DE60113029T2

DE60113029T2 - Verfahren zur Klonierung und Expression der BpmI Restriktions-Endonuklease in E.coli

Info

Publication number: DE60113029T2
Application number: DE60113029T
Authority: DE
Inventors: Shuang-yong Lexington XU; Jian-ping Wenham Xiao; Zhenyu Beverly Zhu
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 2000-10-20
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2006-03-30
Anticipated expiration: 2021-10-11
Also published as: EP1199365A3; EP1199365A2; JP2002315587A; EP1199365B1; DE60113029D1; US6413758B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die BpmI Restriktionsendonuclease und BpmI Methyltransferase kodiert, sowie die Expression von BpmI Restriktionsendonuclease von E. coli Zellen, die die rekombinante DNA enthalten. BpmI ist ein Isoschizomer von GsuI (Fermentas, Katalog 2000–2001, Produkt-Nr. ER0461/ER0462).
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien und in einigen Viren vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in kleine Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das Molekül innerhalb oder an einer Seite oder an beiden Seiten der Erkennungssequenz. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als zweihundertundelf Restriktionsendonucleasen mit einzigartigen Spezifitäten wurden unter den vielen Hunderten von Bakterienspezies identifiziert, die bisher untersucht wurden (Roberts und Macelis, Nucl. Acids Res. 27: 312–313 (1999)).
Restriktionsendonucleasen werden gewöhnlich nach den Bakterien, von denen sie abstammen, benannt. Die Spezies Deinococcus radiophilus produziert somit beispielsweise drei verschiedene Restriktionsendonucleasen mit dem Namen DraI, DraII und DraIII. Diese Enzyme erkennen und spalten jeweils die Sequenzen 5TTT/AAA3', 5'PuG/GNCCPy3' und 5'CACNNN/GTG3'. Escherichia coli RY13 produziert hingegen nur ein Enzym, nämlich EcoRI, das die Sequenz 5'G/AATTC3' erkennt.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Restriktions-Modifikations-(R-M)-Systemen sind die Methyltransferasen (Methylasen). Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden. Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch ein spezielles Nucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe (C5-Methyl-Cytosin, N4-Methyl-Cytosin oder N6-Methyl-Adenin). Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die zugehörige Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird durch die Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets vollständig modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA reagiert auf eine Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Anhand der DNA-Rekombinationstechnik ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Enzyme in großen Mengen überzuproduzieren. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer genomischer DNA-Bibliotheken, d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Es wurde eine große Anzahl von Restriktionsmodifikationssystemen des Typs II kloniert. Das erste Klonierungsverfahren nutzte eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zur Identifizierung oder Selektierung von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Mol. Gen. Genet. 178: 717–719 (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3: 97–112 (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78: 1503–1507 (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standhalten zu können, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von genomischen DNA-Bibliotheken, die Phagen ausgesetzt wurden, selektiv isoliert werden. Man stellte jedoch fest, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen fand man, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig gekennzeichneten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acids. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19: 355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164: 501–509 (1985; Tsp45I: Wayne et al. Gene 202: 83–88 (1997)).
Gemäß einem dritten Ansatz wird im Hinblick auf eine aktive Expression von Methylasegenen selektiert (Methylaseselektion) (US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acids. Res. 13: 6403–6421 (1985)). Da R-M-Gene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10: 219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20: 197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf Gene 21: 111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258: 1235–1241 (1983)).
Ein neueres Verfahren, das "Endo-Blue-Verfahren", wurde zum direkten Klonieren von Restriktionsendonucleasegenen in E. coli auf der Basis des Indikatorstammes von E. coli beschrieben, der die dinD::lacZ Fusion enthält (Fomenkov et al., US-Patent Nr. 5,498,535 (1996); Fomenkov et al., Nucl. Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)). Im Rahmen dieses Verfahrens werden die E. coli SOS-Reaktionssignale im Anschluss an DNA-Schäden genutzt, die durch Restriktionsendonucleasen oder unspezifische Nucleasen verursacht werden. Mit diesem Verfahren wurde eine Reihe thermostabiler Nucleasegene (TaqI, Tth111I, BsoBI Tf Nuclease) kloniert (US-Patent Nr. 5,498,535).
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zur Schaffung rekombinanter Moleküle im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Restriktionsenzyme in großen Mengen produzieren. Solche Überexpressionsstämme müssten auch die Aufgabe der Enzymreinigung vereinfachen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Klonieren der BpmI Restriktionsendonuclease von Bacillus pumilus in E. coli durch Methylaseselektion und inverse PCR-Amplifikation der angrenzenden DNA des BpmI Methylasegens.
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante BpmI und Verfahren für ihre Herstellung. BpmI Restriktionsendonuclease ist im Stamm von Bacillus pumilus zu finden (New England Biolabs' Stammsammlung Nr. 711). Sie erkennt die doppelsträngige DNA-Sequenz 5'CTGGAG3' (oder 5'CTCCAG3') und spaltet 16/14 Basen stromabwärts ihrer Erkennungssequenz (N16/14), um einen 2-Basen-Überhang am 3'-Ende zu erzeugen.
Durch Methylaseselektion wurde ein Methylasegen mit hoher Homologie zu Amino-Methyltransferasen (N6-Adenin-Methylasen) in einer DNA-Bibliothek gefunden. Dieses Gen wurde BpmI M1 Gen (BpmIM1, 1650 bp) genannt und kodierte ein 549-aa Protein mit vorhergesagter Molekülmasse von 63.702 Dalton. Es gab ein teilweises offenes Leseraster oberhalb des BpmIM1 Gens, das 31% Aminosäuresequenzidentität zu einem anderen Restriktionsenzym, Eco57I, mit ähnlicher Erkennungssequenz aufwies (Eco57I Erkennungssequenz: 5'CTGAAG N16/N14; BpmI Erkennungssequenz: 5'CTGGAG N16/N14; A. Janulaitis et al. Nucl. Acids Res. 20: 6051–6056 (1992)).
Zum Klonieren des Rests des BpmIRM Gens wurde eine inverse PCR angewendet, um die angrenzende DNA-Sequenz zu amplifizieren. Nach vier Runden der inversen PCR-Reaktion wurde ein offenes Leseraster von 3030 bp stromaufwärts des BpmI M1 Methylasegen gefunden, das ein 1009-aa Protein mit vorhergesagter Molekülmasse von 116.891 Dalton kodierte. Durch einen Aminosäuresequenzvergleich der BpmI Endonuclease mit allen bekannten Proteinen in der GenBank Proteindatenbank wurde entdeckt, dass die BpmI Endonuclease eine Fusion von zwei verschiedenen Elementen mit einer möglichen Strukturdomäne von Restriktions-Methylierungs-Spezifität (R-M-S) ist. Diese Domänenorganisation ist analog zum Restriktionsmodifikationssystem des Typs I mit drei verschiedenen Untereinheiten R, M und S. Da BpmI gegenüber anderen Restriktionsenzymen des Typs II recht unterschiedlich ist, wird vorgeschlagen, dass BpmI zu einer Untergruppe von Restriktionsenzymen des Typs II mit der Bezeichnung Typ IIf gehört (f steht für Fusion von Restriktionsmodifikationsdomänen).
Zum Erzeugen eines zuvor modifizierten Expressionswirts wurde das BpmIM1 Gen in PCR amplifiziert und im E. coli Stamm ER2566 kloniert. Die BpmI M1 Methylase modifiziert außerdem den XhoI Ort. Die XhoI Erkennungssequenz 5'CTCGAG3' ist der BpmI Erkennungssequenz 5'CTGGAG3' ähnlich, mit nur einem Basenunterschied. Man kam zu dem Schluss, dass BpmI M1 Methylase die Sequenz 5'CTNNAG3' erkennen und möglicherweise die Adenin-Base modifizieren kann, um N6-Adenin in der symmetrischen Sequenz zu erzeugen.
Die Expression des 3030-bp BpmIRM Gens war aufgrund der großen Größe des PCR-Produkts recht schwierig. Das BpmIRM Gen wurde zuerst durch Taq DNA-Polymerase amplifiziert und in den zuvor modifizierten Wirt kloniert, es wurde aber keine BpmI Aktivität nachgewiesen. Zur Verbesserung der Genauigkeit der PCR-Reaktion wurde Deep Vent DNA-Polymerase in der PCR verwendet. Von 18 Klonen mit dem Insert wies lediglich ein Klon (Nr. 4) teilweise BpmI Aktivität auf. Dieser Klon wurde sequenziert und es wurde bestätigt, dass eine Wildtypsequenz enthalten war.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1: Genorganisation des BpmI Restriktionsmodifikationssystems. Die Gene BpmIRM und BpmIM1 kodieren die BpmI Endonuclease (jeweils BpmI Endonuclease-Methylase-Fusionsprotein und BpmI M1. BpmI-ΔNr. 1, BpmI-ΔNr. 2 und BpmI-ΔNr. 3 sind Deletionsmutanten mit Deletionen in den Methylierungs- oder Spezifitätsdomänen.
2: DNA-Sequenz des BpmI M1 Methylasegens (BpmIM1) (SEQ ID Nr. 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3: DNA-Sequenz des BpmI Endonucleasegens (BpmIRM) (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminsäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4: Rekombinante BpmI Endonucleaseaktivität in Säulenfraktionen nach einer Heparin-Sepharose-Chromatographie. Bahn 1: gereinigte native BpmI Endonuclease; Bahnen 2 bis 23: Heparin-Sepharose-Säulenfraktionen. Die Fraktionen 11 bis 14 verursachten einen kompletten BpmI Verdau von λ DNA. Die restlichen Fraktionen weisen keine oder teilweise BpmI Aktivität auf. Bahn 24: 1 kb DNA-Größenmarker.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem das BpmI Methylasegen und die BpmI Restriktionsendonucleasegene vorzugsweise in E. coli kloniert und exprimiert werden, umfasst die folgenden Schritte:
1. Präparation von genomischer DNA und Restriktionsverdau von genomischer DNA
Genomische DNA wird vom Bacillus pumilus (New England Biolabs Sammlung Nr. 711) mit Standardverfahren hergestellt. Fünf μg genomische DNA werden teilweise mit 2, 1, 0,5 und 0,25 Einheiten ApoI (Erkennungssequenz R/AATTY) verdaut.
Genomische DNA-Fragmente im Bereich von 2–10 kb werden durch ein leichtschmelzbares Agarosegel gereinigt. Genomische und pBR322 DNA werden jeweils außerdem mit AatII, BamHI, ClaI, EagI, EcoRI, HindIII, NdeI, NheI, SalI und SphI verdaut, es wurden jedoch keine methylasepositive Klone erhalten.
2. Konstruktion von teilweiser genomischer DNA-Bibliothek von ApoI und Inkontaktbringen der Bibliothek mit BpmI
Die teilweisen DNA-Fragmente von ApoI werden mit EcoRI-verdautem und CIP-behandeltem pBR322 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wird durch Elektroporation in E. coli RR1 kompetente Zellen transferiert. Transformanten werden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wird von den Zeilen präpariert und mit BpmI in Kontakt gebracht. Nach dem BpmI Verdau wird die kontaktierte DNA in RR1 Zellen transformiert. Überlebende werden im Hinblick auf Resistenz gegenüber BpmI Verdau gescreent. Man stellte fest, dass zwei resistente Klone, Nr. 18 und Nr. 26, gegenüber BpmI-Verdau resistent sind. Mit AatII, BamHI, ClaI, EagI, EcoRI, HindIII, NdeI, NheI, SalI und SphI verdaute genomische DNA wurde ebenfalls mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert und es wurden genomische DNA-Bibliotheken konstruiert. Es wurden jedoch keine scheinbar BpmI resistenten Klone anhand dieser Bibliotheken entdeckt.
3. Subklonierung und DNA-Sequenzierung des resistenten Klons
Ein resistenter Klon Nr. 26 enthielt ein Insert von etwa 3,1 kb. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer von pUC19 wurden zum Sequenzieren des Inserts verwendet. Drei ApoI und ein HindIII Fragment(e) wurden in pUC19 subkloniert und sequenziert. Das gesamte Insert wurde durch Primer-Walking sequenziert. Ein Methylasegen mit hoher Homologie zu Amino-Methyltransferase wird in dem Insert gefunden, das BpmIM1 Gen genannt wird. Das BpmIM1 Gen umfasst 1650 bp und kodiert ein 549-Aminosäureprotein mit vorhergesagter Molekülmasse von 63.702 Dalton.
4. Klonierung des BpmI Restriktionsendonucleasegens (BpmIRM) durch inverse PCR
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde ermittelt, dass ein teilweises offenes Leseraster oberhalb des BpmIM1 Gens vorhanden ist, das 31% Aminosäuresequenzidentität zu einem anderen Restriktionsenzym, Eco57I, mit ähnlicher Erkennungssequenz hat (Eco57I Erkennungssequenz: 5'CTGAAG N16/N14; A. Janulaitis et al. Nucl. Acids Res. 20:
6051–6056 (1992); BpmI Erkennungssequenz: 5'CTGGAG N16/N14). Genomische DNA wird mit Restriktionsenzymen verdaut. Die verdaute DNA wird bei einer niedrigen DNA-Konzentration ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BpmIR Gens verwendet. Inverse PCR-Produkte werden gewonnen, von leichtschmelzbarer Agarose gelgereinigt und sequenziert. Nach vier Runden der inversen PCR-Reaktion wurde ein offenes Leseraster von 3030 bp oberhalb des BpmIM1 Methylasegens gefunden, das ein 1009-Aminosäureprotein mit vorhergesagter Molekülmasse von 116.891 Dalton kodierte. Dies ist eines der größten bisher entdeckten Restriktionsenzyme. Durch einen Aminosäuresequenzvergleich der BpmI Endonuclease mit allen bekannten Proteinen in der GenBank Proteindatenbank wurde entdeckt, dass die BpmI Endonuclease eine Fusion von zwei verschiedenen Elementen mit einer möglichen Strukturdomäne von Restriktions-Methylierungs-Spezifität (R-M-S) ist. Diese Domänenorganisation ist analog zum Restriktionsmodifikationssystem des Typs I mit drei verschiedenen Untereinheiten, Restriktion, Methylierung und Spezifität (R, M und S). Da sich BpmI von anderen Restriktionsenzymen des Typs II ziemlich unterscheidet, wird vorgeschlagen, dass BpmI zu einer Untergruppe von Restriktionsenzymen des Typs II mit der Bezeichnung Typ IIf gehört (f steht für Fusion von Restriktions-Modifikations-Spezifitäts-Domänen).
5. Expression des BpmIM1 Gens in E. coli
Zwei Primer werden zum Amplifizieren des BpmIM1 Gens in PCR synthetisiert. Nach einem Verdau mit BamHI und SphI wird das PCR-Produkt in pACYC184 mit kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wird in kompetente ER2566 Zellen transformiert. Plasmide mit BpmIM1 Gen-Inserts werden im Hinblick auf Resistenz gegen BpmI-Verdau getestet. Zwei von 18 Klonen waren gegenüber einem BpmI-Verdau resistent, was ein Hinweis auf eine effiziente BpmI M1 Expression in E. coli Zellen und eine BpmI Ortsmodifikation auf dem Expressionsplasmid war. Die Wirtszelle ER2566 [pACYC-BpmIM1] wird zur Expression des BpmIRM Gens verwendet.
Die BpmI M1 Methylase modifiziert außerdem den XhoI Ort. Die XhoI Erkennungssequenz 5'CTCGAG3' ist der BpmI Erkennungssequenz 5'CTGGAG3' ähnlich, mit nur einem Basenunterschied. Man kommt zu dem Schluss, dass BpmI M1 Methylase die Sequenz 5'CTNNAG3' erkennen und die Adenin-Base modifizieren kann, um N6-Adenin in der symmetrischen Sequenz zu erzeugen.
6. Expression des BpmIRM Gens in E. coli mit einem T7 Expressionsvektor
Das 3030-bp BpmIRM Gen wurde in PCR mit Taq DNA-Polymerase amplifiziert, mit BamHI verdaut und in die BamHI-verdauten T7 Expressionsvektoren pAII17 und pET21a ligiert. Nach der Transformation der ligierten DNA in ER2566 [pACYC-BpmIM1] wurden die Transformanten im Hinblick auf das Endonucleasegen-Insert gescreent. Sieben von 72 Klonen enthielten das Insert mit korrekter Orientierung. Es wurde jedoch keine BpmI Aktivität in Zellextrakten von IPTG-induzierten Zellen nachgewiesen. Dies liegt wahrscheinlich an Mutationen, die im Laufe des PCR-Prozesses eingebracht wurden.
Zum Reduzieren der Mutationsfrequenz wurde Deep Vent^® DNA-Polymerase in PCR-Reaktionen verwendet, um das 3030-bp BpmIRM Gen zu amplifizieren. Das PCR-Produkt wurde mit BamHI und XbaI verdaut und mit den T7 Expressionsvektoren pAII17 und pET21at ligiert. Achtzehn von 36 Klonen enthalten das Insert korrekter Größe. 10-ml-Zellkulturen für alle 18 Klone wurden mit IPTG induziert und Zellextrakte wurden präpariert und im Hinblick auf BpmI Aktivität untersucht. Klon Nr. 4 wies eine teilweise BpmI Aktivität auf.
7. Teilweise Reinigung rekombinanter BpmI Aktivität
Eine Zellkultur von 500 ml wurde für den Expressionsklon Nr. 4 ER2566 [pACYC-BpmIM1, pET21at-BpmIRM] hergestellt. BpmI-haltiger Zellextrakt (40 ml) wurde durch eine Heparin-Sepharose-Säule gereinigt. Proteine wurden mit einem NaCl-Gradienten von 50 mM bis 1 M eluiert. Die Fraktionen 6 bis 27 wurden im Hinblick auf BpmI Aktivität auf λ DNA untersucht. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen 15 bis 18 die höchste BpmI Aktivität enthielten (4). Die Ausbeute wurde auf 1800 Einheiten BpmI je Gramm nasser E. coli Zellen geschätzt. Die spezifische Aktivität wurde auf 24.000 Einheiten je mg Protein geschätzt.
Die vorliegende Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele veranschaulicht. Diese Beispiele sollen zum Verständnis der Erfindung beitragen und sind nicht als diese einschränkend anzusehen.
1. BEISPIEL
KLONIERUNG DES BpmI RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEMS IN E. COLI
1. Herstellung genomischer DNA und Restriktionsverdau von genomischer DNA
Genomische DNA wird von Bacillus pumilus (New England Biolabs Sammlung Nr. 711) mit einem Standardverfahren hergestellt, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Zelllyse durch Zugabe von Lysozym (2 mg/ml Endkonz.), Saccharose (1 Endkonz.) und 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(b) Zelllyse durch Zugabe von 10% SDS (Endkonzentration 0,1%);
(c) Zelllyse durch Zugabe von 1% Triton X-100 und 62 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0;
(d) Phenol-CHCl₃-Extraktion von DNA, dreimal (gleiches Volumen), und CHCl₃-Extraktion, einmal;
(e) DNA-Dialyse in 4 Liter TE-Puffer, dreimal Wechsel; und
(f) RNA wurde durch RNAse-A-Behandlung entfernt und die genomische DNA wurde in Ethanol präzipitiert und in TE-Puffer resuspendiert.

Fünf μg genomische DNA wurden teilweise mit 2, 1, 0,5 und 0,25 Einheiten von ApoI (Erkennungssequenz R/AATTY) 30 Minuten lang bei 50°C verdaut. Genomische DNA-Fragmente zwischen 2 und 10 kb wurden durch ein 1%iges leichtschmelzbares Agarosegel gereinigt. Genomische und pBR322 DNA wurden außerdem jeweils mit AatII, BamHI, ClaI, EagI, EcoRI, HindIII, NdeI, NheI, SalI und SphI verdaut. Genomische DNA-Fragmente wurden mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert.
2. Konstruktion einer teilweisen genomischen DNA-Bibliothek von ApoI und Inkontaktbringen der Bibliothek mit BpmI
Die teilweisen DNA-Fragmente von ApoI wurden mit EcoRI-verdautem und CIP-behandeltem pBR322 Vektor ligiert. Die ligierte DNA wurde durch Tropfendialyse auf 4 l destilliertes Wasser dialysiert und in kompetente E. coli RR1 Zellen durch Elektroporation transferiert. Ap^R Transformanten wurden gepoolt und amplifiziert. Plasmid-DNA wurde von den Übernachtzellen präpariert und mit BpmI in Kontakt gebracht. Nach dem BpmI Verdau wurde die kontaktierte DNA in RR1 Zellen transformiert. Ap^R Überlebende wurden im Hinblick auf Resistenz gegen BpmI Verdau gescreent. Es wurden insgesamt 36 Plasmid-Mini-Präparationen gemacht. Es wurde festgestellt, dass zwei resistente Klone, Nr. 18 und Nr. 26, gegenüber BpmI-Verdau resistent waren. Mit AatII, BamHI, ClaI, EagI, EcoRI, HindIII, NdeI, NheI, SalI und SphI verdaute genomische DNA wurde ebenfalls mit pBR322 mit kompatiblen Enden ligiert und es wurden genomische DNA-Bibliotheken konstruiert. Es wurden jedoch keine scheinbar BpmI resistenten Klone anhand dieser Bibliotheken nach dem Screenen von mehr als 144 Klonen entdeckt.
3. Subklonierung und DNA-Sequenzierung des resistenten Klons
Ein resistenter Klon Nr. 26 enthält einen Insert von etwa 3,1 kb. Die Vorwärts- und Rückwärtsprimer von pUC19 wurden zum Sequenzieren des Inserts verwendet. Drei ApoI und ein HindIII Fragmente) wurden gelgereinigt und in pUC19 subkloniert und sequenziert. Der Rest des Inserts wurde durch Primer-Walking sequenziert. Ein Methylasegen mit hoher Homologie zu Amino-Methyltransferase (N6-Adeninmethylase) wurde in dem Insert gefunden, das BpmI M1 Gen genannt wurde. Das BpmIM1 Gen umfasst 1650 bp und kodiert ein 549-Aminosäureprotein mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 63.702 Dalton.
4. Klonierung des BpmI Restriktionsendonucleasegens (BpmIRM) durch inverse PCR
Es gibt ein teilweises offenes Leseraster oberhalb des BpmIM1 Gens, das 31% Aminosäuresequenzidentität zu einem anderen Restriktionsenzym, Eco57I, mit ähnlicher Erkennungssequenz hat (Eco57I Erkennungssequenz: 5'CTGAAG N16/N14; A. Janulaitis et al. Nucl. Acids Res. 20: 6051–6056 (1992); BpmI Erkennungssequenz: 5'CTGGAG N16/N14). Genomische DNA wurde mit den Restriktionsenzymen AseI, BclI, HaeII, HpaII, MboI, MseI, NlaIII, PacI und Tsp509I verdaut. Die verdaute DNA wurde bei einer niedrigen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BpmIR Gens verwendet. Die Sequenz der inversen PCR-Primer war wie folgt:
Inverse PCR-Bedingungen waren 94°C, 1 min., 55°C, 1 min, 72°C, 2 min, 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von HaeIII und NlaIII Matrizen gewonnen, gelgereinigt von leichtschmelzbarer Agarose und mit den Primern 232–34 und 35 sequenziert.
Die Primer für die zweite Runde der inversen PCR waren die Folgenden:
Die genomische DNA wurde mit AseI, BclI, BsrFI, BstNI, EcoRI, HincII, HindIII, HpaII, NcoI, PacI, PvuI, TaqI, TfiI und XbaI verdaut. Die verdaute DNA wurde bei einer niedrigen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BpmIR-Gens verwendet. Inverse PCR-Bedingungen waren 94°C, 1 min., 55°C, 1 min., 72°C, 2 min, 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von AseI, HindIII, HpaII und TaqI Matrizen gewonnen, gelgereinigt von leichtschmelzbarer Agarose und mit den Primern 233–76 und 77 sequenziert.
Die Primer für die dritte Runde der inversen PCR waren die Folgenden:
Genomische DNA wurde mit AflIIII, BspHI, BstNI, EcoRI, HaeII, HinP1I, HhaII, HindIII, StyI und XmnI verdaut. Die verdaute DNA wurde bei einer niedrigen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BpmIR-Gens verwendet. Die inversen PCR-Bedingungen waren 94°C, 1 min., 55°C, 1 min., 72°C, 2 min., 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von HinP1I und XmnI Matrizen gewonnen, von leichtschmelzbarer Agarose gelgereinigt und mit den Primern 234–61 und 62 sequenziert.
Die Primer für die vierte Runde der inversen PCR waren die Folgenden:
Genomische DNA wurde mit ApoI, BstBI, BstYI, ClaI, EcoRI, NdeI, RsaI, Sau3AI, SspI, TaqI und XmnI verdaut. Die verdaute DNA wurde bei einer niedrigen DNA-Konzentration von 2 μg/ml ligiert und dann zur inversen PCR-Amplifikation des BpmIR Gens verwendet. Die inversen PCR-Bedingungen waren 94°C, 1 min, 55°C, 1 min, 72°C, 2 min, 35 Zyklen. Inverse PCR-Produkte wurden von ApoI, ClaI, NdeI, RsaI, SspI und TaqI Matrizen gewonnen, gelgereinigt von leichtschmelzbarer Agarose und mit den Primern 235–50 und 51 sequenziert. Das ClaI Fragment (2,4 kb) verläuft weiter oberhalb des BpmIRM Gens. Der Rest des ClaI Fragments wurde mit Primer-Walking sequenziert.
Nach vier Runden der inversen PCR-Reaktion wurde ein offenes Leseraster von 3030 bp oberhalb des BpmI M1 Methylasegens gefunden, das ein 1009-Aminosäureprotein mit vorhergesagter Molekülmasse von 116.891 Dalton kodierte. Dies ist eines der größten bisher entdeckten Restriktionsenzyme. Durch einen Aminosäuresequenzvergleich von BpmI Endonuclease mit allen bekannten Proteinen in der GenBank Proteindatenbank wurde entdeckt, dass BpmI Endonuclease eine Fusion von zwei verschiedenen Elementen mit möglichen Strukturdomänen von Restriktions-Methylierungs-Spezifität (R-M-S) ist. Diese Domänenorganisation ist analog zum Restriktions-Modifikationssystem des Typs I mit drei verschiedenen Untereinheiten, Restriktion, Methylierung und Spezifität (R, M und S). Da BpmI im Vergleich zu anderen Restriktionsenzymen des Typs II recht unterschiedlich ist, wird vorgeschlagen, dass BpmI zu einer Untergruppe von Restriktionsenzymen des Typs II mit der Bezeichnung Typ IIf gehört (f steht für Fusion von Restriktions-Modifikations-Spezifitäts-Domänen).
5. Expression des BpmIM1 Gens in E. coli
Zwei Primer werden synthetisiert, um das BpmIM1 Gen in PCR zu amplifizieren. Die Primersequenzen sind:
vorwärts:
rückwärts:
Nach dem Verdau mit BamHI und SphI wurde das PCR-Produkt in pACYC184 mit den kompatiblen Enden ligiert. Die ligierte DNA wurde in kompetente ER2566 Zellen transformiert. CM^R Transformanten wurden über Nacht bei 37°C plattiert. Plasmide mit BpmIM1 Gen-Inserts wurden im Hinblick auf eine Resistenz gegen BpmI Verdau getestet. Zwei von 18 Klonen zeigten eine vollständige Resistenz gegen BpmI Verdau, was ein Hinweis auf eine effiziente BpmI M1 Expression in E. coli Zellen und eine BpmI Ortsmodifikation auf dem Expressionsplasmid war. Die Wirtszelle ER2566 [pACYC-BpmIM1] wurde zur Expression des BpmIRM Gens verwendet.
BpmI M1 Methylase modifiziert auch den XhoI Ort. Die XhoI Erkennungssequenz 5'CTCGAG3' ist der BpmI Erkennungssequenz 5'CTGGAG3' ähnlich, mit nur einem Basenunterschied. Man kommt zu dem Schluss, dass BpmI M1 Methylase die Sequenz 5'CTNNAG3' erkennen und die Adenin-Base modifizieren kann, um N6-Adenin in der symmetrischen Erkennungssequenz zu erzeugen.
6. Expression des BpmIRM Gens in E. coli mit einem T7 Expressionsvektor
Zwei Primer wurden synthetisiert, um das BpmIRM Gen zu amplifizieren. Die Primersequenzen waren:
Das 3030-bp BpmIRM Gen wurde in PCR mit Taq DNA-Polymerase amplifiziert, mit BamHI verdaut und in die BamHI-verdauten T7 Expressionsvektoren pAII17 und pET21a ligiert. Nach der Transformation der ligierten DNA in ER2566 [pACYC-BpmIM1] wurden Ap^A CM^R Transformanten im Hinblick auf das Endonucleasegen-Insert gescreent. Sieben von 72 Klonen enthielten das Insert mit korrekter Orientierung. Keine BpmI Aktivität wurde jedoch in Zellextrakten IPTG-induzierter Zellen nachgewiesen. Dies lag wahrscheinlich an Mutationen, die im Laufe des PCR-Prozesses eingebracht wurden.
Zum Reduzieren der Mutationsfrequenz wurde Deep Vent^® DNA-Polymerase in PCR-Reaktionen verwendet, um das 3030-bp BpmIRM Gen zu amplifizieren. Der Vorwärtsprimer beinhaltete einen XbaI Ort und hatte die folgende Sequenz:
Die PCR wurde mit den Primern 238–181, 238–182 und Deep Vent^® DNA-Polymerase durchgeführt. Die PCR-Bedingungen waren 94°C, 5 min., ein Zyklus; 94°C, 1 min., 55°C, 1,5 min., 72°C, 8 min., 20 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde durch eine Qiagen Spin-Säule gereinigt, mit BamHI und XbaI verdaut und mit den T7 Expressionsvektoren pAII17 und pET21at mit kompatiblen Enden ligiert. Achtzehn von 36 Klonen enthalten das Insert korrekter Größe. 10-ml-Zellkulturen für alle 18 Klone mit Inserts wurden mit IPTG 3 Stunden lang induziert und Zellextrakte wurden durch Beschallung präpariert und im Hinblick auf BpmI Aktivität untersucht. Der Klon Nr. 4 wies teilweise BpmI Aktivität auf. Da dieses Gen durch PCR-Klonierung gewonnen wurde, wurde das gesamte BpmIRM Fusionsgen an beiden Strängen sequenziert und es wurde bestätigt, dass es eine Wildtypsequenz war.
7. Teilweise Reinigung rekombinanter BpmI Aktivität
Eine Zellkultur von 500 ml wurde für den Expressionsklon Nr. 4 ER2566 [pACYC-BpmIM1, pET21at-BpmIRM] hergestellt. Zellen der späten log-Phase wurden mit IPTG induziert und BpmI-haltiger Zellextrakt (40 ml) wurde durch eine Heparin-Sepharose-Säule gereinigt. Proteine wurden mit einem NaCl Gradienten von 50 mM bis 1 M eluiert. Die Fraktionen 6 bis 27 enthielten die höchste Proteinkonzentration und wurden im Hinblick auf BpmI Aktivität auf λ DNA untersucht. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen 15 bis 18 die höchste BpmI Aktivität enthielten (4). Die Ausbeute wurde auf 1800 Einheiten BpmI je Gramm nasser E. coli Zellen geschätzt. Die spezifische Aktivität wurde auf 24.000 Einheiten je mg Protein geschätzt. Proteine der Fraktionen 15 bis 18 wurden auf einem SDS-PAGE-Gel analysiert und Proteinbanden wurden mit Gelcode Blue Stain gefärbt. Eine Proteinbande, die 115 kDa entsprach, wurde auf dem Proteingel nachgewiesen und stimmte eng mit der vorhergesagten Größe von 117 kDa überein.
Der E. coli Stamm ER2566 [pACYC-BpmIM1, pET21at-BpmIRM] wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 12. Oktober 2000 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung mit der Beitrittsnummer PTA-2598 hinterlegt.
2. Beispiel
Deletion des Methylaseabschnitts des BpmI RM Fusionsproteins
Zwei Primer wurden synthetisiert, um die angebliche Endonucleasedomäne mit einer Deletion der Methylase- und Spezifitätsdomäne zu amplifizieren. Der Deletionsklon enthielt somit nur den R-Abschnitt und der M- und S-Abschnitt wurden entfernt. Der Vorwärtsprimer war wie oben beschrieben 238–181. Der Rückwärtsprimer hatte die folgende Sequenz mit einem XhoI Ort am 5'-Ende:
Die Deletionsjunktion war im Motiv I der γ Typ N6-Adenin-Methylase. Die γ Typ N6-Adenin-Methylasen enthalten konservierte Motive von X, I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII. Die Spezifitätsdomäne (TRD) befindet sich hinter Motiv VIII. Der BpmI Deletionsklon (BpmI-ΔNr. 1) trug noch immer die Motive X und einen Teil von Motiv I. Die Spezifitätsdomäne hinter Motiv VIII war ebenfalls deletiert (der restliche Abschnitt ist in 1 dargestellt).
Eine PCR wurde mit den Primern 238–181 und 244–95 und Taq plus Vent^® DNA-Polymerase durchgeführt (94°C, 1 min., 60°C, 1 min., und 72°C, 1 min, 25 Zyklen). Das PCR-Produkt wurde mit XbaI und XhoI verdaut und in einen T7 Expressionsvektor pET21b kloniert. Sechzehn Klone von 36 gescreenten enthielten das Insert korrekter Größe und die Zellen wurden 3 Stunden lang mit IPTG induziert.
Zellextrakt wurde durch Beschallung präpariert und im Hinblick auf BpmI Aktivität auf λ DNA untersucht. Es wurde jedoch kein scheinbares BpmI Verdaumuster nachgewiesen. Lediglich unspezifische Nuclease wurde im Zellextrakt nachgewiesen und resultierte in einem Verschmieren von DNA-Substrat. Man kam zu dem Schluss, dass die Deletion des Methylase- und Spezifitätsabschnitts des BpmIRM Fusionsproteins BpmI Restriktionsaktivität aufhob.
Zur weiteren Bestätigung des obigen Ergebnisses wurde ein weiterer Deletionsklon konstruiert, der die Methylasemotive IV, V, VI, VII, VIII und die Spezifitätsdomäne deletierte. Diese EcoRI-Fragmentdeletionsmutante enthält eine 1521 bp (507 Aminosäuren) Deletion in der C-Terminus-Hälfte des Fusionsproteins (BpmI-ΔNr. 2). IPTG-induzierter Zellextrakt dieser Mutante wies ebenfalls keine BpmI Endonucleaseaktivität auf.
Zum Deletieren der Spezifitätsdomäne (Targeterkennungsdomäne, TRD) wurde ein HindIII-Fragment von 579 bp (193 Aminosäuren) vom C-Terminus der BpmI RM-Fusionsendonuclease (BpmI-ΔNr. 3) deletiert. IPTG-induzierter Zellextrakt der TRD-Deletionsmutante wies keinerlei BpmI Endonucleaseaktivität auf. Das Mutantenprotein wies jedoch unspezifische Nucleaseaktivität auf. Man kam zu dem Schluss, dass die Spezifitäts-(TRD)-Domäne auch für BpmI Endonucleaseaktivität notwendig ist. Die Deletion der Spezifitäts-(TRD)-Domäne kann ihre DNA-Bindungsaffinität und – Spezifität aufheben oder reduzieren. Durch das Eintauschen anderer N6-Methylase- und Spezifitätsdomänen kann eine neue Enzymspezifität geschaffen werden.
3. Beispiel
Erzeugung neuer Enzymspezifität unter Verwendung des BpmI RM Fusionsproteins
Da BpmI Endonuclease aus drei Domänen (R-M-S) besteht, ist es möglich, andere Methylierungs-Spezifitäts-Domänen einzuschieben, um eine neue Enzymspezifität zu erzeugen. Das BpmIRM Fusionsgen wird in einen T7 Expressionsvektor wie im 1. Beispiel beschrieben kloniert. Plasmid-DNA wird präpariert. Die γ Typ N6-Adenin-Methylasen enthalten konservierte Motive von X, I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII (Malone T. et al. J. Mol. Biol 253: 618–632 (1995)). Die Motive X bis VIII und TRD werden deletiert und ein DNA-Linker, der eine oder mehrere Überbrückungsaminosäuren kodiert, wird mit einem Restriktionsort eingesetzt, vorzugsweise abgestumpft (z.B. SmaI Ort). Die Anzahl von Aminosäuren unterscheidet sich von einem System zum anderen und kann durch routinemäßige Experimente bestimmt werden. Ziel ist es, genügend sterischen Raum für die Einführung neuer M-S-Domänen bereitzustellen. DNA, die andere γ Typ N6-Adenin-Methylasen mit Motiven von X, I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und TRD kodiert, wird mit dem verdauten Blunt-Ort (in-frame) des BpmI Deletionsklons ligiert. Die ligierte DNA wird in einen Nicht-T7-Expressionsvektor transformiert. Nachdem das Insert verifiziert wurde, wird das Plasmid, das neue Methylierungs-Spezifitäts-Domänen enthält, in einen T7 Expressionswirt transformiert und mit IPTG induziert. Zellextrakt wird auf Plasmid- und Phagen-DNA untersucht und im Hinblick auf neue Restriktionsaktivität analysiert.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die BpmI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-2598 erhältlich ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment nach Anspruch 1, eingefügt wurde.
Isoliertes DNA-Segment, das die BpmI Restriktionsendonuclease und BpmI Methylase M1 und M2 kodiert, wobei die isolierte DNA von ATCC Nr. PTA-2598 erhältlich ist.
Klonierungsvektor, umfassend die isolierte DNA aus Anspruch 3.
Wirtszelle, transformiert durch den Vektor aus Anspruch 2 oder 4.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten BpmI Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor aus Anspruch 2 oder 4 transformiert wurde, unter Bedingungen zur Expression der genannten Endonuclease.
Verfahren zur Modifizierung der Spezifität eines BpmI Restriktions-Modifikationssystems, wobei das genannte System DNA beinhaltet, die eine Restriktionsendonuclease und -methylase kodiert; wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (a) Isolieren des DNA-Segments nach Anspruch 3 und Deletieren der Methylierungs-Spezifitätsdomäne des genannten BpmI DNA-Segments, um einen BpmI Delektionsklon zu bilden; (b) Einfügen eines DNA-Linkers, der einen angemessenen Restriktionsort kodiert und eine oder mehrere Aminosäuren kodiert, am Deletionsort von Schritt (a), um einen verdauten Blunt-Ort zu bilden; und (c) In-frame-Ligieren von DNA, die andere γ-Typ-N6-Adeninmethylasen kodiert, die Motive von X, I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII und TRD enthalten, mit dem verdauten Blunt-Ort des BpmI Deletionsklons, um eine modifizierte DNA zu bilden, die ein Restriktions-Modifikationssystem kodiert.