JP4485644B2

JP4485644B2 - ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニングおよび精製のための方法

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Publication number: JP4485644B2
Application number: JP2000108834A
Authority: JP
Inventors: ホイミン・コン; ローレン・エス・ヒギンズ; マイケル・エイ・ドルトン
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブズ・インコーポレイテツド
Priority date: 1999-04-27
Filing date: 2000-04-11
Publication date: 2010-06-23
Anticipated expiration: 2020-04-11
Also published as: EP1048731A2; EP1048731B1; JP2000316589A; DE60022814D1; US6245545B1; EP1048731A3; DE60022814T2

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ、ならびに該組換えＤＮＡからのＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造に関する。ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼ（米国特許第５，１５８，８７８号）は元々はスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）から単離された。それは、ＤＮＡ配列５’ＡＴＴＴＡＡＡＴ３’を認識し、該認識配列の２番目のＡの５’側のホスホジエステル結合を切断して平滑末端を与える。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、細菌中に天然に存在する酵素のクラスである。それらが他の細菌タンパク質から精製されている場合には、分子クローニングおよび遺伝子の特徴づけのための厳密な断片にＤＮＡ分子を切断するために、これらの制限エンドヌクレアーゼを実験室内で使用することができる。
【０００３】
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子に沿ったヌクレオチドの特定の配列（「認識配列」）を認識しそれに結合することにより作用する。それらは、一旦結合すると、該ＤＮＡ分子を特定の位置で切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは、異なる認識配列に対する親和性を有する。これまでに３０００を超えるエンドヌクレアーゼが特徴づけられており、それらは、２１２個の異なる制限配列を認識する（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｊ．，Ｍａｃｅｌｉｓ，Ｄ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２６：３３８−３５０（１９９８））。
【０００４】
制限エンドヌクレアーゼは、自然界において、細菌細胞の繁殖における防御的な役割を果たすと考えられている。制限エンドヌクレアーゼは、細菌がバクテリオファージ、プラスミドなどの外来ＤＮＡ分子による感染に抵抗することを可能にし、もしそれが無ければ、細菌は該外来ＤＮＡ分子に破壊されるか寄生されるであろう。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が見出されるたびに侵入性外来ＤＮＡ分子を切断することにより抵抗性を付与する。生じる切断は、該感染遺伝子の多数を不能にし、該ＤＮＡを非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解に対して感受性にする。
【０００５】
細菌防御系のもう１つの成分は修飾メチラーゼである。この酵素は、制限エンドヌクレアーゼを補完するものであり、細菌がそれ自身のＤＮＡを保護しそれを外来感染性ＤＮＡから識別するのを可能にする手段を与える。修飾メチラーゼは、対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ認識配列を認識しそれに結合するが、該ＤＮＡを切断することなく、メチル基の付加により該配列内の標的ヌクレオチドを化学修飾する。メチル化後にはもはや、該認識配列は該制限エンドヌクレアーゼに切断されることはない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性により常に完全に修飾される。したがって、それは、内在性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に不感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識および切断に対して感受性なのは、未修飾であり従って識別されうる外来ＤＮＡだけである。
【０００６】
遺伝子操作技術の出現に伴い、現在では、遺伝子をクローニングしたり、それがコードするタンパク質を、通常の精製技術で得られるより大量に生産することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離する際に鍵となるのは、複雑な「ライブラリー」（すなわち、「ショットガン」法により誘導されるクローンの集団）内の該クローンを、それが１０^−３〜１０^−４の頻度でしか存在しない場合に同定するための簡便かつ信頼しうる方法を開発することである。好ましくは、望ましくない大部分のクローンが破壊され、望ましい希少クローンが生存するように、そのような方法は選択的であるべきである。
【０００７】
ＩＩ型制限−修飾系は、頻度の増加を伴いながらクローニングされている。クローニングされた最初の系では、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージの感染が用いられた（ＥｃｏＲＩＩ：Ｋｏｓｙｋｈら，Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ１７８：７１７−７１９（１９８０）；ＨｈａＩＩ：Ｍａｎｎら，Ｇｅｎｅ３：９７−１１２（１９７８）；ＰｓｔＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：１５０３−１５０７（１９８１））。細菌内の制限−修飾系の存在により該細菌はバクテリオファージによる感染に抵抗することができるため、クローン化制限−修飾遺伝子を保持する細胞は、原則として、ファージにさらされたライブラリーから生存体として選択的に単離することができる。しかしながら、この方法は、限られた価値しか有していないことが判明している。特に、クローン化制限−修飾遺伝子は、選択的な生存性を付与するのに十分なファージ抵抗性を常に現すわけではないことが判明している。
【０００８】
もう１つのクローニングアプローチは、プラスミドを保持することが初めに確認された系を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クローニングプラスミド内に導入することを含むものである（ＥｃｏＲＶ：Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１２：３６５９−３６７６（１９８４）；ＰａｅＲ７：ＧｉｎｇｅｒａｓおよびＢｒｏｏｋｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：４０２−４０６（１９８３）；ＴｈｅｒｉａｕｌｔおよびＲｏｙ，Ｇｅｎｅ１９：３５５−３５９（１９８２）；ＰｖｕＩＩ：Ｂｌｕｍｅｎｔｈａｌら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４：５０１−５０９（１９８５））。
【０００９】
ますます多数の系のクローニングに用いられているもう１つのアプローチは、活性メチラーゼ遺伝子に関する選択を含むものである（例えば、米国特許第５，２００，３３３号およびＢｓｕＲＩ：Ｋｉｓｓら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１３：６４０３−６４２１（１９８５）を参照されたい）。制限遺伝子および修飾遺伝子はしばしば密接に連鎖しているため、両遺伝子は同時にクローニングできることが多い。しかしながら、この選択は、完全な制限系を常に与えるわけではなく、むしろメチラーゼ遺伝子のみを与えるにすぎない（ＢｓｐＲＩ：Ｓｚｏｍｏｌａｎｙｉら，Ｇｅｎｅ１０：２１９−２２５（１９８０）；ＢｃｎＩ：Ｊａｎｕｌａｉｔｉｓら，Ｇｅｎｅ２０：１９７−２０４（１９８２）；ＢｓｕＲＩ：ＫｉｓｓおよびＢａｌｄａｕｆ，Ｇｅｎｅ２１：１１１−１１９（１９８３）；およびＭｓｐＩ：Ｗａｌｄｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：１２３５−１２４１（１９８３））。
【００１０】
メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするためのもう１つの方法は、ＤＮＡ損傷に関する比色アッセイに基づくものである（米国特許第５，４９２，８２３号を参照されたい）。メチラーゼに関するスクリーニングの場合には、該プラスミドライブラリーをＡＰ１−２００などの宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内に形質転換する。メチラーゼの発現は、ＭｃｒＡ^＋、ＭｃｒＢＣ^＋またはＭｒｒ^＋である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内でＳＯＳ応答反応を誘導するであろう。ＡＰ１−２００株は、ＭｃｒおよびＭｒｒ系に関して温度感受性であり、損傷で誘導されうる大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｄｉｎＤ遺伝子座と融合したｌａｃ−Ｚ遺伝子を含む。メチラーゼ遺伝子またはエンドヌクレアーゼ遺伝子をコードする組換えプラスミドの検出は、ｌａｃＺ遺伝子の制限温度での誘導に基づく。メチラーゼ遺伝子をコードする形質転換体は、Ｘ−ｇａｌを含有するＬＢ寒天プレート上で青色コロニーとして検出される（Ｐｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：１８３１−１８３５（１９９１）およびＰｉｅｋａｒｏｗｉｃｚら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ１７３：１５０−１５５（１９９１））。同様に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ１９９２は、ｄｉｎＤ１−ＬａｃＺ融合体を含有するが、メチル化依存性制限系ＭｃｒＡ、ＭｃｒＢＣおよびＭｒｒを欠いている。この系（「エンドブルー（ｅｎｄｏ−ｂｌｕｅ）」法と称される）では、エンドヌクレアーゼが宿主細胞ＤＮＡを損傷してＳＯＳ応答を誘導する場合、該エンドヌクレアーゼ遺伝子は、その対応（ｃｏｇｎａｔｅ）メチラーゼの不存在下で検出されうる。ＳＯＳにより誘導された細胞は、Ｘ−ｇａｌで補足されたＬＢ寒天プレート上に濃青色のコロニーを形成する（Ｘｕら，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２２：２３９９−２４０３（１９９４））。
【００１１】
直接的メチラーゼ選択方法は、種々の障害のため、メチラーゼ（および／またはエンドヌクレアーゼ）クローンを産生しないことがある。例えば、Ｌｕｎｎｅｎら，Ｇｅｎｅ，７４（１）：２５−３２（１９８８）を参照されたい。制限−修飾遺伝子をクローニングする場合の１つの考えられる障害は、修飾による保護が未だなされていない宿主内にエンドヌクレアーゼ遺伝子の導入を試みることにある。メチラーゼ遺伝子およびエンドヌクレアーゼ遺伝子を単一のクローンとして一緒に導入する場合には、エンドヌクレアーゼが宿主ＤＮＡを切断する機会を得る前に、メチラーゼが宿主ＤＮＡを保護的に修飾しなければならない。したがって、場合によっては、まずメチラーゼ、ついでエンドヌクレアーゼというように該遺伝子を順次クローニングすることだけが可能かもしれない（米国特許第５，３２０，９５７号を参照されたい）。
【００１２】
制限−修飾系をクローニングする場合のもう１つの障害は、いくつかの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株が、シトシンまたはアデニンの修飾とは逆の反応をすることが認められていることにある。それらは、メチル化シトシン（ＲａｌｅｉｇｈおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ８３：９０７０−９０７４（１９８６））またはメチル化アデニン（ＨｅｉｔｍａｎおよびＭｏｄｅｌ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１９６：３２４３−３２５０（１９８７）；Ｒａｌｅｉｇｈ，ＴｒｉｍａｒｃｈｉおよびＲｅｖｅｌ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２２：２７９−２９６（１９８９），Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７３：５２０７−５２１９（１９９１））を含有するＤＮＡを破壊する系を有する。シトシン特異的またはアデニン特異的なメチラーゼ遺伝子を、それら単独で又はそれらの対応エンドヌクレアーゼ遺伝子と共にこれらの株内に容易にクローニングすることはできない。この問題を避けるためには、これらの系が欠損している大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株（ＭｃｒＡ⁻およびＭｃｒＢ⁻またはＭｒｒ⁻）を使用する必要がある。
【００１３】
もう１つの考えられる問題は、起源生物と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）とで転写装置（例えば、プロモーターおよびリボソーム結合部位）が異なるため、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子およびメチラーゼ遺伝子が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されない可能性があることである。メチラーゼ選択技術においては、該メチラーゼが、該遺伝子を保持するプラスミドの少なくともいくつかを完全に保護するのに十分な程度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内で発現されることが必要である。
【００１４】
精製された制限エンドヌクレアーゼは、およびそれより低度ではあるが修飾メチラーゼは、実験室内で遺伝子を特徴づけるための有用な手段であるため、これらの酵素を大量に合成する細菌株を組換えＤＮＡ技術により得ることが商業的に要請されている。そのような株は、精製作業を単純化し、商業的に有用な量で製造する手段を提供するため、有用であろう。
【００１５】
（発明の概要）
ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングし、ＳｗａＩメチラーゼにより予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株内で該遺伝子を発現させるために、独特の組合せの方法を用いた。ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接的にクローニングするために、高度に精製された天然ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端アミノ酸配列を決定した。該Ｎ末端アミノ酸配列に基づき縮重プライマーを設計し、ＳｗａＩエンドヌクレアーゼタンパク質のアミノ末端をコードするＤＮＡ断片を増幅するためにＰＣＲ技術を用いた。該ＰＣＲ産物を配列決定し、該情報を用いて逆ＰＣＲ反応用のプライマーを設計した。逆ＰＣＲによる染色体歩行により、該エンドヌクレアーゼのオープンリーディングフレーム（ｓｗａＩＲ）を推定した。逆ＰＣＲを継続することにより、該エンドヌクレアーゼ遺伝子に隣接したオープンリーディングフレームを見出した。Ｂｌａｓｔ分析は、この遺伝子がアデニンメチラーゼ（ｄｒａＩＩＩＭ）をコードしていることを示唆した。
【００１６】
新規発現ベクターｐＨＫＵＶ５を、ＳｗａＩメチラーゼを発現するように特別に操作した。ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、低コピー数Ｔ７発現ベクターｐＨＫＴ７内にクローニングし、ｐＨＫＵＶ５内にクローニングされたＳｗａＩメチラーゼにより予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主内に形質転換した。この組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（ＮＥＢ＃１１８３）は、細胞１ｇ当たり約２．０×１０^５単位のＳｗａＩエンドヌクレアーゼを産生する。組換えＳｗａＩエンドヌクレアーゼの収量は、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）由来の天然エンドヌクレアーゼの収量より１０倍高い。
【００１７】
（発明の詳細な記載）
スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）からのＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングは挑戦しがいのあることだと分かった。メチラーゼ選択法を試したが、メチラーゼ発現クローンは単離されなかった。好ましくはＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でクローニングし発現させる本明細書に記載の方法においては、以下の工程を行なう。
【００１８】
１．ほぼ均一な状態へのＳｗａＩエンドヌクレアーゼの精製およびＮ末端アミノ酸配列の決定
ＳｗａＩエンドヌクレアーゼタンパク質を精製するために、４個のクロマトグラフィーカラムを使用した。それらには、ＨｅｐａｒｉｎＨｙｐｅｒ−Ｄカラム、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）−１５Ｑカラム、Ｓｏｕｒｃｅ（登録商標）−１５ＳおよびＨｅｐａｒｉｎＴＳＫ−Ｇｕａｒｄｇｅｌカラムが含まれた。該精製は、クーマシーブルー染色後にＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上に約６３ｋＤａおよび２８ｋＤａの２つのタンパク質バンドを与えた。両方のタンパク質に関して、自動シークエンサー上での該精製タンパク質の連続的分解によりＮ末端アミノ酸残基を決定した。両方のタンパク質のＮ末端アミノ酸配列は同一であった。
【００１９】
２．ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域の増幅およびそれに続くプラスミド内へのクローニング
Ｎ末端アミノ酸配列に基づき縮重プライマーを設計し、これらのプライマーを使用して、該エンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端をＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物をプラスミドｐＣＡＢ１６内にクローニングし、配列決定した。ついでＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端に対応する９９ｂｐのＰＣＲ断片を、該クローン化ＤＮＡから推定したアミノ酸配列と該ＳｗａＩエンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列とを比較することにより同定した。
【００２０】
３．ＳｗａＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を単離するための逆ＰＣＲによる染色体歩行
全ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子およびその対応ＤＮＡメチラーゼ遺伝子をクローニングするために、逆ＰＣＲ技術を採用して、元の９９ｂｐのエンドヌクレアーゼ遺伝子断片に隣接するＤＮＡを増幅し（Ｏｃｈｍａｎら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１２０：６２１（１９８８），Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１６：８１８６（１９８８）ならびにＳｉｌｖｅｒおよびＫｅｅｒｉｋａｔｔｅ，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，（Ｓｕｐｐｌ．）１３Ｅ：３０６，ＡｂｓｔｒａｃｔＮｏ．ＷＨ２３９（１９８９））、該増幅産物を配列決定した。合計４ラウンドの逆ＰＣＲを行なった。その時点で、２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定した（図１）。６８１ｂｐのエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｓｗａＩＲ）は、２６，８４２の推定分子量（これは、観察されたＳｗａＩエンドヌクレアーゼの分子量に合致する）を有する２２７アミノ酸のタンパク質をコードしている。１８５７ｂｐのＯＲＦ（ｓｗａＩＭ）は、ｓｗａＩＲ遺伝子に隣接して見出され、収束的に配向している。ｓｗａＩＭ遺伝子から推定したタンパク質配列は、他のアデニンメチラーゼに対する有意な配列類似性を共有している。
【００２１】
４．ｐＨＫＵＶ５およびｐＨＫＴ７プラスミドを使用するＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現
制限−修飾系をクローニングするための２工程法は米国特許第５，３２０，９５７号に記載されている。第１工程は、該メチラーゼ遺伝子を宿主細胞内に導入し、該細胞内で該遺伝子を発現させて、認識配列を予め修飾することにより対応するエンドヌクレアーゼ消化から該宿主細胞を防御することを含む。第２工程は、予め修飾された宿主細胞内に該エンドヌクレアーゼ遺伝子を導入し、ついでエンドヌクレアーゼを産生させることことを含む。
【００２２】
ｓｗａＩＭ遺伝子を発現させるために、新規プラスミドｐＨＫＵＶ５を使用した。ｐＨＫＵＶ５は、Ｌａｃリプレッサー（ＬａｃＩ）結合部位を有さない強力な構成的ＵＶ５プロモーター（Ｐ_ＵＶ５）により特徴づけられ、その結果、メチルトランスフェラーゼ遺伝子が高レベルで連続的に発現されることとなる（図４）。さらに、ｐＨＫＵＶ５はまた、高コピー数の複製起点（ＣｏｌＥ１）およびＬａｃＩ遺伝子を保持する。ＬａｃＩ遺伝子は高コピー数プラスミド上に存在するため、それは高度に発現される。しかしながら、ＬａｃＩ結合部位が該プロモーターから欠失しているため、その大量のＬａｃＩはＰ_ＵＶ５からのメチラーゼ遺伝子の発現を妨げないであろう。
【００２３】
プラスミドｐＨＫＵＶ５はプラスミドｐＵＣ１９（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，＃３０４）から設計した。まず、合成オリゴヌクレオチドを使用して、−１０配列をＴＡＴＧＴＴから、より保存されたＴＡＴＡＡＴに変化させることにより、ｐＵＣ１９のＰ_１ａｃを、より強力なＵＶ５プロモーターに変換した（図４）。その時点で、ＬａｃＩ結合部位を欠失させた。つぎに、ＬａｃＩ遺伝子を供与プラスミドからｐＨＫＵＶ５内にクローニングした。ついでｓｗａＩＭ遺伝子をプラスミドｐＨＫＵＶ５内にクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内に形質転換した。ついで該宿主細胞をｐＨＫＵＶ５−ｓｗａＩＭ構築物により完全に修飾した。
【００２４】
ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現させるために、低コピー数ベクターｐＨＫＴ７を使用した（図４）。プラスミドｐＨＫＴ７は、ＬａｃＩにより制御される誘導性Ｔ７プロモーターを含有する。該複製起点は、ｐＨＫＵＶ５プラスミドに和合性のプラスミドｐ１５Ａに由来する。遺伝子発現の基底レベルは、ｐＨＫＴ７内にクローニングされた遺伝子に関しては２つの理由により非常に低い。第１に、Ｔ７プロモーターは低コピー数プラスミド上に存在するため、発現は減少する。第２に、高コピー数プラスミドｐＨＫＵＶ５から得た高レベルのＬａｃＩリプレッサーもまた、発現レベルを低く維持するように作用する。
【００２５】
エンドヌクレアーゼ遺伝子ｓｗａＩＲをｐＨＫＴ７内にクローニングし、ついでｐＨＫＵＶ５−ｓｗａＩＭを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６内に導入した。該培養を中期対数期まで増殖させ、ついで最終濃度０．４ｍＭまでのＩＰＴＧの添加により誘導した。組換えＳｗａＩエンドヌクレアーゼの収量は細胞１ｇ当たり２．０×１０^５単位であり、これはスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）由来の天然エンドヌクレアーゼの収量より１０倍高い。
【００２６】
実施するのに現在好ましい本発明の実施形態を更に例示するために、以下に実施例を記載する。本実施例は例示にすぎず、本発明は、添付の請求の範囲に示されているものを除き、本実施例に限定されると解釈されるものではないと理解されるであろう。
【００２７】
前記および後記に引用する参照文献を、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００２８】
【実施例】
実施例１
ＳｗａＩエンドヌクレアーゼの精製およびそのタンパク質配列の決定
１．スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）からのＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼのほぼ均一な状態までの精製
スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）細胞を３０℃で増殖させた。該細胞を、２０時間の増殖の後で遠心分離により収穫し、使用するまで−７０℃で保存した。４５１ｇの細胞を４℃で一晩融解し、ついで、５０ｍＭＮａＣｌおよび１２０ｍｇのリソスタフィン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で補足された１．５ＬのバッファーＡ（２０ｍＭＫＰＯ_４，１０ｍＭＢＭＥ，０．１ｍＭＥＤＴＡ，５％グリセロール，ｐＨ６．９）に再懸濁した。該再懸濁細胞を室温で攪拌プレート上でインキュベートした。８時間のインキュベーションの後、２５ｍｌのプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｐ８４６５；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を加え、該攪拌プレート装置を該細胞と共に冷凍庫内に移し、該細胞を４℃で一晩攪拌した。翌朝、該細胞を室温で２時間インキュベートした。ついで全細胞タンパク質の約３．１％が遊離するまで該細胞を音波処理し、ついで該細胞をＭａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎホモジナイザーで破壊した。該抽出物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。
【００２９】
以下の操作のすべては氷上または４℃で行なった。該上清を、バッファーＡ．１（５０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＫＰＯ_４，ｐＨ７．０，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび５％グリセロール）で平衡化された４００ｍｌのＸＫ５０／３０ＨｅｐａｒｉｎＨｙｐｅｒ−Ｄカラム（ＢｉｏＳｅｐｒａＩｎｃ．，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）上にローディングした。該カラムを８００ｍｌのバッファーＡ．１で、ついでバッファーＡ（２０ｍＭＫＰＯ_４，ｐＨ７．０，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび５％グリセロール）中の５０ｍＭＮａＣｌから１ＭＮａＣｌへの直線勾配（４Ｌ）で洗浄した。２５ｍｌの画分を集めた。画分をＳｗａＩ制限活性に関してＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡでアッセイした。制限酵素活性のピークは、０．６２〜０．７１ＭＮａＣｌで該カラムから溶出することが判明し、それをプールした。ＳｗａＩエンドヌクレアーゼの量は１１．０×１０^６単位であると推定された。
【００３０】
このＨｅｐａｒｉｎＨｙｐｅｒ−Ｄプールを、バッファーＢ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび５％グリセロール，最終ｐＨ７．８）中の８Ｌの１００ｍＭＮａＣｌに対して透析した。該透析プールをバッファーＢで最終濃度５０ｍＭＮａＣｌまで希釈し、バッファーＢ．１（５０ｍＭＮａＣｌ，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，０．１ｍＭＥＤＴＡ，１０ｍＭ β−メルカプトエタノールおよび５％グリセロール，最終ｐＨ７．８）中で平衡化された９０ｍｌのＳｏｕｒｃｅ（商標登録）−１５Ｑカラム（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）に適用した。該カラムを２００ｍｌのバッファーＢ１で、ついでバッファーＢ中の５０ｍＭＮａＣｌから７００ｍＭＮａＣｌへの直線勾配（１Ｌ）で洗浄した。１０ｍｌの画分を集めた。画分をＳｗａＩ活性に関してＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡでアッセイした。制限酵素活性の大部分は該カラムから流出した（８．６×１０^６単位）。約９６０，０００単位は該カラムに結合し、最初の１５画分で溶出した。
【００３１】
最初の１５画分をプールし、０．５容積のバッファーＡで希釈し、バッファーＡ．１で平衡化された８ｍｌのＨＲ１０／１０Ｓｏｕｒｃｅ（商標登録）−１５ＳＦＰＬＣ（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上にローディングした。該カラムを１０ｍｌバッファーＡ．１で洗浄し、ついでバッファーＡ中の５０ｍＭＮａＣｌから８００ｍＭＮａＣｌへの９０ｍｌの直線勾配を行なった。１．５ｍｌの画分を集めた。画分をＳｗａＩ活性に関してＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡでアッセイした。非常に少量の活性が該カラムから流出し、５４４，０００単位以上が画分１７〜１９で溶出した。
【００３２】
画分１７〜１９を集め、バッファーＢ中で５０ｍＭＮａＣｌまで希釈した。ついで該希釈プールを、バッファーＢ１で予め平衡化された９ｍｌのＨＲ１０／１０Ｈｅｐａｒｉｎ５ＰＷＴＳＫＧｕａｒｄｇｅｌカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ）上にローディングした。該カラムを１０ｍｌのバッファーＢ１で、ついでバッファーＢ中の５０ｍＭＮａＣｌから１ＭＮａＣｌへの１００ｍｌの直線勾配で洗浄した。１．５ｍｌの画分を集めた。画分をＳｗａＩ活性に関してＭ１３ｍｐ１９ＲＦＤＮＡでアッセイした。該酵素活性のピークは０．５６ＭＮａＣｌで溶出した。２００，０００単位を超えるＳｗａＩ活性をほぼ均一になるまで精製した。２０ｕｌの該ピーク画分（４６および４７）をＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ゲル上にローディングし、電気泳動に付した。該ゲルをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼ活性に対応する約６３ｋＤａおよび２８ｋＤａの２つの顕著なバンドが認められた。
【００３３】
２．ＳｗａＩエンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列の決定
前記のとおりに調製したＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼを電気泳動に付し、既に記載されているとおりに（Ｌｏｏｎｅｙ，Ｍら，Ｇｅｎｅ８０：１９３−２０８，（１９８９））修飾されたＭａｔｓｕｄａｉｒａ（Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１００５３−１００３８，（１９８７））の方法に従いエレクトロブロッティングした。該メンブレンをクーマシーブルーＲ−２５０で染色し、約６３ｋＤａおよび２８ｋＤａのタンパク質のバンドを切り出し、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓＤｉｖｉｓｉｏｎ，Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）Ｍｏｄｅｌ４０７Ａ気相タンパク質シークエンサー（Ｗａｉｔｅ−Ｒｅｅｓら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３：５２０７−５２１９，（１９９１））上での連続的な分解に付した。両方のｋＤａのタンパク質バンドの最初の３１残基は、Ｍ−Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｅ−Ｎ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｓ−Ｉ−Ｅ−Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｑ−Ｘ−Ｉ−Ｉ−Ｄ−Ｄ−Ｋ−Ｘ−Ｘ−Ｐ−Ｎ−Ｉ−Ｉ（配列番号５）に対応する。
【００３４】
実施例２
ＳｗａＩ制限−修飾遺伝子のクローニング
１．スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）からのゲノムＤＮＡの精製
スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）のゲノムＤＮＡを調製するために、１０ｇの細胞を２０ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、該溶液が均一になるまで混合した。１０ｍｌの０．２５ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）および新鮮に調製された６ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム（０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中）を加え、該溶液を４℃で一晩インキュベートした。リソスタフィンを該細胞に加え、該混合物を３７℃で１時間インキュベートした。ついで２４ｍｌの溶解混合物（１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００，５０ｍＭＴｒｉｓ，６２ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）および５ｍｌの１０％ＳＤＳを加え、該溶液を穏やかに混合した。該溶液を１容積の平衡化フェノール／クロロホルム（５０：５０，ｖ／ｖ）で抽出し、該水相を回収した。該水溶液を２Ｌの１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ（４回変更）に対して透析した。該透析溶液をＲＮアーゼＡ（１００μｇ／ｍｌ）で３７℃で１時間消化した。該ＤＮＡを、１／１０容積の５ＭＮａＣｌおよび０．５５容積の２−プロパノールの添加により沈殿させ、ガラス棒上に巻き取った。該ＤＮＡを風乾させ、５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭＴｒｉｓ，１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０）に溶解して約６５５μｇ／ｍｌの濃度とし、４℃で保存した。
【００３５】
２．ｐＣＡＢ１６内へのＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’領域のクローニング
ＢｓａＡＩによるｐＣＡＢ１６の消化を、後記の条件で該ベクターを３７℃で１時間インキュベートすることにより行なった。
【００３６】
１２０μｌのｐＣＡＢ１６（６〜１２μｇ）
１０μｌのＢｓａＡＩ（５０Ｕ）
４０μｌの１０ＸＮＥＢバッファー＃３
２３０μｌのｄＨ_２Ｏ
【００３７】
７５℃で１５分間インキュベートすることにより、該反応内のＢｓａＡＩを熱失活させた。ついで、消化されたベクター１００μｌ（２μｇ）を１００ｍＭＭｇＣｌ_２内の１単位のシュリンプアルカリホスファターゼと共に３７℃で１時間インキュベートすることにより、該ベクターを脱リン酸化した。
【００３８】
ＳｗａＩＮ末端タンパク質配列の以下のアミノ酸配列に基づき、縮重プライマーを設計した：１）Ｎ−Ｆ−Ｋ−Ｋ−Ｙ−Ｅ−Ｅ（配列番号６）、および２）Ｉ−Ｉ−Ｇ−Ｋ−Ｔ。それらは、ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の５’末端の周囲のＤＮＡに対して収束的にハイブリダイズするように設計した。
【００３９】
プライマー１：５’ＡＡＹＴＴＹＡＡＲＡＡＲＴＡＹＧＡＲＧＡＧ３’（配列番号７）
プライマー２：５’ＮＧＴＹＴＴＮＣＣＤＡＴＤＡＴ３’（配列番号８）
【００４０】
これらのプライマーを合成し、２００μｌの反応容積中の１００単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、２０μｌの１０ＸＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッファーおよび１０μｌの１０ｍＭＡＴＰと共に１０μｇのプライマーを３７℃で３０分間インキュベートすることにより、それぞれをリン酸化した。該反応物を６５℃で１０分間インキュベートすることにより、該キナーゼを熱失活させた。
【００４１】
該産物の増幅に成功した反応においては、以下のものを一緒にすることにより反応混合物を調製した：
１５０μｌのＴａｑＰＣＲバッファー（マグネシウム無し）
１５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ溶液
７５μｌのリン酸化プライマー１（３．７５ｕｇ）
７５μｌのリン酸化プライマー２（３．７５ｕｇ）
１５μｌの１ＭＭｇＣｌ_２
２２．５μｌの精製細菌ＤＮＡ鋳型（〜１５ｕｇ）
１１４０μｌのｄＨ_２Ｏ
７μｌ（３５単位）のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
【００４２】
該ＰＣＲ増幅条件は、９４℃で３０秒間、３５℃で３０秒間および７２℃で２０秒間の３５サイクルであった。ＰＣＲ後に７．５ｕｌのクレノウ（３５単位、ＮＥＢ＃２１２）を加え、該反応物を室温で１５分間、ついで７５℃で２０分間インキュベートした。該反応物をエタノールで沈殿させ、最終ＤＮＡペレットを６０μｌのｄＨ_２Ｏに再懸濁させた。該再懸濁化反応物を、ＴＡＥバッファー（４０ｍＭＴｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ８，１ｍＭＥＤＴＡ）中の３％低融点アガロースゲル（ＮｕＳｉｅｖｅＡｇａｒｏｓｅ，ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動させた。９９ｂｐのＤＮＡバンドを切り出し、該ゲル切片を６５℃で１０分間インキュベートした。ついで該温度を４０℃に低下させた。２ｕｌのβ−アガラーゼ（Ａｇａｒａｓｅ）（２単位）を加え、該インキュベーションを４０℃で１時間継続した。ついで以下のものを３７℃で一緒にすることにより、連結反応を行なった：
３μｌの調製されたｐＣＡＢ１６（５０ｎｇ）
５μｌのＰＣＲ産物（５０ｎｇ）
２．５μｌの１０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバッファー
１μｌの濃縮Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２０００単位）
１３．５μｌのｄＨ_２Ｏ
【００４３】
該反応物を３７℃で１時間、ついで２５℃で１時間インキュベートした。ついでそれを、冷蔵庫内に位置する氷水で満たされた氷バケツ内に配置した。該反応物をそのまま一晩インキュベートした。この一晩反応させた連結反応物の１０μｌを１００μｌのコンピテント細胞（ｃａｔ．＃Ｌ２０１１，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内に形質転換した。これは、該ＤＮＡおよび細胞を一緒にし、氷上で１０分間、４２℃で４５秒間インキュベートすることにより行なった。全容積をアンピシリンＬＢプレート上に配置し、３７℃で一晩インキュベートした。成長したコロニーをプラスミド構築物の正しさに関して調べた。これは、ＱｉａｇｅｎＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔを使用して該プラスミドＤＮＡを精製し、ＡｓｅＩで消化して、該ＰＣＲ産物が該ベクター内にクローニングされているか否かを調べることにより行なった。
【００４４】
５μｌのミニプレップ
１．５μｌの１０ＸＮＥＢ＃３
０．５ｕｌのＡｓｅＩ
８μｌのｄＨ_２Ｏ
【００４５】
前記反応物を３７℃で３０分間インキュベートした。正しいサイズのインサートを含有するミニプレップを配列決定した。該ＤＮＡ配列を６個のリーディングフレーム内で翻訳して、推定アミノ酸配列がＳｗａＩタンパク質Ｎ末端配列に対応するか否かを調べた。
【００４６】
３．ＳｗａＩエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ遺伝子を単離するための逆ＰＣＲによる染色体歩行
Ａ）ゲノムＤＮＡの調製
連続的な４個の逆ＰＣＲ反応のために４個の鋳型（Ｓａｕ３ＡＩ、ＲｓａＩ、ＢｓｔｙＩおよびＤｒａＩ）を調製した。Ｓａｕ３ＡＩの場合には、５０μｌの反応容積中で最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌまでＢＳＡで補足された１ＸＳａｕ３ＡＩバッファー中の１００単位のＳａｕ３ＡＩ制限エンドヌクレアーゼで１．５μｇの細菌ＤＮＡを消化した。ＲｓａＩの場合、５０μｌの反応容積中の１ＸＮＥＢバッファー中の５０単位のＲｓａＩ制限エンドヌクレアーゼで１．５μｇの細菌ＤＮＡを消化した。５０μｌの反応容積中で最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌまでＢＳＡで補足された１ＸＢｓｔｙＩバッファー中の５０単位のＢｓｔｙＩ制限エンドヌクレアーゼで１．５μｇの細菌ＤＮＡを消化することにより、ＢｓｔｙＩ鋳型を調製した。最後に、５０ｕｌの反応容積内の１ＸＮＥＢバッファー４中、１００単位のＤｒａＩ制限エンドヌクレアーゼで１．５ｕｇの細菌ＤＮＡを消化することにより、ＤｒａＩを調製した。全４個の反応物を最適温度で１時間インキュベートした。１３ｕｌの該消化反応物を１％アガロースゲル上で移動させることにより、該消化物を確認した。ついで該反応物を、７０℃で２０分間インキュベートすることにより熱失活させた。ついで５００μｌの反応容積内の１ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバッファー中、３０００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼと共に残りの３７μｌ（〜１μｇ）を１６℃で一晩インキュベートすることにより、環化を行なった。ついでこの環化連結反応物の一部を、後続の逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用した。
【００４７】
Ｂ）Ｓａｕ３ＡＩ逆ＰＣＲ
ｐＣＡＢ１６内にクローニングされたＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の断片のＤＮＡ配列に基づき、逆ＰＣＲプライマーを合成した：
５’ＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＣＴＡＧ３’（１９４−２４）（配列番号９）
５’ＧＴＴＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＴＴＡＴＡＧＡ３’（１９４−２５）（配列番号１０）
【００４８】
プライマー１９４−２４および１９４−２５ならびに前記のＳａｕ３ＡＩＤＮＡ鋳型を使用して、逆ＰＣＲを行なった。該Ｓａｕ３ＡＩ環状鋳型ＰＣＲ反応において、約８５０塩基対の産物が産生した。この産物をゲル精製し、３０μｌのｄＨ_２Ｏに再懸濁した。ついでＡＢＩ３７３自動配列決定系を製造業者の指示書に従い用いて該ＰＣＲ産物を配列決定した。前記のＰＣＲプライマーを配列決定用プライマーとして使用した。該Ｓａｕ３ＡＩ逆ＰＣＲ産物は約６４０ｂｐのＳｗａＩＯＲＦを含有していた。
【００４９】
Ｃ．ＲｓａＩ逆ＰＣＲ反応
ついで、該Ｓａｕ３ＡＩＰＣＲ産物から新たに読取られたエンドヌクレアーゼＯＲＦ配列に相補的な２個の逆ＰＣＲプライマーを後記のとおりに合成し、逆ＰＣＲ反応で使用した。Ｓａｕ３ＡＩ連結ではなくＲｓａＩ連結により鋳型を作製する以外は前記のとおりに、鋳型の調製、逆ＰＣＲ、精製およびＤＮＡ配列決定を行なった。１．１ＫｂのＰＣＲ産物を得、配列決定した。該データは、残りのエンドヌクレアーゼＯＲＦ配列とｓｗａＩＭＤＮＡ配列の一部とを明らかにした。
【００５０】
５’ＣＡＣＡＴＴＴＡＧＡＡＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡ３’（１９５−５）（配列番号１１）
５’ＧＧＴＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＣＴＴＧ３’（１９５−６）（配列番号１２）
【００５１】
Ｄ．ＢｓｔＹＩ逆ＰＣＲ反応
ついで、該ＲｓａＩＰＣＲ産物から新たに読取られた配列に相補的な２個の逆ＰＣＲプライマーを後記のとおりに合成し、逆ＰＣＲ反応で使用した。逆ＰＣＲ鋳型としてＢｓｔＹＩ連結を用いる以外は前記のとおりに、鋳型の調製、逆ＰＣＲ、精製およびＤＮＡ配列決定を行なった。１．７ＫｂのＰＣＲ産物を得、配列決定した。８５８ｂｐの新規配列はｓｗａＩＭ遺伝子のより詳細を明らかにした。
【００５２】
５’ＴＡＡＴＣＴＴＴＡＡＣＧＡＡＧＧＡＡＧＡＴＴＣＣ３’（１９６−３９）（配列番号１３）
５’ＴＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＡＣ３’（１９６−４０）（配列番号１４）
【００５３】
Ｄ．ＤｒａＩ逆ＰＣＲ反応
ついで、該ＢｓｔｙＩＰＣＲ産物から新たに読取られた配列に相補的な２個の逆ＰＣＲプライマーを後記のとおりに合成し、逆ＰＣＲ反応で使用した。逆ＰＣＲ反応においてＤｒａＩ連結を用いる以外は前記のとおりに、鋳型の調製、逆ＰＣＲ、精製およびＤＮＡ配列決定を行なった。２．０ＫｂのＰＣＲ産物を得、配列決定した。該新規配列はｓｗａＩＭ遺伝子の残部を明らかにした。
【００５４】
５’ＧＧＴＡＴＡＡＡＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＡ３’（１９６−１７８）（配列番号１５）
５’ＴＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡ３’（１９７−３１）（配列番号１６）
【００５５】
実施例３
ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼの発現
１．和合性ベクター上でのＳｗａＩメチラーゼのクローニング
ＳｗａＩメチラーゼ遺伝子（ｓｗａＩＭ）の発現を、発現ベクターｐＨＫＵＶ５内の強力なＵＶ５プロモーターの直下流に該遺伝子を挿入することにより行なった。これを行なうために、該ＤＮＡ配列データを利用して２個のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。該フォワードオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのＰｓｔＩ部位、ｌａｃＺタンパク質の翻訳を終結させるための、ｌａｃＺ遺伝子に対してインフレームの終結コドン、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、およびハイブリダイゼーションのためのスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ＤＮＡに相補的な２４ヌクレオチドを含有していた：
５’−ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＧＴＡＴＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＡＴＡＧＡＣ−３’（１９８−１４０）（配列番号１７）
【００５６】
該リバースプライマーは、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ＤＮＡに該ＳｗａＩ遺伝子の３’末端でハイブリダイズするように設計した。それは、クローニングを促進するためのＢａｍＨＩ制限部位、およびインビボＳｗａＩメチラーゼ活性を試験するために使用するＳｗａＩ部位を含有していた。
【００５７】
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＴＴＡＡＡＴＣＴＡＡＴＴＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡ−３’（１９８−１３２）（配列番号１８）
【００５８】
これらの２個のプライマーを使用し、
１０μｌの１０ＸＶｅｎｔ（登録商標）ＴｈｅｒｍｏＰｏｌバッファー
１０μｌの２ｍＭｄＮＴＰ
０．５μｌ（３００ｎｇ）のスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ゲノムＤＮＡ
１μｌのプライマー１９８−１４０（７５ｎｇ）
１μｌのプライマー１９８−１３２（７５ｎｇ）
７５．５μｌのｄＨ_２Ｏ
１μｌ（０．１単位）のＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ
１μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５単位）
を一緒にし、９４℃で３０秒間、５０℃で１分間および７２℃で２分間の２５サイクルにわたり増幅することにより、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ゲノムＤＮＡからｓｗａＩＭ遺伝子を増幅した。ＰｒｏｍｅｇａＷｉｚａｒｄＰＣＲＰｒｅｐＫｉｔを使用して該増幅産物を精製した。５００ｎｇのｐＨＫＵＶ５ベクターおよび残りのＰＣＲ産物（〜２μｇ）の両方を、６５μｌの反応物中、１ＸＮＥＢＢａｍＨＩバッファー中の０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡで補足された２０単位のＢａｍＨＩおよび２０単位のＰｓｔＩで消化し、該反応物を３７℃で１時間インキュベートした。該消化物を、ＴＡＥバッファー中、１％低融点ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上で移動させた。該ＰＣＲおよびベクターＤＮＡバンドを切り出し、該ゲル切片をβ−アガラーゼ（Ａｇａｒａｓｅ）で４０℃で１時間処理した。ついで該反応物を凍結・融解し、残りの固体ゲル片を、ミクロ遠心機を使用して迅速に遠心沈殿させた。該上清をエタノールで沈殿させ、最終的なＤＮＡペレットを水に再懸濁させた。該ＤＮＡ濃度をアガロースゲル上での目視検査により測定した。ｐＨＫＵＶ５とｓｗａＩＭとの連結を、以下のものを一緒にすることにより行なった：
５μｌの調製されたｐＨＫＵＶ５（１００ｎｇ）
５μｌのメチラーゼＰＣＲ産物（５００ｎｇ）
５μｌの１０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバッファー
２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（８００単位）
３３μｌのｄＨ_２Ｏ
【００５９】
該反応物を３７℃で１時間インキュベートし、１０μｌの該連結反応物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６内に形質転換した。個々のコロニーを単離し、該クローニング酵素によるミニプレップの消化により分析して、該メチラーゼ遺伝子が実際に該ベクター内にクローニングされていることを確認した。
【００６０】
７μｌのミニプレップ
１．５μｌの１０ＸＢａｍＨＩバッファー
１．５μｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
０．５μｌのＰｓｔＩ（１０Ｕ）
０．５μｌのＢａｍＨＩ（１０Ｕ）
４μｌのｄＨ_２Ｏ
【００６１】
該消化物を３７℃で１時間インキュベートした。
【００６２】
ついで正しい構築物であるミニプレップをＳｗａＩで消化して、メチラーゼの保護に関して調べた：
７μｌのミニプレップ
１．５μｌの１０ＸＮＥＢｕｆｆｅｒ３
１．５μｌの１ｍｇ／ｍｌＢＳＡ
１μｌのＳｗａＩ（１０Ｕ）
４．５μｌのｄＨ_２Ｏ
【００６３】
該消化物を２５℃で１時間インキュベートした。塩化カルシウムコンピテント細胞を得るために、ＳｗａＩ消化に対して抵抗性である１μｌのクローンをＥＲ２５６６細胞内に形質転換した。
【００６４】
２．ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングおよび発現
ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ｓｗａＩＲ）の発現を、該遺伝子を発現ベクターｐＨＫＴ７内の強力な誘導性Ｔ７プロモーターおよび保存されたリボソーム結合部位（ＲＢＳ）の直下流に挿入することにより行なった。これを行なうために、該ＤＮＡ配列データを利用して２個のオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。該フォワードオリゴヌクレオチドプライマーは、クローニングを容易にするためのＢａｍＨＩ部位、ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のＡＴＧ開始コドン、、およびハイブリダイゼーションのためのスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ＤＮＡに相補的な２４ヌクレオチドを含有していた：
５’−ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＡＴＣＡＴＡＴＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＣＧＡＡＧＡＡ−３’（１９５−１５２）（配列番号１９）
【００６５】
該リバースプライマーは、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ＤＮＡにｓｗａＩ遺伝子の３’末端でハイブリダイズするように設計した。それは、クローニングを促進するためのＸｈｏＩ制限部位を含有していた。
【００６６】
５’−ＧＣＡＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＡＴＴＧＡＧＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧＡＡＴ−３’（１９５−１５３）（配列番号２０）
【００６７】
これらの２個のプライマーを使用し、
３０μｌの１０ＸＴａｑＰＣＲバッファー（１．５ｍＭＭｇ＋＋を含有）
３０μｌの２ｍＭｄＮＴＰ
０．７５μｌ（４５０ｎｇ）のスタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ゲノムＤＮＡ
３μｌのプライマー１９５−１５２（２２５ｎｇ）
３μｌのプライマー１９５−１５３（２２５ｎｇ）
２２７．５μｌのｄＨ_２Ｏ
３μｌ（０．３単位）のＤｅｅｐＶｅｎｔ（登録商標）ポリメラーゼ
３μｌＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（１５単位）
を一緒にし、９５℃で３０秒間、５０℃で１分間および７２℃で２分間の２５サイクルにわたり増幅することにより、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｗａｒｎｅｒｉ）ゲノムＤＮＡからｓｗａＩＲ遺伝子を増幅した。ＰｒｏｍｅｇａＷｉｚａｒｄＰＣＲＰｒｅｐＫｉｔを使用して該増幅産物を精製した。１μｇのｐＨＫＴ７ベクターおよび残りのＰＣＲ産物（〜１ｕｇ）の両方を、５０μｌの反応物中、１ＸＮＥＢＢａｍＨＩバッファー中の０．１ｍｇ／ｍｌＢＳＡで補足された２０単位のＢａｍＨＩおよび２０単位のＸｈｏＩで消化し、該反応物を３７℃で１時間インキュベートした。該消化物を、ＴＡＥバッファー中、１％低融点ＮｕＳｉｅｖｅアガロースゲル上で移動させた。該ＰＣＲおよびベクターＤＮＡバンド（それぞれ６８１ｂｐおよび３５００ｂｐ）を切り出し、該ゲル切片を６５℃で１０分間インキュベートした。温度を４０℃に低下させ、該ゲル切片をβ−アガラーゼ（Ａｇａｒａｓｅ）で処理した。ｐＨＫＴ７とｓｗａＩＲとの連結を、以下のものを３７℃で一緒にすることにより行なった：
９．０μｌの調製されたｐＨＫＴ７（１００ｎｇ）
７μｌのエンドヌクレアーゼＰＣＲ産物（７０ｎｇ）
５μｌの１０ＸＴ４ＤＮＡリガーゼバッファー
２μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（８００単位）
２７μｌのｄＨ_２Ｏ
【００６８】
該反応物を３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌの該連結反応物を、ＳｗａＩメチラーゼ遺伝子で予め修飾された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＥＲ２５６６内に形質転換した。形質転換体を分析したところ、すべてがｓｗａＩＲ遺伝子を含有していた。ＳｗａＩエンドヌクレアーゼの産生のために、このプラスミド構築物ｐＨＫＴ７−ｓｗａＩＲを選択した。ｐＨＫＴ７−ｓｗａＩＲおよびｐＨＫＵＶ５−ｓｗａＩＭプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株をＮＥＢ＃１１８３と命名した。株ＮＥＢ＃１１８３からの組換えＳｗａＩの収量は、細胞１ｇ当たり約２．０×１０^５単位であった。
【００６９】
３．大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６ＮＥＢ＃１１８３からの組換えＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼの産生
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６ＮＥＢ＃１１８３を、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）と共にＬ−ブロス培地を含有する発酵槽内で中期対数期まで増殖させた。該培養を、ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭまで加えることにより誘導し、１６時間増殖を継続した。該細胞を遠心分離により収穫した。該細胞は−７０℃で保存するか、あるいは直ちに使用することができる。
【００７０】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮＥＢ＃１１８３からのＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼの精製は、前記実施例１に大まかに説明されているとおりアフィニティークロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーなどの標準的なタンパク質精製技術の組合せにより行なうことができる。この精製から得られたＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼは実質的に純粋であり、非特異的なエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる汚染を受けていない。
【００７１】
ｐＨＫＵＶ５−ｓｗａＩＭおよびｐＨＫＴ７−ｓｗａＩＲプラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２５６６ＮＥＢ＃１１８３のサンプルは、ブダペスト条約の条項および条件に従いＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９９年４月２３日付けで寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号２０７２２７が付与されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳｗａＩ制限−修飾系の遺伝子体制を示す。ｓｗａＩＲ：ＳｗａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子、ｓｗａＩＭ：ＳｗａＩメチラーゼ遺伝子。
【図２】図２は、ｓｗａＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３Ａ】ｓｗａＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３Ｂ】ｓｗａＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図３Ｃ】ｓｗａＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号３）およびそのコード化アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図４】図４は、２つの発現ベクターｐＨＫＵＶ５およびｐＨＫＴ７を示す。

Claims

配列番号２により表されるアミノ酸配列を有するＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
請求項１に記載のＤＮＡが挿入されているベクターを含んでなる組換えＤＮＡベクター。
ＡＴＣＣ第２０７２２７号から入手可能な、ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離されたＤＮＡ。
ＳｗａＩ制限エンドヌクレアーゼの製造法であって、請求項２に記載のベクターで形質転換された宿主細胞を該エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養することを含んでなる製造法。