CN107805634A - 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物 - Google Patents

用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物 Download PDF

Info

Publication number
CN107805634A
CN107805634A CN201610808052.0A CN201610808052A CN107805634A CN 107805634 A CN107805634 A CN 107805634A CN 201610808052 A CN201610808052 A CN 201610808052A CN 107805634 A CN107805634 A CN 107805634A
Authority
CN
China
Prior art keywords
argonaute
nucleic acid
albumen
composition
polynucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610808052.0A
Other languages
English (en)
Inventor
席建忠
叶延桢
王博伦
骆宇峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Peking University
Original Assignee
Peking University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Peking University filed Critical Peking University
Priority to CN201610808052.0A priority Critical patent/CN107805634A/zh
Publication of CN107805634A publication Critical patent/CN107805634A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/916—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1), e.g. phosphatases (3.1.3), phospholipases C or phospholipases D (3.1.4)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物。具体而言，本发明涉及能在核酸链帮助下切割靶核苷酸序列的Argonaute、Argonaute‑核酸序列组分组合物、Argonaute‑核酸序列组分序列操纵系统，及利用所述Argonaute、Argonaute‑核酸序列组分组合物和Argonaute‑核酸序列组分序列操纵系统操纵序列的方法。本发明的Argonaute可以在常温下在核酸链帮助下切割靶核苷酸序列，切割效率不低于20％，最佳盐浓度在100‑200毫摩尔/升。

Description

用于序列操纵的Argonaute-核酸序列组分系统、方法以及组 合物
技术领域
本发明涉及用于序列操纵的Argonaute-核酸序列组分系统、方法以及组合物。具体而言，本发明涉及能在核酸链帮助下切割靶核苷酸序列的Argonaute、Argonaute-核酸序列组分组合物、Argonaute-核酸序列组分序列操纵系统，及利用所述Argonaute、Argonaute-核酸序列组分组合物和Argonaute-核酸序列组分序列操纵系统操纵序列的方法。
背景技术
Argonaute家族蛋白(Ago)广泛存在于动植物、细菌和古生菌中。动植物细胞中的Argonaute(eAgo)蛋白通过单链RNA介导的RNAi的机制调控细胞内mRNA的降解和翻译，以达到基因表达调控的目的。近些年的研究表明，细菌和古生菌中的Argonaute蛋白承担着相似于eAgo的功能：它们通过DNA或者RNA介导来抵御外来核酸的入侵。至今已有多个细菌或者古生菌已报道具有核酸酶活性，能够切割DNA。在细菌中，已有AaAgo(Yuan Y.R.,Pei Y.,MaJ.B.,Kuryavyi V.,Zhadina M.,Meister G.,Chen H.Y.,Dauter Z.,Tuschl T.,PatelD.J.Crystal structure of Aaeolicus Argonaute,a site-specific DNA-guidedendoribonuclease,provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage.Mol.Cell2005；19:405-419.)、RsAgo(Olovnikov,I.,Chan,K.,Sachidanandam,R.,Newman,D.K.andAravin,A.A.Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreignDNA.Mol.Cell,2013 51,594–605.)和TtAgo(Swarts D.C.,Jore M.M.,Westra E.R.,ZhuY.,Janssen J.H.,Snijders A.P.,Wang Y.,Patel D.J.,Berenguer J.,Brouns S.J.,etal.DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute.Nature2014；507:258-261.)蛋白有核酸酶活性；在古生菌中，已有MjAgo(Zander A.,Holzmeister P.,Klose D.,Tinnefeld P.,Grohmann D.Single-molecule FRET supports the two-state model ofArgonaute action.RNA Biol.2014；11:45-56.)和PfAgo(Swarts D.C.,Hegge J.W.,Hinojo I.,Shiimori M.,Ellis M.A.,Dumrongkulraksa J.,Terns R.M.,Terns M.P.,andOost J,Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNA-guided nucleasethat targets cognate DNA.Nucleic Acids Res.2015 43(10):5120-9.)。
最近发现的两个有活性的Argonaute蛋白：TtAgo和PfAgo，都是来源于高温生长环境下的微生物。详尽的生化实验表明TtAgo和PfAgo都需要长度约20nt的5’端磷酸化的单链DNA来介导切割靶点单链DNA。当用两条完全互补的5’端磷酸化的单链DNA介导，则可以使带有对应靶点的质粒线性化。但是酶切反应所需的温度都在75℃，明显高于大多数生物的生存温度。需要进行高温酶切也极大限制了这两个酶在动植物细胞中进行基因编辑的应用。因此，寻找一个能在常温下发挥作用的Argonaute蛋白，对于应用于动植物细胞的基因编辑显得尤为重要。
与强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)类似，同属于古生菌的Halogeometricumborinquense也拥有Argonaute蛋白。波多黎各盐几何形菌(Halogeometricumborinquense，H.borinquense)属于盐杆菌纲(halobacteria)，是一种在极端生活环境(高盐)下生存的古菌。最早发现于波多黎各的卡沃罗霍(Cabo Rojo,Puerto Rico)。该纲下的诸多菌株，都需要不低于1.5M的NaCl浓度进行生长。37℃是它们合适的生长温度。该菌株基因组包含一个大的环状染色体和5个质粒。基因组的GC含量高达60％。Argonaute基因位于染色体上。
H.borinquense的Argonaute蛋白(简称HbAgo)全长895个氨基酸。HbAgo分别与TtAgo和PfAgo有29.8％和32.3％的同源性。3者由相似的四个结构域组成：N端结构域、PAZ结构域、MID结构域和PIWI结构域。其中，核心的PIWI结构域属于Ribonuclease H-like结构域，是蛋白的核酸结合及核酸酶活性区域。PIWI结构域包含核酸酶催化活性氨基酸DDX(D是指天冬氨酸，X可以是天冬氨酸、谷氨酸或组氨酸)。DDX会与合适的2价金属离子结合。用blastp分析三个蛋白质催化活性氨基酸位点的保守性(如图1所示)，三个催化氨基酸位点都是保守的天冬氨酸。突变两个或三个位点，会使TtAgo和PfAgo的核酸酶活性丧失。在真核生物细胞的RISC复合体中，Ago蛋白的PAZ结构域是介导的单链RNA 3’端最后两个碱基的结合锚。TtAgo与单链DNA核酸链的解析复合体结构中也表明其PAZ结构域有相似功能，同样包裹着核酸链的3’端。而当核酸链与靶点DNA链相配对后，核酸链3’末端会从PAZ结构域的“口袋中”释放出来。MID结构域则锚合着核酸链的5’磷酸根基团。然而，截至目前，并未有对HbAgo的生物学功能的相关报道。
本领域仍然存在对能在常温下发挥作用以应用于动植物细胞等细胞的基因编辑的Argonaute蛋白的迫切需求。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种Argonaute蛋白与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
本发明的第二方面涉及一种Argonaute蛋白编码多核苷酸序列与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中多核苷酸序列是DNA序列或mRNA序列，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。
本发明的第三方面涉及一种Argonaute蛋白表达载体与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中编码HbAgo蛋白的多核苷酸序列有效连接到表达载体中并能在目标细胞中表达，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。
在一些实施方案中，表达载体为原核表达载体或真核表达载体，优选地，表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体，更优选地，表达载体为动物细胞表达载体，更优选地，表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
在一些实施方案中，核酸链是单链或双链核酸链，优选地，核酸链选自单链DNA(ssDNA)，单链RNA(ssRNA)，完全配对或不完全配对的双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)或DNA/RNA杂合链。
在一些实施方案中，核酸链的长度为15-30个核苷酸或脱氧核苷酸，优选地，核酸链的长度为22-26个核苷酸或脱氧核苷酸，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或脱氧核苷酸。
在一些实施方案中，核酸链的核碱基、核糖和/或磷氧键被化学修饰，优选地，核碱基的修饰包括杂环修饰、5一甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤，核糖的修饰包括己糖、2’-O-甲基取代核糖、环戊烷、alpha构象核糖，锁核酸(Locked nucleic acid)，磷氧键的修饰包括硫代寡核苷酸和甲基代寡核苷酸、phosphoramidates、SS-ODN和磷酸三酯、硼烷代寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述组合物处于纳米粒子、外泌体和/或微囊泡中。
在一些实施方案中，所述组合物用注射器或基因枪进行递送。
在一些实施方案中，Argonaute蛋白对应的NCBI基因序列号选自：AFZ73749.1、WP_012265209.1、WP_006111085.1、WP_006090832.1、WP_006183335.1、WP_002747795.1、WP_012265209.1、WP_011378069.1、WP_006054116.1、WP_058572808.1、WP_006111085.1、WP_049969002.1、WP_049934199.1和GenBanK：ELZ29017.1，优选地，Argonaute蛋白是HbAgo，其是指波多黎各盐几何形菌Halogeometricum borinquense的Argonaute蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些实施方案中，编码Argonaute蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一些实施方案中，Argonaute蛋白或多核苷酸序列与核酸链的摩尔比为20:1到1:107之间。
本发明的第四方面涉及一种Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒，其包含上述方面所述的组合物及在施用时所需的其它组分，优选地，所述其它组分包括NaCl、缓冲液、甘油、DTT、BSA和Mg2+，优选地，NaCl浓度为10-500mM，优选地，50-400mM，更优选地，100-300mM，更优选地，150-250mM，和/或，优选地，缓冲液为pH 6.5-8.5的2-100mM的Tris-HCl缓冲液，更优选地，缓冲液为pH 7.5-8.2的5-20mM的Tris-HCl缓冲液，和/或，优选地，甘油的浓度为0.1-1％(v/v)，更优选地，0.2-0.6％(v/v)，和/或，优选地，DTT的浓度为0.5-4mM，更优选地，1-3mM，和/或，优选地，BSA的浓度为5-100μg/mL，更优选地，10-40μg/mL，更优选地，15-25μg/mL，和/或，优选地，Mg2+的浓度为0.001-100mM，更优选地，0.01-10mM，更优选地，0.1-2mM，更优选地，0.2-1mM。在一些实施方案中，所述缓冲液还可以是磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液等本领域常用的缓冲液。
本发明的第五方面涉及一种操纵基因组座位中靶序列来进行基因编辑的方法，其包括应用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体上述方面所限定。
本发明的第六方面涉及一种通过借助于向含有和表达编码基因产物的双链DNA分子的细胞中引入Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒使脱靶修饰最小化而修饰感兴趣的基因组座位的方法，其包括应用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中核酸链靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Argonautes蛋白使编码该基因产物的DNA分子产生单链或者双链切口，由此改变该基因产物的表达，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如上述方面所限定。
在一些实施方案中，所述步骤在10-50℃下进行，优选地，20-40℃，更优选，25-37℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃或44℃。
在一些实施方案中，所述步骤进行1分钟-48小时，优选地，进行2分钟-24小时，更优选地，进行3分钟-16小时，更优选地，进行4-10小时，例如，进行1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时，或更久。
在一些实施方案中，所述步骤在体内、离体或体外进行。
在一些实施方案中，Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒应用于细胞中，优选地，所述细胞选自原核细胞或真核细胞，优选地，所述细胞选自细菌、蓝细菌、放线菌、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、植物细胞或动物细胞，更优选地，细胞选自动物细胞，更优选地，细胞选自昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞，更优选地，细胞选自啮齿类动物细胞或灵长类动物细胞，更优选地，细胞选自人类细胞。
在一些实施方案中，所述组合物中Argonaute的浓度为0.1μM到500μM，优选地，0.2μM到200μM，优选地，0.3μM到100μM，更优选地，0.4μM到50μM，例如0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、3.5μM、4μM、4.5μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM、200μM、500μM。
在一些实施方案中，所述Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、组合物经由纳米粒子、外泌体、微囊泡、注射器或基因枪进行递送。
本发明的第七方面涉及Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的用途，其中所述用途选自基因组靶向编辑、靶向基因标记示踪、基因表达调控、抗病毒和/或抗菌，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如上述方面所限定。
本发明的第八方面涉及Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒用于诊断和/或治疗有此需要的受试者疾病的方法，其包括施用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如上述方面所限定。
本发明的第九方面涉及Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒在制备用于诊断和/或治疗有此需要的受试者疾病的试剂中的用途，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如上述方面所限定。
本发明的第十方面涉及Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、上述方面所述的组合物或Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒，其用于诊断和/或治疗有此需要的受试者的疾病，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如上述方面所限定。
换言之，本发明人推测HbAgo蛋白的PAZ和MID结构域也有类似于TtAgo和PfAgo的PAZ和MID结构域的结构功能。HbAgo比TtAgo和PfAgo的氨基酸序列都稍长些。3者的N端区域相较于C端的PIWI结构域区域会不保守些。经blastp分析，相比于TtAgo和PfAgo，HbAgo有更长的N端结构区域。通过InterPro数据库分析HbAgo序列，表明其N端100个氨基酸属于OB-fold结构域家族(IPR012340)。该结构域家族通常出现在单链核酸结合蛋白或寡聚糖结合蛋白中，如tRNA合成酶、单链DNA结合蛋白CDC13、DNA连接酶和DNA复合体起始子等。含有OB-fold结构域的Argonaute核酸酶包括下述基因：NCBI基因序列号AFZ73749.1、WP_012265209.1、WP_006111085.1、WP_006090832.1、WP_006183335.1、WP_002747795.1、WP_012265209.1、WP_011378069.1、WP_006054116.1、WP_058572808.1、WP_006111085.1、WP_049969002.1、WP_049934199.1和GenBanK：ELZ29017.1。在此基础上，本发明人以HbAgo为例研究了这类Argonaute蛋白在互补于靶DNA的正义链和/或反义链的单链DNA(ssDNA)和配对的双链DNA(dsDNA)的帮助下切割靶DNA的活性。本发明的实验数据初步证实，在不同的NaCl浓度下，HbAgo可以选择性地在ssDNA或dsDNA的帮助下切割DNA靶序列。本申请的HbAgo在核酸链帮助下发挥切割活性可能与OB-fold结构域的存在有关。同时，尽管现有实验数据仅涉及ssDNA或dsDNA，但通过调整NaCl的浓度和/或反应体系的其它组分，HbAgo通过结构优化可以在ssRNA或dsRNA的帮助下切割DNA靶序列是可以预测的结果。本发明的Argonaute可以在常温下在核酸链帮助下切割靶核苷酸序列，切割效率不低于20％，对于在ssDNA或dsDNA帮助下切割靶DNA而言，最佳盐浓度在100-200毫摩尔/升。基于本发明的Argonaute蛋白的上述性质，其可以实现A)基因组靶向编辑上的应用，包括但不限于基因插入、基因敲除、基因碱基修饰；B)靶向基因标记示踪；C)基因表达调控，包括但不限于表达抑制、表达增加等；D)切割外源基因达到抗病毒、抗菌等效果。相比较CRISPR-Cas技术，具有DNA介导短链容易合成、用量容易调节等优势，此外，体内介导DNA短链含量较少，有望降低脱靶效应。
附图说明
上述及其它目的、特征和优点将由本发明的具体实施方案的以下说明变得明显，如附图中例示。示意性附图不必按比例。相反，重点在于例示某些操作原理。
图1示出了blastp分析的TtAgo、PfAgo和HbAgo三个蛋白的催化活性氨基酸位点的保守性，三个催化氨基酸位点都是保守的天冬氨酸。
图2示出了HbAGO-GST蛋白纯化结果。
图3示出了验证HbAgo在不同核酸链帮助下切割双链质粒的实验，其中泳道1-9分别为仅有质粒、BamHI切割、NoHb NoSS、NoSS、nc、F、R、nc/R和F/R。最右侧为分子量标记。其中NoHb代表没有加入HbAgo蛋白，NoSS代表没有加入介导的ssDNA，nc代表阴性对照ssDNA，F代表正义介导ssDNA，R代表反义介导ssDNA。
图4示出了验证NaCl浓度对HbAgo在双链DNA核酸链帮助下切割双链质粒的影响，其中泳道1-12分别为仅有质粒、BamHI切割、20mM NaCl下的NoHb NoSS、20mM NaCl下的NoSS、20mM NaCl下的nc、20mM NaCl下的nc/R和20、100、200、250、300和400mM NaCl下的F/R。最右侧为分子量标记。其中NoHb代表没有加入HbAgo蛋白，NoSS代表没有加入介导的ssDNA，nc代表阴性对照ssDNA，F代表正义介导ssDNA，R代表反义介导ssDNA。
图5示出了不同浓度NaCl下HbAgo对反义介导的ssDNA的切割活性的影响。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人士一般理解的相同意义。
本发明的Argonaute蛋白与现有技术的Argonaute蛋白相比，表现出不同的活性特征，例如其可以在常温下发挥其切割活性，且通过调整NaCl的浓度和/或反应体系的其它组分，和/或通过Argonatue蛋白的结构优化可以在ssDNA、ssRNA、完全配对或不完全配对的dsDNA或dsRNA的帮助下切割DNA靶序列。不受任何理论的束缚，本发明人认为本发明的Argonaute蛋白的上述切割活性特征可能与其N端的OB-fold结构域有关，含有OB-fold结构域的Argonaute核酸酶包括但不限于下述基因：NCBI基因序列号AFZ73749.1、WP_012265209.1、WP_006111085.1、WP_006090832.1、WP_006183335.1、WP_002747795.1、WP_012265209.1、WP_011378069.1、WP_006054116.1、WP_058572808.1、WP_006111085.1、WP_049969002.1、WP_049934199.1和GenBanK：ELZ29017.1。本发明用HbAgo蛋白进行的实验表明，其可以在常温条件下在单链或双链核酸链的帮助下，实现对靶DNA的切割。
本发明的Argonaute既可以以蛋白质的形式直接使用，也可以以其编码多核苷酸序列和包含该编码的核苷酸序列的表达载体的方式使用。为了在目标生物体如细胞中有效地表达并发挥其活性，根据目标生物体的密码子使用偏好性对编码多核苷酸序列进行密码子优化是合乎需要的。例如，如果希望在酵母菌中引入该编码多核苷酸序列并发挥作用，则可以以酵母菌的密码子偏好性进行优化，这样的优化可以由本领域技术人员根据需要进行合适的选择。当以蛋白形式使用时，其与核酸链混合后，直接添加入反应体系或引入目标生物体如细胞中并直接发挥其作用。以编码的核苷酸序列形式使用时，可以有效操作该编码的核苷酸序列，使其进入目标生物体如细胞后依靠如宿主的表达调控机制表达，或者直接使用mRNA形式的编码多核苷酸序列，该mRNA在进入目标生物体如细胞后，利用如宿主细胞的表达调控机制表达为蛋白并发挥其作用。以包含该编码多核苷酸序列的表达载体使用时，该编码多核苷酸序列被有效连接到表达载体中，所说有效连接是指，通过该连接方式，所述包含编码多核苷酸序列的表达载体在进入目标生物体如细胞后，可以顺利地表达为活性形式的蛋白质并在其中发挥其活性。本发明的表达载体并无特殊的要求，只要其能保证有效连接其中的编码多核苷酸序列在目标生物体中表达为活性形式的蛋白并在其中发挥其活性即可。本领域技术人员可以根据具体的需求容易地选择合适的表达载体。例如，如果期望在哺乳动物细胞中表达该编码多核苷酸序列，则可以选择适合于哺乳动物细胞表达的表达载体使用。
本发明使用的核酸链可以是单链DNA(ssDNA)，单链RNA(ssRNA)，完全配对或不完全配对的双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)或DNA/RNA杂合链，长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，例如15-30个核苷酸或脱氧核苷酸，当是双链形式的核酸链时，配对的核苷酸或脱氧核苷酸长度为15-30，可以为连续配对，也可以在其中间隔1个或多个错配的核苷酸或脱氧核苷酸。
当Argonaute与核酸链组合时，二者的比例为摩尔比为20:1到1:107之间，例如1:1到1:106之间，1：10到1:106之间，1:102到1：105之间，1:103到1:105之间。该比例可以由本领域技术人员根据具体的靶基因合适地进行调整。所述Argonaute与核酸链的组合物既可以以溶液的形式提供，也可以冻干粉末的形式提供，还可以置于适用于显微注射或基因枪递送形式的纳米粒子、外泌体、脂质体、微囊泡中。所述组合物中不应含有导致Argonaute和/或核酸链失活的物质，如DNA酶或RNA酶等。
本发明的Argonaute-核酸链序列操纵系统是指除上述的Argonaute和核酸链之外，其还含有其它的组分，以便在体外、离体或体内施用时，可以顺利地施用所述组合物并使其顺利发挥其活性，切割靶DNA序列。例如在体外应用时，所述系统中还含有使Argonaute发挥其活性所需的NaCl、甘油、DTT、缓冲体系、BSA、Mg2+等。在体内应用时，所述系统中应包括为使所述组合物进行递送及在目标生物体中转录和/或翻译表达所需的成分。本领域技术人员可以根据具体的需要，合理地确定这些组分。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1：HbAgo基因序列的密码子优化及全基因合成
HbAgo基因的GenBank ID：WP_006054116.1，按大肠杆菌密码子优化后的序列如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
5'-ATGGCGGTGAAAGCGGACATTGAAGATGGTGAAGAGATTGATATTGCGCTCCATGTCACCGGTATTGACGAATGGGAGCACGATGCCATTGCCCGTAAGATCCAGCTTGAAGACGTTGACGGTGCAGCAATTGATCTGACCGTTTTTCACAACAATGATGTGTCTGACTTTGAATGGGAGATTGGTGAATGGTACCTGCTGGAAAACGTGGTTGGCAATGAATTTCGCGGCGAAATGCAGCTGAACCCAGGCTACGATCTCACCGTCACACTGTTAAATGACCCGCCAGCCGCGGCTGGTAACGATAAATCACCCGGGTCCGTACCACCAGAAGAACCTGTAGATCAGTCGGGGGAGAGCGGATCGAGTGGGGCAGCGGCTTCCACGTCAGGCGAGCCTGGAGATGCTGAATTTGTACGCGGTAGCGAAGTGGATGATGGCAGCCGCCCGACTGCTGATGGCGGCGGTAAACTGCTCCACCAGCAGCCTCTGTCGGACGGCAACTATTTATTGCAATTTGAACTGGGGAGTTTACCGGAACTGCCGGTCCATGAATATGAATTACGTGCAACTGGGTCGGGTGGAATTGACCCGGATGACTTTACCAACGGCATTGAGGGGTTCACCGCCAAAGCCGCAAACTATTATCAATCGCGCATTGGTTCACCGGTGACGACTGCGGACGCCAGTCGTCGTCGCATTTATGCGACCGAGAAGCTGCACGGCACTATTAGCATGCATGGTTACACCGTTAAACCCGTCCACCAGGGTGAGACAACACTGGAAGCTCGCTCATATACTAATGATGGCCCGCTCCAGGAATTTGTGAAACAGGATGTTAAACGCGCAGTTGCCGGCCGCTTTGAAGTTTCCGGGATTGATTCAATTATTGAACCCACCCCGCAGCGCACGGCGAACTCCGGTTTATTTGAGGCGTATCGCAAATACAAATGTCGTATTCGCGTTGATGCGGACGGGACCGTGATCTGCGGCGTGAATGTAGCTTACCATTTAGAGAGCACCTTCTCCGCGGCGGAATGGGTCCAGCGCGGTCATGACATCGCGGATGTGACCGTTGAACACGATACGGACCTGTATGATAGCGCGCGCACCGCTACCGTAAAAGAAATCATCGATATGGACTACGACGACATGTTGGACGGCCCGGGGGTCCCGATGTCTGAATACCATGAAAAGCATGTAGAGCAAGATGTTATCGACAGCATGCGTGCAGGGAATCCAGTGATTGCGGACTTGCAATATGGGTCGGGCGAAGATTCGATCTTCCCACAGTTGCTGGAATATTGCAAAGTAATTCCCACGTTTGACCAACTGGGGCGCGTCGACGAAACCTTTCTTAACGTAATTCACAACGAAAGTCGTATGAAACCGGAAGAGCGCTTCAACGTGGTCACCAGCTTTGTGGACCTGCTGGGGCCGACCCCTTACTTCGACTTTGGACCGGTTCCACAGCCGACGAATGCCGGATATCGCGAGCAGAAGACACCGAATATCCCGAACCTGCGCTTCGGTGATGGTCGCACGGGGTATTATGGCGCCGGCGGATTGGAACGTAAAGGCTACGGTGTCTACAAAGCTCCAGAAAGCTTTGATATTATCGCCCTCTACCCGGACTCAGAACAAGCCGCCGCACGTCCCTACGTACTCTCCGTGCTGGGCAAACTGGCCGAATATGACGGCAAACCGACCAAATTTGACCAGGAAACGTACGAACTGGGCTCCGAATTTCACTATTCTCAGCATGCACAGAAAACGTCGGACTACGACGCGGCCCTGATTGTGGTGCCAGATAAAGACAAAGCCGCCGCAGCCGATTATGACGATCCGTACCCGGAATTTAAACGTCGTTTGGGCCAGCTGGGCGTTCCATCTCAGATGATCACTATTGATAACCTGGGGAACGACTCCTACCTGGGCAACATTAGCTCAAGCCTGATTGGTAAAGCAGGCGGTGTACCTTGGCGCATCGATGATGTTCCAGGGGACGTAGATGCGTTCGTAGGTTTAGATGTGACCTATGATCACGCCACGAAACAGCACTTGGGTGCTGCAGCCAATGTGATTATGGCTGACGGCACGATCCTGGCTTCTGAGGCCGTGACAAAACAGGCCGGCGAAACCTTCGACGAAGATGATGTTGCGAACGTAATTAAACACGTGTTAGAAATTTTCGCGGAAGAAGAAGGTCGTCCACCTCGTCATGTAGTCATTCACCGCGATGGCAAATTCTATCTGGACATCGAGTCGCTGATTAAACGCCTGGATAAAGCTCGTGATTTGATTCAGCGCTTCGATCTGGTGGAAATTCGTAAATCAGGTAATCCTCGCATTGCCGAATATGATGAAAGCAAGAGCCGTTTCGATATTGCGGATAAAGGCGTGGCGTTTCACGTTCATAACGGTGACCACTCTTACCTGACCACTACGGGTGGGAAAGAAGGAAGCCCGGGTACACCGCGCCCGCTGCAGATCGTGAAGCGTCACGGCTCTACGGATCTGGACACGCTGGCCGAACAAACCTACTGGCTTAGCGAAGCGCATGTAGGCTCTCTGAGCCGTAGCACGCGTTTACCAATTACGACCTACTACGCCGACAAGTGCGCCGACTTTGCCATGAAAGGGTATCTTACCAAAGGTAGTGTTATTCGTGGAGTTCCGTATATCTAA-3'(SEQ ID NO:1)
MAVKADIEDGEEIDIALHVTGIDEWEHDAIARKIQLEDVDGAAIDLTVFHNNDVSDFEWEIGEWYLLENVVGNEFRGEMQLNPGYDLTVTLLNDPPAAAGNDKSPGSVPPEEPVDQSGESGSSGAAASTSGEPGDAEFVRGSEVDDGSRPTADGGGKLLHQQPLSDGNYLLQFELGSLPELPVHEYELRATGSGGIDPDDFTNGIEGFTAKAANYYQSRIGSPVTTADASRRRIYATEKLHGTISMHGYTVKPVHQGETTLEARSYTNDGPLQEFVKQDVKRAVAGRFEVSGIDSIIEPTPQRTANSGLFEAYRKYKCRIRVDADGTVICGVNVAYHLESTFSAAEWVQRGHDIADVTVEHDTDLYDSARTATVKEIIDMDYDDMLDGPGVPMSEYHEKHVEQDVIDSMRAGNPVIADLQYGSGEDSIFPQLLEYCKVIPTFDQLGRVDETFLNVIHNESRMKPEERFNVVTSFVDLLGPTPYFDFGPVPQPTNAGYREQKTPNIPNLRFGDGRTGYYGAGGLERKGYGVYKAPESFDIIALYPDSEQAAARPYVLSVLGKLAEYDGKPTKFDQETYELGSEFHYSQHAQKTSDYDAALIVVPDKDKAAAADYDDPYPEFKRRLGQLGVPSQMITIDNLGNDSYLGNISSSLIGKAGGVPWRIDDVPGDVDAFVGLDVTYDHATKQHLGAAANVIMADGTILASEAVTKQAGETFDEDDVANVIKHVLEIFAEEEGRPPRHVVIHRDGKFYLDIESLIKRLDKARDLIQRFDLVEIRKSGNPRIAEYDESKSRFDIADKGVAFHVHNGDHSYLTTTGGKEGSPGTPRPLQIVKRHGSTDLDTLAEQTYWLSEAHVGSLSRSTRLPITTYYADKCADFAMKGYLTKGSVIRGVPYI(SEQ ID NO:2)。
上述SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列委托北京唯尚立德生物科技有限公司进行全基因合成，经酶切图谱分析和测序分析表明，合成的基因序列准确无误(数据未提供)。
实施例2HbAgo蛋白在大肠杆菌中的表达
HbAgo基因插入至pGEX-6p-1载体(Biofeng)的BamHI和NotI酶切位点中，构建获得能表达GST标签-HbAgo的融合蛋白的质粒。将质粒转化至BL21(DE3)plyss大肠杆菌感受态(北京全式金生物技术有限公司)，并由终浓度0.5mM的IPTG诱导表达。蛋白质纯化回收参见GST标签蛋纯化收说明书(GE，17-0756-01)。经蛋白质电泳及N-端测序证实表达的蛋白为HbAgo蛋白(数据未提供)且纯度为95％以上，浓度为2.5mg/mL。结果见图2。
实施例3HbAgo的体外切割实验
1.实验方法
(1)反应体系：
H2O:
2X RB:25uL
DTT(1M):0.1uL
BSA(10mg/ml)：0.1uL
HbAgo蛋白:5ug
ssDNA：300ng
质粒:400ng
用水将总体积补足为50μL
2X RB的组成为:20mM Tris(pH＝8.0)，400mM NaCl，1mM MgCl2，0.8％甘油，4mMDTT，40ug/mL BSA。
实验中用的5'端磷酸化ssDNA有：
nc：5‘-TGGGCTCCTCCTTGTACTCTCTGA(SEQ ID NO：3)
F：5’-GCTGCTGCGAAATTTGAACGCCAG(SEQ ID NO：4)
R：5‘-CTGGCGTTCAAATTTCGCAGCAGC(SEQ ID NO：5)
上述F或R SSDNA针对的靶点为质粒pACYCDuet1中的序列，该质粒的序列如SEQ IDNO：6所示：
(2)先将HbAgo蛋白与各种DNA核酸链混匀、离心，55℃水浴1个小时。
(3)加入靶点质粒，混匀离心，37℃水浴16个小时。
(4)加入1uL蛋白酶K(20mg/mL),混匀离心，52℃水浴2个小时。
(5)加入6X上样缓冲液，在1％的TAE凝胶中电泳，后染色观察。
结果如图3所示。图3表明，如对比泳道4、5、6和泳道8和9所能看出的，在本实施例的反应条件下，HbAgo蛋白需要两条ssDNA核酸链的帮助才能切割靶标的双链质粒，使其线性化，而单条的ssDNA核酸链不起作用，ssDNA核酸链的5'端需要修饰磷酸基团，而且两条ssDNA核酸链完全互补的部分的长度为24nt左右。
实施例4HbAgo蛋白最适切割活性的NaCl浓度测定
该实验的方法步骤基本与实施例3的方法步骤相同，但NaCl浓度不同，具体安排如图4所示。结果如图4所示。图4表明HbAgo蛋白的最适切割活性的NaCl浓度为200mM左右，在100-300mM的浓度范围内均可以发挥切割活性。
实施例4HbAgo蛋白切割ssDNA(反义链)的最适NaCl浓度的测定
该实验的方法步骤基本与实施例3的方法步骤相同，但NaCl浓度不同且仅测试了反义介导的ssDNA，即，仅测试了R，具体安排如图5所示。结果如图5所示。图5表明HbAgo蛋白切割反义介导的ssDNA时的最适切割活性的NaCl浓度为150mM左右，在50-300mM的浓度范围内均可以发挥切割活性。

Claims (25)

1.一种Argonaute蛋白与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶。
2.一种Argonaute蛋白编码多核苷酸序列与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中多核苷酸序列是DNA序列或mRNA序列，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。
3.一种Argonaute蛋白表达载体与核酸链的组合物，其中核酸链是指与靶基因的正义链和/或反义链互补且5'端磷酸化的核酸序列，其长度为10-200个核苷酸或脱氧核苷酸，并且其中编码HbAgo蛋白的多核苷酸序列有效连接到表达载体中并能在目标细胞中表达，并且其中所述的Argonaute蛋白是在10-50℃下能以核酸链作为向导对靶向的双链DNA进行切割造成单链或者双链断裂的Argonaute核酸内切酶，优选地，所述多核苷酸序列进行了密码子优化以适于在相应的靶细胞中表达。
4.如权利要求3所述的HbAgo蛋白表达载体与核酸链的组合物，其中表达载体为原核表达载体或真核表达载体，优选地，表达载体为质粒表达载体或病毒表达载体，更优选地，表达载体为动物细胞表达载体，更优选地，表达载体为哺乳动物细胞表达载体。
5.如权利要求1-4任一项所述的组合物，其中核酸链是单链或双链核酸链，优选地，核酸链选自单链DNA(ssDNA)，单链RNA(ssRNA)，完全配对或不完全配对的双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)或DNA/RNA杂合链。
6.如权利要求1-5任一项所述的组合物，其中核酸链的长度为15-30个核苷酸或脱氧核苷酸，优选地，核酸链的长度为22-26个核苷酸或脱氧核苷酸。
7.如权利要求1-6任一项所述的组合物，其中核酸链的核碱基、核糖和/或磷氧键被化学修饰，优选地，核碱基的修饰包括杂环修饰、5一甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤，核糖的修饰包括己糖、2’-O-甲基取代核糖、环戊烷、alpha构象核糖，锁核酸(Locked nucleic acid)，磷氧键的修饰包括硫代寡核苷酸和甲基代寡核苷酸、phosphoramidates、SS-ODN和磷酸三酯、硼烷代寡核苷酸。
8.如权利要求1-7任一项所述的组合物，其中所述组合物处于纳米粒子、外泌体和/或微囊泡中。
9.如权利要求1-8任一项所述的组合物，其中所述组合物用注射器或基因枪进行递送。
10.如权利要求1-9任一项所述的组合物，其中Argonaute蛋白对应的NCBI基因序列号选自：AFZ73749.1、WP_012265209.1、WP_006111085.1、WP_006090832.1、WP_006183335.1、WP_002747795.1、WP_012265209.1、WP_011378069.1、WP_006054116.1、WP_058572808.1、WP_006111085.1、WP_049969002.1、WP_049934199.1和GenBanK：ELZ29017.1，优选地，Argonaute蛋白是HbAgo，其是指波多黎各盐几何形菌Halogeometricum borinquense的Argonaute蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
11.如权利要求1-10任一项所述的组合物，其中编码Argonaute蛋白的多核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
12.如权利要求1-11任一项所述的组合物，其中Argonaute蛋白或多核苷酸序列与核酸链的摩尔比为20:1到1:107之间。
13.一种Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒，其包含权利要求1-12任一项所述的组合物及在施用时所需的其它组分，优选地，所述其它组分包括NaCl、缓冲液、甘油、DTT、BSA和Mg2+，优选地，NaCl浓度为100-300mM，更优选地，150-250mM，和/或，优选地，缓冲液为pH6.5-8.5的2-100mM的Tris-HCl缓冲液，更优选地，缓冲液为pH 7.5-8.2的5-20mM的Tris-HCl缓冲液，和/或，优选地，甘油的浓度为0.1-1％(v/v)，更优选地，0.2-0.6％(v/v)，和/或，优选地，DTT的浓度为0.5-4mM，更优选地，1-3mM，和/或，优选地，BSA的浓度为5-100μg/mL，更优选地，10-40μg/mL，更优选地，15-25μg/mL，和/或，优选地，Mg2+的浓度为0.001-100mM，更优选地，0.01-10mM，更优选地，0.1-2mM，更优选地，0.2-1mM。
14.一种操纵基因组座位中靶序列来进行基因编辑的方法，其包括应用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
15.一种通过借助于向含有和表达编码基因产物的双链DNA分子的细胞中引入Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒使脱靶修饰最小化而修饰感兴趣的基因组座位的方法，其包括应用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中核酸链靶向编码该基因产物的DNA分子，并且该Argonautes蛋白使编码该基因产物的DNA分子产生单链或者双链切口，由此改变该基因产物的表达，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述步骤在10-50℃下进行，优选地，20-40℃，更优选，25-37℃。
17.如权利要求14-16任一项所述的方法，其中所述步骤进行1分钟-48小时，优选地，进行2分钟-24小时，更优选地，进行3分钟-16小时，更优选地，进行4-10小时，例如，进行1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时，或更久。
18.如权利要求14-17任一项所述的方法，其中所述步骤在体内、离体或体外进行。
19.如权利要求14-18任一项所述的方法，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒应用于细胞中，优选地，所述细胞选自原核细胞或真核细胞，优选地，所述细胞选自细菌、蓝细菌、放线菌、真菌细胞、藻类细胞、原生动物细胞、植物细胞或动物细胞，更优选地，细胞选自动物细胞，更优选地，细胞选自昆虫细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞，更优选地，细胞选自啮齿类动物细胞或灵长类动物细胞，更优选地，细胞选自人类细胞。
20.如权利要求14-19任一项所述的方法，其中所述组合物中Argonaute的浓度为0.1μM到500μM。
21.如权利要求14-20任一项所述的方法，其中所述Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、组合物经由纳米粒子、外泌体、微囊泡、注射器或基因枪进行递送。
22.Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的用途，其中所述用途选自基因组靶向编辑、靶向基因标记示踪、基因表达调控、抗病毒和/或抗菌，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
23.Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒用于诊断和/或治疗有此需要的受试者疾病的方法，其包括施用Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体、权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒的步骤，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
24.Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒在制备用于诊断和/或治疗有此需要的受试者疾病的试剂中的用途，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
25.Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体或权利要求1-12任一项所述的组合物或权利要求13所述的Argonaute-核酸链序列操纵试剂盒，其用于诊断和/或治疗有此需要的受试者的疾病，其中Argonaute蛋白或其编码多核苷酸序列或Argonaute蛋白表达载体如权利要求1-12任一项所限定。
CN201610808052.0A 2016-09-07 2016-09-07 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物 Pending CN107805634A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610808052.0A CN107805634A (zh) 2016-09-07 2016-09-07 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610808052.0A CN107805634A (zh) 2016-09-07 2016-09-07 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107805634A true CN107805634A (zh) 2018-03-16

Family

ID=61575890

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610808052.0A Pending CN107805634A (zh) 2016-09-07 2016-09-07 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107805634A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108796036A (zh) * 2018-04-03 2018-11-13 上海交通大学 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
CN112941107A (zh) * 2021-04-01 2021-06-11 西北农林科技大学 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用
WO2022121301A1 (zh) * 2020-12-11 2022-06-16 湖北大学 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用
CN117778377A (zh) * 2023-12-14 2024-03-29 湖北大学 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108796036A (zh) * 2018-04-03 2018-11-13 上海交通大学 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
WO2019192156A1 (zh) * 2018-04-03 2019-10-10 上海交通大学 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用
JP2021517469A (ja) * 2018-04-03 2021-07-26 上海交通大学Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 原核アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用
JP7224676B2 (ja) 2018-04-03 2023-02-20 ジャオホン バイオテクノロジー （シャンハイ） カンパニー リミテッド 原核アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用
US12110538B2 (en) 2018-04-03 2024-10-08 Jiaohong Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. Method for detecting nucleic acid based on prokaryotic argonaute protein and application thereof
WO2022121301A1 (zh) * 2020-12-11 2022-06-16 湖北大学 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用
CN112941107A (zh) * 2021-04-01 2021-06-11 西北农林科技大学 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用
CN112941107B (zh) * 2021-04-01 2024-01-23 西北农林科技大学 原核Argonaute蛋白的基因编辑应用
CN117778377A (zh) * 2023-12-14 2024-03-29 湖北大学 基于新型可编程核酸酶Argonaute的大片段DNA高效合成与组装方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2019204675B2 (en) Using rna-guided foki nucleases (rfns) to increase specificity for rna-guided genome editing
AU2012264606B2 (en) Transcription terminator sequences
CN112538470B (zh) 一种原核生物来源的Argonaute蛋白及其应用
CN107805634A (zh) 用于序列操纵的Argonaute‑核酸序列组分系统、方法以及组合物
KR20210139254A (ko) Ruvc 도메인이 존재하는 효소
CN102796728A (zh) 用于通过转座酶的dna片段化和标记的方法和组合物
CN102216455B (zh) 腈水合酶突变体
CN109154001A (zh) 新型最小utr序列
JP2019528743A (ja) 規定された配列および長さのｄｎａ１本鎖分子の拡大可能な生物工学的生成
TW202305130A (zh) 原核系統中環狀多核糖核苷酸之產生
US20220389425A1 (en) Mbp_argonaute proteins from prokaryotes and applications thereof
US20190292537A1 (en) Prokaryotic Argonaute Proteins and Uses Thereof
CN115975985B (zh) 一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用
CN117999351A (zh) Ii类v型crispr系统
Acevedo et al. Cloning of complete genes for novel hydrolytic enzymes from Antarctic sea water bacteria by use of an improved genome walking technique
WO2018195224A1 (en) Barcoded transposases to increase efficiency of high-accuracy genetic sequencing
US20240110178A1 (en) Application of prokaryotic argonaute protein with only rna target cleavage activity in rna editing
US20240240165A1 (en) Synthetic cas proteins
CN115820604B (zh) 一种高温Argonaute蛋白质及其应用
CN112585260A (zh) 使用RNase III突变体产生sRNA以控制宿主病原体感染的系统、方法和组合物
CN109735516A (zh) 受核苷酸片段引导具有特异核酸内切酶活性的piwi蛋白
JP2024501892A (ja) 新規の核酸誘導型ヌクレアーゼ
CN108884450A (zh) Mini-III RNA酶、改变Mini-III RNA酶切割RNA序列的特异性的方法及其用途
US20220186254A1 (en) Argonaute proteins from prokaryotes and applications thereof
CN109880840A (zh) 一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180316

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication