JP4210769B2 - Ｇａｔｅｗａｙエントリークローンの作製方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野に属する。特に本発明は、遺伝子の組換え技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Gatewayクローニングテクノロジーは、ｃＤＮＡやＰＣＲ ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現やクローニング／サブクローニングのための迅速で高効率な汎用クローニングシステムである（ＵＳＰ５，８８８，７３２）。このGatewayシステムは、部位特異的ＤＮＡ組換え反応を利用して、異なるベクター間でのインサートＤＮＡの載せ換えを、制限酵素やリガーゼなしで、短時間にin vitroで行う技術であり、基本となるエントリークローンを構築して、多種類の発現クローンを迅速かつ容易に作製することを可能とした技術である。
【０００３】
該システムでは、目的とする遺伝子ＤＮＡを、まずエントリーベクターに入れてエントリークローンを作製する。該エントリークローンは、ＰＣＲ、制限酵素消化、リガーゼ接続でも作ることができ、Gatewayベクターで構築されたｃＤＮＡライブラリーからの部位特異的組み換え反応でも作製できることが知られている。ａttサイトと呼ばれる組み換え部位に接続された目的ＤＮＡを、適切なデスティネーションベクター及びCLONASE酵素ミックスと混合することにより、attサイト間の部位特異的組換えによって生成した中間体（co-integrate）分子が２個の分子に分解し、このうち１個は目的ＤＮＡを含む新しいベクター分子（発現クローン）が作製される。もう１個の分子は陰性選択(ccdB)遺伝子を含むため、宿主菌が殺され、この陽性、陰性選択により、目的とするクローンを効率よく（９０％以上）回収できるものである。
【０００４】
該エントリークローンの作製におけるＰＣＲ法は、まず、５'末端に配列表の配列番号３に記載の25bpのattＢ1の組換え配列を、３’末端に配列番号５に記載の25bpのattＢ2の組換え配列をそれぞれアダプターとして持つ２種類のプライマーによって目的の遺伝子ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アダプターＰＣＲ産物を得る。この目的遺伝子ＤＮＡをattPプラスミドに移し換える場合に、in vitroのＢＰ反応（Gatewayクローニングテクノロジー(2000)，五島直樹，木須康智，今本文男，実験医学，18(19)2716-2717）によって目的遺伝子の方向性を維持したまま移すことができる。
【０００５】
該ＰＣＲ法による該エントリークローンの作製における高効率化は、該Gatewayシステムの有効性を高めるための重要な課題である。中でも、融合たんぱく質の発現クローンを選択的に得ることは、該システムの汎用性と応用範囲の拡大を図る重要な技術としてその開発が要請されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に作製する技術を提供することをその課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意検討をした結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、以下に示す方法が提供される。
（１）２ステップアダプターＰＣＲにおいて、鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダプターａを含む５'末端プライマーＡを用い、アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする部位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる配列attＢ1を持つアダプターｃを含む５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる配列attＢ2を含むアダプターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡを作製し、得られたｃＤＮＡをattＰプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに導入することを特徴とするGatewayエントリークローンの作製方法。
（２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する前記（１）に記載のＰＣＲプライマーＣ。
（３）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＡであり、該プライマーＤは、配列番号７に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号８に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ。
（５）配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（６）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＡであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１０に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（７）配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ。
（８）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（９）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＣＣTであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１１に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（１０）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（９）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の該エントリークローンの作製方法により作製されたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローン。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ネイティブ型ｃＤＮＡ及び融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に効率良く作製する独創的な方法に関する。好ましい態様において、本発明では、目的とする遺伝子ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片からネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローン作製の前駆体である、５'末端に該attＢ1の組換え配列を、３’末端に該attＢ2の組換え配列をそれぞれアダプターとして持つそれぞれのｃＤＮＡのＰＣＲ産物を構築するために、２ステップアダプターＰＣＲを用いる。
【０００９】
本発明による該２ステップアダプターＰＣＲにおいては、目的とする鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、該アダプターaを含む５'末端プライマーＡを用い、該アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする部位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる該配列attＢ1を持つアダプターｃを含む該５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる該配列attＢ2を含む該アダプターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行い、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物をそれぞれ効率良く得ることができる。その概略図を図１に示す。
【００１０】
該第１ステップのＰＣＲで、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列において、ＡＴＴ及びＡＴＡ（なお、図１ではこの組み合わせの場合のみを例示してある）、ＡＣＴ及びＡＣＡあるいはＡＣＴ及びＣＣＴであるそれぞれ２種類組み合わせの該プライマーＢ及び該プライマーＢ'を混合して用いて増幅された該ｃＤＮＡの３'末端が、それぞれＴＡＡ及びＴＡＴ、ＴＧＡ及びＴＧＴあるいはＴＧＡ及びＧＧＡである２種類のＤＮＡが増幅されるが、得られた第１ステップのＰＣＲ産物を鋳型とした第２ステップでのＰＣＲに際して、該３'末端のＰＣＲプライマーとして、それぞれＡＴＴあるいはＡＣＴの配列を３’末端に持つ、配列番号７あるいは９に記載の該ネイティブ型共通プライマーＤ及びそれぞれＡＴＡ、ＡＣＡあるいはＣＣＴの配列を３’末端に持つ配列番号８、１０あるいは１１に記載の該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'を用いることにより、停止コドンによる読みとりを停止するネイティブ型ｃＤＮＡ及び停止コドンが破壊されＣ末端を読み繋ぐＣ末端融合型ｃＤＮＡを選択的に且つ効率良く、それぞれ作製することができる。
【００１１】
第２ステップでのＰＣＲを、該アダプターｃを含む該５’末端の該共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとして、該アダプターｄを含む該ネイティブ型共通プライマーＤ及び該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'の２種類を用いて行うことにより、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2は配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、それぞれ得ることができ、得られたｃＤＮＡをattPプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに導入することでGatewayエントリークローンを作製することができる。
【００１２】
本発明による該第１ステップＰＣＲにおいて、用いられる５'末端側プライマーＡ中のアダプターａの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の配列を用いることができる。３'末端側プライマーＢ及びＢ'中のアダプターｂの塩基配列は、配列番号２を用いることができる。
【００１３】
本発明では、該第２ステップでのＰＣＲにおける５’末端のアダプターを含む共通プライマーＣが用いられるが、該プライマーＣにおけるアダプターｃの塩基配列は、配列番号３に記載の配列を持つアダプターを用いることができ、該プライマーＣは、配列番号４に記載の塩基配列を持つものを用いることができる。
３'末端側はアダプターを含む該ネイティブ型共通プライマーＤ及び該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'の２種類を用いて行うが、両共通プライマーにおけるアダプターｄの塩基配列は、配列番号６に記載の配列を持つアダプターを用いることができる。
【００１４】
本発明では、ＲＮＡを逆転写して得られる全長ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を用いる。該ＤＮＡ断片は、ウイルス、細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫、及びヒトを含む動物など自然の材料から由来することができる。また、あらゆるＲＮＡ材料から調製することもできる。
【００１５】
本発明によるＰＣＲ過程においては、多様なＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）(Taq)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）(Tth)及びパイロコカスフリオサス（Pyrococcus furiosus)(Pfu)を含む様々な細菌から得られるような熱安定的な該ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】
本発明によるＰＣＲ過程においては、エンハンサー溶液（インビトロジェン社製）を用いることにより反応効率を上げることができる。該エンハンサー溶液を加える場合には、ＰＣＲ反応溶液組成中に、５〜１５％であり、好ましくは８〜１２％である。
【００１７】
本発明による該第１ステップＰＣＲにおいては、ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は３〜１０が好ましく、さらに好ましくは４〜６である。
該第２ステップＰＣＲにおいては、ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は５〜２０が好ましく、さらに好ましくは８〜１２である。
【００１８】
本発明における第１ステップＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表１に、反応プログラムを表２にそれぞれ示した。
【００１９】
【表１】
【００２０】
【表２】
【００２１】
本発明における第２ステップＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表３に、反応プログラムを表４にそれぞれ示した。
【００２２】
【表３】
【００２３】
【表４】
【００２４】
表１〜表４のＰＣＲの反応条件は一例であって、エントリークローン作製のためのｃＤＮＡの長さ等に対応して、例えば鋳型ＤＮＡの量等その条件は適宜選択することができる。
【００２５】
本発明によれば、該２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2は配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を同時に効率良く得ることができる。エントリークローン作製のための、第２ステップ（以後、２ｎｄと略記）ＰＣＲ産物のattＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により容易に行うことができる。表５にＢＰ反応における、反応溶液組成の一例を示す。
【００２６】
【表５】
【００２７】
該ＢＰ反応は、例えば以下のような操作により行うことができる。氷上で表５における２ｎｄＰＣＲ産物を含まない反応溶液を混合しておき、２ｎｄＰＣＲ産物を所定量加えて、２５℃で１時間以上インキュベートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μg/μl）を加え、３７℃で１０minインキュベートして反応を停止する。
【００２８】
本発明においては、該ＢＰ反応により得られた産物を、例えば以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションすることで、Gatewayエントリークローンを作製することができる。即ち、氷上で５０μlのコンピテントセル溶液に５μlのＢＰ反応産物を加え、そのまま３０minインキュベートする。その後、４２℃でセルを３０sec熱ショックを行い、直ちに２min氷上に置く。続いて、２５０μlのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養する。選択培地プレート（５０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上にセル１００〜１５０μlを蒔き、３７℃でインキュベートする。生えてきたそれぞれのクローンから４個のコロニーをとり、５０μg/mlのカナマイシンを含む０．２mlのＴＢ培地中で振とう培養する。その後、８０％グリセロール溶液に５０μlの培養液を加えて、良く攪拌し、シールした後−８０℃で保存する。
得られたクローンについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行う。
【００２９】
本発明における、目的エントリークローンの生成の確認は、前記クローンから得られ保存したコロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うことにより可能となる。コロニーＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表６に、反応プログラムを表７にそれぞれ示した。なお、プライマーCの塩基配列は、配列表の配列番号４に、attＢ2プライマーの塩基配列は、配列番号１２にそれぞれ記載のものを用いることができる。
【００３０】
【表６】
【００３１】
【表７】
【００３２】
該コロニーＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物は、その反応産物の５μlを１．５％のアガロースゲル上で分離し、所定のエントリークローン作製の確認を行うことができる。
【００３３】
【実施例】
本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特記しない限りインビトロジェン社又は和光純薬社製の分析レベル及び生化学レベルのものを使用した。
【００３４】
実施例１
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００３５】
ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるPLATINUM Taq DNA polymerase High Fidelity（以後、Taq HiFiと略記）以外にPLATINUM Pfx DNA polymerase（以後、Pfxと略記）の２種類について検討した。また、Taq HiFiを用いた場合については、エンハンサー溶液を添加した時と、添加しないと時について検討を行った。
【００３６】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに２０μl分注した後、プライマーＡ（10μM）を0.5μl、プライマーＢ及びＢ'の混合液（10μM）を0.5μl及び鋳型DNAを5.0μl（50ng〜）をそれぞれのチューブに加えて、表２の反応プログラムにより反応を行った。
【００３７】
【表８】
【００３８】
第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号６に記載のプライマーＣ及び配列番号７に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号８に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００３９】
第１ステップＰＣＲ反応と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応においても９６ウエルプレートを用いて行い、表９の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに２０μl分注した後、第１ステップのＰＣＲ反応溶液5.0μlをそれぞれのチューブに加えて、表４の反応プログラムにより反応を行った。
【００４０】
【表９】
【００４１】
２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物が得られる。エントリークローン作製のための、attＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により行う。ＢＰ反応は、基本的には表５に示した反応溶液組成により行うが、ＰＣＲ反応と同様に９６ウエルプレートを用いて行い、表１０の反応溶液組成（１２４反応分）を調製した。
【００４２】
【表１０】
【００４３】
ＢＰ反応の操作は、氷上で表１０に示した反応溶液を混合しておき、各チューブに５μl を分注した後、２ｎｄＰＣＲ産物を５μl加えて、２５℃で一晩インキュベートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μg/μl）を加え、３７℃で１０minインキュベートして反応を停止した。
【００４４】
ＢＰ反応により得られた産物で、以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。即ち、氷上で５０μlのコンピテントセル（ＤＨ５α）溶液に５μlのＢＰ反応産物を加え、そのまま３０minインキュベートした。その後、４２℃でセルを３０sec熱ショックし、直ちに２min氷上に置いた。続いて、２５０μlのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養した。選択培地プレート（５０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上に培養液１００〜１５０μlを蒔き、３７℃でインキュベートした。
【００４５】
以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１１に示した。
【００４６】
【表１１】
【００４７】
表１１の結果から、２ステップのＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。生えてきたそれぞれのクローンのコロニーから任意に４個のコロニーを選びとり、５０μg/mlのカナマイシンを含む０．２mlのＴＢ培地中で振とう培養した。その後、８０％グリセロール溶液に５０μlの培地を加えて、良く攪拌し、シールした後−８０℃で保存した。
【００４８】
選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行った。即ち、各クローンから得られ、保存したコロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行った。コロニーＰＣＲは、基本的には反応溶液組成を表６に示したものを用いて、反応プログラムを表７に示した方法で行った。
【００４９】
第１、第２ステップＰＣＲ反応と同様に、コロニーＰＣＲ反応においても284ウエルプレートを用いて行い、表１２の反応溶液組成（４１６反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに１５μl分注した後、各コロニー培養液０．５μlをそれぞれのチューブに加えて、表７の反応プログラムにより反応を行った。
【００５０】
【表１２】
【００５１】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１３にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００５２】
【表１３】
【００５３】
表１３の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。特に、Taq HiFiにエンハンサー溶液添加の場合には、ネイティブ型、C末端融合型ｃＤＮＡとも１００％の選択率でクローン化されていることが分かる。
【００５４】
実施例２
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００５５】
実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいてにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類について検討した。
【００５６】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラムにより反応を行った。ただし、表８におけるＤＮＡポリメラーゼを Taq HiFiを用いた場合、エンハンサー溶液の無添加の反応は、本実施例では行っていない。
【００５７】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応においても９６ウエルプレートを用いて行い、表９の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表４の反応プログラムにより反応を行った。
【００５８】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１０に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００５９】
実施例１と同様に、２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００６０】
ＢＰ反応により得られた産物で、実施例１と同様に、コンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１４に示した。
【００６１】
【表１４】
【００６２】
表１４の結果から、２ステップアダプターＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、必要なコロニー数が得られることが分かる。実施例１と同様に、任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０℃で保存した。
【００６３】
引き続き、実施例１に従って、選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることをコロニーＰＣＲにより確認を行った。
【００６４】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１５にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００６５】
【表１５】
【００６６】
表１５の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。
【００６７】
実施例３
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣTの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００６８】
実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣTの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類について検討した。また、Taq HiFiを用いた場合については、エンハンサー溶液を添加した時と、添加しないと時について検討を行った。
【００６９】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラムにより反応を行った。
【００７０】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１１に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００７１】
実施例１と同様に、２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００７２】
ＢＰ反応により得られた産物を、実施例１と同様の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。
それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１６に示した。
【００７３】
【表１６】
【００７４】
表１６の結果から、２ステップのＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。それぞれのクローンのコロニーから任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０℃で保存した。
【００７５】
選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることを、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うことにより確認した。コロニーＰＣＲは、実施例１と同様に行った。
【００７６】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１７にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００７７】
【表１７】
【００７８】
表１７の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。特に、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaq HiFiをもちいて、エンハンサー溶液添加の場合には、ネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡともほぼ１００％の選択率でクローン化されていることが分かる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によるGatewayエントリークローンの作成方法は、多種類の発現クローンを迅速かつ容易に作製することを可能とした技術である。ｃＤＮＡやＰＣＲ ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現等が容易となり、ヒトゲノムｃＤＮＡ等による医薬品開発などの進展に寄与する。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅の概略を示したものである。
【符号の説明】
ａ：アダプターａ
ｂ：アダプターｂ
ｃ：アダプターｃ
ｄ：アダプターｄ
ＡＴＧ：読み込み開始コドン配列
Ｔｅｒ：停止コドン配列（ＴＧＡ，ＴＡＡ，ＴＡＧを総称）
ＯＲＦ：ｃＤＮＡの翻訳領域
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学の分野に属する。特に本発明は、遺伝子の組換え技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Gatewayクローニングテクノロジーは、ｃＤＮＡやＰＣＲ ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現やクローニング／サブクローニングのための迅速で高効率な汎用クローニングシステムである（ＵＳＰ５，８８８，７３２）。このGatewayシステムは、部位特異的ＤＮＡ組換え反応を利用して、異なるベクター間でのインサートＤＮＡの載せ換えを、制限酵素やリガーゼなしで、短時間にin vitroで行う技術であり、基本となるエントリークローンを構築して、多種類の発現クローンを迅速かつ容易に作製することを可能とした技術である。
【０００３】
該システムでは、目的とする遺伝子ＤＮＡを、まずエントリーベクターに入れてエントリークローンを作製する。該エントリークローンは、ＰＣＲ、制限酵素消化、リガーゼ接続でも作ることができ、Gatewayベクターで構築されたｃＤＮＡライブラリーからの部位特異的組み換え反応でも作製できることが知られている。ａttサイトと呼ばれる組み換え部位に接続された目的ＤＮＡを、適切なデスティネーションベクター及びCLONASE酵素ミックスと混合することにより、attサイト間の部位特異的組換えによって生成した中間体（co-integrate）分子が２個の分子に分解し、このうち１個は目的ＤＮＡを含む新しいベクター分子（発現クローン）が作製される。もう１個の分子は陰性選択(ccdB)遺伝子を含むため、宿主菌が殺され、この陽性、陰性選択により、目的とするクローンを効率よく（９０％以上）回収できるものである。
【０００４】
該エントリークローンの作製におけるＰＣＲ法は、まず、５'末端に配列表の配列番号３に記載の25bpのattＢ1の組換え配列を、３’末端に配列番号５に記載の25bpのattＢ2の組換え配列をそれぞれアダプターとして持つ２種類のプライマーによって目的の遺伝子ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、アダプターＰＣＲ産物を得る。この目的遺伝子ＤＮＡをattPプラスミドに移し換える場合に、in vitroのＢＰ反応（Gatewayクローニングテクノロジー(2000)，五島直樹，木須康智，今本文男，実験医学，18(19)2716-2717）によって目的遺伝子の方向性を維持したまま移すことができる。
【０００５】
該ＰＣＲ法による該エントリークローンの作製における高効率化は、該Gatewayシステムの有効性を高めるための重要な課題である。中でも、融合たんぱく質の発現クローンを選択的に得ることは、該システムの汎用性と応用範囲の拡大を図る重要な技術としてその開発が要請されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に作製する技術を提供することをその課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、前記の課題を解決するために鋭意検討をした結果、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明によれば、以下に示す方法が提供される。
（１）２ステップアダプターＰＣＲにおいて、鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダプターａを含む５'末端プライマーＡを用い、アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする部位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる配列attＢ1を持つアダプターｃを含む５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる配列attＢ2を含むアダプターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡを作製し、得られたｃＤＮＡをattＰプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに導入することを特徴とするGatewayエントリークローンの作製方法。
（２）配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する前記（１）に記載のＰＣＲプライマーＣ。
（３）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＡであり、該プライマーＤは、配列番号７に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号８に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（４）配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ。
（５）配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（３）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（６）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＡであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１０に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（７）配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ。
（８）配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（６）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（９）該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＣＣTであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１１に記載の塩基配列であることを特徴とする前記（１）に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
（１０）配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有する前記（１）又は（９）に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
（１１）前記（１）〜（１０）のいずれかに記載の該エントリークローンの作製方法により作製されたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローン。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による、ネイティブ型ｃＤＮＡ及び融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローンを選択的に効率良く作製する独創的な方法に関する。好ましい態様において、本発明では、目的とする遺伝子ｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片からネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローン作製の前駆体である、５'末端に該attＢ1の組換え配列を、３’末端に該attＢ2の組換え配列をそれぞれアダプターとして持つそれぞれのｃＤＮＡのＰＣＲ産物を構築するために、２ステップアダプターＰＣＲを用いる。
【０００９】
本発明による該２ステップアダプターＰＣＲにおいては、目的とする鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、該アダプターaを含む５'末端プライマーＡを用い、該アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする部位の塩基配列が異なる３'末端プライマーＢ及びＢ'を混合して行い、第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでの増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる該配列attＢ1を持つアダプターｃを含む該５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる該配列attＢ2を含む該アダプターｄを持つネイティブ型共通プライマーＤ又はＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行い、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物をそれぞれ効率良く得ることができる。その概略図を図１に示す。
【００１０】
該第１ステップのＰＣＲで、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列において、ＡＴＴ及びＡＴＡ（なお、図１ではこの組み合わせの場合のみを例示してある）、ＡＣＴ及びＡＣＡあるいはＡＣＴ及びＣＣＴであるそれぞれ２種類組み合わせの該プライマーＢ及び該プライマーＢ'を混合して用いて増幅された該ｃＤＮＡの３'末端が、それぞれＴＡＡ及びＴＡＴ、ＴＧＡ及びＴＧＴあるいはＴＧＡ及びＧＧＡである２種類のＤＮＡが増幅されるが、得られた第１ステップのＰＣＲ産物を鋳型とした第２ステップでのＰＣＲに際して、該３'末端のＰＣＲプライマーとして、それぞれＡＴＴあるいはＡＣＴの配列を３’末端に持つ、配列番号７あるいは９に記載の該ネイティブ型共通プライマーＤ及びそれぞれＡＴＡ、ＡＣＡあるいはＣＣＴの配列を３’末端に持つ配列番号８、１０あるいは１１に記載の該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'を用いることにより、停止コドンによる読みとりを停止するネイティブ型ｃＤＮＡ及び停止コドンが破壊されＣ末端を読み繋ぐＣ末端融合型ｃＤＮＡを選択的に且つ効率良く、それぞれ作製することができる。
【００１１】
第２ステップでのＰＣＲを、該アダプターｃを含む該５’末端の該共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとして、該アダプターｄを含む該ネイティブ型共通プライマーＤ及び該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'の２種類を用いて行うことにより、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2は配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を、それぞれ得ることができ、得られたｃＤＮＡをattPプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに導入することでGatewayエントリークローンを作製することができる。
【００１２】
本発明による該第１ステップＰＣＲにおいて、用いられる５'末端側プライマーＡ中のアダプターａの塩基配列は、配列表の配列番号１に記載の配列を用いることができる。３'末端側プライマーＢ及びＢ'中のアダプターｂの塩基配列は、配列番号２を用いることができる。
【００１３】
本発明では、該第２ステップでのＰＣＲにおける５’末端のアダプターを含む共通プライマーＣが用いられるが、該プライマーＣにおけるアダプターｃの塩基配列は、配列番号３に記載の配列を持つアダプターを用いることができ、該プライマーＣは、配列番号４に記載の塩基配列を持つものを用いることができる。
３'末端側はアダプターを含む該ネイティブ型共通プライマーＤ及び該Ｃ末端融合型共通プライマーＤ'の２種類を用いて行うが、両共通プライマーにおけるアダプターｄの塩基配列は、配列番号６に記載の配列を持つアダプターを用いることができる。
【００１４】
本発明では、ＲＮＡを逆転写して得られる全長ｃＤＮＡポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を用いる。該ＤＮＡ断片は、ウイルス、細菌、酵母、糸状菌、植物、昆虫、及びヒトを含む動物など自然の材料から由来することができる。また、あらゆるＲＮＡ材料から調製することもできる。
【００１５】
本発明によるＰＣＲ過程においては、多様なＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。好ましくは、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）(Taq)、サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）(Tth)及びパイロコカスフリオサス（Pyrococcus furiosus)(Pfu)を含む様々な細菌から得られるような熱安定的な該ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１６】
本発明によるＰＣＲ過程においては、エンハンサー溶液（インビトロジェン社製）を用いることにより反応効率を上げることができる。該エンハンサー溶液を加える場合には、ＰＣＲ反応溶液組成中に、５〜１５％であり、好ましくは８〜１２％である。
【００１７】
本発明による該第１ステップＰＣＲにおいては、ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は３〜１０が好ましく、さらに好ましくは４〜６である。
該第２ステップＰＣＲにおいては、ＰＣＲの反応プログラムのサイクル数は５〜２０が好ましく、さらに好ましくは８〜１２である。
【００１８】
本発明における第１ステップＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表１に、反応プログラムを表２にそれぞれ示した。
【００１９】
【表１】
【表２】
本発明における第２ステップＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表３に、反応プログラムを表４にそれぞれ示した。
【００２２】
【表３】
【表４】
表１〜表４のＰＣＲの反応条件は一例であって、エントリークローン作製のためのｃＤＮＡの長さ等に対応して、例えば鋳型ＤＮＡの量等その条件は適宜選択することができる。
【００２５】
本発明によれば、該２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2は配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物を同時に効率良く得ることができる。エントリークローン作製のための、第２ステップ（以後、２ｎｄと略記）ＰＣＲ産物のattＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により容易に行うことができる。表５にＢＰ反応における、反応溶液組成の一例を示す。
【００２６】
【表５】
該ＢＰ反応は、例えば以下のような操作により行うことができる。氷上で表５における２ｎｄＰＣＲ産物を含まない反応溶液を混合しておき、２ｎｄＰＣＲ産物を所定量加えて、２５℃で１時間以上インキュベートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μg/μl）を加え、３７℃で１０minインキュベートして反応を停止する。
【００２８】
本発明においては、該ＢＰ反応により得られた産物を、例えば以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションすることで、Gatewayエントリークローンを作製することができる。即ち、氷上で５０μlのコンピテントセル溶液に５μlのＢＰ反応産物を加え、そのまま３０minインキュベートする。その後、４２℃でセルを３０sec熱ショックを行い、直ちに２min氷上に置く。続いて、２５０μlのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養する。選択培地プレート（５０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上にセル１００〜１５０μlを蒔き、３７℃でインキュベートする。生えてきたそれぞれのクローンから４個のコロニーをとり、５０μg/mlのカナマイシンを含む０．２mlのＴＢ培地中で振とう培養する。その後、８０％グリセロール溶液に５０μlの培養液を加えて、良く攪拌し、シールした後−８０℃で保存する。
得られたクローンについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行う。
【００２９】
本発明における、目的エントリークローンの生成の確認は、前記クローンから得られ保存したコロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うことにより可能となる。コロニーＰＣＲの反応条件の一例として、反応溶液組成を表６に、反応プログラムを表７にそれぞれ示した。なお、プライマーCの塩基配列は、配列表の配列番号４に、attＢ2プライマーの塩基配列は、配列番号１２にそれぞれ記載のものを用いることができる。
【００３０】
【表６】
【表７】
該コロニーＰＣＲにより得られたＰＣＲ産物は、その反応産物の５μlを１．５％のアガロースゲル上で分離し、所定のエントリークローン作製の確認を行うことができる。
【００３３】
【実施例】
本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、本発明はこの実施例によって限定されるものではない。また、実施例で用いた酵素及び試薬は、特記しない限りインビトロジェン社又は和光純薬社製の分析レベル及び生化学レベルのものを使用した。
【００３４】
実施例１
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００３５】
ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＴＴ及びＡＴＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるPLATINUM Taq DNA polymerase High Fidelity（以後、Taq HiFiと略記）以外にPLATINUM Pfx DNA polymerase（以後、Pfxと略記）の２種類について検討した。また、Taq HiFiを用いた場合については、エンハンサー溶液を添加した時と、添加しないと時について検討を行った。
【００３６】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに２０μl分注した後、プライマーＡ（10μM）を0.5μl、プライマーＢ及びＢ'の混合液（10μM）を0.5μl及び鋳型DNAを5.0μl（50ng〜）をそれぞれのチューブに加えて、表２の反応プログラムにより反応を行った。
【００３７】
【表８】
第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号６に記載のプライマーＣ及び配列番号７に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号８に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００３９】
第１ステップＰＣＲ反応と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応においても９６ウエルプレートを用いて行い、表９の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに２０μl分注した後、第１ステップのＰＣＲ反応溶液5.0μlをそれぞれのチューブに加えて、表４の反応プログラムにより反応を行った。
【００４０】
【表９】
２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果、５'末端にattＢ1配列を、３'末端にattＢ2配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物が得られる。エントリークローン作製のための、attＰプラスミドへの組み込みは、ＢＰ反応により行う。ＢＰ反応は、基本的には表５に示した反応溶液組成により行うが、ＰＣＲ反応と同様に９６ウエルプレートを用いて行い、表１０の反応溶液組成（１２４反応分）を調製した。
【００４２】
【表１０】
ＢＰ反応の操作は、氷上で表１０に示した反応溶液を混合しておき、各チューブに５μl を分注した後、２ｎｄＰＣＲ産物を５μl加えて、２５℃で一晩インキュベートした後、1μlの10xプロテナーゼＫ（2μg/μl）を加え、３７℃で１０minインキュベートして反応を停止した。
【００４４】
ＢＰ反応により得られた産物で、以下の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。即ち、氷上で５０μlのコンピテントセル（ＤＨ５α）溶液に５μlのＢＰ反応産物を加え、そのまま３０minインキュベートした。その後、４２℃でセルを３０sec熱ショックし、直ちに２min氷上に置いた。続いて、２５０μlのＳＯＣ培地を加えて、３７℃で１．５時間振とう培養した。選択培地プレート（５０μg/mlのカナマイシンを含むＬＢ培地プレート）上に培養液１００〜１５０μlを蒔き、３７℃でインキュベートした。
【００４５】
以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１１に示した。
【００４６】
【表１１】
表１１の結果から、２ステップのＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。生えてきたそれぞれのクローンのコロニーから任意に４個のコロニーを選びとり、５０μg/mlのカナマイシンを含む０．２mlのＴＢ培地中で振とう培養した。その後、８０％グリセロール溶液に５０μlの培地を加えて、良く攪拌し、シールした後−８０℃で保存した。
【００４８】
選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることの確認を行った。即ち、各クローンから得られ、保存したコロニーについて、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行った。コロニーＰＣＲは、基本的には反応溶液組成を表６に示したものを用いて、反応プログラムを表７に示した方法で行った。
【００４９】
第１、第２ステップＰＣＲ反応と同様に、コロニーＰＣＲ反応においても284ウエルプレートを用いて行い、表１２の反応溶液組成（４１６反応分）を調製し、１２チャンネルピペットを用いて各チューブに１５μl分注した後、各コロニー培養液０．５μlをそれぞれのチューブに加えて、表７の反応プログラムにより反応を行った。
【００５０】
【表１２】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１３にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００５２】
【表１３】
表１３の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。特に、Taq HiFiにエンハンサー溶液添加の場合には、ネイティブ型、C末端融合型ｃＤＮＡとも１００％の選択率でクローン化されていることが分かる。
【００５４】
実施例２
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００５５】
実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいてにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＡＣＡの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類について検討した。
【００５６】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラムにより反応を行った。ただし、表８におけるＤＮＡポリメラーゼを Taq HiFiを用いた場合、エンハンサー溶液の無添加の反応は、本実施例では行っていない。
【００５７】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応においても９６ウエルプレートを用いて行い、表９の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表４の反応プログラムにより反応を行った。
【００５８】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１０に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００５９】
実施例１と同様に、２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００６０】
ＢＰ反応により得られた産物で、実施例１と同様に、コンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。以上の実験により、それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１４に示した。
【００６１】
【表１４】
表１４の結果から、２ステップアダプターＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、必要なコロニー数が得られることが分かる。実施例１と同様に、任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０℃で保存した。
【００６３】
引き続き、実施例１に従って、選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることをコロニーＰＣＲにより確認を行った。
【００６４】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１５にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００６５】
【表１５】
表１５の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。
【００６７】
実施例３
第１ステップのＰＣＲに際して、３'末端側のアダプターｂを持つプライマーとして、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣTの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いるGatewayエントリークローン作製の実施例。
【００６８】
実施例１と同様に、ヒト完全長ｃＤＮＡプロジェクトにおいて見出されたＯＲＦ６２４、１４７３、９１５、１３８９、４９８、１４１０、３７８及び６７２のそれぞれのｃＤＮＡを含むＤＮＡ断片を２ステップアダプターＰＣＲによりｃＤＮＡの増幅を行い、Gatewayエントリークローンの作製を行った。第１ステップのＰＣＲ反応は、プライマーＡ及び配列番号２に記載ののアダプターｂを持ち、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列が、ＡＣＴ及びＣＣTの２種類であるプライマーＢ及びＢ'を混合して用いて、基本的には表１の反応組成溶液により、表２の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。なお、第１及び第２ステップのＰＣＲ反応において、ＤＮＡポリメラーゼとしては、表１、表３にあるTaq HiFi以外にPfxの２種類について検討した。また、Taq HiFiを用いた場合については、エンハンサー溶液を添加した時と、添加しないと時について検討を行った。
【００６９】
第１ステップＰＣＲ反応は、９６ウエルプレートを用いて行い、実施例１と同様に、表８の反応溶液組成（１２４反応分）を調製し、表２の反応プログラムにより反応を行った。
【００７０】
実施例１と同様に、第２ステップのＰＣＲ反応は、配列番号4に記載のプライマーＣ及び配列番号９に記載の配列を持つプライマーＤあるいは配列番号１１に記載の配列を持つプライマーＤ'用いて、基本的には表３の反応組成溶液により、表４の反応プログラムでＰＣＲ反応を行った。
【００７１】
実施例１と同様に、２ステップアダプターＰＣＲ法による反応の結果得られたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのＰＣＲ産物について、エントリークローン作製のための、ＢＰ反応を行った。
【００７２】
ＢＰ反応により得られた産物を、実施例１と同様の操作によりコンピテントセルをトランスフォメーションし、Gatewayエントリークローンを作製した。
それぞれのクローンについて得られたコロニー数を確認した結果を表１６に示した。
【００７３】
【表１６】
表１６の結果から、２ステップのＰＣＲの反応条件により各クローンにおいて、充分なコロニー数が得られることが分かる。それぞれのクローンのコロニーから任意に４個のコロニーを選びとり、処理後−８０℃で保存した。
【００７５】
選別した各クローンのコロニーについて、目的とするエントリークローンが作製されていることを、コロニーＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅を行うことにより確認した。コロニーＰＣＲは、実施例１と同様に行った。
【００７６】
コロニーＰＣＲにより確認を行った各クローンの４個のコロニーについて、停止コドンの塩基配列についての確認結果を表１７にまとめて示した。２ステップアダプターＰＣＲによる停止コドンの改変を、任意に選別した４個のコロニー中での目的の配列を持つものの数で示した。
【００７７】
【表１７】
表１７の結果によれば、本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるエントリークローンの作製において、同時に選択性良くネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのクローンができていることが分かる。特に、ＤＮＡポリメラーゼとしてTaq HiFiをもちいて、エンハンサー溶液添加の場合には、ネイティブ型及びＣ末端融合型ｃＤＮＡともほぼ１００％の選択率でクローン化されていることが分かる。
【００７９】
【発明の効果】
本発明によるGatewayエントリークローンの作成方法は、多種類の発現クローンを迅速かつ容易に作製することを可能とした技術である。ｃＤＮＡやＰＣＲ ＤＮＡの機能解析、たんぱく質発現等が容易となり、ヒトゲノムｃＤＮＡ等による医薬品開発などの進展に寄与する。
【００８０】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による２ステップアダプターＰＣＲによるｃＤＮＡの増幅の概略を示したものである。
【符号の説明】
ａ：アダプターａ
ｂ：アダプターｂ
ｃ：アダプターｃ
ｄ：アダプターｄ
ＡＴＧ：読み込み開始コドン配列
Ｔｅｒ：停止コドン配列（ＴＧＡ，ＴＡＡ，ＴＡＧを総称）
ＯＲＦ：ｃＤＮＡの翻訳領域
Claims (11)
- ２ステップアダプターＰＣＲにおいて、
鋳型ｃＤＮＡを増幅する第１ステップのＰＣＲを、アダプターａを含む５'末端プライマーＡを用い、アダプターｂを含み、鋳型ｃＤＮＡの停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＴ又はＡＣＴである３'末端プライマーＢ及び停止コドンと同じ位置で異なる塩基配列にハイブリダイズする塩基配列がＡＴＡ又はＡＣＡであるＢ'を混合して行い、
第２ステップのＰＣＲを、第１ステップでのＰＣＲ増幅により、５ ' 末端にアダプターａを含み、３ ' 末端にアダプターｂを含む増幅産物を鋳型として、５’末端にプラスミドへの接続部位となる配列attＢ1を持つアダプターｃを含み且つ前記アダプターａにハイブリダイズすることができる５’末端共通プライマーＣを用い、３'末端のＰＣＲプライマーとしてプラスミドへの接続部位となる配列attＢ2を含み且つ前記アダプターｂにハイブリダイズすることができるアダプターｄを持ち、さらに停止コドンに対する配列を有するネイティブ型共通プライマーＤ、又はさらに前記アダプターｄを持ち前記停止コドンと同じ位置で異なる塩基配列に対する配列を有するＣ末端融合型共通プライマーＤ'を用いてそれぞれ増幅を行い、両末端に異なる接続塩基配列を持つネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡを作製し、得られたｃＤＮＡをattＰプラスミドに組み込み、これをコンピテントセルに導入することを特徴とするGatewayエントリークローンの作製方法。 - 配列表の配列番号４に記載の塩基配列を有する請求項１に記載のＰＣＲプライマーＣ。
- 該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＴＡであり、該プライマーＤは、配列番号７に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号８に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
- 配列表の配列番号７に記載の塩基配列を有する請求項１又は３に記載のＰＣＲプライマーＤ。
- 配列表の配列番号８に記載の塩基配列を有する請求項１又は３に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
- 該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＡであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１０に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
- 配列表の配列番号９に記載の塩基配列を有する請求項１又は６に記載のＰＣＲプライマーＤ。
- 配列表の配列番号１０に記載の塩基配列を有する請求項１又は６に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
- 該プライマーＢは、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＡＣＴであり、該プライマーＢ'は、その停止コドンにハイブリダイズする塩基配列がＣＣTであり、該プライマーＤは、配列番号９に記載の塩基配列であり、該プライマーＤ'は、配列番号１１に記載の塩基配列であることを特徴とする請求項１に記載のGatewayエントリークローンの作製方法。
- 配列表の配列番号１１に記載の塩基配列を有する請求項１又は９に記載のＰＣＲプライマーＤ'。
- 請求項１〜１０のいずれかに記載の該エントリークローンの作製方法により作製されたネイティブ型ｃＤＮＡ及びＣ末端融合型ｃＤＮＡのGatewayエントリークローン。
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