JP3162059B2 - ＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、制限エンドヌクレアーゼNde Iおよびその
修飾メチラーゼのクローンならびに該クローンからこれ
らの酵素を製造する方法に係る。

制限エンドヌクレアーゼは天然の細菌中にみられる酵
素の一群である。制限エンドヌクレアーゼは、夾雑する
他の細菌成分から精製すると、実験室でDNA分子を切断
して各々相応する正確な断片を形成するのに使用するこ
とができる。この性質の故に、DNA分子はひとつずつ独
自に同定することができ、また分画してその構成遺伝子
を単離することができる。制限エンドヌクレアーゼは現
在の遺伝子研究における不可欠の手段であることが立証
されている。これらの酵素は生化学的な「ハサミ」であ
り、これによって遺伝子工学および遺伝子解析が達成さ
れる。

制限エンドヌクレアーゼは、DNA分子上の特定のヌク
レオチド配列（いわゆる「認識配列」）を認識してこれ
に結合することによって作用する。これらの酵素はDNA
分子に結合すると、その配列の内部または一端でその分
子を開裂する。異なる制限エンドヌクレアーゼはそれぞ
れ異なる認識配列に対して親和性を有している。今日ま
でに調べられた幾百株もの細菌で百を越える数の異なる
制限エンドヌクレアーゼが同定されている。

通常、細菌は、その株毎に、少数の制限エンドヌクレ
アーゼを持つに過ぎない。これらのエンドヌクレアーゼ
はそれの由来となった細菌に因んで命名される。たとえ
ば、Haemophilus aegyptius株はHae I、Hae IIおよびH
ae IIIと呼称される３つの異なる制限エンドヌクレアー
ゼを合成する。これらの酵素は、それぞれ（AT）GGCC
（AT）、PuGCGCPyおよびGGCCという配列を認識して開裂
する。一方、大腸菌Escherichia coli RY13は１種類の
酵素EcoR Iを合成するだけであり、この酵素はGAATTCと
いう配列を認識する。

理論に縛られつもりはないが、自然界で制限エンドヌ
クレアーゼは細菌細胞の増殖に関して保護的な役割を果
たしていると考えられる。これらの酵素のおかげで、細
菌は、放っておくとこれらの細菌を破壊したりまたはこ
れに寄生したりするウィルスやプラスミドのような外来
DNA分子による感染に対して抵抗することが可能にな
る。制限エンドヌクレアーゼは、侵入して来るDNA分子
に結合し、認識配列に出会う度毎にそれらのDNA分子を
開裂することによって、細菌に抵抗性を付与する。こう
して生起する破壊の結果、侵入する遺伝子の多くは不活
性となり、そのDNAはエキソヌクレアーゼによってさら
に細かく分解されることになる。

細菌の防御系の第二の要素は修飾メチラーゼである。
これらの酵素は制限エンドヌクレアーゼと相補的であ
り、これによって、細菌が外来の感染性DNAから自身のD
NAを防御し区別できうようにする手段が提供される。修
飾メチラーゼは対応する制限エンドヌクレアーゼと同じ
ヌクレオチド認識配列を認識してそれに結合するが、こ
のDNAを破断する代わりに、メチル基を付加することに
よってその配列内のヌクレオチドのいずれかを化学的に
修飾する。このメチル化が起こると、その認識配列に制
限エンドヌクレアーゼが結合することはなく、また、そ
の配列が制限エンドヌクレアーゼによって開裂されるこ
ともない。細菌細胞のDNAはその修飾メチラーゼの活性
のあかげでいつも完全に修飾されており、したがって自
身の内因性制限エンドヌクレアーゼの存在に対して完全
に非感受性となっている。制限エンドヌクレアーゼの認
識と攻撃に対して感受性のあるのは未修飾のDNA、した
がって外来のものであることが確認できるDNAだけであ
る。

遺伝子工学技術の出現によって、今では、遺伝子をク
ローニングし、その遺伝子がコードしているタンパク質
や酵素を従来の精製技術で入手可能な量より大量に生産
することが可能である。制限エンドヌクレアーゼ遺伝子
のクローンを単離する際の鍵は、そのようなクローンの
出現頻度が10^-3〜10^-4程度に低い場合、複雑な「ライブ
ラリー」、すなわち「ショットガン」法で得られるクロ
ーンの集団の中で目的とするクローンを同定するための
簡単で信頼のおける方法を開発することである。好まし
くは、この方法は、目的としない大多数のクローンは破
壊されるが珍にある望ましいクローンは生き残れるよう
に、選択的なものであるべきである。

II型の制限−修飾系はクローニングされつつあり、そ
の数は次第に増加している。最初にクローニングされた
系は、制限エンドヌクレアーゼクローンを同定または選
択する手段としてバクテリオファージによる感染を使用
した［Hha II:Mannら,Gene,3:97−112（1978）;EcoR I
I:Kosykhら,Molec.gen.Genet.,178:717−719（1980）;P
st I:Walderら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA,78,1503−1507
（1981）］。細菌中に制限−修飾系が存在すると細菌は
バクテリオファージによる感染に対して抵抗できるの
で、クローニングされた制限−修飾遺伝子を保持する細
菌は、原理的に、ファージに暴露されたライブラリーか
らの生き残りとして選択的に単離することができる。し
かしこの方法は限られた価値しかないことが判明した。
特定的にいうと、クローニングされた制限−修飾遺伝子
は、選択的な生き残りを可能にする程に充分なファージ
耐性を常に発現するとは限らないことが判明したのであ
る。

別のクローニング法では、最初プラスミド由来とされ
ていた系をE.coliクローニングプラスミド中に組み込ん
でいる［EcoR V:Bougueleretら,Nucleic Acids Res.,1
2:3659−3676（1984）;PeaR7:GingerasとBrooks,Proc.N
atl.Acad.Sci.USA,80:402−406（1983）;TheriaultとRo
y,Gene,19:355−359（1982）;Pvu II:Blumenthalら,J.B
acteriol.,164:501−509（1985）］。

第三の方法として多くの系のクローニングに使用され
ている方法では、本発明者らの特許出願第707079号に関
連する活性なメチラーゼ遺伝子について選択する［BsuR
I:Kissら,Nucleic Acids Res.,13:6403−6421（198
5）］。制限遺伝子と修飾遺伝子とは近接して結合して
いる傾向があるので、両者の遺伝子を含有するクローン
は一方の遺伝子について選択するだけで単離できること
が多い。しかし、メチル化活性による選択では常に完全
な制限−修飾系が得られるわけではなく、逆に、メチラ
ーゼ遺伝子のみが得られることもある［BspR I:Szomola
nyiら,Gene,10:219−225（1980）;Bcn I:Janulaitisら,
Gene,20:197−204（1982）;BsuR I:KissとBaldauf,Gen
e,21:111−119（1983）；およびMsp I:Walderら,J.Bio
l.Chem.,258:1235−1241（1983）］。

制限−修飾遺伝子のクローニングに対する潜在的な障
壁は、修飾によって保護されていない宿主中にエンドヌ
クレアーゼ遺伝子を導入しようとすることにある。メチ
ラーゼ遺伝子とエンドヌクレアーゼ遺伝子とを一緒に単
一のクローンとして導入すると、エンドヌクレアーゼが
宿主DNAを開裂する機会を得る前にメチラーゼがそのDNA
を修飾して保護するはずである。したがって、場合によ
っては、これらの遺伝子を順番にすなわち、最初にメチ
ラーゼ、次にエンドヌクレアーゼの順にのみクローニン
グすることが可能となるかもしれない。制限−修飾系の
クローニングに対する別の障壁は、E.coliの株の中には
シトシンの修飾に対して逆の反応を示すものがあるとい
う発見の中に存する。すなわち、そのような株は、メチ
ル化シトシンを含有しているDNAを破壊する系を持って
いるのである［RaleighとWilson,Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,83:9070−9074（1986）］。シトシンに対して特異的
なメチラーゼ遺伝子は、それ単独でも、あるいはその対
応するエンドヌクレアーゼ遺伝子と一緒にでも、これら
の株中で容易にクローニングすることができない。この
問題を避けるためには、これらの系を欠損しているE.co
li変異株（McrA^-およびMcrB^-）を使用する必要がある。

精製した制限エンドヌクレアーゼ、および重要性はそ
れより落ちるが修飾メチラーゼは、実験室でDNAの特性
決定と再配列をするのに有用な道具であるために、これ
らの酵素を大量に合成する細菌株を組換えDNA技術によ
って得ることは商業的な魅力がある。そのような株が得
られれば、商業的に有用な量で生産するための手段が提
供されるばかりでなく精製の作業も簡単になると思われ
るので、これらの株は極めて有用なものとなろう。

発明の概要 本発明によって、Neisseria denitrificansに由来す
るNde I制限エンドヌクレアーゼおよび修飾メチラーゼ
の遺伝子を含有するクローン、ならびにこれらの酵素の
製造方法が提供される。より特定すると、本発明は、CA
^↓TATGというDNA配列を認識して矢印で示した最初の
５′ＡとＴの間を開裂する酵素である制限エンドヌクレ
アーゼNde Iを発現するクローンに係る。FEBS Letters.
150:114−116（1982）参照。本文献の開示は本明細書に
参照として組み入れるものとする。

この酵素をクローニングする好ましい方法は、Neisse
ria denitrificansに由来するDNAを含有するライブラ
リーを形成し、Nde I修飾メチラーゼをコードしているD
NAを含有するクローンを単離し、これらをスクリーニン
グして、Nde I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子も共に含
有しているクローンを同定することからなる。

詳細な説明 本発明は、Nde I制限および修飾遺伝子のクローニン
グ、ならびにこれによって生産されるクローンから制限
エンドヌクレアーゼNde Iを製造する方法を提供する。

本方法は、発現されたNed I制限遺伝子およびメチラ
ーゼ遺伝子を含有することに基づいて、エンドヌクレア
ーゼ選択法によりクローンを選択したという事実を利用
している。そのようなクローンはNde I制限エンドヌク
レアーゼによるin vitro消化に抵抗性である。

Nde I制限遺伝子およびメチラーゼ遺伝子をクローニ
ングして発現させるための本発明の好ましい方法には以
下のステップが含まれる。

（１） Neisseria denitrificans株のゲノムDNAを精
製する。

（２） このゲノムDNAをNsi I制限エンドヌクレアーゼ
のような制限エンドヌクレアーゼを完全に消化する。

（３） その結果得られたNsi I断片を、pUC19若しくは
pBR322のようなクローニングベクターのPst Iクローニ
ング部位中又はpACYC177のNsi I部位中に結合し、この
混合物を用いてE.coli RR1細胞のような適当な宿主細胞
を形質転換する。

（４） この形質転換された混合物を、形質転換細胞を
選択するためのアンピシリンのような抗生物質を含有す
る培地に接種する。培養後、形質転換されたコロニーを
ひとつに集めて細胞ライブラリーとする。

（５） この細胞ライブラリーから組換えプラスミド全
部をそっくり精製してプラスミドライブラリーを作製す
る。

（６） このプラスミドライブラリーを、Watsonら,sup
raに記載されている方法と類似の方法によってNeisseri
a denitrificansから製造したNde I制限エンドヌクレ
アーゼで完全に消化する。Nde I消火により、メチラー
ゼを含有しない未修飾クローンが特異的に破壊され、Nd
e Iメチラーゼクローンの相対頻度が増大する。

（７） 消化したプラスミドライブラリーをアガロース
ゲル電気泳動に掛け、未消化の超らせんプラスミドDNA
をゲルから切り出して溶離させる。

（８） 切り出したプラスミドの超らせんDNAをE.coli
RR1のような適当な宿主中に形質転換し、形質転換体を
選択培地上に接種して回収する。これらのコロニーを採
取し、そのDNAをNde I修飾遺伝子の存在について以下の
ように分析する。すなわち、コロニーが保持するプラス
ミドを精製し、Nde I制限エンドヌクレアーゼと共にイ
ンキュベートしてプラスミドが消化に対して抵抗性か否
かを決定する。また、全細胞DNA（染色体およびプラス
ミド）も精製し、Nde I制限エンドヌクレアーゼと共に
インキュベートする。Nde I修飾遺伝子を保持するクロ
ーンのDNAは充分に修飾されているはずであり、プラス
ミドDNAと全DNAは両方とも消化に対して実質的に抵抗性
であるはずである。

（９） Nde I制限エンドヌクレアーゼを保持するクロ
ーンを、Nde Iメチラーゼ遺伝子を保持することが分っ
ているクローンの粗製抽出物を調製し且つNde I制限エ
ンドヌクレアーゼ活性について粗製抽出物を活性測定す
ることによって同定する。粗製細胞抽出物中のNde I活
性のレベルは、測定の結果、pNdeIRM 6.7−A6を含むク
ローンの細胞1g当たり約4,500,000unitsまたはpNdeIRM
6.7−B9を含むクローンの細胞1g当たり約500,000units
である。

（10） Nde I制限エンドヌクレアーゼ活性が陽性であ
る組換えプラスミドpNdeIRM 6.7−A6およびpNdeIRM 6.7
−B6を含有するクローンは、pUC19のPst Iクローニング
部位に挿入された単一の4.0KbのNsi I DNA断片を含む。

（11） 種々の制限エンドヌクレアーゼに対する多数の
制限エンドヌクレアーゼ部位を、このプラスミド上にマ
ップ化し第３図に示した。遺伝子の位置は、欠失サブク
ローニングによって決定した。

（12） Nde I制限エンドヌクレアーゼを、プラスミドp
NdeIRM 6.7−A6上にNde I制限遺伝子および修飾遺伝子
を保持する細胞から製造する。この細胞を、発酵槽内の
アンピシリン含有富栄養培地中で増殖させる。

（13） 得られた細胞を遠心分離して採取する。

（14） この細胞を超音波処理で破砕すると、Nde I制
限エンドヌクレアーゼ活性を含有する粗製細胞抽出物が
生成する。

（15） Nde I制限エンドヌクレアーゼ活性を含有する
粗製細胞抽出物を、イオン交換クロマトグラフィーやア
フィニティークロマトグラフィーによって精製する。

（16） このようにして精製したエンドヌクレアーゼ
は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動上で均質であ
ること、並びに43,000ダルトンの分子量を有し且つλDN
A上で力価測定されたそれの比活性が2,000,000units/mg
タンパク質であることが判明した。

上に概略を記載した手順は本発明の好ましい実施態様
であるが、上記の手順を業界で公知の技術によって変え
ることができるということは当業者には明らかであろ
う。

以下に現状で好ましい具体例を挙げて本発明を例示す
るが、これらの実施例は単なる例示であって特許請求の
範囲で指摘されない限り本発明がこれらの実施例に限定
されることはないものと考えられたい。

実施例 Nde I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子のクローニング （１）ゲノムDNAの精製： 約5gのNeisseria denitrificans細胞（NRCC31009,NE
B ＃321株）を解凍して、Corning社製プラスチックチュ
ーブ（50ml）内の0.1M Tris−HCl,pH7.1,0.1M EDTA（25
ml）中に再懸濁させた。35mlの上記バッファーと60mgの
リゾチームの溶液を２個の50ml容プラスチックチューブ
に分割し、各々に細胞懸濁液を当容量（15ml）ずつ加え
た。この溶液を37℃で15分間インキュベートした。20％
SDS保存溶液を加えてSDSの最終濃度を１％に調整し、次
いで、200μのプロティナーゼＫ（20mg/ml保存溶液）
を添加して37℃で１時間インキュベートした。この時、
溶液は糸を引くように粘質となって拡散するが、不透明
であった。チューブ（各1ml）に2mlの10％SDS/8％サル
コシル（sarcosyl）を加えて55℃で２時間加熱した。サ
ンプルは相変らず粘質状であったが全体的に不透明であ
った。サンプルをTE（10mM Tris HCl,pH7.1,1mM EDTA）
（２）に対して全体で16時間透析し、この間１回だけ
TEを交換した。透析後、溶液（98ml）を等容量のTE（pH
8.0）で希釈してCsCl勾配用に調製し、これを２つに分
割し、各々に98.0gのCsClと1mlの5mg/ml臭化エチジウム
を添加した。20個のチューブを用いてTi 70ローター内
で48時間、44,000rpmで遠心した。生じたバンドを取り
出し、水を飽和させたイソブタノールで抽出した。溶液
を上記と同じバッファー（４）に対して透析した後、
フェノールおよびクロロホルムで１回ずつ抽出した。こ
の溶液をもう一度透析してフェノールを除き、さらに電
気泳動に掛けた。

（２）限定消化： 精製したDNAをNsi Iで切断し、以下のように完全消化
を達成した。100μg/mlの濃度で、10mM Tris pH7.5,10m
M MgCl₂,50mM NaCl,10mM 2−メルカプトエタノールバ
ッファーに溶解したDNA50μを３個のチューブに分注
し、各チューブに10unitsのNsiIを添加した。チューブ
を37℃で１時間インキュベートした後、フェノール ク
ロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。得られ
たペレットを100μの10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0
中に再溶解し、このうち各10μをアガロースゲル電気
泳動で分析した。

（３）結 合： 断片化したDNAを、以下に示すようにしてpUC19又はpA
CYC177に結合した。Nsi Iで消化したNeisseria denitr
ificansのDNA1.0μｇ（15μ）を、Nsi Iで切断し且つ
脱リン酸化したpACYC177 0.2μｇ（2.5μｇ）と混合し
た。これに2.5μの10X結合混合液（500mM Tris,pH7.
5,100mM MgCl₂,100mM DTT,5mM ATP）と2.5μの滅菌蒸
溜水を加えて最終容量を25μと成した。1.0μのT4
DNAリガーゼを添加し、混合物を16℃で16時間インキュ
ベートした。このうち2.5μおよび5.0μのアリコー
トを用いて、E.coli RR1株を以下のように形質転換し
た。各アリコートを200μの氷冷E.coli RR1コンピテ
ント（competent）細胞と混合して氷上に30分間放置し
た。42℃で２分間ヒートショックした後、細胞を1mlのL
uria−ブロス（Ｌ−broth）で希釈し、37℃で１時間増
殖させた。

（４）１次細胞ライブラリー： 形質転換した細胞培養物を遠心分離し、上清の一部を
捨て残りの上清250μに再懸濁させ、100μg/mlアンピ
シリン又は25μg/mlテトラサイクリンを含有するLuria
−寒天培地（Ｌ−agar）プレート上に接種した。37℃で
一晩インキュベートした後、プレートを取り出し、25ml
のLB中、抗生物質を用いて約5000個のコロニーを破壊し
た。これらの細胞からプラスミドDNAを以下のように調
整した。細菌を遠心分離によりペレット化し、3gの細胞
ペーストを14mlの25mM Tris−HCl,10mM EDTA pH8.0およ
び50mMグルコース中に再懸濁させた。この懸濁液に1.0m
g/mlリゾチームを添加し、25℃で５分間インキュベート
した。１％ドデシル硫酸ナトリウムおよび0.2N NaOHか
ら成るアリコート27mlを加えて溶液を混合し、０℃で５
分間インキュベートした。ゲノムDNAを、20mlの氷冷し
た3M酢酸カリウム（pH4.8）を添加して沈澱させ、10秒
間静かに攪拌し、氷上に５分間放置し、12,000×ｇで10
分間遠心分離した。上清取り出して等容量のフェノール
／クロロホルム（1:1）で抽出した。これを10,000×ｇ
で５分間遠心して複数の層に分離し、上側の層を取り出
し、２倍容量のエタノールを添加して核酸を沈澱させ
た。沈澱物を12,000×ｇで10分間遠心分離して採集し、
ペレットを70％エタノールで１回洗浄し、上記のように
再ペレット化した。ペレットを真空乾燥し、20μg/mlの
RNAaseを含有する8mlの10mM Tris−HCl,1mM EDTA,pH8.0
中に再懸濁させた。このDNA溶液を37℃で１時間インキ
ュベートした後、塩化セシウム−臭化エチジウム平衡密
度遠心用の調製するために、8.8gの塩化セシウム、次い
で0.4mlの臭化エチジウム溶液（5mg/ml）を加えた。DNA
溶液を44,000rpmで48時間遠心し、その結果得られたプ
ラスミドのDNAバンドを18ゲージの針付注射器を用いて
取り出した。CsCl−水で飽和した等容量のイソプロパノ
ールで抽出して臭化エチジウムを除去した後、透析によ
り塩化セシウムを除去した。DNAを等容量のフェノール
／クロロホルム（1:1）で抽出し、さらに等容量のクロ
ロホルムで抽出し、透析した。

（５）１次選択および選択ライブラリー： １μｇ（2.5μｇ）のプラスミドライブラリーを50μ
の制限エンドヌクレアーゼ消化用バッファー（10mM T
ris pH7.5,10mM MgCl₂,10mM ２−メルカプトエタノー
ル,150mM NaClおよび100μｇの牛血清アルブミン）中に
希釈した。8units（１μ）のNde I制限エンドヌクレ
アーゼを加え、チューブを37℃で２時間インキュベート
した。この反応物を200μの氷冷E.coli RR1コンピテ
スト細胞と混合し、接種し、１次ライブラリー用として
一晩増殖させた。プラスミドDNAを、１次ライブラリー
に関する前記の方法により調製した。

（６）２次選択： １回選択の１次ライブラリーに由来するプラスミドDN
Aの２つの同一反応物を、上記のようにして２次選択に
掛けた。しかしながら、37℃に１時間放置後、一方の反
応物に1unit（１μ）のλのエキソヌクレアーゼを、
また他方の反応物に100units（１μ）のエキソヌクレ
アーゼIIIを添加し、この２つの反応物をさらに１時間3
7℃に維持た。

（７）ゲル電気泳動および形質転換： 上記の各反応物を0.7％アガロースゲル上で２時間電
気泳動し、消化物の中から無傷のまま残っている超らせ
んプラスミドDNAバンドを、長波長UVで視覚化しながら
カミソリの刃で切り取って1.5mlのミクロフュー（micro
fue）チューブの中に入れた。これに100μのTE（10mM
Tris−HCl,10mM EDTA,pH8.0）を加えて攪拌した。チュ
ーブをドライアイス−エタノール浴中で５分間凍結し、
次いで解凍した。火炎で先端を封じた200μのピペッ
トマンチップを用いて、ゲル断片を押しつぶした。上記
の凍結−解凍−押しつぶしの各ステップをさらに２回繰
り返した後、チューブを、Eppendorfミクロン遠心機
中、12,000×ｇで10分間遠心し、約125μの上清を取
り出した。このうち2.5μおよび5.0μのアリコート
を用いて、以下のようにE.coli RR1株を形質転換した。
各アリコートを200μの氷冷E.coli RR1コンピテント
細胞と混合し、氷上に30分間置いた。42℃で２分間ヒー
トショックした後、細胞を1mlのLuria−ブロス（Ｌ−br
oth）で希釈し、37℃で１時間増殖させた。次いで、こ
の混合物を遠心分離に掛け、ペレット化した細胞をアン
ピシリン含有LBプレート上に振り撤いた。

（８）個体の分析： 上記の形質転換によって得られた38個のコロニーを10
mlの培養液中で完全に増殖し、それらのコロニーが保持
するプラスミドを、BrnboimとDoly［Nucleic Acids Re
s.7:1513（1979）］の方法を適用した以下に示すminipr
ep（小調製物）精製法により調製した。

miniprep法： 各々の培養を以下に示す手順により実施した。一晩培
養した1.5mlの培養物を6,000×ｇで２分間遠心してペレ
ット化した。上清を取除き、細胞ペレットを、1mg/mlリ
ゾチームを含有する150μの25mM Tris,10mM EDTA,50m
Mグルコース,pH8.0中に再懸濁させた。室温に５分間放
置後、200μの0.2M NaOH,1％SDSを加え、チューブを
振盪して細胞を溶解した後、氷上に置いた。５分後、15
0μの3M酢酸ナトリウム（pH4.8）を加えて振盪し、さ
らに５分間氷上に置いた。生じた沈澱を12,000×ｇ、４
℃で10分間遠心して沈降させた。上清を取り出して等容
量のフェノール／クロロホルム（1:1）で抽出した。10,
000×ｇで５分間遠心して複数の層を分離し、上清を880
μのエタノールを含有する遠心チューブに注入して混
合した。室温に10分間放置後、チューブを12,000×ｇで
10分間遠心して沈澱した核酸をペレット化した。上清を
捨て、ペレットを1mlの70％エタノール−水で再洗浄
し、再びペレット化し、室温で30分間減圧乾燥した。乾
燥後、ペレットを20μg/ml RNaseを含有する50μの10
mM Tris,1mM EDTA,pH8.0中に再懸濁し、これを37℃で１
時間インキュベートしてRNAを消化した。

プラスミドminipreps（小調製物）を、引き続き、Nde
IおよびHind IIIで消化することによって分析した。

（９）メチラーゼ遺伝子クローン： 分析したプラスミドの多くは、DNAのランダムなNsi I
断片を保持すること、およびNde Iによる消化に対して
感受性であるか又はpUC19の小欠失物（small deletion
s）であることが判明した。これらのプラスミドはもは
や興味のない偽の生残りの個体であったが、それ以外の
残りのプラスミドは、Nde Iに抵抗性であり且つ長さ約
4.0kbのNsi I断片を保持することが共に判明した。さら
に、これらのプラスミドはNde I修飾メチラーゼ遺伝子
および制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を共に保持するこ
とが分かった。

（10）制限遺伝子クローン： Nde I修飾メチラーゼ遺伝子を保持するものとして上
記（第（８）項）において同定されたクローンを、Nde
I制限エンドヌクレアーゼ遺伝子についてもテストし
た。このテストは以下のように実施した。一晩培養した
培養物の残留物を用いてエンドヌクレアーゼ活性をチェ
ックした。このチェック法を以下に示す。

エンドヌクレアーゼ活性測定： 10X制限エンドヌクレアーゼバッファー:100mM Tris,p
H7.5,100mM MgCl₂,100mM 2−メルカプトエタノール,500
mM NaCl。

細胞抽出物の調製法を以下に示す。

培養物1mlを4,000rpmで５分間遠心分離して細胞をペ
レット化した。上清を捨て、ペレットを1mg/mlリゾチー
ムを含有する1mlの超音波処理用バッファー（10mM Tri
s,pH7.5,100mM NaCl,10mM ２−メルカプトエタノール,
1mM EDTA）中に再懸濁させた。この懸濁液を攪拌し、30
分間氷上に放置した。このうち1mlのサンプルをEppendo
rfチューブに移し、連続して10秒間ずつ２回静かに超音
波で処理して細胞を破壊した。チューブをミクロ遠心機
中で５分間遠心し、この上清を細胞抽出物として使用し
た。抽出物１μおよび５μを、５μの１×制限エ
ンドヌクレアーゼバッファー中のλDNA 1μｇと一緒に3
7℃で５分間インキュベートした。18個のコロニーはNde
I制限系を安定に保持することが判明した。

メチラーゼ陽性クローンの全てがエンドヌクレアーゼ
を含有することが分った。これらのクローンは、また、
配向（oreintaion）Ａの湿潤細胞ペースト1g当たり約4,
500,000unitsのNde I制限エンドヌクレアーゼを、およ
び配向（oreintaion）Ｂの湿潤細胞ペースト1g当たり約
500,000unitsのNde I制限エンドヌクレアーゼを合成す
ることが判明した。

（11）Nde I制限エンドヌクレアーゼおよびメチラーゼ
をコードする遺伝子を保持している組換えプラスミドpN
deIRM 6.7−A6を形質転換によってE.coli RR1株に移入
した。

（12）E.coli由来のNde Iエンドヌクレアーゼ： E.coli RR1/pNdeIRM 6.7−A6を、10g/カゼイン加水
分解物,5g/イーストエキストラクト,10g/ NaCl,1g/
,1g/塩化マグネシウム六水和物,1g/グルコース,1
00mg/アンピシリンから成るＬ−broth培地を含む醗酵
槽中、37℃で増殖させた。このとき、pHをNaOHで7.2に
調整した。遠心分離により細胞を集め、得られた細胞ペ
ーストを新鮮なうちに使用するか又は−70℃に保存す
る。

（13）以下に続く全てのステップを４℃で実施する。

（14）細胞ペースト（24g）を解凍し、100mlの超音波処
理用バッファー（25mM Tris−HCl,pH8.0,100mM NaCl,10
mM ２−メルカプトエタノールおよび10mM EDTA）中に
細胞を再懸濁させる。

（15）この細胞を超音波処理（すなわち、250ワットで
２分間処理し、５分間氷上で冷却する。この操作を３回
行う。）によって破壊し、懸濁した細胞1ml当たり約50m
gの可溶性タンパク質を放出させる。

（16）不溶性の細胞破片を21,000×ｇで20分間遠心分離
して除去する。

（17）上清を、20mM KH₂PO₄,ph6.9,10mM NaClおよび100
mM 2−メルカプトエタノールで平衡化したホスホセルロ
ースカラム（５×35cm）（Whatman P−11）に流し込
む。このカラムをカラム容量の２倍容積の上記バッファ
ーで洗浄し、カラムから素通りする流体を１個のフラス
コ中に集める。カラムに滞留しているNde Iエンドヌク
レアーゼを0.3〜0.5M NaClで溶出させる。最大活性の画
分をプールし、20mM Tris−HCl,pH7.4,50mM NaClおよび
10mM 2−メルカプトエタノールに対して透析する。

（18）ホスホセルロースカラムから得たプールを、20mM
Tris−HCl,pH7.4,50mM NaClおよび10mM 2−メルカプト
エタノールで平衡化したヘパリン−Sepharose CL−6Bカ
ラムに流し込み、カラム容積の２倍容量の同一バッファ
ーで洗浄する。0.1M〜1.0M NaCl（総容量700ml）の直線
的濃度勾配を形成させながらカラムに流し込む。このと
き10mlずつ分画する。各々の画分を、λDNA基質に対す
るNde I制限エンドヌクレアーゼ活性の存在について測
定する。活性画分をプールし、100倍容量のバッファー
（50mM KCl,20mM Tris−HCl,pH7.4,10mM 2−メルカプト
エタノール）に対して透析する。

（19）透析したNde I活性プール（50ml）を1mlのMono−
Q FPLCカラム（Pharmacia）に流し込み、バッファーＱ
（0.020M Tris−HCl,pH7.4,50mM KCl,10mM 2−メルカプ
トエタノール）で洗浄し、50mM〜0.6M KCl（総容量40m
l）の直線的濃度勾配をバッファーＱ中で形成させなが
らカラムに流し込む。1mlずつ分画し、各々の画分をNde
I制限エンドヌクレアーゼ活性の存在について測定す
る。２つの最大活性の均質な画分を得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は、Nde I制限エンドヌクレアーゼをクローニン
グする方法を概略を示す。 第２図は、Nde I制限エンドヌクレアーゼを製造する方
法の概略を示す。 第３図は、pUC19内にNde I制限エンドヌクレアーゼおよ
び修飾メチラーゼをコードしているNeisseria denitri
ficans由来の4.0kbのNsi I断片の制限地図であり、この
断片をpUC19（ATCC37254）のPst I部位中にクローニン
グしてpNdeIRM 6.7−A6およびpNdeIRM 6.7−B9を作製す
る。 第４図は、制限地図中の制限部位を実証するアガロース
ゲルの写真である。 第５図は、pNdeIRM 6.7−A6およびpNdeIRM 6.7−B9を保
持しているE.coli RR1（ATCC 31343）の細胞抽出物中の
Nde I制限エンドヌクレアーゼ活性を実証するアガロー
スゲルの写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:36） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/55 C12N 9/00 - 9/22 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (6)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】Nde I制限エンドヌクレアーゼをコードす
   るNeisseria denitrificans（NRCC No.31009）から単離
   されたDNAセグメントであって、下記図に示される制限
   部位を有し、上記ヌクレアーゼが、約43,000ダルトンの
   分子量を有するとともにDNA配列CA↓TATGを認識し、矢
   印で示すように５′からの最初のＡとＴの間で切断する
   ことを特徴とする前記DNAセグメント。
2. 【請求項２】請求項１に記載の単離されたDNAセグメン
   トが挿入されているベクターを有する組み換えDNAベク
   ター。
3. 【請求項３】Nde I制限エンドヌクレアーゼ及びメチラ
   ーゼをコードするNeisseria denitrificans（NRCC No.3
   1009）から単離されたDNAセグメントであって、下記図
   に示される制限部位を有し、上記ヌクレアーゼが、約4
   3,000ダルトンの分子量を有するとともにDNA配列CA↓TA
   TGを認識し、矢印で示すように５′からの最初のＡとＴ
   の間で切断することを特徴とする前記DNAセグメント。
4. 【請求項４】請求項３に記載の単離されたDNAセグメン
   トを有するクローニングベクター。
5. 【請求項５】請求項２または４のベクターにより形質転
   換された宿主細胞。
6. 【請求項６】請求項２または４に記載のベクターにより
   形質転換された宿主細胞を、下記制限エンドヌクレアー
   ゼの発現に適した条件下に培養することを含む、Nde I
   制限エンドヌクレアーゼを製造する方法。