basen auf, um den unterstrichenen BspHI Ort zu erzeugen: 5' GGA GAC ACT CTC ATG AAG ATT G 3' (SEQ ID Nr. 5). Primer 2 enthält eine Sequenz von direkt hinter dem Stoppcodon von bglIIR und weist 2 gegenüber der ursprünglichen Sequenz veränderte Basen auf, um den unterstrichenen BamHI Ort zu erzeugen: 5' TGT TTA TAT GGA TCC TCA CTC AC 3' (SEQ ID Nr. 6). Das 0,8 kb Fragment zwischen diesen beiden Primern wurde in einer PCR-Reaktion mit 2, 5 Einheiten Taq DNA Polymerase (Bethesda Research Laboratories), 10 ng pBglR1.8B-Matrize und 0,25 mM von jedem Primer (16, 6 mM (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;, 67 mM Tris-HCl, pH 8, 8, 6, 7 mM MgCl&sub2;, 10 mM β-Mercaptoethanol, 187 uM von jedem dNTP, 100 ug/ml BSA) bei 93ºC 1,5 Minuten lang, bei 60ºC 1,5 Minuten lang und bei 72ºC 1,5 Minuten lang für 30 Zyklen amplifiziert. Die Probe wurde außerdem vor dem ersten Zyklus bei 93ºC 5 Minuten lang und nach dem Endzyklus bei 72ºC 3 Minuten lang inkubiert.
Das PCR-Produkt wurde dann zur Verdauung durch Extraktion jeweils einmal mit Phenol und dann mit Chloroform gereinigt, mit Ethanol in einem Trockeneis- Ethanolbad 12 Minuten lang präzipitiert, durch Zentrifugation aufgefangen und in 10 ul TE resuspendiert. Die resuspendierte DNA (etwa 3 ug) wurde dann mit 50 Einheiten BamHI und 12,5 Einheiten BspHI in einem 50 ul Reaktionsvolumen bei 37ºC 60 Minuten lang verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Elektrophorese auf einem 0,7%igen Agarosegel separiert, die richtige Bande wurde exzidiert und die DNA mit dem Prep-A-Gene-Kit von Bio-Rad gemäß Herstelleranweisungen gereinigt und in 30 ul Prep-A-Gene Elutionspuffer resuspendiert.
Das verdaute PCR-Produkt wurde mit NcoI- und BamHI- verdauter und dephoshorylierter pAGR3 DNA ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in E.coli ER2206 Zellen elektroporiert, die das pSYXBglM Plasmid enthielten.
Transformierte Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit Carbenicillin, Kanamycin und Tetracyclin selektiert.
Plasmide wurden mit dem alkalischen Lyseverfahren isoliert, mit Restriktionsendonucleasen verdaut und anhand von Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Klone, die Plasmide mit der richtigen Konfiguration enthielten, wurden in bezug auf endonukleolytische Aktivität im Rohextrakt überprüft. Das neue Endonuclease ausprägende Plasmid erhielt die Bezeichnung pAGRBglR2 (Fig. 6E).
Der neue Klon wurde hinsichtlich optimaler Wachstums- und Expressionsbedingungen getestet. Die besten Ergebnisse wurden erhalten, als der Klon in LB mit Carbenicillin, Kanamycin und Tetracyclin bei 30ºC bis zur späten log-Phase (eine Anzeige von 100 auf einem photoelektrischen Kolorimeter von Klett-Summerson) vermehrt, mit 0,5 mM IPTG induziert und weitere 20 Stunden bei 30ºC vor der Ernte vermehrt wurde. Unter diesen Bedingungen lag der Ertrag von R. BglII bei etwa 1.200.000 Einheiten pro Gramm Zellen - eine 40fache Überexpression gegenüber B. globigii RUB562 Zellen. Ein zur weiteren Charakterisierung und Optimierung ausgewähltes Isolat des Klons erhielt die Stammbezeichnung NEB#731. Eine Probe von NEB#731 wurde am 23. Februar 1993 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung in Rockville, Maryland mit der Beitrittsnummer 69247 hinterlegt. Eine Titration der von Rohzellextrakten von NEB#731 produzierten BglII Restriktionsendonucleaseaktivität ist in Fig. 8 dargestellt.
18. Fermentation: Eine einzelne Kolonie wurde zum Inokulieren von 1 Liter LB verwendet, das angemessene Antibiotika enthielt; die Kultur wurde über Nacht bei 30ºC auf eine Enddichte von 109 Zellen/ml vermehrt. Die Übernacht-Kultur wurde zum Inokulieren eines Fermenters mit 100 Litern der gleichen Medien mit einem pH-Wert von 7, 1 verwendet. Die Fermenterkultur wurde bei 30ºC auf Klett = 100 vermehrt, mit 0,3 mM IPTG induziert und über Nacht bei 30ºC vermehrt. Zellen wurden kontinuierlich in einer Sharples-Zentrifuge mit 16.000 UPM geerntet. Der Endertrag betrug 758 Gramm Zellen.
19. R. BglII-Reinigung: Etwa 400 Gramm Zellen wurden in etwa 1200 ml Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,1, 0,1 mM EDTA, 10 mM β-Mercaptoethanol), der 50 mM NaCl enthielt, resuspendiert und mit einem Manton-Gaulin 15 M Labor- Homogenisator aufgespalten (etwa 4 Durchläufe mit 12.000 psi oder bis OD595 und OD260 eingepegelt waren). Bruchstücke wurden durch 40-minütige Zentrifugation in einer Sharples- Zentrifuge entfernt. Festes NaCl wurde in das Supernatant auf eine Endkonzentration von 400 mM und Polyethylenglykol (PEG) auf 7,5% gegeben (über einen Zeitraum von 30 Minuten unter Rühren). Das PEG wurde durch Schleudern in einer Beckman-Zentrifuge mit 4000 UPM über einen Zeitraum von 20 Minuten präzipitiert und das Pellet entsorgt.
Das Supernatant wurde mit Puffer A auf eine Endkonzentration von 150 mM NaCl verdünnt, mit einem Leitfähigkeitsmessgerät überwacht. Die Probe wurde auf eine 5 cm · 13 cm Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia LKB Biotechnologies) aufgebracht, äquilibriert mit Puffer A, der 150 mM NaCl enthielt. Die Säule wurde mit etwa 500 ml Puffer A gewaschen, der 150 mM NaCl enthielt. Protein wurde mit einem 2000 ml Gradienten von 150 mM bis 1200 mM NaCl in Puffer A eluiert, und 24 ml Fraktionen wurden aufgefangen. R. BglII Aktivität eluierte zwischen 0,6 und 0,85 M NaCl. An dieser Stelle und während der gesamten Reinigung wurde die Aktivität anhand eines Tests gemessen, unter Verwendung von 1 ul A DNA (New England Biolabs) als Substrat, 1 ul Säulenfraktionen und Standardpufferbedingungen, inkubiert bei 37ºC über einen Zeitraum von 2 Minuten.
Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst und über Nacht mit 4 Liter Puffer A, der 150 mM NaCl enthielt, dialysiert. Das Dialysät wurde auf eine zweite Heparin- Sepharose-Säule (Pharmacia LKB), 1,5 cm · 34 cm, aufgebracht, äquilibriert mit Puffer A mit 150 mM NaCl. Die Säule wurde mit 2 Säulenvolumen von Puffer A mit 150 mM NaCl gewaschen. Protein wurde mit einem 1000 ml Gradienten von 150 mM bis 1200 mM NaCl in Puffer A eluiert, und es wurden 12 ml Fraktionen aufgefangen. R. BglII Endonucleaseaktivität, die wie zuvor beschrieben untersucht wurde, eluierte zwischen 0,4 und 0,65 M NaCl.
Aktive Fraktionen wurden zusammengefasst, Rinderserumalbumin wurde auf eine Endkonzentration von 100 ug/ml zugegeben, und die Lösung wurde über Nacht mit Speicherpuffer (50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% Glycerol) dialysiert, um das Volumen zu reduzieren.
Das Dialysat wurde auf eine Sepadex G75 Klassierungssäule (2,5 cm · 114 cm) aufgebracht, und die Säule wurde mit Puffer B (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 7, 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% Glycerol) mit einer Fließgeschwindigkeit von 4,5 ml/h betrieben. R. BglII eluierte in einem Volumen von 60 ml; aktive Fraktionen wurden zusammengefasst, Rinderserumalbumin wurde auf eine Endkonzentration von 200 mg/ml zugegeben, und das Enzym wurde in Speicherpuffer redialysiert.
Mit diesem Reinigungssystem wurden 1, 2 · 106 Einheiten R. BglII produziert - ein Ertrag von 16%.
Die aus dieser Reinigung erhaltene BglII Restriktionsendonuclease war im wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease und Exonuclease. Die Reinheit des BglII Restriktionsendonucleasepräparates wurde anhand der folgenden Kriterien überprüft: 1) Ligation: Nach einer 15fachen Überverdauung von X DNA konnten mehr als 95% der produzierten DNA-Fragmente mit T4 DNA Ligase religiert werden (mit einer V-Ende-Konzentration von 1-2 mM bei 16ºC). Von diesen ligierten Fragmenten konnten 95% erneut zerschnitten werden. 2) Verlängerte Verdauung: Nach dem Inkubieren einer 50 ul Reaktion mit 1 ug A DNA und 400 Einheiten an Enyzm über einen Zeitraum von 16 Stunden wurde das gleiche Bandenmuster wie bei einer Reaktion produziert, die 1 Einheit an Enzym enthielt und 1 Stunde lang inkubiert wurde. 3) Exonucleasenaktivität: Nach dem Inkubieren von 3000 Einheiten Enzym über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37ºC in einer 50 ul Reaktion, die 1 ug beschallte [³H] DNA (10&sup5; cpm/mg) enthielt, wurden weniger als 0,1% der Radioaktivität freigesetzt. 4) Endonucleasenkontamination: Nach dem Inkubieren von 80 Einheiten Enzym über einen Zeitraum von 4 Stunden bei 37ºC in einer 50 ul Reaktion, die 1 ug X174 RFI DNA enthielt, wurden 10% der DNA in RFII umgewandejt. Alle Tests wurden in dem folgenden Reaktionspuffer durchgeführt: 50 mM NaCl, 10 mM Tris HCl, 10 mM MgCl&sub2;, 1 mM DTT (pH 7,9 bei 25ºC).

EINZELHEITEN ZU STANDARDVERFAHREN

1. Antibiotikazusätze in Medien: Nach Bedarf wurden sowohl Flüssigmedien als auch Agarplatten die folgenden Antibiotika in den genannten Konzentrationen zugegeben: Ampicillin (50 ug/ml), Carbenicillin (50 ug/ml), Tetracyclin (10 ug/ml), Kanamycin (50 ug/ml).
2. DNA-Reinigung nach Restriktionsendonuclease- Verdauung: Die Restriktionsverdauungsreaktion wird einmal mit einem gleichen Phenolvolumen und einmal mit einem gleichen Chloroformvolumen extrahiert. Zwei Volumen 95%iges Ethanol werden anschließend zugegeben, und das Gemisch wird 10 Minuten lang in einem Trockeneis-Ethanolbad inkubiert, um die DNA zu präzipitieren. Die DNA wird durch 10-minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge bei 4ºC aufgefangen, das Supernatant wird dekantiert und das DNA- Pellet in einem geeigneten Volumen von TE-Puffer resuspendiert.
3. Präparation von kompetenten E.coli Zellen mit CaCl&sub2; E.coli Zellen werden zur Transformation präpariert, indem eine Vermehrung in Flüssigkultur bis zur späten 10g- Phase (Klett = 100) und eine Ernte durch Zentrifugation stattfindet. Zellen werden in einem halben Volumen 50 mM CaCl&sub2; gewaschen, wie zuvor beschrieben geerntet und schließlich in 1/50 Originalvolumen 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert:
4. Transformation kompetenter calciumbehandelter E.coli Zellen: Zellen werden durch Vermischen von DNA mit 200 ul Zellen und Inkubieren über einen Zeitraum von 20 Minuten auf Eis transformiert. Zellen werden durch 2- minütige Inkubation bei 42ºC einem Hitzeschock ausgesetzt. Es wird 1 ml LB-Medium zugegeben, die Zellen werden 1 Stunde lang bei 37ºC inkubiert und auf Agarplatten verteilt, die das/die entsprechende(n) Antibiotikum/Antibiotika enthalten.
5. Plasmidisolierung durch das Alkali-Lvse- "Miniprep"-Verfahren: Zellen von einer 5 ml Übernacht- Kultur werden durch 10-minütige Zentrifugation in einem Beckman JA-17 Rotor mit 5000 UPM geerntet und in 100 ul eiskaltem GET-Puffer (50 mM Glucose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 8,0, 4 mg/ml Lysozym) resuspendiert. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur werden 200 ul einer frisch zubereiteten Lösung (0,2 N. NaOH, 1% SDS) zugegeben. Die Lösung wird durch Inversion leicht vermischt und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. In das Lysat werden 150 ul einer 5 M Kaliumacetatlösung mit einem mit Eisessig auf 4,8 eingestellten pH-Wert gegeben. Das Zell-Lysat wird vermischt, 5 Minuten lang auf Eis inkubiert und 5 Minuten lang in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4ºC zentrifugiert. Das Supernatant wird einmal mit einem gleichen Volumen Phenol: Chloroform (1 : 1) extrahiert, vermischt und 2 Minuten lang in einer Eppendorf-Zentrifuge geschleudert. Zwei Volumen 95%iges Ethanol werden zur oberen Schicht gegeben, das Gemisch wird 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und die DNA wird durch 5-minütige Zentrifugation in einer Eppendorf-Zentrifuge aufgefangen. Das Pellet wird mit 1 ml 70%igem Ethanol gewaschen und wie zuvor erneut zentrifugiert. Das Supernatant wird dekantiert, das DNA- Pellet an der Luft oder in einem Vacuum-Exsikkator trocknen gelassen, und das Trockenpellet wird in 50 ul TE mit 20 ug/ml RNase resuspendiert.
6. Transformation von E.coli Zellen durch Elektroporation: 1 Liter LB-Medium wird 1 : 500 mit einer Übernacht-Kultur von E.coli Zellen inokuliert. Wenn die Kultur die mittlere 10g-Phase (Klett = 65) erreicht, werden die Zellen durch 15-minütige Zentrifugation mit 4000 UPM in einer Beckman J2-21 Zentrifuge mit einem JA-14 Rotor geerntet. Das Supernatant wird dekantiert und die Zellen werden in 1 Liter sterilem H&sub2;O bei 4ºC resuspendiert. Zellen werden wie zuvor beschrieben geerntet und wieder in 0,5 Liter sterilem H&sub2;O bei 4ºC resuspendiert. Zellen werden wie zuvor beschrieben geerntet und zum dritten Mal in 20 ml sterilem H&sub2;O, das 10% Glycerol enthält, bei 4ºC resuspendiert. Zellen werden wie zuvor beschrieben geerntet und ein letztes Mal in 2 ml sterilem H&sub2;O, das 10% Glycerol enthält, bei 4ºC resuspendiert. Die Zelldichte sollte zu diesem Zeitpunkt wenigstens 3 · 10¹&sup0; Zellen/ml betragen. Auf diese Weise präparierte Zellen können direkt verwendet oder bei -70ºC auf unbestimmte Zeit gelagert und unmittelbar vor der Verwendung auf Eis aufgetaut werden.
Zellen werden durch Vermischen von DNA (1-40 ml Volumen) mit 40 ul Zellen elektroporiert und 1 Minute lang auf Eis inkubiert. Strom wird an das Gemisch mit einer Gene-Pulser-Vorrichtung von Bio-Rad angelegt, die auf eine Kapazität von 25 uFD und einen Widerstand von 200 Ω eingestellt ist, und zwar mit einem 2,5 kV Impuls. Die elektroporierten Zellen werden in 1 ml LB resuspendiert und bei 37ºC 1 Stunde lang inkubiert, bevor sie auf Agarplatten mit den geeigneten Antibiotika verteilt werden.
7. Verfahren zur Plasmidisolierung durch Triton- Lyse: Zellen werden von Flüssigkultur durch 15-minütige Zentrifugation mit 5000 UPM in einer Beckman J2-21 Zentrifuge mit JA-17 Rotor geerntet und in 8 ml Tris- Saccharose-Puffer (50 mM Tris, pH 8,0, 25% Saccharose) pro Liter Kultur resuspendiert. Die Zellen werden anschließend zusammengefasst; in den Pool werden 0,8 ml 0,5 M EDTA, pH 8,0, 0,8 ml 10 mg/ml Lysozym und 5,6 ml Triton-Puffer (62,5 mM EDTA, 1% Triton X-100, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0) pro Liter Kultur gegeben. Die Komponenten werden durch leichte Inversion vermischt, 30 Minuten lang auf Eis inkubiert und mit 16.000 UPM 45 Minuten lang im gleichen Rotor wie oben zentrifugiert, um Zellreste zu entfernen. 1,1 g/ml CsCl werden zum Supernatant gegeben, gefolgt von Ethidiumbromid zu 100,ug/ml. Das Gemisch wird mit 44.000 UPM 48 Stunden lang (oder 55.000 UPM 24 Stunden lang, gefolgt von 44.000 UPM 1 Stunde lang) in einer Beckman L8-55 Ultrazentrifuge mit einem Ti70 Rotor geschleudert. Nach der Zentrifugation werden DNA-Banden mit einer Spritze von den CsCl-Gradienten entfernt, mit 2 Volumen H&sub2;O verdünnt, und DNA wird von der resultierenden Lösung durch Zugabe von 2 Volumen 95%iges Ethanol präzipitiert und bei -20ºC wenigstens 30 Minuten lang eingefroren. Die DNA wird durch Schleudern mit 12.000 UPM über einen Zeitraum von 20 Minuten in einer Beckman J2- 21 Zentrifuge mit JA-17 Rotor aufgefangen, das Supernatant wird dekantiert und das Pellet in 1-2 ml TE resuspendiert. Die DNA-Lösung wird einmal mit einem gleichen Phenolvolumen extrahiert, gefolgt von der Extraktion mit einem gleichen Chloroformvolumen. LiCl wird in einer Konzentration von 0,2 M zugegeben, anschließend werden 2 Volumen 95%iges Ethanol zugegeben. DNA wird ein zweites Mal durch Einfrieren bei - 70ºC über Nacht präzipitiert und dann wie zuvor beschrieben aufgefangen. Das endgültige DNA-Pellet wird in 0,5 ml TE resuspendiert.
8. Papierelution von DNA von Agarose: Whatman Chromatographiepapier DE81 wird mehrere Stunden lang in 2,5 M NaCl eingeweicht, einige Minuten vorsichtig mit H&sub2;O gewaschen und trocknen gelassen.
Nach dem Separieren der Fragmente durch Agarose- Gelelektrophorese wird in das Gel neben der zu reinigenden DNA-Bande eine Mulde geschnitten, und DEAE-Papier, das wie zuvor beschrieben präpariert wurde, wird in die Mulde eingesetzt. Die Mulde wird mit Puffer gefüllt, und das Gel wird in einem Winkel von 90º gedreht, so dass die Bande von Interesse in die eingeschnittene Mulde wandert und nicht untertaucht, bis dies geschehen ist.
Die Waschvorrichtung besteht aus einer 0,5 ml Eppendorf-Röhre mit einem Loch im Boden, die in einer 1,5 ml Eppendorf-Röhre sitzt. In der präparierten Röhre wird das DEAE-Papier zweimal mit 150 ul salzarmem Puffer (0,1 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) gewaschen, indem das Papier in der Flüssigkeit zerstampft und die Flüssigkeit dann durch das Loch im Boden durch Zentrifugation herausgezogen wird. Anschließend finden 4 Wäschen in 75 ul salzreichem Puffer (1, 0 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) statt. Die Waschflüssigkeiten mit hohem Salzgehalt werden zusammengefasst und einmal mit einem gleichen Volumen Phenol: Chloroform (1 : 1) und einmal mit Chloroform extrahiert. DNA wird durch Zugabe von 2 oder mehr Volumen 95%iges Ethanol präzipitiert, in einem Trockeneis- Ethanolbad 15 Minuten lang eingefroren und 10 Minuten lang bei 4ºC zentrifugiert. Das Supernatant wird vorsichtig entfernt und das Pellet getrocknet und in einem angemessenen TE-Volumen resuspendiert.
9. Präparation kompetenter E.coli Zellen mit RbCl: E.coli Zellen werden in Flüssigkultur bis zur mittleren 10g-Phase (Klett = 60 bis 80) vermehrt, auf Eis gekühlt und durch 5- minütige Zentrifugation in einem Beckman JA-14 Rotor mit 4000 UPM geerntet. Zellen werden in 1/5 Volumen TFB I (30 mM Kaliumacetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl&sub2;, 50 mM MnCl&sub2;, 15% Glycerol, pH 5,8 mit 0,2 M Essigsäure) resuspendiert, gekühlt und wie zuvor beschrieben geerntet. Zellen werden in 1/50 Originalvolumen TFB II (10 mM MOPS, 75 mM CaCl&sub2;, 10 mM RbCl, 15% Glycerol, pH 6,5 mit KOH) resuspendiert und " " vor dem Gebrauch 15 bis 60 Minuten lang auf Eis gekühlt. Das für CaCl&sub2;-behandelte Zellen beschriebene
Transformationsprotokoll kommt auch für RbCl-behandelte Zellen zur Anwendung.
10. Phagenprüfung zur Methylierung: 20 ml Rich-Nährlösung (pro Liter enthält Rich-Nährlösung: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, mit 1 N NaOH auf 7,0 eingestellter pH-Wert) mit 0,04% Maltose und geeigneten Antibiotika werden 1 : 100 mit einer Übernacht-Kultur des Transformanten inokuliert. Die neue Kultur wird bis zur mittleren log- Phase bei 37ºC unter Schütteln vermehrt, und die Zellen werden durch Zentrifugation (4000 UPM, 5 Min.) geerntet und in 1 ml SM (100 mM NaCl, 8 mM MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% Gelatine) resuspendiert. λvir-Phagen werden zu einer Infektionsmultiplizität von 10 gegeben, und die Zellen werden zur Phagenadsorption bei 37ºC 20 Minuten lang inkubiert. Nach der Inkubation wird durch Zugabe von Rich- Nährlösung, die 0,04% Maltose enthält, ein Volumen von 20 ml wieder hergestellt, und die Kultur wird bei 37ºC über Nacht vermehrt. Am nächsten Tag werden 200 ul Chloroform zur Kultur gegeben, Zellreste werden durch Zentrifugation und anschließend durch Filtration durch einen 0,45 um Filter (Schleicher und Schuell) entfernt. Phagen-DNA wird von 1 ml geklärtem Supernatanten durch Extraktion mit Phenol und anschließend Chloroform, Präzipitation mit Ethanol bei -70ºC, gefolgt von Zentrifugation (12000 UPM, 20 Min. in einem Beckman JA-17 Rotor) und Resuspension des Pellets in 100 ul TE mit 20 ug/ml RNase isoliert.

SEQUENZAUFLISTUNG

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDERIN:
(A) NAME: NEW ENGLAND BIOLABS, INC.
(B) STRASSE: 32 TOZER ROAD
(C) STADT: BEVERLY
(D) STAAT: MASSACHUSETTS
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 01915
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: VERFAHREN ZUM KLONIEREN UND HERSTELLEN DER BglII RESTRIKTIONSENDONUCLEASE UND MODIFIKATIONSMETHYLASE
(iii)ANZAHL SEQUENZEN: 6
(iv) MASCHINENLESBARES FORMULAR:
(A) MEDIENTYP: Diskette
(B) COMPUTER: IBM-kompatibler PC
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patent in Release Nr. 1.0, Version Nr. 1.25 (EPO)
(vi) FRÜHERE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER: US 08/017664
(B) REGISTRIERUNGSDATUM: 9. APRIL 1993
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 16 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(C) STRÄNGIGKEIT: unbekannt
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID No. 1:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 2:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 3:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 17 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 3:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 4:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 3188 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 4:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 5:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 21 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 5:
(2) INFORMATIONEN FÜR SEQ ID Nr.: 6:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIKEN:
(A) LÄNGE: 23 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einfach
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID Nr. 6:

Claims

1. Isolierte DNA-Codierung für die BglII Restriktionsendonuclease, wobei die isolierte DNA von ATCC Accession Nr. 69247 erhältlich ist.

2. Rekombinanter DNA-Vektor, in den eine DNA-Segment- Codierung für BglII Endonuclease eingefügt wurde, die von Bacillus globigii ATCC Accession Nr. 69247 erhalten werden kann.

3. Isolierte DNA-Codierung für die BglII Restriktionsendonuclease und Methylase, wobei die isolierte DNA von ATCC Accession Nr. 69247 erhältlich ist.

4. Klonierungsvektor, in den die isolierte DNA von Anspruch 1 eingefügt wurde.

5. Klonierungsvektor, in den die isolierte DNA von Anspruch 3 eingefügt wurde.

6. Prokaryotische Wirtszelle, die von dem Vektor nach Anspruch 2, 4 oder 5 transformiert wurde.

7. Verfahren zur Herstellung von BglII Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer prokaryotischen Wirtszelle, die gegen BglII Spaltung geschützt ist, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 2, 4 oder 5 unter Bedingungen, die für die Expression der genannten Endonuclease geeignet sind.