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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BsmI Restriktionsendonuclease
(Endonuclease) sowie zwei BsmI Methyltransferasen (Methylasen, M1
und M2) kodiert, sowie die Expression von BsmI Restriktionsendonuclease
von E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
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BsmI
Restriktionsendonuclease ist im Stamm von Bacillus stearothermophilus
NUB36 (New England Biolabs Stammsammlung Nr. 328) zu finden. Sie
erkennt doppelsträngige
DNA-Sequenz
5' GARTGCN↓ 3'
3' CTTAC↑GN 5' (↓/↑ Spaltstelle)
und spaltet stromabwärts
ihrer Erkennungssequenz (N1) auf dem oberen Strang und spaltet außerdem innerhalb
der Erkennungssequenz auf dem unteren Strang (zwischen G und C der
Sequenz 5' GCATTC
3'), um einen 2-Basen-Überhang
am 3' Ende zu erzeugen.
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Restriktionsendonucleasen
des Typs II und IIs sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in
Bakterien und in einigen Viren vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienproteinen
weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen
im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine
Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet
werden.
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Restriktionsendonucleasen
erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden
(die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül. Nach
dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb, an einer Seite
oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen
haben Affinität
zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertundelf
Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden
unter den vielen hundert bisher untersuchten Bakterienspezies identifiziert
(Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27:312-313 (1999)).
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Restriktionsendonucleasen
werden typischerweise nach den Bakterien benannt, von denen sie
abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit
beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen namens
DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils
die Sequenzen 5'TTT↓AAA3', 5'PuG↓GNCCPy3' und 5'CACNNN↓GTG3'. Escherichia coli
RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz
5'G↓AATTC3' erkennt.
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Eine
zweite Komponente von bakteriellen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die
Methyltransferasen (Methylasen). Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen
und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und
sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen
erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die
entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu
spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb
der Sequenz durch Hinzufügen
einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss
an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch
die zugehörige
Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle
wird durch die Aktivität
ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher
gegenüber
der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich.
Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert
auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
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Mittels
DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und
die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren.
Der Schlüssel
zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die
Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung
solcher Klone innerhalb komplexer genomischer DNA-Bibliotheken, d.h.
Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn
sie in geringen Frequenzen von 10–3 bis
10–9 auftreten.
Das Verfahren sollte vorzugsweise selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit
der Klone zerstört
wird, während
die erwünschten
seltenen Klone überleben.
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Es
wurde eine große
Zahl von Restriktions-Modifikationssystemen
des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine
Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren
von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol.
Gen. Genet. 178:717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3:97-112
(1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507
(1981)). Da die Anwesenheit von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese
befähigt,
Infektionen durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen,
die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell
als Überlebende von
genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv
isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren
nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass
klonierte Restriktions-Modifikationsgene
nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben
zu gewähren.
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Ein
weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als
plasmidbürtig
gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsvektoren ein (EcoRV:
Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7:
Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983);
Theriault und Roy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et
al., J. Bacteriol. 164:501-509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene
202:83-88 (1997)).
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Gemäß einem
dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen
selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI:
Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403-6421 (1985)). Da R-M-Gene oft eng miteinander
verknüpft
sind, können
beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt
jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern
stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene
10:219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20:197-204 (1982);
BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21:111-119 (1983); und MspI: Walder
et al., J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)).
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Ein
neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten
Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis
des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ
Fusion enthält
(Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al.,
Nucl. Acids Res. 22:2399-2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens
werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an einen DNA-Schaden genutzt,
der durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen
verursacht wird. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler
Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent
Nr. 5, 498, 535).
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Da
gereinigte Restriktionsendonucleasen und in geringerem Maße Modifikationsmethylasen
nützliche Werkzeuge
zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, besteht ein
kommerzieller Anreiz, Stämme von
Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken
zu gewinnen, die Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch
die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren des BsmI
Restriktionsendonucleasegens von Bacillus stearothermophilus NUB36.
Zunächst
wurde das Methylaseselektionsverfahren angewendet, um das BsmI Methylasegen
zu klonieren. Ein methylasepositiver Klon wurde von einer Plasmidbibliothek abgeleitet,
die BsmI Genom-DNA enthielt. Es wurde jedoch keine scheinbare BsmI
Aktivität
im Zellextrakt vom M+ Klon nachgewiesen.
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Das
DNA-Insert im M+ Klon wurde durch Primer-Walking
sequenziert. Man fand, dass der Klon das gesamte bsmIM1 Gen und
einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens enthielt. Auf der linken
Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befand sich ein ORF, das etwa 30%
Aminosäuresequenzidentität zu einem DNA-Partitionsprotein
aufwies (ParA-Familie). Da sich Restriktionsendonucleasegene oft
neben dem Methylasegen befinden, wurde angenommen, dass sich das
BsmI Endonucleasegen (bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten Seite
des BsmIM1 und BsmIM2 Gens befindet (1). Es wurden
Anstrengungen unternommen, den Rest des BsmI M2 Gens und das gesamte
bsmIR Gen durch inverse PCR und PCR zu klonieren. Nach fünf Runden
der inversen PCR und Sequenzierung der inversen PCR-Produkte wurde
die gesamte Sequenz des bsmIM2 Gens erhalten. Ein offenes Leseraster
(ORF) von 2031 bp wurde stromabwärts
des BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde BsmIR Gen genannt
(1 und 4). Das Plasmid pBR-BsmIM1 war
nur teilweise gegen BsmI Verdau resistent, wohingegen pBR-BsmIM2
völlig
resistent gegen BsmI Verdau war. Beide BsmI M1 und M2 Gene wurden
durch PCR amplifiziert und in den Vektor pBR322 kloniert, um das
Plasmid pBR-BsmIM1&M2
zu erzeugen. Beide BsmI M1 und M2 Gene befanden sich unter der Kontrolle
des TcR-Promotors und wurden konstitutiv
in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 war völlig resistent gegen BsmI Verdau,
was auf eine ausreichende Expression vom TcR-Promotor
hinwies.
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Das
bsmIR Gen wurde durch PCR amplifiziert und in einen T7 Expressionsvektor
pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden kloniert.
Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammt von pACYC184 und hat 5-8
Kopien pro Zelle. Er enthält
4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des
T7 Promotors. Von den Transkriptionsterminatoren wird erwartet,
dass sie die Run-off Transkription von/vom kryptischen E. coli Promotor(en)
auf dem Vektor reduzieren. Zellextrakte wurden präpariert
und im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität geprüft. Zwei Isolate (Nr. 11 und
Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Die Ausbeute von rekombinantem
BsmI wurde mit 2 × 106 Einheiten pro Gramm nasser Zellen bestimmt
(siehe 5 für
den Aktivitätsassay).
Das gesamte bsmIR Gen wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass
Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
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Da
die BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym ist, wurde der E.
coli Zellextrakt, der BsmI enthielt, auf 65°C erhitzt und denaturierte Proteine
wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden auf
eine Heparin-Sepharose-Säule
geladen. Die Proteine wurden mit einem Salzgradient von 50 mM bis
1 M NaCl eluiert. BsmI Aktivität
wurde für
jede Fraktion geprüft.
Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf SDS-PAGE analysiert (6).
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Die
beobachtete Molekülmasse
von BsmI Endonuclease auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was in enger Übereinstimmung
zur vorhergesagten Molekülmasse
von 78,1 kDa ist.
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KURZBESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1:
Genorganisation des BsmI Restriktionsmodifikationssystems. Die Gene
bsmIM1 und bsmIM2 kodieren jeweils die BsmI Methylasen M1 und M2.
Das Gen bsmIR kodiert die BsmI Restriktionsendonuclease. ORF ist
ein kleines offenes Leseraster zwischen M1 und M2.
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2:
DNA-Sequenz des BsmI M1 Methylasegens (SEQ ID Nr. 1) (bsmIM1) und
die kodierte Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 2).
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3:
DNA-Sequenz des BsmI M2 Methylasegens (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte
Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 4).
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4:
DNA-Sequenz des BsmI Endonucleasegens (SEQ ID Nr. 5) (bsmIR) und
die kodierte Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 6).
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5:
Rekombinante BsmI Endonucleaseaktivität in Zellextrakt. Bahn 1, 1
kb DNA Größenmarker; Bahn
2, Lambda-DNA gespalten
durch gereinigtes natives BsmI; Bahnen 3 bis 12, Lambda DNA gespalten durch
Zellextrakt, der rekombinantes BsmI enthält. Verdünnungsfaktoren in Bahn 3 bis
12 waren: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800,
1/25600 und 1/51200.
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6:
SDS-PAGE von teilweise gereinigter BsmI Restriktionsendonuclease.
Die vorhergesagte Molekülmasse
von BsmI Endonuclease ist 78,1 kDa. Die beobachtete Molekülmasse auf
SDS-PAGE ist 77,9 kDa. Bahn 1, Proteingrößenmarker; Bahnen 2-12, eluierte
Fraktionen (19-29)
von einer Heparin-Sepharose-Säule.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Das
hierin beschriebene Verfahren, mit dem die beiden BsmI Methylasegene
und das BsmI Restriktionsendonucleasegen bevorzugt kloniert und
in E. coli exprimiert werden, beinhaltet die folgenden Schritte:
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1. Konstruktion von BsmI
Genom-DNA-Bibliotheken und Klonierung des bsmIM1 Gens
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Genomische
DNA wurde von Bacillus stearothermophilus NUB36 (New England Biolabs
Sammlung Nr. 328) mit dem Standardverfahren präpariert. Zehn μg genomische
DNA wurden jeweils mit AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI
verdaut und mit einem modifizierten pBR322 (2 BsmI Orte) mit kompatiblen
Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Elektroporation in kompetente
RR1 Zellen transferiert. Mehr als 104 ApR-Kolonien wurden von den AatII, BspEI, ClaI,
HindIII, NdeI und EcoRI Bibliotheken gepoolt und Zellen wurden über Nacht
in 2 Liter LB plus Ap amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen
präpariert.
Die Plasmidbibliothek-DNA wurde mit BsmI über Nacht verdaut und die kontaktierte
DNA wurde zum Transformieren von kompetenten ER2683 Zellen (McrBC–,
Mrr–,
McrA–)
verwendet. Überlebende
Transformanten wurden über
Nacht bei 37°C
auf Ap-Platten plattiert. Es wurden Plasmid-Mini-Präparationen
gemacht und mit BsmI verdaut, um zu prüfen, ob sie gegen BsmI-Verdau
resistent waren. Man fand, dass zwei Plasmide (Nr. 22 und Nr. 54)
von 54 Klonen gegen BsmI-Verdau teilresistent waren, was ein Hinweis
darauf war, dass ein bsmIM Gen kloniert und in einem akzeptablen
Maß in
E. coli exprimiert worden war. Es wurde jedoch keine scheinbare BsmI
Aktivität
im Zellextrakt des M+ Klons nachgewiesen.
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Das
DNA-Insert im M+ Klon Nr. 54 wurde mit ApoI,
NdeI und PvuII verdaut und die DNA-Fragmente wurden in pUC19 subkloniert.
Die inserierten Fragmente wurden dann unter Verwendung von pUC19
Universalprimer und Rückwärtsprimer
sequenziert. Der Rest des Inserts wurde durch Primer-Walking sequenziert. Man
fand, dass der Klon in einem NdeI Ort endete und das gesamte bsmIM1
Gen und einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens enthielt. Auf
der linken Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befand sich ein ORF,
das 30% Aminosäuresequenzidentität zu einem
DNA-Partitionsprotein
(ParA-Familie) aufwies. Da sich Restriktionsendonucleasegene gewöhnlich neben
dem Methylasegen befanden, ging man davon aus, dass das BsmI Endonucleasegen
(bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten Seite des bsmIM1 und bsmIM2
Gens lag (1). Es wurden Anstrengungen
unternommen, den Rest des M2 Gens und das gesamte BsmIR Gen durch
inverse PCR und PCR zu klonieren.
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2. Klonierung des BsmIM2
und BsmIR Gens durch inverse PCR und PCR
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Zwei
inverse PCR-Primer (230-119 und 229-159) wurden synthetisiert. BsmI
Genom-DNA wurde jeweils mit BsaWI, BspHI, EcoRI, HindIII, MfeI,
NlaIII, NspI und TaqI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und
bei geringer Konzentration selbstligiert. Die T4 DNA-Ligase wurde
durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als
Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in BsaWI,
EcoRI, MfeI, NlaIII und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht
schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter
Verwendung der Primer 230-119 und 229-159 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 540
bp einer neuen DNA-Sequenz in dem BsmI M2 Gen hervor.
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Zwei
inverse PCR-Primer (232-188 und 232-189) wurden synthetisiert. BsmI
Genom-DNA wurde mit BstUI, BstYI, ClaI DraI, NdeI, RsaI und XbaI
verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringen Konzentration
selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein
Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet.
PCR-Produkte wurden in DraI und RsaI Matrizen gefunden und von einem
leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA
wurde unter Verwendung der Primer 232-188 und 232-189 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 120 bp einer neuen
DNA-Sequenz in dem BsmI M2 Gen hervor.
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Zwei
inverse PCR-Primer (233-125 und 233-126) wurden dann synthetisiert.
BsmI Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI,
HindIII, MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute
DNA wurde gereinigt und in einer geringer Konzentration (2 μg/ml Endkonz.)
selbstligiert. Die T4 DNA-Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten
lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize
zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in ClaI, RsaI, SspI
und XbaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel
gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer
233-125 und 233-126 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert.
Interne Primer wurden ebenfalls zum Sequenzieren des 1600 bp XbaI
Fragments verwendet. Dieser inverse PCR Schritt brachte etwa 1440
bp einer neuen DNA-Sequenz
im BsmI M2 und bsmIR Gen hervor.
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Es
wurden zwei inverse PCR-Primer (234-167 und 234-168) synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit
BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII, MfeI, MluI, NdeI,
NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt
und in einer geringen Konzentration selbstligiert. Die Ligase wurde
durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als
Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in HindIII,
SspI und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden
Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung
der Primer 234-167 und 234-168 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert.
Dieser inverse PCR-Schritt
brachte etwa 300 bp einer neuen DNA-Sequenz in den BsmIR Genen hervor.
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Es
wurden zwei inverse PCR-Primer (238-179 und 238-180) synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit
ApoI, BglII, DraI, EcoRI, HindIII, KpnI, RsaI und XbaI verdaut.
Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringen Konzentration
selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein
Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet.
PCR-Produkte wurden in KpnI und RsaI Matrizen gefunden und von einem
leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA
wurde unter Verwendung der Primer 238-179 und 238-180 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 500 bp einer neuen
DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor. Ein ORF von 2031 bp wurde stromabwärts des
BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde bsmIR Gen genannt (1 und 4).
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3. Expression des BsmI
M1 und M2 Gens in E. coli
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Es
wurden zwei Primer (230-29 und 230-32) zur PCR-Amplifikation des BsmI M1 Gens synthetisiert. Das
BsmI M1 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 230-29 und
230-32 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit BamHI
und SphI verdaut. Die PCR DNA wurde durch Spin-Säulen
wieder gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Nach
der Transformation in kompetente ER2683 Zellen wurden Mini-Präparationen
durchgeführt
und die Plasmid-DNA wurde mit BsmI in Kontakt gebracht. Zwölf Isolate
waren gegen BsmI Verdau teilresistent. Es war möglich, dass ein zweites Peptid
für die
optimale M1 Methylaseaktivität
erforderlich war. Ein kleines ORF von 228 bp (75 Aminosäurereste)
befand sich zwischen dem BsmI M1 und M2 Gen. Dieses 75-Aminosäurepeptid
kann zur optimalen M1 Aktivität
beitragen. Da BsmI M1 nur einen Strang der asymmetrischen BsmI Erkennungssequenz
(5' GAATGC 3' oder Komplementärstrang
5'GCATTC 3') methylieren kann,
ist evtl. eine zweite Methylase zum Methylieren des anderen Strangs
erforderlich (siehe M2 Expression unten).
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Zwei
Primer (247-322 und 247-323) wurden zur PCR-Amplifikation des BsmI M2 Gens synthetisiert. Das
BsmI M2 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 247-322
und 247-323 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit
SphI und SalI über
Nacht bei 37°C
verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen
Enden ligiert. Dreizehn Plasmide wurden präpariert und mit BsmI verdaut.
Es zeigte sich, dass ein Isolat, Nr. 9, gegen BsmI Verdau resistent
war. Das SphI-SalI Fragment mit dem BsmI M2 Gen wurde von einem
leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Das gereinigte M2 DNA-Fragment
wurde mit pBR-BsmIM1
mit kompatiblen Enden ligiert. Das resultierende Plasmid war pBR-BsmIM1&M2. Die BsmI M1
und M2 Gene sind unter der Kontrolle des TcR-Promotors
und wurden konstitutity in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 ist gegen BsmI
Verdau völlig
resistent, was ein Hinweis auf eine ausreichende Expression vom
TcR-Promotor ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung
wurde bestimmt, dass zwei Methylasen für den vollen Schutz von BsmI
Orten erforderlich waren.
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4. Expression
des BsmI Restriktionsendonuclease(bsmIR)-Gens in E. coli
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Es
wurden zwei Primer (214-212 und 235-293) zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens synthetisiert. Das
bsmIR Gen wurde durch PCR mit 214-212 und 235-293 amplifiziert.
Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht
bei 37°C
verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor
pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert.
Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammte von pACYC184 und hatte
5-8 Kopien pro Zelle. Er enthielt 4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren
stromaufwärts
des T7-Promotors.
Man erwartete, dass die Transkriptionsterminatoren die Run-off Transkription
von/vom kryptischen E. coli Promotor(en) auf dem Vektor reduzierten.
Die ligierte DNA von bsmIR plus pACYC-T7ter wurde in den mit BsmI
Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert.
Es wurden sechsunddreißig
Plasmid-Mini-Präparationen
gemacht und es zeigte sich, dass sechs Isolate das Endonucleasegeninsert
enthielten. Zehn-ml-Zellkulturen wurden für diese sechs Isolate nach
einer IPTG-Induktion hergestellt. Nach einer Zelllyse durch Beschallung
wurden die Zellextrakte im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität untersucht.
Zwei Isolate (Nr. 11 und Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Drei
Isolate hatten teilweise BsmI Aktivität und ein Isolat hatte keine
Aktivität,
wahrscheinlich aufgrund von (einer) Mutation(en), die durch PCR
in das bsmIR Gen eingeführt
wurde(n). Der BsmI Expressionsklon Nr. 11 wurde für eine 500-ml-Kultur
verwendet, um die Anzahl von BsmI Einheiten pro Gramm nasser Zellen
zu bestimmen. Die Ausbeute an rekombinanter BsmI wurde mit 2 × 106 Einheiten pro Gramm nasser Zellen bestimmt
(zum Aktivitätsassay
siehe 5). Das gesamte bsmIR Gen wurde sequenziert, um
zu bestätigen,
dass Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
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5. Teilweise
Reinigung der BsmI
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Restriktionsendonuclease
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Da
BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym war, wurde E. coli Zellextrakt
mit BsmI 30 Minuten lang auf 65°C
erhitzt und denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt.
Die löslichen
Proteine wurden auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde
gründlich
mit einem salzarmen Puffer gewaschen. Das Protein wurde mit einem
Salzgradient von 50 mM bis 1 M NaCl eluiert. BsmI Aktivität wurde für jede Fraktion
geprüft.
Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf einem SDS-PAGE analysiert
(6). Die beobachtete Molekülmasse der BsmI Endonuclease
auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was nahezu der vorhergesagten
Molekülmasse
von 78,1 kDa entsprach.
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6. Expression der langen
Form der BsmI Endonuclease
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Es
gibt zwei „in
frame"-Codone (ATG
und CAG) stromaufwärts
des Startcodons des bsmIR Gens. Diese beiden Codone kodieren die
Aminosäurereste
M (Met) und Q (Gln). Die reguläre
BsmI Endonuclease hat eine Länge
von 676 Aminosäuren.
Die lange Form der BsmI Endonuclease hat eine Länge von 678 Aminosäuren. Zum
Exprimieren der langen Form der BsmI Endonuclease wurden zwei Primer
(244-186 und 235-293)
zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens (lange Form) synthetisiert.
Das bsmIR Gen (lange Form) wurde durch PCR mit 244-186 und 235-293
amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht
bei 37°C
verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor
pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert.
Die ligierte DNA von bsmIR (lange Form) plus pACYC-T7ter wurde in
den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert.
Es zeigte sich, dass ein Isolat (Nr. 4) das Endonucleasegen-(lange
Form)-Insert enthielt. Eine Zehn-ml-Zellkultur wurde für das Isolat hergestellt und
mit IPTG induziert und der Zellextrakt wurde im Hinblick auf BsmI
Endonucleaseaktivität
untersucht. Nr. 4 Zellextrakt wies volle BsmI Aktivität auf. Es
wurde bestimmt, dass die lange Form der BsmI Endonuclease mit zwei
zusätzlichen
Rminosäureresten
bei der DNA-Spaltung auch aktiv war.
-
Die
vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele
illustriert. Diese Beispiele sollen dem Verständnis der Erfindung dienen
und sind nicht als Begrenzung davon anzusehen.
-
BEISPIEL 1
-
Klonierung des BsmI Restriktionsmodifikationssystems
in E. coli
-
1. Konstruktion
von BsmI Genom-DNA-Bibliotheken und
-
Klonierung des bsmIM1
Gens
-
Genomische
DNA wird von Bacillus stearothermophilus NUB36 (New England Biolabs
Sammlung Nr. 328) mit dem Standardverfahren präpariert, das die folgenden
Schritte beinhaltet:
- (a) Zelllyse durch Zugabe
von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1% Endkonz.) und 50
mM Tris-HCl, pH 8,0;
- (b) Zelllyse durch Zugabe von 10% SDS (Endkonzentration 0,1%);
- (c) Zelllyse durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 62 mM EDTA,
50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
- (d) Phenol-CHCl3-Extraktion von DNA,
dreimal (gleiches Volumen), und CHCl3-Extraktion,
einmal;
- (e) DNA-Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, dreimal Wechsel; und
- (f) RNA wurde durch RNase-A-Behandlung entfernt und die genomische
DNA wurde in Ethanol präzipitiert und
in TE-Puffer resuspendiert.
-
Zehn μg genomische
DNA wurden jeweils mit AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI
2 Stunden lang bei 37°C
verdaut. Das Vektorplasmid pBR322 wurde auch jeweils mit AatII,
BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI verdaut und weiter mit CIP
1 Stunde lang bei 37°C
behandelt. Vektor und genomische DNA Proben wurden durch Qiagen
Spin-Säulen gereinigt.
Die verdaute genomische DNA wurde mit pBR322 mit kompatiblen Enden
ligiert und über
Nacht bei 16°C
inkubiert. Nach einer Übernachtligation
wurde die DNA in 4 1 destilliertem Wasser auf einer Nitrocellulosemembran
durch Tropfdialyse dialysiert. Anschließend wurde sie in kompetente
RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Mehr als 104 ApR-Kolonien wurden
von den AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI Bibliotheken
gepoolt und Zellen wurden über
Nacht in 2 Liter LB plus Ap amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von
den Übernachtzellen
durch Qiagen Maxi-Prep-Säulen
präpariert.
0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 μg
Bibliotheken-DNR wurden mit BsmI (25 Einheiten) über Nacht verdaut und die in
Kontakt gebrachte DNA wurde zum Transformieren kompetenter ER2683
Zellen verwendet (methylierungsabhängiger Restriktions-Minus-Stamm,
McrBC–,
Mrr–,
McrA–). Überlebende
Transformanten wurden über
Nacht bei 37°C
auf Ap-Platten plattiert. Es wurden insgesamt 54 Plasmid-Mini-Präparationen
gemacht und mit BsmI verdaut, um zu prüfen, ob sie gegen BsmI Verdau
resistent waren. Zwei Plasmide (Nr. 22 und Nr. 54) von 54 Klonen
waren gegen BsmI Verdau teilresistent, was ein Hinweis darauf war,
dass ein bsmIM Gen kloniert und in einem akzeptablen Maß in E.
coli exprimiert worden war. Zehn ml Zellen mit Nr. 54 Plasmid-DNA wurden über Nacht kultiviert
und Zellextrakt wurde präpariert
und zum Untersuchen der BsmI Aktivität auf Lambda-DNA verwendet.
Es wurde keine scheinbare BsmI Aktivität im Zellextrakt nachgewiesen.
Man folgerte, dass das bsmIR Gen wahrscheinlich im methylasepositiven
Klon (Nr. 54) abwesend war oder dass nur ein kleiner Teil des bsmIR Gens
anwesend war, oder dass das bsmIR Gen in E. coli nicht gut exprimiert
war. (Später
wurde demonstriert, dass kein bsmIR Gen in diesem M+ Klon
vorlag, siehe unten im Abschnitt zu Klonierung und Expression des bsmIR
Gens).
-
Das
DNA-Insert im M+ Klon Nr. 54 wurde mit ApoI,
NdeI und PvuII verdaut und die DNA-Fragmente wurden in pUCl9 subkloniert.
Die inserierten Fragmente wurden dann unter Verwendung von pUCl9
Universalprimer und Rückwärtsprimer
sequenziert. Der Rest des Inserts wurde durch Primer-Walking sequenziert.
Der Klon endete in einem NdeI Ort und enthielt das gesamte bsmIM1
Gen und einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens. Auf der linken
Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befindet sich ein ORF, das 30 Aminosäuresequenzidentität zu einem
DNA Partitionsprotein (ParA-Familie) aufweist. Da sich das Restriktionsendonucleasegen
gewöhnlich
neben dem Methylasegen befindet, kommt man zu dem Schluss, dass
das BsmI Endonucleasegen (bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten
Seite des bsmIM1 und bsm1M2 Gens liegt (1). Man bemühte sich,
den Rest des M2 Gens und das gesamte bsmIR Gen durch inverse PCR
und PCR zu klonieren.
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2. Klonierung des bsmIM2
und bsmIR Gens durch inverse PCR und PCR
-
Es
wurden die folgenden inversen PCR Primer synthetisiert:
5' tatcgtaatattccttgttaattt
3' (230-119) (SEQ
ID Nr. 7)
5' cttaaacgtatagaatctactcag
3' (229-159) (SEQ
ID Nr. 8)
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BsmI
Genom-DNA wurde mit BsaWI, BspHI, EcoRI, HindIII, MfeI, NlaIII,
NspI, SspI und TaqI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen
Miniprep-Spin-Säulen
gereinigt und bei einer niedrigen Konzentration (2 μg/ml Endkonz.)
selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten
lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde
als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR
waren 95°C
1 min, 55°C
1 min und 72°C
1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1).
PCR-Produkte wurden in BsaWI, EcoRI, MfeI, NlaIII und TaqI Matrizen
gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt.
Die gereinigte DNA wurde mit den Primern 230-119 und 229-159 ohne
Klonierungsschritt direkt sequenziert.
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Dieser
inverse PCR-Schritt brachte etwa 540 bp einer neuen DNA-Sequenz
im BsmI M2 Gen hervor.
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Es
wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' ctagatcctccgtactttaatacg
3' (232-188) (SEQ
ID Nr. 9)
5' aattgtcccatagtatcttccacg
3' (232-189) (SEQ
ID Nr. 10)
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BsmI
Genom-DNA wurde mit BstUI, BstYI, ClaI, DraI, NdeI, RsaI und XbaI
verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt
und in niedriger Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert.
Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert
und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur
inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und
72°C 1 min,
35 Zyklen. PCR-Produkte wurden in DraI und RsaI Matrizen gefunden
und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte
DNA wurde unter Verwendung der Primer 232-188 und 232-189 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 120 bp
einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 Gen hervor.
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Es
wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' ctttcgatggtaaacgagaagatg
3' (233-125) (SEQ
ID Nr. 11)
5' attttattcctctggagtttagcg
3' (233-126) (SEQ
ID Nr. 12)
-
BsmI
Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII,
MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute
DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und in niedriger
Konzentration (2 μg/ml
Endkonz.) selbstligiert. Die T4 DNA- Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten
lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde
als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen
PCR waren 95°C
1 min, 55°C
1 min und 72°C
1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1).
PCR-Produkte wurden in ClaI, RsaI, SspI und XbaI Matrizen gefunden
und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte
DNA wurde unter Verwendung der Primer 233-125 und 233-126 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Interne Primer wurden ebenfalls zum Sequenzieren
des 1600 bp XbaI Fragments verwendet. Dieser inverse PCR-Schritt
brachte etwa 1440 bp einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 und bsmIR
Gen hervor.
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Es
wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' atgtgaagttattatcattttttg
3' (234-167) (SEQ
ID Nr. 13)
5' ttcagaatgggagagtatctacaa
3' (234-168) (SEQ
ID Nr. 14)
-
BsmI
Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII,
MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute
DNA wurde durch Qiagen-Miniprep-Spin-Säulen gereinigt
und in niedriger Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert.
Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert
und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur
inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min,
55°C 1 min
und 72°C
1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1).
PCR-Produkte wurden in HindIII, SspI und TaqI Matrizen gefunden
und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte
DNA wurde unter Verwendung der Primer 234-167 und 234-168 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 300
bp einer neuen DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor.
-
Es
wurden die folgenden PCR-Primer synthetisiert:
5' gaaactccagatgtaataattacc
3' (238-179) (SEQ
ID Nr. 15)
5' tacaaaaaacttcctttttgactt
3' (238-180) (SEQ
ID Nr. 16)
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BsmI
Genom-DNA wurde mit ApoI, BglII, DraI, EcoRI, HindIII, KpnI, RsaI
und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt
und in einer niedrigen Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert.
Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert
und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur
inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min,
55°C 1 min
und 72°C
1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1).
PCR-Produkte wurden in KpnI und RsaI Matrizen gefunden und von einem
leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA
wurde unter Verwendung der Primer 238-179 und 238-180 ohne Klonierungsschritt
direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 500 bp einer neuen
DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor. Ein ORF von 2031 bp wurde
stromabwärts
des BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde bsmIR Gen genannt
(1 und 4).
-
3. Expression von BsmI
M1 und M2 Genen in E. coli
-
Zwei
Primer wurden zur PCR-Amplifikation des BsmI M1 Gens synthetisiert.
5' cgcggatccggaggtaaataaatgctttcagaatggattaataccatc
3' (230-29) (SEQ
ID Nr. 17)
5' tatcaagcatgcttataaattcatacaaatttgctcaat
3' (230-32) (SEQ
ID Nr. 18)
-
Das
BsmI M1 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 230-29 und
230-32 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 30 sec,
55°C 30
sec und 72°C
1 min, 25 Zyklen, 2 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt
wurde durch eine Qiagen Spin-Säule
gereinigt und mit BamHI und SphI über Nacht bei 37°C verdaut.
Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit pBR322
mit kompatiblen Enden ligiert. Nach der Transformation in kompetente
ER2683 Zellen wurden 36 Plasmid-Mini-Präparationen
durchgeführt
und die Plasmid-DNA wurde mit BsmI in Kontakt gebracht. Zwölf Isolate
waren gegen BsmI Verdau teilresistent. Es gab ein paar mögliche Erklärungen.
Eine Erklärung
war, dass das BsmI M1 Gen vom TCR-Promotor
nicht effizient exprimiert wurde oder die Halbwertzeit des BsmI
M1 Proteins sehr kurz war. Die zweite Erklärung war, dass ein zweites
Peptid für
eine optimale M1 Methylaseaktivität erforderlich war. Es gibt
ein kleines ORF von 228 bp (75 Aminosäurereste) zwischen dem BsmI
M1 und M2 Gen. Dieses 75-Aminosäure-Peptid
kann zur optimalen M1 Aktivität
beitragen. Da BsmI M1 nur einen Strang der asymmetrischen BsmI Erkennungssequenz
(5' GAATGC 3' und 5' GCATTC 3') methylieren kann,
ist möglicherweise eine
zweite Methylase zum Methylieren des anderen Strangs erforderlich
(siehe M2 Expression unten).
-
Es
wurden zwei Primer zur PCR-Amplifikation des BsmI M2 Gens synthetisiert.
5' tgaagagcatgcggaggtaaataaatgaacaaaatctcttttcaacctgct
(247-322) (SEQ ID Nr. 19)
5' ccctctgtcgactcaccaattaagatataaggattcgaa
3' (247-323 (SEQ
ID Nr. 20)
-
Das
BsmI M2 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 247-322
und 247-323 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 30 sec,
55°C 1,5
min und 72°C
2,25 min, 20 Zyklen, 4 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt wurde durch
eine Qiagen Spin-Säule
gereinigt und mit SphI und SalI über
Nacht bei 37°C
verdaut. Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit pBR322 mit
kompatiblen Enden ligiert. Dreizehn Plasmide wurden präpariert
und mit BsmI verdaut. Es zeigte sich, dass ein Isolat, Nr. 9, gegen
BsmI Verdau resistent war. Das SphI – SalI Fragment mit dem BsmI
M2 Gen wurde von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt.
Das gereinigte M2 DNA-Fragment wurde mit pBR-BsmIM1 mit kompatiblen
Enden ligiert. Das resultierende Plasmid war pBR-BsmIM1&M2. Beide Gene BsmI
M1 und M2 waren unter der Kontrolle des TcR-Promotors und wurden
konstitutiv in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 war gegen BsmI
Verdau völlig
resistent, was auf eine ausreichende Expression vom TcR-Promotor hinwies.
-
4. Expression
des BsmI RestriktionsendonucleasebsmIR)-Gens in E. coli
-
Es
wurden zwei Primer zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens synthetisiert.
Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
5' agataaatgcatatgaatgtttttagaattcatggtgataat
3' (241-212) (SEQ
ID Nr. 21)
5' cgcggatccttatccctctatatgaaaaaatcctgt
(235-293) (SEQ ID Nr. 22)
-
Das
bsmIR Gen wurde durch PCR mit 241-212 und 235-293 unter den folgenden
Bedingungen amplifiziert: 95°C
1 min, 1 Zyklus; 95°C
45 sec, 55°C
45 sec und 72°C
2 min, 20 Zyklen, 2 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt
wurde durch eine Qiagen Spin-Säule
gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht bei 37°C verdaut.
Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit einem
T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen
Enden ligiert. Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammte von pACYCl84 und hatte
5-8 Kopien pro Zelle. Er enthielt 4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des
T7 Promotors. Man erwartete, dass die Transkriptionsterminatoren
die Run-off Transkription von/vom kryptischen E. coli Promotor(en)
auf dem Vektor reduzierten. Die ligierte DNA von bsmIR plus pACYC-T7ter
wurde in den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert.
Es wurden sechsunddreißig
Plasmid-Mini-Präparationen
gemacht und es zeigte sich, dass sechs Isolate das Endonucleasegeninsert
enthielten. Zehn-ml-Zellkulturen wurden für diese sechs Isolate hergestellt
und mit 0,5 mM IPTG 3 Stunden lang induziert. Nach der Zelllyse
durch Beschallung wurden Zelltrümmer
durch Zentrifugation entfernt und die Zellextrakte wurden im Hinblick
auf BsmI Endonucleaseaktivität
untersucht. Zwei Isolate (Nr. 11 und Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Drei
Isolate hatten teilweise BsmI Aktivität und ein Isolat hatte keine
Aktivität,
wahrscheinlich aufgrund von (einer) Mutation(en), die durch PCR
in das bsmIR Gen eingeführt
wurde(n). Der BsmI Expressionsklon Nr. 11 wurde für eine 500-ml-Kultur
verwendet, um die Anzahl von BsmI Einheiten je Gramm nasser Zellen
zu bestimmen.
-
Zwanzig
ml Zellen ER2566 [pBR-BsmIM1&M2,
pACYC-T7ter-BsmIR]
wurden über
Nacht bei 37°C
in LB plus Ap (100 μg/ml)
und Cm (33 μg/ml)
wachsen gelassen. Die 20 ml Übernachtzellen
wurden in 500 ml frische LB plus Ap (100 μg/ml) und Cm (33 μg/ml) inokuliert.
Die Zellen wurden bis zur späten
log-Phase etwa 3 Stunden lang wachsen gelassen und IPTG wurde auf
eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und 3 Stunden lang induziert.
Zellen wurden geerntet und durch Beschallung lysiert. Zelltrümmer wurden
durch Zentrifugation entfernt und Zellextrakt wurde verdünnt und
im Hinblick auf BsmI Aktivität
bei 65°C
auf Lambda DNA 1 Stunde lang geprüft. Die Ausbeute an rekombinantem
BsmI lag bei 2 × 106 Einheiten pro Gramm nasser Zellen (zum
Aktivitätsassay
siehe 5). Das gesamte bsmIR-Gen wurde sequenziert, um
zu bestätigen,
dass Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
-
Der
E. coli Stamm ER2566 [pBR-BsmIM1&M2,
pACYC-T7ter-BsmIR]
wurde am 20. Oktober 2000 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags
bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung
mit der ATCC Akzessionsnummer PTA-2619 hinterlegt.
-
5. Partielle
Reinigung der BsmI
-
Restriktionsendonuclease
-
Da
die BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym ist, wurde E. coli
Zellextrakt mit BsmI 30 Minuten lang bei 65°C erhitzt und denaturierte Proteine
wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden auf
eine Heparin-Sepharose-Säule
geladen. Die Säule
wurde gründlich
mit salzarmem Puffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 mM β-Mercaptoethanol,
1 mM EDTA) gewaschen. Das Protein wurde mit einem Salzgradient von
50 mM bis 1 M NaCl eluiert. Die Proteinmenge wurde in jeder Fraktion
gemessen und die BsmI Aktivität
wurde auf Lambda DNA geprüft.
Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf einem SDS-PAGE analysiert
(6). Die beobachtete Molekülmasse der BsmI Endonuclease
auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was nahezu der vorhergesagten
Molekülmasse
von 78,1 kDa entsprach.
-
6. Expression
der langen Form der BsmI Endonuclease
-
Es
gibt zwei „in
frame"-Codone (ATG
und CAG) stromaufwärts
des Startcodons des bsmIR Gens. Diese beiden Codone kodieren die
Aminosäurereste
M (Met) und Q (Gln). Die reguläre
BsmI Endonuclease hat eine Länge
von 676-aa. Die lange Form der BsmI Endonuclease hat eine Länge von
678-aa. Zum Exprimieren der langen Form der BsmI Endonuclease wurden
zwei Primer zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens (lange Form) synthetisiert.
-
Die
Primer hatten die folgenden Sequenzen:
5' agggagagacatatgcagatgaatgtttttagaattcatggt 3' (244-186). (atg
und cag sind die zusätzlichen
Codone) (SEQ ID Nr. 23)
5' cgcggatccttatccctctatatgaaaaaatcctgt
3' (235-293) (SEQ
ID Nr. 24).
-