DE60022814T2

DE60022814T2 - Verfahren zur Klonierung und Herstellung von der Restrictionsendonuklease SwaI

Info

Publication number: DE60022814T2
Application number: DE60022814T
Authority: DE
Inventors: Huimin Wenham Kong; Lauren S. Essex Higgins; Michael A. Manchester Dalton
Original assignee: New England Biolabs Inc
Current assignee: New England Biolabs Inc
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: DE60022814D1; US6245545B1; JP4485644B2; JP2000316589A; EP1048731B1; EP1048731A2; EP1048731A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante DNA, die die SwaI Restriktionsendonuclease und Modifikationsmethylase kodiert, sowie die Produktion von SwaI Restriktionsendonuclease von der rekombinanten DNA. SwaI Restriktionsendonuclease (siehe US-Patent Nr. 5,158,878) wird ursprünglich von Staphylococcus warneri isoliert. Sie erkennt die DNA-Sequenz 5'ATTTAAAT3' und spaltet die Phosphodiesterbindung 5' zum zweiten A der Erkennungssequenz, um ein Blunt-Ende zu produzieren.
Restriktionsendonucleasen des Typs II sind eine Klasse von Enzymen, die natürlich in Bakterien vorkommen. Wenn sie von anderen Bakterienkomponenten weggereinigt werden, können Restriktionsendonucleasen im Labor zum Spalten von DNA-Molekülen in präzise Fragmente zur molekularen Klonierung und Gencharakterisierung verwendet werden.
Restriktionsendonucleasen des Typs II agieren, indem sie spezielle Sequenzen von Nucleotiden (die "Erkennungssequenz") entlang dem DNA-Molekül erkennen und sich an sie binden. Nach dem Anbinden spalten sie das DNA-Molekül an bestimmten Positionen. Unterschiedliche Restriktionsendonucleasen haben Affinität zu unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Mehr als 3000 Restriktionsendonucleasen wurden bisher charakterisiert, die 212 verschiedene Erkennungssequenzen erkennen (Roberts, R.J., Macelis, D. Nucleic Acids Res. 26:338–350 (1998)).
Es wird davon ausgegangen, dass Restriktionsendonucleasen in der Natur eine schützende Rolle zum Wohle der Bakterienzelle spielen. Sie machen Bakterien widerstandsfähig gegen Infektionen durch Fremd-DNA-Moleküle wie Bakteriophagen und Plasmide, die sie sonst zerstören oder befallen würden. Sie verleihen Widerstandsfähigkeit, indem sie eindringende Fremd-DNA-Moleküle immer dann spalten, wenn die Erkennungssequenz auftritt. Durch die stattfindende Spaltung werden viele der infizierenden Gene deaktiviert, und die DNA wird für einen weiteren Abbau durch unspezifische Nucleasen empfänglich gemacht.
Eine zweite Komponente von bakteriellen Schutzsystemen sind die Modifikationsmethylasen. Diese Enzyme sind komplementär zu Restriktionsendonucleasen und liefern das Mittel, das Bakterien dazu befähigt, ihre eigene DNA zu schützen und sie von fremder, infizierender DNA zu unterscheiden.
Modifikationsmethylasen erkennen und binden sich an die gleiche Erkennungssequenz wie die entsprechende Restriktionsendonuclease, anstatt aber die DNA zu spalten, modifizieren sie chemisch das Zielnucleotid innerhalb der Sequenz durch Hinzufügen einer Methylgruppe. Im Anschluss an die Methylierung wird die Erkennungssequenz nicht mehr durch die Restriktionsendonuclease gespalten. Die DNA einer Bakterienzelle wird aufgrund der Aktivität ihrer Modifikationsmethylase stets modifiziert. Sie ist daher gegenüber der Anwesenheit der endogenen Restriktionsendonuclease völlig unempfindlich. Lediglich unmodifizierte und daher identifizierbare Fremd-DNA ist gegenüber einer Erkennung und Spaltung durch Restriktionsendonuclease empfindlich.
Seit dem Beginn der Gentechnologie ist es nun möglich, Gene zu klonieren und die Proteine, die sie kodieren, in größeren Mengen zu produzieren, als es mit konventionellen Reinigungstechniken möglich ist. Der Schlüssel zur Isolierung von Klonen von Restriktionsendonucleasegenen ist die Entwicklung eines einfachen und zuverlässigen Verfahrens zur Identifizierung solcher Klone innerhalb komplexer "Bibliotheken", d.h. Populationen von Klonen, die durch "Shotgun"-Verfahren hergeleitet werden, wenn sie in geringen Frequenzen von 10^–3 bis 10^–4 auftreten. Vorzugsweise sollte das Verfahren selektiv sein, so dass die unerwünschte Mehrheit von Klonen zerstört wird, während die erwünschten seltenen Klone überleben.
Restriktionsmodifikationssysteme des Typs II werden immer öfter kloniert. Die ersten klonierten Systeme nutzten eine Bakteriophage-Infektion als ein Mittel zum Identifizieren oder Selektieren von Restriktionsendonucleaseklonen (EcoRII: Kosykh et al., Molec. Gen. Genet. 178:717–719, (1980); HhaII: Mann et al., Gene 3:97–112, (1978); PstI: Walder et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 78 1503–1507, (1981)). Da die Anwesenheit von Restriktionsmodifikationssystemen in Bakterien diese dazu befähigt, Infektionen durch Bakteriophagen standzuhalten, können Zellen, die klonierte Restriktionsmodifikationsgene beinhalten, prinzipiell als Überlebende von Bibliotheken selektiv isoliert werden, die dem Phage ausgesetzt wurden. Man hat jedoch festgestellt, dass dieses Verfahren nur von begrenztem Nutzen ist. Im Speziellen wurde gefunden, dass klonierte Restriktionsmodifikationsgene nicht immer ausreichend Phagenwiderstand aufweisen, um selektives Überleben zu gewähren.
Ein weiterer Klonierungsansatz schließt das Übertragen von anfänglich als plasmidbürtig charakterisierten Systemen in E. coli Klonierungsplasmide ein (EcoRV: Bougueleret et al., Nucl. Acid. Res. 12: 3659–3676 (1984); PaeR7: Gingeras und Brooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:402–406 (1983); Theriault und Roy, Gene 19:355–359 (1982); PvuII: Blumenthal et al., J. Bacteriol. 164:501–509, (1985)).
Ein dritter Ansatz, der zum Klonieren einer wachsenden Zahl von Systemen angewendet wird, schließt die Selektion im Hinblick auf ein aktives Methylasegen ein (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,200,333 und BsuRI: Kiss et al., Nucl. Acid. Res. 13:6403–6421 (1985)). Da Restriktions- und Modifikationsgene oft eng miteinander verknüpft sind, können beide Gene oft simultan kloniert werden. Diese Selektion bringt jedoch nicht immer ein komplettes Restriktionssystem hervor, sondern stattdessen nur das Methylasegen (BspRI: Szomolanyi et al., Gene 10:219–225 (1980); BcnI: Janulaitis et al., Gene 20:197–204 (1982); BsuRI: Kiss und Baldauf Gene 21:111–119 (1983); und MspI: Walder et al., J. Biol. Chem. 258:1235–1241 (1983)).
Ein weiteres Verfahren zur Klonierung von Methylase- und Endonucleasegenen beruht auf einem kolorimetrischen Assay hinsichtlich DNA-Schäden (siehe US-Patent Nr. 5,492,823). Beim Screenen nach einer Methylase wird die Plasmidbibliothek in einen E. coli-Stamm wie AP1-200 transformiert. Durch die Expression einer Methylase wird die SOS-Reaktion in einem E. coli-Stamm ausgelöst, der McrA+, McrBC+ oder Mrr+ ist. Der AP1-200 Stamm ist temperaturempfindlich im Hinblick auf die Mcr und Mrr Systeme und beinhaltet ein lac-Z Gen, das mit dem schadeninduzierbaren dinD Locus von E. coli fusioniert ist. Der Nachweis rekombinanter Plasmide, die ein Methylase- oder Endonucleasegen kodieren, basiert auf einer Induktion bei der restriktiven Temperatur des lacZ Gens. Methylasegene kodierende Transformanten werden auf X-Gal-haltigen LB-Agarplatten als blaue Kolonien nachgewiesen (Piekarowicz, et al., Nucleic Acids Res. 19:1831–1835 (1991) und Piekarowicz, et al., J. Bacteriology 173:150–155 (1991)). Der E. coli Stamm ER1992 enthält ebenfalls eine dinD1-LacZ Fusion, ihm fehlen jedoch die methylierungsabhängigen Restriktionssysteme McrA, McrBC und Mrr. In diesem System (mit der Bezeichnung „Endo-Blue"-Verfahren) kann das Endonucleasegen in Abwesenheit seiner zugehörigen Methylase nachgewiesen werden, wenn die Endonuclease die Wirtszell-DNA beschädigt und die SOS-Reaktion auslöst. Die SOS-induzierten Zellen bilden tiefblaue Kolonien auf LB-Agarplatten, die mit X-GaI angereichert sind (Xu et al. Nucleic Acids Res. 22: 2399–2403 (1994)).
Manchmal wird mit dem einfachen Methylaseselektionsverfahren aufgrund verschiedener Hindernisse kein Methylase-(und/oder Endonuclease-)-klon erhalten (siehe z.B. Lunnen, et al., Gene, 74(1):25–32 (1988)). Ein mögliches Hindernis für die Klonierung von Restriktions-Modifikationsgenen liegt in dem Versuch, das Endonucleasegen in einen Wirt einzubringen, der noch nicht durch Modifikation geschützt wurde. Werden das Methylasegen und das Endonucleasegen zusammen als ein einzelner Klon eingebracht, dann muss die Methylase die Wirts-DNA schützend modifizieren, bevor die Endonuclease die Gelegenheit erhält, sie zu spalten. Gelegentlich ist daher nur die sequentielle Klonierung der Gene möglich, zuerst die Methylase und dann die Endonuclease (siehe US-Patent Nr. 5,320,957).
Ein weiteres Hindernis für das Klonieren von Restriktionsmodifikationssystemen liegt in der Entdeckung, dass einige Stämme von E. coli auf eine Cytosin- oder Adenin-Modifikation ungünstig reagieren; sie besitzen Systeme, die DNA zerstören, die methyliertes Cytosin (Raleigh und Wilson, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070–9074, (1986)) oder methyliertes Adenin (Heitman und Model, J. Bact. 196:3243–3250, (1987); Raleigh, Trimarchi und Revel, Genetics, 122:279–296, (1989) Waite-Rees, et al., J. Bacteriology, 173:5207–5219 (1991)) enthält. Cytosin-spezifische oder Adenin-spezifische Methylasegene können nicht ohne weiteres in diese Stämme kloniert werden, weder alleine, noch zusammen mit ihren entsprechenden Endonucleasegenen. Um dieses Problem zu umgehen, müssen Mutantenstämme von E. coli (McrA- und McrB- oder Mrr-) verwendet werden, in denen diese Systeme defekt sind.
Ein dritte Schwierigkeit besteht möglicherweise darin, dass einige Restriktionsendonuclease- und -methylasegene aufgrund von Differenzen im Transkriptionsmechanismus des Quellorganismus und E. coli nicht in E. coli exprimieren können, wie z.B. Differenzen in Promotor- und Ribosomenbindungsstellen. Die Methylaseselektionstechnik setzt voraus, dass die Methylase in E. coli ausreichend exprimiert, um wenigstens einige der das Gen tragenden Plasmide vollständig zu schützen.
Da gereinigte Restriktionsendonucleasen und, in geringerem Maße, Modifikationsmethylasen nützliche Werkzeuge zum Charakterisieren von Genen im Labor sind, gibt es einen kommerziellen Anreiz, Stämme von Bakterien durch DNA-Rekombinationstechniken zu gewinnen, die diese Enzyme im Überfluss synthetisieren. Solche Stämme wären von Nutzen, da sie die Aufgabe der Reinigung vereinfachen und außerdem das Mittel zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen bereitstellen würden.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es wurde eine einzigartige Kombination von Verfahren angewendet, um das SwaI Endonucleasegen direkt zu klonieren und das Gen in einem E. coli Stamm zu exprimieren, der zuvor durch SwaI Methylase modifiziert wurde. Zum direkten Klonieren des SwaI Endonucleasegens wurde die N-terminale Aminosäuresequenz von hoch gereinigter nativer SwaI Restriktionsendonuclease bestimmt. Degenerierte Primer wurden auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz entworfen und PCR-Techniken wurden angewendet, um das DNA-Fragment zu amplifizieren, das die Amino-Termini des SwaI Endonucleaseproteins kodiert. Das PCR-Produkt wurde sequenziert und die Informationen wurden zum Entwerfen von Primern für inverse PCR-Reaktionen verwendet. Durch Chromosome-Walking per inverser PCR wurde das offene Endonuclease-Leseraster swaIR hergeleitet. Durch Fortsetzen der inversen PCR wurde ein offenes Leseraster neben dem Endonucleasegen gefunden. Eine Blast-Analyse ergab, dass dieses Gen eine Adeninmethylase kodierte (draIIIM).
Ein neuer Expressionsvektor, pHKUV5, wurde speziell konstruiert, um SwaI Methylase zu exprimieren. Das SwaI Endonucleasegen wurde in einen T7 Expressionsvektor geringer Kopiezahl, pHKT7, kloniert und in den E. coli Wirt transformiert, der zuvor durch in pHKUV5 klonierte SwaI Methylase modifiziert wurde. Dieser rekombinante E. coli Stamm (NEB#1183) produziert etwa 2,0 × 10⁵ Einheiten SwaI Endonuclease je Gramm Zellen. Die Ausbeute von rekombinanter SwaI Endonuclease ist 10 Mal höher als die Ausbeute von nativer Endonuclease von Staphylococcus warneri.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Genorganisation des SwaI Restriktionsmodifikationssystems. swaIR: SwaI Endonucleasegen; swaIM: SwaI Methylasegen.
2 zeigt die DNA-Sequenz des swaIR Gens (SEQ ID Nr. 1) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2).
3 zeigt die DNA-Sequenz des swaIM Gens (SEQ ID Nr. 3) und die kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 4).
4 zeigt zwei Expressionsvektoren, pHKUV5 und pHKT7.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Klonierung des SwaI Restriktionsendonucleasegens von Staphylococcus warneri erwies sich als eine Herausforderung. Man probierte eine Methylaseselektionsstrategie aus, allerdings wurden keine Methylaseexpressionsklone isoliert. Das hierin beschriebene Verfahren, mit dem die SwaI Restriktionsendonuclease in E. coli bevorzugt kloniert und exprimiert wird, umfasst die folgenden Schritte:
1. Reinigung der SwaI Restriktionsendonuclease auf fast Homogenität und N-terminale Aminosäuresequenzbestimmung
Zum Reinigen des SwaI Endonucleaseproteins wurden vier Chromatographiesäulen verwendet. Hierzu gehörten eine Heparin-Hyper-D-Säule, eine Source^TM-15Q-Säule, eine Source^TM-15S- und eine Heparin-TSK-Guardgel-Säule. Die Reinigung brachte zwei Proteinbanden von etwa 63 kDa und 28 kDa auf einem SDS-PAGE Proteingel nach einer Coomassie-Blau-Färbung hervor. Für beide Proteine wurden die N-terminalen Aminosäurereste durch sequentiellen Abbau des gereinigten Proteins auf einem automatisierten Sequenzer bestimmt. Die N-terminale Aminosäuresequenz war bei den beiden Proteinen gleich.
2. Amplifikation der 5'-Region des SwaI Endonucleasegens und anschließende Klonierung ins Plasmid
Degenerierte Primer wurden auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz entworfen und zum Amplifizieren des 5'-Endes des Endonucleasegens per PCR verwendet. PCR-Produkte wurden in das Plasmid pCAB 16 kloniert und sequenziert. Das 99 bp PCR-Fragment, das dem 5'-Ende des SwaI Endonucleasegens entsprach, wurde dann durch einen Vergleich der Aminosäuresequenzen, die von der klonierten DNA abgeleitet wurden, mit der N-terminalen Aminosäuresequenz des SwaI Endonucleaseproteins identifiziert.
3. Chromosome-Walking per inverser PCR zur Isolation der SwaI Endonuclease- und Methylasegene
Zum Klonieren des gesamten SwaI Endonucleasegens sowie seines entsprechenden DNA-Methylasegens wurden inverse PCR-Techniken angewendet, um DNA neben dem ursprünglichen 99 bp Endonucleasegenfragment zu amplifizieren (Ochman, et al., Genetics, 120:621 (1988), Triglia, et al., Nucl. Acids Res., 16:8186 (1988) und Silver und Keerikatte, J. Cell. Biochem., (Suppl.) 13E:306, Abstract No. WH239 (1989)), und die amplifizierten Produkte wurden sequenziert. Insgesamt fanden vier Runden der inversen PCR statt. An diesem Punkt wurden zwei offene Leseraster (ORF) identifiziert (1). Das 681-bp Endonucleasegen (swaIR) kodiert ein 227-Aminosäureprotein mit einer abgeleiteten Molekülmasse von 26.842, die mit der beobachteten Molekülmasse der SwaI Endonuclease übereinstimmt. Ein 1857-bp ORF, swaIM, wird neben dem swaIR Gen gefunden, orientiert in einer konvergenten Weise. Die von dem swaIM Gen abgeleitete Proteinsequenz hat mit anderen Adeninmethylasen eine signifikante Sequenzähnlichkeit gemeinsam.
4. Expression des SwaI Endonucleasegens unter Verwendung der Plasmide pHKUV5 und pHKT7
Das Zwei-Schritt-Verfahren zum Klonieren der Restriktionsmodifikationssysteme ist im US-Patent Nr. 5,320,957 beschrieben. Der erste Schritt beinhaltet das Einbringen des Methylasegens in eine Wirtszelle und Exprimieren des Gens darin, um die Wirtszelle vor dem entsprechenden Endonucleaseverdau durch vorherige Modifikation von Erkennungssequenzen zu schützen. Der zweite Schritt beinhaltet das Einbringen des Endonucleasegens in die zuvor modifizierte Wirtszelle und die anschließende Endonucleaseproduktion.
Ein neues Plasmid, pHKUV5, wurde zum Exprimieren des swaIM Gens verwendet. pHKUV5 weist einen starken, konstitutiven UV5 Promotor (P_uv5) ohne die Lac-Repressor-(LacI)-Bindungsstelle auf, so dass das Methyltransferasegen ständig auf hohem Niveau exprimiert wird (4). Darüber hinaus trägt pHKUV5 auch einen Replikationsstartpunkt hoher Kopiezahl (ColE1) und das LacI-Gen. Da sich das LacI-Gen auf einem Plasmid hoher Kopiezahl befindet, wird es hoch exprimiert. Die große Menge von LacI wird jedoch nicht die Expression des Methylasegens von P_uv5 stören, da die LacI-Bindungsstelle von dem Promotor deletiert wurde.
Das Plasmid pHKUV5 wurde vom Plasmid pUC19 konstruiert (New England Biolabs, Nr. 304). Zunächst wurden synthetische Oligonucleotide verwendet, um P_lac von pUC19 in einen stärkeren UV5-Promotor umzuwandeln, indem die –10 Sequenz von P_lac von TATGTT in konservierteres TATAAT geändert wurde (4). Zu diesem Zeitpunkt wurde die LacI-Bindungsstelle deletiert. Als nächstes wurde das LacI-Gen von einem Donor-Plasmid in pHKUV5 kloniert. Das swaIM-Gen wurde dann in das Plasmid pHKUVS5 kloniert und in E. coli Zellen transformiert. Die Wirtszellen wurden dann durch das pHKUV5-swaIM-Konstrukt völlig modifiziert.
Zum Exprimieren des SwaI Endonucleasegens wurde der Vektor pHKT7 geringer Kopiezahl verwendet (4). Das Plasmid pHKT7 enthält einen induzierbaren T7 Promotor, der durch LacI kontrolliert wird. Der Replikationsstartpunkt ist vom Plasmid p15A, das mit dem pHKUV5 Plasmid kompatibel ist. Das Grundniveau der Genexpression ist aus zwei Gründen für in pHKT7 klonierte Gene extrem niedrig. Zum Ersten wird die Expression reduziert, da sich der T7 Promotor auf einem Plasmid geringer Kopiezahl befindet. Zum Zweiten dienen hohe Niveaus des von dem Plasmid pHKUVS5 hoher Kopiezahl hergestellten LacI-Repressors auch dazu, die Expressionsniveaus gering zu halten.
Das Endonucleasegen swaIR wurde in pHKT7 kloniert und dann in E. coli ER2566 mit pHKUV5-swaIM eingebracht. Die Kultur wurde bis zur mittleren log-Phase wachsen gelassen und dann durch die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,4 mM induziert. Die Ausbeute rekombinanter SwaI Endonuclease beträgt 2,0 × 10⁵ Einheiten je Gramm Zellen, was 10 Mal höher ist als die Ausbeute von nativer Endonuclease von Staphylococcus warneri.
1. BEISPIEL
REINIGUNG DER SwaI ENDONUCLEASE UND BESTIMMUNG IHRER PROTEINSEQUENZ
1. Reinigung der SwaI Restriktionsendonuclease von Staphylococcus warneri auf fast Homogenität:
Staphylococcus warneri Zellen wurden bei 30°C vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation nach 20 Stunden Wachstum geerntet und bis zum Gebrauch bei –70°C gelagert. 451 g Zellen wurden über Nacht bei 4°C aufgetaut und dann in 1,5 l Puffer A (20 mM KPO4, 10 mM BME, 0,1 mM EDTA, 5 % Glycerol, pH 6,9) resuspendiert, der mit 50 mM NaCl und 120 mg Lysostaphin (Sigma, St. Louis, Missouri) angereichert war. Die resuspendierten Zellen wurden bei Raumtemperatur auf einer Rührplatte inkubiert. Nach acht Stunden Inkubation wurden 25 ml eines Proteaseinhibitor-Cocktails (P8465; Sigma, St. Louis, Missouri) zugegeben, die Rührplattenvorrichtung wurde zusammen mit den Zellen in einen Kühlschrank gegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 4°C gerührt. Am nächsten Morgen wurden die Zellen zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Zellen beschallt, bis etwa 3,1 % des gesamten Zellproteins freigesetzt waren, und anschließend wurden die Zellen mit einem Manton-Gaulin-Homogenisator aufgebrochen. Der Extrakt wurde 10 Minuten lang bei 4°C mit 14.000 rpm zentrifugiert.
Alle folgenden Verfahren fanden auf Eis oder bei 4°C statt. Der Überstand wurde auf eine 400 ml XK50/30 Heparin-Hyper-D-Säule (BioSepra Inc., Marlborough, MA) geladen, die mit Puffer A.1 (50 mM NaCl, 20 mM KPO₄, pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 10 mM Beta-Mercaptoethanol und 5 % Glycerol) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 800 ml Puffer A.1 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten (4 l) von 50 mM NaCl bis 1 M NaCl in Puffer A (20 mM KPO4, pH 7,0, 0,1 mM EDTA, 10 mM Beta-Mercaptoethanol und 5 % Glycerol). 25-ml-Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick auf SwaI Restriktionsaktivität mit M13mp19RF DNA untersucht; der Peak der Restriktionsenzymaktivität eluierte von der Säule zwischen 0,62 und 0,71 M NaCl und wurde gepoolt. Die Menge von SwaI Endonuclease wurde auf 11,0 × 10⁶ Einheiten geschätzt.
Dieser Heparin-Hyper-D-Pool wurde gegen 81 von 100 mM NaCl in Puffer B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0 0,1 mM EDTA, 10 mM Beta-Mercaptoethanol und 5 Glycerol, End-pH 7,8) dialysiert. Der dialysierte Pool wurde mit Puffer B auf eine Endkonzentration von 50 mM NaCl verdünnt und auf eine 90 ml Source^TM-15Q-Säule (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) aufgebracht, die in Puffer B.1 (50 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA, 10 mM Beta-Mercaptoethanol und 5 % Glycerol, End-pH 7,8) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 200 ml Puffer B1 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten (1 l) von 50 mM NaCl bis 700 mM NaCl in Puffer B. 10-ml-Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick auf SwaI Aktivität mit M13mp19RF DNA untersucht. Der Großteil der Restriktionsenzymaktivität floss durch die Säule (8,6 × 10⁶ Einheiten). Etwa 960.000 Einheiten banden sich an die Säule und wurden in den ersten 15 Fraktionen eluiert.
Die ersten fünfzehn Fraktionen wurden gepoolt und mit 0,5 Volumen von Puffer A verdünnt und auf eine 8 ml HR 10/10 Source^TM-15S FPLC-Säule (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) geladen, die mit Puffer A.1 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 ml Puffer A.1 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten (90 ml) von 50 mM NaCl bis 800 mM NaCl in Puffer A. 1,5 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick auf SwaI Aktivität mit M13mp19RF DNA untersucht. Eine sehr geringe Menge an Aktivität floss durch die Säule und mehr als 544.000 Einheiten wurden in den Fraktionen 17–19 eluiert.
Die Fraktionen 17–19 wurden kombiniert und zu 50 mM NaCl in Puffer B verdünnt. Der verdünnte Pool wurde dann auf eine 9 ml HR 10/10 Heparin 5PW TSK Guardgel-Säule (Toso Haas) geladen, die zuvor mit Puffer B1 äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 10 ml Puffer B1 gewaschen, gefolgt von einem linearen Gradienten (100 ml) von 50 mM NaCl bis 1 M NaCl in Puffer B. 1,5 ml Fraktionen wurden aufgefangen. Die Fraktionen wurden im Hinblick auf SwaI Aktivität mit M13mp19RF DNA untersucht. Der Peak der Enzymaktivität eluierte bei 0,56 M NaCl. Mehr als 200.000 Einheiten SwaI Aktivität wurden auf fast Homogenität gereinigt. 20 μl der Peakfraktionen (46 und 47) wurden auf ein SDS-PAGE Proteingel geladen und Elektrophorese unterzogen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt und es wurden zwei prominente Banden von etwa 63 kDa und 28 kDA beobachtet, die der SwaI Restriktionsendonucleaseaktivität entsprachen.
2. Bestimmung der N-terminalen Proteinsequenz der SwaI Endonuclease
Die wie beschrieben präparierte SwaI Restriktionsendonuclease wurde Elektrophorese unterzogen und gemäß dem Verfahren von Matsudaira (Matsudaira, P., J. Biol. Chem. 262:10035–10038, (1987)) mit zuvor beschriebenen Modifikationen (Looney, M., et al. Gene 80:193–208, (1989)) elektrogeblottet. Die Membran wurde mit Coomassie-Blau R-250 gefärbt und die Proteinbanden von etwa 64 kDa und 28 kDa wurden exzidiert und einem sequentiellen Abbau auf einem Gasphasen-Proteinsequenzer Modell 407A von Applied BioSystems Division, Perkin-Elmer Corporation (Foster City, Kalifornien) unterzogen (Waite-Rees, et al., J. Bacteriol. 173:5207–5219, (1991)). Die ersten 31 Reste beider kDa Proteinbanden entsprachen M-N-F-K-K-Y-E-E-N-L-V-A-S-I-E-E-V-I-Q-X-I-I-D-D-K-X-X-P-N-I-I (SEQ ID Nr. 5).
2. BEISPIEL
KLONIERUNG DER SwaI RESTRIKTIONSMODIFIKATIONSGENE
1. Reinigung genomischer DNA von Staphylococcus warneri
Zum Präparieren der genomischen DNA von Staphylococcus warneri wurden 10 g Zellen in 20 ml von 25 % Saccharose, 50 mM Tris, pH 8,0, resuspendiert und vermischt, bis die Lösung homogen war. Zehn ml 0,25M EDTA, pH 8,0, plus 6 ml frisch zubereitetes Lysozym (10 mg/ml) in 0,25M Tris-HCl (pH 8,0) wurden zugegeben und die Lösung wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Lysostaphin wurde zu den Zellen gegeben und das Gemisch wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Vierundzwanzig ml lytisches Gemisch (1 % Triton-X100, 50 mM Tris, 62 mM EDTA, pH 8,0) und 5 ml von 10 % SDS wurden dann zugegeben und die Lösung wurde vorsichtig vermischt. Die Lösung wurde mit einem Volumen von äquilibriertem Phenol/Chloroform (50:50, v/v) extrahiert und die wässrige Phase wurde gewonnen. Die wässrige Lösung wurde dann gegen 2 l 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA (vier Wechsel) dialysiert. Die dialysierte Lösung wurde mit RNase A (100 μg/ml) 1 Stunde lang bei 37°C verdaut. Die DNA wurde durch die Zugabe von 1/10 Volumen 5 M NaCl und 0,55 Volumen 2-Propanol präzipitiert und auf einen Glasstab gespult. Die DNA wurde an der Luft getrocknet und in 5 ml TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) auf eine Konzentration von etwa 655 μl/ml gelöst und bei 4°C gelagert.
2. Klonierung der 5' Region des SwaI Endonucleasegens in pCAB16
pCAB16 wurde mit BsaAI durch einstündiges Inkubieren des Vektors bei 37°C unter den nachfolgend beschriebenen Bedingungen verdaut.

120 μl pCAB 16 (6 – 12 μg)
10 μl BsaAI (50 U)
40 μl 10X NEB Puffer Nr.3
230 μl dH₂O

BsaAI wurde in der Reaktion durch Hitze zerstört, indem 15 Minuten lang bei 75°C inkubiert wurde. Der Vektor wurde dann durch einstündiges Inkubieren von 100 μl (2 μg) verdautem Vektor mit 1 Einheit alkalischer Shrimp-Phosphatase in 100 mM MgCl₂ bei 37°C dephosphoryliert.
Degenerierte Primer wurden auf der Basis der folgenden Aminosäuresequenzen entworfen, die von der N-terminalen SwaI Proteinsequenz stammten: 1) N-F-K-K-Y-E-E (SEQ ID Nr. 6) und 2) I-I-G-K-T. Sie wurden so gestaltet, dass sie in konvergenter Weise mit DNA um das 5' Ende des SwaI Endonucleasegens hybridisierten.
Primer 1 5' AAYTTYAARAARTAYGARGAG 3'
(SEQ ID NO:7)
Primer 2 5' NGTYTTNCCDATDAT 3'
(SEQ ID NO:8)
Diese Primer wurden synthetisiert und jeweils durch 30-minütiges Inkubieren von 10 μg Primer mit 100 Einheiten T4 Polynucleotidkinase, 20 μl 10X T4 Polynucleotidkinasepuffer und 10 μl 10 mM ATP in einem 200-μl-Reaktionsvolumen bei 37°C einer Kinasebehandlung unterzogen. Die Kinase wurde durch 10-minütiges Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 65°C hitzeinaktiviert.
In der Reaktion, die das Produkt erfolgreich amplifizierte, wurde ein Reaktionsgemisch durch Kombinieren der folgenden Bestandteile hergestellt:

150 μl Taq PCR-Puffer (kein Magnesium)
15 μl von 20 mM dNTP-Lösung
75 μl kinasebehandelter Primer 1 (3,75 μg)
75 μl kinasebehandelter Primer 2 (3,75 μg)
15 μl von 1 M MgCl₂
22,5 μl gereinigte bakterielle DNA-Matrize (~15 μg)
1140 μl dH₂O
7 μl (35 Einheiten) Taq DNA Polymerase

Die PCR-Amplifikationsbedingungen waren: 35 Zyklen bei 94°C, 30 Sekunden lang, bei 35°C, 30 Sekunden lang, und bei 72°C, 20 Sekunden lang. 7,5 μl Klenow (35 Einheiten, NEB Nr. 212) wurden nach der PCR zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann 20 Minuten lang bei 75°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit Ethanol präzipitiert und das endgültige DNA-Pellet wurde in 60 μl dH₂O resuspendiert. Das resuspendierte Reaktionsgemisch wurde auf einem leicht schmelzbaren 3%igen Agarosegel (NuSieve Agarose, FMC BioProducts, Rockland, ME) in TAE Puffer (40 mM Tris-Acetat, pH 8,1 mM EDTA) Elektrophorese unterzogen. Die 99 bp DNA-Bande wurde exzidiert und die Gelscheibe wurde 10 Minuten lang bei 65°C inkubiert. Die Temperatur wurde dann auf 40°C reduziert. Zwei μl Beta-Agarase (2 Einheiten) wurden zugegeben und die Inkubation wurde eine Stunde lang bei 40°C fortgesetzt. Anschließend fand eine Ligation durch Kombinieren der folgenden Bestandteile bei 37°C statt:

3 μl präpariertes pCAB16 (50 ng)
5 μl PCR-Produkt (50 ng)
2,5 μl 10X T4 DNA Ligasepuffer
1 μl konzentrierte T4 DNA-Ligase (2000 Einheiten)
13,5 μl dH₂O

Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei 37°C und dann eine Stunde lang bei 25°C inkubiert. Anschließend wurde es in einen Eiskübel gegeben, der mit Wasser und Eis gefüllt war und sich im Kühlschrank befand. Das Reaktionsgemisch wurde so über Nacht inkubiert. Zehn μl des Übernacht-Ligationsreaktionsgemischs wurden in 100 μl kompetente Zellen (cat.# L2011, Promega, Madison, WI) durch Kombinieren von DNA und Zellen und 10-minütiges Inkubieren auf Eis, gefolgt von 45 Sekunden bei 42°C, transformiert. Das gesamte Volumen wurde auf eine Ampicillin-LB-Platte plattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Wachsende Kolonien wurden im Hinblick auf das korrekte Plasmidkonstrukt durch Reinigen der Plasmid-DNA mit dem Qiagen QIAprep Spin Plasmid Kit und Verdauen mit AseI begutachtet, um zu sehen, ob das PCR-Produkt in den Vektor kloniert war.

5 μl Miniprep
1,5 μl 10X NEB Nr.3
0,5 μl AseI
8 μl dH₂O

Das obige Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Minipreps, die das Insert korrekter Größe enthielten, wurden sequenziert. Die DNA-Sequenz wurde in sechs Leseraster translatiert, um zu prüfen, ob die abgeleitete Aminosäuresequenz mit der N-terminalen Sequenz des SwaI Proteins übereinstimmte.
3. Chromosome-Walking über inverse PCR zur Isolation der SwaI Endonuclease- und Methylasegene

A) Genomische DNA präparieren – Vier Matrizen wurden für vier aufeinander folgende inverse PCR-Reaktionen präpariert; Sau3AI, RsaI, BstyI und DraI. Im Falle von Sau3AI wurden 1,5 μg bakterielle DNA mit 100 Einheiten Sau3AI Restriktionsendonuclease in 1X Sau3AI-Puffer, der mit BSA auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml angereichert war, in einem 50-μl-Reaktionsvolumen verdaut. Im Falle von RsaI wurden 1,5 μg bakterielle DNA mit 50 Einheiten RsaI Restriktionsendonuclease in 1X NEB Puffer 1 in einem 50-μl-Reaktionsvolumen verdaut. Die BstyI-Matrize wurde durch Verdauen von 1,5 μg bakterieller DNA mit 50 Einheiten BstyI Restriktionsendonuclease in 1X BstyI-Puffer, der mit BSA auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml angereichert war, in einem 50-μl-Reaktionsvolumen präpariert. Schließlich wurde die DraI-Matrize durch Verdauen von 1,5 μg bakterieller DNA in 1X NEB Puffer 4 mit 100 Einheiten DraI Restriktionsendonuclease in einem 50-μl-Reaktionsvolumen präpariert. Alle vier Reaktionsgemische wurden bei optimalen Temperaturen eine Stunde lang inkubiert. Die Verdaus wurden bestätigt, indem 13 μl des Verdaureaktionsgemischs auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen wurden. Die Reaktionsgemische wurden dann durch 20-minütiges Inkubieren bei 70°C mit Hitze zerstört. Die Zirkularisierung wurde dann durch Inkubieren der restlichen 37 μl(~ 1 μg) in 1X T4 DNA-Ligasepuffer mit 3000 Einheiten T4 DNA-Ligase in einem 500-μl-Reaktionsvolumen über Nacht bei 16°C erreicht. Ein Teil dieses Zirkularisierungs-Ligationsreaktionsgemischs wurde dann als Matrize für nachfolgende inverse PCR-Reaktionen verwendet.
B) Inverse PCR mit Sau3AI – Inverse PCR-Primer wurden auf der Basis der DNA-Sequenz des SwaI Endonucleasegenstücks synthetisiert, das in pCAB 16 kloniert wurde: 5' TTCTTCAATAGATGCTACTAG 3' (194-24) (SEQ ID NO:9) 5' GTTATTCAACGCATTATAGA 3' (194-25) (SEQ ID NO:10) Eine inverse PCR wurde mit den Primern 194-24 und 194-25 und der oben erwähnten Sau3AI DNA-Matrize durchgeführt. Ein Produkt von etwa 850 bp wurde in der Sau3AI-zirkuläre-Matrizen-PCR-Reaktion produziert. Dieses Produkt wurde gelgereinigt und in 30 μl dH₂O resuspendiert. Das PCR-Produkt wurde dann mit einem automatisierten Sequenzierungssystem ABI373 gemäß Herstelleranweisungen sequenziert. Die obigen PCR-Primer wurden als Sequenzierungsprimer verwendet. Das Sau3AI inverse PCR-Produkt enthielt etwa 640 bp des SwaI ORF.
C. Inverse PCR-Reaktion mit RsaI – Zwei inverse PCR-Primer, die komplementär zur neu gelesenen Endonuclease-ORF-Sequenz von dem Sau3AI-PCR-Produkt waren, wurden anschließend wie nachfolgend aufgeführt synthetisiert und in einer inversen PCR-Reaktion verwendet. Matrizenpräparation, inverse PCR, Reinigung und DNA-Sequenzierung wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde die RsaI-Ligation zur Erzeugung der Matrize anstelle der Sau3AI-Ligation verwendet. Ein 1,1 Kb PCR-Produkt wurde generiert und sequenziert. Die Daten zeigten die restliche Endonuclease-ORF-Sequenz und einen Teil der swaIM DNA-Sequenz. 5' CACATTTAGAACTAGAGAAGAA 3' (195-5) (SEQ ID NO:11) 5 GGTTCTGCTGCAATATTAACTTG 3' (195-6) (SEQ ID NO:12)
D. Inverse PCR-Reaktion mit BstYI – Zwei inverse PCR-Primer, die komplementär zur neu gelesenen Sequenz vom RsaI PCR-Produkt waren, wurden dann wie nachfolgend aufgeführt synthetisiert und in einer inversen PCR-Reaktion verwendet. Matrizenpräparation, inverse PCR, Reinigung und DNA-Sequenzierung wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde die BstYI-Ligation als inverse PCR-Matrize verwendet. Ein 1,7 Kb PCR-Produkt wurde generiert und sequenziert. Die neue 858-bp-Sequenz zeigte den größeren Teil des swaIM-Gens. 5' TAATCTTTAACGAAGGAAGATTCC 3' (196-39) (SEQ ID NO:13) TAAACCAGAAACGGATTTTCAC 3' (196-40) (SEQ ID NO:14)
E. Inverse PCR-Reaktion mit DraI – Zwei inverse PCR-Primer, die komplementär zur neu gelesenen Sequenz des BstyI PCR-Produkts waren, wurden anschließend wie nachfolgend aufgeführt synthetisiert und in einer inversen PCR-Reaktion verwendet. Matrizenpräparation, inverse PCR, Reinigung und DNA-Sequenzierung wurden wie oben durchgeführt, allerdings wurde die DraI-Ligation in der inversen PCR-Reaktion verwendet. Ein 2,0 Kb PCR-Produkt wurde generiert und sequenziert. Die neue Sequenz zeigte den Rest des swaIM Gens. 5' GGTATAAAATCATAATTTCGTATTA 3' (196-178) (SEQ ID NO:15) 5' TAAAAACGTAAAAAATGGAAAA 3' (197-31) (SEQ ID NO:16)

3. BEISPIEL
EXPRESSION DER SwaI RESTRIKTIONSENDONUCLEASE
1. Klonierung der SwaI Methylase auf einem kompatiblen Vektor
Das SwaI Methylasegen (swaIM) wurde durch Einfügen des Gens in einen Expressionsvektor, pHKUV5, direkt unterhalb des starken UV5 Promotors exprimiert. Um dies zu erreichen, wurden zwei Oligonucleotidprimer mit den DNA-Sequenzdaten synthetisiert. Der Oligonucleotid-Vorwärtsprimer enthielt einen PstI Ort zur Erleichterung der Klonierung, ein Stoppcodon in-frame mit dem lacZ-Gen zur Beendung der Translation des lacZ-Proteins, eine Ribosomenbindungsstelle (RBS) und 24 Nucleotide, die komplementär zur Staphylococcus warneri DNA waren, zur Hybridisierung:
5'-AAAACTGCAGATAAGGAGGTGATCGTATGAAAAATTATAATTTAATAGAC-3'
(198-140) (SEQ ID NO:17)
Der Rückwärtsprimer wurde so gestaltet, dass er mit Staphylococcus warneri DNA am 3' Ende des SwaI Gens hybridisierte. Er enthielt einen BamHI Restriktionsort zur Erleichterung der Klonierung und einen SwaI Ort, der zum Testen der In-vivo-SwaI-Methylaseaktivität verwendet wurde.
5'-CGCGGATCCATTTAAATCTAATTTGAATTAATATAGTTTTTA-3'
(198-132) (SEQ ID NO:18)
Diese beiden Primer wurden zum Amplifizieren des swaIM Gens von genomischer Staphylococcus warneri DNA durch Kombinieren der folgenden Bestandteile verwendet:

10 μl 10X Vent^® ThermoPol-Puffer
10 μl 2 mM dNTPs
0,5 μl (300 ng) genomische Staphylococcus warneri DNA
1 μl Primer 198-140 (75 ng)
1 μl Primer 198-132 (75 ng)
75,5 μl dH₂O
1 μl (0,1 Einheiten) Deep Vent^® Polymerase
1 μl Taq DNA-Polymerase (5 Einheiten)

5 μl präpariertes pHKUV5 (100 ng)
5 μl Methylase-PCR-Produkt (500 ng)
5 μl 10X T4 DNA Ligase-Puffer
2 μl T4 DNA Ligase (800 Einheiten)
33 μl dH₂O

Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert und 10 μl des Ligationsreaktionsgemischs wurden in den E. coli Stamm ER2566 transformiert. Individuelle Kolonien wurden isoliert und durch den Verdau von Minipreps mit den Klonierungsenzymen analysiert, um zu gewährleisten, dass das Methylasegen tatsächlich in den Vektor kloniert wurde:

7 μl Miniprep
1,5 μl 10X BamHI Puffer
1,5 μl 1 mg/ml BSA
0,5 μl PstI (10 U)
0,5 μl BamHI (10 U)
4 μl dH₂O

Die Verdaus wurden eine Stunde lang bei 37°C inkubiert.
Die Minipreps, die das korrekte Konstrukt waren, wurden dann mit SwaI verdaut, um hinsichtlich eines Methylaseschutzes zu prüfen:

7 μl Miniprep
1,5 μl 10X NEBuffer 3
1,5 μl 1 mg/ml BSA
1 μl SwaI (10 U)
4,5 μl dH₂O

Die Verdaus wurden eine Stunde lang bei 25°C inkubiert. Ein μl eines Klons, der gegenüber SwaI Verdau resistent war, wurde zur Herstellung von calciumchloridkompetenten Zellen in ER2566 Zellen transformiert.
2. Klonierung und Expression des SwaI Endonucleasegens
Das SwaI Endonucleasegen (swaIR) wurde durch Einfügen des Gens in einen Expressionsvektor, pHKT7, direkt unterhalb eines starken induzierbaren T7 Promotors und einer konservierten Ribosomenbindungsstelle (RBS) exprimiert. Um dies zu erreichen, wurden zwei Oligonucleotidprimer mit den DNA-Sequenzdaten synthetisiert. Der Oligonucleotid-Vorwärtsprimer enthielt einen BamHI Ort zur Erleichterung der Klonierung, ein ATG Startcodon des SwaI Endonucleasegens und 24 Nucleotide, die komplementär zu Staphylococcus warneri DNA waren, zur Hybridisierung:
5'-CGCGGATCCTAAGGAGGTGATCATATGAACTTTAAAAAATACGAAGAA-3'
(195-152) (SEQ ID NO:19)
Der Rückwärtsprimer wurde so gestaltet, dass er mit Staphylococcus warneri DNA am 3' Ende des swaIR Gens hybridisierte. Er enthielt einen XhoI Restriktionsort zur Erleichterung der Klonierung.
5'-GCATCTCGAGTTAAATTGAGTTGTCATTAGAAT-3'
(195-153) (SEQ ID NO:20)
Diese beiden Primer wurden zum Amplifizieren des swaIR Gens von genomischer Staphylococcus warneri DNA durch Kombinieren der folgenden Bestandteile verwendet:

30 μl 10X Taq PCR-Puffer (mit 1,5 mM Mg++)
30 μl 2 mM dNTPs
0,75 μl (450 ng) genomische Staphylococcus warneri DNA
3 μl Primer 195-152 (225 ng)
3 μl Primer 195-153 (225 ng)
227,5 μl dH₂O
3 μl (0,3 Einheiten) Deep Vent^® Polymerase
3 μl Taq DNA-Polymerase (15 Einheiten)

9,0 μl präpariertes pHKT7 (100 ng)
7 μl Endonuclease-PCR-Produkt (70 ng)
5 μl 10X T4 DNA Ligase-Puffer
2 μl T4 DNA Ligase (800 Einheiten)
27 μl dH₂O

Das Reaktionsgemisch wurde eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Zehn μl der Ligationsreaktion wurden in den E. coli Stamm ER2566 transformiert, der zuvor mit dem SwaI Methylasegen modifiziert worden war. Transformanten wurden analysiert und alle enthielten das swaIR Gen. Dieses Plasmidkonstrukt, pHKT7-swaIR, wurde zur Herstellung der SwaI-Endonuclease ausgewählt. Der E. coli Stamm, der sowohl pHKT7-swaIR als auch PHKUV5-swaIM Plasmide enthielt, wurde NEB#1183 genannt. Die Ausbeute von rekombinantem SwaI vom Stamm NEB Nr. 1183 lag bei etwa 2,0 × 10⁵ Einheiten/Gramm Zellen.
3. Herstellung der rekombinanten SwaI Restriktionsendonuclease von E. coli ER2566 NEB Nr. 1183
E. coli ER2566 NEB Nr. 1183 wurde bis zur mittleren log-Phase in einem Fermentor wachsen gelassen, der L-Broth-Medium mit Ampicillin (100 μg/ml) und Chloramphenicol (50 μg/ml) enthielt. Die Kultur wurde durch die Zugabe von IPTG auf eine Endkonzentration von 0,4 mM induziert und 16 Stunden lang weiter wachsen gelassen. Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet und können bei –70°C gelagert oder sofort verwendet werden.
Die Reinigung der SwaI Restriktionsendonuclease von E. coli NEB Nr. 1183 kann durch eine Kombination von standardmäßigen Proteinreinigungstechniken erreicht werden, wie Affinitätschromatographie oder Ionenaustauschchromatographie, wie im 1. Beispiel oben dargelegt ist. Die aus dieser Reinigung hervorgehende SwaI Restriktionsendonuclease ist im Wesentlichen rein und frei von unspezifischer Endonuclease- und Exonucleaseverunreinigung.
Eine Probe von E. coli ER2566 NEB Nr. 1183, die sowohl pHKUV5-swaIM als auch PHKT7-swaIR Plasmide enthält, wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags am 23. April 1999 mit der ATCC Beitritts-NR. 207227 bei der Amerikanischen Typus-Kultursammlung hinterlegt.

Claims

Isoliertes DNA-Segment, das die SwaI Restriktionsendonuclease kodiert, wobei das isolierte DNA-Segment von einem Plasmid erhältlich ist, das in ATCC Nr. 207227 enthalten ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, in den ein DNA-Segment nach Anspruch 1, das die SwaI Restriktionsendonclease kodiert, eingefügt wurde.
Isoliertes DNA-Segment, das die SwaI Methylase kodiert, wobei die isolierte DNA-Segment von einem Plasmid erhältlich ist, das in ATCC Nr. 207227 enthalten ist.
Rekombinanter DNA-Vektor, der das isolierte DNA-Segment aus Anspruch 3 umfasst.
Wirtszelle, die die Vektoren der Ansprüche 2 und 4 enthält.
Verfahren zur Herstellung der SwaI Restriktionsendonuclease, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle, die mit dem Vektor aus den Ansprüchen 2 und 4 transformiert wurde, unter Bedingungen zur Expression, der genannten Endonuclease.