JP3889098B2 - 大腸菌によりＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼをクローニングし生産する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びにこの組換えＤＮＡからのＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
II型制限エンドヌクレアーゼは細菌で天然に存在する一群の酵素である。細菌の他の成分を除去して制限エンドヌクレアーゼを精製すると、該酵素はＤＮＡ分子を、分子クローニングと遺伝子キャラクタリゼーション用の正確なフラグメントに切断するために、実験室で使用できる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列（“認識配列”）を認識し結合することによって作用する。結合すると、該酵素は認識配列内で、又はその一方の側で分子を切断する。別の制限エンドヌクレアーゼは別の認識配列にアフィニティーを有する。１８０を超える独特の特異性をもつ制限エンドヌクレアーゼが、現在まで試験された何百もの細菌の種から同定された。
【０００４】
細菌は多くとも種当たり少数の制限エンドヌクレアーゼのみを有する傾向がある。通常、エンドヌクレアーゼは由来する細菌に基づいて命名される。即ち、例えばDeinococcus radiophilus という種は３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成するが、それらの名はＤｒａＩ、ＤｒａII、ＤＲＡIII である。これらの酵素は、それぞれ配列ＴＴＴＡＡＡ（配列番号１）、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ（配列番号２）、ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ（配列番号３）を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13 は唯一の酵素ＥｃｏＲＩを合成するが、それは配列ＧＡＡＴＴＣ（配列番号４）を認識する。
【０００５】
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の生存に関して防御的役割をもつと考えられている。制限エンドヌクレアーゼは、細菌を破壊し又は細菌に寄生するウイルスやプラスミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対して細菌を抵抗性にすることができる。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が存在する毎に、侵入してくる外来ＤＮＡ分子を切断することによって抵抗性を付与する。切断が起ると、多くの感染性遺伝子は無能になり、そのＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによって更に分解されやすくなる。
【０００６】
細菌の防御システムの第２の成分は修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに対して相補的であり、細菌が自身のＤＮＡを防御でき、自身のＤＮＡを外来の感染性ＤＮＡから区別できる手段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同一の認識配列を認識し結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することで配列内の１つのヌクレオチド又は他のヌクレオチドを化学修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって切断されない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性により常に十分に修飾されている。そのため、細菌細胞のＤＮＡは、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識と切断に感受性なのは、未修飾で、そのため同定可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、遺伝子をクローニングし、該遺伝子がコードするタンパク質や酵素を従来の精製技術によって得られるより多量に生産することが現在では可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための鍵は、複雑な“ライブラリー”即ち“ショットガン”法により得られるクローンの集団内で、あるクローンが１０-3〜１０-4の低い頻度で得られるときに、該クローンを同定する簡単で信頼性のある方法を開発することである。望ましくない大部分のクローンが破壊され、目的とするまれなクローンが生き残るような選択的な方法が好ましい。
【０００８】
II型の制限−修飾システムは盛んにクローニングされつつある。最初にクローニングされたシステムは、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定又は選別する手段としてバクテリオファージ感染を使用した（EcoRII：Kosykhら、Molec. Gen. Genet 178:717-719(1980) ；HhaII ：Mannら、Gene 3:97-112(1978) ；PstI：Walderら、Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507(1981)、それらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。細菌に制限−修飾システムが存在するとその細菌はバクテリオファージ感染に対して抵抗することができるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を有する細胞は原則として、ファージにさらされたライブラリーから生存細胞として選択的に単離されうる。しかし、この方法は限定された価値しかないことが判明した。即ち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、必ずしも選択的生存をさせるのに十分なファージ抵抗性を発現しないことが知見された。
【０００９】
別のクローニングのアプローチは、初めプラスミド担持として特徴付けられたシステムをE. coli クローニングプラスミド内へ転移することを含む（EcoRV ：Bougueleret ら、Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676(1984) ；PaeR7 ：GingerasとBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:402-406(1983)；Theriault とRoy, Gene 19:355-359(1982)；PvuII ：Blumenthalら、J. Bacteriol. 164:501-509(1985) 、これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。
【００１０】
第３のアプローチ、そして現在増え続けているたくさんのシステムをクローニングするために使用されている方法は活性メチラーゼ遺伝子を選別することによってクローニングするものである（本発明者らによる EPO No. 193,413（1986年９月３日公開）及びBsuRI ：Kissら、Nucl. Acid. Res. 13:6403-6421(1985) を参照されたい。これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。制限遺伝子と修飾遺伝子はしばしば接近して結合しているので、両方の遺伝子はしばしば同時にクローニングすることができる。しかし、この選択によって必ずしも完全な制限システムが得られるわけではなく、代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得られる（BspRI ：Szomolanyiら、Gene 10:219-225(1980) ；BcnI：Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982) ；BsuRI ：KissとBaldauf, Gene 21:111-119(1983)；MspI：Walderら、J. Biol. Chem 258:1235-1241(1983) 、これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。
【００１１】
より最近の方法（“エンド−ブルー（endo-blue ）法”）が、dinD::lacZ融合体を含むＥ．ｃｏｌｉの指示株に基づくＥ．ｃｏｌｉでの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接的クローニングについて記載された（Fomenkovら、Nucl. Acids Res. 22:2399-2403(1994) 、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。この方法は、エンドヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷後のＥ．ｃｏｌｉのＳＯＳ反応を用いる。いくつかの熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（TaqI、Tth111I 、BsoBI 、Tfヌクレアーゼ）がこの方法によりクローニングされた。
【００１２】
Ｅ．ｃｏｌｉでこれらのシステムをクローニングする際の別の障害が各種のメチラーゼをクローニングする過程で発見された。多くのＥ．ｃｏｌｉ株（クローニングに通常使用されるものを含む）は、シトシンメチル化を含有するＤＮＡの導入に抵抗性のシステムを有する（Raleigh とWilson、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074(1986)、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。それ故、クローニングにどのＥ．ｃｏｌｉ株を使うべきかを注意深く考察することも必要である。
【００１３】
外来の制限−修飾システムをクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉに導入したとき、メチラーゼとエンドヌクレアーゼの発現は、恐らくＥ．ｃｏｌｉでの遺伝子の転写又は翻訳がうまくいかないために、天然のエンドヌクレアーゼ生産株と比較して極めて低いことがある。特に、Ｅ．ｃｏｌｉへのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子のクローニングに当てはまる。これは２種の微生物のＧＣ含量が異なるためである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで十分発現させ、効率的な遺伝子発現に基づいて選別することができるクローニングシステムがあれば望ましい。
【００１４】
精製された制限エンドヌクレアーゼ及び有用性の程度は小さいが修飾メチラーゼは、実験室で遺伝子をキャラクタリゼーションするのに有用な道具であるので、組換えＤＮＡ技術によりこれらの酵素を豊富に合成する細菌株を得るという商業的動機が存在する。このような株は商業的に有用な量を生産する手段を提供すると同様に精製の仕事を簡単にするので有用であろう。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩをコードする単離ＤＮＡ及び改変したメチラーゼ選択法によるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのメチラーゼ遺伝子をＥ ．ｃｏｌｉにクローニングする方法に関する。最初は、標準メチラーゼ遺伝子選択方法を用いて、ライブラリー構築の間、高コピー数のクローニングベクターｐＵＣ１９を使用するＳｃａＩメチラーゼ遺伝子のクローニングを試みた。ｐＵＣ１９を使用するＳｃａＩメチラーゼ遺伝子のクローニングはできなかった。恐らくは、Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩメチラーゼ遺伝子が十分発現できなかったためと考えられる。もしＳｃａＩメチラーゼがＥ．ｃｏｌｉで有効に発現しないならば、プラスミドのＳｃａＩ部位はメチラーゼによって十分に修飾されないだろう。結果として、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼの攻撃後、プラスミドは切断され、プラスミドライブラリー中で失れるだろう。標準メチラーゼ選択は有効でなかったので、“エンド−ブルー法”を用いてＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングを試みた。１９の青色のコロニーが同定されたが、いずれにもＳｃａＩエンドヌクレアーゼ活性は検出できなかった。
【００１６】
Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩメチラーゼ遺伝子発現を増加させるために、ｐＲＲＳという名称の、ｌａｃＵＶ５プロモーターを含む高コピー数プラスミド（Skoglundら、Gene 88:1-5(1990）、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）をＳｃａＩメチラーゼ遺伝子をクローニングするために使用し、得られたライブラリーＤＮＡをメチラーゼ選択のために使用した。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を、次の４段階でｐＲＲＳにクローニングするのに成功した。（１）Ｓａｕ３ＡＩによって部分消化されたゲノムＤＮＡとＢａｍＨＩによって切断されＣＩＰ処理されたｐＲＲＳとの連結及びＥ．ｃｏｌｉＲＲ１コンピテント細胞の連結ＤＮＡによる形質転換、（２）混合プラスミドライブラリーの調製、（３）プラスミドＤＮＡライブラリーのＳｃａＩ消化、及びＲＲ１細胞の攻撃されたＤＮＡによる再形質転換、（４）生き残った細胞からのＳｃａＩ耐性プラスミドのスクリーニング。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子をクローニングした後、メチラーゼ遺伝子の両側のＤＮＡフラグメントをクローニングする努力をした。通常、特定の制限−修飾システムでメチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子は互いに隣接して存在している。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の左側のＤＮＡを、逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅でクローニングした。該ＤＮＡの配列決定を行ない、６つ全てのリーディングフレームで翻訳した。翻訳されたタンパク質配列を、部分精製したＳｃａＩタンパク質のＮ末端タンパク質配列と比較した。１つの予測タンパク質配列がＳｃａＩタンパク質のＮ末端配列とぴったりと合う。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を増幅してクローニングし、ｐＲＲＳベクターに連結し、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換した。
【００１７】
【発明の実施の態様】
ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子とＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし発現させる本発明の方法を図１で説明する。本方法は以下の段階を含む。
【００１８】
１．ストレプトマイセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）のゲノムＤＮＡを精製する。
【００１９】
２．完全なＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを生成する、Ｓａｕ３ＡＩ又はそのアイソシゾマーのいずれかなどの制限エンドヌクレアーゼで、該ＤＮＡを部分消化する。フラグメントはまた、クローニング可能な大きさ、即ち１−２０ｋｂであるべきである。
【００２０】
３．好ましくは、Ｓａｕ３ＡＩで消化されたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理されたｐＲＲＳなどの高発現ベクターと連結する。Ｐtac 、λＰL 、λＰR プロモーターを有する他のベクターも使用することができる。得られた混合物を使用して適切な宿主、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１などのｈｓｄＲ- 、ｍｃｒＢＣ- 、ｍｒｒ- 株を形質転換する。ＤＮＡ／細胞の混合物を、形質転換細胞用のアンピシリン選択培地に塗布する。インキュベーション後、形質転換細胞をまとめてプールし、第１細胞ライブラリーを作る。
【００２１】
４．組換えプラスミドを第１細胞ライブラリーから全体として精製し、第１プラスミドライブラリーを作る。それから、精製プラスミドライブラリーを、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ又は任意のＳｃａＩアイソシゾマーを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に消化する。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ消化により、未修飾でメチラーゼ非含有クローンが選択的に破壊され、ＳｃａＩメチラーゼ含有クローンの相対的頻度が増加する。
【００２２】
５．ＳｃａＩメチラーゼクローンの同定：消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１などの宿主に戻して形質転換を行ない、アンピシリンプレートに塗布して形質転換コロニーを再び得る。コロニーを拾い上げ、そのプラスミドＤＮＡを調製し、それがＳｃａＩ消化に抵抗性であるかどうかを決定するために、精製プラスミドＤＮＡをＳｃａＩエンドヌクレアーゼと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートしてＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
【００２３】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされたことが確立されたならば、クローンを制限地図作成と欠失地図作成により解析する。ＳｃａＩＭ遺伝子を含む領域を配列決定する。
【００２４】
７．ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の右側の合計６２３ｂｐＤＮＡの配列決定をした。このＤＮＡ配列を、プログラム“Ｂｌａｓｔｘ”を用いてＧｅｎｂａｎｋデータベースのすべての公知の遺伝子と比較した。配列の比較によると、この６２３ｂｐからの１つの予測されたオープンリーディングフレーム（終止せず）はＥ．ｃｏｌｉのコールドショックタンパク質に多少の相同性を有する。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の右側のＤＮＡは、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子であるはずがないことが結論された。
【００２５】
８．左側に結合しているＤＮＡをクローニングするために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＥ１、ＮｌａIII 、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩ制限酵素又は逆ＰＣＲ反応用の適切な大きさの鋳型ＤＮＡ（３ｋｂ未満）を生成する任意の他の制限酵素で消化する。消化ＤＮＡは、ＤＮＡの低濃度（２μｇ／ｍｌ未満）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の末端にアニールする１セットのプライマーを使用する逆ＰＣＲ反応のための鋳型として用いる。上記のプロトコルの後、ＰｖｕＩ切断、自己連結のゲノムＤＮＡから１．６ｋｂの逆ＰＣＲ産物を得る。該ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクローニングする。完全インサート（ｉｎｓｅｒｔ）を配列決定し、ＤＮＡ配列を全ての６つのリーディングフレームでアミノ酸配列に翻訳し、次にＳｃａＩのＮ末端タンパク質配列と比較する。このアプローチで、実際のＳｃａＩタンパク質配列と６つのアミノ酸が一致する６８４ｂｐの１つのオープンリーディングフレームが得られる。
【００２６】
９．次に、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を適合性プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を予め改変する。Ｅ．ｃｏｌｉでの翻訳効率を増大させるために、効果的なリボソーム結合部位と最適なスペーシングをメチラーゼ遺伝子の前に入れる。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。正方向のプライマーはリボソーム結合部位及びＡＴＧ開始コドンの前の６ｂｐのスペーシングを含む。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベクターｐＲＲＳにクローニングし、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変した細胞を形質転換する。
【００２７】
１０．ｐＡＣＹＣ１８４−ＳｃａＩＭ+ とｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を３０℃で一晩、定常相まで生育させる。細胞を回収し、音波処理で溶菌する。細胞抽出物のＳｃａＩエンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼをクロマトグラフィーで精製する。
【００２８】
以下の実施例で、本発明の好適実施態様を説明する。以下の実施例は単なる例示であり、本発明は以下の実施例に限定されるべきでないことが理解されよう。
【００２９】
【実施例】
ＳｃａＩ制限−修飾システムのクローニング
１．クローニングベクターとしてｐＵＣ１９を用いるＳｃａＩメチラーゼの選別
１つのＳｃａＩリンカーをｐＵＣ１９のＳｓｐＩ部位に挿入した。改変ｐＵＣ１９をライブラリー構築のために使用した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理のＰＵＣ１９ＤＮＡに連結した。ＳｍａＩで部分消化及び完全消化したゲノムＤＮＡを、ＳｍａＩ切断／ＣＩＰ処理のｐＵＣ１９ＤＮＡに連結した。連結ＤＮＡ混合物を用いてＲＲ１コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリンプレートに塗布した。ＳｍａＩ及びＳａｕ３ＡＩライブラリー中に、それぞれ合計１３，６００と６０，０００の細胞が見出された。プラスミドＤＮＡを各１次細胞ライブラリーから調製した。ライブラリーＤＮＡの５μｇ、２μｇ、１μｇを３７℃で２時間、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの１００ユニットで切断した。ＳｃａＩで攻撃されたＤＮＡを用いて、ＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。再び、プラスミドＤＮＡを生き残っている形質転換菌から分離し、ＳｃａＩ制限酵素で消化し、プラスミドＤＮＡがＳｃａＩ消化に耐性であるかどうかを試験した。Ｓａｕ３ＡＩライブラリーからの１４４の単離プラスミド及びＳｍａＩライブラリーからの５８の単離プラスミドのＳｃａＩ消化に対する抵抗性を解析した。ベクター中のＳｃａＩ部位の一方又は両方を失なった５つの耐性クローンを見出した。真の抵抗性クローン（メチラーゼ含有クローン）はこれら２つのライブラリーでは見出されなかった。
【００３０】
２．“エンド−ブルー法”を用いるＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングの試み
ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現されるのが貧弱であるならば、ＳｃａＩメチラーゼによる防御が無くともＥ．ｃｏｌｉでエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングするために“エンド−ブルー法”を使用できることが推察された。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳｃａＩゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理のｐＵＣ１９に連結し、それを用いてｄｉｎ１::ｌａｃＺ融合体を有するＥ．ｃｏｌｉの指示株を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ指示薬含有プレートに塗布した。１９の青色のコロニーが５０００のＡｐR 形質転換菌の中で見出された。個々の青色のコロニーを１０ｍｌのＬＢプラスＡｐ培地に植菌し、３０℃で一晩揺動した。細胞を回収し、１ｍｌの音波処理用緩衝液プラスリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）に再懸濁した。細胞抽出物の１μｌ、２．５μｌ、５μｌ、１０μｌを使用して、３７℃で１時間１μｇのλＤＮＡを切断した。ＳｃａＩ活性は、青色の単離菌のいずれの細胞抽出物中にも見出されなかった。クローンのどれもＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでいない、又はエンドヌクレアーゼ遺伝子がｉｎ ｖｉｔｒｏ検出のためによく発現しないことが結論された。
【００３１】
３．クローニングベクターとしてｐＲＲＳを使用するＳｃａＩメチラーゼ選別
メチラーゼ選別方法は、メチラーゼがＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を保有するベクターのＳｃａＩ部位を修飾できるように、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子がｉｎ ｖｉｖｏで適度なレベルで発現されることを必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子が、２種の微生物のＧＣ含量が異なるために、Ｅ．ｃｏｌｉで十分に発現されないことが公知である。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を高レベルで発現させるために、別の高コピー数ベクターｐＲＲＳをクローニングビヒクルとして使用した。プラスミドｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９の正規のｌａｃプロモーターより強いｌａｃＵＶ５プロモーターを有する。多重クローニング部位にクローニングされた遺伝子はｌａｃＵＶ５プロモーターに制御される。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理のｐＲＲＳベクターに連結し、連結ＤＮＡを用いてＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。合計１８，０００のＡｐR 形質転換菌を１次細胞ライブラリーとして得た。プラスミドＤＮＡを１次細胞ライブラリーから調製した。ライブラリーＤＮＡ５μｇをＳｃａＩ制限酵素１００ユニットで切断し、それを用いて再びＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。生き残っている形質転換菌を拾い上げ、培養した。プラスミドＤＮＡを個々の細胞の培養物から単離した。これらのプラスミドのいずれかがＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を有するかを試験するために、７８の個々のプラスミドをＳｃａＩエンドヌクレアーゼで消化した。プラスミド＃３７、＃３８、＃５４がＳｃａＩ消化に真に抵抗性であることが知見された。プラスミド＃５４が約５０００ｂｐのインサートを有し、それを更に解析した。１．７ｋｂのＳａｃＩフラグメント欠失クローンが依然として活性あるメチラーゼ遺伝子を有する。インサートのＰｓｔＩフラグメント（約２ｋｂ）の欠失はＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を不活性化し、欠失クローンをＳｃａＩエンドヌクレアーゼ切断に感受性にする。１つのＰｓｔＩ部位がＳｃａＩメチラーゼ遺伝子内に位置することが結論された。ＰｓｔＩ部位を囲むＤＮＡの配列決定の努力をした。３つのサブクローン（ＳａｃＩ〜ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII 〜ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ〜ＰｓｔＩ）を、ｐＵＣ１９ベクターを用いて構築した。ｐＵＣ１９のユニバーサルの正方向と逆方向のプライマーを使用して、ＤＮＡ配列を決定した。残りのＤＮＡをプライマーウォーキングにより配列決定した。メチラーゼモチーフＳＰＰＹ（配列番号９）とＤＰＦＬＧＳＧＴＴ（配列番号１０）を含む１つのオープンリーディングフレームを同定した。メチラーゼ遺伝子は下部の（ｂｏｔｔｏｍ）鎖によってコードされ、逆向きである。
【００３２】
ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定するために、メチラーゼ遺伝子の右側の６２３ｂｐのＤＮＡの配列決定をした。この一続きのＤＮＡをＧｅｎＢａｎｋの全ての公知の遺伝子と比較した。６２３ｂｐ内の１つの部分的なオープンリーディングフレームは、Ｅ．ｃｏｌｉのコールドショックタンパク質をコードする遺伝子と多少の相同性を有することが知見された。それ故、メチラーゼ遺伝子の左側のＤＮＡをクローニングし、配列決定することに努力を集中した。
【００３３】
４．ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
逆ＰＣＲによるＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング：逆ＰＣＲは公知のＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡをクローニングする有効な方法である。Ｓ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを逆ＰＣＲ反応のために、制限酵素ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＥＩ、ＮｌａIII 、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩで消化した。制限消化後、ＤＮＡを、フェノール−ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、９５％エタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。各々の消化されたＤＮＡを、低いＤＮＡ濃度（合計容量５００μｌ、２μｇ／ｍｌ）で自己連結させ、環状化した。連結ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 で一度、ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、９５％エタノールで沈澱させた。該ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用した（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、３０サイクル）。メチラーゼ遺伝子の末端にアニールする１セットのプライマーを次の様に設計した：
正方向のプライマー
【００３４】
【化１】
【００３５】
逆方向のプライマー
【００３６】
【化２】
【００３７】
１．６ｋｂの逆ＰＣＲ産物が自己連結ＰｖｕＩゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応で見出された。逆ＰＣＲ産物を、反応容量５０μｌ中（ＤＮＡ２μｇ、１０倍キナーゼ緩衝液５μｌ、ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ、０．１Ｍ ＡＴＰ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、ＴＥ４１μｌ、３７℃、１時間）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した。該ＤＮＡをｐＵＣ１９にクローニングした。インサートを配列決定するために、いくつかの欠失クローンを構築した（ＮｇｏＭＩ及びＳｍａＩ欠失、ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＥII欠失、ＢｓｓＨII及びＢｓｓＨII欠失、ＡａｔII及びＡａｔII欠失）。ＤＮＡ配列を、ｐＵＣ１９の正方向と逆方向のプライマー及びカスタマーメイド（customer-made ）のプライマーを用いて配列決定した。合計９５６ｂｐの配列を決定し、６つの全てのリーディングフレームで翻訳した。
【００３８】
予測アミノ酸配列
【００３９】
【化３】
【００４０】
を有する６８４ｂｐの１つのオープンリーディングフレームが見出された。６８４ｂｐのＤＮＡは分子量２６ｋＤのタンパク質をコードするコーディング能力を有する。部分精製ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列は次の通りである。
【００４１】
【化４】
【００４２】
実際のタンパク質配列は始めの４残基を欠いているけれども、６残基（太字体で示す）が実際のタンパク質配列と予測タンパク質配列で同一であった。部分精製ＳｃａＩタンパク質の最初の４残基はタンパク質精製の間にプロテアーゼで分解されたものと考えられる。部分精製ＳｃａＩタンパク質の分子量は２５−２６ｋＤである。この６８４ｂｐのオープンリーディングフレームはＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子であることが結論された。
【００４３】
５．Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩエンドヌクレアーゼの発現
ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を、正方向のプライマー
【００４４】
【化５】
【００４５】
及び逆方向のプライマー
【００４６】
【化６】
【００４７】
（逆方向のプライマーはメチラーゼ終止コドンの８５ｂｐ下流である）
を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲのＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を予め改変した。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、２つのプライマーによるＰＣＲで増幅した。正方向のプライマーはリボソーム結合部位及びＡＴＧ開始コドンの前の６ｂｐのスペーシングを含む（正方向のプライマー：
【００４８】
【化７】
【００４９】
逆方向のプライマー：
【００５０】
【化８】
【００５１】
）。
【００５２】
両端にＳｐｈＩ部位をもつＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＲＲＳのＳｐｈＩ部位にクローニングし、それを用いて、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変した細胞を形質転換した。ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ とｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ を保有する細胞５００ｍｌを、ＬＢプラスＡｐ（１００μｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３０μｇ／ｍｌ）中で３０℃で一晩生育させた。細胞を回収し、音波処理用緩衝液３０ｍｌに再懸濁した。溶菌を、リゾチーム最終濃度１００μｇ／ｍｌの添加と音波処理で行なった。細胞残渣を遠心分離で取り除いた。細胞抽出物をＴＥ緩衝液で１０、１００、１０００、１００００倍に希釈した。希釈抽出物を５μｌ使用して、λＤＮＡ１μｇを１時間、３７℃で消化した。消化ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分析した。ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ 及びｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ を保有するＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ湿細胞１ｇ当り１０6 ユニットのＳｃａＩエンドヌクレアーゼを産生することが知見された。
【００５３】
６．組換えＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
組換えＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼを、ヘパリン−セファロース、ＤＥＡＥセルロース、Ｑ−セファロースカラムを使用するクロマトグラフィーにより均一になるまで精製した。
【００５４】
ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ 及びｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ の両方を保有するＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ９９１）のサンプルを、ブダペスト条約の条件の下、American Type Culture Collectionに１９９５年１２月８日寄託し、ＡＴＣＣ受託番号６９９６６を受けた。
【００５５】
【００５６】
【化９】
【００５７】
【化１０】
【００５８】
【００５９】
【化１１】
【００６０】
【００６１】
【化１２】
【００６２】
【化１３】
【００６３】
【００６４】
【化１４】
【００６５】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び生産のスキーム。
【図２】ＳｃａＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）及びそれにコードされたタンパク質配列（配列番号６）。
【図３】ＳｃａＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）及びそれにコードされたタンパク質配列（配列番号８）。
【図４】ＳｃａＩ制限−修飾システムの構成。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼをコードする組換えＤＮＡ並びにこの組換えＤＮＡからのＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関わる。
【０００２】
【従来の技術】
II型制限エンドヌクレアーゼは細菌で天然に存在する一群の酵素である。細菌の他の成分を除去して制限エンドヌクレアーゼを精製すると、該酵素はＤＮＡ分子を、分子クローニングと遺伝子キャラクタリゼーション用の正確なフラグメントに切断するために、実験室で使用できる。
【０００３】
制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ分子の特定のヌクレオチド配列（“認識配列”）を認識し結合することによって作用する。結合すると、該酵素は認識配列内で、又はその一方の側で分子を切断する。別の制限エンドヌクレアーゼは別の認識配列にアフィニティーを有する。１８０を超える独特の特異性をもつ制限エンドヌクレアーゼが、現在まで試験された何百もの細菌の種から同定された。
【０００４】
細菌は多くとも種当たり少数の制限エンドヌクレアーゼのみを有する傾向がある。通常、エンドヌクレアーゼは由来する細菌に基づいて命名される。即ち、例えばDeinococcus radiophilus という種は３つの異なる制限エンドヌクレアーゼを合成するが、それらの名はＤｒａＩ、ＤｒａII、ＤＲＡIII である。これらの酵素は、それぞれ配列ＴＴＴＡＡＡ（配列番号１）、ＰｕＧＧＮＣＣＰｙ（配列番号２）、ＣＡＣＮＮＮＧＴＧ（配列番号３）を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13 は唯一の酵素ＥｃｏＲＩを合成するが、それは配列ＧＡＡＴＴＣ（配列番号４）を認識する。
【０００５】
自然界では、制限エンドヌクレアーゼは細菌細胞の生存に関して防御的役割をもつと考えられている。制限エンドヌクレアーゼは、細菌を破壊し又は細菌に寄生するウイルスやプラスミドのような外来ＤＮＡ分子の感染に対して細菌を抵抗性にすることができる。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列が存在する毎に、侵入してくる外来ＤＮＡ分子を切断することによって抵抗性を付与する。切断が起ると、多くの感染性遺伝子は無能になり、そのＤＮＡは非特異的ヌクレアーゼによって更に分解されやすくなる。
【０００６】
細菌の防御システムの第２の成分は修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼに対して相補的であり、細菌が自身のＤＮＡを防御でき、自身のＤＮＡを外来の感染性ＤＮＡから区別できる手段を提供する。修飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同一の認識配列を認識し結合するが、ＤＮＡを切断する代わりに、メチル基を付加することで配列内の１つのヌクレオチド又は他のヌクレオチドを化学修飾する。メチル化後、認識配列はもはや制限エンドヌクレアーゼによって切断されない。細菌細胞のＤＮＡは、その修飾メチラーゼの活性により常に十分に修飾されている。そのため、細菌細胞のＤＮＡは、内因性の制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全に非感受性である。制限エンドヌクレアーゼの認識と切断に感受性なのは、未修飾で、そのため同定可能な外来ＤＮＡだけである。
【０００７】
遺伝子工学技術の出現により、遺伝子をクローニングし、該遺伝子がコードするタンパク質や酵素を従来の精製技術によって得られるより多量に生産することが現在では可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローンを単離するための鍵は、複雑な“ライブラリー”即ち“ショットガン”法により得られるクローンの集団内で、あるクローンが１０-3〜１０-4の低い頻度で得られるときに、該クローンを同定する簡単で信頼性のある方法を開発することである。望ましくない大部分のクローンが破壊され、目的とするまれなクローンが生き残るような選択的な方法が好ましい。
【０００８】
II型の制限−修飾システムは盛んにクローニングされつつある。最初にクローニングされたシステムは、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定又は選別する手段としてバクテリオファージ感染を使用した（EcoRII：Kosykhら、Molec. Gen. Genet 178:717-719(1980) ；HhaII ：Mannら、Gene 3:97-112(1978) ；PstI：Walderら、Proc. Nat. Acad. Sci. 78:1503-1507(1981)、それらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。細菌に制限−修飾システムが存在するとその細菌はバクテリオファージ感染に対して抵抗することができるので、クローニングされた制限−修飾遺伝子を有する細胞は原則として、ファージにさらされたライブラリーから生存細胞として選択的に単離されうる。しかし、この方法は限定された価値しかないことが判明した。即ち、クローニングされた制限−修飾遺伝子は、必ずしも選択的生存をさせるのに十分なファージ抵抗性を発現しないことが知見された。
【０００９】
別のクローニングのアプローチは、初めプラスミド担持として特徴付けられたシステムをE. coli クローニングプラスミド内へ転移することを含む（EcoRV ：Bougueleret ら、Nucl. Acid. Res. 12:3659-3676(1984) ；PaeR7 ：GingerasとBrooks, Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:402-406(1983)；Theriault とRoy, Gene 19:355-359(1982)；PvuII ：Blumenthalら、J. Bacteriol. 164:501-509(1985) 、これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。
【００１０】
第３のアプローチ、そして現在増え続けているたくさんのシステムをクローニングするために使用されている方法は活性メチラーゼ遺伝子を選別することによってクローニングするものである（本発明者らによる EPO No. 193,413（1986年９月３日公開）及びBsuRI ：Kissら、Nucl. Acid. Res. 13:6403-6421(1985) を参照されたい。これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。制限遺伝子と修飾遺伝子はしばしば接近して結合しているので、両方の遺伝子はしばしば同時にクローニングすることができる。しかし、この選択によって必ずしも完全な制限システムが得られるわけではなく、代わりにメチラーゼ遺伝子のみが得られる（BspRI ：Szomolanyiら、Gene 10:219-225(1980) ；BcnI：Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982) ；BsuRI ：KissとBaldauf, Gene 21:111-119(1983)；MspI：Walderら、J. Biol. Chem 258:1235-1241(1983) 、これらの開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。
【００１１】
より最近の方法（“エンド−ブルー（endo-blue ）法”）が、dinD::lacZ融合体を含むＥ．ｃｏｌｉの指示株に基づくＥ．ｃｏｌｉでの制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の直接的クローニングについて記載された（Fomenkovら、Nucl. Acids Res. 22:2399-2403(1994) 、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。この方法は、エンドヌクレアーゼ又は非特異的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷後のＥ．ｃｏｌｉのＳＯＳ反応を用いる。いくつかの熱安定性ヌクレアーゼ遺伝子（TaqI、Tth111I 、BsoBI 、Tfヌクレアーゼ）がこの方法によりクローニングされた。
【００１２】
Ｅ．ｃｏｌｉでこれらのシステムをクローニングする際の別の障害が各種のメチラーゼをクローニングする過程で発見された。多くのＥ．ｃｏｌｉ株（クローニングに通常使用されるものを含む）は、シトシンメチル化を含有するＤＮＡの導入に抵抗性のシステムを有する（Raleigh とWilson、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83:9070-9074(1986)、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）。それ故、クローニングにどのＥ．ｃｏｌｉ株を使うべきかを注意深く考察することも必要である。
【００１３】
外来の制限−修飾システムをクローニングして、Ｅ．ｃｏｌｉに導入したとき、メチラーゼとエンドヌクレアーゼの発現は、恐らくＥ．ｃｏｌｉでの遺伝子の転写又は翻訳がうまくいかないために、天然のエンドヌクレアーゼ生産株と比較して極めて低いことがある。特に、Ｅ．ｃｏｌｉへのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子のクローニングに当てはまる。これは２種の微生物のＧＣ含量が異なるためである。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子をＥ．ｃｏｌｉで十分発現させ、効率的な遺伝子発現に基づいて選別することができるクローニングシステムがあれば望ましい。
【００１４】
精製された制限エンドヌクレアーゼ及び有用性の程度は小さいが修飾メチラーゼは、実験室で遺伝子をキャラクタリゼーションするのに有用な道具であるので、組換えＤＮＡ技術によりこれらの酵素を豊富に合成する細菌株を得るという商業的動機が存在する。このような株は商業的に有用な量を生産する手段を提供すると同様に精製の仕事を簡単にするので有用であろう。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題及びその解決手段】
本発明は、制限エンドヌクレアーゼＳｃａＩをコードする単離ＤＮＡ及び改変したメチラーゼ選択法によるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのメチラーゼ遺伝子をＥ ．ｃｏｌｉにクローニングする方法に関する。最初は、標準メチラーゼ遺伝子選択方法を用いて、ライブラリー構築の間、高コピー数のクローニングベクターｐＵＣ１９を使用するＳｃａＩメチラーゼ遺伝子のクローニングを試みた。ｐＵＣ１９を使用するＳｃａＩメチラーゼ遺伝子のクローニングはできなかった。恐らくは、Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩメチラーゼ遺伝子が十分発現できなかったためと考えられる。もしＳｃａＩメチラーゼがＥ．ｃｏｌｉで有効に発現しないならば、プラスミドのＳｃａＩ部位はメチラーゼによって十分に修飾されないだろう。結果として、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼの攻撃後、プラスミドは切断され、プラスミドライブラリー中で失れるだろう。標準メチラーゼ選択は有効でなかったので、“エンド−ブルー法”を用いてＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングを試みた。１９の青色のコロニーが同定されたが、いずれにもＳｃａＩエンドヌクレアーゼ活性は検出できなかった。
【００１６】
Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩメチラーゼ遺伝子発現を増加させるために、ｐＲＲＳという名称の、ｌａｃＵＶ５プロモーターを含む高コピー数プラスミド（Skoglundら、Gene 88:1-5(1990）、この開示内容は引用により本明細書に含まれるものとする）をＳｃａＩメチラーゼ遺伝子をクローニングするために使用し、得られたライブラリーＤＮＡをメチラーゼ選択のために使用した。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を、次の４段階でｐＲＲＳにクローニングするのに成功した。（１）Ｓａｕ３ＡＩによって部分消化されたゲノムＤＮＡとＢａｍＨＩによって切断されＣＩＰ処理されたｐＲＲＳとの連結及びＥ．ｃｏｌｉＲＲ１コンピテント細胞の連結ＤＮＡによる形質転換、（２）混合プラスミドライブラリーの調製、（３）プラスミドＤＮＡライブラリーのＳｃａＩ消化、及びＲＲ１細胞の攻撃されたＤＮＡによる再形質転換、（４）生き残った細胞からのＳｃａＩ耐性プラスミドのスクリーニング。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子をクローニングした後、メチラーゼ遺伝子の両側のＤＮＡフラグメントをクローニングする努力をした。通常、特定の制限−修飾システムでメチラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子は互いに隣接して存在している。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の左側のＤＮＡを、逆ＰＣＲ（ｉｎｖｅｒｓｅ ＰＣＲ）によるＤＮＡ増幅でクローニングした。該ＤＮＡの配列決定を行ない、６つ全てのリーディングフレームで翻訳した。翻訳されたタンパク質配列を、部分精製したＳｃａＩタンパク質のＮ末端タンパク質配列と比較した。１つの予測タンパク質配列がＳｃａＩタンパク質のＮ末端配列とぴったりと合う。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応により該遺伝子を増幅してクローニングし、ｐＲＲＳベクターに連結し、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変したＥ．ｃｏｌｉ株を形質転換した。
【００１７】
【発明の実施の態様】
ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子とＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子をクローニングし発現させる本発明の方法を図１で説明する。本方法は以下の段階を含む。
【００１８】
１．ストレプトマイセス・カエスピトーサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓ）のゲノムＤＮＡを精製する。
【００１９】
２．完全なＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを生成する、Ｓａｕ３ＡＩ又はそのアイソシゾマーのいずれかなどの制限エンドヌクレアーゼで、該ＤＮＡを部分消化する。フラグメントはまた、クローニング可能な大きさ、即ち１−２０ｋｂであるべきである。
【００２０】
３．好ましくは、Ｓａｕ３ＡＩで消化されたゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理されたｐＲＲＳなどの高発現ベクターと連結する。Ｐtac 、λＰL 、λＰR プロモーターを有する他のベクターも使用することができる。得られた混合物を使用して適切な宿主、即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１などのｈｓｄＲ- 、ｍｃｒＢＣ- 、ｍｒｒ- 株を形質転換する。ＤＮＡ／細胞の混合物を、形質転換細胞用のアンピシリン選択培地に塗布する。インキュベーション後、形質転換細胞をまとめてプールし、第１細胞ライブラリーを作る。
【００２１】
４．組換えプラスミドを第１細胞ライブラリーから全体として精製し、第１プラスミドライブラリーを作る。それから、精製プラスミドライブラリーを、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ又は任意のＳｃａＩアイソシゾマーを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで完全に消化する。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ消化により、未修飾でメチラーゼ非含有クローンが選択的に破壊され、ＳｃａＩメチラーゼ含有クローンの相対的頻度が増加する。
【００２２】
５．ＳｃａＩメチラーゼクローンの同定：消化されたプラスミドライブラリーＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ株ＲＲ１などの宿主に戻して形質転換を行ない、アンピシリンプレートに塗布して形質転換コロニーを再び得る。コロニーを拾い上げ、そのプラスミドＤＮＡを調製し、それがＳｃａＩ消化に抵抗性であるかどうかを決定するために、精製プラスミドＤＮＡをＳｃａＩエンドヌクレアーゼと共にｉｎｖｉｔｒｏでインキュベートしてＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
【００２３】
６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされたことが確立されたならば、クローンを制限地図作成と欠失地図作成により解析する。ＳｃａＩＭ遺伝子を含む領域を配列決定する。
【００２４】
７．ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の右側の合計６２３ｂｐＤＮＡの配列決定をした。このＤＮＡ配列を、プログラム“Ｂｌａｓｔｘ”を用いてＧｅｎｂａｎｋデータベースのすべての公知の遺伝子と比較した。配列の比較によると、この６２３ｂｐからの１つの予測されたオープンリーディングフレーム（終止せず）はＥ．ｃｏｌｉのコールドショックタンパク質に多少の相同性を有する。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の右側のＤＮＡは、ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子であるはずがないことが結論された。
【００２５】
８．左側に結合しているＤＮＡをクローニングするために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを、ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＥ１、ＮｌａIII 、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩ制限酵素又は逆ＰＣＲ反応用の適切な大きさの鋳型ＤＮＡ（３ｋｂ未満）を生成する任意の他の制限酵素で消化する。消化ＤＮＡは、ＤＮＡの低濃度（２μｇ／ｍｌ未満）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子の末端にアニールする１セットのプライマーを使用する逆ＰＣＲ反応のための鋳型として用いる。上記のプロトコルの後、ＰｖｕＩ切断、自己連結のゲノムＤＮＡから１．６ｋｂの逆ＰＣＲ産物を得る。該ＤＮＡを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、ＨｉｎｃII切断／ＣＩＰ処理ｐＵＣ１９ベクターにクローニングする。完全インサート（ｉｎｓｅｒｔ）を配列決定し、ＤＮＡ配列を全ての６つのリーディングフレームでアミノ酸配列に翻訳し、次にＳｃａＩのＮ末端タンパク質配列と比較する。このアプローチで、実際のＳｃａＩタンパク質配列と６つのアミノ酸が一致する６８４ｂｐの１つのオープンリーディングフレームが得られる。
【００２６】
９．次に、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を適合性プラスミドｐＡＣＹＣ１８４にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を予め改変する。Ｅ．ｃｏｌｉでの翻訳効率を増大させるために、効果的なリボソーム結合部位と最適なスペーシングをメチラーゼ遺伝子の前に入れる。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、２つのプライマーを用いてＰＣＲ増幅する。正方向のプライマーはリボソーム結合部位及びＡＴＧ開始コドンの前の６ｂｐのスペーシングを含む。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を発現ベクターｐＲＲＳにクローニングし、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変した細胞を形質転換する。
【００２７】
１０．ｐＡＣＹＣ１８４−ＳｃａＩＭ+ とｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ を含むＥ．ｃｏｌｉ細胞を３０℃で一晩、定常相まで生育させる。細胞を回収し、音波処理で溶菌する。細胞抽出物のＳｃａＩエンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。ＳｃａＩエンドヌクレアーゼをクロマトグラフィーで精製する。
【００２８】
以下の実施例で、本発明の好適実施態様を説明する。以下の実施例は単なる例示であり、本発明は以下の実施例に限定されるべきでないことが理解されよう。
【００２９】
【実施例】
ＳｃａＩ制限−修飾システムのクローニング
１．クローニングベクターとしてｐＵＣ１９を用いるＳｃａＩメチラーゼの選別
１つのＳｃａＩリンカーをｐＵＣ１９のＳｓｐＩ部位に挿入した。改変ｐＵＣ１９をライブラリー構築のために使用した。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ切断／ＣＩＰ処理のＰＵＣ１９ＤＮＡに連結した。ＳｍａＩで部分消化及び完全消化したゲノムＤＮＡを、ＳｍａＩ切断／ＣＩＰ処理のｐＵＣ１９ＤＮＡに連結した。連結ＤＮＡ混合物を用いてＲＲ１コンピテント細胞を形質転換し、アンピシリンプレートに塗布した。ＳｍａＩ及びＳａｕ３ＡＩライブラリー中に、それぞれ合計１３，６００と６０，０００の細胞が見出された。プラスミドＤＮＡを各１次細胞ライブラリーから調製した。ライブラリーＤＮＡの５μｇ、２μｇ、１μｇを３７℃で２時間、ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの１００ユニットで切断した。ＳｃａＩで攻撃されたＤＮＡを用いて、ＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。再び、プラスミドＤＮＡを生き残っている形質転換菌から分離し、ＳｃａＩ制限酵素で消化し、プラスミドＤＮＡがＳｃａＩ消化に耐性であるかどうかを試験した。Ｓａｕ３ＡＩライブラリーからの１４４の単離プラスミド及びＳｍａＩライブラリーからの５８の単離プラスミドのＳｃａＩ消化に対する抵抗性を解析した。ベクター中のＳｃａＩ部位の一方又は両方を失なった５つの耐性クローンを見出した。真の抵抗性クローン（メチラーゼ含有クローン）はこれら２つのライブラリーでは見出されなかった。
【００３０】
２．“エンド−ブルー法”を用いるＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニングの試み
ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子がＥ．ｃｏｌｉ細胞で発現されるのが貧弱であるならば、ＳｃａＩメチラーゼによる防御が無くともＥ．ｃｏｌｉでエンドヌクレアーゼ遺伝子を直接クローニングするために“エンド−ブルー法”を使用できることが推察された。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳｃａＩゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理のｐＵＣ１９に連結し、それを用いてｄｉｎ１::ｌａｃＺ融合体を有するＥ．ｃｏｌｉの指示株を形質転換し、Ｘ−ｇａｌ指示薬含有プレートに塗布した。１９の青色のコロニーが５０００のＡｐR 形質転換菌の中で見出された。個々の青色のコロニーを１０ｍｌのＬＢプラスＡｐ培地に植菌し、３０℃で一晩揺動した。細胞を回収し、１ｍｌの音波処理用緩衝液プラスリゾチーム（１００μｇ／ｍｌ）に再懸濁した。細胞抽出物の１μｌ、２．５μｌ、５μｌ、１０μｌを使用して、３７℃で１時間１μｇのλＤＮＡを切断した。ＳｃａＩ活性は、青色の単離菌のいずれの細胞抽出物中にも見出されなかった。クローンのどれもＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を含んでいない、又はエンドヌクレアーゼ遺伝子がｉｎ ｖｉｔｒｏ検出のためによく発現しないことが結論された。
【００３１】
３．クローニングベクターとしてｐＲＲＳを使用するＳｃａＩメチラーゼ選別
メチラーゼ選別方法は、メチラーゼがＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を保有するベクターのＳｃａＩ部位を修飾できるように、ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子がｉｎ ｖｉｖｏで適度なレベルで発現されることを必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ遺伝子が、２種の微生物のＧＣ含量が異なるために、Ｅ．ｃｏｌｉで十分に発現されないことが公知である。ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を高レベルで発現させるために、別の高コピー数ベクターｐＲＲＳをクローニングビヒクルとして使用した。プラスミドｐＲＲＳは、ｐＵＣ１９の正規のｌａｃプロモーターより強いｌａｃＵＶ５プロモーターを有する。多重クローニング部位にクローニングされた遺伝子はｌａｃＵＶ５プロモーターに制御される。Ｓａｕ３ＡＩで部分消化したＳ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩ消化／ＣＩＰ処理のｐＲＲＳベクターに連結し、連結ＤＮＡを用いてＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。合計１８，０００のＡｐR 形質転換菌を１次細胞ライブラリーとして得た。プラスミドＤＮＡを１次細胞ライブラリーから調製した。ライブラリーＤＮＡ５μｇをＳｃａＩ制限酵素１００ユニットで切断し、それを用いて再びＲＲ１コンピテント細胞を形質転換した。生き残っている形質転換菌を拾い上げ、培養した。プラスミドＤＮＡを個々の細胞の培養物から単離した。これらのプラスミドのいずれかがＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を有するかを試験するために、７８の個々のプラスミドをＳｃａＩエンドヌクレアーゼで消化した。プラスミド＃３７、＃３８、＃５４がＳｃａＩ消化に真に抵抗性であることが知見された。プラスミド＃５４が約５０００ｂｐのインサートを有し、それを更に解析した。１．７ｋｂのＳａｃＩフラグメント欠失クローンが依然として活性あるメチラーゼ遺伝子を有する。インサートのＰｓｔＩフラグメント（約２ｋｂ）の欠失はＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を不活性化し、欠失クローンをＳｃａＩエンドヌクレアーゼ切断に感受性にする。１つのＰｓｔＩ部位がＳｃａＩメチラーゼ遺伝子内に位置することが結論された。ＰｓｔＩ部位を囲むＤＮＡの配列決定の努力をした。３つのサブクローン（ＳａｃＩ〜ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄIII 〜ＰｓｔＩ、ＰｓｔＩ〜ＰｓｔＩ）を、ｐＵＣ１９ベクターを用いて構築した。ｐＵＣ１９のユニバーサルの正方向と逆方向のプライマーを使用して、ＤＮＡ配列を決定した。残りのＤＮＡをプライマーウォーキングにより配列決定した。メチラーゼモチーフＳＰＰＹ（配列番号９）とＤＰＦＬＧＳＧＴＴ（配列番号１０）を含む１つのオープンリーディングフレームを同定した。メチラーゼ遺伝子は下部の（ｂｏｔｔｏｍ）鎖によってコードされ、逆向きである。
【００３２】
ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を同定するために、メチラーゼ遺伝子の右側の６２３ｂｐのＤＮＡの配列決定をした。この一続きのＤＮＡをＧｅｎＢａｎｋの全ての公知の遺伝子と比較した。６２３ｂｐ内の１つの部分的なオープンリーディングフレームは、Ｅ．ｃｏｌｉのコールドショックタンパク質をコードする遺伝子と多少の相同性を有することが知見された。それ故、メチラーゼ遺伝子の左側のＤＮＡをクローニングし、配列決定することに努力を集中した。
【００３３】
４．ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング
逆ＰＣＲによるＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング：逆ＰＣＲは公知のＤＮＡ配列に隣接するＤＮＡをクローニングする有効な方法である。Ｓ．ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓゲノムＤＮＡを逆ＰＣＲ反応のために、制限酵素ＢｓａＷＩ、ＢｓｐＥＩ、ＮｌａIII 、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＳｐｅＩで消化した。制限消化後、ＤＮＡを、フェノール−ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、９５％エタノールで沈殿させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁した。各々の消化されたＤＮＡを、低いＤＮＡ濃度（合計容量５００μｌ、２μｇ／ｍｌ）で自己連結させ、環状化した。連結ＤＮＡをフェノール−ＣＨＣｌ3 で一度、ＣＨＣｌ3 で一度抽出し、９５％エタノールで沈澱させた。該ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として使用した（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、３０サイクル）。メチラーゼ遺伝子の末端にアニールする１セットのプライマーを次の様に設計した：
正方向のプライマー
【００３４】
【化１】
逆方向のプライマー
【００３６】
【化２】
１．６ｋｂの逆ＰＣＲ産物が自己連結ＰｖｕＩゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応で見出された。逆ＰＣＲ産物を、反応容量５０μｌ中（ＤＮＡ２μｇ、１０倍キナーゼ緩衝液５μｌ、ポリヌクレオチドキナーゼ１μｌ、０．１Ｍ ＡＴＰ２μｌ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ１μｌ、ＴＥ４１μｌ、３７℃、１時間）Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼとＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理した。該ＤＮＡをｐＵＣ１９にクローニングした。インサートを配列決定するために、いくつかの欠失クローンを構築した（ＮｇｏＭＩ及びＳｍａＩ欠失、ＢａｍＨＩ及びＢｓｔＥII欠失、ＢｓｓＨII及びＢｓｓＨII欠失、ＡａｔII及びＡａｔII欠失）。ＤＮＡ配列を、ｐＵＣ１９の正方向と逆方向のプライマー及びカスタマーメイド（customer-made ）のプライマーを用いて配列決定した。合計９５６ｂｐの配列を決定し、６つの全てのリーディングフレームで翻訳した。
【００３８】
予測アミノ酸配列
【００３９】
【化３】
を有する６８４ｂｐの１つのオープンリーディングフレームが見出された。６８４ｂｐのＤＮＡは分子量２６ｋＤのタンパク質をコードするコーディング能力を有する。部分精製ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼのＮ末端タンパク質配列は次の通りである。
【００４１】
【化４】
実際のタンパク質配列は始めの４残基を欠いているけれども、６残基（太字体で示す）が実際のタンパク質配列と予測タンパク質配列で同一であった。部分精製ＳｃａＩタンパク質の最初の４残基はタンパク質精製の間にプロテアーゼで分解されたものと考えられる。部分精製ＳｃａＩタンパク質の分子量は２５−２６ｋＤである。この６８４ｂｐのオープンリーディングフレームはＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子であることが結論された。
【００４３】
５．Ｅ．ｃｏｌｉでのＳｃａＩエンドヌクレアーゼの発現
ＳｃａＩメチラーゼ遺伝子を、正方向のプライマー
【００４４】
【化５】
及び逆方向のプライマー
【００４６】
【化６】
（逆方向のプライマーはメチラーゼ終止コドンの８５ｂｐ下流である）
を用いてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲのＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、ｐＡＣＹＣ１８４のＢａｍＨＩ部位にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を予め改変した。完全ＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、２つのプライマーによるＰＣＲで増幅した。正方向のプライマーはリボソーム結合部位及びＡＴＧ開始コドンの前の６ｂｐのスペーシングを含む（正方向のプライマー：
【００４８】
【化７】
逆方向のプライマー：
【００５０】
【化８】
）。
【００５２】
両端にＳｐｈＩ部位をもつＳｃａＩエンドヌクレアーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＲＲＳのＳｐｈＩ部位にクローニングし、それを用いて、ＳｃａＩメチラーゼで予め改変した細胞を形質転換した。ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ とｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ を保有する細胞５００ｍｌを、ＬＢプラスＡｐ（１００μｇ／ｍｌ）及びＣｍ（３０μｇ／ｍｌ）中で３０℃で一晩生育させた。細胞を回収し、音波処理用緩衝液３０ｍｌに再懸濁した。溶菌を、リゾチーム最終濃度１００μｇ／ｍｌの添加と音波処理で行なった。細胞残渣を遠心分離で取り除いた。細胞抽出物をＴＥ緩衝液で１０、１００、１０００、１００００倍に希釈した。希釈抽出物を５μｌ使用して、λＤＮＡ１μｇを１時間、３７℃で消化した。消化ＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分析した。ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ 及びｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ を保有するＥ．ｃｏｌｉ株は、Ｅ．ｃｏｌｉ湿細胞１ｇ当り１０6 ユニットのＳｃａＩエンドヌクレアーゼを産生することが知見された。
【００５３】
６．組換えＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの精製
組換えＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼを、ヘパリン−セファロース、ＤＥＡＥセルロース、Ｑ−セファロースカラムを使用するクロマトグラフィーにより均一になるまで精製した。
【００５４】
ｐＲＲＳ−ＳｃａＩＲ+ 及びｐＡＣＹＣ−ＳｃａＩＭ+ の両方を保有するＥ．ｃｏｌｉ（ＮＥＢ９９１）のサンプルを、ブダペスト条約の条件の下、American Type Culture Collectionに１９９５年１２月８日寄託し、ＡＴＣＣ受託番号６９９６６を受けた。
【００５５】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【化１３】
【化１４】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼのクローニング及び生産のスキーム。
【図２】ＳｃａＩＭ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号５）及びそれにコードされたタンパク質配列（配列番号６）。
【図３】ＳｃａＩＲ遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号７）及びそれにコードされたタンパク質配列（配列番号８）。
【図４】ＳｃａＩ制限−修飾システムの構成。
Claims (4)
- 配列番号７の配列から成るＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼをコードする単離ＤＮＡ。
- 請求項１に記載のＤＮＡセグメントが挿入された組換えＤＮＡベクター。
- 請求項２に記載のクローニングベクターによって形質転換された宿主細胞。
- ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの発現に適した条件下、請求項２に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞を培養することを含む、前記ＳｃａＩ制限エンドヌクレアーゼの生産方法。
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