JPH10313883A - 大腸菌でのＢｓｓＨＩＩ制限酵素のクローニング及び生産方法 - Google Patents
大腸菌でのＢｓｓＨＩＩ制限酵素のクローニング及び生産方法Info
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- JPH10313883A JPH10313883A JP10105323A JP10532398A JPH10313883A JP H10313883 A JPH10313883 A JP H10313883A JP 10105323 A JP10105323 A JP 10105323A JP 10532398 A JP10532398 A JP 10532398A JP H10313883 A JPH10313883 A JP H10313883A
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- bsshii
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
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- Biomedical Technology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 BssHII制限エンドヌクレアーゼとBssHIIメチ
ラーゼをコードする組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤ
ＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの生産に関す
る新規方法の提供。 【解決手段】 Bacillus stearothermophilus H3 E.col
i.からの多重特異性メチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)、BssH
II制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)及び同族Bss
HIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)をコードする組み換え
ＤＮＡをクローニングすること及びこれによるBssHII型
制限エンドヌクレアーゼの生産。
ラーゼをコードする組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤ
ＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの生産に関す
る新規方法の提供。 【解決手段】 Bacillus stearothermophilus H3 E.col
i.からの多重特異性メチラーゼ遺伝子(bssHIIM1)、BssH
II制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)及び同族Bss
HIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)をコードする組み換え
ＤＮＡをクローニングすること及びこれによるBssHII型
制限エンドヌクレアーゼの生産。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はＢｓｓＨＩＩ制限エ
ンドヌクレアーゼとＢｓｓＨＩＩメチラーゼをコードす
る組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤＮＡからのＢｓｓ
ＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関する。
ンドヌクレアーゼとＢｓｓＨＩＩメチラーゼをコードす
る組み換えＤＮＡ及び当該組み換えＤＮＡからのＢｓｓ
ＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼの生産に関する。
【０００２】II型制限エンドヌクレアーゼは細菌中に自
然にできる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼ
が他の細菌成分から精製されると、実験室でＤＮＡ分子
を切断して分子クローニング及び遺伝子の特徴付けのた
めの精密な断片を得ることに用いることができる。
然にできる種類の酵素である。制限エンドヌクレアーゼ
が他の細菌成分から精製されると、実験室でＤＮＡ分子
を切断して分子クローニング及び遺伝子の特徴付けのた
めの精密な断片を得ることに用いることができる。
【０００３】
【従来の技術】制限エンドヌクレアーゼはＤＮＡ分子上
のヌクレオチドの特定の配列（認識配列）を認識し結合
して働く。一度、結合すると認識配列の内部でまたは一
端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは
異なる認識配列に親和性を有する。独特の特異性を有す
る２１１以上の制限エンドヌクレアーゼが今日までに研
究された何百もの細菌種の中から同定されている(Rober
tsとMaceils, Nucl.Acids Res.24:223-235,(1996))。
のヌクレオチドの特定の配列（認識配列）を認識し結合
して働く。一度、結合すると認識配列の内部でまたは一
端で分子を切断する。異なる制限エンドヌクレアーゼは
異なる認識配列に親和性を有する。独特の特異性を有す
る２１１以上の制限エンドヌクレアーゼが今日までに研
究された何百もの細菌種の中から同定されている(Rober
tsとMaceils, Nucl.Acids Res.24:223-235,(1996))。
【０００４】細菌は種毎にせいぜい少数の制限エンドヌ
クレアーゼを持つにすぎないという傾向がある。エンド
ヌクレアーゼは典型的には由来する細菌に従って名前が
付けられる。例えば、Deinococcus radiophilusは Dra
I, DraII, DraIIIと名付けられた３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを生産する。これら３つの酵素はそれぞ
れ5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3'及び5'CACNNNGTG3'という
配列を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13
は5'GAATTC3'という配列を認識する酵素、EcoRIだけを
生産する。
クレアーゼを持つにすぎないという傾向がある。エンド
ヌクレアーゼは典型的には由来する細菌に従って名前が
付けられる。例えば、Deinococcus radiophilusは Dra
I, DraII, DraIIIと名付けられた３つの異なる制限エン
ドヌクレアーゼを生産する。これら３つの酵素はそれぞ
れ5'TTTAAA3', 5'PuGGNCCPy3'及び5'CACNNNGTG3'という
配列を認識し切断する。一方、Escherichia coli RY13
は5'GAATTC3'という配列を認識する酵素、EcoRIだけを
生産する。
【０００５】自然にでは、制限エンドヌクレアーゼは細
菌細胞の繁栄のために防御的な役割を果たすと考えられ
ている。制限エンドヌクレアーゼは細菌を破壊しまたは
細菌に寄生するであろうウィルス及びプラスミドのよう
な外来性ＤＮＡ分子による感染に対して細菌が抵抗する
ことを可能にする。認識配列がある度に侵入外来性ＤＮ
Ａ分子を切断することにより抵抗性を与える。この切断
が生じると多くの感染遺伝子は無力になり、ＤＮＡは非
特異的ヌクレアーゼによる更なる分解をうけやすくな
る。
菌細胞の繁栄のために防御的な役割を果たすと考えられ
ている。制限エンドヌクレアーゼは細菌を破壊しまたは
細菌に寄生するであろうウィルス及びプラスミドのよう
な外来性ＤＮＡ分子による感染に対して細菌が抵抗する
ことを可能にする。認識配列がある度に侵入外来性ＤＮ
Ａ分子を切断することにより抵抗性を与える。この切断
が生じると多くの感染遺伝子は無力になり、ＤＮＡは非
特異的ヌクレアーゼによる更なる分解をうけやすくな
る。
【０００６】細菌の防御システムの２番目の構成成分は
修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌク
レアーゼを補足し、細菌が自己のＤＮＡを防御し外来性
感染ＤＮＡを区別し得る手段を提供する。修飾メチラー
ゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ配列を認識
し結合する。しかし、ＤＮＡを切断する代わりにメチル
基の付加により配列内の特定のヌクレオチドを化学的に
修飾する。メチル化の後、認識配列はもはや制限エンド
ヌクレアーゼにより切断されない。細菌細胞のＤＮＡは
その細菌の修飾メチラーゼの働きで常に充分に修飾され
ている。それ故に、内因性の制限エンドヌクレアーゼの
存在に対して完全に無反応性である。制限エンドヌクレ
アーゼの認識及び開裂に感受性であるのは未修飾で、そ
れ故外来性と見なし得るＤＮＡのみである。
修飾メチラーゼである。これらの酵素は制限エンドヌク
レアーゼを補足し、細菌が自己のＤＮＡを防御し外来性
感染ＤＮＡを区別し得る手段を提供する。修飾メチラー
ゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ配列を認識
し結合する。しかし、ＤＮＡを切断する代わりにメチル
基の付加により配列内の特定のヌクレオチドを化学的に
修飾する。メチル化の後、認識配列はもはや制限エンド
ヌクレアーゼにより切断されない。細菌細胞のＤＮＡは
その細菌の修飾メチラーゼの働きで常に充分に修飾され
ている。それ故に、内因性の制限エンドヌクレアーゼの
存在に対して完全に無反応性である。制限エンドヌクレ
アーゼの認識及び開裂に感受性であるのは未修飾で、そ
れ故外来性と見なし得るＤＮＡのみである。
【０００７】遺伝子工学技術の出現により、今や遺伝子
をクローニングしそれらがコードするタンパク質及び酵
素を従来の精製技術で得られるより大量に生産すること
が可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を単離す
る鍵は複雑な「ライブラリー」すなわち、「ショットガ
ン」方法により得たクローン集団中のクローンを10-3か
ら10-4より低い頻度で出現するときに同定する簡単で確
かな方法を開発することである。好ましくは、その方法
は所望であるがまれなクローンが生き残る間に不要な多
数のクローンが破壊されるように選択的であるべきであ
る。
をクローニングしそれらがコードするタンパク質及び酵
素を従来の精製技術で得られるより大量に生産すること
が可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を単離す
る鍵は複雑な「ライブラリー」すなわち、「ショットガ
ン」方法により得たクローン集団中のクローンを10-3か
ら10-4より低い頻度で出現するときに同定する簡単で確
かな方法を開発することである。好ましくは、その方法
は所望であるがまれなクローンが生き残る間に不要な多
数のクローンが破壊されるように選択的であるべきであ
る。
【０００８】II型制限−修飾系は高頻度でクローニング
されつつある。最初のクローニングシステムは制限エン
ドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段とし
てバクテリオファージ感染を用いた(EcoRII: Kosykh
ら、Molec.Gen.Genet.178:717-719,(1980); HhaII:Mann
ら、Gene 3:97-112,(1978); PstI:Walderら、Proc.Nat.
Acad.Sci.78:1503-1507,(1981))。細菌内の制限−修飾
系の存在は細菌がバクテリオファージによる感染へ抵抗
することを可能にするので、クローニングされた制限−
修飾遺伝子を有する細胞は原理的にはファージに曝され
たライブラリーからの生き残りとして選択的に単離され
得る。しかし、この方法は限定的な価値しかないことが
わかった。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺
伝子は選択的な生存を授与する充分なファージ抵抗性が
常に現れるのではないことがわかった。
されつつある。最初のクローニングシステムは制限エン
ドヌクレアーゼクローンを同定または選択する手段とし
てバクテリオファージ感染を用いた(EcoRII: Kosykh
ら、Molec.Gen.Genet.178:717-719,(1980); HhaII:Mann
ら、Gene 3:97-112,(1978); PstI:Walderら、Proc.Nat.
Acad.Sci.78:1503-1507,(1981))。細菌内の制限−修飾
系の存在は細菌がバクテリオファージによる感染へ抵抗
することを可能にするので、クローニングされた制限−
修飾遺伝子を有する細胞は原理的にはファージに曝され
たライブラリーからの生き残りとして選択的に単離され
得る。しかし、この方法は限定的な価値しかないことが
わかった。すなわち、クローニングされた制限−修飾遺
伝子は選択的な生存を授与する充分なファージ抵抗性が
常に現れるのではないことがわかった。
【０００９】別のクローニングアプローチはプラスミド
を増殖させるＥ．ｃｏｌｉ中へのプラスミド運搬として
最初に特徴づけられた形質転換系を含む（ＥｃｏＲＶ：
Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅ
ｓ．１２：３６５９−３６７６（１９８４）； Ｐａｅ
Ｒ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びBrooks,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80:402-406,(1983); Theriault及びRoy,Gene 19:
355-359(1982);PvuII:Blumenthalら、J.Bacteriol.164:
501-509,(1985))。
を増殖させるＥ．ｃｏｌｉ中へのプラスミド運搬として
最初に特徴づけられた形質転換系を含む（ＥｃｏＲＶ：
Ｂｏｕｇｕｅｌｅｒｅｔら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅ
ｓ．１２：３６５９−３６７６（１９８４）； Ｐａｅ
Ｒ７：Ｇｉｎｇｅｒａｓ及びBrooks,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 80:402-406,(1983); Theriault及びRoy,Gene 19:
355-359(1982);PvuII:Blumenthalら、J.Bacteriol.164:
501-509,(1985))。
【００１０】３番目のアプローチ、すなわち増大しつつ
ある系のクローニングに用いられるアプローチの一つは
活性メチラーゼ遺伝子に向けられる(Wilson,1993年４月
６日に発行されたU.S.Patent No.5,200,333及びBsuRI:K
issら、Nucl.Acid.Res.13:6403-6421,(1985))。制限と
修飾遺伝子はたいてい近接して連鎖しているので、たい
てい両遺伝子は同時にクローニングできる。しかし、こ
の選択により常に完全な制限系が得られるとは限られ
ず、そのかわりにメチラーゼ遺伝子のみが得られること
がある(BspRI:Szomolanyiら、Gene 10:219-225,(1980);
BcnI:Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982);BsuRI:Kis
s及びBaldauf,Gene 21:111-119,(1983);及びMspI:Walde
rら、J.Biol.Chem.258:1235-1241,(1983))。
ある系のクローニングに用いられるアプローチの一つは
活性メチラーゼ遺伝子に向けられる(Wilson,1993年４月
６日に発行されたU.S.Patent No.5,200,333及びBsuRI:K
issら、Nucl.Acid.Res.13:6403-6421,(1985))。制限と
修飾遺伝子はたいてい近接して連鎖しているので、たい
てい両遺伝子は同時にクローニングできる。しかし、こ
の選択により常に完全な制限系が得られるとは限られ
ず、そのかわりにメチラーゼ遺伝子のみが得られること
がある(BspRI:Szomolanyiら、Gene 10:219-225,(1980);
BcnI:Janulaitisら、Gene 20:197-204(1982);BsuRI:Kis
s及びBaldauf,Gene 21:111-119,(1983);及びMspI:Walde
rら、J.Biol.Chem.258:1235-1241,(1983))。
【００１１】より最近の方法、すなわち「エンドブルー
法(endo-blue method)」がdinD::lacZ融合を含むE.Coli
の指標株に基づいてE.coli中の制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の直接クローニングのために記載された(Fomenko
vら、1996年3月12日に発行されたU.S.Patent No.5,498,
535、Fomenkovら、Nucl.Acids Res.22:2399-2403,(199
4))。この方法は制限エンドヌクレアーゼまたは非特異
的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷に続いて起こるE.coli
ＳＯＳ反応を利用する。多数の熱安定性ヌクレアーゼ
遺伝子（Tth111I, BsoBI, Tfヌクレアーゼ)がこの方法
によりクローニングされた。
法(endo-blue method)」がdinD::lacZ融合を含むE.Coli
の指標株に基づいてE.coli中の制限エンドヌクレアーゼ
遺伝子の直接クローニングのために記載された(Fomenko
vら、1996年3月12日に発行されたU.S.Patent No.5,498,
535、Fomenkovら、Nucl.Acids Res.22:2399-2403,(199
4))。この方法は制限エンドヌクレアーゼまたは非特異
的ヌクレアーゼによるＤＮＡ損傷に続いて起こるE.coli
ＳＯＳ反応を利用する。多数の熱安定性ヌクレアーゼ
遺伝子（Tth111I, BsoBI, Tfヌクレアーゼ)がこの方法
によりクローニングされた。
【００１２】E.coliでのこれらの系のクローニングの別
の障害が多様なメチラーゼのクローニング過程で発見さ
れた。多くのE.coli株は（クローニングに通常用いられ
る株も含めて）シトシンのメチル化を含むＤＮＡの導入
に抵抗するシステムを持っている(Raleigh及びWilson,
Proc.Natl.Acad.Sci., USA 83:9070-9074, (1986))。そ
れ故、どのE.coli株をクローニングに用いるかも注意深
く考える必要がある。
の障害が多様なメチラーゼのクローニング過程で発見さ
れた。多くのE.coli株は（クローニングに通常用いられ
る株も含めて）シトシンのメチル化を含むＤＮＡの導入
に抵抗するシステムを持っている(Raleigh及びWilson,
Proc.Natl.Acad.Sci., USA 83:9070-9074, (1986))。そ
れ故、どのE.coli株をクローニングに用いるかも注意深
く考える必要がある。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】精製された制限エンド
ヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組み換え分
子を創るのに有用なツールなので、これらの酵素を大量
に生産する組み換えＤＮＡ技術を通して細菌株を得るこ
とに商業的な動機がある。そのような過剰発現株はまた
酵素精製の仕事をも簡単にするであろう。
ヌクレアーゼ及び修飾メチラーゼは実験室で組み換え分
子を創るのに有用なツールなので、これらの酵素を大量
に生産する組み換えＤＮＡ技術を通して細菌株を得るこ
とに商業的な動機がある。そのような過剰発現株はまた
酵素精製の仕事をも簡単にするであろう。
【００１４】本発明はBacillus stearothermophilus H3
E.coli.からの多重特異性(multi-specific)メチラーゼ
遺伝子(bssHIIM1)、BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子(bssHIIR)及び同族BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM
2)をコードする組み換えＤＮＡに関する。
E.coli.からの多重特異性(multi-specific)メチラーゼ
遺伝子(bssHIIM1)、BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝
子(bssHIIR)及び同族BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM
2)をコードする組み換えＤＮＡに関する。
【００１５】
【課題を解決するための手段】BssHII多重特異性メチラ
ーゼ遺伝子は最初、２カ所のBssHII部位を有する修飾pL
ITMUS28ベクターを用いてSau3AIライブラリー中にクロ
ーニングした(New England Biolabs,Inc.,Beverly,M
A)。多重特異性BssHIIメチラーゼの発現は２カ所のBssH
II部位をBssHII分解に対して抵抗性にする。驚くべきこ
とに、クローニングしたメチラーゼはまたBssHII部位
（5’GCGCGC3’）に加え他の部位も修飾する。即ち、こ
のメチラーゼはまたBsrFI（5’RCCGGY3’）及びHaeII部
位（5’RGCGCY3’）並びに部分的にはEagI（5’CGGCCG
3’）及びMluI部位（5’ACGCGT3’）を修飾する。単一
特異性BssHIIメチラーゼはB.stearothermophilus H3ゲ
ノムＤＮＡから調製した部分的Sau3AIライブラリーから
回収できなかった。
ーゼ遺伝子は最初、２カ所のBssHII部位を有する修飾pL
ITMUS28ベクターを用いてSau3AIライブラリー中にクロ
ーニングした(New England Biolabs,Inc.,Beverly,M
A)。多重特異性BssHIIメチラーゼの発現は２カ所のBssH
II部位をBssHII分解に対して抵抗性にする。驚くべきこ
とに、クローニングしたメチラーゼはまたBssHII部位
（5’GCGCGC3’）に加え他の部位も修飾する。即ち、こ
のメチラーゼはまたBsrFI（5’RCCGGY3’）及びHaeII部
位（5’RGCGCY3’）並びに部分的にはEagI（5’CGGCCG
3’）及びMluI部位（5’ACGCGT3’）を修飾する。単一
特異性BssHIIメチラーゼはB.stearothermophilus H3ゲ
ノムＤＮＡから調製した部分的Sau3AIライブラリーから
回収できなかった。
【００１６】BssHII制限エンドヌクレアーゼのクローニ
ングを容易にするために、多量のBssHII制限エンドヌク
レアーゼタンパク質がB.stearothermophilus H3細胞か
ら精製された。Ｎ末端アミノ酸配列は以下のように決定
された。(Met) Gly Glu AsnGln Glu Ser Ile Trp Ala A
sn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? ProGlu
Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）
（？は曖昧であることを意味する）。
ングを容易にするために、多量のBssHII制限エンドヌク
レアーゼタンパク質がB.stearothermophilus H3細胞か
ら精製された。Ｎ末端アミノ酸配列は以下のように決定
された。(Met) Gly Glu AsnGln Glu Ser Ile Trp Ala A
sn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? ProGlu
Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号１）
（？は曖昧であることを意味する）。
【００１７】多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHI
IM1)に近接したＤＮＡ断片はBssHIIエンドヌクレアーゼ
遺伝子の発見を期待して配列決定された。多重特異性メ
チラーゼ遺伝子の周囲の５０００ｂｐ以上のＤＮＡが配
列決定された。転写解読枠のアミノ酸配列への翻訳はBs
sHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列に適合しなかった。真のBssHII制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子はB.stearothermophilus H3染色体の別の
場所に位置していそうだと結論づけた。
IM1)に近接したＤＮＡ断片はBssHIIエンドヌクレアーゼ
遺伝子の発見を期待して配列決定された。多重特異性メ
チラーゼ遺伝子の周囲の５０００ｂｐ以上のＤＮＡが配
列決定された。転写解読枠のアミノ酸配列への翻訳はBs
sHII制限エンドヌクレアーゼタンパク質のＮ末端アミノ
酸配列に適合しなかった。真のBssHII制限エンドヌクレ
アーゼ遺伝子はB.stearothermophilus H3染色体の別の
場所に位置していそうだと結論づけた。
【００１８】BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の位
置を決定するために、２セットの縮重プライマー(degen
erate primer)をタンパク質の配列に基づいて設計し、
ＰＣＲでB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡ由来のB
ssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐを増幅
するのに用いた。次いで、pUC19(ATCC 37254)中にクロ
ーニングし挿入の配列決定をした。１セットの逆ＰＣＲ
（inverse ＰＣＲ)プライマーを当該配列のわかってい
る５９ｂｐ配列から設計した。逆ＰＣＲ産物はSau3AIで
分解し、自己連結したB.steatothermophilus H3ゲノム
ＤＮＡ中に見出された。逆ＰＣＲ ＤＮＡをクローニン
グし配列決定した。これによりさらに４６５ｂｐの新し
いＤＮＡコード配列が得られた。逆ＰＣＲの別のセット
を４６５ｂｐ配列の末端から設計しHinfI又はRsaIで分
解し自己連結したB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮ
ＡからBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りの部分を
増幅するのに用いた。逆ＰＣＲ産物をクローニングし、
配列決定した。別の７３０ｂｐの新しい配列の後に、ス
トップコドンがRsaI断片中に見出された。完全なBssHII
エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)は１２５４ｂｐで
あり（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）、推定分子
量４７ｋＤａの４１７アミノ酸BssHII制限エンドヌクレ
アーゼをコードしていた。
置を決定するために、２セットの縮重プライマー(degen
erate primer)をタンパク質の配列に基づいて設計し、
ＰＣＲでB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡ由来のB
ssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の５９ｂｐを増幅
するのに用いた。次いで、pUC19(ATCC 37254)中にクロ
ーニングし挿入の配列決定をした。１セットの逆ＰＣＲ
（inverse ＰＣＲ)プライマーを当該配列のわかってい
る５９ｂｐ配列から設計した。逆ＰＣＲ産物はSau3AIで
分解し、自己連結したB.steatothermophilus H3ゲノム
ＤＮＡ中に見出された。逆ＰＣＲ ＤＮＡをクローニン
グし配列決定した。これによりさらに４６５ｂｐの新し
いＤＮＡコード配列が得られた。逆ＰＣＲの別のセット
を４６５ｂｐ配列の末端から設計しHinfI又はRsaIで分
解し自己連結したB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮ
ＡからBssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の残りの部分を
増幅するのに用いた。逆ＰＣＲ産物をクローニングし、
配列決定した。別の７３０ｂｐの新しい配列の後に、ス
トップコドンがRsaI断片中に見出された。完全なBssHII
エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHIIR)は１２５４ｂｐで
あり（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂｐ）、推定分子
量４７ｋＤａの４１７アミノ酸BssHII制限エンドヌクレ
アーゼをコードしていた。
【００１９】E.coli染色体を予め修飾するために、多重
特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIMI)をコンパチブ
ルベクターpACYC184(ATCC 37033)にクローニングした。
BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。
効率的なリボソーム結合部位及び最適スペース(spacin
g)をbssHIIR遺伝子の前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をpUC
19中にクローニングした。ＰＣＲ挿入を担っている３つ
の単離体が見出された。しかし、ＩＰＴＧ誘導細胞培養
では活性は検出できなかった。３つの挿入はbssHIIR遺
伝子中に変異をもたらしたと結論された。
特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIMI)をコンパチブ
ルベクターpACYC184(ATCC 37033)にクローニングした。
BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子をＰＣＲで増幅した。
効率的なリボソーム結合部位及び最適スペース(spacin
g)をbssHIIR遺伝子の前に組み込んだ。ＰＣＲ産物をpUC
19中にクローニングした。ＰＣＲ挿入を担っている３つ
の単離体が見出された。しかし、ＩＰＴＧ誘導細胞培養
では活性は検出できなかった。３つの挿入はbssHIIR遺
伝子中に変異をもたらしたと結論された。
【００２０】ベクターpUC19はlacプロモーターを含む高
コピー数プラスミドである。lacプロモーターからの遺
伝子の発現は厳密に調節されていない。従って、T7プロ
モーターのような厳密に調節されたプロモーターがbssH
IIR遺伝子の発現に好ましいであろうと判断された。bss
HIIR遺伝子は両側にXbaIとBamHI部位のあるプライマー
を用いてＰＣＲで増幅された。効率的なリボソーム結合
部位と最適スペースを遺伝子の前部に組み込んだ。ＰＣ
Ｒ産物をT7プロモータの上流に転写終了暗号を有するT7
発現ベクターpET21AT(New England Biolabs Inc.,Berve
rly, MA)に連結した。最初bssHIIM1遺伝子をベクターpL
G339中に挿入した。次いでエンドヌクレアーゼを担って
いるプラスミドをE.coli細胞ER2504(pLysS, pLG-BssHII
M1)に形質転換した。pLysS, pLG-BssHIIM1及びpET21AT-
BssHIIRを担っているE.coli細胞をＩＰＴＧで誘導し、
細胞抽出物のBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイ
した。１２の単離体由来の細胞抽出物についてアッセイ
を行ったところ、１２クローン総てがBssHIIエンドヌク
レアーゼ活性を産生していた。１実施例を図４に示す。
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び同族メチラー
ゼ遺伝子は互いに近接して位置しているので、１セット
の逆ＰＣＲプライマーを制限エンドヌクレアーゼ配列の
末端に基づいて合成した。下流配列を逆ＰＣＲにより増
幅し、クローニングした。真のBssHIIメチラーゼ遺伝子
(bssHIIM2)を２段階の逆ＰＣＲでクローニングした。完
全なbssHIIM2遺伝子をＰＣＲにより増幅し、E.coli染色
体を予め修飾すべくpSC101由来のコンパチブルベクター
pLG339(ATCC37131)中にクローニングした。予め修飾し
た宿主ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIR
で形質転換した。その結果生じた株ER2417（pLysP,pLG-
BssHIIM2,pET21AT-BssHIIR）はＩＰＴＧ誘導後に１×１
０5単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
コピー数プラスミドである。lacプロモーターからの遺
伝子の発現は厳密に調節されていない。従って、T7プロ
モーターのような厳密に調節されたプロモーターがbssH
IIR遺伝子の発現に好ましいであろうと判断された。bss
HIIR遺伝子は両側にXbaIとBamHI部位のあるプライマー
を用いてＰＣＲで増幅された。効率的なリボソーム結合
部位と最適スペースを遺伝子の前部に組み込んだ。ＰＣ
Ｒ産物をT7プロモータの上流に転写終了暗号を有するT7
発現ベクターpET21AT(New England Biolabs Inc.,Berve
rly, MA)に連結した。最初bssHIIM1遺伝子をベクターpL
G339中に挿入した。次いでエンドヌクレアーゼを担って
いるプラスミドをE.coli細胞ER2504(pLysS, pLG-BssHII
M1)に形質転換した。pLysS, pLG-BssHIIM1及びpET21AT-
BssHIIRを担っているE.coli細胞をＩＰＴＧで誘導し、
細胞抽出物のBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイ
した。１２の単離体由来の細胞抽出物についてアッセイ
を行ったところ、１２クローン総てがBssHIIエンドヌク
レアーゼ活性を産生していた。１実施例を図４に示す。
ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ遺伝子及び同族メチラー
ゼ遺伝子は互いに近接して位置しているので、１セット
の逆ＰＣＲプライマーを制限エンドヌクレアーゼ配列の
末端に基づいて合成した。下流配列を逆ＰＣＲにより増
幅し、クローニングした。真のBssHIIメチラーゼ遺伝子
(bssHIIM2)を２段階の逆ＰＣＲでクローニングした。完
全なbssHIIM2遺伝子をＰＣＲにより増幅し、E.coli染色
体を予め修飾すべくpSC101由来のコンパチブルベクター
pLG339(ATCC37131)中にクローニングした。予め修飾し
た宿主ER2417(pLysP,pLG-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIR
で形質転換した。その結果生じた株ER2417（pLysP,pLG-
BssHIIM2,pET21AT-BssHIIR）はＩＰＴＧ誘導後に１×１
０5単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産した。
【００２１】
【発明の実施の形態】ここに記載された方法によると、
多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子、BssHII制限エンド
ヌクレアーゼ及び同族メチラーゼ遺伝子は好ましくは以
下の段階を経てクローニングされ発現される。
多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子、BssHII制限エンド
ヌクレアーゼ及び同族メチラーゼ遺伝子は好ましくは以
下の段階を経てクローニングされ発現される。
【００２２】１．B.stearothermophilus H3のゲノムＤ
ＮＡを精製する。
ＮＡを精製する。
【００２３】２．ＤＮＡをSau3AIのような制限エンドヌ
クレアーゼ又はそのアイソシゾマーのいずれかで部分的
に分解し、完全なBssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を生成させる。代わりに、段階９を経ず
にＮ末端アミノ酸配列から設計された縮重プライマーを
用いたＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより直接BssHIIエンドヌク
レアーゼ遺伝子をクローニングすることもできる。
クレアーゼ又はそのアイソシゾマーのいずれかで部分的
に分解し、完全なBssHII多重特異性メチラーゼ遺伝子を
含むＤＮＡ断片を生成させる。代わりに、段階９を経ず
にＮ末端アミノ酸配列から設計された縮重プライマーを
用いたＰＣＲ及び逆ＰＣＲにより直接BssHIIエンドヌク
レアーゼ遺伝子をクローニングすることもできる。
【００２４】３．Sau3AIで分解したゲノムＤＮＡを次い
で２つのBssHII部位を有するBamHI-開裂/CIPで処理した
pLITMUSクローニングベクター中に連結させる。連結Ｄ
ＮＡを適切な宿主、即ちE.coli株RR1のようなHsdR-, Mc
rBC-, Mrr- 株を形質転換させるのに用いる。ＤＮＡ/細
胞混合物を次いで形質転換細胞を選択するアンピシリン
培地に播く。インキュベーション後、形質転換コロニー
を採取し増幅させ最初の細胞ライブラリーを形成する。
で２つのBssHII部位を有するBamHI-開裂/CIPで処理した
pLITMUSクローニングベクター中に連結させる。連結Ｄ
ＮＡを適切な宿主、即ちE.coli株RR1のようなHsdR-, Mc
rBC-, Mrr- 株を形質転換させるのに用いる。ＤＮＡ/細
胞混合物を次いで形質転換細胞を選択するアンピシリン
培地に播く。インキュベーション後、形質転換コロニー
を採取し増幅させ最初の細胞ライブラリーを形成する。
【００２５】４．次に組み換えプラスミドを最初の細胞
ライブラリー全体から精製し、最初のプラスミドライブ
ラリーを作る。次いで、精製プラスミドライブラリーを
BssHII制限エンドヌクレアーゼまたはBssHIIアイソシゾ
マーのいずれかを用いてインビトロで完全に分解させ
る。BssHIIエンドヌクレアーゼ分解は未修飾でメチラー
ゼを含有していないクローンを選択的に分解し、BssHII
メチラーゼ遺伝子を有するクローンの相対的頻度を高め
る。
ライブラリー全体から精製し、最初のプラスミドライブ
ラリーを作る。次いで、精製プラスミドライブラリーを
BssHII制限エンドヌクレアーゼまたはBssHIIアイソシゾ
マーのいずれかを用いてインビトロで完全に分解させ
る。BssHIIエンドヌクレアーゼ分解は未修飾でメチラー
ゼを含有していないクローンを選択的に分解し、BssHII
メチラーゼ遺伝子を有するクローンの相対的頻度を高め
る。
【００２６】５．多重特異性BssHIIメチラーゼクローン
の同定 分解したプラスミドライブラリーＤＮＡはE.coli株RR1
のような宿主に戻し形質転換させ、アンピシリンプレー
ト上に播いて再び形質転換コロニーを得る。コロニーを
拾いそのプラスミドを調製しBssHII分解に抵抗性かどう
かを決定するために精製プラスミドＤＮＡをインビトロ
でBssHIIエンドヌクレアーゼとインキュベートすること
によりBssHIIメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
の同定 分解したプラスミドライブラリーＤＮＡはE.coli株RR1
のような宿主に戻し形質転換させ、アンピシリンプレー
ト上に播いて再び形質転換コロニーを得る。コロニーを
拾いそのプラスミドを調製しBssHII分解に抵抗性かどう
かを決定するために精製プラスミドＤＮＡをインビトロ
でBssHIIエンドヌクレアーゼとインキュベートすること
によりBssHIIメチラーゼ遺伝子の存在を分析する。
【００２７】６．メチラーゼ遺伝子がクローニングされ
たことを確認したら、クローンを制限地図作製及び欠失
地図作製により分析する。次いで、完全な挿入について
配列決定する。このアプローチ後に、BssHII多重特異性
メチラーゼ遺伝子に対応した１つの転写解読枠を見つけ
る。クローニングしたメチラーゼはBssHII部位（5’GCG
CGC3’)の他にいくつかの他の部位を修飾する。多重特
異性BssHIIメチラーゼ遺伝子を担っているプラスミドＤ
ＮＡもBsrFI(5’RCCGGY3’)及びHaeII(5'RGCGCY3')分解
に抵抗性であり、またEagI（5’CGGCCG3’)及びMlUI
(5’ACGCGT3’)分解に部分的に抵抗性である。クローニ
ングしたメチラーゼは多重特異性メチラーゼであると結
論される。
たことを確認したら、クローンを制限地図作製及び欠失
地図作製により分析する。次いで、完全な挿入について
配列決定する。このアプローチ後に、BssHII多重特異性
メチラーゼ遺伝子に対応した１つの転写解読枠を見つけ
る。クローニングしたメチラーゼはBssHII部位（5’GCG
CGC3’)の他にいくつかの他の部位を修飾する。多重特
異性BssHIIメチラーゼ遺伝子を担っているプラスミドＤ
ＮＡもBsrFI(5’RCCGGY3’)及びHaeII(5'RGCGCY3')分解
に抵抗性であり、またEagI（5’CGGCCG3’)及びMlUI
(5’ACGCGT3’)分解に部分的に抵抗性である。クローニ
ングしたメチラーゼは多重特異性メチラーゼであると結
論される。
【００２８】７．BssHII制限エンドヌクレアーゼタンパ
ク質を多量に精製しＮ末端アミノ酸配列を決定する。Ｎ
末端配列は次の通りである。(Met)Gly Glu Asn Gln Glu
Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln L
eu Val Ser? Pro Glu Thr HisXaa Gln Asn? Xaa Ala As
p（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）
８．上のアプローチに基づいて、メチラーゼ含有クロー
ンを用いて多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子の周囲の
5.8KbのＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ配列を総
ての６つの枠に翻訳し、BssHII制限エンドヌクレアーゼ
のアミノ酸配列と比較する。しかし、精製BssHII制限エ
ンドヌクレアーゼの翻訳アミノ酸配列とＮ末端アミノ酸
配列の間に明らかな同一性/相同性は認められない。真
のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は多重特異性メ
チラーゼの隣には位置していないと結論される。
ク質を多量に精製しＮ末端アミノ酸配列を決定する。Ｎ
末端配列は次の通りである。(Met)Gly Glu Asn Gln Glu
Ser Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln L
eu Val Ser? Pro Glu Thr HisXaa Gln Asn? Xaa Ala As
p（配列番号１）（？は曖昧であることを意味する）
８．上のアプローチに基づいて、メチラーゼ含有クロー
ンを用いて多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子の周囲の
5.8KbのＤＮＡ断片の配列を決定する。ＤＮＡ配列を総
ての６つの枠に翻訳し、BssHII制限エンドヌクレアーゼ
のアミノ酸配列と比較する。しかし、精製BssHII制限エ
ンドヌクレアーゼの翻訳アミノ酸配列とＮ末端アミノ酸
配列の間に明らかな同一性/相同性は認められない。真
のBssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は多重特異性メ
チラーゼの隣には位置していないと結論される。
【００２９】９．BssHIIエンドヌクレアーゼをＮ末端ア
ミノ酸配列に基づいてＰＣＲ及び逆ＰＣＲで直接クロー
ニングする努力がなされる。２セットの縮重プライマー
を最初の５アミノ酸残基(MGENQE)（配列番号５）及び１
５番目から２０番目の残基(DKAQLV)（配列番号６）から
設計する。プライマーをB.stearothermophilus H3ゲノ
ムＤＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の
５９ｂｐをＰＣＲにより増幅するのに用いる。多数のＰ
ＣＲ産物が見出され５９〜６７ｂｐのＤＮＡ断片をゲル
精製し、pUC19にクローニングし配列決定する。２クロ
ーンのうちの１つは期待されるＮ末端アミノ酸配列と同
一である翻訳アミノ酸配列を有していた。
ミノ酸配列に基づいてＰＣＲ及び逆ＰＣＲで直接クロー
ニングする努力がなされる。２セットの縮重プライマー
を最初の５アミノ酸残基(MGENQE)（配列番号５）及び１
５番目から２０番目の残基(DKAQLV)（配列番号６）から
設計する。プライマーをB.stearothermophilus H3ゲノ
ムＤＮＡからのBssHII制限エンドヌクレアーゼの最初の
５９ｂｐをＰＣＲにより増幅するのに用いる。多数のＰ
ＣＲ産物が見出され５９〜６７ｂｐのＤＮＡ断片をゲル
精製し、pUC19にクローニングし配列決定する。２クロ
ーンのうちの１つは期待されるＮ末端アミノ酸配列と同
一である翻訳アミノ酸配列を有していた。
【００３０】１０．逆ＰＣＲプライマーを最初の５９ｂ
ｐ ＤＮＡから設計し、周囲のＤＮＡ配列をB.stearothe
rmophilus H3ゲノムＤＮＡから逆ＰＣＲにより増幅する
のに用いる。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを
以下の制限酵素で分解する。６ｂｐ認識配列を有するAa
tII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII,Mlu
I, NheI又はSphI及び４−５ｂｐ認識配列を有するSau3A
I, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII,
EaeI又はAciIである。分解により逆ＰＣＲ反応に適し
たサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じる。分解
ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ
以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反
応の鋳型として用いる。単一のＰＣＲ産物がSau3AI, Mb
oI及びAciIで分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に
見出される。ＤＮＡ断片をpUC19中にクローニングし配
列決定する。その結果４６５ｂｐの新しい配列が生じ
る。
ｐ ＤＮＡから設計し、周囲のＤＮＡ配列をB.stearothe
rmophilus H3ゲノムＤＮＡから逆ＰＣＲにより増幅する
のに用いる。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを
以下の制限酵素で分解する。６ｂｐ認識配列を有するAa
tII, BamHI, BglII, BspEI, ClaI, EcoRI, HindIII,Mlu
I, NheI又はSphI及び４−５ｂｐ認識配列を有するSau3A
I, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, HhaI, HpaII, HaeII,
EaeI又はAciIである。分解により逆ＰＣＲ反応に適し
たサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じる。分解
ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2マイクログラム/ｍＬ
以下）で自己連結させる。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反
応の鋳型として用いる。単一のＰＣＲ産物がSau3AI, Mb
oI及びAciIで分解しかつ自己連結したゲノムＤＮＡ中に
見出される。ＤＮＡ断片をpUC19中にクローニングし配
列決定する。その結果４６５ｂｐの新しい配列が生じ
る。
【００３１】１１．逆ＰＣＲプライマーを465bpの新し
い配列の末端から設計し、さらに周囲のＤＮＡを増幅す
るのに用いる。 B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮ
ＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1
I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI,TaiI, HinfI, RsaI又はA
ciIで分解する。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2
マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環
状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一の逆
ＰＣＲ産物がHinfI又はRsaI分解しかつ自己連結したゲ
ノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をクローニング
し、配列決定する。７３０ｂｐのさらなる配列の後に、
配列決定されたRsaI断片中にストップコドンが見出され
る。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂ
ｐ（５９ｂｐ ＋ ４６５ｂｐ ＋ ７３０ｂｐ）であ
り、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHiiエ
ンドヌクレアーゼをコードしている。
い配列の末端から設計し、さらに周囲のＤＮＡを増幅す
るのに用いる。 B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮ
ＡをApoI, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1
I, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI,TaiI, HinfI, RsaI又はA
ciIで分解する。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（2
マイクログラム/ｍＬ以下）で自己連結させる。連結環
状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応の鋳型として用いる。単一の逆
ＰＣＲ産物がHinfI又はRsaI分解しかつ自己連結したゲ
ノムＤＮＡ中に見出される。ＤＮＡ断片をクローニング
し、配列決定する。７３０ｂｐのさらなる配列の後に、
配列決定されたRsaI断片中にストップコドンが見出され
る。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子は１２５４ｂ
ｐ（５９ｂｐ ＋ ４６５ｂｐ ＋ ７３０ｂｐ）であ
り、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸のBssHiiエ
ンドヌクレアーゼをコードしている。
【００３２】１２．多重特異性BssHIIメチラーゼ遺伝子
をpACYC184(ATCC 37033)中にクローニングしE.coli宿主
を予め修飾する。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子
を２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させる。
効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをATG
開始コドンの前に組み込む。エンドヌクレアーゼ遺伝子
をpUC19中にクローニングする。挿入を有する３つのク
ローンが見出されるが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の抽出物
中にBssHII活性は見出されない。
をpACYC184(ATCC 37033)中にクローニングしE.coli宿主
を予め修飾する。完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子
を２つのプライマーを用いてＰＣＲにより増幅させる。
効率的なリボソーム結合部位と７ｂｐのスペースをATG
開始コドンの前に組み込む。エンドヌクレアーゼ遺伝子
をpUC19中にクローニングする。挿入を有する３つのク
ローンが見出されるが、ＩＰＴＧ誘導細胞培養の抽出物
中にBssHII活性は見出されない。
【００３３】１３．bssHIIR遺伝子の発現の２回目の試
みにおいて、T7発現ベクターpET21ATが厳密な調節の発
現に用いられる(F.W.StudierとB.A.Moffatt, J.Mol.Bio
l.189:113-130,(1986))。ベクターpET21ATはT7プロモー
ターの上流の転写終了暗号を４コピー有している。pLys
Sの共形質転換(co-transformation)(F.W.Studier, J.Mo
l.Biol.219:37-44(1991))は非誘導条件下でベースとな
る発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲ
により増幅しpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339
(ATCC 37131)中にクローニングする。bssHIIR遺伝子を
ＰＣＲで増幅しpET21AT中にクローニングする。T7発現
のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM
1, pET21AT-BssHIIRで形質転換する。１２の単離体がＩ
ＰＴＧにより誘導され、細胞抽出物を調製しBssHII制限
エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。総てのクロー
ンはBssHIIエンドヌクレアーゼを生産する。
みにおいて、T7発現ベクターpET21ATが厳密な調節の発
現に用いられる(F.W.StudierとB.A.Moffatt, J.Mol.Bio
l.189:113-130,(1986))。ベクターpET21ATはT7プロモー
ターの上流の転写終了暗号を４コピー有している。pLys
Sの共形質転換(co-transformation)(F.W.Studier, J.Mo
l.Biol.219:37-44(1991))は非誘導条件下でベースとな
る発現レベルをさらに減じる。bssHIIM1遺伝子をＰＣＲ
により増幅しpSC101由来のコンパチブルベクターpLG339
(ATCC 37131)中にクローニングする。bssHIIR遺伝子を
ＰＣＲで増幅しpET21AT中にクローニングする。T7発現
のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHIIM
1, pET21AT-BssHIIRで形質転換する。１２の単離体がＩ
ＰＴＧにより誘導され、細胞抽出物を調製しBssHII制限
エンドヌクレアーゼ活性をアッセイする。総てのクロー
ンはBssHIIエンドヌクレアーゼを生産する。
【００３４】１４．bssHIIR遺伝子に近接したメチラー
ゼ遺伝子をクローニングするために、１セットのプライ
マーを下流のＤＮＡ配列を増幅するために作る。逆ＰＣ
Ｒ産物がHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し、自己連結し
たゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出される。逆Ｐ
ＣＲ産物をクローニングし配列決定される。未終結の転
写解読枠が新しく得られた８９５ｂｐ配列中に見出さ
れ、Genbankの周知遺伝子と配列を比較する。この未終
結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ
酸配列を有している。
ゼ遺伝子をクローニングするために、１セットのプライ
マーを下流のＤＮＡ配列を増幅するために作る。逆ＰＣ
Ｒ産物がHhaI, HaeIII及びSau3AIで分解し、自己連結し
たゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中に見出される。逆Ｐ
ＣＲ産物をクローニングし配列決定される。未終結の転
写解読枠が新しく得られた８９５ｂｐ配列中に見出さ
れ、Genbankの周知遺伝子と配列を比較する。この未終
結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類似したアミノ
酸配列を有している。
【００３５】１５．２番目のセットの逆ＰＣＲプライマ
ーを合成し下流の配列を増幅するの用いる。逆ＰＣＲ産
物はStyIで分解して自己連結させたＤＮＡのＰＣＲ反応
物中に見出される。ＤＮＡ産物をpUC19中にクローニン
グし、その挿入について配列決定する。完全BssHIIメチ
ラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．
２ｋＤａの分子量を有するBssHIIメチラーゼタンパク質
をコードすることが判明する。
ーを合成し下流の配列を増幅するの用いる。逆ＰＣＲ産
物はStyIで分解して自己連結させたＤＮＡのＰＣＲ反応
物中に見出される。ＤＮＡ産物をpUC19中にクローニン
グし、その挿入について配列決定する。完全BssHIIメチ
ラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐであり、４２．
２ｋＤａの分子量を有するBssHIIメチラーゼタンパク質
をコードすることが判明する。
【００３６】１６．完全bssHIIM2遺伝子を増幅しpLG339
ベクターに挿入する。予め修飾されたE.coli宿主細胞,E
R2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形
質転換する。生じた株ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2,
pET21AT-BssHIIR)(NEB#1070)はE.coli細胞湿重１グラ
ム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアー
ゼを生産する。
ベクターに挿入する。予め修飾されたE.coli宿主細胞,E
R2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形
質転換する。生じた株ER2417(pLysP, pLG339-BssHIIM2,
pET21AT-BssHIIR)(NEB#1070)はE.coli細胞湿重１グラ
ム当たり１×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアー
ゼを生産する。
【００３７】NEB#1070のサンプルはブタペスト条約の条
件に従ってAmerican Type CultureCollectionに１９９
７年２月２４日に寄託し、ATCC受託番号９８３３４を得
た。
件に従ってAmerican Type CultureCollectionに１９９
７年２月２４日に寄託し、ATCC受託番号９８３３４を得
た。
【００３８】
【実施例】本発明は以下の実施例によりさらに実証され
る。実施例は本発明の理解を助けるために提供されるが
発明を限定するものとは解釈されない。
る。実施例は本発明の理解を助けるために提供されるが
発明を限定するものとは解釈されない。
【００３９】上及び以下で引用する文献は参考として本
明細書に導入する。
明細書に導入する。
【００４０】実施例１ BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング １．メチラーゼ選択法を用いた多重特異性BssHIIメチラ
ーゼ遺伝子(bssHIIM1)のクローニング １０μｇのB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを4,
2, 1, 0.5, 又は0.25単位のSau3AIを用いて37℃、３０
分間部分分解した。部分分解したＤＮＡを電気泳動によ
り分析した。１単位及び０．５単位のSau3AI分解により
限定部分分解が生じたことが判明した。Sau3AI部分分解
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをBamHI開裂/CIP
処理pLITMUS28(２つのBssHII部位を持つpUC19誘導体、N
ew England Biolabs Inc.,Baverly,MA)中に16℃一晩で
連結した。連結ＤＮＡをRR1 コンピテント細胞に形質
転換し、アンピシリンプレート上に播いた。トータル約
１×１０5 細胞が形質転換実験で得られた。これらの細
胞を一緒にプールし１リッターのAp添加LBブイヨン中に
接種し３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを最初
の細胞ライブラリーから調製した。10, 5, 2及び1μｇ
のプラスミドＤＮＡを４０単位のBssHII制限エンドヌク
レアーゼを用いて５０℃で４時間分解した。BssHII分解
ＤＮＡをRR1コンピテント細胞中に再形質転換した。プ
ラスミドを再び生存形質転換体から単離し、BssHII制限
酵素で分解しプラスミドＤＮＡがBssHII分解に抵抗性か
どうかを調べた。３６のプラスミドについてBssHII分解
への抵抗性を調べた。３つの抵抗性クローン（＃３、＃
１８及び＃３０）が見つかった。それらは約６ｋｂのゲ
ノムＤＮＡ挿入を担っていた。これらのプラスミドをBs
rFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI, HhaI, SacI又
はEcoO109Iで分解したとき、BsrFI, HaeII, EagI又はMl
uI分解に対して抵抗性か又は部分的に抵抗性であること
が判明した。細胞抽出物を３つの単離体から得て、BssH
IIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。明らかなエ
ンドヌクレアーゼ活性は３つの細胞抽出物中に検出され
なかった。完全な多重特異性メチラーゼ遺伝子と周囲の
ＤＮＡの配列を決定した。bssHIIM1遺伝子配列を図１に
示す。明らかな制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は見つか
らなかった。このメチラーゼ遺伝子はファージがコード
する多重特異性メチラーゼ遺伝子であろうと結論され
た。同様の遺伝子がクローニングされ、その配列が公表
された（Schumann,J.,ら, Gene 157:103-104(1995)）。
ーゼ遺伝子(bssHIIM1)のクローニング １０μｇのB.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを4,
2, 1, 0.5, 又は0.25単位のSau3AIを用いて37℃、３０
分間部分分解した。部分分解したＤＮＡを電気泳動によ
り分析した。１単位及び０．５単位のSau3AI分解により
限定部分分解が生じたことが判明した。Sau3AI部分分解
B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをBamHI開裂/CIP
処理pLITMUS28(２つのBssHII部位を持つpUC19誘導体、N
ew England Biolabs Inc.,Baverly,MA)中に16℃一晩で
連結した。連結ＤＮＡをRR1 コンピテント細胞に形質
転換し、アンピシリンプレート上に播いた。トータル約
１×１０5 細胞が形質転換実験で得られた。これらの細
胞を一緒にプールし１リッターのAp添加LBブイヨン中に
接種し３７℃で一晩培養した。プラスミドＤＮＡを最初
の細胞ライブラリーから調製した。10, 5, 2及び1μｇ
のプラスミドＤＮＡを４０単位のBssHII制限エンドヌク
レアーゼを用いて５０℃で４時間分解した。BssHII分解
ＤＮＡをRR1コンピテント細胞中に再形質転換した。プ
ラスミドを再び生存形質転換体から単離し、BssHII制限
酵素で分解しプラスミドＤＮＡがBssHII分解に抵抗性か
どうかを調べた。３６のプラスミドについてBssHII分解
への抵抗性を調べた。３つの抵抗性クローン（＃３、＃
１８及び＃３０）が見つかった。それらは約６ｋｂのゲ
ノムＤＮＡ挿入を担っていた。これらのプラスミドをBs
rFI, SacII, EagI, MluI, HaeII, NarI, HhaI, SacI又
はEcoO109Iで分解したとき、BsrFI, HaeII, EagI又はMl
uI分解に対して抵抗性か又は部分的に抵抗性であること
が判明した。細胞抽出物を３つの単離体から得て、BssH
IIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイした。明らかなエ
ンドヌクレアーゼ活性は３つの細胞抽出物中に検出され
なかった。完全な多重特異性メチラーゼ遺伝子と周囲の
ＤＮＡの配列を決定した。bssHIIM1遺伝子配列を図１に
示す。明らかな制限エンドヌクレアーゼ遺伝子は見つか
らなかった。このメチラーゼ遺伝子はファージがコード
する多重特異性メチラーゼ遺伝子であろうと結論され
た。同様の遺伝子がクローニングされ、その配列が公表
された（Schumann,J.,ら, Gene 157:103-104(1995)）。
【００４１】２．bssHIIR遺伝子のクローニング メチラーゼ選択法では多重特異性BssHIIメチラーゼを得
られるだけなので、努力をBssHIIエンドヌクレアーゼ遺
伝子の直接クローニングに集中した。BssHII制限エンド
ヌクレアーゼをB.stearothermophilus H3細胞からクロ
マトグラフィーにより精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定
に当てた。Ｎ末端アミノ酸配列は以下の通りである。
られるだけなので、努力をBssHIIエンドヌクレアーゼ遺
伝子の直接クローニングに集中した。BssHII制限エンド
ヌクレアーゼをB.stearothermophilus H3細胞からクロ
マトグラフィーにより精製し、Ｎ末端アミノ酸配列決定
に当てた。Ｎ末端アミノ酸配列は以下の通りである。
【００４２】(Met) Gly Glu Asn Gln Glu Ser Ile Trp
Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? P
ro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号
１）（？は曖昧であることを意味する）。
Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu Val Ser? P
ro Glu Thr His Xaa Gln Asn? Xaa Ala Asp（配列番号
１）（？は曖昧であることを意味する）。
【００４３】（下線を引いた残基は縮重プライマーを設
計するのに用いられた）。
計するのに用いられた）。
【００４４】前向き(forward)縮重プライマーは最初の
６アミノ酸配列、(Met) Gly Glu Asn Gln Glu（配列番
号５）に基づいて設計された。
６アミノ酸配列、(Met) Gly Glu Asn Gln Glu（配列番
号５）に基づいて設計された。
【００４５】前向きプライマー配列は以下の通りであ
る。
る。
【００４６】5’ATGGGNGARAAYCARGA3’（配列番号７） （N=A,C,G及びT;R=A,G;Y=C,T) ２つの逆向き(reverse)縮重プライマーをアミノ酸配
列、Asp Lys Ala Gln LeuVal（配列番号６）に基づいて
設計した。Leuをコードするコドンは６つの可能性(CUG,
CUC,CUU,CUA,UUG及びUUA)があるため、２つの縮重プラ
イマーを作成した。一方はLeuをコードするCTNで、もう
一方はLeuをコードするTTRであった。この２つの逆向き
縮重プライマーの配列は以下の通りである。
列、Asp Lys Ala Gln LeuVal（配列番号６）に基づいて
設計した。Leuをコードするコドンは６つの可能性(CUG,
CUC,CUU,CUA,UUG及びUUA)があるため、２つの縮重プラ
イマーを作成した。一方はLeuをコードするCTNで、もう
一方はLeuをコードするTTRであった。この２つの逆向き
縮重プライマーの配列は以下の通りである。
【００４７】 逆向きプライマー１ 5’ACYAAYTGNGCYTTRTC3’（配列番号８） (N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T) 逆向きプライマー２ 5’ACNAGYTGNGCYTTRTC3’(配列番号９) (N=A,C,G及びT;R=A,G:Y=C,T) ２つのＰＣＲ反応を計画した。前向きプライマーと逆向
きプライマー１をＰＣＲ反応１に用いた。前向きプライ
マーと逆向きプライマー２をＰＣＲ反応２に用いた。Ｄ
ＮＡ増幅が正の結果を示せば、５９ｂｐＰＣＲ産物が期
待できるであろう。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の
５９ｂｐは最初の２０アミノ酸をコードしている。３０
回のＰＣＲ増幅（９５℃１分、４０℃１分、７２℃３０
秒、で３０回）の後、期待したＰＣＲ産物がアガロース
ゲル上で検出された。小ＤＮＡ産物を３％低温溶解アガ
ロースゲルを通してゲル精製した。ゲル切片をβアガラ
ーゼで処理しＤＮＡを沈降させpUC19中にクローニング
した。挿入を有する２クローンについて配列決定した。
最初の５９ｂｐのbssHIIR遺伝子の配列は以下の通りで
あった。
きプライマー１をＰＣＲ反応１に用いた。前向きプライ
マーと逆向きプライマー２をＰＣＲ反応２に用いた。Ｄ
ＮＡ増幅が正の結果を示せば、５９ｂｐＰＣＲ産物が期
待できるであろう。BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子の
５９ｂｐは最初の２０アミノ酸をコードしている。３０
回のＰＣＲ増幅（９５℃１分、４０℃１分、７２℃３０
秒、で３０回）の後、期待したＰＣＲ産物がアガロース
ゲル上で検出された。小ＤＮＡ産物を３％低温溶解アガ
ロースゲルを通してゲル精製した。ゲル切片をβアガラ
ーゼで処理しＤＮＡを沈降させpUC19中にクローニング
した。挿入を有する２クローンについて配列決定した。
最初の５９ｂｐのbssHIIR遺伝子の配列は以下の通りで
あった。
【００４８】5'ATGGGAGAAAACCAAGAATCTATGGGCAAATCAGAT
ATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１０） コードアミノ酸配列は Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser
Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu V
al（配列番号１１）であった。この配列は天然タンパク
質のアミノ酸配列決定で得られたアミノ酸配列と完全に
適合した。
ATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１０） コードアミノ酸配列は Met Gly Glu Asn Gln Glu Ser
Ile Trp Ala Asn Gln Ile Leu Asp Lys Ala Gln Leu V
al（配列番号１１）であった。この配列は天然タンパク
質のアミノ酸配列決定で得られたアミノ酸配列と完全に
適合した。
【００４９】残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロー
ニングするために１セットの逆ＰＣＲプライマーを５９
ｂｐのＤＮＡ配列から設計した。逆ＰＣＲプライマーは
以下の通りであった。
ニングするために１セットの逆ＰＣＲプライマーを５９
ｂｐのＤＮＡ配列から設計した。逆ＰＣＲプライマーは
以下の通りであった。
【００５０】 5’GATATTGGACAAGGCCCAACTGGT3’（配列番号１２） 5’TATTGATTCTTGGTTTTCTCCCAT3’（配列番号１３） B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡを６ｂｐの認識
配列を持つ制限酵素、AatII, BamHI, BglII, BspEI, Cl
aI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂ
ｐの認識配列を持つ制限酵素Sau3AI, NlaIII, MspI, Mb
oI, HinP1L, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIを用い
て２時間所望の温度で分解した。分解により逆ＰＣＲ反
応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じ
た。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログ
ラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフ
ェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。
ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁し、
逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、
で３０回）の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はSau3AI,
MboI及びAciIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見
出された。ＤＮＡ断片はpUC19中にクローニングされ配
列決定され、４６５ｂｐの新しい配列を生じた。
配列を持つ制限酵素、AatII, BamHI, BglII, BspEI, Cl
aI, EcoRI, HindIII, MluI, NheI又はSphI及び４−５ｂ
ｐの認識配列を持つ制限酵素Sau3AI, NlaIII, MspI, Mb
oI, HinP1L, HhaI, HpaII, HaeII, EaeI又はAciIを用い
て２時間所望の温度で分解した。分解により逆ＰＣＲ反
応に適したサイズの鋳型ＤＮＡ（１０ｋｂ以下）が生じ
た。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログ
ラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフ
ェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出した。
ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁し、
逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、６０℃１分、７２℃２分、
で３０回）の鋳型として用いた。ＰＣＲ産物はSau3AI,
MboI及びAciIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中に見
出された。ＤＮＡ断片はpUC19中にクローニングされ配
列決定され、４６５ｂｐの新しい配列を生じた。
【００５１】残りのエンドヌクレアーゼ遺伝子をクロー
ニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセッ
トが４６５ｂｐの新しい配列から設計された。プライマ
ーの配列は以下の通りであった。
ニングするために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセッ
トが４６５ｂｐの新しい配列から設計された。プライマ
ーの配列は以下の通りであった。
【００５２】 5’TCCGCTAATTACCTTACCATTATTGGT3’（配列番号１４） 5’CTTTAACTTCAGCCAATAGCATTATGT3’（配列番号１５） ２つのプライマーが追加の周囲ＤＮＡを増幅するのに用
いられた。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApo
I, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, Hha
I, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで
分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイ
クログラム/mL以下）で自己連結した。連結環状ＤＮＡ
をフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出
した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸
濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、
６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用い
た。逆ＰＣＲ産物はHinfI又はRsaIで分解し自己連結し
たゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はクローニ
ングされ配列決定された。７３０ｂｐの追加の配列の後
に、ストップコドンが配列決定したRsaI断片中に見出さ
れた。図２に示された完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺
伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂ
ｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸の
BssHIIエンドヌクレアーゼをコードしている。この分子
量はSDS-PAGEゲル上の明確なサイズ（４６．５ｋＤａ）
と非常に適合している。
いられた。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをApo
I, BsaWI, Sau3AI, NlaIII, MspI, MboI, HinP1I, Hha
I, HpaII, HaeII, EaeI, TaiI, HinfI, RsaI又はAciIで
分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイ
クログラム/mL以下）で自己連結した。連結環状ＤＮＡ
をフェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出
した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸
濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、
６０℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用い
た。逆ＰＣＲ産物はHinfI又はRsaIで分解し自己連結し
たゲノムＤＮＡ中に見出された。ＤＮＡ断片はクローニ
ングされ配列決定された。７３０ｂｐの追加の配列の後
に、ストップコドンが配列決定したRsaI断片中に見出さ
れた。図２に示された完全BssHIIエンドヌクレアーゼ遺
伝子は１２５４ｂｐ（５９ｂｐ＋４６５ｂｐ＋７３０ｂ
ｐ）であり、推定分子量４７ｋＤａの４１７アミノ酸の
BssHIIエンドヌクレアーゼをコードしている。この分子
量はSDS-PAGEゲル上の明確なサイズ（４６．５ｋＤａ）
と非常に適合している。
【００５３】３．bssHIIR遺伝子のpUC19中での発現 E.coli宿主を予め修飾するために、多重特異性BssHIIメ
チラーゼ遺伝子をpACYC184中にクローニングした。完全
BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを
用いたＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位
と７ｂｐのスペースをＡＴＧ開始コドンの前に組み込ん
だ。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニン
グした。挿入を有する３つのクローンが見つかったが、
ＩＰＴＧ誘導細胞培養の細胞抽出物中に明らかなBssHII
活性は見られなかった。挿入はＰＣＲ増幅の間に変異を
もたらすと結論された。pUC19からのBssHIIエンドヌク
レアーゼ遺伝子の発現もまた漏出性(leaky)の発現のた
め不安定であろう。
チラーゼ遺伝子をpACYC184中にクローニングした。完全
BssHIIエンドヌクレアーゼ遺伝子を２つのプライマーを
用いたＰＣＲで増幅した。効率的なリボソーム結合部位
と７ｂｐのスペースをＡＴＧ開始コドンの前に組み込ん
だ。エンドヌクレアーゼ遺伝子をpUC19中にクローニン
グした。挿入を有する３つのクローンが見つかったが、
ＩＰＴＧ誘導細胞培養の細胞抽出物中に明らかなBssHII
活性は見られなかった。挿入はＰＣＲ増幅の間に変異を
もたらすと結論された。pUC19からのBssHIIエンドヌク
レアーゼ遺伝子の発現もまた漏出性(leaky)の発現のた
め不安定であろう。
【００５４】４．T7発現ベクターpET21AT中のbssHIIR遺
伝子の発現 bssHII遺伝子を発現させる２番目の企てで、T7発現ベク
ターpET21ATが厳密に調製された発現に用いられた。ベ
クターpET21ATはT7プロモーターの上流に転写終了暗号
を４コピー担っている。pLysSの共形質転換体は非誘導
条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssH
IIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しコンパチブルベクター
pLG339（pSC101由来）中にクローニングした。以下の通
りの２つのプライマーをbssHIIR遺伝子増幅のために設
計した。
伝子の発現 bssHII遺伝子を発現させる２番目の企てで、T7発現ベク
ターpET21ATが厳密に調製された発現に用いられた。ベ
クターpET21ATはT7プロモーターの上流に転写終了暗号
を４コピー担っている。pLysSの共形質転換体は非誘導
条件下でベースとなる発現レベルをさらに減じる。bssH
IIM1遺伝子をＰＣＲにより増幅しコンパチブルベクター
pLG339（pSC101由来）中にクローニングした。以下の通
りの２つのプライマーをbssHIIR遺伝子増幅のために設
計した。
【００５５】 前向きプライマー （XbaI部位） 5’AGCTCTAGAGGAGGTAAATAAATGGGAGAAAACCAAGAATCAATATGGGCA3’（配列番号 １ ６） 逆向きプライマー （BamHI部位） 5’CGCGGATCCTCAGAATTGGAAGTTTTCTCTAATCCATTCATC3’（配列番号 １７） bssHIIR遺伝子をVent（登録商標）ポリメラーゼを用い
たＰＣＲ(９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分で２０
回)により増幅し、pET21AT中にクローニングした。T7発
現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHI
IM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換させた。１２の単離体
を対数増殖期後半（約１２０klett単位）まで培養し、
ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。ＩＰＴＧ誘
導を３時間行い細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌ
クレアーゼ活性についてアッセイを行った。１２クロー
ン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼを生産していた。１
つのクローンは500mL細胞培養で誘導し、その細胞抽出
物を１０， １００， １０００倍希釈しラムダＤＮＡ
上でBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイするのに
用いた。図５はアッセイ結果を示す。細胞抽出物は１０
倍及び１００倍希釈でBssHII活性を表した（レーン２及
び３）。
たＰＣＲ(９５℃１分、６０℃１分、７２℃１分で２０
回)により増幅し、pET21AT中にクローニングした。T7発
現のためのE.coli宿主細胞、ER2504をpLysS, pLG-BssHI
IM1, pET21AT-BssHIIRで形質転換させた。１２の単離体
を対数増殖期後半（約１２０klett単位）まで培養し、
ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで添加した。ＩＰＴＧ誘
導を３時間行い細胞抽出物を調製しBssHII制限エンドヌ
クレアーゼ活性についてアッセイを行った。１２クロー
ン総てがBssHIIエンドヌクレアーゼを生産していた。１
つのクローンは500mL細胞培養で誘導し、その細胞抽出
物を１０， １００， １０００倍希釈しラムダＤＮＡ
上でBssHIIエンドヌクレアーゼ活性をアッセイするのに
用いた。図５はアッセイ結果を示す。細胞抽出物は１０
倍及び１００倍希釈でBssHII活性を表した（レーン２及
び３）。
【００５６】５．bssHIIM2遺伝子のクローニング II型制限−修飾系において、制限エンドヌクレアーゼ遺
伝子とその同族メチラーゼ遺伝子は通常互いにきわめて
近接して並んでいる。bssHIIR遺伝子の上流のＤＮＡを
逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定し
た。上流の配列は周知のリボゾームrRNA配列と相同性が
ある。従って、真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)
は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流に位置している
に違いない。bssHIIR遺伝子の下流のメチラーゼ遺伝子
をクローニングするために１セットのプライマーを以下
の通りに作成した。
伝子とその同族メチラーゼ遺伝子は通常互いにきわめて
近接して並んでいる。bssHIIR遺伝子の上流のＤＮＡを
逆ＰＣＲにより増幅し、クローニングし、配列決定し
た。上流の配列は周知のリボゾームrRNA配列と相同性が
ある。従って、真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)
は制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の下流に位置している
に違いない。bssHIIR遺伝子の下流のメチラーゼ遺伝子
をクローニングするために１セットのプライマーを以下
の通りに作成した。
【００５７】 5’TCTTTCGTCGCTCAGGTTCTGAAGTAC3’（配列番号１８） 5’TGATTAAAAACAAAGTCGAAAGATTCG3’（配列番号１９） B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをAciI, AluI, A
poI, BsaWI, EaeI, HhaII, HaeIII, MseI, Sau3AI又はT
sp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度
（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結
環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で
１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝
液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５
℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型と
して用いた。逆ＰＣＲ産物はHhaI, HaeIII及びSau3AIで
分解し自己連結させたゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中
に見出された。３つのＰＣＲ産物をクローニングし配列
決定した。未終結転写解読枠が新たに得られた８９５ｂ
ｐの配列中に見出されGenbankの周知遺伝子と比較し
た。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類
似したアミノ酸配列を有する。
poI, BsaWI, EaeI, HhaII, HaeIII, MseI, Sau3AI又はT
sp509Iで分解した。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度
（２マイクログラム/mL以下）で自己連結させた。連結
環状ＤＮＡをフェノールＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で
１回抽出した。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝
液に再懸濁した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５
℃１分、５５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型と
して用いた。逆ＰＣＲ産物はHhaI, HaeIII及びSau3AIで
分解し自己連結させたゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲ反応物中
に見出された。３つのＰＣＲ産物をクローニングし配列
決定した。未終結転写解読枠が新たに得られた８９５ｂ
ｐの配列中に見出されGenbankの周知遺伝子と比較し
た。この未終結転写解読枠は周知のＣ5メチラーゼに類
似したアミノ酸配列を有する。
【００５８】残りのbssHIIM2遺伝子をクローニングする
ために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットを以下の
ように合成した。
ために、２番目の逆ＰＣＲプライマーのセットを以下の
ように合成した。
【００５９】 5’GGAAAATGTAGCGAACTTGAAAGGTGT3’（配列番号２０） 5’ACAAAGAATGGAGGGTTGATTTTCTCA3’（配列番号２１） これらの２つのプライマーを下流の配列を増幅するため
に使用した。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをA
vaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, H
aeIII, Hinf1I, MboI, MseI, RsaI, Sau3AI, Sau96I, S
peI, StyI, TaiI, TfiI, Tsp45I又はTsp509Iで分解し
た。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログ
ラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフ
ェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出し
た。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁
した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５
５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用い
た。逆ＰＣＲ産物がHaeIII, Hinf1I, MboI, Sau3AI及び
StyIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中の逆ＰＣＲ産
物中に見出された。StyIで分解し自己連結したＤＮＡか
らのＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングし、挿入につ
いて配列決定した。新たに得られた２５０ｂｐのＤＮＡ
配列中にストップコドンが見出された。図４に示した完
全なBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐ
であり、４２．２ＫＤａの分子量を有する３７５アミノ
酸のBssHIIメチラーゼタンパク質をコードしていた。
に使用した。B.stearothermophilus H3ゲノムＤＮＡをA
vaI, AluI, BsaJI, BstNI, Csp6I, DpnII, EcoO109I, H
aeIII, Hinf1I, MboI, MseI, RsaI, Sau3AI, Sau96I, S
peI, StyI, TaiI, TfiI, Tsp45I又はTsp509Iで分解し
た。分解ＤＮＡサンプルを低ＤＮＡ濃度（２マイクログ
ラム/mL以下）で自己連結させた。連結環状ＤＮＡをフ
ェノール−ＣＨＣｌ3で２回、ＣＨＣｌ3で１回抽出し
た。ＤＮＡをエタノールで沈降させＴＥ緩衝液に再懸濁
した。連結環状ＤＮＡを逆ＰＣＲ反応（９５℃１分、５
５℃１分、７２℃２分、で３０回）の鋳型として用い
た。逆ＰＣＲ産物がHaeIII, Hinf1I, MboI, Sau3AI及び
StyIで分解し自己連結したゲノムＤＮＡ中の逆ＰＣＲ産
物中に見出された。StyIで分解し自己連結したＤＮＡか
らのＰＣＲ産物をpUC19中にクローニングし、挿入につ
いて配列決定した。新たに得られた２５０ｂｐのＤＮＡ
配列中にストップコドンが見出された。図４に示した完
全なBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)は１１２８ｂｐ
であり、４２．２ＫＤａの分子量を有する３７５アミノ
酸のBssHIIメチラーゼタンパク質をコードしていた。
【００６０】６．bssHIIM2で予め修飾した宿主細胞中の
bssHIIR遺伝子の発現 完全なbssHIIM2遺伝子を以下に示す２つのプライマーを
用いて増幅した。
bssHIIR遺伝子の発現 完全なbssHIIM2遺伝子を以下に示す２つのプライマーを
用いて増幅した。
【００６１】5’CAAGGATCC(BamHI部位)GGAGGT(リボソー
ム結合部位)TAATTAAATGAATGGATTAGAGAAAACTTCCAAT3’
（配列番号２２） 5’TTCGGATCC(BamHI部位)TTAAACAAGTTTAGGTAAACCTTTGAA
GGC3’（配列番号２３） bssHIIM2遺伝子をプラスミドベクターpLG339中に挿入し
た。予め修飾したE.coli宿主細胞ER2417(pLysP,pLG-Bss
HIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生
じた株ER2417(pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)
を500mLのAp(50μg/mL), Km(50μg/mL), Cm(30μg/mL)
添加ＬＢ中で３０℃で対数増殖期後半(120-150klett単
位)まで培養した。ＩＰＴＧを培養に最終濃度０．５ｍ
Ｍまで添加した。３時間のＩＰＴＧ誘導に続いて細胞を
採取しリゾチームと超音波処理により溶解させた。細胞
抽出物についてラムダＤＮＡ上でBssHII活性をアッセイ
した。そのクローンはE.coli細胞湿重１グラム当たり１
×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産し
た。
ム結合部位)TAATTAAATGAATGGATTAGAGAAAACTTCCAAT3’
（配列番号２２） 5’TTCGGATCC(BamHI部位)TTAAACAAGTTTAGGTAAACCTTTGAA
GGC3’（配列番号２３） bssHIIM2遺伝子をプラスミドベクターpLG339中に挿入し
た。予め修飾したE.coli宿主細胞ER2417(pLysP,pLG-Bss
HIIM2)をpET21AT-BssHIIRで形質転換した。その結果生
じた株ER2417(pLysP, pLG-BssHIIM2, pET21AT-BssHIIR)
を500mLのAp(50μg/mL), Km(50μg/mL), Cm(30μg/mL)
添加ＬＢ中で３０℃で対数増殖期後半(120-150klett単
位)まで培養した。ＩＰＴＧを培養に最終濃度０．５ｍ
Ｍまで添加した。３時間のＩＰＴＧ誘導に続いて細胞を
採取しリゾチームと超音波処理により溶解させた。細胞
抽出物についてラムダＤＮＡ上でBssHII活性をアッセイ
した。そのクローンはE.coli細胞湿重１グラム当たり１
×１０5 単位のBssHII制限エンドヌクレアーゼを生産し
た。
【００６２】
配列番号：１ 配列の長さ：３１アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００６３】
【表１】
【００６４】配列番号：２ 配列の長さ：１６０８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す名称/記号：Coding Sequence 存在位置：１．．．１６０５
【００６５】
【表２】
【００６６】
【表３】
【００６７】
【表４】
【００６８】配列番号：３ 配列の長さ：１２５４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す名称／記号：Coding Sequence 存在位置：1...1251
【００６９】
【表５】
【００７０】
【表６】
【００７１】
【表７】
【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：１１２８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 特徴を表す名称/記号：Coding Sequence 存在位置：１．．．１１２５
【００７３】
【表８】
【００７４】
【表９】
【００７５】
【表１０】
【００７６】配列番号：５ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７７】
【表１１】
【００７８】配列番号：６ 配列の長さ：６アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００７９】
【表１２】
【００８０】配列番号：７ 配列の長さ：１６塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 存在位置：５ 他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ 存在位置：８及び１４ 他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ 存在位置：１１ 他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８１】
【表１３】
【００８２】配列番号：８ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 存在位置：９ 他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ 存在位置：１５ 他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ 存在位置：３、６及び１２ 他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８３】
【表１４】
【００８４】配列番号：９ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ 配列の特徴： 存在位置：３及び９ 他の情報：Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴ 存在位置：１５ 他の情報：Ｒ＝Ａ，Ｇ 存在位置：６及び１２ 他の情報：Ｙ＝Ｃ、Ｔ
【００８５】
【表１５】
【００８６】配列番号：１０ 配列の長さ：５９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００８７】
【表１６】
【００８８】配列番号：１１ 配列の長さ：２０アミノ酸 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ フラグメント型：Ｎ末端フラグメント
【００８９】
【表１７】
【００９０】配列番号：１２ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００９１】
【表１８】
【００９２】配列番号：１３ 配列の長さ：２４塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００９３】
【表１９】
【００９４】配列番号：１４ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００９５】
【表２０】
【００９６】配列番号：１５ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００９７】
【表２１】
【００９８】配列番号：１６ 配列の長さ：５１塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【００９９】
【表２２】
【０１００】配列番号：１７ 配列の長さ：４２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１０１】
【表２３】
【０１０２】配列番号：１８ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１０３】
【表２４】
【０１０４】配列番号：１９ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１０５】
【表２５】
【０１０６】配列番号：２０ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１０７】
【表２６】
【０１０８】配列番号：２１ 配列の長さ：２７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１０９】
【表２７】
【０１１０】配列番号：２２ 配列の長さ：４９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１１１】
【表２８】
【０１１２】配列番号：２３ 配列の長さ：３９塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ＤＮＡ ハイポセティカル：Ｎｏ アンチセンス：Ｎｏ
【０１１３】
【表２９】
【図１】多重特異性ＢｓｓＨＩＩ遺伝子(bssHIIM1)のＤ
ＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配
列番号２）。
ＮＡ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配
列番号２）。
【図２】多重特異性BssHII遺伝子(bssHIIM1)のＤＮＡ配
列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号
２）。
列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列番号
２）。
【図３】BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHII
R)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列
である（配列番号３）。
R)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列
である（配列番号３）。
【図４】BssHII制限エンドヌクレアーゼ遺伝子(bssHII
R)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列
である（配列番号３）。
R)のＤＮＡ配列及び及びそれがコードするアミノ酸配列
である（配列番号３）。
【図５】細胞抽出物とλＤＮＡを用いたBssHIIエンドヌ
クレアーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
クレアーゼ活性アッセイの結果を示す図である。
【図６】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮ
Ａ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列
番号４）。
Ａ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列
番号４）。
【図７】真のBssHIIメチラーゼ遺伝子(bssHIIM2)のＤＮ
Ａ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列
番号４）。
Ａ配列及びそれがコードするアミノ酸配列である（配列
番号４）。
【図８】BssHII制限−修飾系の遺伝子構成を示す図であ
る。
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/16 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 ＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼを
コードする単離ＤＮＡであって、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈ
ｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓから得られ得る単離ＤＮＡ。 - 【請求項２】 ＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼを
コードするＤＮＡ断片が挿入されたベクターからなる組
み換えＤＮＡベクター。 - 【請求項３】 ＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼ及
びメチラーゼをコードする単離ＤＮＡであって、単離Ｄ
ＮＡがＡＴＣＣ Ｎｏ．９８３３４から入手可能な単離
ＤＮＡ． - 【請求項４】 請求項３に記載された単離ＤＮＡからな
るクローニングベクター。 - 【請求項５】 請求項２又は４のクローニングベクター
により形質転換された宿主細胞。 - 【請求項６】 ＢｓｓＨＩＩ制限エンドヌクレアーゼを
生産する方法であって、請求項２又は４に記載されたベ
クターで形質転換された宿主細胞を当該エンドヌクレア
ーゼの発現に適した条件下で培養することからなる方
法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/815,688 US5786195A (en) | 1997-03-12 | 1997-03-12 | Method for cloning and producing the bssHII restriction endonuclease in E. coli |
| US815688 | 1997-03-12 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10313883A true JPH10313883A (ja) | 1998-12-02 |
| JP4165775B2 JP4165775B2 (ja) | 2008-10-15 |
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Family Applications (1)
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|---|---|
| US (1) | US5786195A (ja) |
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| JP (1) | JP4165775B2 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005034001A (ja) * | 2002-03-26 | 2005-02-10 | New England Biolabs Inc | 大腸菌におけるＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6562955B2 (en) * | 2000-03-17 | 2003-05-13 | Tosoh Corporation | Oligonucleotides for detection of Vibrio parahaemolyticus and detection method for Vibrio parahaemolyticus using the same oligonucleotides |
| US6660475B2 (en) * | 2000-12-15 | 2003-12-09 | New England Biolabs, Inc. | Use of site-specific nicking endonucleases to create single-stranded regions and applications thereof |
| EP1919937A2 (en) | 2005-08-04 | 2008-05-14 | New England Biolabs, Inc. | Novel restriction endonucleases, dna encoding these endonucleases and methods for identifying new endonucleases with the same or varied specificity |
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| US5200333A (en) * | 1985-03-01 | 1993-04-06 | New England Biolabs, Inc. | Cloning restriction and modification genes |
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| US5498535A (en) * | 1994-05-24 | 1996-03-12 | New England Biolabs, Inc. | Method for direct cloning of nuclease genes in E. coli |
-
1997
- 1997-03-12 US US08/815,688 patent/US5786195A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-11 EP EP98200763A patent/EP0885964B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-11 DE DE69814526T patent/DE69814526T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-12 JP JP10532398A patent/JP4165775B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2005034001A (ja) * | 2002-03-26 | 2005-02-10 | New England Biolabs Inc | 大腸菌におけるＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 |
| JP4601264B2 (ja) * | 2002-03-26 | 2010-12-22 | ニュー・イングランド・バイオラブズ・インコーポレイティッド | 大腸菌におけるＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ及びＢｓａＩメチラーゼのクローニング及び発現方法 |
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|---|---|
| EP0885964B1 (en) | 2003-05-14 |
| EP0885964A3 (en) | 1999-12-29 |
| US5786195A (en) | 1998-07-28 |
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| DE69814526T2 (de) | 2004-03-18 |
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