CN117778377A - 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 - Google Patents
基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778377A CN117778377A CN202311725165.0A CN202311725165A CN117778377A CN 117778377 A CN117778377 A CN 117778377A CN 202311725165 A CN202311725165 A CN 202311725165A CN 117778377 A CN117778377 A CN 117778377A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- resistance gene
- argonaute
- fragment
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 62
- 102000008682 Argonaute Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 36
- 108010088141 Argonaute Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 142
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 113
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 15
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 claims description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 13
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 7
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 5
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 5
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 claims description 3
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 claims 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 12
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 14
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 13
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000007702 DNA assembly Methods 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000010448 genetic screening Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102100035102 E3 ubiquitin-protein ligase MYCBP2 Human genes 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091060592 XDNA Proteins 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011449 brick Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 231100000310 mutation rate increase Toxicity 0.000 description 1
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007858 polymerase cycling assembly Methods 0.000 description 1
- 230000001915 proofreading effect Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000003202 restriction enzyme-based method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法，具体为：构建抗性基因重构载体并利用Argonaute对其进行线性化处理，将目标DNA分成多个小片段DNA并合成，再将小片段DNA装载到抗性基因重构载体中，利用SLIC克隆和抗性基因重构实现目标DNA的组装。本发明方法综合了SLIC克隆和抗性基因重构策略，重构一次抗性基因可以组装5‑6个小片段，效率更高效，周期短，而且可以根据DNA的片段长度，灵活选择重构抗性基因的次数，本发明也不会引入由PCR带来的突变，重构后的大片段无需进行二次测序，节省时间和成本。本发明为大片段DNA的合成与组装技术提供了新的思路。
Description
技术领域
本发明属于大片段DNA合成与组装技术领域，具体涉及一种基于新型可编程核酸酶Argonaute(简称Ago)的大片段DNA高效合成与组装方法。
背景技术
DNA合成在基因工程、临床诊断和治疗、法医学等各个领域日益发挥重要的作用。大规模、低成本地合成DNA，将有望快速发展工程生物学、治疗、数据存储和纳米技术等领域。近几年DNA合成技术取得了较大的进步，但在合成通量、成本控制，尤其是大片段DNA的合成等方面仍然面临挑战。大片段DNA的组装仍然依赖于既费时且昂贵的克隆技术。合成生物学的发展目前面临DNA供应的瓶颈，以DNA合成为主的写入技术在合成长度、合成准确率及合成成本等方面均有极大的改进空间。目前小片段DNA的组装与转移技术已经比较成熟，大片段DNA由于其分子量大、易断裂，使得体外操作繁琐且效率低下。因此亟需开发低成本、高效率的DNA合成和大片段DNA组装方法，提高“书写DNA”的能力，进一步拓展DNA的应用范围。
目前DNA组装技术主要包括酶依赖的组装、非酶依赖的组装和依赖于体内同源重组的三种类型组装方法。其中酶依赖的组装包括基于DNA聚合酶的组装，聚合酶循环组装(Polymerase Cycling Assembly,PCA)基于PCR技术，该方法依赖于高保真校对PCR酶，不适合长片段DNA的合成，且随着DNA长度增加，突变率增加，不适用高GC含量和重复序列等特殊DNA序列的合成。基于限制性内切酶的方法还包括Bio-Brick和Golden Gate，但是这两种方法主要的局限是元件序列中不能含有前后缀中的酶切位点序列，且连接处会形成疤痕序列，这种疤痕序列可能会影响生物元件的功能，不能做到无缝组装。基于Cas编程酶的大片段DNA组装方法，由于Cas蛋白在发挥酶切作用时需要PAM序列，因此基于Cas的组装方法都存在疤痕影响，不能做到严格意义的无缝组装；且Cas的向导核酸都是较长的RNA，由于RNA不稳定、价格贵，导致组装的成本高，效率低。
总之，目前DNA的合成尤其是大片段DNA的组装都存在效率低、成本高等问题，且高GC含量、重复序列等特殊DNA的合成目前还没有高效的方法，极大地制约了合成生物学的发展与进步。因此，亟需发展高效、低成本的DNA合成和大片段DNA组装技术，促进合成生物学的发展。
发明内容
针对现有技术中大片段DNA组装存在的问题，本发明提供了一种基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法。
本发明的技术方法具体如下：
一种基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法，包括以下步骤：
S1、构建抗性基因重构载体pNEW(Ampr)质粒，所述pNEW(Ampr)质粒含有填充片段和抗性基因片段，且抗性基因片段之间有m(bp)的同源序列；
S2、利用Argonaute和gDNA切除pNEW(Ampr)质粒中的填充片段，得到3’端突出m(nt)的线性载体；
S3、将目标DNA分成n个500bp左右的小片段DNA，合成小片段DNA并引入m(nt)与线性载体同源互补的序列；
S4、将S2得到的线性载体与S3合成的小片段DNA混合后转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n；
S5、基于Argonaute和抗性基因重构对重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n进行组装。
在本发明方法中，所用核酸酶Argonaute需要将质粒切割为线性载体，但并非所有具有切割双链DNA功能的Argonaute或其突变体均能实现本发明；发明人实验发现，所用核酸酶Argonaute具有在Mg2+条件下可以高效切割双链DNA和质粒DNA的活性，特别是能够切割GC含量≥50(如GC含量高达70％)的双链DNA时，才能较好的实现本发明方法。
优选地，在上述方法中，pNEW(Ampr)质粒中的抗性基因包括但不限于为Kanr、Chlr、Genr和Spcr，而且抗性基因的个数可根据实际组装需求进行设置。
优选地，在上述方法中，pNEW(Ampr)质粒中的填充片段为ccdb致死基因(序列如SEQ ID NO.3所示)；通过引入ccdb致死基因进行反向筛选，背景极低，降低了后期筛选重组菌落的工作量。
在本发明的一个具体实施例中，提供了的pNEW(Ampr)质粒同时含有Kanr、Chlr、Genr和Spcr抗性基因，并以ccdb致死基因作为填充片段，抗性片段5Kana/3Kana、5Chl/3Chl、5Gen/3Gen和5Spc/3Spc之间均有10bp的同源序列。
优选地，在上述方法中，所述核酸酶Argonaute为ApfAgo且其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；更为优选地，编码该ApfAgo的基因序列如SEQ ID NO.2所示，该核酸酶能够在15min内将70％GC含量的双链DNA切割80％-90％。
优选地，在上述方法中，步骤S2具体为：针对同源序列设计16-18nt gDNA并进行5’端磷酸化处理，将5’-P gDNA与Argonaute孵育后再与目标质粒混合反应，待反应结束后用琼脂糖凝胶检测回收备用。
在本发明一个具体实施例中，采用ApfAgo对目标质粒进行线性化处理，其反应条件具体为：先将5’-P gDNA与ApfAgo于70℃孵育5min后，再与目标质粒混合，并于92℃反应10min。
优选地，在上述方法中，步骤S3中合成小片段DNA的方法为：针对小片段DNA设计彼此重叠(overlapping)17-20nt且无缝的寡核苷酸引物组合，其中寡核苷酸引物的长度为50-59nt，且首尾两条寡核苷酸引物的5’端分别引入了m(nt)与线性载体同源互补的序列；将寡核苷酸引物组合与LA Taq Buffer置于反应管中退火合成DNA小片段。
更为优选地，所述退火的程序为：94℃、5min，94℃-37℃slope 20min，37℃、7min。
优选地，在上述方法中，步骤S5具体为：将步骤S4制备的重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n分成x组，每组2～6个重组质粒，取每组首尾两个重组质粒分别用Argonaute酶切处理得到带有目的序列和抗性基因单元的片段，其他中间质粒分别用Argonaute酶切处理得到只有3’端突出m(nt)的目的片段，由于利用的是重构抗性基因进行正向遗传筛选，不怕没有酶切的背景质粒污染，因此酶切产物可以不用回收，直接再取酶切产物混合后转化不含F质粒(F-)的大肠杆菌感受态细胞，筛选得到x个重组子，重复上述步骤直至将所有DNA小片段组装成目标DNA即可。
需要注意的是，步骤S5中筛选重组子的方式除了进行涂布平板外，还可以直接用加有相应抗性基因的抗生素进行溶液培养的方式进行筛选，该方式进一步缩短了周期，降低了成本。
在本发明方法中，从450-500bp的小片段DNA出发，如果一次组装6个片段，重构一次抗性基因，就可以得到3kb长度的片段，能够满足99％以上的基因合成；重构两次就可以组装到18kb，这样就可以满足99％以上的大片段DNA的合成；重构三次就可以到30kb。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)本发明将大片段DNA分成450-500bp的小片段单元进行再合成，小片段单元通过无缝隙的寡核苷酸引物组合直接退火，利用碱基之间的氢键互补配对，再和带粘性末端的载体进行退火，形成带缺刻的环化质粒，转化大肠杆菌，利用大肠杆菌自身的修复系统进行合成；没有引入PCR扩增的步骤，故不会引入由于PCR扩增引入的突变，使得合成的准确率大大提高。
(2)本发明在抗性基因重构载体中引入了ccdb致死基因，利用ccdb致死的原理，转化不含F质粒(F-)的大肠杆菌感受态细胞，可以使没有插入目的片段的背景质粒因为含有ccdb致死基因会使得背景质粒因致死不能生长，大大降低背景，提高转化效率和重组效率，降低筛选重组子的工作量。
(3)本发明组合利用SLIC克隆和抗性基因重构策略组装小片段，通过Argonaute酶切获得小片段DNA单元，不经过PCR操作，直接将酶切后的产物转化大肠杆菌，利用抗性重构基因遗传筛选，不会引入由于PCR扩增造成的突变，故突变率极低，甚至为零，无需进行二次测序，成本低；结合SLIC克隆，一次重构可以组装多个片段，提高效率，缩短合成周期，重构一次一天，也就是从测序正确的450-500bp目的片段质粒出发，可以3天组装至30kb。
(4)本发明的操作体系简单，只用了一个Ago酶进行酶切质粒，酶切产物无需纯化，无需进行连接，可以直接转化大肠杆菌。
(5)本发明利用抗性基因重构的原理，在重构抗性基因的同时，将多个彼此带有同源互补序列的目的片段组装一起。用重构抗性的相应抗生素进行正向遗传筛选，在加入相应抗生素后，只有重构出完整的对应抗性基因，才能生长起来，而一些没有酶切的质粒或者重构错误的产物由于不能得到完整的抗性基因，不能在加有抗生素的培养基中生长，准确率高，操作简单。
(6)可以合成特殊的DNA序列，如高度重复序列，Poly A等Poly序列，可以合成研究一些复杂结构或一些调控DNA序列，由于该方法是从质粒出发，片段通过酶切获得，不需要进行PCR，可以合成PCR方法不能合成的高度重复序列。
(7)由于利用抗生素抗性基因进行正向筛选，不怕背景质粒的干扰，重构后的重组质粒转化子可以不用涂平板操作，直接用重构后对应的抗性基因的抗生素液体培养基进行培养，即筛选操作简单，可以实现溶液操作，从而有利于实现自动化操作，进一步缩短了周期。
(8)有利于构建突变体文库，对于做定点诱变和定向进化效率非常高，筛选工作量比现有的构建突变体库的方法可以降低至2-3个数量级。
附图说明
图1为本发明实施例所用核酸编程酶Argonaute(APfAgo)的SDS-PAGE鉴定分析结果图。
图2为本发明实施例制备的抗性基因重构载体pNEW(Ampr)质粒的结构示意图。
图3为本发明实施例中pNEW(Ampr)质粒在ApfAgo不同切割时间下所得产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，OC为开环质粒(质粒一条链断开)，LIN为线性化质粒(质粒双链断开)，SC为超螺旋质粒，红色箭头表示酶切产物。
图4为本发明实施例所用APfAgo切割不同GC含量的双链DNA所得产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果图，product bands表示切割产物。
图5为本发明实施例中引入小片段DNA片段后形成的重组质粒的结构示意图。
图6为本发明实施例5中第一轮重构质粒1-16个质粒酶切琼脂糖凝胶电泳检测结果图。
图7为本发明实施例5中第一轮重构Kanr抗性后的重组质粒接头处测序结果峰形图。
图8为本发明实施例中基于Argonaute、SLIC和抗性基因重构策略组装大片段DNA的流程图(一次组装重构2个质粒)。
图9为本发明实施例中基于Argonaute、SLIC和抗性基因重构策略组装大片段DNA(一次组装重构6个质粒)的第一步示意图(第一次SLIC和重构Kan抗性基因)。
图10为本发明实施例中基于Argonaute、SLIC和抗性基因重构策略组装大片段DNA(一次组装重构6个质粒)的第二步示意图(第二次SLIC和重构Chl抗性基因)。
图11为本发明实施例中基于Argonaute、SLIC和抗性基因重构策略组装大片段DNA(一次组装重构6个质粒)的第三步示意图(第三次重构Gen抗性基因)。
具体实施方式
下面将结合实施例和附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本申请的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书和权利要求书中的术语“包括”和“具有”以及它们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。
为了解决现有大片段DNA组装技术中存在的效率低，成本高，高GC含量、重复序列等特殊DNA难合成等问题，本发明提供了一种基于可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA合成与组装方法。
本发明方法主要包括以下步骤：
(1)用于组装DNA片段的抗性基因重构载体的制备。
本发明所述抗性基因重构载体中含有填充片段和抗性基因片段，抗性基因片段之间均设有用于做SLIC克隆的同源序列。
在本发明一实施例中，选择质粒pET-23a载体作为起始载体进行改造，分别用Kanr抗性、Chlr抗性、Genr抗性和Spcr抗性质粒做模板扩增Kanr、Chlr、Genr和Spcr抗性基因，最终构建成pNEW(Ampr)质粒；该质粒以ccdb致死基因作为填充片段，且同源序列长度为10bp。
(2)线性载体的制备。
将测序正确的抗性基因重构载体用Ago酶切，通过设计合适的向导DNA，将填充片段(ccdb致死基因)切掉，并使得切出来的线性载体在其3’端各突出10nt，酶切产物进行凝胶回收后-20℃保存备用。
(3)小片段DNA的合成。
选择目标DNA，将其划分小片段DNA单元，再分别合成每个小片段DNA。
以450-500bp的小片段DNA为例，分别设计彼此重叠(overlapping)17-20nt且无缝的寡核苷酸引物组合，每个450-500bp的片段需要合成16条长度为50-59nt的寡核苷酸引物，且首尾两条引物的5’端分别引入与线性载体同源互补的序列；再分别将合成好的16条寡核苷酸序列稀释成终浓度10M，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2μL的10×Buffer(500mM KAc,200mM Tris-Ac,100mM MgAc,1mg/mL BSA)，最后加双蒸水至终体积20μL混匀；分别让其按照94℃、5min，94℃-37℃slope 20min，37℃、7min的逐步降温的程序退火。
(4)SLIC克隆制备重组质粒。
将准备好的线性载体与退火形成的小片段DNA混合后，直接转化不带F因子的大肠杆菌感受态细胞(如DH5a)，涂布氨苄抗性平板，筛选重组子，并将测序正确重组质粒分别命名为pNEW(Ampr)1,2,3.......。
(5)利用SLIC克隆和抗性基因重构策略组装大片段。
在重构抗性基因的同时，通过SLIC克隆将多个彼此带有同源互补序列的目的片段组装在一起。
以合成的DNA片段为30kb为例，先将其分成60个500bp左右的片段，参照上述步骤，利用pNEW(Ampr)质粒制得60个重组质粒。将60个重组质粒分成10组，每组6个质粒，进行第一次重构。具体为：每组含有首尾片段的重组质粒分别用Ago酶切，切出带有目的序列和抗性基因单元的片段，每组含中间片段的质粒则分别用Ago酶切出只有3’端突出同源序列的目的片段，再各取酶切产物混合后直接转化大肠杆菌，涂布Kanr抗性平板，筛选即可得到10个新的重组质粒(即每组1个)，每个重组质粒的目的DNA片段大小为3kb左右。
将第一次重构得到的10个重组质粒分成2组，每组5个质粒，参考第一次重构过程进行第二次重构Chlr抗性基因，即可得到2个新的重组质粒，且每个重组质粒的目的DNA片段大小为15kb左右。再将第二次重构得到的2个质粒两两酶切，进行第三次重构Genr抗性基因，得到1个质粒，且该质粒含有30kb的目标DNA片段。
本发明方法从质粒出发，不经过PCR，不会引入由于PCR引进的突变，组装后的大片段无需二次测序，成本低。而且，本发明方法通过重构抗生素抗性基因进行正向遗传筛选，同时利用重构抗性后的重组子抗性与起始质粒抗性的不同，转化出来的即为重组子，可以实现溶液操作，简化操作步骤、降低成本，更易于实现自动化操作。另外，酶切体系只有一种Ago酶，体系简单，通过利用重组子与背景质粒不同的抗性进行筛选，不怕背景质粒的干扰，酶切的片段无需回收纯化，无需进行酶连操作，直接转化，无需PCR仪等特殊的贵重仪器，操作简单。
在本发明方法中，核酸酶Argonaute或突变体只要能满足以下条件即可实现本发明：
具有在Mg2+条件下可以高效切割双链DNA和质粒DNA的活性，且能够切割高GC含量(如GC含量达70％)的双链DNA。
相较于Cas编程酶，Argonaute核酸酶酶切DNA时无需PAM识别序列，且酶切不受任何序列的限制，只需要利用一条16-18nt的DNA向导，可以对任意位点进行酶切，有利于实现无缝装配，无需回避任何酶切位点，具有实验设计简单、操作简单的优势。
下面列举了一些具体实施例，需说明的是，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或按照产品说明书进行；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
以合成的DNA片段为30kb为例，本例通过以下步骤实现了大片段DNA的合成与组装：
(1)Argonaute的表达与纯化。
本例所用的可编程核酸酶Argonaute为PfAgo突变体(简称APfAgo)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其制备方式具体为：
将APfAgo基因序列(如SEQ ID NO.2所示)连接至pET28a上得到pET28a-APfAgo质粒，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)，单菌落接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD600达到0.8时，移至18℃摇床，IPTG诱导过夜。6000rpm离心10min收集菌体，用Buffer A(20mM HEPES缓冲液pH 7.5,250mM NaCl,1mMDTT)洗菌后，将菌体重悬于Buffer A，添加终浓度1mM的PMSF，高压破碎，18000rpm离心30min，收集上清。
上清过滤后，进行Ni-NTA纯化。20mM和50mM咪唑各洗10个柱体积(分3次加入)，100mM、200mM、300mM各洗3个柱体积，取样进行SDS-PAGE检测。收集含有高纯度目的蛋白的洗脱组分，超滤换液至Buffer A。用20mM HEPES(pH 7.5)将NaCl浓度稀释至125mM后，进行肝素柱(HiTrap Heparin HP,GE Healthcare)纯化。肝素柱预先用Buffer B(20mM HEPESpH7.5,125mM NaCl)平衡，通过升高NaCl的浓度洗脱APfAgo。收集纯化的蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定纯度并进行活性验证后，将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在-80℃。
纯化后的目的蛋白用Millipore 50-kDa超滤管于4℃、4000rpm浓缩，换液去除咪唑。酶浓度通过BCA试剂盒进行定量测定，测定步骤按照操作说明进行，以BSA作为标准品，配制标准溶液，绘制标准曲线，从而计算出纯化的APfAgo的蛋白浓度。
SDS-PAGE鉴定分析结果如图1所示，通过http://www.expasy.org/计算，APfAgo的预期大小为87kDa。
(2)抗性基因重构载体的制备。
本例选择质粒pET-23a载体作为起始载体进行改造，构建了抗性基因重构载体pNEW(Ampr)质粒，具体操作如下：
以4种抗性的质粒pET-28a、pASK-IBA7C、pDONR223、pMP2463为模板，分别进行PCR扩增Kanr、Chlr、Genr和Spcr抗性基因，在此基础上通过几轮重叠延伸PCR，将所有片段最终融合成四条目的片段，并通过胶回收获得纯净的目的片段。将四个片段按照摩尔数比1:1:1:1的量进行T5核酸外切酶介导的克隆，经菌落PCR初步筛选出阳性克隆送生物公司测序，提取测序正确菌落的质粒，命名为pNEW(Ampr)，储存在-20℃备用。
在pNEW(Ampr)质粒中，每个抗性片段之间5Kana/3Kana、5Chl/3Chl、5Gen/3Gen和5Spc/3Spc预留有10bp的同源序列，用于后续gDNA设计。
图1为本例所得pNEW(Ampr)的结构示意图，其中ccdb致死基因作为填充片段，用于后续小片段DNA的克隆。
(3)ApfAgo对pNEW(Ampr)质粒的切割活性验证及线性化处理。
由于APfAgo通过向导DNA(gDNA)靶向切割ssDNA，本例设计了两对16nt gDNA来切割双链DNA(即pNEW(Ampr)质粒)，并对gDNA进行5’端磷酸化处理。
切割及检测过程具体为：首先将5’-PgDNA分别与APfAgo蛋白质于70℃孵育5min后再和目标质粒混合，92℃分别反应1min、3min和5min，向其中加入2μL 6×DNA loading，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。其中，该过程所用孵育体系和反应体系分别如表1和表2所示。
检测结果如图3所示：APfAgo可以利用一对5’P-gDNA，分别靶向质粒的一条链，剪切超螺旋状态的质粒，生成线性化质粒DNA；而且随着切割时间的增加，产物中线性化质粒含量增加。
表1gDNA与ApfAgo的孵育体系
表2APfAgo酶切质粒的反应体系
参照上述酶切条件，采用APfAgo对pNEW(Ampr)质粒酶切10min，得到3’端突出10nt的线性载体骨架，经琼脂糖凝胶检测回收后-20℃保存备用。
(4)ApfAgo对不同GC含量区域切割活性
为了探究APfAgo切割质粒高GC含量区域的活性，针对pNEW(Ampr)质粒设计了不同GC含量(50％，60％和70％)的三组gDNA。首先通过PCR扩增目标条带，对扩增出的线性双链DNA(dsDNA)进行切割实验，切割产物用1.0％的琼脂糖凝胶检测酶切结果，实验结果证明APfAgo可以在高达70％GC含量的区域进行切割，而野生型的PfAgo对50％及以上GC含量的双链DNA没有切割活性，如图4所示。
(5)小片段pNEW(Ampr)质粒的合成。
将目标DNA划分为n个500bp的小片段，并通过以下过程合成小片段DNA：分别设计彼此重叠17-20nt且无缝的寡核苷酸引物序列对，每个500bp的片段需要合成16条长度为50-59nt左右的寡核苷酸引物，且首尾两条引物的5’端分别引入10nt与线性载体同源互补的序列；再分别将合成好的16条寡核苷酸序列稀释成终浓度10M，然后分别取0.5μL至一PCR管内，加2μL的10×Buffer(500mMKAc,200mMTris-Ac,100mMMgAc,1mg/mLBSA)最后加双蒸水至终体积20μL混合；分别让其按照94℃、5min，94℃-37℃slope 20min，37℃、7min的逐步降温的程序退火，得到小片段DNA。
将步骤(3)准备好的pNEW(Ampr)线性载体与退火形成的小片段DNA混合，37℃放置30min后转化不带F因子的大肠杆菌DH5a感受态细胞，涂布氨苄抗性平板，由于背景质粒带有ccdb致死基因，因此长出来的均为重组子，将测序正确重组质粒分别命名为pNEW(Ampr)1,2,3.......n。所得重组质粒的结构如图5所示。
(6)大片段DNA的组装。
本发明利用抗性基因重构策略组装时，每次可重构2-6个质粒，下面示例说明具体操作：
1、目标DNA按照步骤(5)制备得到16个重组质粒，将其分为8组，每组两个质粒。
首先进行Kanr抗性重构，并行将8组的重组质粒pNEW(Ampr)分别选用相应的gDNA对16个质粒进行分别切割10min(条件同步骤(3))，获得的酶切产物通过0.7％琼脂糖凝胶检测，如图6所示。各取2μL的酶切产物混合后直接转化大肠杆菌，直接用加有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基进行培养，抽提质粒，进一步将这些质粒送经公司测序，测序结果(图7)表明切割位置均无碱基的增加或减少，连接处无疤痕产生。将第一步重构的8个pNEW(Kanr)质粒分成4组，每组两个质粒，进行Chlr抗性重构，得到4个质粒pNEW(Chlr)。再将4个质粒分成2组，每组两个质粒，进行Genr抗性重构，得到两个质粒pNEW(Genr)。最后将两个质粒pNEW(Genr)进行Sper抗性重构得到包含目标片段DNA的质粒pNEW(Sper)，即完成DNA的组装，组装流程如图8。
2、目标DNA按照步骤(5)制备得到60个质粒，将质粒分成10组，每组6个质粒。每组含有首尾片段的重组质粒pNEW(Ampr)分别用APfAgo酶切10min(条件同步骤(3))，切出带有目的序列和抗性基因单元的片段，中间片段的质粒分别用核酸酶Ago酶切10min(条件同步骤(3))切出只有3’端突出10nt的目的片段，再各取2μL的酶切产物混合后直接转化大肠杆菌，直接用加有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基进行培养，即得到10个重组质粒pNEW(Kanr)，每个重组质粒的目的DNA片段大小为3kb左右。将第一步重构的10个pNEW(Kanr)质粒分成2组，每组5个质粒，每5个质粒一组重构氯霉素抗性基因和SLIC克隆，得到2个质粒pNEW(Chlr)，每个重组质粒的目的DNA片段大小为15kb左右。再将2个质粒pNEW(Chlr)两两酶切，重构庆大霉素抗性基因得到1个质粒pNEW(Genr)，得到30kb的目标DNA片段，其组装流程如图9-11。
由于起始质粒是经过测序验证正确的质粒，本发明从测序正确的质粒出发通过重构质粒进行组装大片段，整个过程没有进行PCR，只进行了酶切，不会引入由PCR带来的突变，所以通过抗性基因这种正向遗传因素筛选的重组子就是正确的，即重构后的大片段无需进行二次测序，节省了时间和成本。
综上所述，本发明将需要组装的大片段DNA分成若干450bp-500bp的小片段DNA，再将小片段DNA装载到抗性基因重构载体pNEW(Ampr)质粒中，相邻的小片段之间首尾有10bp用于做SLIC克隆的同源序列。再利用SLIC克隆和重构抗性基因就可以实现大DNA片段的组装，具体可以根据目标DNA的片段长度，确定重构抗性基因的次数。而且，本发明利用对质粒DNA有高酶切活性的Argonaute，对目标质粒进行线性化处理，切割后的目的片段混合后，其具有同源臂的粘性末端可以相互退火形成含有缺刻的环状DNA分子，然后利用大肠杆菌的体内修复机制修补缺刻，从而获得重组质粒，使得本发明方法操作简单、高效。
本发明开发的高效、低成本的大片段DNA组装技术可以为合成生物学底层生物技术工具包的开发提供强有力的补充，为市场上大片段DNA的合成和组装技术开发提供新的思路，具有很强的应用价值。
以上所述是本发明的具体实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建抗生素抗性基因重构载体pNEW(Ampr)质粒，所述pNEW(Ampr)质粒含有填充片段和抗性基因片段，且抗性基因片段之间有m(bp)的同源序列；
S2、利用Argonaute和gDNA切除pNEW(Ampr)质粒中的填充片段，得到3’端突出m(nt)的线性载体；
S3、将目标DNA分成n个450-500bp的小片段DNA，合成小片段DNA并引入m(nt)与线性载体同源互补的序列；
S4、将S2得到的线性载体与S3合成的小片段DNA混合后转化大肠杆菌感受态细胞，得到重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n；
S5、基于Argonaute和抗性基因重构对重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n进行组装。
2.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，在pNEW(Ampr)质粒中，所述抗性基因为Kanr、Chlr、Genr和Spcr中的一个或多个。
3.根据权利要求2所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，在pNEW(Ampr)质粒中，所述抗性基因有Kanr、Chlr、Genr和Spcr，且抗性片段5Kana/3Kana、5Chl/3Chl、5Gen/3Gen和5Spc/3Spc之间均有10(bp)的同源序列。
4.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，所述填充片段为ccdb致死基因。
5.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，所述Argonaute能够在Mg2+条件下有效切割双链线性DNA和质粒DNA，且所述Argonaute能够切割GC含量≥50％的双链DNA。
6.根据权利要求5所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，所述Argonaute的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
7.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，步骤S2具体为：针对同源序列设计16-18nt gDNA并进行5’端磷酸化处理，将5’-P gDNA与Argonaute孵育后再与目标质粒混合反应，待反应结束后用琼脂糖凝胶检测回收备用。
8.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，步骤S3中合成小片段DNA的方法为：针对小片段DNA设计彼此重叠17-20nt且无缝的寡核苷酸引物组合，其中寡核苷酸引物的长度为50-59nt，且首尾两条寡核苷酸引物的5’端分别引入了m(nt)与线性载体同源互补的序列；将寡核苷酸引物组合与Buffer置于反应管中退火合成DNA小片段。
9.根据权利要求8所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，所述退火的程序为：94℃、5min，94℃-37℃slope 20min，37℃、7min。
10.根据权利要求1所述的大片段DNA高效合成与组装方法，其特征在于，步骤S5具体为：将步骤S4制备的重组质粒pNEW(Ampr)1,2,3,……,n分成x组，每组2～6个重组质粒，取每组首尾两个重组质粒分别用Argonaute酶切处理得到带有目的序列和抗性基因单元的片段，其他中间质粒分别用Argonaute酶切处理得到只有3’端突出m(nt)的目的片段，直接取酶切产物混合后转化大肠杆菌，筛选得到x个新的重组质粒；重复上述步骤直至将所有小片段DNA组装成目标DNA即可。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311725165.0A CN117778377A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311725165.0A CN117778377A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778377A true CN117778377A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90386498
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311725165.0A Pending CN117778377A (zh) | 2023-12-14 | 2023-12-14 | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778377A (zh) |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103725674A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 湖北大学 | 一种在大肠杆菌中一步法合成dna片段并组装合成基因的方法 |
| CN103952396A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-07-30 | 湖北大学 | 一种基于质粒库的无引物基因合成方法 |
| CN104109683A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-10-22 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种无引物的基因合成方法 |
| CN105483118A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-04-13 | 浙江大学 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
| US20170367280A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-12-28 | Kws Saat Se | Use of argonaute endonucleases for eukaryotic genome engineering |
| CN107805634A (zh) * | 2016-09-07 | 2018-03-16 | 北京大学 | 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物 |
| CN108118059A (zh) * | 2017-12-30 | 2018-06-05 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的载体和应用 |
| CN109825520A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-05-31 | 湖北大学 | 一种利用改进的CRISPR-Cpf1进行基因装配的新方法 |
| CN110229799A (zh) * | 2018-03-06 | 2019-09-13 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | Argonaute蛋白突变体及其用途 |
| US20190284547A1 (en) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | Purdue Research Foundation | Ngago-based gene-editing method and the uses thereof |
| CN112481309A (zh) * | 2019-09-12 | 2021-03-12 | 石家庄埃佤基因科技有限公司 | Ago蛋白的用途及组合物和基因编辑方法 |
| CN112941107A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用 |
| CN116606839A (zh) * | 2023-05-09 | 2023-08-18 | 湖北大学 | 基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割体系及其应用 |
-
2023
- 2023-12-14 CN CN202311725165.0A patent/CN117778377A/zh active Pending
Patent Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103725674A (zh) * | 2013-12-31 | 2014-04-16 | 湖北大学 | 一种在大肠杆菌中一步法合成dna片段并组装合成基因的方法 |
| CN103952396A (zh) * | 2014-03-06 | 2014-07-30 | 湖北大学 | 一种基于质粒库的无引物基因合成方法 |
| CN104109683A (zh) * | 2014-05-19 | 2014-10-22 | 武汉金开瑞生物工程有限公司 | 一种无引物的基因合成方法 |
| CN105483118A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-04-13 | 浙江大学 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
| US20170367280A1 (en) * | 2016-05-27 | 2017-12-28 | Kws Saat Se | Use of argonaute endonucleases for eukaryotic genome engineering |
| CN107805634A (zh) * | 2016-09-07 | 2018-03-16 | 北京大学 | 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物 |
| CN108118059A (zh) * | 2017-12-30 | 2018-06-05 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 一种改进的启动子及其组成的载体和应用 |
| CN110229799A (zh) * | 2018-03-06 | 2019-09-13 | 北京贝瑞和康生物技术有限公司 | Argonaute蛋白突变体及其用途 |
| US20190284547A1 (en) * | 2018-03-16 | 2019-09-19 | Purdue Research Foundation | Ngago-based gene-editing method and the uses thereof |
| CN109825520A (zh) * | 2019-01-08 | 2019-05-31 | 湖北大学 | 一种利用改进的CRISPR-Cpf1进行基因装配的新方法 |
| CN112481309A (zh) * | 2019-09-12 | 2021-03-12 | 石家庄埃佤基因科技有限公司 | Ago蛋白的用途及组合物和基因编辑方法 |
| CN112941107A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-06-11 | 西北农林科技大学 | 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用 |
| CN116606839A (zh) * | 2023-05-09 | 2023-08-18 | 湖北大学 | 基于Argonaute蛋白TcAgo的核酸切割体系及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BEHNAM ENGHIAD等: "PlasmidMaker is a versatile, automated, and high throughput end-to-end platform for plasmid construction", 《NATURE COMMUNICATIONS》, vol. 13, 16 May 2022 (2022-05-16), pages 2697 * |
| XINGCHEN XIONG等: "Applications of Programmable Endonucleases in Sequence- and Ligation-Independent Seamless DNA Assembly", 《BIOMOLECULES》, vol. 13, 21 June 2023 (2023-06-21), pages 1022 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20190241921A1 (en) | Methods for in vitro joining and combinatorial assembly of nucleic acid molecules | |
| Ostermeier et al. | A combinatorial approach to hybrid enzymes independent of DNA homology | |
| US20070269870A1 (en) | Methods for assembly of high fidelity synthetic polynucleotides | |
| EP1733055A2 (en) | Polynucleotide synthesis | |
| US20060014169A1 (en) | Methods for obtaining directionally truncated polypeptides | |
| EP1817413A1 (en) | Ladder assembly and system for generating diversity | |
| US11946039B2 (en) | Class II, type II CRISPR systems | |
| CN111819188A (zh) | 融合单链DNA聚合酶Bst、编码融合DNA聚合酶NeqSSB-Bst的核酸分子、其制备方法和用途 | |
| CN111073871B (zh) | 热稳定性提高的dna聚合酶突变体及其构建方法和应用 | |
| CN109385417A (zh) | 体内dna无缝组装方法 | |
| CA2944638A1 (en) | Pcr-based method for generating multisite saturation mutagenic dna librairies | |
| CN109868271B (zh) | 利用芯片合成寡核苷酸文库进行dna洗牌文库从头合成的方法 | |
| CN114990080B (zh) | 一种赖氨酸突变的热稳定核酸连接酶 | |
| CN117778377A (zh) | 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法 | |
| AU2022343270A1 (en) | Systems and methods for transposing cargo nucleotide sequences | |
| EP4083204A1 (en) | Gene wide randomization | |
| CN117187210B (zh) | 一种突变型Bst DNA聚合酶大片段及其制备方法 | |
| CN112680431B (zh) | 基于片段化酶的dna文库制备方法 | |
| US20060199185A1 (en) | Plasmid having a function of t-vector and expression vector, and expression of the target gene using the same | |
| Jansen et al. | A robust life-or-death selection platform for enzyme evolution | |
| JP4116615B2 (ja) | 環状突然変異および／またはキメラポリヌクレオチドを得る方法 | |
| CN117487830A (zh) | 一种用于多片段快速高效组装构建质粒的方法 | |
| US20090305359A1 (en) | Method for producing circular duplex polynucleotides from linear duplex polynucleotides and applications thereof | |
| CN117701525A (zh) | 一种制备线性共价闭合dna微载体的酶切体系及其应用 | |
| KR100482530B1 (ko) | 부위특이적 변이 도입방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |