JP4165775B2 - 大腸菌でのＢｓｓＨＩＩ制限酵素のクローニング及び生産方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼとＢｓｓＨＩＩメチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤＮＡからのＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関する。
【０００２】
II型制限エンドヌクレアーゼは細菌中に自然にできる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼが他の細菌成分から精製されると、実験室でＤＮＡ分子を切断して分子クローニング及び遺伝子の特徴付けのための精密な断片を得ることに用いることができる。
【０００３】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子上のヌクレオチドの特定の配列（認識配列）を認識し結合して働く。一度、結合すると認識配列の内部でまたは一端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有する。独特の特異性を有する２１１以上の制限エンドヌクレアーゼが今日までに研究された何百もの細菌種の中から同定されている(RobertsとMaceils, Nucl.Acids Res.24:223-235,(1996))。
【０００４】
細菌は種毎にせいぜい少数の制限エンドヌクレアーゼを持つにすぎないという傾向がある。エンドヌクレアーゼは典型的には由来する細菌に従って名前が付けられる。例えば、Deinococcus radiophilusは DraI, DraII, DraIIIと名付けられた３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを生産する。これら３つの酵素はそれぞれ5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3'及び5'CACNNNGTG3'という配列を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13は5'GAATTC3'という配列を認識する酵素、EcoRIだけを生産する。
【０００５】
自然にでは、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄のために防御的な役割を果たすと考えられている。制限エンドヌクレアーゼは細菌を破壊しまたは細菌に寄生するであろうウィルス及びプラスミドのような外来性ＤＮＡ分子による感染に対して細菌が抵抗することを可能にする。認識配列がある度に侵入外来性ＤＮＡ分子を切断することにより抵抗性を与える。この切断が生じると多くの感染遺伝子は無力になり、ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解をうけやすくなる。
【０００６】
細菌の防御システムの２番目の構成成分は修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌が自己のＤＮＡを防御し外来性感染ＤＮＡを区別し得る手段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ配列を認識し結合する。しかし、ＤＮＡを切断する代わりにメチル基の付加により配列内の特定のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化の後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼにより切断されない。細菌細胞のＤＮＡはその細菌の修飾メチラーゼの働きで常に充分に修飾されている。それ故に、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に無反応性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及び開裂に感受性であるのは未修飾で、それ故外来性と見なし得るＤＮＡのみである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、今や遺伝子をクローニングしそれらがコードするタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得られるより大量に生産することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を単離する鍵は複雑な「ライブラリー」すなわち、「ショットガン」方法により得たクローン集団中のクローンを10-3から10-4より低い頻度で出現するときに同定する簡単で確かな方法を開発することである。好ましくは、その方法は所望であるがまれなクローンが生き残る間に不要な多数のクローンが破壊されるように選択的であるべきである。
【０００８】
II型制限−修飾系は高頻度でクローニングされつつある。最初のクローニングシステムは制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染を用いた(EcoRII: Kosykhら、Molec.Gen.Genet.178:717-719,(1980); HhaII:Mannら、Gene 3:97-112,(1978); PstI:Walderら、Proc.Nat.Acad.Sci.78:1503-1507,(1981))。細菌内の制限−修飾系の存在は細菌がバクテリオファージによる感染へ抵抗することを可能にするので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を有する細胞は原理的にはファージに曝されたライブラリーからの生き残りとして選択的に単離され得る。しかし、この方法は限定的な価値しかないことがわかった。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は選択的な生存を授与する充分なファージ抵抗性が常に現れるのではないことがわかった。
【０００９】
別のクローニングアプローチはプラスミドを増殖させるＥ．ｃｏｌｉ中へのプラスミド運搬として最初に特徴づけられた形質転換系を含む(EcoRV:Bougueleretら,Nucl.Acid.Res.12:3659-3676(1984); PaeR7:Gingeras及びBrooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:402-406,(1983); Theriault及びRoy,Gene 19:355-359(1982);PvuII:Blumenthalら、J.Bacteriol.164:501-509,(1985))。
【００１０】
３番目のアプローチ、すなわち増大しつつある系のクローニングに用いられるアプローチの一つは活性メチラーゼ遺伝子に向けられる(Wilson,1993年４月６日に発行されたU.S.Patent No.5,200,333及びBsuRI:Kissら、Nucl.Acid.Res.13:6403-6421,(1985))。制限と修飾遺伝子はたいてい近接して連鎖しているので、たいてい両遺伝子は同時にクローニングできる。しかし、この選択により常に完全な制限系が得られるとは限られず、そのかわりにメチラーゼ遺伝子のみが得られることがある(BspRI:Szomolanyiら、Gene 10:219-225,(1980);BcnI:Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982);BsuRI:Kiss及びBaldauf,Gene 21:111-119,(1983);及びMspI:Walderら、J.Biol.Chem.258:1235
-1241,(1983))。
【００１１】
より最近の方法、すなわち「エンドブルー法(endo-blue method)」がdinD::lacZ融合を含むE.Coliの指標株に基づいてE.coli中の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングのために記載された(Fomenkovら、1996年3月12日に発行されたU.S.Patent No.5,498,535、Fomenkovら、Nucl.Acids Res.22:2399-2403,(1994))。この方法は制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷に続いて起こるE.coli ＳＯＳ反応を利用する。多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Tth111I, BsoBI, Tfヌクレアーゼ)がこの方法によりクローニングされた。
【００１２】
E.coliでのこれらの系のクローニングの別の障害が多様なメチラーゼのクローニング過程で発見された。多くのE.coli株は（クローニングに通常用いられる株も含めて）シトシンのメチル化を含むＤＮＡの導入に抵抗するシステムを持っている(Raleigh及びWilson, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 83:9070-9074, (1986))。それ故、どのE.coli株をクローニングに用いるかも注意深く考える必要がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
精製された制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組み換え分子を創るのに有用なツールなので、これらの酵素を大量に生産する組み換えＤＮＡ技術を通して細菌株を得ることに商業的な動機がある。そのような過剰発現株はまた酵素精製の仕事をも簡単にするであろう。
【００１４】
本発明はBacillus stearothermophilus H3 E.coli.からの多重特異性(multi-specific)メチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)、BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)及び同族BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)をコードする組み換えＤＮＡに関する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
BssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子は最初、２カ所のBssHII部位を有する修飾pLITMUS28ベクターを用いてSau3AIライブラリー中にクローニングした(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)。多重特異性BssHIIメチラーゼの発現は２カ所のBssHII部位をBssHII分解に対して抵抗性にする。驚くべきことに、クローニングしたメチラーゼはまたBssHII部位（5’GCGCGC3’）に加え他の部位も修飾する。即ち、このメチラーゼはまたBsrFI（5’RCCGGY3’）及びHaeII部位（5’RGCGCY3’）並びに部分的にはEagI（5’CGGCCG3’）及びMluI部位（5’ACGCGT3’）を修飾する。単一特異性BssHIIメチラーゼはB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡから調製した部分的Sau3AIライブラリーから回収できなかった。
【００１６】
BssHII制限エンドヌクレアーゼのクローニングを容易にするために、多量のBssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質がB.stearothermophilus H3細胞から精製された。Ｎ末端アミノ酸配列は以下のように決定された。(Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）。
【００１７】
多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)に近接したＤＮＡ断片はBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発見を期待して配列決定された。多重特異性メチラーゼ遺伝子の周囲の５０００ｂｐ以上のＤＮＡが配列決定された。転写解読枠のアミノ酸配列への翻訳はBssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に適合しなかった。真のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子はB.stearothermophilus H3染色体の別の場所に位置していそうだと結論づけた。
【００１８】
BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定するために、２セットの縮重プライマー(degenerate primer)をタンパク質の配列に基づいて設計し、ＰＣＲでB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡ由来のBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐを増幅するのに用いた。次いで、pUC19(ATCC 37254)中にクローニングし挿入の配列決定をした。１セットの逆ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ)プライマーを当該配列のわかっている５９ｂｐ配列から設計した。逆ＰＣＲ産物はSau3AIで分解し、自己連結したB.steatothermophilus H3ゲノムＤＮＡ中に見出された。逆ＰＣＲ ＤＮＡをクローニングし配列決定した。これによりさらに４６５ｂｐの新しいＤＮＡコード配列が得られた。逆ＰＣＲの別のセットを４６５ｂｐ配列の末端から設計しHinfI又はRsaIで分解し自己連結したB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡからBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りの部分を増幅するのに用いた。逆ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。別の７３０ｂｐの新しい配列の後に、ストップコドンがRsaI断片中に見出された。完全なBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)は１２５４ｂｐであり（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸BssHII制限エンドヌクレアーゼをコードしていた。
【００１９】
E.coli染色体を予め修飾するために、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIMI)をコンパチブルベクターpACYC184(ATCC 37033)にクローニングした。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位及び最適スペース(spacing)をbssHIIR遺伝子の前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングした。ＰＣＲ挿入を担っている３つの単離体が見出された。しかし、ＩＰＴＧ誘導細胞培養では活性は検出できなかった。３つの挿入はbssHIIR遺伝子中に変異をもたらしたと結論された。
【００２０】
ベクターpUC19はlacプロモーターを含む高コピー数プラスミドである。lacプロモーターからの遺伝子の発現は厳密に調節されていない。従って、T7プロモーターのような厳密に調節されたプロモーターがbssHIIR遺伝子の発現に好ましいであろうと判断された。bssHIIR遺伝子は両側にXbaIとBamHI部位のあるプライマーを用いてＰＣＲで増幅された。効率的なリボソーム結合部位と最適スペースを遺伝子の前部に組み込んだ。ＰＣＲ産物をT7プロモータの上流に転写終了暗号を有するT7発現ベクターpET21AT(New England Biolabs Inc.,Berverly, MA)に連結した。最初bssHIIM1遺伝子をベクターpLG339中に挿入した。次いでエンドヌクレアーゼを担っているプラスミドをE.coli細胞ER2504(pLysS, pLG-BssHIIM1)に形質転換した。pLysS, pLG-BssHIIM1及びpET21AT-BssHIIRを担っているE.coli細胞をＩＰＴＧで誘導し、細胞抽出物のBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。１２の単離体由来の細胞抽出物についてアッセイを行ったところ、１２クローン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼ活性を産生していた。１実施例を図４に示す。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び同族メチラーゼ遺伝子は互いに近接して位置しているので、１セットの逆ＰＣＲプライマーを制限エンドヌクレアーゼ配列の末端に基づいて合成した。下流配列を逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングした。真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)を２段階の逆ＰＣＲでクローニングした。完全なbssHIIM2遺伝子をＰＣＲにより増幅し、E.coli染色体を予め修飾すべくpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339(ATCC37131)中にクローニングした。予め修飾した宿主ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生じた株ER2417（pLysP,pLG-BssHIIM2,pET21AT-BssHIIR）はＩＰＴＧ誘導後に１×１０5単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
【００２１】
【発明の実施の形態】
ここに記載された方法によると、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子、BssHII制限エンドヌクレアーゼ及び同族メチラーゼ遺伝子は好ましくは以下の段階を経てクローニングされ発現される。
【００２２】
１．B.stearothermophilus H3のゲノムＤＮＡを精製する。
【００２３】
２．ＤＮＡをSau3AIのような制限エンドヌクレアーゼ又はそのアイソシゾマーのいずれかで部分的に分解し、完全なBssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を生成させる。代わりに、段階９を経ずにＮ末端アミノ酸配列から設計された縮重プライマーを用いたＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより直接BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることもできる。
【００２４】
３．Sau3AIで分解したゲノムＤＮＡを次いで２つのBssHII部位を有するBamHI-開裂/CIPで処理したpLITMUSクローニングベクター中に連結させる。連結ＤＮＡを適切な宿主、即ちE.coli株RR1のようなHsdR-, McrBC-, Mrr- 株を形質転換させるのに用いる。ＤＮＡ/細胞混合物を次いで形質転換細胞を選択するアンピシリン培地に播く。インキュベーション後、形質転換コロニーを採取し増幅させ最初の細胞ライブラリーを形成する。
【００２５】
４．次に組み換えプラスミドを最初の細胞ライブラリー全体から精製し、最初のプラスミドライブラリーを作る。次いで、精製プラスミドライブラリーをBssHII制限エンドヌクレアーゼまたはBssHIIアイソシゾマーのいずれかを用いてインビトロで完全に分解させる。BssHIIエンドヌクレアーゼ分解は未修飾でメチラーゼを含有していないクローンを選択的に分解し、BssHIIメチラーゼ遺伝子を有するクローンの相対的頻度を高める。
【００２６】
５．多重特異性BssHIIメチラーゼクローンの同定
分解したプラスミドライブラリーＤＮＡはE.coli株RR1のような宿主に戻し形質転換させ、アンピシリンプレート上に播いて再び形質転換コロニーを得る。コロニーを拾いそのプラスミドを調製しBssHII分解に抵抗性かどうかを決定するために精製プラスミドＤＮＡをインビトロでBssHIIエンドヌクレアーゼとインキュベートすることによりBssHIIメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
【００２７】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされたことを確認したら、クローンを制限地図作製及び欠失地図作製により分析する。次いで、完全な挿入について配列決定する。このアプローチ後に、BssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子に対応した１つの転写解読枠を見つける。クローニングしたメチラーゼはBssHII部位（5’GCGCGC3’)の他にいくつかの他の部位を修飾する。多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子を担っているプラスミドＤＮＡもBsrFI(5’RCCGGY3’)及びHaeII(5'RGCGCY3')分解に抵抗性であり、またEagI（5’CGGCCG3’)及びMlUI(5’ACGCGT3’)分解に部分的に抵抗性である。クローニングしたメチラーゼは多重特異性メチラーゼであると結論される。
【００２８】
７．BssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質を多量に精製しＮ末端アミノ酸配列を決定する。Ｎ末端配列は次の通りである。(Met)Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）
８．上のアプローチに基づいて、メチラーゼ含有クローンを用いて多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子の周囲の5.8KbのＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ配列を総ての６つの枠に翻訳し、BssHII制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較する。しかし、精製BssHII制限エンドヌクレアーゼの翻訳アミノ酸配列とＮ末端アミノ酸配列の間に明らかな同一性/相同性は認められない。真のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は多重特異性メチラーゼの隣には位置していないと結論される。
【００２９】
９．BssHIIエンドヌクレアーゼをＮ末端アミノ酸配列に基づいてＰＣＲ及び逆ＰＣＲで直接クローニングする努力がなされる。２セットの縮重プライマーを最初の５アミノ酸残基(MGENQE)（配列番号５）及び１５番目から２０番目の残基(DKAQLV)（配列番号６）から設計する。プライマーをB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐをＰＣＲにより増幅するのに用いる。多数のＰＣＲ産物が見出され５９〜６７ｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、pUC19にクローニングし配列決定する。２クローンのうちの１つは期待されるＮ末端アミノ酸配列と同一である翻訳アミノ酸配列を有していた。
【００３０】
１０．逆ＰＣＲプライマーを最初の５９ｂｐ ＤＮＡから設計し、周囲のＤＮＡ配列をB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡから逆ＰＣＲにより増幅するのに用いる。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを以下の制限酵素で分解する。６ｂｐ認識配列を有するAatII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂｐ認識配列を有するSau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIである。分解により逆ＰＣＲ反応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じる。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一のＰＣＲ産物がSau3AI, MboI及びAciIで分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をpUC19中にクローニングし配列決定する。その結果４６５ｂｐの新しい配列が生じる。
【００３１】
１１．逆ＰＣＲプライマーを465bpの新しい配列の末端から設計し、さらに周囲のＤＮＡを増幅するのに用いる。 B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで分解する。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一の逆ＰＣＲ産物がHinfI又はRsaI分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をクローニングし、配列決定する。７３０ｂｐのさらなる配列の後に、配列決定されたRsaI断片中にストップコドンが見出される。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ ＋ ４６５ｂｐ ＋ ７３０ｂｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHiiエンドヌクレアーゼをコードしている。
【００３２】
１２．多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子をpACYC184(ATCC 37033)中にクローニングしE.coli宿主を予め修飾する。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させる。効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをATG開始コドンの前に組み込む。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニングする。挿入を有する３つのクローンが見出されるが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の抽出物中にBssHII活性は見出されない。
【００３３】
１３．bssHIIR遺伝子の発現の２回目の試みにおいて、T7発現ベクターpET21ATが厳密な調節の発現に用いられる(F.W.StudierとB.A.Moffatt, J.Mol.Biol.189:113-130,(1986))。ベクターpET21ATはT7プロモーターの上流の転写終了暗号を４コピー有している。pLysSの共形質転換(co-transformation)(F.W.Studier, J.Mol.Biol.219:37-44(1991))は非誘導条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339(ATCC 37131)中にクローニングする。bssHIIR遺伝子をＰＣＲで増幅しpET21AT中にクローニングする。T7発現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換する。１２の単離体がＩＰＴＧにより誘導され、細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。総てのクローンはBssHIIエンドヌクレアーゼを生産する。
【００３４】
１４．bssHIIR遺伝子に近接したメチラーゼ遺伝子をクローニングするために、１セットのプライマーを下流のＤＮＡ配列を増幅するために作る。逆ＰＣＲ産物がHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し、自己連結したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出される。逆ＰＣＲ産物をクローニングし配列決定される。未終結の転写解読枠が新しく得られた８９５ｂｐ配列中に見出され、Genbankの周知遺伝子と配列を比較する。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ酸配列を有している。
【００３５】
１５．２番目のセットの逆ＰＣＲプライマーを合成し下流の配列を増幅するの用いる。逆ＰＣＲ産物はStyIで分解して自己連結させたＤＮＡのＰＣＲ反応物中に見出される。ＤＮＡ産物をpUC19中にクローニングし、その挿入について配列決定する。完全BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．２ｋＤａの分子量を有するBssHIIメチラーゼタンパク質をコードすることが判明する。
【００３６】
１６．完全bssHIIM2遺伝子を増幅しpLG339ベクターに挿入する。予め修飾されたE.coli宿主細胞,ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換する。生じた株ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)(NEB#1070)はE.coli細胞湿重１グラム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産する。
【００３７】
NEB#1070のサンプルはブタペスト条約の条件に従ってAmerican Type Culture Collectionに１９９７年２月２４日に寄託し、ATCC受託番号９８３３４を得た。
【００３８】
【実施例】
本発明は以下の実施例によりさらに実証される。実施例は本発明の理解を助けるために提供されるが発明を限定するものとは解釈されない。
【００３９】
上及び以下で引用する文献は参考として本明細書に導入する。
【００４０】
実施例１
BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．メチラーゼ選択法を用いた多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)のクローニング
１０μｇのB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを4, 2, 1, 0.5, 又は0.25単位のSau3AIを用いて37℃、３０分間部分分解した。部分分解したＤＮＡを電気泳動により分析した。１単位及び０．５単位のSau3AI分解により限定部分分解が生じたことが判明した。Sau3AI部分分解B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをBamHI開裂/CIP処理pLITMUS28(２つのBssHII部位を持つpUC19誘導体、New England Biolabs Inc.,Baverly,MA)中に16℃一晩で連結した。連結ＤＮＡをRR1 コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリンプレート上に播いた。トータル約１×１０5 細胞が形質転換実験で得られた。これらの細胞を一緒にプールし１リッターのAp添加LBブイヨン中に接種し３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを最初の細胞ライブラリーから調製した。10, 5, 2及び1μｇのプラスミドＤＮＡを４０単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを用いて５０℃で４時間分解した。BssHII分解ＤＮＡをRR1コンピテント細胞中に再形質転換した。プラスミドを再び生存形質転換体から単離し、BssHII制限酵素で分解しプラスミドＤＮＡがBssHII分解に抵抗性かどうかを調べた。３６のプラスミドについてBssHII分解への抵抗性を調べた。３つの抵抗性クローン（＃３、＃１８及び＃３０）が見つかった。それらは約６ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入を担っていた。これらのプラスミドをBsrFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI, HhaI, SacI又はEcoO109Iで分解したとき、BsrFI, HaeII, EagI又はMluI分解に対して抵抗性か又は部分的に抵抗性であることが判明した。細胞抽出物を３つの単離体から得て、BssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。明らかなエンドヌクレアーゼ活性は３つの細胞抽出物中に検出されなかった。完全な多重特異性メチラーゼ遺伝子と周囲のＤＮＡの配列を決定した。bssHIIM1遺伝子配列を図１に示す。明らかな制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は見つからなかった。このメチラーゼ遺伝子はファージがコードする多重特異性メチラーゼ遺伝子であろうと結論された。同様の遺伝子がクローニングされ、その配列が公表された（Schumann,J.,ら, Gene 157:103-104(1995)）。
【００４１】
２．bssHIIR遺伝子のクローニング
メチラーゼ選択法では多重特異性BssHIIメチラーゼを得られるだけなので、努力をBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングに集中した。BssHII制限エンドヌクレアーゼをB.stearothermophilus H3細胞からクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定に当てた。Ｎ末端アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４２】
(Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）。
【００４３】
（下線を引いた残基は縮重プライマーを設計するのに用いられた）。
【００４４】
前向き(forward)縮重プライマーは最初の６アミノ酸配列、(Met) Gly Glu Asn Gln Glu（配列番号５）に基づいて設計された。
【００４５】
前向きプライマー配列は以下の通りである。
【００４６】
5’ATGGGNGARAAYCARGA3’（配列番号７）
（N=A,C,G及びT;R=A,G;Y=C,T)
２つの逆向き(reverse)縮重プライマーをアミノ酸配列、Asp Lys Ala Gln Leu Val（配列番号６）に基づいて設計した。Leuをコードするコドンは６つの可能性(CUG,CUC,CUU,CUA,UUG及びUUA)があるため、２つの縮重プライマーを作成した。一方はLeuをコードするCTNで、もう一方はLeuをコードするTTRであった。この２つの逆向き縮重プライマーの配列は以下の通りである。
【００４７】
逆向きプライマー１
5’ACYAAYTGNGCYTTRTC3’（配列番号８）
(N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T)
逆向きプライマー２
5’ACNAGYTGNGCYTTRTC3’(配列番号９)
(N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T)
２つのＰＣＲ反応を計画した。前向きプライマーと逆向きプライマー１をＰＣＲ反応１に用いた。前向きプライマーと逆向きプライマー２をＰＣＲ反応２に用いた。ＤＮＡ増幅が正の結果を示せば、５９ｂｐＰＣＲ産物が期待できるであろう。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の５９ｂｐは最初の２０アミノ酸をコードしている。３０回のＰＣＲ増幅（９５℃１分、４０℃１分、７２℃３０秒、で３０回）の後、期待したＰＣＲ産物がアガロースゲル上で検出された。小ＤＮＡ産物を３％低温溶解アガロースゲルを通してゲル精製した。ゲル切片をβアガラーゼで処理しＤＮＡを沈降させpUC19中にクローニングした。挿入を有する２クローンについて配列決定した。最初の５９ｂｐのbssHIIR遺伝子の配列は以下の通りであった。
【００４８】
5'ATGGGAGAAAACCAAGAATCTATGGGCAAATCAGATATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１０）
コードアミノ酸配列は Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val（配列番号１１）であった。この配列は天然タンパク質のアミノ酸配列決定で得られたアミノ酸配列と完全に適合した。
【００４９】
残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために１セットの逆ＰＣＲプライマーを５９ｂｐのＤＮＡ配列から設計した。逆ＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
【００５０】
5’GATATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１２）
5’TATTGATTCTTGGTTTTCTCCCAT3’（配列番号１３）
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを６ｂｐの認識配列を持つ制限酵素、AatII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂｐの認識配列を持つ制限酵素Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1L, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIを用いて２時間所望の温度で分解した。分解により逆ＰＣＲ反応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じた。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁し、逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はSau3AI, MboI及びAciIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はpUC19中にクローニングされ配列決定され、４６５ｂｐの新しい配列を生じた。
【００５１】
残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットが４６５ｂｐの新しい配列から設計された。プライマーの配列は以下の通りであった。
【００５２】
5’TCCGCTAATTACCTTACCATTATTGGT3’（配列番号１４）
5’CTTTAACTTCAGCCAATAGCATTATGT3’（配列番号１５）
２つのプライマーが追加の周囲ＤＮＡを増幅するのに用いられた。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結した。連結環状ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物はHinfI又はRsaIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はクローニングされ配列決定された。７３０ｂｐの追加の配列の後に、ストップコドンが配列決定したRsaI断片中に見出された。図２に示された完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHIIエンドヌクレアーゼをコードしている。この分子量はSDS-PAGEゲル上の明確なサイズ（４６．５ｋＤａ）と非常に適合している。
【００５３】
３．bssHIIR遺伝子のpUC19中での発現
E.coli宿主を予め修飾するために、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子をpACYC184中にクローニングした。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを用いたＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをＡＴＧ開始コドンの前に組み込んだ。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニングした。挿入を有する３つのクローンが見つかったが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の細胞抽出物中に明らかなBssHII活性は見られなかった。挿入はＰＣＲ増幅の間に変異をもたらすと結論された。pUC19からのBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現もまた漏出性(leaky)の発現のため不安定であろう。
【００５４】
４．T7発現ベクターpET21AT中のbssHIIR遺伝子の発現
bssHII遺伝子を発現させる２番目の企てで、T7発現ベクターpET21ATが厳密に調製された発現に用いられた。ベクターpET21ATはT7プロモーターの上流に転写終了暗号を４コピー担っている。pLysSの共形質転換体は非誘導条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しコンパチブルベクターpLG339（pSC101由来）中にクローニングした。以下の通りの２つのプライマーをbssHIIR遺伝子増幅のために設計した。
【００５５】
前向きプライマー
（XbaI部位）
5’AGCTCTAGAGGAGGTAAATAAATGGGAGAAAACCAAGAATCAATATGGGCA3’（配列番号 １６）
逆向きプライマー
（BamHI部位）
5’CGCGGATCCTCAGAATTGGAAGTTTTCTCTAATCCATTCATC3’（配列番号 １７）
bssHIIR遺伝子をVent（登録商標）ポリメラーゼを用いたＰＣＲ(９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分で２０回)により増幅し、pET21AT中にクローニングした。T7発現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換させた。１２の単離体を対数増殖期後半（約１２０klett単位）まで培養し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。ＩＰＴＧ誘導を３時間行い細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイを行った。１２クローン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼを生産していた。１つのクローンは500mL細胞培養で誘導し、その細胞抽出物を１０， １００， １０００倍希釈しラムダＤＮＡ上でBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイするのに用いた。図５はアッセイ結果を示す。細胞抽出物は１０倍及び１００倍希釈でBssHII活性を表した（レーン２及び３）。
【００５６】
５．bssHIIM2遺伝子のクローニング
II型制限−修飾系において、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子とその同族メチラーゼ遺伝子は通常互いにきわめて近接して並んでいる。bssHIIR遺伝子の上流のＤＮＡを逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定した。上流の配列は周知のリボゾームrRNA配列と相同性がある。従って、真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流に位置しているに違いない。bssHIIR遺伝子の下流のメチラーゼ遺伝子をクローニングするために１セットのプライマーを以下の通りに作成した。
【００５７】
5’TCTTTCGTCGCTCAGGTTCTGAAGTAC3’（配列番号１８）
5’TGATTAAAAACAAAGTCGAAAGATTCG3’（配列番号１９）
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをAciI, AluI, ApoI, BsaWI, EaeI, HhaII, HaeIII, MseI, Sau3AI又はTsp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物はHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し自己連結させたゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出された。３つのＰＣＲ産物をクローニングし配列決定した。未終結転写解読枠が新たに得られた８９５ｂｐの配列中に見出されGenbankの周知遺伝子と比較した。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ酸配列を有する。
【００５８】
残りのbssHIIM2遺伝子をクローニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットを以下のように合成した。
【００５９】
5’GGAAAATGTAGCGAACTTGAAAGGTGT3’（配列番号２０）
5’ACAAAGAATGGAGGGTTGATTTTCTCA3’（配列番号２１）
これらの２つのプライマーを下流の配列を増幅するために使用した。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをAvaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, HaeIII, Hinf1I, MboI, MseI, RsaI, Sau3AI, Sau96I, SpeI, StyI, TaiI, TfiI, Tsp45I又はTsp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物がHaeIII, Hinf1I, MboI, Sau3AI及びStyIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中の逆ＰＣＲ産物中に見出された。StyIで分解し自己連結したＤＮＡからのＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングし、挿入について配列決定した。新たに得られた２５０ｂｐのＤＮＡ配列中にストップコドンが見出された。図４に示した完全なBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．２ＫＤａの分子量を有する３７５アミノ酸のBssHIIメチラーゼタンパク質をコードしていた。
【００６０】
６．bssHIIM2で予め修飾した宿主細胞中のbssHIIR遺伝子の発現
完全なbssHIIM2遺伝子を以下に示す２つのプライマーを用いて増幅した。
【００６１】
5’CAAGGATCC(BamHI部位)GGAGGT(リボソーム結合部位)TAATTAAATGAATGGATTAGAGAAAACTTCCAAT3’（配列番号２２）
5’TTCGGATCC(BamHI部位)TTAAACAAGTTTAGGTAAACCTTTGAAGGC3’（配列番号２３）bssHIIM2遺伝子をプラスミドベクターpLG339中に挿入した。予め修飾したE.coli宿主細胞ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生じた株ER2417(pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)を500mLのAp(50μg/mL), Km(50μg/mL), Cm(30μg/mL)添加ＬＢ中で３０℃で対数増殖期後半(120-150klett単位)まで培養した。ＩＰＴＧを培養に最終濃度０．５ｍＭまで添加した。３時間のＩＰＴＧ誘導に続いて細胞を採取しリゾチームと超音波処理により溶解させた。細胞抽出物についてラムダＤＮＡ上でBssHII活性をアッセイした。そのクローンはE.coli細胞湿重１グラム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
【００６２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００６３】
【表１】
【００６４】
配列番号：２
配列の長さ：１６０８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1605
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】
配列番号：３
配列の長さ：１２５４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1251
【００６９】
【表５】
【００７０】
【表６】
【００７１】
【表７】
【００７２】
配列番号：４
配列の長さ：１１２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1125
【００７３】
【表８】
【００７４】
【表９】
【００７５】
【表１０】
【００７６】
配列番号：５
配列の長さ：６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７７】
【表１１】
【００７８】
配列番号：６
配列の長さ：６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７９】
【表１２】
【００８０】
配列番号：７
配列の長さ：１６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：5
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：８及び１４
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：１１
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８１】
【表１３】
【００８２】
配列番号：８
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：９
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：１５
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：３、６及び１２
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８３】
【表１４】
【００８４】
配列番号：９
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：３及び９
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：１５
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：６及び１２
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８５】
【表１５】
【００８６】
配列番号：１０
配列の長さ：５９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００８７】
【表１６】
【００８８】
配列番号：１１
配列の長さ：２０アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００８９】
【表１７】
【００９０】
配列番号：１２
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９１】
【表１８】
【００９２】
配列番号：１３
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９３】
【表１９】
【００９４】
配列番号：１４
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９５】
【表２０】
【００９６】
配列番号：１５
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９７】
【表２１】
【００９８】
配列番号：１６
配列の長さ：５１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９９】
【表２２】
【０１００】
配列番号：１７
配列の長さ：４２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０１】
【表２３】
【０１０２】
配列番号：１８
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０３】
【表２４】
【０１０４】
配列番号：１９
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０５】
【表２５】
【０１０６】
配列番号：２０
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０７】
【表２６】
【０１０８】
配列番号：２１
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０９】
【表２７】
【０１１０】
配列番号：２２
配列の長さ：４９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１１１】
【表２８】
【０１１２】
配列番号：２３
配列の長さ：３９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１１３】
【表２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】多重特異性BssHII遺伝子(bssHIIM1)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図２】多重特異性BssHII遺伝子(bssHIIM1)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図３】 BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図４】 BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図５】細胞抽出物とλＤＮＡを用いたBssHIIエンドヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
【図６】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図７】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図８】 BssHII制限−修飾系の遺伝子構成を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明はＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼとＢｓｓＨＩＩメチラーゼをコードする組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤＮＡからのＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関する。
【０００２】
II型制限エンドヌクレアーゼは細菌中に自然にできる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼが他の細菌成分から精製されると、実験室でＤＮＡ分子を切断して分子クローニング及び遺伝子の特徴付けのための精密な断片を得ることに用いることができる。
【０００３】
【従来の技術】
制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子上のヌクレオチドの特定の配列（認識配列）を認識し結合して働く。一度、結合すると認識配列の内部でまたは一端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは異なる認識配列に親和性を有する。独特の特異性を有する２１１以上の制限エンドヌクレアーゼが今日までに研究された何百もの細菌種の中から同定されている(RobertsとMaceils, Nucl.Acids Res.24:223-235,(1996))。
【０００４】
細菌は種毎にせいぜい少数の制限エンドヌクレアーゼを持つにすぎないという傾向がある。エンドヌクレアーゼは典型的には由来する細菌に従って名前が付けられる。例えば、Deinococcus radiophilusは DraI, DraII, DraIIIと名付けられた３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを生産する。これら３つの酵素はそれぞれ5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3'及び5'CACNNNGTG3'という配列を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13は5'GAATTC3'という配列を認識する酵素、EcoRIだけを生産する。
【０００５】
自然にでは、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の繁栄のために防御的な役割を果たすと考えられている。制限エンドヌクレアーゼは細菌を破壊しまたは細菌に寄生するであろうウィルス及びプラスミドのような外来性ＤＮＡ分子による感染に対して細菌が抵抗することを可能にする。認識配列がある度に侵入外来性ＤＮＡ分子を切断することにより抵抗性を与える。この切断が生じると多くの感染遺伝子は無力になり、ＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによる更なる分解をうけやすくなる。
【０００６】
細菌の防御システムの２番目の構成成分は修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼを補足し、細菌が自己のＤＮＡを防御し外来性感染ＤＮＡを区別し得る手段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ配列を認識し結合する。しかし、ＤＮＡを切断する代わりにメチル基の付加により配列内の特定のヌクレオチドを化学的に修飾する。メチル化の後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼにより切断されない。細菌細胞のＤＮＡはその細菌の修飾メチラーゼの働きで常に充分に修飾されている。それ故に、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に無反応性である。制限エンドヌクレアーゼの認識及び開裂に感受性であるのは未修飾で、それ故外来性と見なし得るＤＮＡのみである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、今や遺伝子をクローニングしそれらがコードするタンパク質及び酵素を従来の精製技術で得られるより大量に生産することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を単離する鍵は複雑な「ライブラリー」すなわち、「ショットガン」方法により得たクローン集団中のクローンを10-3から10-4より低い頻度で出現するときに同定する簡単で確かな方法を開発することである。好ましくは、その方法は所望であるがまれなクローンが生き残る間に不要な多数のクローンが破壊されるように選択的であるべきである。
【０００８】
II型制限−修飾系は高頻度でクローニングされつつある。最初のクローニングシステムは制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段としてバクテリオファージ感染を用いた(EcoRII: Kosykhら、Molec.Gen.Genet.178:717-719,(1980); HhaII:Mannら、Gene 3:97-112,(1978); PstI:Walderら、Proc.Nat.Acad.Sci.78:1503-1507,(1981))。細菌内の制限−修飾系の存在は細菌がバクテリオファージによる感染へ抵抗することを可能にするので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を有する細胞は原理的にはファージに曝されたライブラリーからの生き残りとして選択的に単離され得る。しかし、この方法は限定的な価値しかないことがわかった。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は選択的な生存を授与する充分なファージ抵抗性が常に現れるのではないことがわかった。
【０００９】
別のクローニングアプローチはプラスミドを増殖させるＥ．ｃｏｌｉ中へのプラスミド運搬として最初に特徴づけられた形質転換系を含む(EcoRV:Bougueleretら,Nucl.Acid.Res.12:3659-3676(1984); PaeR7:Gingeras及びBrooks,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:402-406,(1983); Theriault及びRoy,Gene 19:355-359(1982);PvuII:Blumenthalら、J.Bacteriol.164:501-509,(1985))。
【００１０】
３番目のアプローチ、すなわち増大しつつある系のクローニングに用いられるアプローチの一つは活性メチラーゼ遺伝子に向けられる(Wilson,1993年４月６日に発行されたU.S.Patent No.5,200,333及びBsuRI:Kissら、Nucl.Acid.Res.13:6403-6421,(1985))。制限と修飾遺伝子はたいてい近接して連鎖しているので、たいてい両遺伝子は同時にクローニングできる。しかし、この選択により常に完全な制限系が得られるとは限られず、そのかわりにメチラーゼ遺伝子のみが得られることがある(BspRI:Szomolanyiら、Gene 10:219-225,(1980);BcnI:Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982);BsuRI:Kiss及びBaldauf,Gene 21:111-119,(1983);及びMspI:Walderら、J.Biol.Chem.258:1235
-1241,(1983))。
【００１１】
より最近の方法、すなわち「エンドブルー法(endo-blue method)」がdinD::lacZ融合を含むE.Coliの指標株に基づいてE.coli中の制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングのために記載された(Fomenkovら、1996年3月12日に発行されたU.S.Patent No.5,498,535、Fomenkovら、Nucl.Acids Res.22:2399-2403,(1994))。この方法は制限エンドヌクレアーゼまたは非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷に続いて起こるE.coli ＳＯＳ反応を利用する。多数の熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（Tth111I, BsoBI, Tfヌクレアーゼ)がこの方法によりクローニングされた。
【００１２】
E.coliでのこれらの系のクローニングの別の障害が多様なメチラーゼのクローニング過程で発見された。多くのE.coli株は（クローニングに通常用いられる株も含めて）シトシンのメチル化を含むＤＮＡの導入に抵抗するシステムを持っている(Raleigh及びWilson, Proc.Natl.Acad.Sci., USA 83:9070-9074, (1986))。それ故、どのE.coli株をクローニングに用いるかも注意深く考える必要がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
精製された制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組み換え分子を創るのに有用なツールなので、これらの酵素を大量に生産する組み換えＤＮＡ技術を通して細菌株を得ることに商業的な動機がある。そのような過剰発現株はまた酵素精製の仕事をも簡単にするであろう。
【００１４】
本発明はBacillus stearothermophilus H3 E.coli.からの多重特異性(multi-specific)メチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)、BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)及び同族BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)をコードする組み換えＤＮＡに関する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
BssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子は最初、２カ所のBssHII部位を有する修飾pLITMUS28ベクターを用いてSau3AIライブラリー中にクローニングした(New England Biolabs,Inc.,Beverly,MA)。多重特異性BssHIIメチラーゼの発現は２カ所のBssHII部位をBssHII分解に対して抵抗性にする。驚くべきことに、クローニングしたメチラーゼはまたBssHII部位（5’GCGCGC3’）に加え他の部位も修飾する。即ち、このメチラーゼはまたBsrFI（5’RCCGGY3’）及びHaeII部位（5’RGCGCY3’）並びに部分的にはEagI（5’CGGCCG3’）及びMluI部位（5’ACGCGT3’）を修飾する。単一特異性BssHIIメチラーゼはB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡから調製した部分的Sau3AIライブラリーから回収できなかった。
【００１６】
BssHII制限エンドヌクレアーゼのクローニングを容易にするために、多量のBssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質がB.stearothermophilus H3細胞から精製された。Ｎ末端アミノ酸配列は以下のように決定された。(Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）。
【００１７】
多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)に近接したＤＮＡ断片はBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発見を期待して配列決定された。多重特異性メチラーゼ遺伝子の周囲の５０００ｂｐ以上のＤＮＡが配列決定された。転写解読枠のアミノ酸配列への翻訳はBssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に適合しなかった。真のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子はB.stearothermophilus H3染色体の別の場所に位置していそうだと結論づけた。
【００１８】
BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の位置を決定するために、２セットの縮重プライマー(degenerate primer)をタンパク質の配列に基づいて設計し、ＰＣＲでB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡ由来のBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐを増幅するのに用いた。次いで、pUC19(ATCC 37254)中にクローニングし挿入の配列決定をした。１セットの逆ＰＣＲ（inverse ＰＣＲ)プライマーを当該配列のわかっている５９ｂｐ配列から設計した。逆ＰＣＲ産物はSau3AIで分解し、自己連結したB.steatothermophilus H3ゲノムＤＮＡ中に見出された。逆ＰＣＲ ＤＮＡをクローニングし配列決定した。これによりさらに４６５ｂｐの新しいＤＮＡコード配列が得られた。逆ＰＣＲの別のセットを４６５ｂｐ配列の末端から設計しHinfI又はRsaIで分解し自己連結したB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡからBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りの部分を増幅するのに用いた。逆ＰＣＲ産物をクローニングし、配列決定した。別の７３０ｂｐの新しい配列の後に、ストップコドンがRsaI断片中に見出された。完全なBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)は１２５４ｂｐであり（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸BssHII制限エンドヌクレアーゼをコードしていた。
【００１９】
E.coli染色体を予め修飾するために、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIMI)をコンパチブルベクターpACYC184(ATCC 37033)にクローニングした。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位及び最適スペース(spacing)をbssHIIR遺伝子の前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングした。ＰＣＲ挿入を担っている３つの単離体が見出された。しかし、ＩＰＴＧ誘導細胞培養では活性は検出できなかった。３つの挿入はbssHIIR遺伝子中に変異をもたらしたと結論された。
【００２０】
ベクターpUC19はlacプロモーターを含む高コピー数プラスミドである。lacプロモーターからの遺伝子の発現は厳密に調節されていない。従って、T7プロモーターのような厳密に調節されたプロモーターがbssHIIR遺伝子の発現に好ましいであろうと判断された。bssHIIR遺伝子は両側にXbaIとBamHI部位のあるプライマーを用いてＰＣＲで増幅された。効率的なリボソーム結合部位と最適スペースを遺伝子の前部に組み込んだ。ＰＣＲ産物をT7プロモータの上流に転写終了暗号を有するT7発現ベクターpET21AT(New England Biolabs Inc.,Berverly, MA)に連結した。最初bssHIIM1遺伝子をベクターpLG339中に挿入した。次いでエンドヌクレアーゼを担っているプラスミドをE.coli細胞ER2504(pLysS, pLG-BssHIIM1)に形質転換した。pLysS, pLG-BssHIIM1及びpET21AT-BssHIIRを担っているE.coli細胞をＩＰＴＧで誘導し、細胞抽出物のBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。１２の単離体由来の細胞抽出物についてアッセイを行ったところ、１２クローン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼ活性を産生していた。１実施例を図４に示す。ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び同族メチラーゼ遺伝子は互いに近接して位置しているので、１セットの逆ＰＣＲプライマーを制限エンドヌクレアーゼ配列の末端に基づいて合成した。下流配列を逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングした。真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)を２段階の逆ＰＣＲでクローニングした。完全なbssHIIM2遺伝子をＰＣＲにより増幅し、E.coli染色体を予め修飾すべくpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339(ATCC37131)中にクローニングした。予め修飾した宿主ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生じた株ER2417（pLysP,pLG-BssHIIM2,pET21AT-BssHIIR）はＩＰＴＧ誘導後に１×１０5単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
【００２１】
【発明の実施の形態】
ここに記載された方法によると、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子、BssHII制限エンドヌクレアーゼ及び同族メチラーゼ遺伝子は好ましくは以下の段階を経てクローニングされ発現される。
【００２２】
１．B.stearothermophilus H3のゲノムＤＮＡを精製する。
【００２３】
２．ＤＮＡをSau3AIのような制限エンドヌクレアーゼ又はそのアイソシゾマーのいずれかで部分的に分解し、完全なBssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を生成させる。代わりに、段階９を経ずにＮ末端アミノ酸配列から設計された縮重プライマーを用いたＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより直接BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングすることもできる。
【００２４】
３．Sau3AIで分解したゲノムＤＮＡを次いで２つのBssHII部位を有するBamHI-開裂/CIPで処理したpLITMUSクローニングベクター中に連結させる。連結ＤＮＡを適切な宿主、即ちE.coli株RR1のようなHsdR-, McrBC-, Mrr- 株を形質転換させるのに用いる。ＤＮＡ/細胞混合物を次いで形質転換細胞を選択するアンピシリン培地に播く。インキュベーション後、形質転換コロニーを採取し増幅させ最初の細胞ライブラリーを形成する。
【００２５】
４．次に組み換えプラスミドを最初の細胞ライブラリー全体から精製し、最初のプラスミドライブラリーを作る。次いで、精製プラスミドライブラリーをBssHII制限エンドヌクレアーゼまたはBssHIIアイソシゾマーのいずれかを用いてインビトロで完全に分解させる。BssHIIエンドヌクレアーゼ分解は未修飾でメチラーゼを含有していないクローンを選択的に分解し、BssHIIメチラーゼ遺伝子を有するクローンの相対的頻度を高める。
【００２６】
５．多重特異性BssHIIメチラーゼクローンの同定
分解したプラスミドライブラリーＤＮＡはE.coli株RR1のような宿主に戻し形質転換させ、アンピシリンプレート上に播いて再び形質転換コロニーを得る。コロニーを拾いそのプラスミドを調製しBssHII分解に抵抗性かどうかを決定するために精製プラスミドＤＮＡをインビトロでBssHIIエンドヌクレアーゼとインキュベートすることによりBssHIIメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
【００２７】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされたことを確認したら、クローンを制限地図作製及び欠失地図作製により分析する。次いで、完全な挿入について配列決定する。このアプローチ後に、BssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子に対応した１つの転写解読枠を見つける。クローニングしたメチラーゼはBssHII部位（5’GCGCGC3’)の他にいくつかの他の部位を修飾する。多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子を担っているプラスミドＤＮＡもBsrFI(5’RCCGGY3’)及びHaeII(5'RGCGCY3')分解に抵抗性であり、またEagI（5’CGGCCG3’)及びMlUI(5’ACGCGT3’)分解に部分的に抵抗性である。クローニングしたメチラーゼは多重特異性メチラーゼであると結論される。
【００２８】
７．BssHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質を多量に精製しＮ末端アミノ酸配列を決定する。Ｎ末端配列は次の通りである。(Met)Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）
８．上のアプローチに基づいて、メチラーゼ含有クローンを用いて多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子の周囲の5.8KbのＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ配列を総ての６つの枠に翻訳し、BssHII制限エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列と比較する。しかし、精製BssHII制限エンドヌクレアーゼの翻訳アミノ酸配列とＮ末端アミノ酸配列の間に明らかな同一性/相同性は認められない。真のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は多重特異性メチラーゼの隣には位置していないと結論される。
【００２９】
９．BssHIIエンドヌクレアーゼをＮ末端アミノ酸配列に基づいてＰＣＲ及び逆ＰＣＲで直接クローニングする努力がなされる。２セットの縮重プライマーを最初の５アミノ酸残基(MGENQE)（配列番号５）及び１５番目から２０番目の残基(DKAQLV)（配列番号６）から設計する。プライマーをB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐをＰＣＲにより増幅するのに用いる。多数のＰＣＲ産物が見出され５９〜６７ｂｐのＤＮＡ断片をゲル精製し、pUC19にクローニングし配列決定する。２クローンのうちの１つは期待されるＮ末端アミノ酸配列と同一である翻訳アミノ酸配列を有していた。
【００３０】
１０．逆ＰＣＲプライマーを最初の５９ｂｐ ＤＮＡから設計し、周囲のＤＮＡ配列をB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡから逆ＰＣＲにより増幅するのに用いる。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを以下の制限酵素で分解する。６ｂｐ認識配列を有するAatII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂｐ認識配列を有するSau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIである。分解により逆ＰＣＲ反応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じる。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一のＰＣＲ産物がSau3AI, MboI及びAciIで分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をpUC19中にクローニングし配列決定する。その結果４６５ｂｐの新しい配列が生じる。
【００３１】
１１．逆ＰＣＲプライマーを465bpの新しい配列の末端から設計し、さらに周囲のＤＮＡを増幅するのに用いる。 B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで分解する。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一の逆ＰＣＲ産物がHinfI又はRsaI分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をクローニングし、配列決定する。７３０ｂｐのさらなる配列の後に、配列決定されたRsaI断片中にストップコドンが見出される。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ ＋ ４６５ｂｐ ＋ ７３０ｂｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHiiエンドヌクレアーゼをコードしている。
【００３２】
１２．多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子をpACYC184(ATCC 37033)中にクローニングしE.coli宿主を予め修飾する。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させる。効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをATG開始コドンの前に組み込む。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニングする。挿入を有する３つのクローンが見出されるが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の抽出物中にBssHII活性は見出されない。
【００３３】
１３．bssHIIR遺伝子の発現の２回目の試みにおいて、T7発現ベクターpET21ATが厳密な調節の発現に用いられる(F.W.StudierとB.A.Moffatt, J.Mol.Biol.189:113-130,(1986))。ベクターpET21ATはT7プロモーターの上流の転写終了暗号を４コピー有している。pLysSの共形質転換(co-transformation)(F.W.Studier, J.Mol.Biol.219:37-44(1991))は非誘導条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339(ATCC 37131)中にクローニングする。bssHIIR遺伝子をＰＣＲで増幅しpET21AT中にクローニングする。T7発現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換する。１２の単離体がＩＰＴＧにより誘導され、細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。総てのクローンはBssHIIエンドヌクレアーゼを生産する。
【００３４】
１４．bssHIIR遺伝子に近接したメチラーゼ遺伝子をクローニングするために、１セットのプライマーを下流のＤＮＡ配列を増幅するために作る。逆ＰＣＲ産物がHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し、自己連結したゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出される。逆ＰＣＲ産物をクローニングし配列決定される。未終結の転写解読枠が新しく得られた８９５ｂｐ配列中に見出され、Genbankの周知遺伝子と配列を比較する。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ酸配列を有している。
【００３５】
１５．２番目のセットの逆ＰＣＲプライマーを合成し下流の配列を増幅するの用いる。逆ＰＣＲ産物はStyIで分解して自己連結させたＤＮＡのＰＣＲ反応物中に見出される。ＤＮＡ産物をpUC19中にクローニングし、その挿入について配列決定する。完全BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．２ｋＤａの分子量を有するBssHIIメチラーゼタンパク質をコードすることが判明する。
【００３６】
１６．完全bssHIIM2遺伝子を増幅しpLG339ベクターに挿入する。予め修飾されたE.coli宿主細胞,ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換する。生じた株ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)(NEB#1070)はE.coli細胞湿重１グラム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産する。
【００３７】
NEB#1070のサンプルはブタペスト条約の条件に従ってAmerican Type Culture Collectionに１９９７年２月２４日に寄託し、ATCC受託番号９８３３４を得た。
【００３８】
【実施例】
本発明は以下の実施例によりさらに実証される。実施例は本発明の理解を助けるために提供されるが発明を限定するものとは解釈されない。
【００３９】
上及び以下で引用する文献は参考として本明細書に導入する。
【００４０】
実施例１
BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
１．メチラーゼ選択法を用いた多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)のクローニング
１０μｇのB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを4, 2, 1, 0.5, 又は0.25単位のSau3AIを用いて37℃、３０分間部分分解した。部分分解したＤＮＡを電気泳動により分析した。１単位及び０．５単位のSau3AI分解により限定部分分解が生じたことが判明した。Sau3AI部分分解B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをBamHI開裂/CIP処理pLITMUS28(２つのBssHII部位を持つpUC19誘導体、New England Biolabs Inc.,Baverly,MA)中に16℃一晩で連結した。連結ＤＮＡをRR1 コンピテント細胞に形質転換し、アンピシリンプレート上に播いた。トータル約１×１０5 細胞が形質転換実験で得られた。これらの細胞を一緒にプールし１リッターのAp添加LBブイヨン中に接種し３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを最初の細胞ライブラリーから調製した。10, 5, 2及び1μｇのプラスミドＤＮＡを４０単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを用いて５０℃で４時間分解した。BssHII分解ＤＮＡをRR1コンピテント細胞中に再形質転換した。プラスミドを再び生存形質転換体から単離し、BssHII制限酵素で分解しプラスミドＤＮＡがBssHII分解に抵抗性かどうかを調べた。３６のプラスミドについてBssHII分解への抵抗性を調べた。３つの抵抗性クローン（＃３、＃１８及び＃３０）が見つかった。それらは約６ｋｂのゲノムＤＮＡ挿入を担っていた。これらのプラスミドをBsrFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI, HhaI, SacI又はEcoO109Iで分解したとき、BsrFI, HaeII, EagI又はMluI分解に対して抵抗性か又は部分的に抵抗性であることが判明した。細胞抽出物を３つの単離体から得て、BssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。明らかなエンドヌクレアーゼ活性は３つの細胞抽出物中に検出されなかった。完全な多重特異性メチラーゼ遺伝子と周囲のＤＮＡの配列を決定した。bssHIIM1遺伝子配列を図１に示す。明らかな制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は見つからなかった。このメチラーゼ遺伝子はファージがコードする多重特異性メチラーゼ遺伝子であろうと結論された。同様の遺伝子がクローニングされ、その配列が公表された（Schumann,J.,ら, Gene 157:103-104(1995)）。
【００４１】
２．bssHIIR遺伝子のクローニング
メチラーゼ選択法では多重特異性BssHIIメチラーゼを得られるだけなので、努力をBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の直接クローニングに集中した。BssHII制限エンドヌクレアーゼをB.stearothermophilus H3細胞からクロマトグラフィーにより精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定に当てた。Ｎ末端アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４２】
(Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? Pro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）。
【００４３】
（下線を引いた残基は縮重プライマーを設計するのに用いられた）。
【００４４】
前向き(forward)縮重プライマーは最初の６アミノ酸配列、(Met) Gly Glu Asn Gln Glu（配列番号５）に基づいて設計された。
【００４５】
前向きプライマー配列は以下の通りである。
【００４６】
5’ATGGGNGARAAYCARGA3’（配列番号７）
（N=A,C,G及びT;R=A,G;Y=C,T)
２つの逆向き(reverse)縮重プライマーをアミノ酸配列、Asp Lys Ala Gln Leu Val（配列番号６）に基づいて設計した。Leuをコードするコドンは６つの可能性(CUG,CUC,CUU,CUA,UUG及びUUA)があるため、２つの縮重プライマーを作成した。一方はLeuをコードするCTNで、もう一方はLeuをコードするTTRであった。この２つの逆向き縮重プライマーの配列は以下の通りである。
【００４７】
逆向きプライマー１
5’ACYAAYTGNGCYTTRTC3’（配列番号８）
(N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T)
逆向きプライマー２
5’ACNAGYTGNGCYTTRTC3’(配列番号９)
(N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T)
２つのＰＣＲ反応を計画した。前向きプライマーと逆向きプライマー１をＰＣＲ反応１に用いた。前向きプライマーと逆向きプライマー２をＰＣＲ反応２に用いた。ＤＮＡ増幅が正の結果を示せば、５９ｂｐＰＣＲ産物が期待できるであろう。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の５９ｂｐは最初の２０アミノ酸をコードしている。３０回のＰＣＲ増幅（９５℃１分、４０℃１分、７２℃３０秒、で３０回）の後、期待したＰＣＲ産物がアガロースゲル上で検出された。小ＤＮＡ産物を３％低温溶解アガロースゲルを通してゲル精製した。ゲル切片をβアガラーゼで処理しＤＮＡを沈降させpUC19中にクローニングした。挿入を有する２クローンについて配列決定した。最初の５９ｂｐのbssHIIR遺伝子の配列は以下の通りであった。
【００４８】
5'ATGGGAGAAAACCAAGAATCTATGGGCAAATCAGATATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１０）
コードアミノ酸配列は Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val（配列番号１１）であった。この配列は天然タンパク質のアミノ酸配列決定で得られたアミノ酸配列と完全に適合した。
【００４９】
残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために１セットの逆ＰＣＲプライマーを５９ｂｐのＤＮＡ配列から設計した。逆ＰＣＲプライマーは以下の通りであった。
【００５０】
5’GATATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１２）
5’TATTGATTCTTGGTTTTCTCCCAT3’（配列番号１３）
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを６ｂｐの認識配列を持つ制限酵素、AatII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂｐの認識配列を持つ制限酵素Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1L, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIを用いて２時間所望の温度で分解した。分解により逆ＰＣＲ反応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じた。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁し、逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はSau3AI, MboI及びAciIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はpUC19中にクローニングされ配列決定され、４６５ｂｐの新しい配列を生じた。
【００５１】
残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットが４６５ｂｐの新しい配列から設計された。プライマーの配列は以下の通りであった。
【００５２】
5’TCCGCTAATTACCTTACCATTATTGGT3’（配列番号１４）
5’CTTTAACTTCAGCCAATAGCATTATGT3’（配列番号１５）
２つのプライマーが追加の周囲ＤＮＡを増幅するのに用いられた。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結した。連結環状ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物はHinfI又はRsaIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はクローニングされ配列決定された。７３０ｂｐの追加の配列の後に、ストップコドンが配列決定したRsaI断片中に見出された。図２に示された完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHIIエンドヌクレアーゼをコードしている。この分子量はSDS-PAGEゲル上の明確なサイズ（４６．５ｋＤａ）と非常に適合している。
【００５３】
３．bssHIIR遺伝子のpUC19中での発現
E.coli宿主を予め修飾するために、多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子をpACYC184中にクローニングした。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを用いたＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをＡＴＧ開始コドンの前に組み込んだ。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニングした。挿入を有する３つのクローンが見つかったが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の細胞抽出物中に明らかなBssHII活性は見られなかった。挿入はＰＣＲ増幅の間に変異をもたらすと結論された。pUC19からのBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の発現もまた漏出性(leaky)の発現のため不安定であろう。
【００５４】
４．T7発現ベクターpET21AT中のbssHIIR遺伝子の発現
bssHII遺伝子を発現させる２番目の企てで、T7発現ベクターpET21ATが厳密に調製された発現に用いられた。ベクターpET21ATはT7プロモーターの上流に転写終了暗号を４コピー担っている。pLysSの共形質転換体は非誘導条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しコンパチブルベクターpLG339（pSC101由来）中にクローニングした。以下の通りの２つのプライマーをbssHIIR遺伝子増幅のために設計した。
【００５５】
前向きプライマー
（XbaI部位）
5’AGCTCTAGAGGAGGTAAATAAATGGGAGAAAACCAAGAATCAATATGGGCA3’（配列番号 １６）
逆向きプライマー
（BamHI部位）
5’CGCGGATCCTCAGAATTGGAAGTTTTCTCTAATCCATTCATC3’（配列番号 １７）
bssHIIR遺伝子をVent（登録商標）ポリメラーゼを用いたＰＣＲ(９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分で２０回)により増幅し、pET21AT中にクローニングした。T7発現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換させた。１２の単離体を対数増殖期後半（約１２０klett単位）まで培養し、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。ＩＰＴＧ誘導を３時間行い細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌクレアーゼ活性についてアッセイを行った。１２クローン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼを生産していた。１つのクローンは500mL細胞培養で誘導し、その細胞抽出物を１０， １００， １０００倍希釈しラムダＤＮＡ上でBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイするのに用いた。図５はアッセイ結果を示す。細胞抽出物は１０倍及び１００倍希釈でBssHII活性を表した（レーン２及び３）。
【００５６】
５．bssHIIM2遺伝子のクローニング
II型制限−修飾系において、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子とその同族メチラーゼ遺伝子は通常互いにきわめて近接して並んでいる。bssHIIR遺伝子の上流のＤＮＡを逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定した。上流の配列は周知のリボゾームrRNA配列と相同性がある。従って、真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流に位置しているに違いない。bssHIIR遺伝子の下流のメチラーゼ遺伝子をクローニングするために１セットのプライマーを以下の通りに作成した。
【００５７】
5’TCTTTCGTCGCTCAGGTTCTGAAGTAC3’（配列番号１８）
5’TGATTAAAAACAAAGTCGAAAGATTCG3’（配列番号１９）
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをAciI, AluI, ApoI, BsaWI, EaeI, HhaII, HaeIII, MseI, Sau3AI又はTsp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物はHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し自己連結させたゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出された。３つのＰＣＲ産物をクローニングし配列決定した。未終結転写解読枠が新たに得られた８９５ｂｐの配列中に見出されGenbankの周知遺伝子と比較した。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ酸配列を有する。
【００５８】
残りのbssHIIM2遺伝子をクローニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットを以下のように合成した。
【００５９】
5’GGAAAATGTAGCGAACTTGAAAGGTGT3’（配列番号２０）
5’ACAAAGAATGGAGGGTTGATTTTCTCA3’（配列番号２１）
これらの２つのプライマーを下流の配列を増幅するために使用した。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをAvaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, HaeIII, Hinf1I, MboI, MseI, RsaI, Sau3AI, Sau96I, SpeI, StyI, TaiI, TfiI, Tsp45I又はTsp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用いた。逆ＰＣＲ産物がHaeIII, Hinf1I, MboI, Sau3AI及びStyIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中の逆ＰＣＲ産物中に見出された。StyIで分解し自己連結したＤＮＡからのＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングし、挿入について配列決定した。新たに得られた２５０ｂｐのＤＮＡ配列中にストップコドンが見出された。図４に示した完全なBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．２ＫＤａの分子量を有する３７５アミノ酸のBssHIIメチラーゼタンパク質をコードしていた。
【００６０】
６．bssHIIM2で予め修飾した宿主細胞中のbssHIIR遺伝子の発現
完全なbssHIIM2遺伝子を以下に示す２つのプライマーを用いて増幅した。
【００６１】
5’CAAGGATCC(BamHI部位)GGAGGT(リボソーム結合部位)TAATTAAATGAATGGATTAGAGAAAACTTCCAAT3’（配列番号２２）
5’TTCGGATCC(BamHI部位)TTAAACAAGTTTAGGTAAACCTTTGAAGGC3’（配列番号２３）bssHIIM2遺伝子をプラスミドベクターpLG339中に挿入した。予め修飾したE.coli宿主細胞ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生じた株ER2417(pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)を500mLのAp(50μg/mL), Km(50μg/mL), Cm(30μg/mL)添加ＬＢ中で３０℃で対数増殖期後半(120-150klett単位)まで培養した。ＩＰＴＧを培養に最終濃度０．５ｍＭまで添加した。３時間のＩＰＴＧ誘導に続いて細胞を採取しリゾチームと超音波処理により溶解させた。細胞抽出物についてラムダＤＮＡ上でBssHII活性をアッセイした。そのクローンはE.coli細胞湿重１グラム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
【００６２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３１アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００６３】
【表１】
配列番号：２
配列の長さ：１６０８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1605
【００６５】
【表２】
【表３】
【表４】
配列番号：３
配列の長さ：１２５４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1251
【００６９】
【表５】
【表６】
【表７】
配列番号：４
配列の長さ：１１２８塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
特徴を表す名称/記号：Coding Sequence
存在位置：1...1125
【００７３】
【表８】
【表９】
【表１０】
配列番号：５
配列の長さ：６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７７】
【表１１】
配列番号：６
配列の長さ：６アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７９】
【表１２】
配列番号：７
配列の長さ：１６塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：5
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：８及び１４
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：１１
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８１】
【表１３】
配列番号：８
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：９
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：１５
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：３、６及び１２
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８３】
【表１４】
配列番号：９
配列の長さ：１７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
配列の特徴：
存在位置：３及び９
他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ
存在位置：１５
他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ
存在位置：６及び１２
他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８５】
【表１５】
配列番号：１０
配列の長さ：５９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００８７】
【表１６】
配列番号：１１
配列の長さ：２０アミノ酸
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００８９】
【表１７】
配列番号：１２
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９１】
【表１８】
配列番号：１３
配列の長さ：２４塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９３】
【表１９】
配列番号：１４
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９５】
【表２０】
配列番号：１５
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９７】
【表２１】
配列番号：１６
配列の長さ：５１塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【００９９】
【表２２】
配列番号：１７
配列の長さ：４２塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０１】
【表２３】
配列番号：１８
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０３】
【表２４】
配列番号：１９
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０５】
【表２５】
配列番号：２０
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０７】
【表２６】
配列番号：２１
配列の長さ：２７塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１０９】
【表２７】
配列番号：２２
配列の長さ：４９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１１１】
【表２８】
配列番号：２３
配列の長さ：３９塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ
ハイポセティカル：Ｎｏ
アンチセンス：Ｎｏ
【０１１３】
【表２９】
【図面の簡単な説明】
【図１】多重特異性BssHII遺伝子(bssHIIM1)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図２】多重特異性BssHII遺伝子(bssHIIM1)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号２）。
【図３】 BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図４】 BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号３）。
【図５】細胞抽出物とλＤＮＡを用いたBssHIIエンドヌクレアーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
【図６】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図７】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号４）。
【図８】 BssHII制限−修飾系の遺伝子構成を示す図である。
Claims (6)
- 配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
- 配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む制限エンドヌクレアーゼをコードするＤＮＡ断片が挿入されたベクターからなる組み換えＤＮＡベクター。
- 配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む制限エンドヌクレアーゼ及び配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む同族メチラーゼをコードする単離ＤＮＡ。
- 請求項３に記載された単離ＤＮＡを含むクローニングベクター。
- 請求項２の組み換えＤＮＡベクター又は請求項４のクローニングベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 制限エンドヌクレアーゼを生産する方法であって、請求項２又は４に記載されたベクターで形質転換された宿主細胞を当該エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下で培養することを含む方法。
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