DE60126217T2

DE60126217T2 - Verfahren zur Klonierung und Expression des BsmI Restriktions-Modifikationssystem in E.coli

Info

Publication number: DE60126217T2
Application number: DE60126217T
Authority: DE
Inventors: Jing Beverly Zhou; Zhenyu Berverly Zhu; Shuang-yong Lexington Xy
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: US6335190B1; JP2002262889A; DE60126217D1; EP1199366B1; EP1199366A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BsmI Restriktionsendonuclease (Endonuclease) sowie zwei BsmI Methyltransferasen (Methylasen, M1 und M2) kodiert, sowie die Expression von BsmI Restriktionsendonuclease von E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten.
BsmI Restriktionsendonuclease ist im Stamm von Bacillus stearothermophilus NUB36 (New England Biolabs Stammsammlung Nr. 328) zu finden. Sie erkennt doppelsträngige DNA-Sequenz
5' GARTGCN↓ 3'
3' CTTAC↑GN 5' (↓/↑ Spaltstelle) und spaltet stromabwärts ihrer Erkennungssequenz (N1) auf dem oberen Strang und spaltet außerdem innerhalb der Erkennungssequenz auf dem unteren Strang (zwischen G und C der Sequenz 5' GCATTC 3'), um einen 2-Basen-Überhang am 3' Ende zu erzeugen.
Restriktionsendonucleasen des Typs II und IIs sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien und in einigen Viren vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienproteinen weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen erkennen und binden sich an spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb, an einer Seite oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertundelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen hundert bisher untersuchten Bakterienspezies identifiziert (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27:312-313 (1999)).
Restriktionsendonucleasen werden typischerweise nach den Bakterien benannt, von denen sie abstammen. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen namens DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5'TTT↓AAA3', 5'PuG↓GNCCPy3' und 5'CACNNN↓GTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G↓AATTC3' erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methyltransferasen (Methylasen). Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Mittels DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–9 auftreten. Das Verfahren sollte vorzugsweise selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit der Klone zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Es wurde eine große Zahl von Restriktions-Modifikationssystemen des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178:717-719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3:97-112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktions-Modifikationssystemen in Bakterien diese befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen zu widerstehen, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktions-Modifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsvektoren ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659-3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402-406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19:355-359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501-509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202:83-88 (1997)).
Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403-6421 (1985)). Da R-M-Gene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10:219-225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20:197-204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf, Gene 21:111-119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258:1235-1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22:2399-2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an einen DNA-Schaden genutzt, der durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht wird. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI, Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5, 498, 535).
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und in geringerem Maße Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, besteht ein kommerzieller Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren des BsmI Restriktionsendonucleasegens von Bacillus stearothermophilus NUB36. Zunächst wurde das Methylaseselektionsverfahren angewendet, um das BsmI Methylasegen zu klonieren. Ein methylasepositiver Klon wurde von einer Plasmidbibliothek abgeleitet, die BsmI Genom-DNA enthielt. Es wurde jedoch keine scheinbare BsmI Aktivität im Zellextrakt vom M⁺ Klon nachgewiesen.
Das DNA-Insert im M⁺ Klon wurde durch Primer-Walking sequenziert. Man fand, dass der Klon das gesamte bsmIM1 Gen und einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens enthielt. Auf der linken Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befand sich ein ORF, das etwa 30% Aminosäuresequenzidentität zu einem DNA-Partitionsprotein aufwies (ParA-Familie). Da sich Restriktionsendonucleasegene oft neben dem Methylasegen befinden, wurde angenommen, dass sich das BsmI Endonucleasegen (bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten Seite des BsmIM1 und BsmIM2 Gens befindet (1). Es wurden Anstrengungen unternommen, den Rest des BsmI M2 Gens und das gesamte bsmIR Gen durch inverse PCR und PCR zu klonieren. Nach fünf Runden der inversen PCR und Sequenzierung der inversen PCR-Produkte wurde die gesamte Sequenz des bsmIM2 Gens erhalten. Ein offenes Leseraster (ORF) von 2031 bp wurde stromabwärts des BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde BsmIR Gen genannt (1 und 4). Das Plasmid pBR-BsmIM1 war nur teilweise gegen BsmI Verdau resistent, wohingegen pBR-BsmIM2 völlig resistent gegen BsmI Verdau war. Beide BsmI M1 und M2 Gene wurden durch PCR amplifiziert und in den Vektor pBR322 kloniert, um das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 zu erzeugen. Beide BsmI M1 und M2 Gene befanden sich unter der Kontrolle des Tc^R-Promotors und wurden konstitutiv in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 war völlig resistent gegen BsmI Verdau, was auf eine ausreichende Expression vom Tc^R-Promotor hinwies.
Das bsmIR Gen wurde durch PCR amplifiziert und in einen T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden kloniert. Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammt von pACYC184 und hat 5-8 Kopien pro Zelle. Er enthält 4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des T7 Promotors. Von den Transkriptionsterminatoren wird erwartet, dass sie die Run-off Transkription von/vom kryptischen E. coli Promotor(en) auf dem Vektor reduzieren. Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität geprüft. Zwei Isolate (Nr. 11 und Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Die Ausbeute von rekombinantem BsmI wurde mit 2 × 10⁶ Einheiten pro Gramm nasser Zellen bestimmt (siehe 5 für den Aktivitätsassay). Das gesamte bsmIR Gen wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
Da die BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym ist, wurde der E. coli Zellextrakt, der BsmI enthielt, auf 65°C erhitzt und denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen. Die Proteine wurden mit einem Salzgradient von 50 mM bis 1 M NaCl eluiert. BsmI Aktivität wurde für jede Fraktion geprüft. Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf SDS-PAGE analysiert (6).
Die beobachtete Molekülmasse von BsmI Endonuclease auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was in enger Übereinstimmung zur vorhergesagten Molekülmasse von 78,1 kDa ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Genorganisation des BsmI Restriktionsmodifikationssystems. Die Gene bsmIM1 und bsmIM2 kodieren jeweils die BsmI Methylasen M1 und M2. Das Gen bsmIR kodiert die BsmI Restriktionsendonuclease. ORF ist ein kleines offenes Leseraster zwischen M1 und M2.
2: DNA-Sequenz des BsmI M1 Methylasegens (SEQ ID Nr. 1) (bsmIM1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3: DNA-Sequenz des BsmI M2 Methylasegens (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4: DNA-Sequenz des BsmI Endonucleasegens (SEQ ID Nr. 5) (bsmIR) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6).
5: Rekombinante BsmI Endonucleaseaktivität in Zellextrakt. Bahn 1, 1 kb DNA Größenmarker; Bahn 2, Lambda-DNA gespalten durch gereinigtes natives BsmI; Bahnen 3 bis 12, Lambda DNA gespalten durch Zellextrakt, der rekombinantes BsmI enthält. Verdünnungsfaktoren in Bahn 3 bis 12 waren: 1/100, 1/200, 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, 1/6400, 1/12800, 1/25600 und 1/51200.
6: SDS-PAGE von teilweise gereinigter BsmI Restriktionsendonuclease. Die vorhergesagte Molekülmasse von BsmI Endonuclease ist 78,1 kDa. Die beobachtete Molekülmasse auf SDS-PAGE ist 77,9 kDa. Bahn 1, Proteingrößenmarker; Bahnen 2-12, eluierte Fraktionen (19-29) von einer Heparin-Sepharose-Säule.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem die beiden BsmI Methylasegene und das BsmI Restriktionsendonucleasegen bevorzugt kloniert und in E. coli exprimiert werden, beinhaltet die folgenden Schritte:
1. Konstruktion von BsmI Genom-DNA-Bibliotheken und Klonierung des bsmIM1 Gens
Genomische DNA wurde von Bacillus stearothermophilus NUB36 (New England Biolabs Sammlung Nr. 328) mit dem Standardverfahren präpariert. Zehn μg genomische DNA wurden jeweils mit AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI verdaut und mit einem modifizierten pBR322 (2 BsmI Orte) mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Elektroporation in kompetente RR1 Zellen transferiert. Mehr als 10⁴ Ap^R-Kolonien wurden von den AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI Bibliotheken gepoolt und Zellen wurden über Nacht in 2 Liter LB plus Ap amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen präpariert. Die Plasmidbibliothek-DNA wurde mit BsmI über Nacht verdaut und die kontaktierte DNA wurde zum Transformieren von kompetenten ER2683 Zellen (McrBC^–, Mrr^–, McrA^–) verwendet. Überlebende Transformanten wurden über Nacht bei 37°C auf Ap-Platten plattiert. Es wurden Plasmid-Mini-Präparationen gemacht und mit BsmI verdaut, um zu prüfen, ob sie gegen BsmI-Verdau resistent waren. Man fand, dass zwei Plasmide (Nr. 22 und Nr. 54) von 54 Klonen gegen BsmI-Verdau teilresistent waren, was ein Hinweis darauf war, dass ein bsmIM Gen kloniert und in einem akzeptablen Maß in E. coli exprimiert worden war. Es wurde jedoch keine scheinbare BsmI Aktivität im Zellextrakt des M⁺ Klons nachgewiesen.
Das DNA-Insert im M⁺ Klon Nr. 54 wurde mit ApoI, NdeI und PvuII verdaut und die DNA-Fragmente wurden in pUC19 subkloniert. Die inserierten Fragmente wurden dann unter Verwendung von pUC19 Universalprimer und Rückwärtsprimer sequenziert. Der Rest des Inserts wurde durch Primer-Walking sequenziert. Man fand, dass der Klon in einem NdeI Ort endete und das gesamte bsmIM1 Gen und einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens enthielt. Auf der linken Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befand sich ein ORF, das 30% Aminosäuresequenzidentität zu einem DNA-Partitionsprotein (ParA-Familie) aufwies. Da sich Restriktionsendonucleasegene gewöhnlich neben dem Methylasegen befanden, ging man davon aus, dass das BsmI Endonucleasegen (bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens lag (1). Es wurden Anstrengungen unternommen, den Rest des M2 Gens und das gesamte BsmIR Gen durch inverse PCR und PCR zu klonieren.
2. Klonierung des BsmIM2 und BsmIR Gens durch inverse PCR und PCR
Zwei inverse PCR-Primer (230-119 und 229-159) wurden synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde jeweils mit BsaWI, BspHI, EcoRI, HindIII, MfeI, NlaIII, NspI und TaqI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und bei geringer Konzentration selbstligiert. Die T4 DNA-Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in BsaWI, EcoRI, MfeI, NlaIII und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 230-119 und 229-159 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 540 bp einer neuen DNA-Sequenz in dem BsmI M2 Gen hervor.
Zwei inverse PCR-Primer (232-188 und 232-189) wurden synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit BstUI, BstYI, ClaI DraI, NdeI, RsaI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringen Konzentration selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in DraI und RsaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 232-188 und 232-189 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 120 bp einer neuen DNA-Sequenz in dem BsmI M2 Gen hervor.
Zwei inverse PCR-Primer (233-125 und 233-126) wurden dann synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII, MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringer Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die T4 DNA-Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in ClaI, RsaI, SspI und XbaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 233-125 und 233-126 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Interne Primer wurden ebenfalls zum Sequenzieren des 1600 bp XbaI Fragments verwendet. Dieser inverse PCR Schritt brachte etwa 1440 bp einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 und bsmIR Gen hervor.
Es wurden zwei inverse PCR-Primer (234-167 und 234-168) synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII, MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringen Konzentration selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in HindIII, SspI und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 234-167 und 234-168 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 300 bp einer neuen DNA-Sequenz in den BsmIR Genen hervor.
Es wurden zwei inverse PCR-Primer (238-179 und 238-180) synthetisiert. BsmI Genom-DNA wurde mit ApoI, BglII, DraI, EcoRI, HindIII, KpnI, RsaI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde gereinigt und in einer geringen Konzentration selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in KpnI und RsaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 238-179 und 238-180 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 500 bp einer neuen DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor. Ein ORF von 2031 bp wurde stromabwärts des BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde bsmIR Gen genannt (1 und 4).
3. Expression des BsmI M1 und M2 Gens in E. coli
Es wurden zwei Primer (230-29 und 230-32) zur PCR-Amplifikation des BsmI M1 Gens synthetisiert. Das BsmI M1 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 230-29 und 230-32 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit BamHI und SphI verdaut. Die PCR DNA wurde durch Spin-Säulen wieder gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Nach der Transformation in kompetente ER2683 Zellen wurden Mini-Präparationen durchgeführt und die Plasmid-DNA wurde mit BsmI in Kontakt gebracht. Zwölf Isolate waren gegen BsmI Verdau teilresistent. Es war möglich, dass ein zweites Peptid für die optimale M1 Methylaseaktivität erforderlich war. Ein kleines ORF von 228 bp (75 Aminosäurereste) befand sich zwischen dem BsmI M1 und M2 Gen. Dieses 75-Aminosäurepeptid kann zur optimalen M1 Aktivität beitragen. Da BsmI M1 nur einen Strang der asymmetrischen BsmI Erkennungssequenz (5' GAATGC 3' oder Komplementärstrang 5'GCATTC 3') methylieren kann, ist evtl. eine zweite Methylase zum Methylieren des anderen Strangs erforderlich (siehe M2 Expression unten).
Zwei Primer (247-322 und 247-323) wurden zur PCR-Amplifikation des BsmI M2 Gens synthetisiert. Das BsmI M2 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 247-322 und 247-323 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit SphI und SalI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Dreizehn Plasmide wurden präpariert und mit BsmI verdaut. Es zeigte sich, dass ein Isolat, Nr. 9, gegen BsmI Verdau resistent war. Das SphI-SalI Fragment mit dem BsmI M2 Gen wurde von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Das gereinigte M2 DNA-Fragment wurde mit pBR-BsmIM1 mit kompatiblen Enden ligiert. Das resultierende Plasmid war pBR-BsmIM1&M2. Die BsmI M1 und M2 Gene sind unter der Kontrolle des Tc^R-Promotors und wurden konstitutity in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 ist gegen BsmI Verdau völlig resistent, was ein Hinweis auf eine ausreichende Expression vom Tc^R-Promotor ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde bestimmt, dass zwei Methylasen für den vollen Schutz von BsmI Orten erforderlich waren.
4. Expression des BsmI Restriktionsendonuclease(bsmIR)-Gens in E. coli
Es wurden zwei Primer (214-212 und 235-293) zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens synthetisiert. Das bsmIR Gen wurde durch PCR mit 214-212 und 235-293 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert. Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammte von pACYC184 und hatte 5-8 Kopien pro Zelle. Er enthielt 4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des T7-Promotors. Man erwartete, dass die Transkriptionsterminatoren die Run-off Transkription von/vom kryptischen E. coli Promotor(en) auf dem Vektor reduzierten. Die ligierte DNA von bsmIR plus pACYC-T7ter wurde in den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert. Es wurden sechsunddreißig Plasmid-Mini-Präparationen gemacht und es zeigte sich, dass sechs Isolate das Endonucleasegeninsert enthielten. Zehn-ml-Zellkulturen wurden für diese sechs Isolate nach einer IPTG-Induktion hergestellt. Nach einer Zelllyse durch Beschallung wurden die Zellextrakte im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität untersucht. Zwei Isolate (Nr. 11 und Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Drei Isolate hatten teilweise BsmI Aktivität und ein Isolat hatte keine Aktivität, wahrscheinlich aufgrund von (einer) Mutation(en), die durch PCR in das bsmIR Gen eingeführt wurde(n). Der BsmI Expressionsklon Nr. 11 wurde für eine 500-ml-Kultur verwendet, um die Anzahl von BsmI Einheiten pro Gramm nasser Zellen zu bestimmen. Die Ausbeute an rekombinanter BsmI wurde mit 2 × 10⁶ Einheiten pro Gramm nasser Zellen bestimmt (zum Aktivitätsassay siehe 5). Das gesamte bsmIR Gen wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
5. Teilweise Reinigung der BsmI
Restriktionsendonuclease
Da BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym war, wurde E. coli Zellextrakt mit BsmI 30 Minuten lang auf 65°C erhitzt und denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde gründlich mit einem salzarmen Puffer gewaschen. Das Protein wurde mit einem Salzgradient von 50 mM bis 1 M NaCl eluiert. BsmI Aktivität wurde für jede Fraktion geprüft. Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf einem SDS-PAGE analysiert (6). Die beobachtete Molekülmasse der BsmI Endonuclease auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was nahezu der vorhergesagten Molekülmasse von 78,1 kDa entsprach.
6. Expression der langen Form der BsmI Endonuclease
Es gibt zwei „in frame"-Codone (ATG und CAG) stromaufwärts des Startcodons des bsmIR Gens. Diese beiden Codone kodieren die Aminosäurereste M (Met) und Q (Gln). Die reguläre BsmI Endonuclease hat eine Länge von 676 Aminosäuren. Die lange Form der BsmI Endonuclease hat eine Länge von 678 Aminosäuren. Zum Exprimieren der langen Form der BsmI Endonuclease wurden zwei Primer (244-186 und 235-293) zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens (lange Form) synthetisiert. Das bsmIR Gen (lange Form) wurde durch PCR mit 244-186 und 235-293 amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA von bsmIR (lange Form) plus pACYC-T7ter wurde in den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert. Es zeigte sich, dass ein Isolat (Nr. 4) das Endonucleasegen-(lange Form)-Insert enthielt. Eine Zehn-ml-Zellkultur wurde für das Isolat hergestellt und mit IPTG induziert und der Zellextrakt wurde im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität untersucht. Nr. 4 Zellextrakt wies volle BsmI Aktivität auf. Es wurde bestimmt, dass die lange Form der BsmI Endonuclease mit zwei zusätzlichen Rminosäureresten bei der DNA-Spaltung auch aktiv war.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele illustriert. Diese Beispiele sollen dem Verständnis der Erfindung dienen und sind nicht als Begrenzung davon anzusehen.
BEISPIEL 1
Klonierung des BsmI Restriktionsmodifikationssystems in E. coli
1. Konstruktion von BsmI Genom-DNA-Bibliotheken und
Klonierung des bsmIM1 Gens
Genomische DNA wird von Bacillus stearothermophilus NUB36 (New England Biolabs Sammlung Nr. 328) mit dem Standardverfahren präpariert, das die folgenden Schritte beinhaltet:

(a) Zelllyse durch Zugabe von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1% Endkonz.) und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(b) Zelllyse durch Zugabe von 10% SDS (Endkonzentration 0,1%);
(c) Zelllyse durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 62 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(d) Phenol-CHCl₃-Extraktion von DNA, dreimal (gleiches Volumen), und CHCl₃-Extraktion, einmal;
(e) DNA-Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, dreimal Wechsel; und
(f) RNA wurde durch RNase-A-Behandlung entfernt und die genomische DNA wurde in Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert.

Zehn μg genomische DNA wurden jeweils mit AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI 2 Stunden lang bei 37°C verdaut. Das Vektorplasmid pBR322 wurde auch jeweils mit AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI verdaut und weiter mit CIP 1 Stunde lang bei 37°C behandelt. Vektor und genomische DNA Proben wurden durch Qiagen Spin-Säulen gereinigt. Die verdaute genomische DNA wurde mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert und über Nacht bei 16°C inkubiert. Nach einer Übernachtligation wurde die DNA in 4 1 destilliertem Wasser auf einer Nitrocellulosemembran durch Tropfdialyse dialysiert. Anschließend wurde sie in kompetente RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Mehr als 10⁴ Ap^R-Kolonien wurden von den AatII, BspEI, ClaI, HindIII, NdeI und EcoRI Bibliotheken gepoolt und Zellen wurden über Nacht in 2 Liter LB plus Ap amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen durch Qiagen Maxi-Prep-Säulen präpariert. 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2 μg Bibliotheken-DNR wurden mit BsmI (25 Einheiten) über Nacht verdaut und die in Kontakt gebrachte DNA wurde zum Transformieren kompetenter ER2683 Zellen verwendet (methylierungsabhängiger Restriktions-Minus-Stamm, McrBC^–, Mrr^–, McrA^–). Überlebende Transformanten wurden über Nacht bei 37°C auf Ap-Platten plattiert. Es wurden insgesamt 54 Plasmid-Mini-Präparationen gemacht und mit BsmI verdaut, um zu prüfen, ob sie gegen BsmI Verdau resistent waren. Zwei Plasmide (Nr. 22 und Nr. 54) von 54 Klonen waren gegen BsmI Verdau teilresistent, was ein Hinweis darauf war, dass ein bsmIM Gen kloniert und in einem akzeptablen Maß in E. coli exprimiert worden war. Zehn ml Zellen mit Nr. 54 Plasmid-DNA wurden über Nacht kultiviert und Zellextrakt wurde präpariert und zum Untersuchen der BsmI Aktivität auf Lambda-DNA verwendet. Es wurde keine scheinbare BsmI Aktivität im Zellextrakt nachgewiesen. Man folgerte, dass das bsmIR Gen wahrscheinlich im methylasepositiven Klon (Nr. 54) abwesend war oder dass nur ein kleiner Teil des bsmIR Gens anwesend war, oder dass das bsmIR Gen in E. coli nicht gut exprimiert war. (Später wurde demonstriert, dass kein bsmIR Gen in diesem M⁺ Klon vorlag, siehe unten im Abschnitt zu Klonierung und Expression des bsmIR Gens).
Das DNA-Insert im M⁺ Klon Nr. 54 wurde mit ApoI, NdeI und PvuII verdaut und die DNA-Fragmente wurden in pUCl9 subkloniert. Die inserierten Fragmente wurden dann unter Verwendung von pUCl9 Universalprimer und Rückwärtsprimer sequenziert. Der Rest des Inserts wurde durch Primer-Walking sequenziert. Der Klon endete in einem NdeI Ort und enthielt das gesamte bsmIM1 Gen und einen kleinen Teil (131 bp) des bsmIM2 Gens. Auf der linken Seite des bsmIM1 und bsmIM2 Gens befindet sich ein ORF, das 30 Aminosäuresequenzidentität zu einem DNA Partitionsprotein (ParA-Familie) aufweist. Da sich das Restriktionsendonucleasegen gewöhnlich neben dem Methylasegen befindet, kommt man zu dem Schluss, dass das BsmI Endonucleasegen (bsmIR) wahrscheinlich auf der rechten Seite des bsmIM1 und bsm1M2 Gens liegt (1). Man bemühte sich, den Rest des M2 Gens und das gesamte bsmIR Gen durch inverse PCR und PCR zu klonieren.
2. Klonierung des bsmIM2 und bsmIR Gens durch inverse PCR und PCR
Es wurden die folgenden inversen PCR Primer synthetisiert:
5' tatcgtaatattccttgttaattt 3' (230-119) (SEQ ID Nr. 7)
5' cttaaacgtatagaatctactcag 3' (229-159) (SEQ ID Nr. 8)
BsmI Genom-DNA wurde mit BsaWI, BspHI, EcoRI, HindIII, MfeI, NlaIII, NspI, SspI und TaqI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und bei einer niedrigen Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und 72°C 1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1). PCR-Produkte wurden in BsaWI, EcoRI, MfeI, NlaIII und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde mit den Primern 230-119 und 229-159 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert.
Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 540 bp einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 Gen hervor.
Es wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' ctagatcctccgtactttaatacg 3' (232-188) (SEQ ID Nr. 9)
5' aattgtcccatagtatcttccacg 3' (232-189) (SEQ ID Nr. 10)
BsmI Genom-DNA wurde mit BstUI, BstYI, ClaI, DraI, NdeI, RsaI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und in niedriger Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und 72°C 1 min, 35 Zyklen. PCR-Produkte wurden in DraI und RsaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 232-188 und 232-189 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 120 bp einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 Gen hervor.
Es wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' ctttcgatggtaaacgagaagatg 3' (233-125) (SEQ ID Nr. 11)
5' attttattcctctggagtttagcg 3' (233-126) (SEQ ID Nr. 12)
BsmI Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII, MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und in niedriger Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die T4 DNA- Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und 72°C 1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1). PCR-Produkte wurden in ClaI, RsaI, SspI und XbaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 233-125 und 233-126 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Interne Primer wurden ebenfalls zum Sequenzieren des 1600 bp XbaI Fragments verwendet. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 1440 bp einer neuen DNA-Sequenz im BsmI M2 und bsmIR Gen hervor.
Es wurden die folgenden inversen PCR-Primer synthetisiert:
5' atgtgaagttattatcattttttg 3' (234-167) (SEQ ID Nr. 13)
5' ttcagaatgggagagtatctacaa 3' (234-168) (SEQ ID Nr. 14)
BsmI Genom-DNA wurde mit BspHI, BstUI, BstYI, ClaI, DraI, EcoRI, HindIII, MfeI, MluI, NdeI, NspI, RsaI, SspI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen-Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und in niedriger Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und 72°C 1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1). PCR-Produkte wurden in HindIII, SspI und TaqI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 234-167 und 234-168 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 300 bp einer neuen DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor.
Es wurden die folgenden PCR-Primer synthetisiert:
5' gaaactccagatgtaataattacc 3' (238-179) (SEQ ID Nr. 15)
5' tacaaaaaacttcctttttgactt 3' (238-180) (SEQ ID Nr. 16)
BsmI Genom-DNA wurde mit ApoI, BglII, DraI, EcoRI, HindIII, KpnI, RsaI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde durch Qiagen Miniprep-Spin-Säulen gereinigt und in einer niedrigen Konzentration (2 μg/ml Endkonz.) selbstligiert. Die Ligase wurde durch Hitze bei 65°C 30 Minuten lang inaktiviert und ein Teil der ligierten DNA (20-40 ng) wurde als Matrize zur inversen PCR verwendet. Die Bedingungen der inversen PCR waren 95°C 1 min, 55°C 1 min und 72°C 1 min, 35 Zyklen, 5 Einheiten Taq plus Vent@ DNA-Polymerase (Verhältnis 50:1). PCR-Produkte wurden in KpnI und RsaI Matrizen gefunden und von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Die gereinigte DNA wurde unter Verwendung der Primer 238-179 und 238-180 ohne Klonierungsschritt direkt sequenziert. Dieser inverse PCR-Schritt brachte etwa 500 bp einer neuen DNA-Sequenz in den bsmIR Genen hervor. Ein ORF von 2031 bp wurde stromabwärts des BsmI M2 Gens gefunden und dieses ORF wurde bsmIR Gen genannt (1 und 4).
3. Expression von BsmI M1 und M2 Genen in E. coli
Zwei Primer wurden zur PCR-Amplifikation des BsmI M1 Gens synthetisiert.
5' cgcggatccggaggtaaataaatgctttcagaatggattaataccatc 3' (230-29) (SEQ ID Nr. 17)
5' tatcaagcatgcttataaattcatacaaatttgctcaat 3' (230-32) (SEQ ID Nr. 18)
Das BsmI M1 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 230-29 und 230-32 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 30 sec, 55°C 30 sec und 72°C 1 min, 25 Zyklen, 2 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit BamHI und SphI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Nach der Transformation in kompetente ER2683 Zellen wurden 36 Plasmid-Mini-Präparationen durchgeführt und die Plasmid-DNA wurde mit BsmI in Kontakt gebracht. Zwölf Isolate waren gegen BsmI Verdau teilresistent. Es gab ein paar mögliche Erklärungen. Eine Erklärung war, dass das BsmI M1 Gen vom TC^R-Promotor nicht effizient exprimiert wurde oder die Halbwertzeit des BsmI M1 Proteins sehr kurz war. Die zweite Erklärung war, dass ein zweites Peptid für eine optimale M1 Methylaseaktivität erforderlich war. Es gibt ein kleines ORF von 228 bp (75 Aminosäurereste) zwischen dem BsmI M1 und M2 Gen. Dieses 75-Aminosäure-Peptid kann zur optimalen M1 Aktivität beitragen. Da BsmI M1 nur einen Strang der asymmetrischen BsmI Erkennungssequenz (5' GAATGC 3' und 5' GCATTC 3') methylieren kann, ist möglicherweise eine zweite Methylase zum Methylieren des anderen Strangs erforderlich (siehe M2 Expression unten).
Es wurden zwei Primer zur PCR-Amplifikation des BsmI M2 Gens synthetisiert.
5' tgaagagcatgcggaggtaaataaatgaacaaaatctcttttcaacctgct (247-322) (SEQ ID Nr. 19)
5' ccctctgtcgactcaccaattaagatataaggattcgaa 3' (247-323 (SEQ ID Nr. 20)
Das BsmI M2 Gen wurde durch PCR unter Verwendung der Primer 247-322 und 247-323 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 30 sec, 55°C 1,5 min und 72°C 2,25 min, 20 Zyklen, 4 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit SphI und SalI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert. Dreizehn Plasmide wurden präpariert und mit BsmI verdaut. Es zeigte sich, dass ein Isolat, Nr. 9, gegen BsmI Verdau resistent war. Das SphI – SalI Fragment mit dem BsmI M2 Gen wurde von einem leicht schmelzenden Agarosegel gelgereinigt. Das gereinigte M2 DNA-Fragment wurde mit pBR-BsmIM1 mit kompatiblen Enden ligiert. Das resultierende Plasmid war pBR-BsmIM1&M2. Beide Gene BsmI M1 und M2 waren unter der Kontrolle des Tc^R-Promotors und wurden konstitutiv in E. coli exprimiert. Das Plasmid pBR-BsmIM1&M2 war gegen BsmI Verdau völlig resistent, was auf eine ausreichende Expression vom Tc^R-Promotor hinwies.
4. Expression des BsmI RestriktionsendonucleasebsmIR)-Gens in E. coli
Es wurden zwei Primer zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens synthetisiert. Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
5' agataaatgcatatgaatgtttttagaattcatggtgataat 3' (241-212) (SEQ ID Nr. 21)
5' cgcggatccttatccctctatatgaaaaaatcctgt (235-293) (SEQ ID Nr. 22)
Das bsmIR Gen wurde durch PCR mit 241-212 und 235-293 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 1 min, 1 Zyklus; 95°C 45 sec, 55°C 45 sec und 72°C 2 min, 20 Zyklen, 2 Einheiten Vent@ DNA-Polymerase. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert. Der Expressionsvektor pACYC-T7ter stammte von pACYCl84 und hatte 5-8 Kopien pro Zelle. Er enthielt 4 Kopien von E. coli Transkriptionsterminatoren stromaufwärts des T7 Promotors. Man erwartete, dass die Transkriptionsterminatoren die Run-off Transkription von/vom kryptischen E. coli Promotor(en) auf dem Vektor reduzierten. Die ligierte DNA von bsmIR plus pACYC-T7ter wurde in den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert. Es wurden sechsunddreißig Plasmid-Mini-Präparationen gemacht und es zeigte sich, dass sechs Isolate das Endonucleasegeninsert enthielten. Zehn-ml-Zellkulturen wurden für diese sechs Isolate hergestellt und mit 0,5 mM IPTG 3 Stunden lang induziert. Nach der Zelllyse durch Beschallung wurden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und die Zellextrakte wurden im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität untersucht. Zwei Isolate (Nr. 11 und Nr. 33) wiesen volle BsmI Aktivität auf. Drei Isolate hatten teilweise BsmI Aktivität und ein Isolat hatte keine Aktivität, wahrscheinlich aufgrund von (einer) Mutation(en), die durch PCR in das bsmIR Gen eingeführt wurde(n). Der BsmI Expressionsklon Nr. 11 wurde für eine 500-ml-Kultur verwendet, um die Anzahl von BsmI Einheiten je Gramm nasser Zellen zu bestimmen.
Zwanzig ml Zellen ER2566 [pBR-BsmIM1&M2, pACYC-T7ter-BsmIR] wurden über Nacht bei 37°C in LB plus Ap (100 μg/ml) und Cm (33 μg/ml) wachsen gelassen. Die 20 ml Übernachtzellen wurden in 500 ml frische LB plus Ap (100 μg/ml) und Cm (33 μg/ml) inokuliert. Die Zellen wurden bis zur späten log-Phase etwa 3 Stunden lang wachsen gelassen und IPTG wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und 3 Stunden lang induziert. Zellen wurden geerntet und durch Beschallung lysiert. Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt und Zellextrakt wurde verdünnt und im Hinblick auf BsmI Aktivität bei 65°C auf Lambda DNA 1 Stunde lang geprüft. Die Ausbeute an rekombinantem BsmI lag bei 2 × 10⁶ Einheiten pro Gramm nasser Zellen (zum Aktivitätsassay siehe 5). Das gesamte bsmIR-Gen wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass Nr. 11 die Wildtyp-bsmIR-Gensequenz trug.
Der E. coli Stamm ER2566 [pBR-BsmIM1&M2, pACYC-T7ter-BsmIR] wurde am 20. Oktober 2000 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der ATCC Akzessionsnummer PTA-2619 hinterlegt.
5. Partielle Reinigung der BsmI
Restriktionsendonuclease
Da die BsmI Endonuclease ein thermostabiles Enzym ist, wurde E. coli Zellextrakt mit BsmI 30 Minuten lang bei 65°C erhitzt und denaturierte Proteine wurden durch Zentrifugation entfernt. Die löslichen Proteine wurden auf eine Heparin-Sepharose-Säule geladen. Die Säule wurde gründlich mit salzarmem Puffer (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 5 mM β-Mercaptoethanol, 1 mM EDTA) gewaschen. Das Protein wurde mit einem Salzgradient von 50 mM bis 1 M NaCl eluiert. Die Proteinmenge wurde in jeder Fraktion gemessen und die BsmI Aktivität wurde auf Lambda DNA geprüft. Die aktivsten Fraktionen wurden auch auf einem SDS-PAGE analysiert (6). Die beobachtete Molekülmasse der BsmI Endonuclease auf dem SDS-PAGE betrug 77,9 kDa, was nahezu der vorhergesagten Molekülmasse von 78,1 kDa entsprach.
6. Expression der langen Form der BsmI Endonuclease
Es gibt zwei „in frame"-Codone (ATG und CAG) stromaufwärts des Startcodons des bsmIR Gens. Diese beiden Codone kodieren die Aminosäurereste M (Met) und Q (Gln). Die reguläre BsmI Endonuclease hat eine Länge von 676-aa. Die lange Form der BsmI Endonuclease hat eine Länge von 678-aa. Zum Exprimieren der langen Form der BsmI Endonuclease wurden zwei Primer zur PCR-Amplifikation des bsmIR Gens (lange Form) synthetisiert.
Die Primer hatten die folgenden Sequenzen:
5' agggagagacatatgcagatgaatgtttttagaattcatggt 3' (244-186). (atg und cag sind die zusätzlichen Codone) (SEQ ID Nr. 23)
5' cgcggatccttatccctctatatgaaaaaatcctgt 3' (235-293) (SEQ ID Nr. 24).
Das bsmIR Gen (lange Form) wurde durch PCR mit 244-186 und 235-293 unter den folgenden Bedingungen amplifiziert: 95°C 1 min, 1 Zyklus 95°C 45 sec, 55°C 45 sec und 72°C 2 min, 20 Zyklen, 2 Einheiten Vent@ DNA Polymerase. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt und mit NdeI und BamHI über Nacht bei 37°C verdaut. Die PCR-DNA wurde wieder durch Spin-Säulen gereinigt und mit einem T7 Expressionsvektor pACYC-T7ter niedriger Kopienzahl mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA von bsmIR (lange Form) plus pACYC-T7ter wurde in den mit BsmI Methylase zuvor modifizierten Wirt ER2566 [pBR-BsmIM1&M2] transformiert. Es wurden achtzehn Plasmid-Mini-Präparationen gemacht und es zeigte sich, dass ein Isolat (Nr. 4) das Endonucleasegen-(lange Form)-Insert enthielt. Eine Zehn-ml-Zellkultur wurde für das Isolat hergestellt und mit 0,5 mM IPTG 3 Stunden lang induziert. Nach der Zelllyse durch Beschallung wurden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und der Zellextrakt wurde im Hinblick auf BsmI Endonucleaseaktivität geprüft. Nr. 4 Zellextrakt wies volle BsmI Aktivität auf. Man kam zu dem Schluss, dass die lange Form der BsmI Endonuclease mit zwei zusätzlichen Aminosäureresten auch bei der DNA-Spaltung aktiv war. SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die BsmI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-2619 erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, der einen Vektor umfasst, in den ein DNA-Segment gemäß Anspruch 1 eingefügt wurde.
Isoliertes DNA-Segment, das die BsmI Restriktionsendonuclease und BsmI Methylase M1 und M2 kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-2619 erhältlich ist.
Klonierungsvektor, der die isolierte DNA aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, transformiert durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 9.
Verfahren zur Produktion rekombinanter BsmI Restriktionsendonuclease, das die Kultivierung einer mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformierten Wirtszelle unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease beinhaltet.