CN112585260A - 使用RNase III突变体产生sRNA以控制宿主病原体感染的系统、方法和组合物 - Google Patents

使用RNase III突变体产生sRNA以控制宿主病原体感染的系统、方法和组合物 Download PDF

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Abstract

本发明包括用于使用选择的RNase III突变体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包括用于使用RNase III突变体以通过sRNA分子的产生和扩散控制宿主病原体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物，所述sRNA分子可以启动针对宿主病原体的RNAi途径应答。本发明的另外的实施例包括用于使用选择的RNase III突变体来DICER非依赖性产生sRNA分子的系统、方法和组合物。

Description

使用RNase III突变体产生sRNA以控制宿主病原体感染的系 统、方法和组合物
本申请要求2018年3月31日提交的美国临时专利申请第62/651,143号的权益和优先权，其通过引用以其整体并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式被提交并且据此通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明的领域总体上涉及细菌核糖核酸酶突变，特别是核糖核酸酶III中的点突变，以及它们在细菌小RNA(sRNA)的生产中的用途。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是双链RNA(dsRNA)触发含有同源序列的mRNA的切割的过程(在参考文献5中综述)。RNAi途径似乎是一种古老的进化发明，其一直保留在植物、蠕虫和哺乳动物等不同物种中。虽然该过程的细节仍在研究中，但RNAi途径的关键成分已经被鉴定，并且用于其作用的模型已经开始形成。长的双链RNA物种被蛋白质Dicer切割成小的(约21个核苷酸至23个核苷酸[nt])干扰双链RNA(siRNA)，其用作识别线索以靶向同源的mRNA切割。除了全长双链RNA外，实验产生的小发夹RNA(shRNA)也可以用作Dicer切割反应的底物，以产生约22nt的siRNA产物。
除了它们在mRNA切割中的作用外，RNAi途径的成分还可以在其他生物学过程中发挥作用。例如，某些内源编码的不完善的发夹RNA(被称为microRNA(miRNA))可以由Dicer从它们的约75nt的前体(pre-miRNA)进行加工，并且可以将所得的短产物(miRNA)掺入到RISC中。在这种情况下，这些短RNA识别靶mRNA的3'非翻译区(UTR)中的不完全同源性，导致翻译损伤。RNAi已经被证明可有效地沉默多种物种(包括植物)的基因表达，其中对植物、动物的癌症、遗传病、传染病具有广泛的影响。研究还已经表明，在多种生物中，dsRNA或其siRNA衍生物可以用于阻止、延缓或者甚至预防多种病原体，尤其是病毒性疾病。然而，为了对抗宿主生物的RNAi介导的免疫力，某些病毒编码靶向RNAi机制中的RNA和蛋白质成分的RNA沉默病毒抑制因子(VSR)，诸如DICER。此外，由于在诸如细菌的原核系统中不存在DICER介导的系统，因此产生可扩展的dsRNA生产系统的能力受到限制。结果，用于治疗或其他工业应用的dsRNA的生产受到直接化学合成dsRNA或使用基于真核生物的生产系统(其是昂贵且效率低下的生产平台)的需求的阻碍。结果，需要DICER非依赖性机制来启动RNAi途径应答。如下所示，本发明人已经开发了系统、方法和组合物，以通过细菌核糖核酸酶III酶中的靶向的突变来启动DICER非依赖性机制以启动RNAi途径应答。
核糖核酸酶III(“RNase III”)代表高度保守的双链特异性内切核糖核酸酶家族，其对于原核生物和真核生物中的RNA加工和转录后基因调控都是重要的。该家族可以分为三类。1类的结构最简单，具有单个核糖核酸酶结构域和dsRNA结合结构域，并且是最具特征的。其成员存在于真细菌、古细菌和酵母中。2类成员具有两个核糖核酸酶结构域和一个dsRNA结合结构域。这些都存在于真核生物中，其中Drosha是典型的示例。3类(也被称为Dicer酶家族)是最大的，并且通常含有两个核糖核酸酶结构域、dsRNA结合结构域、DEAD盒解旋酶结构域和PAZ结构域。RNase III通过降解和加工mRNA协助调节基因表达。RNase III特异性地切割双链RNA(dsRNA)，产生带有两个核苷酸突出端的5'-磷酸和3'-羟基末端。例如，在大肠杆菌中，由rnc基因编码的RNase III由核糖核酸酶结构域(氨基酸残基21–149)和dsRNA结合结构域(残基155–209)组成。大肠杆菌RNase III起同二聚体的作用，其中两个核糖核酸酶结构域形成一个加工中心，并且每个结构域均有助于双链体底物的一条RNA链的切割。
例如，大肠杆菌RNase III残基E38已经显示出参与蛋白质二聚化。其突变体可以将dsRNA在主要位点加工成离散大小的sRNA，并且也保持与dsRNA产物的结合，从而保护其免受进一步消化。重要的是，该dsRNA产物的大小类似于由Dicer产生的产物。因此，具有E38A突变的RNase III可以产生适合于RNA干扰实验的短dsRNA片段。此外，已经显示RNaseIII氨基酸E65参与底物识别和易断裂键选择，而D45、D114和D117螯合Mn2+离子。已经显示残基E41、D45、D114和E117进行易断裂键的水解。RNase III突变体的研究已经进一步表明，组成性表达rnc70的两个转基因玉米品系(RNC70、E117K突变体，结合但不切割dsRNA)对玉米粗矮病毒(Maize rough dwarf virus)感染更具抗性。
基于上述，显然需要并入RNase突变的特定组合，这些突变可以在可能易受病毒和其他病原体感染的细胞中稳定地整合和/或表达，以促进增强的RNA干扰应答。
发明内容
本发明的一个目的包括用于使用RNase III突变体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包括用于使用RNase III突变体控制宿主病原体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。本发明的另一个目的包括用于使用RNase III突变体在体内产生sRNA分子的系统、方法和组合物。本发明的另一个目的包括用于使用RNaseIII突变体在体外产生sRNA分子的系统、方法和组合物。
本发明的另一个目的包括用于使用RNase III突变体在宿主中产生DICER非依赖性RNAi应答来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。
本发明的一个目的包括用于使用具有增强的催化活性的RNase III突变体来高水平产生sRNA分子的系统、方法和组合物。
本发明的一个目的包括用于使用RNase III突变体来高水平产生sRNA分子的系统、方法和组合物，所述RNase III突变体具有增强的RNase III切割模式的稳定性，导致更一致的dsRNA切割，并且增加消化的sRNA的异源混合物中离散大小的sRNA的百分比。
本发明的另一个目的包括在RNase III的N末端催化结构域中产生一系列的单/多氨基酸突变体，以产生离散大小的sRNA，这些sRNA具有用作RNA沉默的触发物的潜力。在某些实施例中，来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)家族(诸如大肠杆菌和肠杆菌(Enterobacter))以及芽孢杆菌科(Bacillaceae)等的RNase III可以被工程化以包括一个或多个点突变，所述点突变提高了dsRNA切割的催化效率以及离散大小的sRNA的产生。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在宿主中。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以在植物中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在植物宿主中。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以在动物宿主中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNaseIII突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在动物宿主中。
本发明的另一个目的可以包括通过在选择的共生细菌中表达本文所述的一种或多种RNase III突变体，将sRNA分子跨界递送至宿主，其可以在植物中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体在与植物宿主为天然共生体的细菌中共表达。在优选的实施例中，该天然共生体可以包括一种或多种内生细菌。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在植物宿主中。
本发明的另一个目的可以包括通过在共生或内共生细菌中表达本文所述的一种或多种RNase III突变体，将sRNA分子跨界递送至宿主，其可以在动物宿主中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体在与植物宿主为天然共生体的细菌中共表达。在优选的实施例中，该天然共生体可以包括一种或多种共生或内共生细菌，并且优选地为肠细菌。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在动物宿主中。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以产生离散大小的sRNA，从而可以触发RNAi途径应答。在该实施例中，例如，来自选择的病原体的dsRNA，并且优选地，选择的宿主病原体的必需基因可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在宿主中。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以产生离散大小的sRNA，从而可以触发预防性RNAi途径应答。在该实施例中，例如，来自选择的病原体的dsRNA，并且优选地，选择的宿主病原体的必需基因可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导预防性RNAi途径应答，优选地在宿主中，其可以保护宿主免受选择的病原体的感染。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以产生离散大小的sRNA，从而可以触发DICER非依赖性RNAi途径应答。在该实施例中，例如，来自选择的病原体的dsRNA，并且优选地，选择的宿主病原体的必需基因可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNaseIII突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在宿主中，其独立于可以被某些病毒病原体抑制的DICER酶的作用。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以表现出增强的催化活性，从而与野生型或本领域中先前描述的其他RNase III突变体相比，产生更高量的sRNA。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以表现出导致更一致的dsRNA切割的增强的RNase III切割模式的稳定性，从而产生具有更大同质性的sRNA，使得与野生型或本领域中先前描述的其他RNase III突变体相比，产生的sRNA表现出更大的大小一致性。
本发明的另一个目的可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNaseIII突变体，其可以产生离散大小的sRNA分子。在一个优选的实施例中，此类离散大小的sRNA可以是26-29nt和/或22-23。在一个优选的实施例中，此类离散大小的sRNA可以大于26-29nt和/或22-23。在一个优选的实施例中，此类离散大小的sRNA可以小于26-29nt和/或22-23。在一个优选的实施例中，由于改善的固定流扩散，由本文所述的一种或多种RNaseIII突变体产生的此类sRNA分子在宿主中可以表现出更大的扩散。
本发明的另一个目的可以包括用于高水平生产sRNA分子的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，可以对细菌进行遗传修饰以异源地表达本文所述的一种或多种RNase III突变体。在一个优选的实施例中，遗传修饰的细菌可以进一步共表达靶dsRNA分子，优选地针对病原体、害虫或草食动物的必需基因。这些遗传修饰的细菌可以在发酵罐或其他工业生产系统中生长。靶dsRNA分子可以被转化成离散大小的sRNA分子并被分离。在另一个实施例中，可以如上所述生产此类sRNA分子，并且然后进一步分离，而在其他实施例中，可以分离包含sRNA分子的细菌。本发明的另一个目的可以包括组合物，该组合物包括有一定量的sRNA分子或含有sRNA分子的细菌。此类组合物可以包括可以施用和/或施用于宿主(诸如植物或动物宿主)的组合物。实例可以包括药物组合物、局部组合物、包封组合物、凝胶组合物、喷雾组合物等。本发明的另一个目的可以包括处理sRNA分子组合物在宿主中治疗和/或预防病原体引起的疾病病症的用途。本发明的另一个目的可以包括此类sRNA分子组合物在治疗、预防或杀死可能消耗宿主(优选地植物宿主)的害虫中的用途。
本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸。本发明的另一个目的可以包括编码与启动子可操作地连接的本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸。本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸作为表达盒。本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸作为可以用于转化细菌或其他生物的载体。
本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸和编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸。本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸和编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸，其中每个序列与启动子可操作地连接。本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸和编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸作为表达盒。本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸和编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸作为可以用于转化细菌或其他生物的载体。本发明的另一个目的可以包括本文所述的一种或多种RNase III突变体的稳定转化和表达。
本发明的另一个目的包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以表达本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽的系统和方法。
本发明的另一个目的包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以共表达本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽和编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA的多肽的系统和方法。
本发明的另一个目的包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以表达本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽的系统和方法。
本发明的另一个目的可以包括编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽。
本发明的另一个目的包括对靶生物(诸如细菌)进行遗传修饰以表达编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽的系统和方法。
本发明的另一个目的包括对靶生物(诸如细菌)进行遗传修饰以表达编码本文所述的一种或多种RNase III突变体的多肽并共表达针对宿主病原体中的必需基因的dsRNA的系统和方法。
本发明的另一个目的包括在RNase III N末端催化结构域中产生一系列的单/多氨基酸突变体，以产生离散大小的sRNA，其具有用作RNA沉默的触发物的潜力。在某些实施例中，可以对来自肠杆菌科(诸如肠杆菌科和肠杆菌)以及其他细菌家族(诸如芽孢杆菌等)的RNase III进行工程化改造，以包括一个或多个点突变，所述点突变提高了dsRNA切割的催化效率以及离散大小的sRNA的产生。
本发明的另一个目的可以包括在RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是细菌RNase III。本发明的另一个目的可以包括在来自大肠杆菌的RNaseIII中产生一系列的单/多氨基酸突变体。在一个实施例中，来自大肠杆菌的RNase III可以是根据多核苷酸序列SEQ ID NO.1和/或氨基酸序列SEQ ID NO.2。
本发明的另一个目的可以包括在来自肠杆菌科的RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体。本发明的另一个目的可以包括在来自肠杆菌科的RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体。本发明的另一个目的可以包括在RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是本文所述的RNase III的同源物。本发明的另一个目的可以包括在RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是本文所述的RNase III的直系同源物。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括产生被整合到细菌染色体中的E38A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在细菌中转化和/或表达E38A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个目的可以包括在细菌中共表达E38A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个目的可以包括产生E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在细菌中转化和/或表达E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E65A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个目的可以包括在细菌中共表达E65A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个目的可以包括在细菌中共表达E38A-E65A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个目的可以包括在细菌中共表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A RNase III突变体，其具有产生26和29nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个目的可以包括产生具有改善的催化效率的E38A RNaseIII突变体。本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.3-4、13-14和9-10的E38ARNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生E65A RNase III突变体，其具有产生26和29ntsRNA的大小偏好。本发明的另一个目的可以包括产生具有改善的催化效率的E65A RNaseIII突变体。本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.5-6的E65A RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A-E65A RNase III突变体，其具有产生26和29nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个目的可以包括产生具有改善的催化效率的E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.17的E65A RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其具有产生22和23nt的sRNA的大小偏好。在某些其他实施例中，本发明可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，该突变体具有在来自肠杆菌科的RNase III(例如根据SEQ IDNO.7-8)中产生22和23nt的sRNA的大小偏好。在某些其他实施例中，本发明可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其具有在来自肠杆菌的RNase III(例如根据SEQ IDNO.11-12和15-16)以及其他细菌家族(诸如芽孢杆菌科等)中产生22和23nt的sRNA的大小偏好。在某些其他实施例中，本发明可以包括从本文鉴定的RNase III的同源物产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，该突变体具有改善的催化效率和对22和23nt的sRNA的增强的dsRNA切割特异性。本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.7-8、11-12和15-16的E65A RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生一种或多种RNase III突变体，其可以在细菌中表达并产生可以被进一步分离的sRNA。在一个优选的实施例中，本发明可以包括产生RNase III突变体，其可以在细菌中表达并产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的sRNA。
本发明的另一个目的可以包括产生一种或多种RNase III突变体，所述突变体可以在被配置为将sRNA递送至宿主的细菌中表达。在一个优选的实施例中，本发明可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的RNase III突变体，其可以在被配置为将sRNA递送至宿主并启动DICER非依赖性RNAi途径应答的细菌中表达。
本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以与针对必需病原体基因的dsRNA(优选地针对宿主的共生和/或内共生细菌)共表达。在该实施例中，RNase III突变体可以从共表达的dsRNA中产生sRNA，并将sRNA递送至宿主，从而启动RNAi途径应答。
本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以与针对必需害虫基因的dsRNA(优选地针对宿主的共生和/或内共生细菌)共表达。在该实施例中，RNase III突变体可以从共表达的dsRNA产生sRNA并将sRNA递送至宿主，从而在消耗宿主(优选地植物)的害虫中启动RNAi途径应答。
本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以与针对必需病原体基因的dsRNA(优选地针对宿主的共生和/或内共生细菌)共表达。在该实施例中，RNase III突变体可以从共表达的dsRNA产生sRNA并将sRNA递送至宿主，从而启动RNAi途径应答，优选地在植物或动物中。
本发明的另一个目的可以包括产生与野生型RNase III相比可以表现出dsRNA的差异切割的一种或多种RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生Q153P RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生dsRNA，并且与野生型RNase III相比可以进一步表现出dsRNA的差异切割。本发明的另一个目的可以包括产生D115E RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生dsRNA，并且与野生型RNase III相比可以进一步表现出dsRNA的差异切割。
本发明的另一个目的可以包括产生E58A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生dsRNA，并且与野生型RNase III相比可以进一步表现出dsRNA的差异切割。本发明的另一个目的可以包括产生E59A RNase III突变体，其中该RNase III突变体产生dsRNA，并且与野生型RNase III相比可以进一步表现出dsRNA的差异切割。
本发明的另一个目的可以包括产生可以结合但不切割dsRNA的E117K RNase III突变体。
本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.37-40、55-58的一种或多种RNase III突变体，其中所述RNase III突变体产生dsRNA，并且与野生型RNase III相比可以进一步表现出dsRNA的差异切割。
本发明的另一个目的可以包括产生根据SEQ ID NO.27-28的一种或多种RNaseIII突变体，其中所述RNase III突变体结合但不产生sRNA。
本发明的另外的目的可以包括以下实施例中的一个或多个：
基础组合物
1.一种遗传修饰的细胞，其表达与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述RNase III突变体被配置为用于增强从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)，其中所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
2.根据实施例1所述的遗传修饰的细菌，其中所述遗传修饰的细胞选自由以下组成的组：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
3.根据实施例2所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
4.根据实施例3所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌包含与靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
5.根据实施例4所述的遗传修饰的细胞，其中所述靶宿主选自由以下组成的组：植物宿主和动物宿主。
6.根据实施例5所述的遗传修饰的细胞，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体。
7.根据实施例1所述的遗传修饰的细胞，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ IDNO.17的氨基酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
8.根据实施例1所述的遗传修饰的细胞，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
9.根据实施例6、7和8所述的遗传修饰的细胞，其中所述E38A-R107A-R108A RNaseIII突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
10.根据实施例1所述的遗传修饰的细胞，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的RNase III、来自大肠杆菌(E.coli)的RNase III、来自肠杆菌(Enterobacter)的RNase III、来自芽孢杆菌科(Bacillaceae)的RNase III、来自芽孢杆菌(Bacillus)的RNase III、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的RNase III、来自肠道沙门菌(S.enterica)的RNase III、来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的RNase III、来自贝氏考克斯菌(C.burnetii)的RNase III、来自荚膜红假单胞菌(R.capsulatus)的RNase III、来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的RNase III、来自空肠弯曲菌(C.jejuni)的RNase III、来自幽门螺杆菌(H.pylori)的RNase III、来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的RNase III和来自乳酸乳球菌(L.lactis)的RNase III。
11.根据实施例6、7和8所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌进一步共表达与编码dsRNA的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
12.根据实施例11所述的遗传修饰的细胞，其中所述共表达的dsRNA包含针对必需病原体基因的dsRNA。
13.根据实施例12所述的遗传修饰的细胞，其中所述必需病原体基因包含必需病毒病原体基因。
14.根据实施例6所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在靶宿主中启动RNA干扰(RNAi)应答途径。
15.根据实施例14所述的遗传修饰的细胞，其中将所述遗传修饰的细菌引入到靶宿主中包含将遗传修饰的细菌局部地施加至靶宿主植物。
16.根据实施例15所述的遗传修饰的细胞，其中将所述遗传修饰的细菌引入到靶宿主中包含通过饲料将遗传修饰的细菌引入到靶宿主动物中。
17.根据实施例6所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌在发酵罐中生长。
18.根据实施例17所述的遗传修饰的细胞，其中由所述遗传修饰的细菌产生的所述sRNA是分离的。
19.根据实施例17所述的遗传修饰的细胞，其中由所述遗传修饰的细菌产生的所述分离的sRNA被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
20.一种组合物，包含：E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
21.根据实施例20所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
22.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
23.根据实施例22所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
24.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
25.根据实施例24所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
26.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
27.根据实施例26所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
28.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
29.根据实施例28所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
30.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
31.根据实施例30所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
32.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
33.根据实施例32所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
34.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
35.根据实施例34所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
36.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
37.根据实施例36所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
37.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
38.一种组合物，包含：E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
39.一种组合物，包含：E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
40.一种组合物，包含：RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
41.一种组合物，包含：RNase III E58A突变体，其中谷氨酸在残基58处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
42.一种组合物，包含：RNase III E59A突变体，其中天冬氨酸在残基59处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
43.一种组合物，包含：RNase III Q153P突变体，其中谷氨酰胺在残基处被脯氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
44.一种组合物，包含：RNase III D115E突变体，其中谷氨酸在残基处被赖氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
45.一种组合物，包含：RNase III E115K突变体，其中谷氨酸在残基处被赖氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
46.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
47.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
48.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
49.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
50.一种组合物，包含：与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO.17的氨基酸序列。
51.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.24的RNase III E58A突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
52.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.26的RNase III E59A突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
53.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
54.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
55.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
56.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
57.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
58.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.25的RNase III E58A突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
59.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.27的RNase III E59A突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
60.一种产生sRNA的方法，包含以下步骤：
-对细胞进行遗传修饰以表达与至少一种启动子可操作地连接的一个或多个异源多核苷酸序列，所述启动子编码：
-RNase III突变体，其被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)；
-dsRNA，其针对必需病原体基因；
-在培养物中生长所述遗传修饰的细胞；
-用所述RNase III突变体催化切割所述dsRNA以形成sRNA的群体，以产生多个离散大小的sRNA；和
-分离所述遗传修饰的细胞或分离所述离散大小的sRNA。
61.根据实施例60所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞包含选自由以下组成的组的遗传修饰的细胞：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
62.根据实施例61所述的方法，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
63.根据实施例62所述的方法，其中所述遗传修饰的细菌包含与靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
64.根据实施例62所述的方法，其中在培养物中生长所述遗传修饰的细胞的所述步骤包含在发酵罐中生长所述遗传修饰的细胞的步骤。
65.根据实施例60所述的方法，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体。
66.根据实施例60所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ IDNO.17的氨基酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
67.根据实施例60所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
68.根据实施例65、66和67所述的方法，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
69.根据实施例60所述的方法，其中被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)的所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
70.根据实施例62所述的方法，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科的RNase III、来自大肠杆菌的RNase III、来自肠杆菌的RNase III、来自芽孢杆菌科的RNase III、来自芽孢杆菌的RNase III、来自枯草芽孢杆菌的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌的RNase III、来自肠道沙门菌的RNase III、来自铜绿假单胞菌的RNase III、来自贝氏考克斯菌的RNase III、来自荚膜红假单胞菌的RNase III、来自天蓝色链霉菌的RNase III、来自空肠弯曲菌的RNase III、来自幽门螺杆菌的RNaseIII、来自金黄色葡萄球菌的RNase III和来自乳酸乳球菌的RNase III。
80.根据实施例60所述的方法，其中所述分离的细胞被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
81.根据实施例60所述的方法，其中所述分离的sRNA被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
82.根据实施例60所述的方法，其中所述必需病原体基因是必需病毒病原体基因。
83.一种在靶宿主中启动DICER非依赖性RNA干扰(RNAi)应答途径的方法，包含以下步骤：
-对缺乏DICER酶的细胞进行遗传修饰，以表达与至少一种启动子可操作地连接的一个或多个异源多核苷酸序列，所述启动子编码：
-RNase III突变体，其被配置为在不存在DICER酶的情况下催化切割双链RNA(dsRNA)；和
-dsRNA，其针对必需病原体基因；
-将所述遗传修饰的细胞引入到靶宿主中；
-用所述RNase III突变体催化切割表达的dsRNA，以形成能够启动DICER非依赖性RNAi应答途径的小RNA(sRNA)的群体；和
-允许所述sRNA从细胞扩散到所述靶宿主并在所述靶宿主中启动针对所述必需病原体基因的DICER非依赖性RNAi应答途径；和
-通过所述DICER非依赖性RNAi应答途径下调所述必需病原体基因。
84.根据实施例83所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞包含选自由以下组成的组的遗传修饰的细胞：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
85.根据实施例84所述的方法，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
86.根据实施例85所述的方法，其中所述遗传修饰的细菌包含与所述靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
87.根据实施例85所述的方法，其中所述靶宿主选自由以下组成的组：植物靶宿主和动物靶宿主。
88.根据实施例83所述的方法，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNaseIII突变体。
89.根据实施例83所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ IDNO.17的氨基酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
90.根据实施例84所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
91.根据实施例88、89和90所述的方法，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
92.根据实施例86所述的方法，其中被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)的所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
93.根据实施例85所述的方法，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科的RNase III、来自大肠杆菌的RNase III、来自肠杆菌的RNase III、来自芽孢杆菌科的RNase III、来自芽孢杆菌的RNase III、来自枯草芽孢杆菌的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌的RNase III、来自肠道沙门菌的RNase III、来自铜绿假单胞菌的RNase III、来自贝氏考克斯菌的RNase III、来自荚膜红假单胞菌的RNase III、来自天蓝色链霉菌的RNase III、来自空肠弯曲菌的RNase III、来自幽门螺杆菌的RNaseIII、来自金黄色葡萄球菌的RNase III和来自乳酸乳球菌的RNase III。
94.根据实施例83所述的方法，其中所述必需病原体基因是必需病毒病原体基因。
根据下面提供的详细描述和附图，目前公开的实施例的适用性的进一步范围将变得显而易见。然而，应理解，尽管指示了本公开的优选的实施例，但是详细描述和特定的实例仅通过说明的方式给出，因为根据该详细描述，在这些实施例的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。
附图说明
从以下结合附图进行的详细描述，将更好地理解本公开的以上和其他方面、特征和优点，所有这些仅以说明的方式给出，并且不限制目前公开的实施例，其中：
图1A：大肠杆菌核糖核酸酶III(RNase III)的催化中心。
图1B：同源重组，以直接在细菌染色体中进行细菌RNase III点突变体(tet-sacB反选择)。
图2：通过用
Figure BDA0002804897670000231
限制性酶消化来鉴定pKD46和pSIJ8质粒。泳道M：1kb DNA阶梯；泳道1-2：用
Figure BDA0002804897670000232
限制性酶消化的pKD46，并且预期的片段大小为约4.8kb和约1.5kb；泳道3-4：用
Figure BDA0002804897670000233
限制性酶消化的pSIJ8，并且预期的片段大小为约0.8kb、约1.3kb、约1.5kb和约6.0kb。
图3：插入大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38和E117K位置的tetA-sacB盒的PCR扩增。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-7：使用引物JD-5和Tet-sacB-JD-R1对插入到大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38位置中的tetA-sacB盒进行PCR扩增，并且预期的片段大小为368bp；泳道8-14：用引物JD-5和Tet-sacB-JD-R1对插入到大肠杆菌JM109(DE3)RNase IIIE117位置中的tetA-sacB盒进行PCR扩增，并且预期的片段大小为605bp。
图4：E38A-L40F和E117K-L119F突变体的筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-7：使用引物Ecoli-E38A-1F和Ecoli-E38A-1R对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38A-L40F候选突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为256bp；泳道8-14：使用引物Ecoli-E117K-1F和Ecoli-E117K-1R对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E117K-L119F候选突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为323bp；泳道15-21：使用引物JD-5和JD-3对泳道1-7中相同的大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38A-L40F候选突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为879bp；泳道22-28：使用引物JD-5和JD-3对泳道8-14中相同的大肠杆菌JM109(DE3)RNaseIII E117K-L119F候选突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为879bp。
图5：E38A和E117K突变体的筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1、3和5：使用引物Ecoli-E38A-2F和Ecoli-E38A-1R对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38A突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为256bp；泳道2、4和6：使用引物JD-5和JD-3对泳道1、3和5中相同的可能的大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E38A-L40F突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小是879bp；泳道7、9和11：使用引物Ecoli-E117K-2F和Ecoli-E117K-1R对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E117K突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为323bp；泳道8、10和12：使用引物JD-5和JD-3对泳道7、9和11中相同的可能的大肠杆菌JM109(DE3)RNase IIIE117K突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为879bp。
图6：E65A突变体的筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-3，使用引物JD-5和Tet-sacB-JD-R1对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E65<tetA-sacB>突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为449bp；泳道4、6、8、10、12、14和16：使用引物Ecoli-E65A-1F和JD-3对大肠杆菌JM109(DE3)RNase III候选E65A突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为604bp；泳道5、7、9、11、13、15和17：使用引物JD-5和JD-3对泳道4、6、8、10、12、14和16中相同的大肠杆菌JM109(DE3)候选RNase III 65A突变体进行PCR扩增，并且预期的片段大小为879bp。
图7：Bc-E58A和Bc-E137K突变体的构建。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-2：使用Pveg质粒作为模板，用引物Pveg-F1和Pveg-R1进行PCR扩增，并且预期的PCR大小为273bp；泳道3-6：使用蜡状芽孢杆菌53522的基因组DNA作为模板，用引物Bc-E58A-F1和Bc-E58A-R1进行PCR扩增，并且预期的PCR片段大小为205bp；泳道7-10：使用蜡状芽孢杆菌53522的基因组DNA作为模板，用引物Bc-E58A-F2和Bc-E58A-R2进行PCR扩增，并且预期的PCR片段大小为608bp；泳道11-14：使用蜡状芽孢杆菌53522的基因组DNA作为模板，用引物Bc-E58A-F1和Bc-E137K-R1进行PCR扩增，并且预期的PCR片段大小为445bp；泳道15-18：使用蜡状芽孢杆菌53522的基因组DNA作为模板，使用引物Bc-E137K-F1和Bc-E58A-R2进行PCR扩增，并且预期的PCR片段大小为368bp。
图8：pAD-WRKY-GHY7-Pveg3质粒的构建。泳道M：GeneRuler DNA阶梯混合物；泳道1：用
Figure BDA0002804897670000241
限制性酶消化pAD-WRKY-GHY7，并且预期的片段大小为约7.2kb；泳道2：使用Pveg质粒作为模板，用引物Pveg-F2和Pveg-R2进行PCR扩增，并且预期的片段大小为273bp；泳道3-4：用XhoI消化pAD-WRKY-GHY7-Pveg3质粒，并且预期的片段大小为约7.5kb。
图9：预测的RNase III突变体的PCR筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-7：HT115-Bs(枯草芽孢杆菌)-E59A突变体的PCR扩增；泳道8-10：HT115-Bs-E138K突变体的PCR扩增；泳道11-13：HT115-Ec-E38A-ΔSA突变体的PCR扩增；泳道14-16：HT115-Ec-E38A-ΔSASS突变体的PCR扩增；泳道17-19：HT115-Ec-E38A-ΔSA-ΔGPG突变体的PCR扩增；泳道20-21：HT115-Ec-E38A-ΔSASS-ΔGPG突变体的PCR扩增；泳道23-25：HT115-Ec-E38A-R107A-R108A突变体的PCR扩增；泳道26-28：HT115-Ec-E38A-R107E-R108E突变体的PCR扩增；泳道29-30：HT115-Ec-ΔSASS-ΔGPG突变体的PCR扩增。
图10：肠杆菌Ae003、Ae073和Ag001的rnc基因。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1：用Ae-JD-5和Ae-JD-3引物对Ae003进行PCR扩增，并且预期的片段大小为约1.2kb；泳道2：用Ae-JD-5和Ae-JD-3引物对Ae073进行PCR扩增，并且预期的片段大小为约1.2kb；泳道3：用Ae-JD-5和Ae-JD-3引物鉴定对Ag001进行PCR扩增，并且预期的片段大小为约1.2kb。
图11：预测的RNase III突变体的PCR筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-6：HT115-Ae003-E38A突变体的PCR扩增；泳道7-14：HT115-E38A-ΔS33-ΔS34-ΔK35突变体的PCR扩增；泳道15-21：HT115-Ag001-E38A-R107A-R108A突变体的PCR扩增；泳道22-28：HT115-E30A突变体的PCR扩增；泳道29-35：HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34-K35V突变体的PCR扩增；泳道36-42：HT115-E38A-K12opt突变体的PCR扩增；泳道43-47：HT115-E117D的PCR扩增。
图12：预测的RNase III突变体的PCR筛选。泳道M：100bp DNA阶梯；泳道1-6：HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34突变体的PCR扩增；泳道7-12：HT115-E38A-ΔS33-R107A-R108A突变体的PCR扩增；泳道13-18：HT115-E38A-S33A-ΔS34-R107A-R108A突变体的PCR扩增；泳道19-24：HT115-Ag001-E38A突变体的PCR扩增；泳道25-30：HT115-Ae003-E38A-R107A-R108A突变体的PCR扩增；泳道31-36：HT115-E30A-K12opt突变体的PCR扩增；泳道37-42：HT115-E117Q突变体的PCR扩增；泳道43-48：HT115-Q153P突变体的PCR扩增；泳道49-54：HT115-D155E突变体的PCR扩增。
图13：Northern印迹，其揭示了23个核苷酸的小干扰RNA分子(上图)。
Figure BDA0002804897670000251
核酸染色的rRNA在RNA转移前用作凝胶中的装载对照(下图)。每孔装载共6μg的小RNA。泳道1：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒(TMV运动蛋白sRNA，并且特别是hpRNA)的HT115(DE3)(RNaseIII突变体)中提取的dsRNA，阴性对照；泳道2：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的JM109(宽型大肠杆菌)中提取的dsRNA，阴性对照；泳道3：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的JM109(宽型大肠杆菌)中提取的siRNA，阴性对照；泳道4：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSA中提取的siRNA；泳道5：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSASS中提取的siRNA；泳道6：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSA-ΔGPG中提取的siRNA；泳道7：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSASS-ΔGPG中提取的siRNA；泳道8：从预测的突变体HT115-E38A-R107A-R108A中提取的siRNA；泳道9：从预测的突变体HT115-E38A-R107E-R108E中提取的siRNA；泳道9：从预测的突变体HT115-Ec-ΔSASS-ΔGPG中提取的siRNA。
图14：Northern印迹，其揭示了小RNA核苷酸。每孔装载共5μg的RNA。泳道M：TMV运动蛋白基因特异性单链RNA标记，并且其由5个ssRNA组成：21、23、25、27和29个碱基。泳道1：TMV运动蛋白基因特异性单链RNA标记，21个碱基；泳道2-3：从宽型大肠杆菌JM109(DE3)中提取的总小RNA；泳道4-5：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的宽型大肠杆菌JM109(DE3)中提取的总小RNA；泳道6-7：从HT115-E38A-GHY7(在质粒中构建的RNaseIII E38A，用大肠杆菌K12菌株进行编码优化)中提取的总小RNA；泳道8-9：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的大肠杆菌E65A突变体中提取的总小RNA；泳道10-11：从HT115-E38A-R107A-R108A中提取的总小RNA。
图15：Northern印迹，其揭示了23个核苷酸的小干扰RNA分子(上图)。
Figure BDA0002804897670000261
核酸染色的rRNA用作RNA转移前凝胶中的装载对照(下图)。每孔装载6μg的总小RNA。泳道1：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒(TMV运动蛋白hpRNA)的E38A-L40F突变体中提取的siRNA，阳性对照；泳道2-3：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSA中提取的siRNA；泳道4-5：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSASS中提取的siRNA；泳道6-7：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSA-ΔGPG中提取的siRNA；泳道8-9：从预测的突变体HT115-E38A-ΔSASS-ΔGPG中提取的siRNA；泳道10-11：从预测的突变体HT115-E38A R107E-R108E中提取的siRNA。
图16：来自不同的大肠杆菌RNase III突变体的dsRNA切割的qRT-PCR。*表示P<0.05。HT115-pAD-WRKY-GHY7：含有pAD-WRKY-GHY7质粒的HT115菌株(对四环素和氯霉素有抗性)，并且其不能消化dsRNA；HT115-pAD-WRKY-GHY7-E38A：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A质粒的HT115菌株(对四环素和氯霉素有抗性)，并且E38A RNaseIII突变体可以将dsRNA消化成26-29bp的小RNA；与无法消化dsRNA分子的HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，这种菌株可以将几乎一半的dsRNA转化为小RNA；JM109-pAD-WRKY-GHY7：含有pAD-WRKY-GHY7质粒的JM109(DE3)RNase III E38A突变体(对氯霉素有抗性)，其可以将dsRNA切割成26-29bp的小RNA；与HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，这种菌株可以将几乎85％的dsRNA转化为小RNA；HT115-E38A-R107A-R108A：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A-R107A-R108A质粒的HT115菌株(对四环素和氯霉素有抗性)，并且其可以将dsRNA有效地切割成22-23bp的小RNA；与HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，其可以将几乎95％的dsRNA转化为小RNA；HT115-E38A-R107E-R108E：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A-R107E-R108E质粒的HT115菌株(对四环素和氯霉素有抗性)，并且其可以将dsRNA切割成26-29bp的小RNA，并且与HT115-pAD-WRKY-GHY7-E38A相比，可以将几乎80％的dsRNA转化为小RNA。
图17：Northern印迹，其揭示了23个核苷酸的小干扰RNA分子(上图)。
Figure BDA0002804897670000271
核酸染色的RNA指示在RNA转移之前凝胶中的RNA条带。每孔装载12μg的总小RNA。使用与dsRNALadder(NEB)混合的18nM的TMV运动蛋白基因特异性DNA引物(21nt)来指示21nt。泳道1-2：从HT115-E38A(RNase III突变体，用大肠杆菌K12菌株进行编码优化)中提取的总siRNA，阳性对照；泳道3-4：从HT115-Ae003-E38A中提取的总siRNA，并且这是为了检查肠杆菌RNaseIII E38A突变体是否显示出与大肠杆菌菌株类似的dsRNA切割；泳道5-6：从HT115-Ag001-E38A-R107A-R108A中提取的总siRNA，并且这是为了检查该突变体是否显示出与大肠杆菌E38A-R107A-R108A突变体类似的dsRNA切割；泳道7：从HT115-Ag001-E38A-R86C-R107A-R108A中提取的总siRNA，并且这是为了检查该突变体是否显示出与大肠杆菌E38A-R107A-R108A突变体类似的dsRNA裂解；泳道8：从HT115-ver-E30A中提取的总siRNA，疣微菌门细菌(Verrucomicrobia bacterium)E30A RNase III突变体，dsRNA切割被认为与大肠杆菌E38A突变体相似；泳道9-10：从预测的突变体HT115-E38A-ΔS33-ΔS34-ΔK35中提取的总siRNA；泳道11-12：从预测的突变体HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34-K35中提取的总siRNA；泳道13：从宽型细菌菌株JM109(DE3)中提取的总siRNA，阴性对照；泳道14：从RNaseIII突变体HT115(DE3)中提取的总siRNA，阴性对照。
图18：Northern印迹，其揭示了22-23个核苷酸的小干扰RNA分子。每孔装载12μg的总小RNA。与dsRNA Ladder(NEB)混合的6nM的TMV运动蛋白基因特异性DNA引物(21nt)用于指示21nt。泳道1-2：从预测的突变体HT115-Ec-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34中提取的总siRNA；泳道3-4：从预测的突变体HT115-Ec-E38A-ΔS33-R107A-R108A中提取的总siRNA；泳道5-6：从预测的突变体HT115-Ec-E38A-S33A-ΔS34-R107A-R108A中提取的总siRNA；泳道7-8：从Ag001-E38A中提取的总siRNA，并且该突变体产生26-29nt的siRNA；这是为了检查该突变体是否显示出与大肠杆菌Ec-E38A突变体类似的dsRNA切割；泳道9-10：从HT115-Ae003-E38A-R107A-R108A中提取的总siRNA，并且该突变体产生22-23nt的siRNA；这是为了检查该突变体是否显示出与大肠杆菌E38A-R107A-R108A突变体类似的dsRNA切割；泳道11-12：从HT115-ver-E30A-K12opt中提取的总siRNA，HT115-ver-E30A-K12opt是疣微菌门细菌E30A RNase III突变体，具有编码优化。
图19：基于WT超嗜热菌(A.aeolicus)RNase III(浅绿色和青色卡通)的晶体结构的WT大肠杆菌RNase III二聚体(绿色和蓝色卡通)的同源性模型。结合的dsRNA在中心显示为橙色卡通。注意到大肠杆菌模型与超嗜热菌的高的结构重叠，特别是在二级结构元素(α-螺旋和β-折叠)处。为了清楚起见，未示出结合的镁离子。
图20：WT大肠杆菌RNase III二聚体(绿色和蓝色卡通)的同源性模型中的结合界面的特写。结合的dsRNA显示为橙色卡通。来自一种单体的E38和来自另一单体的E65显示为棒。两个阴离子侧链的羧基基团都指向结合的dsRNA的带负电荷的主链，这可以导致结合界面处的静电排斥。黄色虚线给出了每条侧链与dsRNA主链之间的距离(以埃为单位)。注意到，E65侧链被定位成更靠近dsRNA主链。为了清楚起见，未示出结合的镁离子。
图21：大肠杆菌RNase III的预测的dsRNA结合自由能与其切割效率之间的相关性(基于对齐的sRNA读数的比例的实验测量值)。左图示出了在两个轴上使用非相对值的相关性(y轴在此处给出ΔG结合)，而右图给出了当两个轴相对于WT值获取时的相应相关性(y轴在此处给出了相对于WT的ΔΔG结合)。蓝色方块代表单个实验测量的数据点(参见表1)；这些数据点的点突变用黑色文本显示在右边。在两个图中计算这些数据点的趋势线，其中在每个图的左下角给出线性拟合的R2。注意到在两个图中观察到的高的线性相关性。橙色菱形代表对仍在测试的特定RNase III突变体的预测；这些构建体的点突变以红色文本在右边给出。
图22：沿dsRNA靶通过26nt分离的两个大肠杆菌WT RNase III二聚体(绿色和蓝色卡通)的结构模型。注意到，在这种分离下，两个二聚体彼此之间没有显示出空间冲突，如通过在它们的范德华(即分子)表面之间没有任何重叠所指示的。黄色和红色RNA链表示26nt长的dsRNA裂解产物，而白色RNA链表示dsRNA靶的其余部分。为了清楚起见，未示出结合的镁离子。
图23：沿dsRNA靶通过22nt分离的两个大肠杆菌E38A/R107A/R108A突变体RNaseIII二聚体(绿色和蓝色卡通)的结构模型。注意到，在这种分离下，两个二聚体彼此之间没有显示出空间冲突，如通过在它们的范德华(即分子)表面之间没有任何重叠所指示的。黄色和红色RNA链表示22nt长的dsRNA裂解产物，而白色RNA链表示dsRNA靶的其余部分。为了清楚起见，未示出结合的镁离子。
图24A-B：多个RNase III突变体的sRNA 18nt-30nt(固定的Y)的大小分布。
图25：sRNA 18nt-30nt的GHY7构建体的覆盖映射。
图26：每个样品中sRNA群体的无约束分类。
图27：sRNA群体的香农多样性(Shannon Diversity)指数得分。
图28：揭示了小RNA核苷酸的Northern印迹。每孔装载6μg的总小RNA。泳道M：TMV运动蛋白基因特异性单链RNA标记，并且其由5个ssRNA组成：21、23、25、27和29个碱基。泳道1：TMV运动蛋白基因特异性单链RNA标记，21碱基；泳道2：从HT115-E38A-R107A-R108A中提取的总小RNA，并且装载5μg；泳道3：从HT115-Bc-E58A中提取的总小RNA；泳道4：从HT115-Bs-E59A中提取的总小RNA；泳道5：从HT115-Ec-E117D中提取的总小RNA；泳道6：从HT115-Ec-E117Q中提取的总小RNA；泳道7：从HT115-Ec-Q153P中提取的总小RNA；泳道8：从HT115-Ec-D155E中提取的总小RNA；泳道9：从HT115-Bc-E138K中提取的总小RNA；泳道10：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的大肠杆菌突变体E117K中提取的总小RNA；泳道11：从含有pAD-WRKY-GHY7质粒的大肠杆菌突变体E117K-L119中提取的总小RNA。
具体实施方式
提供以下详细描述以帮助本领域技术人员实施本公开的各种实施例，包括本文所述的所有方法、用途、组合物等。即使这样，以下详细描述也不应被解释为不适当地限制本公开，因为本领域普通技术人员可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下对本文所讨论的实施例进行修改和变化。下面更详细地解释本公开。本公开并不旨在成为其中可以实现本公开的实施例的所有不同方式的详细目录，或者不是可以被添加到当前实施例的所有特征的详细目录。例如，关于一个实施例示出的特征可以被并入到其他实施例中，并且关于特定实施例示出的特征可以从该实施例中删除。此外，根据本公开，对于本文中所建议的各种实施例的多种变化和添加对于本领域技术人员将是显而易见的，这些变化和添加不脱离本公开的范围。因此，以下说明书旨在说明本公开的一些特定实施例，而不是穷尽性地指定其所有排列、组合和变形。
如图所示，在一个实施例中，本文鉴定的RNase III蛋白中的突变可以导致RNaseIII切割模式的稳定，从而导致更一致的dsRNA切割。如本文中所使用的，术语一致的dsRNA切割通常是指RNase III突变体蛋白产生相对更多的特定大小的sRNA产物和相对更少的不期望的脱靶大小的sRNA的能力。这可以通过有效地缩小sRNA在特定峰附近的群体中的分布来证明，通常如图24和表7所示。本发明人已经证明，该“一致的dsRNA切割”效应也通过每次切割时不随机地移动蛋白质的切割“阶梯”而导致sRNA的更一致的切割轮廓，如在更宽的sRNA尺寸分布中预期出现的，诸如来自野生型RNase III或DICER的sRNA尺寸分布。这些因素的最终结果是在最终异源sRNA群体中更可预测的切割和基于序列的最终产物，可测量为群体多样性的减少。
在另一个实施例中，本发明人证明目前的文献可能将E38A误解为切割优选的23nt模式的突变体RNase III。Xiao等人最初表征了由E38A突变体切割的dsRNA更倾向于产生23nt的sRNA(Xiao等人，2009)。这一发现是基于northern分析技术缺乏足够的分辨率来准确地将片段大小称为特定的碱基对(Doran等人，1999)。现代测序技术可以通过观察sRNA读数的实际序列来获得准确的长度，从而极大地改善大小评估。
本发明人使用如在sRNA分析方法中概述的Illumina Hi-Seq平台进行了高通量sRNA测序。如图24中所示，本发明人确定E38A的优选的切割长度实际上是26nt。E38A的大小分布实际上与野生型的大小分布非常相似，其中峰值位于26nt。然而，野生型在29nt处具有另一个峰，在E38A中则不常见。
如图25中进一步所示，沿来自烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus)(TMV)GHY7dsRNA序列的示例性sRNA的优选的切割位置也与野生型(JM109)的切割位置非常相似。E38A和野生型中的sRNA的群体在成对分析(通过DMRT)中没有显著差异。然而，当与野生型相比时，E38A在18–30nt范围内的sRNA的相对丰度方面确实显著不同(DMRT，stat＝2.19，p＝0.014)。这些发现表明，E38A不是主要在23nt处进行离散切割，而是充当催化效率突变体，产生比野生型大约3倍的sRNA，如表5所示。同样如图20所示，突变E38A将强负残基变为疏水残基，这可能增加与dsRNA的结合亲和力。如图21中进一步所示，使用MM-GBSA计算技术对结合自由能的估计确实表明突变E38A导致RNase III二聚体更稳定地结合到dsRNA(与WT相比)。
如通常在图22中所示出的，在dsRNA靶上的两个大肠杆菌WT RNase III二聚体的结构模型表明，在26nt的分离的情况下，两个RNase III分离足够远，以至于不会引起空间冲突，并且因此不会相互干扰。当通过23nt分离时，结构模型也显示出在RNase III二聚体之间没有空间冲突。
本发明人进一步证明了新的RNase III突变体E65A比E38A和野生型RNase III具有更高的催化效率。通常参考图20，RNase III的E38和E65残基在与dsRNA结合的RNase III蛋白质单体的二聚体形成中是相邻的。经验数据表明，E65A在产生sRNA方面明显比JM109野生型(DMRT，stat＝3.3，p<0.01)和E38A(KW，stat＝3.9，p＝0.049)更有效。如下表5所示，RNase III E65A突变体的催化效率比野生型高约4.4倍，并且比E38A高约1.5倍。催化效率的提高可能是由于与RNase III突变体E38A中看到的dsRNA结合亲和力增强相似的机制。如图20所示，E65侧链被定位成更靠近dsRNA主链(与E38-dsRNA距离相比)，并且因此突变E65A可能比E38A突变更能降低结合界面处的静电排斥力。如图21所示，使用MM-GBSA计算技术的结合自由能的估计确实表明，与E38A和WT相比，突变E65A导致RNase III二聚体更稳定地结合至dsRNA。
在另一个实施例中，本发明人证明了与野生型(JM109)相比，新的RNase III突变体E38A-R107A-R108A具有增加的催化效率和差异离散切割。本发明人使用本文概述的方法进行sRNA分析。RNase III突变体E38A-R107A-R108A产生与野生型相比显著不同的sRNA产物的相对丰度(KW，stat 3.86，p＝0.049)。如表5所示，与野生型(JM109)相比，增加了约2.7倍。如表6中进一步示出的，在PERMANOVA和ANOSIM测试中，在测试的突变体与野生型之间sRNA群体显著不同。如图26所示，NMDS分析表明RNase III突变体E38A-R107A-R108A中的sRNA群体与其他测试的突变体和野生型有多大差异。这种情况的主要原因之一是sRNA产物重新分布到几乎唯一的22nt和23nt的sRNA中，如图24所示。此外，这表示sRNA产物多样性的降低(参见图27)，或者22nt和23nt的大小的sRNA产物的更加同质的混合物。RNase III突变体E38A-R107A-R108A最终导致以更高的数量、RNAi技术所需性状的差异大小的产物更少。RNase III突变体E38A-R107A-R108A中sRNA群体的多样性与E38A(DMRT，stat＝2.04，p<0.0208)和JM109野生型(DMRT，stat＝3.06，p<0.01)显著不同。
如图21进一步证明的，使用MM-GBSA计算技术估算结合自由能表明，三重态突变E38A/R107A/R108A使RNase III二聚体更稳定地与dsRNA结合(与WT相比)。如图23进一步证明的，在dsRNA靶上两个大肠杆菌E38A/R107A/R108A突变体RNase III二聚体的结构模型表明，在22nt的分离的情况下，两个RNase III分离足够远，以至于不引起空间冲突，并且因此不彼此干扰。该观察结果通常进一步适用于23nt的稍远的分离。
RNase III突变体E38A-R107A-R108A的切割变化的进一步证据可以在沿GHY7构建体的切割模式或阶梯中示出。如图25所示，沿dsRNA构建体的峰区域或热点，虽然在E38A、E65A和JM109中相似，但在E38A-R107A-R108A中非常不同。
以与RNase III突变体E38A-R107A-R108A相同的方式测试另一个RNase III突变体E28A-R107E-R108E。根据northern分析，其能够切割dsRNA。然而，在RNA-seq分析中，其没有显示出与野生型的显著效率或切割模式/大小差异。在该RNase III E28A-R107E-R108E突变体中，两个精氨酸到谷氨酸的突变正在用静电排斥力代替静电吸引力，以使dsRNA结合不太稳定。事实上，如图21所示，使用MM-GBSA计算技术对结合自由能的估计表明，相对于E38A和E38A/R107A/R108A RNase III，三重态突变E38A/R107E/R108E导致RNase III二聚体与dsRNA结合的稳定性降低。
在另一个实施例中，本发明人证明RNase III突变体E38A-E65A关于E38A和E65A的催化作用是组合的。如图21所示，使用MM-GBSA计算技术对结合自由能的估计预测突变E38A/E65A导致RNase III二聚体更稳定地结合至dsRNA(与单独的E38A或单独的E65A相比)，尽管单个突变对增加结合自由能的贡献不是相加的(即，E38A/E65A的预测的结合自由能小于单独的E38A和单独的E65A的结合自由能之和)。结果，E38A/E65A突变体可能具有高催化效率，其中优选的dsRNA切割长度为26nt。
本发明人接下来测试了当R107A-R108A突变被添加到E38A时，四重态RNase III突变体E38A-E65A-R107A-R108A是否将预测的E38A-E65A的增强的催化效率与观察到的22-23nt的优选的切割长度相结合。令人惊讶的是，使用MM-GBSA计算技术对结合自由能的估计预测四重态RNase III突变体E38A-E65A-R107A-R108A导致RNase III二聚体与dsRNA结合不太稳定(与E38A或三重RNase III突变体E38A-R107A-E108A相比)，如图21所示。因此，四重态突变体也可以表现出22-23nt的优选的切割长度；在进行dsRNA的这种切割方面，其可能不如上述RNase III突变体E38A-R107A-R108A有效。
使用RNase III突变体E65A-R107A-R108A的独立MD模拟和分析的另外的测试表明，就预测的与dsRNA的结合自由能而言，该三重态突变体被预测为与WT相当(并且小于E38A、E38A-R107A-R108A，以及甚至E38A-R107E-R108E的结合自由能)(参见图21)。还应注意，E38A-E65A和E38A-E65A-R107A-R108A之间结合自由能的预测的变化与RNase III突变体E65A和E65A-R107A-R108A之间的变化相当(参见，例如图21)。因此，本发明人证明，与E38A不同，R107A-R108A与E65A有更多的结构对话，使得这些的组合导致降低的结合自由能，并且从而导致降低的催化效率。
如上所述，RNAi沉默机制通常依赖于大小为21-23nt的sRNA(Martinez和Richard2013,Zamore等人,2000)。如通常在图24和表7中所示，21nt的sRNA的产量在RNaseIII突变体E38A和E38A-R107A-R108A中相对相同，其中两者产生野生型产生的量的约1.5倍。然而，RNase III突变体E38A-R107A-R108A产生比单独的E38A多约6.5倍并且比野生型多约14倍的22nt的sRNA。本发明人进一步证明RNase III突变体E38A-R107A-R108A也产生比E38A多约10.5倍的23nt的sRNA和比野生型多约22.5倍的23nt的sRNA。
上述RNase III突变体中的每一个通常可以被称为“RNase III突变体”、“突变体”，或者通过其特定的氨基酸突变(即残基和位置)命名。
本发明的一个实施例包括用于使用RNase III突变体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。在一个优选的实施例中，本发明包括用于使用RNase III突变体以通过sRNA分子的产生和扩散控制宿主病原体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物，所述sRNA分子可以启动针对宿主病原体的RNAi途径应答。本发明的另一个实施例包括用于使用RNase III突变体来产生sRNA分子的系统、方法和组合物，其可以在体内、体外或离体完成。
本发明的另一个实施例包括用于使用RNase III突变体在宿主中产生DICER非依赖性RNAi应答来产生sRNA分子的系统、方法和组合物。在该实施例中，可以通过体内、体外或离体机制将本文所述的一种或多种RNase III突变体引入到宿主中。在优选的实施例中，细菌可以被转化成异源地表达根据根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的序列的一种或多种RNase III突变体。可以将此类RNase III突变体引入到来自病原体的dsRNA或者在所述细菌中共表达的针对必需病原体基因的dsRNA中。RNase III突变体可以产生增强水平的sRNA，其可以进一步扩散到宿主中并启动可以抑制病原体必需基因的表达的RNAi应答途径。
编码至少一种RNase III突变体的多核苷酸序列和/或编码针对必需病原体基因的dsRNA的多核苷酸序列可以可操作地连接至共享的或不同的启动子。编码至少一种RNaseIII突变体的多核苷酸序列和/或编码针对必需病原体基因的dsRNA的多核苷酸序列可以形成表达盒。此外，编码至少一种RNase III突变体的多核苷酸序列和/或编码针对必需病原体基因的dsRNA的多核苷酸序列可以形成可以转化靶细菌的载体。本领域普通技术人员通常已知细菌转化的方法。
本发明的另一个实施例包括用于使用RNase III突变体来高水平产生sRNA分子的系统、方法和组合物，所述RNase III突变体与野生型RNase III酶相比具有增强的催化活性。在一个优选的实施例中，具有增强的催化活性的RNase III突变体可以包括具有以下突变中的至少一种的RNase III突变体：
-根据SEQ ID NO.3-4的E38A(谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.5-6的E65A(谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A(谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.7-8的E38A-R107A-R108A(谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代)。
本发明的另一个实施例包括用于使用RNase III突变体来高水平产生sRNA分子的系统、方法和组合物，所述RNase III突变体与野生型RNase III相比具有增强的RNase III切割模式的稳定性，导致更一致的dsRNA切割，并且增加消化的sRNA的异源混合物中离散大小的sRNA的百分比。在一个优选的实施例中，具有增强的催化活性的RNase III突变体可以包括以下RNase III突变体：
-根据SEQ ID NO.3-4、9-10和13-14的E38A(谷氨酸在残基38被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.5-6的E65A(谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A(谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.7-8、11-12和15-16的E38A-R107A-R108A(谷氨酸在残基38被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代)。
本发明的另一个实施例包括在RNase III的N末端催化结构域中产生一系列的单/多氨基酸突变体，以产生离散大小的sRNA，其具有用作RNA沉默的触发物的潜力。在某些实施例中，来自肠杆菌科家族(诸如大肠杆菌和肠杆菌)以及来自芽孢杆菌科家族等的RNaseIII可以被工程化以包括一个或多个点突变，所述点突变提高了dsRNA切割的催化效率以及离散大小的sRNA的产生。本文特别考虑了来自这种另一个家族的RNase III同源物。另外的RNase III蛋白序列的示例可以包括肠道沙门菌(Uniprot ID：E7V351)、铜绿假单胞菌(Uniprot ID：B7UYX2)、贝氏考克斯菌(Uniprot ID：P51837)、荚膜红假单胞菌(UniprotID：Q52698)、天蓝色链霉菌(Uniprot ID：Q9ZBQ7)、空肠弯曲菌(NCBI参考序列：YP_001001278)、幽门螺杆菌(Uniprot ID：P56118)、金黄色葡萄球菌(Uniprot ID：P66668)和乳酸乳球菌(Uniprot ID：Q9CHD0)。(此类Uniprot序列是本领域普通技术人员所理解的，并且此类序列通过引用进一步并入本文)
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以在动物宿主中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在动物宿主中，并且优选地在共生或内共生细菌(诸如共生或内共生肠道细菌)中。示例性的动物，并且特别是哺乳动物宿主和动物病原体在表8-12和说明书中的其他部分提供。
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以在植物中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在植物宿主中，并且优选地在共生或内共生细菌(诸如内生细菌)中。示例性的植物宿主和植物病原体在表8-12和说明书中的其他部分提供。
本发明的另一个实施例可以包括通过在选择的共生细菌中表达根据SEQ IDNO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，将sRNA分子跨界转送至宿主，其可以在植物中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体在与植物宿主为天然共生体的细菌中共表达。在优选的实施例中，该天然共生体可以包括一种或多种内生细菌。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在植物宿主中。
本发明的另一个实施例可以包括通过在共生或内共生细菌中表达根据SEQ IDNO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，将sRNA分子跨界递送至宿主，其可以在动物宿主中触发RNA干扰(RNAi)途径应答。在该实施例中，例如，优选地针对选择的宿主病原体的必需基因的异源dsRNA可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体在与植物宿主为天然共生体的细菌中共表达。在优选的实施例中，该天然共生体可以包括一种或多种共生或内共生细菌，并且优选地肠道细菌。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导RNAi途径应答，优选地在动物宿主中。
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以产生离散大小的sRNA，从而可以在宿主中触发预防性RNAi途径应答。在该实施例中，例如，来自选择的病原体的dsRNA，并且优选地选择的宿主病原体的必需基因，可以与本文所述的一种或多种RNase III突变体共表达。在该实施例中，一种或多种RNase III突变体可以产生离散大小的sRNA，其可以诱导预防性RNAi途径应答，优选地在宿主中，其可以保护宿主免受选择的病原体的感染。
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达一种或多种RNase III突变体，其可以表现出导致更一致的dsRNA切割的增强的RNase III切割模式的稳定性，从而产生具有更大同质性的sRNA，使得与野生型或本领域中先前描述的其他RNase III突变体相比，产生的sRNA表现出更大的大小一致性。
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以包括对产生离散大小的sRNA分子的大小偏好。在一个优选的实施例中，此类离散大小的sRNA可以是26-29nt和/或22-23。在一个优选的实施例中，由于改善的固定流扩散，由本文所述的一种或多种RNase III突变体产生的此类sRNA分子在宿主中表现出更大的nt大小和扩散的同质性。随着扩散的增加以及更一致大小的sRNA分子，在宿主中可能会触发更有效和更大扩散的RNAi应答。
本发明的另一个实施例可以包括在选择的细菌中表达本文所述的一种或多种RNase III突变体，其可以表现出增强的催化活性，从而与野生型或本领域中先前描述的其他RNase III突变体相比，产生更高量的sRNA，并且表现出增强的RNase III切割模式的稳定性，从而导致更一致的dsRNA切割。在优选的实施例中，根据SEQ ID NO.7-8的RNase III突变体可以在选择的细菌中表达，其可以显示出增强的22-23nt的离散大小的sRNA分子的产生，以及增强的sRNA分子生产的催化速率。
本发明的另一个实施例可以包括用于高水平生产sRNA分子的系统、方法和组合物。在本发明的一个优选的实施例中，可以包括用于在DICER非依赖性原核系统中高水平生产sRNA分子的系统、方法和组合物。在本优选的实施例中，细菌可以被遗传修饰，以异源性地表达一种或多种RNase III突变体，以及优选地根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的RNase III突变体，其可以以DICER非依赖性方式产生sRNA。遗传修饰的细菌可以进一步共表达靶dsRNA分子，优选地针对病原体、害虫或食草动物的必需基因。这些遗传修饰的细菌可以在发酵罐或本领域中已知的其他工业生产系统中生长。靶dsRNA分子可以通过异源性表达的RNase III突变体被转化为离散大小的sRNA分子。这些sRNA分子可以如上所述产生，并且然后进一步分离，而在其他实施例中，可以分离或收获含有sRNA分子的细菌用于后续使用，诸如应用/施用至植物或动物。
本发明的另一个实施例可以包括组合物，该组合物包括有一定量的sRNA分子或细菌，所述细菌含有由RNase III突变体并且优选地根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的RNase III突变体产生的sRNA分子。此类组合物可以包括可以施用和/或应用于宿主(诸如植物或动物宿主)的组合物。实例可以包括药物组合物、局部组合物、包封组合物、凝胶组合物、喷雾组合物等。本发明的另一个实施例可以包括此类sRNA分子组合物用于治疗和/或预防宿主中由病原体引起的疾病病症的用途。本发明的另一个实施例可以包括此类sRNA分子组合物用于治疗、预防或杀死可能消耗宿主(优选地植物宿主)的害虫的用途。
本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ IDNO.3、5、7、9、11、13和15的进一步与启动子可操作地连接的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸作为表达盒。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸作为可以用于转化细菌或其他生物的载体。
本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸，以及编码针对宿主病原体中必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸，如在表8-12中通常所鉴定的。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸以及编码针对宿主病原体中必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸，其中每个序列与启动子可操作地连接。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸以及编码针对宿主病原体中的必需基因的一种或多种dsRNA多核苷酸作为表达盒。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸以及编码针对宿主病原体中必需基因的一种或多种dsRNA的多核苷酸作为可以用于转化细菌或其他生物的载体。
本发明的另一个实施例包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以表达根据SEQID NO.4、6、8、10、12、14、16和17的一种或多种RNase III突变体的多肽的系统和方法。本发明的另一个实施例包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以共表达根据SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16和17的一种或多种RNase III突变体的多肽和编码针对宿主病原体中必需基因的一种或多种dsRNA的多肽(例如表8-12中所鉴定的)的系统和方法。
本发明的另一个实施例包括对靶生物(诸如靶细菌)进行遗传修饰以表达根据SEQID NO.4、6、8、10、12、14、16和17的一种或多种RNase III突变体的多肽的系统和方法。转化细菌的方法通常是本领域普通技术人员已知的。
本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16和17的一种或多种RNase III突变体的分离的多肽。本发明的另一个实施例可以包括编码根据SEQID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的分离的多核苷酸。在一个优选的实施例中，编码根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体的多核苷酸可以作为质粒构建体的一部分被分离。
另一个实施例可以包括用根据SEQ ID NO.3、5、7、9、11、13和15的一种或多种RNase III突变体稳定转化植物或细菌。另一个实施例可以包括稳定转化植物或细菌，其表达根据SEQ ID NO.4、6、8、10、12、14、16和17的一种或多种RNase III突变体。
本发明的另一个实施例可以包括在RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是细菌RNase III。本发明的另一个实施例可以包括在来自大肠杆菌的RNase III(优选地根据SEQ ID NO.3-8和17)中产生一系列的单/多氨基酸突变体。在一个实施例中，来自大肠杆菌的RNase III可以是根据多核苷酸序列SEQ ID NO.1和/或氨基酸序列SEQ ID NO.2。
本发明的另一个实施例可以包括在来自肠杆菌科的RNase III(优选地根据SEQID NO.9-12)中产生一系列的单/多氨基酸突变体。本发明的另一个实施例可以包括在来自肠杆菌科的RNase III(优选地根据SEQ ID NO.13-16)中产生一系列的单/多氨基酸突变体。本发明的另一个实施例可以包括在RNase III中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是本文所述的RNase III的同源物。本发明的另一个实施例可以包括在RNaseIII中产生一系列的单/多氨基酸突变体，其中RNase III是本文所述的RNase III的直向同源物。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中转化和/或表达E38A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A RNaseIII突变体，其中RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中共表达E38A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个实施例可以包括产生E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中转化和/或表达E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E65A RNaseIII突变体，其中RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中共表达E65A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNaseIII突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-E65A RNase III突变体，其中RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中共表达E38A-E65A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括在与靶宿主共生或内共生的细菌中转化和/或表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中RNase III突变体产生被递送至靶宿主并诱导RNAi途径应答的sRNA。本发明的另一个实施例可以包括在细菌中共表达E38A-R107A-R108A RNase III突变体和针对靶宿主中的必需病原体基因的dsRNA。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A RNase III突变体，其具有产生26和29nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个实施例可以包括产生具有改善的催化效率的E38ARNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.3-4、13-14和9-10的E38A RNase III突变体。
本发明的另一个实施例可以包括产生E65A RNase III突变体，其具有产生26和29nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个实施例可以包括产生具有改善的催化效率的E65ARNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.5-6的E65A RNaseIII突变体。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A-E65A RNase III突变体，其具有产生26和29nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个实施例可以包括产生具有改善的催化效率的E38A-E65A RNase III突变体。本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.17的E65A RNase III突变体。
本发明的另一个实施例可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其具有产生22和23nt的sRNA的大小偏好。本发明的另一个实施例可以包括产生E38A-R107A-R108A RNase III突变体，该突变体具有改善的催化效率和对22和23nt的sRNA的增强的dsRNA切割特异性。本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.7-8、11-12和15-16的E65A RNase III突变体。
本发明的另一个实施例可以包括产生一种或多种RNase III突变体，其可以在细菌中表达并产生可以被进一步分离的sRNA。在一个优选的实施例中，本发明可以包括产生RNase III突变体，其可以在细菌中表达并产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的sRNA。
本发明的另一个实施例可以包括产生一种或多种RNase III突变体，其可以在被配置为将sRNA递送至宿主的细菌中表达。在一个优选的实施例中，本发明可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的RNase III突变体，其可以在被配置为将sRNA递送至宿主并启动DICER非依赖性RNAi途径应答的细菌中表达。
本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以与针对必需病原体基因的dsRNA(优选地针对宿主的共生和/或内共生细菌)共表达。在该实施例中，RNase III突变体可以从共表达的dsRNA中产生sRNA，并将sRNA递送至宿主，从而启动RNAi途径应答。
本发明的另一个实施例可以包括产生根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的一种或多种RNase III突变体，其可以与针对必需害虫基因的dsRNA(优选地针对宿主的共生和/或内共生细菌)共表达。在该实施例中，RNase III突变体可以从共表达的dsRNA中产生sRNA，并将sRNA递送给宿主，从而在消耗宿主(优选地植物)的害虫中启动RNAi途径应答。
在另一个实施例中，本发明人可以产生被整合到细菌染色体中的RNase III突变体。在优选的实施例中，RNase III突变体可以包括但不限于：
-根据SEQ ID NO.3-4、9-10和13-14的E38A(谷氨酸在残基38被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.5-6的E65A(谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A(谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代)；
-根据SEQ ID NO.7-8、11-12和15-16的E38A-R107A-R108A(谷氨酸在残基38被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代)。
在优选的实施例中，根据SEQ ID NO.3-17或37-40和55-58的RNase III突变体可以被整合到细菌染色体中并被表达。
在进一步的方面中，本发明包括施用治疗有效量的一种或多种遗传修饰的细菌的方法，所述细菌表达异源RNase III突变体和针对通常如上所述的必需病原体基因的dsRNA。
为了帮助读者理解本公开的各个方面，提供以下定义。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。
如在本文中和在所附的权利要求中所使用的，单数形式“一(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括复数指代物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种植物”包括多种此类植物；提及“一种细胞”包括一种或多种细胞以及本领域技术人员已知的其等同物，等等。类似地，词语“或”旨在包括“和”，除非上下文另有明确规定。因此，“包含A或B”是指包括A、或B、或者A和B。此外，术语“包括(including)”以及其他相关形式(诸如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不是限制性的。
如本文中使用的术语“约”是灵活的词语，其含义类似于“大约”或“接近”。术语“约”表示不要求精确，而是预期的变化。因此，如本文中所使用的，术语“约”是指在与具体列举的值的1或2个标准偏差之内，或者与具体列举的值相比，±高达20％、高达15％、高达10％、高达5％、或高达4％、3％、2％或1％的范围内。
如在本文的权利要求中使用的术语“包含”是开放式的，并且意味着权利要求必须具有其中具体列举的所有特征，但是对没有列举的附加特征没有限制。术语“包含”使得权利要求开放以用于包括未指明的成分，即使是以主要量。权利要求中的术语“基本上由……组成”是指本发明必须包括列出的成分，并且对未列出的成分开放，所述未列出的成分不会对本发明的基本和新颖的性质产生实质性影响。“基本上由……组成”权利要求位于以封闭的“由……组成”格式撰写的封闭式权利要求和以“包含”格式撰写的完全开放式权利要求之间的中间地带。如果并且当这可能变得必要时，这些术语可以在本文中互换使用。此外，术语“包括”以及其他相关形式(诸如“包括”和“包括”)的使用不是限制性的。值得注意的是，在本申请的说明书或其他部分提到多核苷酸序列的情况下，它也可以指相应的蛋白质序列，并且反之亦然。
术语“衍生的”是指被突变以产生RNase III突变体的RNase III。术语“饲养”是指将表达RNase III突变体的细菌引入到动物中，例如直接引入，或者通过注入有细菌或其他细胞的饲料引入。
“RNase III”是指一种天然存在的酶或其重组形式。dsRNA特异性核酸内切酶的RNase III家族的特征在于在其催化中心中存在高度保守的9个氨基酸区段(amino acidstretch)，其被称为RNase III特征基序。突变体和衍生物包括在定义中。本文所述的细菌RNase III在哺乳动物细胞中实现沉默的实用性进一步支持了在本实施例中基于共同特征共有序列的存在使用来自真核生物、原核生物病毒或古细菌的RNase。突变体的名称由特定RNase III分离物中的氨基酸位置指定。这些氨基酸位置在来自不同来源的RNase III酶之间可能有所不同。例如，大肠杆菌中的E38对应于超嗜热菌中的E37。大肠杆菌中的位置E38和超嗜热菌中的位置E37对应于上述共有序列的第一个氨基酸位置，并且通过将来自公共数据库的RNase III氨基酸序列按照其共有序列进行比对来确定。本发明的实施例并不旨在局限于实际的数字名称。优选的实施例是指RNase III共有序列中氨基酸的相对位置。特别地，本发明包括残基38、65、107和108以及它们在各种同源细菌RNase III蛋白或同源物中的相应残基。
RNase III中的突变是指点突变、添加、缺失(尽管优选地不在切割结构域中)和重排(优选地在结构域连接区域中)中的任何一种。突变可以在RNase III蛋白的单个位点或多个位点处。可以通过标准技术(包括随机诱变、靶向遗传学和本领域普通技术人员已知的其他方法)来产生突变。
根据本发明，“sRNA”是小RNA，特别是长度为200个核苷酸或更短的RNA，其不被翻译成蛋白质。sRNA可以是被本文所述的一种或多种RNase III突变体消化的RNA分子。sRNA可以包括siRNA、mRNA，或者甚至dsRNA分子，这些分子可能是由RNAi途径响应产生或启动RNAi途径响应，这可能导致靶基因的下调。“RNAi”是指通过引入双链RNA分子诱导的基因下调或抑制。
在本发明的又其他实施例中，RNAi对一种或多种病原体基因产物的表达的抑制可以通过dsRNA介导的RNAi作用和/或被称为发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰的dsRNA形式获得。对于hpRNA干扰，表达盒被设计成表达与其自身杂交以形成发夹结构的RNA分子，所述发夹结构包含单链环区域和碱基配对的茎。碱基配对的茎区域包含对应于编码其表达被抑制的基因产物的全部或部分内源信使RNA的有义序列，在这种情况下，是本文所述的病原体必需基因，以及与有义序列完全或部分互补的反义序列。可替代地，碱基配对的茎区域可以对应于控制编码待抑制的靶多肽的基因的表达的启动子序列的一部分。因此，分子的碱基配对的茎区域通常决定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源基因的表达方面非常有效，并且它们诱导的RNA干扰被随后几代植物遗传。参见，例如，Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4985-4990；Stoutjesdijk等人.(2002)Plant Physiol.129:1723-1731；和Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38。用于使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因的表达的方法描述在例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:4985-4990；Stoutjesdijk等人.(2002)Plant Physiol.129:1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38；Pandolfini等人.BMC Biotechnology 3:7和U.S.Patent PublicationNo.20030175965中；其每一个通过引用并入本文。用于体内沉默基因表达的hpRNA构建体的效率的瞬时测定已经由Panstruga等人.(2003)Mol.Biol.Rep.30:135-140(其通过引用并入本文)描述。
对于ihpRNA，干扰分子与hpRNA具有相同的一般结构，但RNA分子还包含内含子，该内含子能够被剪接在其中表达ihpRNA的细胞中。内含子的使用使剪接后发夹RNA分子中环的大小最小化，并且这提高了干扰的效率。参见，例如，Smith等人(2000)Nature 407:319-320。实际上，Smith等人示出了使用ihpRNA介导的干扰对内源基因表达的100％抑制。用于使用ihpRNA干扰来抑制内源性植物基因的表达的方法在例如Smith等人.(2000)Nature407:319-320；Wesley等人.(2001)Plant J 27:581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5:146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4:29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods 30:289-295和美国专利公开第20030180945号中描述，其每一个均通过引用并入本文。
术语“基因”或“基因序列”是指可操作地连接至能够以某种方式调节基因产物(例如多肽或功能性RNA)的表达的合适的调节序列的编码区。基因包括在编码区(开放阅读框，ORF)之前(上游)和之后(下游)的未翻译的DNA的调节区(例如，启动子、增强子、阻遏物等)，以及在适当的情况下，在单独的编码区(即外显子)之间的插入序列(即内含子)。如本文中所使用的，术语“结构基因”旨在意味着被转录成mRNA的DNA序列，其然后被翻译成特定多肽的特征性氨基酸序列。
如本文中所使用的，“抑制(inhibit、inhibition、suppress)”、“下调”或“沉默”是指通过靶向抑制细胞中的基因表达而部分或完全丧失功能，并且也可以被称为“敲除”，优选地通过RNAi途径应答。根据环境和要解决的生物学问题，部分地减少基因表达可能是优选的。可替代地，可能期望尽可能减少基因表达。沉默的程度可以通过本领域中已知的任何方法来确定，其中一些方法在国际公布第WO 99/32619号(其通过引用并入本文)中总结。如本文中所使用的，“抑制”、“下调”或“沉默”药剂的水平或活性，诸如例如由靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其编码的蛋白质产物的水平或活性，意味着相对于缺乏本公开的dsRNA分子的细胞或生物体，该量以10％或更多，例如20％或更多，优选地30％或更多，更优选地50％或更多，甚至更优选地70％或更多，最优选地80％或更多，例如90％减少。
“大双链RNA”是指具有大于约40个碱基对(bp)(例如大于100bp或更大，特别是大于300bp)的双链区域的任何dsRNA或发夹。大dsRNA的序列可以代表一个或多个mRNA的一个或多个区段或整个mRNA。大dsRNA的最大大小在本文中不受限制。dsRNA可以包括修饰的碱基，其中所述修饰可以是对磷酸糖主链或核苷酸的修饰。此类修饰可以包括氮或硫杂原子或本领域中已知的任何其他修饰。dsRNA可以通过重组技术和/或通过化学合成或使用商业试剂盒(诸如，
Figure BDA0002804897670000441
(安比昂(Ambion)，奥斯汀，德克萨斯州))和本领域中已知的方法酶促地制备。本发明的实施例利用HiScribeTM(新英格兰生物学实验室公司(NewEngland Biolabs,Inc.)，比佛利，马萨诸塞州)制备大dsRNA。用于制备和储存大dsRNA的其他方法在国际公开号WO 99/32619中描述。双链结构可以由自身互补的RNA链(诸如发夹或微小RNA)来形成，或者通过两条不同的互补RNA链的退火来形成。
如本文中所使用的，“野生型”是指不包含异源重组DNA的细胞或生物，所述异源重组DNA表达赋予如本文所述的增强的性状的蛋白质或元件。
“表达(expression或expressing)”是指功能产物的产生，诸如从引入的构建体、内源DNA序列或稳定掺入的异源DNA序列产生RNA转录物。核苷酸编码序列可以包含插入序列(例如，反式)或可以缺少此类插入非翻译序列(例如，如在cDNA中)。表达的基因包括被转录成mRNA并且然后被翻译成蛋白质的基因以及被转录成RNA但未被翻译的基因(例如siRNA、转移RNA和核糖体RNA)。该术语还可以指由任何上述DNA前体产生的mRNA产生的多肽。因此，核酸片段(诸如基因或基因的启动子区域)的表达可以指核酸片段的转录(例如，导致mRNA或其他功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白(多肽)，或两者。
“表达盒”或“表达载体”或“载体”是指核酸构建体，当其被引入到宿主细胞中时，其分别导致RNA或多肽的转录和/或翻译。更具体地，术语“载体”是指可以将DNA、RNA、蛋白质或多肽引入到宿主中的一些手段(means)。待引入到宿主中的多核苷酸、蛋白质和多肽本质上可以是治疗性或预防性的；可以编码或可以是抗原；本质上可以是调控性的等。存在各种类型的载体，包括病毒、质粒、噬菌体、粘粒和细菌。再次，更具体地，“表达载体”是能够在选择的宿主细胞或生物体中复制的核酸。表达载体可以作为自主结构复制，或者可替代地可以全部或部分整合到宿主细胞染色体或细胞器的核酸中，或者用作将外来DNA递送至细胞的穿梭器，并且因此与宿主细胞基因组一起复制。因此，表达载体是能够在选择的宿主细胞、细胞器或生物体中复制的多核苷酸，例如质粒、病毒、人工染色体、核酸片段，并且对于其表达载体上的某些基因(包括目标基因)在细胞、细胞器或生物体内被转录并翻译成多肽或蛋白质；或本领域中已知的任何合适的构建体，其包含“表达盒”。相反，如本文实施例中所述，“盒”是包含本发明的表达载体的一部分的多核苷酸。盒的使用有助于表达载体的组装。表达载体是复制子(诸如质粒、噬菌体、病毒、嵌合病毒或粘粒)，并且其包含可操作地连接至表达控制序列的所需的多核苷酸序列。当表达控制序列控制和调节多核苷酸序列的转录和/或翻译时，该多核苷酸序列可操作地连接至所述表达控制序列(例如，启动子和任选地增强子)。
术语“基因组”不仅包括在细胞核内发现的染色体DNA，而且还包括在细胞的亚细胞成分(例如线粒体、质体)内发现的细胞器DNA。如本文中所使用的，除非另外指出，否则术语“基因组”是指核基因组。
术语“异源的”是指对其周围环境来说是外来的核酸片段或蛋白质。在核酸片段的情况下，这通常通过将衍生自一种来源的此类片段引入到不同的宿主中来实现。异源核酸片段(诸如已经被插入到宿主生物中的编码序列)通常未在宿主生物的遗传互补物中发现。如本文中所使用的，术语“异源的”还指源自相同生物但位于该生物的基因组内不同(例如非天然)位置的核酸片段。因此，生物体可以具有多于位于基因组中其(它们的)正常位置中的此类片段的通常数目的拷贝，并且此外在植物细胞的情况下，在细胞内的不同基因组内，例如在核基因组内以及在质体或线粒体基因组内也是如此。相对于其中其已插入或转移的生物体而言是异源的核酸片段有时被称为“转基因”。
“宿主细胞”是指含有表达载体并支持该载体的复制和/或表达的细胞。术语“引入”是指向细胞中提供核酸(例如，表达构建体)或蛋白质。“引入”包括提及将核酸掺入到真核细胞或原核细胞中，其中核酸可以掺入到细胞的基因组中，并且包括提及将核酸或蛋白质瞬时提供给细胞。“引入”包括提及稳定或短暂的转化方法以及有性杂交。因此，在将核酸片段(例如，重组DNA构建体/表达构建体)插入到细胞中的情况下，“引入”可以指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括提及将核酸片段掺入到真核细胞或原核细胞中，其中核酸片段可以被掺入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，被转化为自主复制子，或被瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
如本文中所使用的，“核酸”或“核苷酸序列”是指多核苷酸(或寡核苷酸)，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物，并且除非另有说明，否则包括具有天然核苷酸的基本本质的天然存在的和合成的核苷酸类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与互补的单链核酸杂交。核酸也可以包括片段和修饰的核苷酸序列。本文公开的核酸可以是天然存在的，例如基因组核酸，或者是分离的、纯化的、非基因组的核酸，包括合成产生的核酸序列，诸如通过固相化学寡核苷酸合成、酶促合成或通过重组方法产生的核酸序列，包括例如cDNA，在不同转基因植物中有效表达的密码子优化序列，反映了此类植物中密码子使用的模式；由于遗传密码的简并性而与本文公开的核苷酸序列不同但仍编码本文公开的目标蛋白质的核苷酸序列；编码目前公开的蛋白质的核苷酸序列，其包含不会对其正常活性产生不利影响的保守(或非保守)氨基酸取代；PCR扩增的核苷酸序列；以及本领域普通技术人员熟悉的其他非基因组形式的核苷酸序列。
“核酸构建体”或“构建体”是指可以被引入到宿主细胞(例如质粒)中的分离的多核苷酸。该构建体可以包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或修饰的核苷酸的任何组合。该构建体可以包含可以被引入到宿主细胞中并在宿主细胞中表达的表达盒。
“可操作地连接”是指元件的功能性排列。当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。控制元件不需要与编码序列相邻，只要它们起指导其表达的作用。因此，例如，插入的未翻译但转录的序列可以存在于启动子和编码序列之间，并且启动子仍然可以被认为与编码序列“可操作地连接”。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”用于指氨基酸残基的聚合物。这些术语特别是旨在涵盖天然存在的生物分子，以及重组或合成产生的生物分子，例如通过固相合成产生的生物分子。
术语“启动子”或“调节元件”是指位于转录起始的上游或下游的区域或核酸序列，并且其参与RNA聚合酶和/或其他蛋白质的识别和结合以启动RNA的转录。启动子不需要来自植物或藻类。例如，来源于植物病毒的启动子(诸如CaMV35S启动子)或来源于其他生物的启动子可以用于本文所讨论的实施例的变型中。可用于本方法的启动子包括，例如，组成型启动子、强启动子、弱启动子、组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子、种子特异性启动子、诱导型启动子、抑制型启动子和发育调节型启动子。用于基因抑制盒的合适的启动子的示例包括但不限于T7启动子、bla启动子、U6启动子、pol II启动子、Ell启动子和CMV启动子等。
“细胞类型特异性”启动子主要驱动一个或多个器官中某些细胞类型的表达。“诱导型”启动子可以是可能受环境控制或由次级分子或化合物诱导的启动子。组织特异性启动子、组织优选的启动子、细胞类型特异性启动子和诱导型启动子构成“非组成型”启动子的类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下或在大多数细胞或组织类型中可能是活性的启动子。
如本文中所使用的，术语“转化”或“遗传修饰”是指将一种或多种核酸分子转移到细胞中。当核酸分子变得被细菌稳定地复制时，微生物被转导到细菌中的核酸分子“转化”或“遗传修饰”。如本文中所使用的，术语“转化”或“遗传修饰的”涵盖可以将核酸分子引入到例如细菌中的所有技术。
如本文中所使用的，“遗传修饰的植物”或“转基因植物”是指其基因组已经通过掺入外源遗传物质，例如通过本文所述的转化而被改变的植物。术语“转基因植物”用于指从原始转化事件产生的植物，或来自转基因植物的后代或杂交后代，只要该后代在其基因组中包含外源遗传物质。“外源的”是指核酸分子(例如重组DNA)来源于其被引入到其中的植物的外部。外源核酸分子可以包含天然或非天然存在的DNA，并且可以来源于与其被引入到其中的植物物种相同或不同的植物物种。
“稳定的转化”旨在意味着将核苷酸构建体引入到宿主中并整合到植物的基因组中，并且能够由其后代遗传。核酸分子可以在细胞中瞬时表达或以功能形式不稳定地保持少于三个月，即瞬时表达。
可以用于本方法中的术语“植物(plant或plants)”广泛地包括适于转化技术的高等和低等植物的类别，包括被子植物(单子叶植物和双子叶植物)、裸子植物、蕨类植物以及单细胞和多细胞藻类。术语“植物”还包括已经通过育种、诱变或基因工程化修饰的植物(转基因植物和非转基因植物)。它包括多种倍性水平的植物，包括非整倍体、多倍体、二倍体、单倍体和半合子。植物可以是任何形式，包括悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉、小孢子、全株、芽营养器官/结构(例如叶、茎和块茎)、根、花和花器官/结构、种子(包括胚、胚乳和种皮)和果实、植物组织(例如维管组织、地面组织等)和细胞及其后代。
术语“益生菌”是指一种微生物(诸如细菌)，其可以在宿主体内定居足够长的时间，以获得治疗或有效量的干扰RNA分子。益生菌可以包括内共生细菌，或者可以永久地或暂时地定居在动物(诸如水生生物)体内的天然存在的菌群。益生菌生物还可以包括藻类和真菌，诸如酵母。
本发明涵盖分离的或基本上纯化的RNase III突变体多核苷酸或氨基酸组合物。“分离的”或“纯化的”RNase III突变体多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分，大体上或基本上不含如在其天然存在的环境中发现的通常伴随RNase III突变体多核苷酸或蛋白质或与其相互作用的组分。因此，当通过重组技术生产时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质大体上不含其他细胞材料或培养基，或者当化学合成时，大体上不含化学前体或其他化学物质。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在多核苷酸来源的生物体的基因组DNA中天然位于多核苷酸侧面的序列(最佳地蛋白质编码序列)(即位于多核苷酸的5’和3’末端的序列)。
“变体”或“同工型”或“蛋白质变体”是一组执行相同或相似生物学作用的相似蛋白质的成员。例如，所公开的RNase III多核苷酸的片段和变体以及由其编码的氨基酸序列也被本发明涵盖。“片段”是指多核苷酸的一部分或氨基酸序列的一部分。对于多核苷酸，变体包含在5’和/或3’末端具有缺失(即截短)的多核苷酸；在天然多核苷酸的一个或多个内部位点处缺失和/或添加一个或多个核苷酸；和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处取代一个或多个核苷酸。如本文中所使用的，“天然”或“野生型”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。通常，本文公开的特定RNase III的变体将与该特定多核苷酸具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所确定的。
本文公开的组合物还包含合成的寡核苷酸或编码RNase III突变体序列的核苷酸序列。合成序列是在实验室环境中产生或复制的序列。尽管核苷酸序列相对于亲本序列可能具有改变的核苷酸序列，但合成序列可能与天然存在的序列相同。然而，在这两种情况下，合成序列的结构被改变或不同于在从其自然环境中直接分离的序列中发现的结构。
如本文中所使用的，短语“宿主”是指携带致病病原体的生物体(诸如植物或动物)、易受致病病原体感染的生物体、其中成员携带致病病原体的生物体群体、或其中成员易受致病病原体感染的生物体群体。这些包括表8-12和其他地方列出的宿主。在一个实施例中，靶宿主可以是水生生物，并且优选地是在水产养殖中生长的生物。如本文中使用的术语“水产养殖”包括在受控的条件下养殖水生生物。如本文中所使用的，术语“水生生物”和/或“水生动物”包括在水(无论是淡水还是咸水)中生长的生物。水生生物/动物包括脊椎动物、无脊椎动物、节肢动物、鱼、软体动物，包括虾(例如，对虾、食用对虾(Penaeusesculentu)、白对虾(Penaeus setiferus)、细角对虾(Penaeus stylirostris)、西方对虾(Penaeus occidentalis)、日本对虾、南美白对虾(Penaeus vannamei)、斑节对虾(Penaeusmonodon)、中国对虾(Penaeus chinensis)、褐对虾(Penaeus aztecus)、桃红对虾(Penaeusduorarum)、印度对虾(Penaeus indicus)和墨吉对虾(Penaeus indicus)、加州对虾(Penaeus calif orniensis)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus)、斑节对虾、盐水虾、淡水虾等)、螃蟹、牡蛎、扇贝、虾蛤、软骨鱼(例如，海鲷、鳟鱼、鲈鱼、条纹鲈鱼、罗非鱼、鲶鱼、鲑科鱼、鲤鱼、鲶鱼、黄尾鱼、鲤鱼斑马鱼、红鼓鱼等)、甲壳纲动物等。虾也包括在水产养殖中饲养的虾。影响水生生物的示例性病原体可能包括白斑综合症(WSS)。
如本文中所使用的，“病原体”是指致病因子。这些包括表8-12和其他地方中包括的病原体。
“靶”或“必需基因”是指任何目标基因或mRNA。事实上，先前通过遗传学或通过测序鉴定的任何基因都可能代表靶。靶基因或mRNA可以包括发育基因和调节基因以及代谢或结构基因或编码酶的基因。靶基因可以在那些其中正在研究表型的细胞中表达，或者以直接或间接影响表型特征的方式在生物体中表达。靶基因可以是内源的或外源的。例如，“必需基因”可以是在病原体中存活、复制或致病性所必需的基因。此类细胞包括在成年或胚胎动物或植物体内的任何细胞，包括配子或任何分离的细胞，诸如在永生细胞系或原代细胞培养物中出现的细胞。
此外，术语“增强(enhance、enhanced)”、“增加(increase、increased)”或“改善(improved)”通常指统计学上显著的增加，例如在性状、表型或催化率方面。为了避免疑问，这些术语通常是指与对照值相比，给定的参数或值的约5％增加、约10％增加、约15％增加、约20％增加、约25％增加、约30％增加、约35％增加、约40％增加、约45％增加、约50％增加、约55％增加、约60％增加、约65％增加、约70％增加、约75％增加、约80％增加、约85％增加、约90％增加、约95％增加、约100％增加或更多。这些术语还涵盖由任何较低的指示值到任何较高的指示值组成的范围，例如“从约5％至约50％”等。
除非另有说明，否则在本说明书的文本中的核酸序列当从左至右读取时以5’至3’方向给出。核酸序列可以作为DNA或作为RNA提供，如所指定的；如本领域普通技术人员所已知的，一个的公开必然定义另一个，并且被理解为包括在适当的实施例中。核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。除非另有说明，否则氨基酸序列分别以从氨基到羧基的方向从左到右书写。氨基酸在本文中可以用它们通常已知的三个字母符号或用如相关领域技术人员通常理解的一个字母符号来指代。
关于所公开的范围，针对相同组分或性质的所有范围的端点是包括在内的并且是可独立组合的(例如，“约25％，或更优选地约5％至约20重量％的范围”包括端点和“约5％至约25％”的范围的所有中间值等)。说明书中引用的数字范围包括定义该范围的数字，并且包括定义的范围内的每个整数。
值得注意的是，公开的所有肽具体地包括具有保守氨基酸取代的肽。如本文中所使用的，“保守氨基酸取代”是指可以用某些氨基酸取代蛋白质结构中的其他氨基酸而不明显损失生物化学或生物学活性的表现。由于决定蛋白质的生物功能活性的是蛋白质的相互作用能力和性质，因此可以在蛋白质序列中进行某些氨基酸序列取代，并且当然可以在基础的DNA编码序列中进行取代，并且仍然获得具有相似性质的蛋白质。因此，可以在本文公开的氨基酸序列或在编码这些氨基酸序列的相应DNA序列中进行各种改变，而不会明显损失它们的生物学效用或活性。
以这种方式定义的氨基酸基团的示例包括：“带电荷的极性基团”，其由谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和组氨酸(His)组成；“芳香族或环状基团”，其由脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)组成；和“脂肪族基团”，其由甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和半胱氨酸(Cys)组成。
在每个组中，也可以鉴定亚组，例如，带电荷的极性氨基酸的基团可以被细分为由以下组成的亚组：“带正电荷的亚组”，其由Lys、Arg和His组成；“带负电荷的亚组”，其由Glu和Asp组成；“极性亚组”，其由Asn和Gin组成。芳族或环状基团可以被细分为由以下组成的亚组：“氮环亚组”，其由Pro、His和Trp组成；以及“苯基亚组”，其由Phe和Tyr组成。脂族基团可以细分为由以下组成的亚组：“大脂族非极性亚组”，其由Val、Leu和Ile组成；“脂肪族弱极性亚组”，其由Met、Ser、Thr和Cys组成；和“小残基亚组”，其由Gly和Ala组成。保守突变的示例包括上述亚组中氨基酸的取代，例如，用Lys取代Arg，并且反之亦然，使得可以保持正电荷；用Glu取代Asp，并且反之亦然，使得可以保持负电荷；用Ser取代Thr，使得可以保持游离的-OH；以及用Gin取代Asn，使得可以保持游离的-NH2。
在生物学功能上等同于本文公开的蛋白质和肽的蛋白质和肽包括在基本氨基酸序列中含有保守氨基酸变化的氨基酸序列。在此类氨基酸序列中，基本序列中的一个或多个氨基酸可以被例如另一个氨基酸取代，其电荷和极性类似于天然氨基酸的电荷和极性，即保守的氨基酸取代，导致沉默的变化。应该注意的是，存在在本领域中已经被开发的多种不同的分类系统以描述肽、多肽和蛋白质中氨基酸彼此之间的互换性。下面的讨论仅仅是这些系统中的一些的说明，并且本公开涵盖来自这些不同系统中的任何一个的肽、多肽和蛋白质化学领域的普通技术人员显而易见的任何“保守”氨基酸变化。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并的密码子取代)、互补(或互补)序列和反向互补序列以及明确指出的序列。具体地说，简并的密码子取代可以通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或所有的)密码子的第三位置被混合的碱基和/或脱氧肌苷残基取代(参见，例如，Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。由于核酸密码子的简并性，人们可以使用各种不同的多核苷酸来编码相同的多肽。下面的表13包含了哪些核酸密码子编码哪些氨基酸的信息。
表13氨基酸核酸密码子
氨基酸 核酸密码子
Ala/A GCT,GCC,GCA,GCG
Arg/R CGT,CGC,CGA,CGG,AGA,AGG
Asn/N AAT,AAC
Asp/D GAT,GAC
Cys/C TGT,TGC
Gln/Q CAA,CAG
Glu/E GAA,GAG
Gly/G GGT,GGC,GGA,GGG
His/H CAT,CAC
Ile/I ATT,ATC,ATA
Leu/L TTA,TTG,CTT,CTC,CTA,CTG
Lys/K AAA,AAG
Met/M ATG
Phe/F TTT,TTC
Pro/P CCT,CCC,CCA,CCG
Ser/S TCT,TCC,TCA,TCG,AGT,AGC
Thr/T ACT,ACC,ACA,ACG
Trp/W TGG
Tyr/Y TAT,TAC
Val/V GTT,GTC,GTA,GTG
根据本公开的一些实施例，包括任何商业上或科学上有价值的植物。在本公开的方法(例如本文所述的sRNA的表达和/或应用)中特别有用的植物包括属于绿色植物超级家族的所有植物，特别是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或豆科牧草、观赏植物、粮食作物、树木或灌木，其选自包含以下的列表：金合欢属(Acacia spp.)、槭属(Acer spp.)、猕猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、贝壳杉(Agathis australis)、苦味合欢(Albizia amara)、三色桫椤属(Alsophila tricolor)、须芒草属(Andropogon spp.)、落花生属(Arachis spp)、槟榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、鹰嘴紫云英(Astragalus cicer)、多小叶红苏木(Baikiaea plurijuga)、桦木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木榄(Bruguiera gymnorrhiza)、伯克苏木(Burkea africana)、紧叔迦树(Butea frondosa)、Cadaba farinosa、朱缨花属(Calliandra spp.)、山茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、肉桂属(Cassia spp.)、距瓣豆(Centroema pubescens)、木瓜属(Chacoomeles spp.)、肉桂(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、可乐豆(Colophospermum mopane)、变异小冠花(Coronilliavaria)、Cotoneaster serotina、山楂属(Crataegus spp.)、黄瓜属(Cucumis spp.)、柏木属(Cupressus spp.)、银蕨(Cyathea dealbata)、榅桲(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅属(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、榅桲、Dalbergia monetaria、大叶骨碎补(Davallia divaricata)、山蚂蝗属(Desmodium spp.)、粗糙蚌贝蕨(Dicksonia squarosa)、拢双黄茅(Dibeteropogon amplectens)、Diocleaspp.、扁豆属(Dolichos spp.)、直矛豆(Dorycnium rectum)、Echinochloa pyramidalis、Ehraffia spp.、龙爪稷(Eleusine coracana)、Eragrestis spp.、刺桐属(Erythrinaspp.)、桉树属(Eucalyptus spp.)、假乌木(Euclea schimperi)、绒毛状金茅(Eulalia vi/losa)、荞麦属(Pagopyrum spp.)、Feijoa sellowlana、草莓属(Fragaria spp.)、千斤拔属(Flemingia spp.)、Freycinetia banksli、童氏老鹳草(Geranium thunbergii)、银杏(GinAgo biloba)、野黄豆(Glycine javanica)、南洋樱属(Gliricidia spp.)、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银桦属(Grevillea spp.)、鞘籽古夷苏木(Guibourtiacoleosperma)、岩黄耆属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemaffhia altissima)、黄茅(Heteropogon contoffus)、大麦(Hordeum vulgare)、红苞茅(Hyparrhenia rufa)、小连翘(Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、Indigo incamata、鸢尾属(Iris spp.)、Leptarrhena pyrolifolia、胡枝子属(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、银合欢(Leucaenaleucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesli、莲属(Lotus spp.)、大结豆(Macrotyloma axillare)、苹果属(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫花苜蓿(Medicago saliva)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草属(Nicotianum spp.)、红豆草属(Onobrychis spp.)、料豆属(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)、非洲盾柱木(Peltophorum africanum)、狼尾草属(Pennisetum spp.)、鳄梨(Persea gratissima)、矮牵牛属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、加那利海枣(Phoenix canariensis)、Phormium cookianum、石楠属(Photinia spp.)、白云杉(Piceaglauca)、松属(Pinus spp.)、Pisum sativam、桃柘罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squamosa、杨树属(Populus spp.)、牧豆树(Prosopis cineraria)、花旗松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、伞形鼠李(Rhaphiolepsis umbellata)、菱壳菌(Rhopalostylis sapida)、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia)、茶藨子属(Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、树莓属(Rubus spp.)、柳树属(Salix spp.)、Schyzachyrium sanguineum、金松(Sciadopitys vefficillata)、北美红杉(Sequoia sempervirens)、巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高梁(Sorghumbicolor)、菠菜属(Spinacia spp.)、流苏状鼠尾粟(Sporobolus fimbriatus)、Stiburusalopecuroides、矮柱花草(Stylosanthos humilis)、葫芦茶属(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、黄背草(Themeda triandra)、三叶草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越橘属(Vaccinium spp.)、蚕豆属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)、锥穂沃森花(Watsonia pyramidata)、马蹄莲(Zantedeschia aethiopica)、玉米、苋菜、朝鲜蓟、芦笋、花椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、加拿大油菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、芥蓝菜、亚麻、羽衣甘蓝、扁豆、油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、大米、大豆、稻草、甜菜、甘蔗、向日葵、番茄、南瓜茶、玉米、小麦、大麦、黑麦、燕麦、花生、豌豆、扁豆和苜蓿、棉花、油菜籽、加拿大油菜、胡椒、向日葵、烟草、茄子、桉树、树、观赏植物、多年生草和草料作物。可替代地，藻类和其他非绿色植物可以用于本公开的方法。
根据本公开的一些实施例，由本公开的方法所使用的植物是作物，包括但不限于棉花、芸苔属蔬菜、油菜、芝麻、橄榄树、棕榈油、香蕉、小麦、玉米、大麦、苜蓿、花生、向日葵、水稻、燕麦、甘蔗、大豆、草坪草、大麦、黑麦、高粱、甘蔗、菊苣、莴苣、番茄、西葫芦、甜椒、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜、豆类、木槿、秋葵、苹果、玫瑰、草莓、辣椒、大蒜、豌豆、小扁豆、加拿大油菜、菊花(mums)、拟南芥、西兰花、卷心菜、甜菜、藜麦、菠菜、南瓜、洋葱、韭菜、烟草、马铃薯、甜菜、木瓜、菠萝、芒果、拟南芥(Arabidopsis thaliana)，以及园艺、花卉栽培或林业中使用的植物，诸如但不限于杨树、冷杉、桉树、松树、观赏植物、多年生草和草料作物、针叶植物、苔藓、藻类，以及可在互联网(例如wwwdotnationmasterdotcom/encyclopedia/Plantae)上获得的其他植物。
根据一个具体实施例，植物选自由玉米、水稻、小麦、番茄、棉花和高粱组成的组。在某些实施例中，植物是玉米植物。在某些实施例中，植物是水稻植物。在某些实施例中，植物是小麦植物。在某些实施例中，植物是棉花植物。在某些实施例中，植物是高粱植物。
由一种或多种RNase III突变体产生的sRNA片段的可用性提供了试剂或治疗剂的供应和新的治疗方法，其中可以在整个生物体中实现期望的敲除效果，而没有基因疗法的缺点。来源于病原体的基因可以被靶向以用于抑制。例如，该基因可能直接导致宿主的免疫抑制，或者对病原体的复制、病原体的传播或感染的维持至关重要。抑制性RNA可以在体外或离体引入到细胞中，并且然后随后被放入到生物体中以实现疗法，或者生物体可以通过体内给药直接被治疗。可以设想一种基因疗法的方法。例如，有被病原体感染风险的细胞或已经感染的细胞可以通过引入根据本发明的sRNA被靶向以用于治疗。靶基因可以是病原体或宿主基因，其负责病原体进入其宿主、病原体或宿主的药物代谢、病原体的基因组的复制或整合、宿主中感染的建立或传播、或下一代病原体的组装。可以设想预防的方法(即预防或降低感染的风险)，以及降低与感染相关的症状的频率或严重性。
在进一步的实施例中，可以将包括遗传修饰的细菌(其被配置为表达一种或多种产生sRNA的RNase III突变体)的组合物配制成饲料和/或水可分散的颗粒或粉末，其可以被进一步配置为分散到环境中。在又一个实施例中，本发明的组合物还可以包含可湿性粉末、喷雾剂、乳剂、胶体、水溶液或有机溶液、粉剂(dust)、丸剂(pellet)或胶体浓缩物。组合物的干燥形式可以被配制成在润湿后立即溶解，或者可替代地，以控释、缓释或其他时间依赖性方式溶解。可替代地或另外地，组合物可以包含水溶液。此类水溶液或悬浮液可以作为在应用前被稀释的浓缩的储备溶液提供，或者可替代地，作为备用的稀释溶液提供。此类组合物可以以多种方式配制。通过与各种惰性材料(诸如无机矿物质(硅酮或硅衍生物、页硅酸盐、碳酸盐、硫酸盐、磷酸盐等)或植物性材料(粉末状玉米芯、稻壳、核桃壳等)混合，它们可以用作可湿性粉末、颗粒剂或粉剂。含有遗传修饰的细菌的制剂或组合物可以包括粘展剂-佐剂(spreader-sticker adjuvant)、稳定剂、其他农药添加剂或表面活性剂。液体制剂可以用作泡沫、悬浮液、可乳化的浓缩物等。成分可以包括流变剂、表面活性剂、乳化剂、分散剂或聚合物。
根据一个实施例，通过喂养将组合物施用给宿主。用该组合物喂养宿主可以在数小时、数天、数周、数月或者甚至数年的时间内一次、定期或半定期地进行。
如上所述，本发明的sRNA可以作为裸露的sRNA来施用。可替代地，本发明的sRNA可以与本领域技术人员已知的载体(诸如转染剂，例如PEI或壳聚糖或蛋白质/脂质载体)缀合，或者与纳米颗粒偶联。该组合物可以在施用前以合适的方式(诸如冻干的、冷冻干燥的、微包封化的、干燥的)配制，或者在水性载体、介质或合适的稀释剂诸如盐水或其他缓冲液中配制。合适的农业载体可以是固体、半固体或液体，并且在本领域中是众所周知的。此类组合物可以被认为是“农业上可接受的载体”，其可以覆盖通常在农药配制技术中使用的所有佐剂，例如惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等。
现在一般描述的本发明将通过参考以下实例更容易地理解，包括这些实例仅用于说明本发明的实施例的某些方面的目的。这些实例并不旨在限制本发明，因为本领域技术人员将从以上教导和以下实例中认识到，在不脱离所要求保护的发明的范围的情况下，其他技术和方法可以满足权利要求并且可以被使用。实际上，虽然已经参照本发明的优选的实施例具体地示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，在不脱离由所附权利要求所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中在形式和细节上进行各种改变。
实例
实例1：RNase III突变体筛选程序。
本发明人利用tetA-sacB反选择方法来筛选在细菌染色体上构建的若干种细菌RNase III突变体。具体而言，本发明人利用tetA-sacB反选择方法来筛选在细菌染色体上构建的若干个大肠杆菌RNase III突变体。
实例2：E38A-L40F和E117K-L119F RNase III突变体的构建。
在一个实施例中，本发明人证明了使用野生型大肠杆菌JM109(DE3)菌株在细菌染色体上构建E38A-L40F和E117K-L119F突变体。JM109(DE3)基因型：endA1、recA1、gyrA96、thi、hsdR17(rk–,mk+)、relA1、supE44、λ–、Δ(lac-proAB)、[F′,traD36,proAB,lacIqZΔM15]、lDE3。TetA-sacB反选择方法用于构建E38A-L40F和E117K-L119F突变体，如图1B所示。在该实施例中，如图2所示，质粒pKD46或pSIJ8被转化到JM109(DE3)中用于红色重组。
本发明人启动了以下方案：使用T-SACK菌株作为模板，以用引物Ecoli-tet-sacB38F1和Ecoli-tet-sacB38R1克隆tetA-sacB盒(约3.5kb靶向片段)，其中每个引物包括超过50bp的同源性臂，如通常在表1中所示出的。含有pKD46(在cgsc2.biology.yale.edu/Strain.php？ID＝68099鉴定)或pSIJ8(在addgene.org/68122/鉴定)质粒的JM109(DE3)在LB中在30℃下生长过夜，其中最终浓度为100μg/mL氨苄青霉素以维持质粒。过夜培养物在SOB中稀释100倍，其中最终浓度为100μg/mL氨苄青霉素，并且在30℃下生长至OD600约0.3。然后以10mmol/L的最终浓度加入L-阿拉伯糖，以诱导另外的2小时以表达红色酶，并且然后用于制造电感受态细胞。将约1μg的纯化的tetA-sacB PCR产物与100μL的感受态细胞混合用于电穿孔。电穿孔条件为0.1cm比色皿、1.8kV、200Ω和25μF。在电穿孔后，细胞被转化为1mL的SOC，并且在通气的情况下生长超过4小时，然后接种在预热的(37℃)四环素板上(最终浓度为10μg/mL)，并且然后孵育一天。
值得注意的是，<tetA-sacB>名称表示通过重组工程在指定的位置内插入tetA-sacB基因。E38<tetA-sacB>和E117<tetA-sacB>突变体通过菌落PCR用特异性的引物JD-5和Tet-sacB-JD-R1进行筛选，如图3和表1所示。含有重组质粒的正确的E38<tetA-sacB>和E117<tetA-sacB>突变体生长过夜，并且用于制造如上通常所述的电感受态细胞。将约5μL的10mmol/L的Ecoli-oligo-E38A或Ecoli-oligo-E117K(参见表1)分别与E38<tetA-sacB>或E117<tetA-sacB>感受态细胞混合，并且然后在与上述相同的条件下进行电穿孔。在电穿孔后，将细胞在30℃下转移到1mL的SOC中，并且在通气的情况下生长超过5小时，然后在预热的(37℃)sacB琼脂板上铺板并孵育2天。用表1中通常鉴定的特异性引物对Ecoli-E38A-1F和Ecoli-E38A-1R以及JD-5和JD-3进行菌落PCR，以筛选正确的突变体E38A和E117K，如图4所示。将正确的突变体在42℃下培养过夜，以消除pKD46或pSIJ8质粒。所有的突变体都通过测序来证实。
如图1B中通常所示出的，本发明人证明重组质粒pKD46或pSIJ8被转化到大肠杆菌JM109(DE3)菌株中，并且通过提取质粒和限制性消化来确认阳性菌落。如图3进一步所示出的，tetA-sacB盒分别被插入到大肠杆菌RNase III E38和E117位置中。本发明人用鉴定引物JD-5和Tet-sacB-JD-R随机地挑选了7个单独的菌落用于菌落PCR，并且预期的片段大小分别为368bp和605bp。如图5所示，E38<tetA-sacB>或E117<tetA-sacB>的正确插入至少纯化两次，并且然后用于E38A和E117K突变体构建。Ecoli-oligo-E38A用于构建E38A-L40F突变体；Ecoli-oligo-E117K用于构建E117K-L119F突变体。用Ecoli-E38A-1F和Ecoli-E38A-1R(预期的PCR大小为256bp)、Ecoli-E117K-1F和Ecoli-E117K-1R(预期的PCR大小为323bp)的引物对进行PCR，以筛选正确的突变体。
实例3：E38A和E117K RNase III突变体的构建。
类似于构建E38A-L40F突变体的示例，如图5和表1所示，本发明人用Ecoli-oligo-E38A-F2构建了E38A，并且然后用鉴定引物对Ecoli-E38A-2F和Ecoli-E38A-1R以及JD-5和JD-3进行筛选。同样如图5和表1所示，E117K突变体也用Ecoli-oligo-E117K-F2构建，并且然后用鉴定引物对Ecoli-E117K-2F和Ecoli-E117K-1R以及JD-5和JD-3筛选。
实例4：E65A RNase III突变体的构建。
类似于上面提供的关于将E38<tetA-sacB>插入到细菌染色体中的实例，进行PCR以用Ecoli-tet-sacB-E65F1和Ecoli-tet-sacB-E65R1的引物对克隆tetA-sacB盒。tetA-sacB PCR片段用于同源重组，以将该盒插入到大肠杆菌JM109(DE3)RNase III E65位置中。本发明人用引物JD-5和Tet-sacB-JD-R进行菌落PCR，如表1所中所鉴定的，以筛选正确的插入，并且预期的片段大小为449bp(参见图6)。同样，如图6所示，Ecoli-oligo-E65A-F1用于构建E65A突变体；Ecoli-E65A-1F和JD-3、JD-5和JD-3的引物对用于筛选正确的E65A候选突变体。
实例5：Bc-E58A和Bc-E137K RNase III突变体的构建。
本发明人证明了蜡状芽孢杆菌53522E58A突变体的构建，其具有三个单独的片段：Pveg启动子片段(如表2所示的引物Pveg-F1和Pveg-R1)、Bc-E58A片段I(如表2所示的引物Bc-E58A-F1和Bc-E58A-R1)和Bc-E58A(如表2所示的引物Bc-E58A-F2和Bc-E58A-R2)。片段II使用
Figure BDA0002804897670000581
High-Fidelity DNA聚合酶通过PCR进行扩增。每个片段用QIAquick Gel提取试剂盒纯化。然后，发明人将这三个片段与
Figure BDA0002804897670000582
消化的pAD-WRKY-GHY7质粒组装在一起，以构建Bc-E58A突变体。
类似于pAD-Bc-E58A的构建，Bc-E137K片段I(如表2所示的引物Bc-E58A-F1和Bc-E137K-R1)和Bc-E137K片段II(如表2所示的引物Bc-E137K-F1和Bc-E58A-R2)使用
Figure BDA0002804897670000583
High-Fidelity DNA聚合酶通过PCR进行扩增，并且然后与Pveg启动子片段和
Figure BDA0002804897670000584
消化的pAD-43-25质粒使用
Figure BDA0002804897670000586
HiFi DNA组装克隆试剂盒组装在一起，以构建Bc-E137K突变体，如图7所示。然后用引物pAD-E58A-F1和pAD-E58A-R1扩增正确的突变体，然后连接到XhoI消化的pAD-WRKY-GHY7质粒中，并将正确的突变体标记为pAD-Bc-E137K。
实例6：另外的预测的RNase III突变体的构建。
使用Pveg质粒作为模板，用Pveg-F2和Pveg-R2引物进行PCR以克隆Pveg启动子片段(如表2所鉴定的引物Pveg-F2和Pveg-R2)，该片段在每侧含有HindIII和XhoI限制性酶位点。然后将纯化的Pveg启动子片段连接至
Figure BDA0002804897670000585
消化的pAD-WRKY-GHY7上，并且将正确的载体标记为pAD-WRKY-GHY7-Pveg3。如本领域普通技术人员容易识别的，预测的RNaseIII突变体片段由第三方合成。如图8所示，将每个预测的RNase III突变体片段连接至XhoI消化的pAD-WRKY-GHY7-Veg3质粒上，并且随后转化到HT115感受态细胞中。阳性菌落在含有四环素(最终浓度为10μg/mL)和氯霉素抗生素(最终浓度为12.5μg/mL)的LB板上选择。如表2所示，引物Eco-F1和SglyA-R1用于扩增阳性突变体，其中预期的PCR大小为约1.0kb，如图9所示。对于每个预测的突变体提取至少2个质粒，并且单独地确认它们的序列。
实例7：另外的肠杆菌RNase III突变体的构建。
为了构建肠杆菌Ae003和Ag001 RNase III突变体，本发明人设计了Ae-JD-5和Ae-JD-3，如表2所示，它们已经被配置为克隆这三种肠杆菌菌株的完整rnc基因(编码RNaseIII酶)，如图10所示。基于Ae003(SEQ ID NO.18)、Ae073(SEQ ID NO.19)和Ag001(SEQ IDNO.20)的rnc基因序列，本发明人设计了更多的RNase III突变体。如表2所示的引物Eco-F1和SglyA-R1用于扩增如图11和12所示的所有预测的RNase III突变体，其具有预期的PCR大小为约1.0kb。所有RNase III突变体通常总结在表3中。值得注意的是，预测的RNase III突变体由GenScript合成。
实例8：siRNA生产的Northern印迹分析。
根据制造商的说明，使用MiniVana microRNA试剂盒提取总siRNA，并且然后在15％聚丙烯酰胺凝胶电泳上运行。表4列出了用于Northern印迹分析的探针。第二代DIG寡核苷酸3’末端标记试剂盒用于标记寡核苷酸片段。TMVU1-MP-F6-21、TMVU1-MP-R6-21、TMVU1-MP-F7-21和TMVU1-MP-R7-21(再次如表4中所鉴定的)被用作DNA标记以指示21nt的siRNA。Northern印迹分析在图13-15和17中示出。
实例9：dsRNA切割分析的qRT-PCR。
如图16所示，本发明人对来自不同大肠杆菌RNase III突变体的dsRNA切割进行了qRT-PCR。具体而言，在该实施例中，本发明人证明了以下情况：HT115-pAD-WRKY-GHY7：含有pAD-WRKY-GHY7质粒(四环素和氯霉素抗性)的HT115菌株，并且它不能消化dsRNA。
HT115-pAD-WRKY-GHY7-E38A：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A质粒(四环素和氯霉素抗性)的HT115菌株，并且E38A RNase III突变体可以将dsRNA消化成26-29bp的小RNA；与不能消化dsRNA分子的HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，该菌株可以将几乎一半的dsRNA转化为小RNA。JM109-pAD-WRKY-GHY7：含有pAD-WRKY-GHY7质粒(氯霉素抗性)的JM109(DE3)RNaseIII E38A突变体，其可以将dsRNA切割成26-29bp的小RNA；与HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，该菌株可以将几乎85％的dsRNA转化为小RNA。HT115-E38A-R107A-R108A：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A-R107A-R108A质粒(四环素和氯霉素抗性)的HT115菌株，并且其可以有效地将dsRNA切割成22-23bp的小RNA；与HT115-pAD-WRKY-GHY7相比，其可以将几乎95％的dsRNA转化成小RNA。HT115-E38A-R107E-R108E：含有pAD-WRKY-GHY7-E38A-R107E-R108E质粒(四环素和氯霉素抗性)的HT115菌株，并且其可以将dsRNA切割成26-29bp的小RNA，且与HT1115-pAD-WRKY-GHY7-E38A相比，可以将几乎80％的dsRNA转化成小RNA。
实例10：siRNA测序分析和结合自由能的计算估计。
六个样品(每个三个复制，共18个)被送到GENEWIZ(南普莱恩菲尔德，新泽西州)用于测序。它们包括：JM109(宽型大肠杆菌)、JM109-GHY7(包含pAD-WRKY-GHY7质粒的宽型大肠杆菌，靶向TMV-GFP和运动蛋白基因两者)、E38A-GHY7(包含pAD-WRKY-GHY7质粒的E38A突变体)、E65A-GHY7(包含pAD-WRKY-GHY7质粒的E65A突变体)和E38A-R107A-R108A-GHY7(包含pAD-WRKY-GHY质粒的E38A-R107A-R108A突变体)、E38A-R107E-R108E(包含pAD-WRKY-GHY7质粒的E38A-R107E-R108E)。
实例11：sRNA分析方法。
从GENEWIZ(南普莱恩菲尔德，新泽西州)接收成对末端Illumina测序数据。成对读数首先使用来自BBMap的bbmerge脚本加入。移除适配器，并且然后使用带有末端和滑动窗口质量微调的Trimmomatic 0.38进行质量微调。过滤得到的读数，以仅包括大小为18nt到30nt的读数。然后使用领结(bowtie)1.2.2将过滤后的读数与GHY7基因序列进行比对，以允许“-最佳”参数设置出现0个不匹配。比对被转换为bam格式，并且使用samtools 1.7进行索引。为了鉴定和计数RNA特征，每个独特的RNA序列被指定为“特征”，并且使用GenomicAlignments 1.16.0(和R中的rtracklayer 1.40.6软件包)将集合转换为GTF格式。然后使用每个样品中每个特征的拷贝数来建立特征计数表。
在R 3.5.1中对比对的读取数据进行进一步分析。覆盖图是在Rsamtools 1.32.3软件包的帮助下在R中生成的。所有其他图形和图都是使用ggplot2 3.1.0软件包生成的。使用R中的素食主义者软件包构建NMDS规范。使用R中的素食主义者软件包进行包括Kruskal-Wallis(KW)测试的成对分析和包括PERMANOVA和ANOSIM的MANOVA类型分析。使用1000个排列进行MANOVA类型分析。事后邓恩(Post-hoc Dunn’s)(DMRT)测试是基于重要的Kruskal-Wallis测试使用R中的dunn.test 1.5.3软件包进行的。
实例11：用于通过分子建模和模拟来估算结合自由能的方法。
使用与dsRNA复合的WT超嗜热菌RNase III的晶体结构(PDB 2NUG)作为模板，构建了WT大肠杆菌RNase III的同源性模型。使用Modeller版本9.20生成五个大肠杆菌RNaseIII模型，根据最低的DOPE(离散优化的蛋白质能量)评估得分从中选择最佳同源性模型(如图19所示)(Shen和Sali 2006)。从该WT模型中，通过引入具有PyMOL版本2.3的计算机内点突变来生成用于各种突变体构建体(E38A、E65A、E38A/R107A/R108A、E38A/R107E/R108E、E38A/E65A、R107A/R108A、E65A/R107A/R108A和E38A/E65A/R107A/R108A)的相应的模型。
然后，使用Amber ff99SB-ILDN力场，对每个与dsRNA(取自PDB 2NUG)复合的大肠杆菌RNase III二聚体模型在显式溶剂中进行全原子MD模拟。对于每个dsRNA结合的RNaseIII模型，添加TIP3P水分子以填充蛋白质-RNA复合物周围的菱形十二面体框，其中从任何蛋白质或RNA原子到模拟框的任何边缘的最小距离为1.0nm。将单价钠和氯离子添加到每个系统中，以便中和总电荷并达到150mM的生理离子强度。然后使用Amber MD引擎版本16对每个系统进行分子动力学(MD)模拟，该引擎版本16已经被GPU优化用于模拟显式溶剂系统。
Figure BDA0002804897670000612
的切割值用于计算短程成对的库仑和伦纳德·琼斯相互作用能。长程静电通过PME(Particle Mesh Ewald)方法计算。使用SHAKE算法约束含氢原子的键。氢质量重分配方法允许使用4-fs时间步长，通过Langevin动力学将温度保持在310K，其中碰撞频率为1.0ps-1，同时使用弛豫时间为4.0ps的Monte Carlo恒压器将各向同性压力耦合设置为1巴。每个系统使用最陡峭的下降500步，随后使用共轭梯度500步来使能量最小化。随后是在NVT集成条件下在310K平衡1ns，并且然后在NPT集成条件下在1巴和310K下平衡1ns。到目前为止，所有蛋白质和RNA重原子具有
Figure BDA0002804897670000611
的位置限制。这些位置限制在每次模拟进行250ns的生产运行中被移除。
为了估计每个大肠杆菌RNase III模型与dsRNA的绝对和相对(相对于WT)结合自由能，通过MMPBSA.py工具采用了MM-GBSA(分子力学-广义玻恩表面积(MolecularMechanics–Generalized Born Surface Area))。在本文中没有考虑构象熵的变化，因为其计算成本高但预测精度低。使用LCPO(成对重叠的线性组合)方法来计算去溶剂化能量的非极性部分，其中表面张力和偏移参数分别被设置为0.0072和0的Amber默认值。在五个广义玻恩(GB)模型与原子半径参数之间计算并比较去溶剂化能的极性部分：i)具有‘mbondi’半径的GB1，ii)具有‘mbondi2’半径的GB2，iii)具有‘mbondi2’半径的GB5，iv)具有‘bondi’半径的GB7，以及v)具有‘mbondi3’半径的GB8。在处理之前，从来自所有模拟轨迹的每一帧中剥离所有水分子和单价离子。在每帧的GB计算中，离子强度被设定为150mM。
表
表1.用于RNase III突变体构建的引物。
Figure BDA0002804897670000621
Figure BDA0002804897670000631
注：*表示硫代磷酸引物。
表1b.用于图14的Northern印迹的单链RNA
TMVU1-MP-F6-RNA21 CAGUUCAAGGUCGUUCCCAAU
TMVU1-MP-F7-RNA23 UGAAGAUGUCAGCGGGUUUCUGU
TMVU1-MP-R6-RNA25 CCAGACGUUUUUCAUCGCGUCCUGG
TMVU1-MP-R7-RNA27 ACGACUUCUUCUGUAAGUUCCAUGGGC
TMVU1-MP-F6-RNA29 CAGUUCAAGGUCGUUCCCAAUUAUGCUAU
表2用于在质粒中构建的RNase III突变体的引物。
Figure BDA0002804897670000641
表3.RNase III突变体的总结
Figure BDA0002804897670000651
Figure BDA0002804897670000661
表4.用于Northern印迹分析和qRT-PCR的探针和引物序列。
Figure BDA0002804897670000671
表5.sRNA处理对齐的读取信息
Figure BDA0002804897670000672
Figure BDA0002804897670000681
表6.Manova-型测试结果
测试类型 测试统计 p-值
PERMANOVA F＝191.19 <0.01
ANOSIM R＝～1 <0.01
表7.显示催化活性增加和优选的sRNA生产结果的选定RNase III突变的总结。
Figure BDA0002804897670000682
*基于与大肠杆菌中RNase III中E38的同源性，预计无WT切割
表8：家禽群体中的靶病原体
Figure BDA0002804897670000691
表9：蜜蜂群体中的靶病原体
Figure BDA0002804897670000692
Figure BDA0002804897670000701
表10：哺乳动物群体中的靶病原体
Figure BDA0002804897670000702
Figure BDA0002804897670000711
Figure BDA0002804897670000721
Figure BDA0002804897670000731
在一个优选的实施例中，本发明可以应用于植物病毒的下列非限制性组中的一种或多种，包括病原体基因靶，通常被称为基因靶，或必需基因，其将被本领域普通技术人员识别并可获得，而无需过度实验：
表11：靶植物病毒性病原体
Figure BDA0002804897670000732
Figure BDA0002804897670000741
另外的植物病原体可以包括：柑桔衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒以及番笳丛矮病毒。
在一个优选的实施例中，本发明可以应用于植物真菌病原体的以下非限制性组中的一种或多种，包括病原体基因靶，通常被称为基因靶，或必需基因，其将被识别并且对于本领域普通技术人员在无需过度实验的情况下可获得：
表12：靶真菌病原体
Figure BDA0002804897670000751
Figure BDA0002804897670000761
参考文献
以下参考文献据此通过引用并入到本说明书中：
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序列表
如上所述，本申请包含完整的序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交并且据此通过引用整体并入本文。随此进一步提供以下序列，并且据此以其整体并入到本说明书中：
SEQ ID NO.1
DNA
大肠杆菌-JM109(DE3)-野生型-681bp
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.2
氨基酸
大肠杆菌-JM109(DE3)-野生型-226aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.3
DNA
M-JM109-GHY7-Ec-E38A
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.4
氨基酸
M-JM109-GHY7-Ec-E38A-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.5
DNA
M-JM109-GHY7-E65A
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCCCGCGTCGACGCCGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.6
氨基酸
M-JM109-GHY7-E65A-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDAGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.7
DNA
HT115-E38A-R107A-R108A
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTGCCGCCGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.8
氨基酸
HT115-E38A-R107A-R108A-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.9
DNA
HT115-Ag001-E38A
肠杆菌科Ag001
ATGAATCCCATCGTAATAAATAGGCTGCAGCGTAAGCTGGGCTACACTTTTCAACATCAGGATCTGTTGCAACAGGCATTAACCCATCGGAGTGCCAGCAGCAAGCATAATGCCCGCTTGGAGTTTTTGGGTGACTCCATTCTCAGTTATGTCATCGCGAATGCGCTGTATCATCGTTTTCCTCGCGTAGATGAAGGCGACATGAGCCGCATGCGTGCGACGCTGGTGCGCGGCAATACGCTGGCGGAAATCGCCCGCGAGTTCGAACTGGGTGAGTGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGTGGCGGTTTCCGTCGCGAGTCGATTCTTGCTGATACCGTGGAAGCGTTGATCGGTGGCGTCTTCCTCGACAGCGACATTCAGAACGTTGAGCGTTTGATTCTCTCGTGGTATCAGACCCGTCTCGACGAAATCAGTCCAGGCGACAAGCAAAAAGATCCGAAAACGCGTCTGCAGGAGTACCTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGTCGTATCTGGTGGTGCAGGTGCGTGGTGAAGCGCACGATCAAGAATTTACCATTCACTGTCAGGTGAGTGGCCTGCCTGAGCCTGTCGTAGGGACGGGCTCAAGCCGCCGTAAAGCGGAACAGGCTGCGGCTGAGCAGGCACTGAAAAAGCTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.10
氨基酸
HT115-Ag001-E38A-aa
肠杆菌科Ag001
MNPIVINRLQRKLGYTFQHQDLLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQNVERLILSWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLPEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.11
DNA
HT115-Ag001-E38A-R107A-R108A
肠杆菌科Ag001
ATGAATCCCATCGTAATAAATAGGCTGCAGCGTAAGCTGGGCTACACTTTTCAACATCAGGATCTGTTGCAACAGGCATTAACCCATCGGAGTGCCAGCAGCAAGCATAATGCCCGCTTGGAGTTTTTGGGTGACTCCATTCTCAGTTATGTCATCGCGAATGCGCTGTATCATCGTTTTCCTCGCGTAGATGAAGGCGACATGAGCCGCATGCGTGCGACGCTGGTGCGCGGCAATACGCTGGCGGAAATCGCCCGCGAGTTCGAACTGGGTGAGTGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGTGGCGGTTTCGCCGCCGAGTCGATTCTTGCTGATACCGTGGAAGCGTTGATCGGTGGCGTCTTCCTCGACAGCGACATTCAGAACGTTGAGCGTTTGATTCTCTCGTGGTATCAGACCCGTCTCGACGAAATCAGTCCAGGCGACAAGCAAAAAGATCCGAAAACGCGTCTGCAGGAGTACCTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGTCGTATCTGGTGGTGCAGGTGCGTGGTGAAGCGCACGATCAAGAATTTACCATTCACTGTCAGGTGAGTGGCCTGCCTGAGCCTGTCGTAGGGACGGGCTCAAGCCGCCGTAAAGCGGAACAGGCTGCGGCTGAGCAGGCACTGAAAAAGCTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.12
氨基酸
HT115-Ag001-E38A-R107A-R108A-aa
肠杆菌科Ag001
MNPIVINRLQRKLGYTFQHQDLLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQNVERLILSWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLPEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.13
DNA
HT115-Ae003-E38A
肠杆菌Ae003
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTCATCATCAGGAGTTGTTGCAACAGGCATTAACCCACCGCAGTGCCAGCAGCAAGCACAACGCCCGCCTGGAGTTTTTAGGCGACTCTATTTTAAGTTTCGTGATTGCGAATGCGCTTTATCATCGTTTCCCGCGCGTGGATGAAGGTGATATGAGCCGCATGCGTGCCACGCTGGTTCGGGGTAACACCCTTGCGGAAATCGCGCGCGAATTTGAACTGGGCGAATGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGCGGCGGCTTCCGTCGTGAATCTATTCTTGCCGATACGGTCGAAGCATTAATTGGTGGTGTGTTCCTGGACAGCGATATCCAGACCGTCGAAAAGCTGATCCTGAACTGGTATCAGACCCGTCTGGACGAAATCAGCCCGGGCGATAAACAAAAAGATCCCAAAACGCGTCTGCAGGAATATTTGCAGGGCCGTCATCTGCCGCTGCCATCTTATCTGGTGGTGCAGGTTCGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACCATCCATTGCCAGGTCAGTGGCCTGAGTGAACCGGTGGTGGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAACAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTAAAAATGCTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.14
氨基酸
HT115-Ae003-E38A-aa
肠杆菌Ae003
MNPIVINRLQRKLGYTFHHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSFVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKMLELE
SEQ ID NO.15
DNA
HT115-Ae003-E38A-R107A-R108A
肠杆菌Ae003
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTCATCATCAGGAGTTGTTGCAACAGGCATTAACCCACCGCAGTGCCAGCAGCAAGCACAACGCCCGCCTGGAGTTTTTAGGCGACTCTATTTTAAGTTTCGTGATTGCGAATGCGCTTTATCATCGTTTCCCGCGCGTGGATGAAGGTGATATGAGCCGCATGCGTGCCACGCTGGTTCGGGGTAACACCCTTGCGGAAATCGCGCGCGAATTTGAACTGGGCGAATGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGCGGCGGCTTCGCCGCCGAATCTATTCTTGCCGATACGGTCGAAGCATTAATTGGTGGTGTGTTCCTGGACAGCGATATCCAGACCGTCGAAAAGCTGATCCTGAACTGGTATCAGACCCGTCTGGACGAAATCAGCCCGGGCGATAAACAAAAAGATCCCAAAACGCGTCTGCAGGAATATTTGCAGGGCCGTCATCTGCCGCTGCCATCTTATCTGGTGGTGCAGGTTCGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACCATCCATTGCCAGGTCAGTGGCCTGAGTGAACCGGTGGTGGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAACAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTAAAAATGCTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.16
氨基酸
HT115-Ae003-E38A-R107A-R108A-aa
肠杆菌Ae003
MNPIVINRLQRKLGYTFHHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSFVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKMLELE
SEQ ID NO.17
氨基酸
RNase III E38A-E65A突变体
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDAGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.18
DNA
Ae003-rnc
肠细菌
AACTAACGACATCCCCTGTCGTTGTGTATAGAATATTCCCCCGAAGTTTAAGGTTGGCCCTGCAAGGGTGCCACGGCACACGAAACCGCGTTGGTTTTCTCAGGTCGGTTTCGTGTGCTGCATTTTTGACGCATTCATTTATTGGTATCGCATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTCATCATCAGGAGTTGTTGCAACAGGCATTAACCCACCGCAGTGCCAGCAGCAAACATAATGAGCGTCTCGAGTTTTTAGGCGACTCTATTTTAAGTTTCGTGATTGCGAATGCGCTTTATCATCGTTTCCCGCGCGTGGATGAAGGTGATATGAGCCGCATGCGTGCCACGCTGGTTCGGGGTAACACCCTTGCGGAAATCGCGCGCGAATTTGAACTGGGCGAATGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGCGGCGGCTTCCGTCGTGAATCTATTCTTGCCGATACGGTCGAAGCATTAATTGGTGGTGTGTTCCTGGACAGCGATATCCAGACCGTCGAAAAGCTGATCCTGAACTGGTATCAGACCCGTCTGGACGAAATCAGCCCGGGCGATAAACAAAAAGATCCCAAAACGCGTCTGCAGGAATATTTGCAGGGCCGTCATCTGCCGCTGCCATCTTATCTGGTGGTGCAGGTTCGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACCATCCATTGCCAGGTCAGTGGCCTGAGTGAACCGGTGGTGGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAACAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTAAAAATGCTGGAGCTGGAATGAGCGAAGAAAAGACCTATTGCGGATTTATTGCCATCGTCGGACGTCCGAACGTCGGCAAATCCACCCTGTTGAATAATCTGCTTGGGCAGAAGATTTCTATCACCTCGCGTAAGGCTCAGACCACGCGTCACCGCATCGTCGGTATCCATACTGAAGGCGCGTATCAGGCGATCTACGTCGATACCCCGGGCCTGCACATGGAAGAGAAGCGTGCCATCAACCGTCTGATGAACAAGGCGGCGAGCAGCTCGATTGGCGACGTGGAGCTGGTGATTTTCGTTGTGGAAGGCACCCGCTGGACGCCTGACGACGAGATGGTGCTGAACAAGCTGCG
SEQ ID NO.19
DNA
Ae073-rnc
肠细菌
AACTAACGACATCCCCTGTCGTTGTGTATAGAATATTCCCCCGAAGTTTAAGGTTGGCCCTGCAAGGGTGCCACGGCACACGAAACCGCGTTGGTTTTCTCAGGTCGGTTTCGTGTGCTGCATTTTTGACGCATTCATTTATTGGTATCGCATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTCATCATCAGGAGTTGTTGCAACAGGCATTAACCCACCGCAGTGCCAGCAGCAAACATAATGAGCGTCTCGAGTTTTTAGGCGACTCTATTTTAAGTTTCGTGATTGCGAATGCGCTTTATCATCGTTTCCCGCGCGTGGATGAAGGTGATATGAGCCGCATGCGTGCCACGCTGGTTCGGGGTAATACCCTTGCGGAAATCGCGCGCGAATTTGAGCTGGGCGAATGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGCGGCGGCTTCCGTCGTGAATCTATTCTTGCCGATACGGTCGAAGCATTAATTGGTGGTGTGTTCCTGGACAGCGATATCCAGACCGTCGAAAAGCTGATCCTGAACTGGTATCAGACCCGTCTGGACGAAATCAGCCCGGGCGATAAACAAAAAGATCCCAAAACGCGTCTGCAGGAATATTTGCAGGGCCGTCATCTGCCGCTGCCATCTTATCTGGTGGTGCAGGTTCGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACCATCCATTGCCAGGTCAGTGGCCTGAGTGAACCGGTGGTGGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAACAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTAAAAATGCTGGAGCTGGAATGAGCGAAGAAAAGACCTATTGCGGATTTATTGCCATCGTCGGACGTCCGAACGTCGGCAAATCCACCCTGTTGAATAATCTGCTTGGGCAGAAGATTTCTATCACCTCGCGTAAGGCGCAGACCACGCGTCACCGCATCGTCGGTATCCATACTGAAGGCGCGTATCAGGCGATCTACGTCGATACACCGGGCCTGCACATGGAAGAGAAGCGTGCCATCAACCGTCTGATGAACAAGGCGGCGAGCAGCTCAATTGGCGACGTGGAGCTGGTGATTTTCGTTGTGGAAGGCACCCGCTGGACGCCGGACGACGAGATGGTGCTGAACAAGCTGCG
SEQ ID NO.20
DNA
Ag001-rnc
肠细菌
AACTAACGACATCCCCTGTCGTTGTGTATAGAATATTCCCGCCTTTAAAGATTGGCTCCCGAAAGGGAGCCACGGCACACGAAACAGCGTTGGTTTCCTTTTTTCAGGTCTGTTCCGTGTGCTGAATAGTTGACGCATTCATTAATTTTGGTATCGCATGAATCCCATCGTAATAAATAGGCTGCAGCGTAAGCTGGGCTACACTTTTCAACATCAGGATCTGTTGCAACAGGCATTAACCCATCGGAGTGCCAGCAGCAAACACAACGAGCGTCTTGAGTTTTTGGGTGACTCCATTCTCAGTTATGTCATCGCGAATGCGCTGTATCATCGTTTTCCTCGCGTAGATGAAGGCGACATGAGCCGCATGCGTGCGACGCTGGTGCGCGGCAATACGCTGGCGGAAATCGCCCGCGAGTTCGAACTGGGTGAGTGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGTGGCGGTTTCCGTCGCGAGTCGATTCTTGCTGATACCGTGGAAGCGTTGATCGGTGGCGTCTTCCTCGACAGCGACATTCAGAACGTTGAGCGTTTGATTCTCTCGTGGTATCAGACCCGTCTCGACGAAATCAGTCCAGGCGACAAGCAAAAAGATCCGAAAACGCGTCTGCAGGAGTACCTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGTCGTATCTGGTGGTGCAGGTGCGTGGTGAAGCGCACGATCAAGAATTTACCATTCACTGTCAGGTGAGTGGCCTGCCTGAGCCTGTCGTAGGGACGGGCTCAAGCCGCCGTAAAGCGGAACAGGCTGCGGCTGAGCAGGCACTGAAAAAGCTGGAGCTGGAATGAGCGAAGAAAAAACGTATTGCGGCTTCGCGGCCATTGTTGGTCGCCCGAACGTCGGCAAATCCACGCTGCTGAATCAGCTGCTTGGGCAAAAAGTTTCCATTACCTCGCGTAAGGCGCAAACCACGCGCCACCGCATCATGGGCATCCATACCGAAGGGCCATATCAGGCGATTTACGTCGATACCCCGGGGCTGCACATGGAAGAAAAACGCGCCATTAACCGCCTGATGAACCGCGCGGCAAGCAGCTCCATCGGTGACGTTGAGCTGGTTATCTTCGTGGTTGAAGGCACCCGCTGGACGCCGGATGATGAAATGGTGCTGAACAAGCTGCG
SEQ ID NO.21
氨基酸
Ag001-rnc
肠细菌
MNPIVINRLQRKLGYTFQHQDLLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQNVERLILSWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLPEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.22
氨基酸
Ae003-rnc
肠细菌
MNPIVINRLQRKLGYTFHHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSFVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKMLELE
SEQ ID NO.23
DNA
疣微菌门-rnc-野生型
疣微菌门
ATGAATCCGCTCGAAGACCGCATCGGTTACAAGTTCCGCAACGCGCTGTTGCTGGAAGAAGCGCTCACGCATCCCAGTGTGAGGCACGAGCGCCTGGAGTTTTTGGGCGATGCGGTCCTGCAGCTCGTGATGACGGAACACCTGTTCGGGCATTTTAAGAAAGAAGCCGAAGGGACGCTGACGAAACTGCGCTCGCGGCTTGTTTCGCGGGAGGCCCTCGCCGTTCATGCGGCGACGCTCGAACTGGGACGCTATCTGGCCGTCGGCCGCGGTGAGGACGCGAGCGGCGGTCGCGAACGCAATTCGACGCTCGCCGACGCTTTCGAGGCGCTCGTCGGAGCGATCTATCTCGATAGCGATCTGGCCACGGTGCGTCGCTTTATCCTGGATCAGGCAGCGGGCGATCTGGCGCAACTCGTCGACGAACCGACCGATATCAACCCGAAGGGTCACCTGCAGGAATTGCTCCAGGCGATTTCGCCCCGCAGCCCGGTTTACGAAGTGATTTCGCAGACCGGGCCGGAGCACGAAAAGACGTTTGTGATTCGCGCGGTTTGGGAGGGCATCACGCTCGGGGAGGGAACCGGGCGAAGCAAGAAACAGGCGGAAACGGCCGCCGCCGAGGAGGCGATGCGGCAAAAGCGGTGGGAAACGGAAAAGACGTCGACCGCACCTTCTCGGTAG
SEQ ID NO.24
氨基酸
疣微菌门-rnc-野生型-aa
疣微菌门
MNPLEDRIGYKFRNALLLEEALTHPSVRHERLEFLGDAVLQLVMTEHLFGHFKKEAEGTLTKLRSRLVSREALAVHAATLELGRYLAVGRGEDASGGRERNSTLADAFEALVGAIYLDSDLATVRRFILDQAAGDLAQLVDEPTDINPKGHLQELLQAISPRSPVYEVISQTGPEHEKTFVIRAVWEGITLGEGTGRSKKQAETAAAEEAMRQKRWETEKTSTAPSR
SEQ ID NO.25
DNA
M-JM109-GHY7-E117K-L119F
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTGAAGGCTTTCATCGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.26
氨基酸
M-JM109-GHY7-E117K-L119F-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVKAFIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.27
DNA
M-JM109-GHY7-Ec-E117K
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTGAAGGCTTTGATCGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.28
氨基酸
M-JM109-GHY7-Ec-E117K-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVKALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.29
DNA
HT115-E38A-K12opt
大肠杆菌
ATGAATCCCATCGTGATCAACCGTTTGCAGCGTAAATTGGGTTACACTTTTAATCACCAAGAATTGCTGCAGCAGGCATTGACCCACCGCTCCGCTTCGTCTAAACACAACGCCCGTCTGGAATTTTTAGGAGATTCGATCCTGTCTTACGTGATCGCCAATGCACTGTATCACCGCTTTCCCCGCGTGGATGAAGGAGATATGAGCCGTATGCGTGCGACACTTGTGCGCGGAAATACCCTGGCAGAACTGGCGCGCGAGTTCGAACTGGGAGAGTGCTTACGCCTTGGTCCCGGTGAGCTGAAGTCCGGGGGCTTTCGTCGTGAGTCTATCCTTGCTGATACGGTTGAAGCTTTAATCGGGGGTGTATTTTTAGACTCAGACATCCAAACAGTGGAAAAGCTTATCTTGAACTGGTACCAAACCCGTTTAGATGAGATCAGCCCGGGGGACAAACAAAAGGACCCAAAGACACGTTTGCAGGAGTACCTTCAAGGGCGTCACCTGCCCTTGCCAACATACTTAGTAGTCCAGGTACGTGGAGAAGCACACGATCAGGAGTTCACCATTCACTGTCAAGTTAGTGGGTTATCCGAACCTGTAGTGGGGACGGGCTCCTCACGTCGCAAAGCGGAACAAGCTGCGGCTGAACAGGCATTGAAAAAATTGGAGCTTGAGTAA
SEQ ID NO.30
氨基酸
HT115-E38A-K12opt-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.31
DNA
Ag001-E38A-R86C-R107A-R108A
肠杆菌科
ATGAATCCCATCGTAATAAATAGGCTGCAGCGTAAGCTGGGCTACACTTTTCAACATCAGGATCTGTTGCAACAGGCATTAACCCATCGGAGTGCCAGCAGCAAGCATAATGCCCGCTTGGAGTTTTTGGGTGACTCCATTCTCAGTTATGTCATCGCGAATGCGCTGTATCATCGTTTTCCTCGCGTAGATGAAGGCGACATGAGCCGCATGCGTGCGACGCTGGTGCGCGGCAATACGCTGGCGGAAATCGCCTGCGAGTTCGAACTGGGTGAGTGTCTGCGTCTTGGGCCGGGTGAACTGAAAAGTGGCGGTTTCGCCGCCGAGTCGATTCTTGCTGATACCGTGGAAGCGTTGATCGGTGGCGTCTTCCTCGACAGCGACATTCAGAACGTTGAGCGTTTGATTCTCTCGTGGTATCAGACCCGTCTCGACGAAATCAGTCCAGGCGACAAGCAAAAAGATCCGAAAACGCGTCTGCAGGAGTACCTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGTCGTATCTGGTGGTGCAGGTGCGTGGTGAAGCGCACGATCAAGAATTTACCATTCACTGTCAGGTGAGTGGCCTGCCTGAGCCTGTCGTAGGGACGGGCTCAAGCCGCCGTAAAGCGGAACAGGCTGCGGCTGAGCAGGCACTGAAAAAGCTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.32
氨基酸
Ag001-E38A-R86C-R107A-R108A-aa
肠杆菌科
MNPIVINRLQRKLGYTFQHQDLLQQALTHRSASSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAEIACEFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQNVERLILSWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPSYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLPEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.33
DNA
HT115-E117Q
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACGGTGCAGGCTTTGATCGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.34
氨基酸
HT115-E117Q-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVQALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.35
DNA
HT115-E117D
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACGGTGGACGCTTTGATCGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.36
氨基酸
HT115-E117D-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVDALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.37
DNA
HT115-Q153P
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGACAAGCCCAAGGACCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.38
氨基酸
HT115-Q153P-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKPKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.39
DNA
HT115-D155E
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGCGTTTAGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGACAAGCAGAAGGAGCCCAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.40
氨基酸
HT115-D155E-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASSKHNERLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKEPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.41
DNA
HT115-E38A-ΔS33-R107A-R108A
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGTAAACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTGCCGCCGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.42
氨基酸
HT115-E38A-ΔS33-R107A-R108A-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSASKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.43
DNA
HT115-E38A-S33A-ΔS34-R107A-R108A
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCGCCAAACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTGCCGCCGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.44
氨基酸
HT115-E38A-S33A-ΔS34-R107A-R108A-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSAAKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFAAESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.45
DNA
HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTAAACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.46
氨基酸
HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSKHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.47
DNA
HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34-K35V
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGTACACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.48
氨基酸
HT115-E38A-ΔA32-ΔS33-ΔS34-K35V-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSVHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.49
DNA
HT115-E38A-ΔS33-ΔS34-ΔK35
大肠杆菌
ATGAACCCCATCGTAATTAATCGGCTTCAACGGAAGCTGGGCTACACTTTTAATCATCAGGAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCCACAATGCCCGCTTGGAATTTTTAGGCGACTCTATTCTGAGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAAGGCGATATGAGCCGGATGCGCGCCACGCTGGTCCGTGGCAATACGCTGGCGGAACTGGCGCGCGAATTTGAGTTAGGCGAGTGCTTACGTTTAGGGCCAGGTGAACTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAAGCATTAATTGGTGGCGTATTCCTCGACAGTGATATTCAAACCGTCGAGAAATTAATCCTCAACTGGTATCAAACTCGTTTGGACGAAATTAGCCCAGGCGATAAACAAAAAGATCCGAAAACGCGCTTGCAAGAATATTTGCAGGGTCGCCATCTGCCGCTGCCGACTTATCTGGTAGTCCAGGTACGTGGCGAAGCGCACGATCAGGAATTTACTATCCACTGCCAGGTCAGCGGCCTGAGTGAACCGGTGGTTGGCACAGGTTCAAGCCGTCGTAAGGCTGAGCAGGCTGCCGCCGAACAGGCGTTGAAAAAACTGGAGCTGGAATGA
SEQ ID NO.50
氨基酸
HT115-E38A-ΔS33-ΔS34-ΔK35-aa
大肠杆菌
MNPIVINRLQRKLGYTFNHQELLQQALTHRSAHNARLEFLGDSILSYVIANALYHRFPRVDEGDMSRMRATLVRGNTLAELAREFELGECLRLGPGELKSGGFRRESILADTVEALIGGVFLDSDIQTVEKLILNWYQTRLDEISPGDKQKDPKTRLQEYLQGRHLPLPTYLVVQVRGEAHDQEFTIHCQVSGLSEPVVGTGSSRRKAEQAAAEQALKKLELE
SEQ ID NO.51
DNA
HT115-E30A
疣微菌门
ATGAATCCGCTCGAAGACCGCATCGGTTACAAGTTCCGCAACGCGCTGTTGCTGGAAGAAGCGCTCACGCATCCCAGTGTGAGGCACGCGCGCCTGGAGTTTTTGGGCGATGCGGTCCTGCAGCTCGTGATGACGGAACACCTGTTCGGGCATTTTAAGAAAGAAGCCGAAGGGACGCTGACGAAACTGCGCTCGCGGCTTGTTTCGCGGGAGGCCCTCGCCGTTCATGCGGCGACGCTCGAACTGGGACGCTATCTGGCCGTCGGCCGCGGTGAGGACGCGAGCGGCGGTCGCGAACGCAATTCGACGCTCGCCGACGCTTTCGAGGCGCTCGTCGGAGCGATCTATCTCGATAGCGATCTGGCCACGGTGCGTCGCTTTATCCTGGATCAGGCAGCGGGCGATCTGGCGCAACTCGTCGACGAACCGACCGATATCAACCCGAAGGGTCACCTGCAGGAATTGCTCCAGGCGATTTCGCCCCGCAGCCCGGTTTACGAAGTGATTTCGCAGACCGGGCCGGAGCACGAAAAGACGTTTGTGATTCGCGCGGTTTGGGAGGGCATCACGCTCGGGGAGGGAACCGGGCGAAGCAAGAAACAGGCGGAAACGGCCGCCGCCGAGGAGGCGATGCGGCAAAAGCGGTGGGAAACGGAAAAGACGTCGACCGCACCTTCTCGGTAG
SEQ ID NO.52
氨基酸
HT115-E30A-aa
疣微菌门
MNPLEDRIGYKFRNALLLEEALTHPSVRHARLEFLGDAVLQLVMTEHLFGHFKKEAEGTLTKLRSRLVSREALAVHAATLELGRYLAVGRGEDASGGRERNSTLADAFEALVGAIYLDSDLATVRRFILDQAAGDLAQLVDEPTDINPKGHLQELLQAISPRSPVYEVISQTGPEHEKTFVIRAVWEGITLGEGTGRSKKQAETAAAEEAMRQKRWETEKTSTAPSR
SEQ ID NO.53
DNA
HT115-E30A-K12opt
疣微菌门
ATGAATCCTTTAGAAGACCGTATTGGGTATAAGTTTCGTAATGCTTTACTGCTGGAAGAAGCTTTGACCCACCCATCTGTGCGCCACGCTCGTTTGGAGTTCTTGGGAGACGCGGTGTTACAATTAGTAATGACAGAACACCTGTTCGGGCACTTTAAGAAAGAAGCTGAAGGGACTTTAACGAAACTTCGTAGCCGTTTGGTTTCCCGCGAGGCTCTGGCTGTCCACGCTGCCACTTTGGAACTTGGACGTTATTTGGCTGTGGGCCGTGGCGAGGACGCATCCGGCGGACGTGAGCGTAACTCAACGTTAGCGGACGCCTTCGAGGCTCTGGTGGGCGCGATTTATCTTGATTCAGACCTGGCAACCGTTCGTCGCTTTATTCTTGATCAGGCTGCAGGGGATTTGGCACAGTTGGTAGATGAACCGACCGATATTAACCCTAAAGGTCATTTACAGGAACTTTTGCAGGCTATCTCCCCTCGTTCCCCAGTATATGAAGTTATCTCTCAAACTGGTCCAGAACACGAAAAGACATTCGTAATCCGCGCAGTATGGGAGGGTATCACTTTAGGGGAGGGAACGGGACGCAGTAAAAAACAAGCTGAGACGGCAGCTGCTGAGGAAGCTATGCGCCAAAAGCGTTGGGAGACGGAGAAAACTTCCACGGCCCCTTCCCGTTAA
SEQ ID NO.54
氨基酸
HT115-E30A-K12opt-aa
疣微菌门
MNPLEDRIGYKFRNALLLEEALTHPSVRHARLEFLGDAVLQLVMTEHLFGHFKKEAEGTLTKLRSRLVSREALAVHAATLELGRYLAVGRGEDASGGRERNSTLADAFEALVGAIYLDSDLATVRRFILDQAAGDLAQLVDEPTDINPKGHLQELLQAISPRSPVYEVISQTGPEHEKTFVIRAVWEGITLGEGTGRSKKQAETAAAEEAMRQKRWETEKTSTAPSR
SEQ ID NO.55
DNA
蜡状芽孢杆菌-E58A
蜡状芽孢杆菌
ATGCCGTACCGAAAATATAGAGAAAAAAAATACGAAACAAAATATCGTGAAGCATTTAAAGTGTTTCAAGAAAAGATAGGTATTACGTTTACAGATGAAAAATTATTGATTCAAGCATTTACGCATTCATCGTATGTGAATGAGCATCGAAAAAAACCGCATGAAGACAACGCCCGCCTCGAATTTCTTGGAGATGCAGTATTGGAACTTACTGTATCGCAGTATCTGTTTCAAAAATATCCGACAATGAGCGAAGGAGAGTTAACAAAACTACGTGCAGCTATTGTATGTGAGCCATCTCTTGTTCGTTTTGCGAACGAATTGTCATTTGGTAGCCTTGTTTTATTAGGAAAAGGTGAAGAAATGACAGGTGGACGTGAACGACCAGCTTTATTAGCGGATGTCTTTGAAGCGTTTATTGGTGCCCTTTATCTTGATCAAGGGTTAGAAACAGTTTGGGAATTCTTAAAAGAAATTGTATATCCGAAAATTAATGAGGGTGCTTTTTCTCATGTGATGGATTATAAGAGTCAGTTACAAGAATTGATTCAGCGTGATGGTAGTGGCAATGTTGAGTATCAAATTTTGCAAGAAAAAGGACCAGCTCACAATCGAGAATTTGTGTCACGTGTTACGTTAAATAACGTAGCTTTAGGTCTTGGTAGTGGTAAGTCGAAAAAAGAAGCAGAGCAACAAGCTGCTGCAGAAGCATTGAAAAAATTAAAAGAACAACTATAA
SEQ ID NO.56
氨基酸
蜡状芽孢杆菌-E58A-aa
蜡状芽孢杆菌
MPYRKYREKKYETKYREAFKVFQEKIGITFTDEKLLIQAFTHSSYVNEHRKKPHEDNARLEFLGDAVLELTVSQYLFQKYPTMSEGELTKLRAAIVCEPSLVRFANELSFGSLVLLGKGEEMTGGRERPALLADVFEAFIGALYLDQGLETVWEFLKEIVYPKINEGAFSHVMDYKSQLQELIQRDGSGNVEYQILQEKGPAHNREFVSRVTLNNVALGLGSGKSKKEAEQQAAAEALKKLKEQL
SEQ ID NO.57
DNA
枯草芽孢杆菌-E59A
蜡状芽孢杆菌
ATGTCAAAACACTCACATTATAAAGATAAAAAAAAGTTCTATAAAAAAGTAGAACAATTTAAAGAGTTTCAAGAACGGATTTCGGTTCACTTTCAAAATGAAAAGCTTTTGTATCAAGCATTTACACATTCATCTTATGTGAATGAGCATCGGAAAAAGCCGTATGAGGACAACGCTAGACTTGAATTTTTAGGTGACGCTGTTTTGGAACTGACGATCTCCAGATTCTTATTTGCCAAATACCCGGCTATGAGTGAAGGAGATTTGACGAAATTGAGAGCCGCAATTGTTTGCGAACCGTCTCTCGTTTCATTGGCTCACGAGCTGTCATTCGGCGATCTTGTCCTGTTGGGTAAAGGCGAGGAAATGACAGGCGGAAGAAAGCGTCCTGCTCTATTGGCGGATGTTTTTGAGGCATTTATCGGAGCCTTGTACCTTGACCAAGGATTAGAGCCGGTCGAAAGTTTCTTAAAAGTTTATGTGTTCCCTAAAATTAACGATGGTGCTTTTTCTCATGTGATGGATTTCAAAAGCCAGCTGCAGGAATACGTGCAGCGGGACGGCAAAGGCTCTCTGGAGTATAAAATCTCCAACGAAAAAGGACCTGCGCACAACCGTGAATTTGAAGCCATCGTATCTCTAAAAGGTGAACCACTCGGAGTCGGAAACGGCCGTTCAAAGAAAGAAGCCGAACAGCACGCTGCTCAGGAAGCTTTAGCTAAATTGCAAAAACACCATACGAAACAATAA
SEQ ID NO.58
氨基酸
枯草芽孢杆菌-E59A-aa
枯草芽孢杆菌
MSKHSHYKDKKKFYKKVEQFKEFQERISVHFQNEKLLYQAFTHSSYVNEHRKKPYEDNARLEFLGDAVLELTISRFLFAKYPAMSEGDLTKLRAAIVCEPSLVSLAHELSFGDLVLLGKGEEMTGGRKRPALLADVFEAFIGALYLDQGLEPVESFLKVYVFPKINDGAFSHVMDFKSQLQEYVQRDGKGSLEYKISNEKGPAHNREFEAIVSLKGEPLGVGNGRSKKEAEQHAAQEALAKLQKHHTKQ
SEQ ID NO.59
DNA
蜡状芽孢杆菌-E137K
蜡状芽孢杆菌
ATGCCGTACCGAAAATATAGAGAAAAAAAATACGAAACAAAATATCGTGAAGCATTTAAAGTGTTTCAAGAAAAGATAGGTATTACGTTTACAGATGAAAAATTATTGATTCAAGCATTTACGCATTCATCGTATGTGAATGAGCATCGAAAAAAACCGCATGAAGATAATGAGCGTCTTGAATTTCTTGGAGATGCAGTATTGGAACTTACTGTATCGCAGTATCTGTTTCAAAAATATCCGACAATGAGCGAAGGAGAGTTAACAAAACTACGTGCAGCTATTGTATGTGAGCCATCTCTTGTTCGTTTTGCGAACGAATTGTCATTTGGTAGCCTTGTTTTATTAGGAAAAGGTGAAGAAATGACAGGTGGACGTGAACGACCAGCTTTATTAGCGGATGTCTTCAAGGCCTTCATCGGTGCCCTTTATCTTGATCAAGGGTTAGAAACAGTTTGGGAATTCTTAAAAGAAATTGTATATCCGAAAATTAATGAGGGTGCTTTTTCTCATGTGATGGATTATAAGAGTCAGTTACAAGAATTGATTCAGCGTGATGGTAGTGGCAATGTTGAGTATCAAATTTTGCAAGAAAAAGGACCAGCTCACAATCGAGAATTTGTGTCACGTGTTACGTTAAATAACGTAGCTTTAGGTCTTGGTAGTGGTAAGTCGAAAAAAGAAGCAGAGCAACAAGCTGCTGCAGAAGCATTGAAAAAATTAAAAGAACAACTATAA
SEQ ID NO.60
氨基酸
蜡状芽孢杆菌-E137K-aa
蜡状芽孢杆菌
MPYRKYREKKYETKYREAFKVFQEKIGITFTDEKLLIQAFTHSSYVNEHRKKPHEDNERLEFLGDAVLELTVSQYLFQKYPTMSEGELTKLRAAIVCEPSLVRFANELSFGSLVLLGKGEEMTGGRERPALLADVFKAFIGALYLDQGLETVWEFLKEIVYPKINEGAFSHVMDYKSQLQELIQRDGSGNVEYQILQEKGPAHNREFVSRVTLNNVALGLGSGKSKKEAEQQAAAEALKKLKEQL
SEQ ID NO.62
DNA
Ecoli-tetsac
人工
GAACTGTTGCAGCAGGCATTAACTCATCGTAGTGCCAGCAGTAAACATAACGAGTCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC
SEQ ID NO.63
DNA
Ecoli-tet-sacB38R1
人工
CGCATTGGCGATAACGTAGCTCAGAATAGAGTCGCCTAAAAATTCTAAACGATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC
SEQ ID NO.64
DNA
Ecoli-oligo-E38A
人工
GTAGCTCAGAATAGAGTCGCCTAAAAATTCGAAGCGGGCATTGTGTTTACTGCTGGCACTACGATGAGTTAATGC
SEQ ID NO.65
DNA
Ecoli-E38A-1F
人工
AGTAAACACAATGCCCGCTTC
SEQ ID NO.66
DNA
Ecoli-E38A-1R
人工
ATGCTTCGACGGTGTCGG
SEQ ID NO.67
DNA
Ecoli-tet-sacB117F1
人工
CTTAAAAGCGGTGGATTTCGTCGTGAGTCAATTCTCGCCGACACCGTCGAATCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC
SEQ ID NO.68
DNA
Ecoli-tet-sacB117R1
人工
TAATTTCTCGACGGTTTGAATATCACTGTCGAGGAATACGCCACCAATTAATGCATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC
SEQ ID NO.69
DNA
Ecoli-oligo-E117K
人工
TTGAATATCACTGTCGAGGAATACGCCACCGATGAAAGCCTTCACGGTGTCGGCGAGAATTGACTCACGACGAAA
SEQ ID NO.70
DNA
Ecoli-E117K-1F
人工
GACACC GTGAAGGCTTTCATC
SEQ ID NO.71
DNA
Ecoli-E117K-1R
人工
TTCAACGCCTGTTCGGC
SEQ ID NO.72
DNA
Ecoli-oligo-E38A-F2
人工
GTAGCTCAGAATAGAGTCGCCTAAAAATTCCAAGCGGGCATTGTGTTTACTGCTGGCACTACGATGAGTTAATGC
SEQ ID NO.73
DNA
Ecoli-E38A-2F
人工
AGTAAACACAATGCCCGCTTG
SEQ ID NO.74
DNA
Ecoli-oligo-E117K-F2
人工
TTGAATATCACTGTCGAGGAATACGCCACCGATCAAAGCCTTCACGGTGTCGGCGAGAATTGACTCACGACGAAA
SEQ ID NO.75
DNA
Ecoli-E117K-2F
人工
GACACCGTGAAGGCTTTGATC
SEQ ID NO.76
DNA
Ecoli-tet-sacB-E65F1
人工
AGCTACGTTATCGCCAATGCGCTTTATCACCGTTTCCCTCGTGTGGATGAATCCTAATTTTTGTTGACACTCTATC
SEQ ID NO.77
DNA
Ecoli-tet-sacB-E65R1
人工
CGCCAGCGTATTGCCACGGACCAGCGTGGCGCGCATCCGGCTCATATCGCCATCAAAGGGAAAACTGTCCATATGC
SEQ ID NO.78
DNA
Ecoli-oligo-E65A-F1
人工
CAGCGTGGCGCGCATCCGGCTCATATCGCCGGCGTCGACGCGGGGGAAACGGTGATAAAGCGCATTGGCGATAAC
SEQ ID NO.79
DNA
Ecoli-E65A-1F
人工
TTTCCCCCGCGTCGACGC
SEQ ID NO.80
DNA
JD-5
人工
ACCGGTAAACTGAAACTGCA
SEQ ID NO.81
DNA
Tet-sacB-JD-R1
人工
TGGCAAGACTGGCATGATAAG
SEQ ID NO.82
DNA
JD-3
人工
TGGAGATTTTCTGCCCCAG
SEQ ID NO.83
RNA
TMVU1-MP-F6-RNA21
人工
CAGUUCAAGGUCGUUCCCAAU
SEQ ID NO.84
RNA
TMVU1-MP-F7-RNA23
人工
UGAAGAUGUCAGCGGGUUUCUGU
SEQ ID NO.85
RNA
TMVU1-MP-R6-RNA25
人工
CCAGACGUUUUUCAUCGCGUCCUGG
SEQ ID NO.86
RNA
TMVU1-MP-R7-RNA27
人工
ACGACUUCUUCUGUAAGUUCCAUGGGC
SEQ ID NO.87
RNA
TMVU1-MP-F6-RNA29
人工
CAGUUCAAGGUCGUUCCCAAUUAUGCUAU
SEQ ID NO.88
DNA
Pveg-F1
人工
ATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGGGAGTTCTGAGAATTGGTATGC
SEQ ID NO.89
DNA
Pveg-R1
人工
ACACCTCCTTTACTACATTTATTGTACAACACGAGC
SEQ ID NO.90
DNA
Pveg-F2
人工
ATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGAAGCTTGGAGTTCTGAGAATTGGTATGC
SEQ ID NO.91
DNA
Pveg-R2
人工
ACGCGATCCCCGGGTACCGAGCTCGCTCGAGACACCTCCTTTACTACATTTATTGTACAACACGAGC
SEQ ID NO.92
DNA
Bc-E58A-F1
人工
ACAATAAATGTAGTAAAGGAGGTGTATGCCGTACCGAAAATATAGAG
SEQ ID NO.93
DNA
Bc-E58A-R1
人工
GAGGCGGGCGTTGTCTTCATGCGGTTTTTTTCG
SEQ ID NO.94
DNA
Bc-E58A-F2
人工
ACCGCATGAAGACAACGCCCGCCTCGAATTTCTTGGAGATGCAGTATTG
SEQ ID NO.95
DNA
Bc-E58A-R2
人工
ACGCGATCCCCGGGTACCGAGCTCGTTATAGTTGTTCTTTTAATTTTTTCAATG
SEQ ID NO.96
DNA
Bc-E137K-R1
人工
GATGAAGGCCTTGAAGACATCCGCTAATAAAGCTGG
SEQ ID NO.97
DNA
Bc-E137K-F1
人工
AGCGGATGTCTTCAAGGCCTTCATCGGTGCCCTTTATCTTGATCAAG
SEQ ID NO.98
DNA
pAD-E58A-F1
人工
CAATAAATGTAGTAAAGGAGGTGTCATGCCGTACCGAAAATATAGAG
SEQ ID NO.99
DNA
pAD-E58A-人工
GCGAGCTCGGTACCCGGGGATCGCGTTATAGTTGTTCTTTTAATTTTTTCAATG
SEQ ID NO.100
DNA
Eco-F1
人工
ACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA
SEQ ID NO.101
DNA
SglyA-R1
人工
CATGTTCGCTTGTGCACCA
SEQ ID NO.102
DNA
Ae-JD-5
人工
AACTAACGACATCCCCTGTCGT
SEQ ID NO.103
DNA
Ae-JD-3
人工
CGCAGCTTGTTCAGCACCAT
SEQ ID NO.104
DNA
TMVMP-探针1s
人工
TCTCGGATCTTACTACACAGCAGCTGCAAAGAAAAGATTTCAGTT
SEQ ID NO.105
DNA
TMVMP-探针2as
人工
TCCTGGGTGGTTATAGCATAATTGGGAACGACCTTGAACTGAAAT
SEQ ID NO.106
DNA
TMVMP-探针3s
人工
CACCCAGGACGCGATGAAAAACGTCTGGCAAGTTTTAGTTAATAT
SEQ ID NO.107
DNA
TMVMP-探针4as
人工
AGCGGACAGAAACCCGCTGACATCTTCACATTTCTAATATTAACT
SEQ ID NO.108
DNA
TMVMP-探针5s
人工
CTGTCCGCTTTCTCTGGAGTTTGTGTCGGTGTGTATTGTTTATAG
SEQ ID NO.109
DNA
TMVMP-探针6as
人工
CCCTCCGTCTCTCACGTTTGTAATCTTCTCTCTCAAACCTAATTT
SEQ ID NO.110
DNA
TMVMP-探针8as
人工
CTTTGCAAGCCTGATCGACATAGGGACATCTTCCATGAACTCATC
SEQ ID NO.111
DNA
TMVMP-探针9s
人工
GTTTCGATCTCGAACCGGAAAAAAGAGTGATGTCCGCAAAGGGAA
SEQ ID NO.112
DNA
TMVU1-MP-F6-21
人工
CAGTTCAAGGTCGTTCCCAAT
SEQ ID NO.113
DNA
TMVU1-MP-R6-21
GTTTTTCATCGCGTCCTGGGT
SEQ ID NO.114
DNA
TMVU1-MP-F7-21
人工
AAGATGTCAGCGGGTTTCTGT
SEQ ID NO.115
DNA
TMVU1-MP-R7-21
人工
CTTCTTCTGTAAGTTCCATGG
SEQ ID NO.116
DNA
TMVU1-MP-F7-21
人工
AAGATGTCAGCGGGTTTCTGT
SEQ ID NO.117
DNA
TMVU1-MP-R7-21
人工
CTTCTTCTGTAAGTTCCATGG
SEQ ID NO.118
DNA
TMVU1-MP-F4
人工
CCAGGACGCGATGAAAAACG
SEQ ID NO.119
DNA
TMVU1-MP-R4
人工
GGACAGAAACCCGCTGACAT
SEQ ID NO.120
DNA
Ec-16SrRNA-F1
人工
GAATGCCACGGTGAATACGTT
SEQ ID NO.121
DNA
Ec-16SrRNA-R1
人工
ACCCACTCCCATGGTGTGA
序列表
<110> 美国卵石实验室公司
<120> 使用RNase III突变体产生sRNA以控制宿主病原体感染的系统、方法和组合物
<130> 90115.00191
<150> US 62/651,143
<151> 2018-03-31
<160> 121
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 1
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 2
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 2
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 3
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 3
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacacaa tgcccgcttg 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 4
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 4
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 5
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 5
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
ccccgcgtcg acgccggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 6
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 6
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Ala Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 7
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 7
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacacaa tgcccgcttg 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttgc cgccgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 8
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 8
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 9
<211> 681
<212> DNA
<213> 肠杆菌科Ag001（Enterobacteriaceae Ag001）
<400> 9
atgaatccca tcgtaataaa taggctgcag cgtaagctgg gctacacttt tcaacatcag 60
gatctgttgc aacaggcatt aacccatcgg agtgccagca gcaagcataa tgcccgcttg 120
gagtttttgg gtgactccat tctcagttat gtcatcgcga atgcgctgta tcatcgtttt 180
cctcgcgtag atgaaggcga catgagccgc atgcgtgcga cgctggtgcg cggcaatacg 240
ctggcggaaa tcgcccgcga gttcgaactg ggtgagtgtc tgcgtcttgg gccgggtgaa 300
ctgaaaagtg gcggtttccg tcgcgagtcg attcttgctg ataccgtgga agcgttgatc 360
ggtggcgtct tcctcgacag cgacattcag aacgttgagc gtttgattct ctcgtggtat 420
cagacccgtc tcgacgaaat cagtccaggc gacaagcaaa aagatccgaa aacgcgtctg 480
caggagtacc tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgtcgt atctggtggt gcaggtgcgt 540
ggtgaagcgc acgatcaaga atttaccatt cactgtcagg tgagtggcct gcctgagcct 600
gtcgtaggga cgggctcaag ccgccgtaaa gcggaacagg ctgcggctga gcaggcactg 660
aaaaagctgg agctggaatg a 681
<210> 10
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠杆菌科Ag001（Enterobacteriaceae Ag001）
<400> 10
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Gln His Gln Asp Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Asn Val Glu Arg Leu Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Pro Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 11
<211> 681
<212> DNA
<213> 肠杆菌科Ag001（Enterobacteriaceae Ag001）
<400> 11
atgaatccca tcgtaataaa taggctgcag cgtaagctgg gctacacttt tcaacatcag 60
gatctgttgc aacaggcatt aacccatcgg agtgccagca gcaagcataa tgcccgcttg 120
gagtttttgg gtgactccat tctcagttat gtcatcgcga atgcgctgta tcatcgtttt 180
cctcgcgtag atgaaggcga catgagccgc atgcgtgcga cgctggtgcg cggcaatacg 240
ctggcggaaa tcgcccgcga gttcgaactg ggtgagtgtc tgcgtcttgg gccgggtgaa 300
ctgaaaagtg gcggtttcgc cgccgagtcg attcttgctg ataccgtgga agcgttgatc 360
ggtggcgtct tcctcgacag cgacattcag aacgttgagc gtttgattct ctcgtggtat 420
cagacccgtc tcgacgaaat cagtccaggc gacaagcaaa aagatccgaa aacgcgtctg 480
caggagtacc tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgtcgt atctggtggt gcaggtgcgt 540
ggtgaagcgc acgatcaaga atttaccatt cactgtcagg tgagtggcct gcctgagcct 600
gtcgtaggga cgggctcaag ccgccgtaaa gcggaacagg ctgcggctga gcaggcactg 660
aaaaagctgg agctggaatg a 681
<210> 12
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠杆菌科Ag001（Enterobacteriaceae Ag001）
<400> 12
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Gln His Gln Asp Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Asn Val Glu Arg Leu Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Pro Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 13
<211> 681
<212> DNA
<213> 肠杆菌Ae003（Enterobacter Ae003）
<400> 13
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt tcatcatcag 60
gagttgttgc aacaggcatt aacccaccgc agtgccagca gcaagcacaa cgcccgcctg 120
gagtttttag gcgactctat tttaagtttc gtgattgcga atgcgcttta tcatcgtttc 180
ccgcgcgtgg atgaaggtga tatgagccgc atgcgtgcca cgctggttcg gggtaacacc 240
cttgcggaaa tcgcgcgcga atttgaactg ggcgaatgtc tgcgtcttgg gccgggtgaa 300
ctgaaaagcg gcggcttccg tcgtgaatct attcttgccg atacggtcga agcattaatt 360
ggtggtgtgt tcctggacag cgatatccag accgtcgaaa agctgatcct gaactggtat 420
cagacccgtc tggacgaaat cagcccgggc gataaacaaa aagatcccaa aacgcgtctg 480
caggaatatt tgcagggccg tcatctgccg ctgccatctt atctggtggt gcaggttcgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttaccatc cattgccagg tcagtggcct gagtgaaccg 600
gtggtgggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgaacagg ctgccgccga acaggcgtta 660
aaaatgctgg agctggaatg a 681
<210> 14
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠杆菌Ae003（Enterobacter Ae003）
<400> 14
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe His His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Phe Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Met Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 15
<211> 681
<212> DNA
<213> 肠杆菌Ae003（Enterobacter Ae003）
<400> 15
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt tcatcatcag 60
gagttgttgc aacaggcatt aacccaccgc agtgccagca gcaagcacaa cgcccgcctg 120
gagtttttag gcgactctat tttaagtttc gtgattgcga atgcgcttta tcatcgtttc 180
ccgcgcgtgg atgaaggtga tatgagccgc atgcgtgcca cgctggttcg gggtaacacc 240
cttgcggaaa tcgcgcgcga atttgaactg ggcgaatgtc tgcgtcttgg gccgggtgaa 300
ctgaaaagcg gcggcttcgc cgccgaatct attcttgccg atacggtcga agcattaatt 360
ggtggtgtgt tcctggacag cgatatccag accgtcgaaa agctgatcct gaactggtat 420
cagacccgtc tggacgaaat cagcccgggc gataaacaaa aagatcccaa aacgcgtctg 480
caggaatatt tgcagggccg tcatctgccg ctgccatctt atctggtggt gcaggttcgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttaccatc cattgccagg tcagtggcct gagtgaaccg 600
gtggtgggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgaacagg ctgccgccga acaggcgtta 660
aaaatgctgg agctggaatg a 681
<210> 16
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠杆菌Ae003（Enterobacter Ae003）
<400> 16
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe His His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Phe Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Met Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 17
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 17
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Ala Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 18
<211> 1166
<212> DNA
<213> 肠细菌（Enterobacteria）
<400> 18
aactaacgac atcccctgtc gttgtgtata gaatattccc ccgaagttta aggttggccc 60
tgcaagggtg ccacggcaca cgaaaccgcg ttggttttct caggtcggtt tcgtgtgctg 120
catttttgac gcattcattt attggtatcg catgaacccc atcgtaatta atcggcttca 180
acggaagctg ggctacactt ttcatcatca ggagttgttg caacaggcat taacccaccg 240
cagtgccagc agcaaacata atgagcgtct cgagttttta ggcgactcta ttttaagttt 300
cgtgattgcg aatgcgcttt atcatcgttt cccgcgcgtg gatgaaggtg atatgagccg 360
catgcgtgcc acgctggttc ggggtaacac ccttgcggaa atcgcgcgcg aatttgaact 420
gggcgaatgt ctgcgtcttg ggccgggtga actgaaaagc ggcggcttcc gtcgtgaatc 480
tattcttgcc gatacggtcg aagcattaat tggtggtgtg ttcctggaca gcgatatcca 540
gaccgtcgaa aagctgatcc tgaactggta tcagacccgt ctggacgaaa tcagcccggg 600
cgataaacaa aaagatccca aaacgcgtct gcaggaatat ttgcagggcc gtcatctgcc 660
gctgccatct tatctggtgg tgcaggttcg tggcgaagcg cacgatcagg aatttaccat 720
ccattgccag gtcagtggcc tgagtgaacc ggtggtgggc acaggttcaa gccgtcgtaa 780
ggctgaacag gctgccgccg aacaggcgtt aaaaatgctg gagctggaat gagcgaagaa 840
aagacctatt gcggatttat tgccatcgtc ggacgtccga acgtcggcaa atccaccctg 900
ttgaataatc tgcttgggca gaagatttct atcacctcgc gtaaggctca gaccacgcgt 960
caccgcatcg tcggtatcca tactgaaggc gcgtatcagg cgatctacgt cgataccccg 1020
ggcctgcaca tggaagagaa gcgtgccatc aaccgtctga tgaacaaggc ggcgagcagc 1080
tcgattggcg acgtggagct ggtgattttc gttgtggaag gcacccgctg gacgcctgac 1140
gacgagatgg tgctgaacaa gctgcg 1166
<210> 19
<211> 1166
<212> DNA
<213> 肠细菌（Enterobacteria）
<400> 19
aactaacgac atcccctgtc gttgtgtata gaatattccc ccgaagttta aggttggccc 60
tgcaagggtg ccacggcaca cgaaaccgcg ttggttttct caggtcggtt tcgtgtgctg 120
catttttgac gcattcattt attggtatcg catgaacccc atcgtaatta atcggcttca 180
acggaagctg ggctacactt ttcatcatca ggagttgttg caacaggcat taacccaccg 240
cagtgccagc agcaaacata atgagcgtct cgagttttta ggcgactcta ttttaagttt 300
cgtgattgcg aatgcgcttt atcatcgttt cccgcgcgtg gatgaaggtg atatgagccg 360
catgcgtgcc acgctggttc ggggtaatac ccttgcggaa atcgcgcgcg aatttgagct 420
gggcgaatgt ctgcgtcttg ggccgggtga actgaaaagc ggcggcttcc gtcgtgaatc 480
tattcttgcc gatacggtcg aagcattaat tggtggtgtg ttcctggaca gcgatatcca 540
gaccgtcgaa aagctgatcc tgaactggta tcagacccgt ctggacgaaa tcagcccggg 600
cgataaacaa aaagatccca aaacgcgtct gcaggaatat ttgcagggcc gtcatctgcc 660
gctgccatct tatctggtgg tgcaggttcg tggcgaagcg cacgatcagg aatttaccat 720
ccattgccag gtcagtggcc tgagtgaacc ggtggtgggc acaggttcaa gccgtcgtaa 780
ggctgaacag gctgccgccg aacaggcgtt aaaaatgctg gagctggaat gagcgaagaa 840
aagacctatt gcggatttat tgccatcgtc ggacgtccga acgtcggcaa atccaccctg 900
ttgaataatc tgcttgggca gaagatttct atcacctcgc gtaaggcgca gaccacgcgt 960
caccgcatcg tcggtatcca tactgaaggc gcgtatcagg cgatctacgt cgatacaccg 1020
ggcctgcaca tggaagagaa gcgtgccatc aaccgtctga tgaacaaggc ggcgagcagc 1080
tcaattggcg acgtggagct ggtgattttc gttgtggaag gcacccgctg gacgccggac 1140
gacgagatgg tgctgaacaa gctgcg 1166
<210> 20
<211> 1172
<212> DNA
<213> 肠细菌（Enterobacteria）
<400> 20
aactaacgac atcccctgtc gttgtgtata gaatattccc gcctttaaag attggctccc 60
gaaagggagc cacggcacac gaaacagcgt tggtttcctt ttttcaggtc tgttccgtgt 120
gctgaatagt tgacgcattc attaattttg gtatcgcatg aatcccatcg taataaatag 180
gctgcagcgt aagctgggct acacttttca acatcaggat ctgttgcaac aggcattaac 240
ccatcggagt gccagcagca aacacaacga gcgtcttgag tttttgggtg actccattct 300
cagttatgtc atcgcgaatg cgctgtatca tcgttttcct cgcgtagatg aaggcgacat 360
gagccgcatg cgtgcgacgc tggtgcgcgg caatacgctg gcggaaatcg cccgcgagtt 420
cgaactgggt gagtgtctgc gtcttgggcc gggtgaactg aaaagtggcg gtttccgtcg 480
cgagtcgatt cttgctgata ccgtggaagc gttgatcggt ggcgtcttcc tcgacagcga 540
cattcagaac gttgagcgtt tgattctctc gtggtatcag acccgtctcg acgaaatcag 600
tccaggcgac aagcaaaaag atccgaaaac gcgtctgcag gagtacctgc agggtcgcca 660
tctgccgctg ccgtcgtatc tggtggtgca ggtgcgtggt gaagcgcacg atcaagaatt 720
taccattcac tgtcaggtga gtggcctgcc tgagcctgtc gtagggacgg gctcaagccg 780
ccgtaaagcg gaacaggctg cggctgagca ggcactgaaa aagctggagc tggaatgagc 840
gaagaaaaaa cgtattgcgg cttcgcggcc attgttggtc gcccgaacgt cggcaaatcc 900
acgctgctga atcagctgct tgggcaaaaa gtttccatta cctcgcgtaa ggcgcaaacc 960
acgcgccacc gcatcatggg catccatacc gaagggccat atcaggcgat ttacgtcgat 1020
accccggggc tgcacatgga agaaaaacgc gccattaacc gcctgatgaa ccgcgcggca 1080
agcagctcca tcggtgacgt tgagctggtt atcttcgtgg ttgaaggcac ccgctggacg 1140
ccggatgatg aaatggtgct gaacaagctg cg 1172
<210> 21
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠细菌（Enterobacteria）
<400> 21
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Gln His Gln Asp Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Asn Val Glu Arg Leu Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Pro Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 22
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠细菌（Enterobacteria）
<400> 22
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe His His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Phe Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Met Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 23
<211> 684
<212> DNA
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 23
atgaatccgc tcgaagaccg catcggttac aagttccgca acgcgctgtt gctggaagaa 60
gcgctcacgc atcccagtgt gaggcacgag cgcctggagt ttttgggcga tgcggtcctg 120
cagctcgtga tgacggaaca cctgttcggg cattttaaga aagaagccga agggacgctg 180
acgaaactgc gctcgcggct tgtttcgcgg gaggccctcg ccgttcatgc ggcgacgctc 240
gaactgggac gctatctggc cgtcggccgc ggtgaggacg cgagcggcgg tcgcgaacgc 300
aattcgacgc tcgccgacgc tttcgaggcg ctcgtcggag cgatctatct cgatagcgat 360
ctggccacgg tgcgtcgctt tatcctggat caggcagcgg gcgatctggc gcaactcgtc 420
gacgaaccga ccgatatcaa cccgaagggt cacctgcagg aattgctcca ggcgatttcg 480
ccccgcagcc cggtttacga agtgatttcg cagaccgggc cggagcacga aaagacgttt 540
gtgattcgcg cggtttggga gggcatcacg ctcggggagg gaaccgggcg aagcaagaaa 600
caggcggaaa cggccgccgc cgaggaggcg atgcggcaaa agcggtggga aacggaaaag 660
acgtcgaccg caccttctcg gtag 684
<210> 24
<211> 227
<212> PRT
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 24
Met Asn Pro Leu Glu Asp Arg Ile Gly Tyr Lys Phe Arg Asn Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Glu Glu Ala Leu Thr His Pro Ser Val Arg His Glu Arg Leu
20 25 30
Glu Phe Leu Gly Asp Ala Val Leu Gln Leu Val Met Thr Glu His Leu
35 40 45
Phe Gly His Phe Lys Lys Glu Ala Glu Gly Thr Leu Thr Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Val Ser Arg Glu Ala Leu Ala Val His Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Glu Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Val Gly Arg Gly Glu Asp Ala Ser Gly
85 90 95
Gly Arg Glu Arg Asn Ser Thr Leu Ala Asp Ala Phe Glu Ala Leu Val
100 105 110
Gly Ala Ile Tyr Leu Asp Ser Asp Leu Ala Thr Val Arg Arg Phe Ile
115 120 125
Leu Asp Gln Ala Ala Gly Asp Leu Ala Gln Leu Val Asp Glu Pro Thr
130 135 140
Asp Ile Asn Pro Lys Gly His Leu Gln Glu Leu Leu Gln Ala Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Ser Pro Val Tyr Glu Val Ile Ser Gln Thr Gly Pro Glu His
165 170 175
Glu Lys Thr Phe Val Ile Arg Ala Val Trp Glu Gly Ile Thr Leu Gly
180 185 190
Glu Gly Thr Gly Arg Ser Lys Lys Gln Ala Glu Thr Ala Ala Ala Glu
195 200 205
Glu Ala Met Arg Gln Lys Arg Trp Glu Thr Glu Lys Thr Ser Thr Ala
210 215 220
Pro Ser Arg
225
<210> 25
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 25
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtgaa ggctttcatc 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 26
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 26
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Lys Ala Phe Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 27
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 27
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtgaa ggctttgatc 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 28
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 28
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Lys Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 29
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 29
atgaatccca tcgtgatcaa ccgtttgcag cgtaaattgg gttacacttt taatcaccaa 60
gaattgctgc agcaggcatt gacccaccgc tccgcttcgt ctaaacacaa cgcccgtctg 120
gaatttttag gagattcgat cctgtcttac gtgatcgcca atgcactgta tcaccgcttt 180
ccccgcgtgg atgaaggaga tatgagccgt atgcgtgcga cacttgtgcg cggaaatacc 240
ctggcagaac tggcgcgcga gttcgaactg ggagagtgct tacgccttgg tcccggtgag 300
ctgaagtccg ggggctttcg tcgtgagtct atccttgctg atacggttga agctttaatc 360
gggggtgtat ttttagactc agacatccaa acagtggaaa agcttatctt gaactggtac 420
caaacccgtt tagatgagat cagcccgggg gacaaacaaa aggacccaaa gacacgtttg 480
caggagtacc ttcaagggcg tcacctgccc ttgccaacat acttagtagt ccaggtacgt 540
ggagaagcac acgatcagga gttcaccatt cactgtcaag ttagtgggtt atccgaacct 600
gtagtgggga cgggctcctc acgtcgcaaa gcggaacaag ctgcggctga acaggcattg 660
aaaaaattgg agcttgagta a 681
<210> 30
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 30
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 31
<211> 681
<212> DNA
<213> 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）
<400> 31
atgaatccca tcgtaataaa taggctgcag cgtaagctgg gctacacttt tcaacatcag 60
gatctgttgc aacaggcatt aacccatcgg agtgccagca gcaagcataa tgcccgcttg 120
gagtttttgg gtgactccat tctcagttat gtcatcgcga atgcgctgta tcatcgtttt 180
cctcgcgtag atgaaggcga catgagccgc atgcgtgcga cgctggtgcg cggcaatacg 240
ctggcggaaa tcgcctgcga gttcgaactg ggtgagtgtc tgcgtcttgg gccgggtgaa 300
ctgaaaagtg gcggtttcgc cgccgagtcg attcttgctg ataccgtgga agcgttgatc 360
ggtggcgtct tcctcgacag cgacattcag aacgttgagc gtttgattct ctcgtggtat 420
cagacccgtc tcgacgaaat cagtccaggc gacaagcaaa aagatccgaa aacgcgtctg 480
caggagtacc tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgtcgt atctggtggt gcaggtgcgt 540
ggtgaagcgc acgatcaaga atttaccatt cactgtcagg tgagtggcct gcctgagcct 600
gtcgtaggga cgggctcaag ccgccgtaaa gcggaacagg ctgcggctga gcaggcactg 660
aaaaagctgg agctggaatg a 681
<210> 32
<211> 226
<212> PRT
<213> 肠杆菌科（Enterobacteriaceae）
<400> 32
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Gln His Gln Asp Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Ile Ala Cys Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Asn Val Glu Arg Leu Ile Leu Ser Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Ser Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Pro Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 33
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 33
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acacggtgca ggctttgatc 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 34
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 34
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Gln Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 35
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 35
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acacggtgga cgctttgatc 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gataaacaaa aagatccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 36
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 36
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Asp Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 37
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 37
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gacaagccca aggacccgaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 38
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 38
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Pro Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 39
<211> 681
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 39
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagcgttta 120
gaatttttag gcgactctat tctgagctac gttatcgcca atgcgcttta tcaccgtttc 180
cctcgtgtgg atgaaggcga tatgagccgg atgcgcgcca cgctggtccg tggcaatacg 240
ctggcggaac tggcgcgcga atttgagtta ggcgagtgct tacgtttagg gccaggtgaa 300
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga agcattaatt 360
ggtggcgtat tcctcgacag tgatattcaa accgtcgaga aattaatcct caactggtat 420
caaactcgtt tggacgaaat tagcccaggc gacaagcaga aggagcccaa aacgcgcttg 480
caagaatatt tgcagggtcg ccatctgccg ctgccgactt atctggtagt ccaggtacgt 540
ggcgaagcgc acgatcagga atttactatc cactgccagg tcagcggcct gagtgaaccg 600
gtggttggca caggttcaag ccgtcgtaag gctgagcagg ctgccgccga acaggcgttg 660
aaaaaactgg agctggaatg a 681
<210> 40
<211> 226
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 40
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Ser Lys His Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu
35 40 45
Ser Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp
50 55 60
Glu Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr
65 70 75 80
Leu Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu
85 90 95
Gly Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu
100 105 110
Ala Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp
115 120 125
Ile Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu
130 135 140
Asp Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Glu Pro Lys Thr Arg Leu
145 150 155 160
Gln Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val
165 170 175
Val Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys
180 185 190
Gln Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg
195 200 205
Arg Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu
210 215 220
Leu Glu
225
<210> 41
<211> 678
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 41
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagta aacacaatgc ccgcttggaa 120
tttttaggcg actctattct gagctacgtt atcgccaatg cgctttatca ccgtttccct 180
cgtgtggatg aaggcgatat gagccggatg cgcgccacgc tggtccgtgg caatacgctg 240
gcggaactgg cgcgcgaatt tgagttaggc gagtgcttac gtttagggcc aggtgaactt 300
aaaagcggtg gatttgccgc cgagtcaatt ctcgccgaca ccgtcgaagc attaattggt 360
ggcgtattcc tcgacagtga tattcaaacc gtcgagaaat taatcctcaa ctggtatcaa 420
actcgtttgg acgaaattag cccaggcgat aaacaaaaag atccgaaaac gcgcttgcaa 480
gaatatttgc agggtcgcca tctgccgctg ccgacttatc tggtagtcca ggtacgtggc 540
gaagcgcacg atcaggaatt tactatccac tgccaggtca gcggcctgag tgaaccggtg 600
gttggcacag gttcaagccg tcgtaaggct gagcaggctg ccgccgaaca ggcgttgaaa 660
aaactggagc tggaatga 678
<210> 42
<211> 225
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 42
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ser Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu Ser
35 40 45
Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp Glu
50 55 60
Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu Gly
85 90 95
Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu Ala
100 105 110
Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp Ile
115 120 125
Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu Asp
130 135 140
Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu Gln
145 150 155 160
Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val Val
165 170 175
Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys Gln
180 185 190
Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg Arg
195 200 205
Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu Leu
210 215 220
Glu
225
<210> 43
<211> 678
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 43
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccgcca aacacaatgc ccgcttggaa 120
tttttaggcg actctattct gagctacgtt atcgccaatg cgctttatca ccgtttccct 180
cgtgtggatg aaggcgatat gagccggatg cgcgccacgc tggtccgtgg caatacgctg 240
gcggaactgg cgcgcgaatt tgagttaggc gagtgcttac gtttagggcc aggtgaactt 300
aaaagcggtg gatttgccgc cgagtcaatt ctcgccgaca ccgtcgaagc attaattggt 360
ggcgtattcc tcgacagtga tattcaaacc gtcgagaaat taatcctcaa ctggtatcaa 420
actcgtttgg acgaaattag cccaggcgat aaacaaaaag atccgaaaac gcgcttgcaa 480
gaatatttgc agggtcgcca tctgccgctg ccgacttatc tggtagtcca ggtacgtggc 540
gaagcgcacg atcaggaatt tactatccac tgccaggtca gcggcctgag tgaaccggtg 600
gttggcacag gttcaagccg tcgtaaggct gagcaggctg ccgccgaaca ggcgttgaaa 660
aaactggagc tggaatga 678
<210> 44
<211> 225
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 44
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
Ala Lys His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu Ser
35 40 45
Tyr Val Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp Glu
50 55 60
Gly Asp Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr Leu
65 70 75 80
Ala Glu Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu Gly
85 90 95
Pro Gly Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Ala Ala Glu Ser Ile Leu Ala
100 105 110
Asp Thr Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp Ile
115 120 125
Gln Thr Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu Asp
130 135 140
Glu Ile Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu Gln
145 150 155 160
Glu Tyr Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val Val
165 170 175
Gln Val Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys Gln
180 185 190
Val Ser Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg Arg
195 200 205
Lys Ala Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu Leu
210 215 220
Glu
225
<210> 45
<211> 672
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 45
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtaaacaca atgcccgctt ggaattttta 120
ggcgactcta ttctgagcta cgttatcgcc aatgcgcttt atcaccgttt ccctcgtgtg 180
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gagctggaat ga 672
<210> 46
<211> 223
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 46
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Lys
20 25 30
His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu Ser Tyr Val
35 40 45
Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp Glu Gly Asp
50 55 60
Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr Leu Ala Glu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu Gly Pro Gly
85 90 95
Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu Ala Asp Thr
100 105 110
Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp Ile Gln Thr
115 120 125
Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu Asp Glu Ile
130 135 140
Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu Gln Glu Tyr
145 150 155 160
Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val Val Gln Val
165 170 175
Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys Gln Val Ser
180 185 190
Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg Arg Lys Ala
195 200 205
Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu Leu Glu
210 215 220
<210> 47
<211> 672
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 47
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgtacaca atgcccgctt ggaattttta 120
ggcgactcta ttctgagcta cgttatcgcc aatgcgcttt atcaccgttt ccctcgtgtg 180
gatgaaggcg atatgagccg gatgcgcgcc acgctggtcc gtggcaatac gctggcggaa 240
ctggcgcgcg aatttgagtt aggcgagtgc ttacgtttag ggccaggtga acttaaaagc 300
ggtggatttc gtcgtgagtc aattctcgcc gacaccgtcg aagcattaat tggtggcgta 360
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ttggacgaaa ttagcccagg cgataaacaa aaagatccga aaacgcgctt gcaagaatat 480
ttgcagggtc gccatctgcc gctgccgact tatctggtag tccaggtacg tggcgaagcg 540
cacgatcagg aatttactat ccactgccag gtcagcggcc tgagtgaacc ggtggttggc 600
acaggttcaa gccgtcgtaa ggctgagcag gctgccgccg aacaggcgtt gaaaaaactg 660
gagctggaat ga 672
<210> 48
<211> 223
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 48
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Val
20 25 30
His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu Ser Tyr Val
35 40 45
Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp Glu Gly Asp
50 55 60
Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr Leu Ala Glu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu Gly Pro Gly
85 90 95
Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu Ala Asp Thr
100 105 110
Val Glu Ala Leu Ile Gly Gly Val Phe Leu Asp Ser Asp Ile Gln Thr
115 120 125
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130 135 140
Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu Gln Glu Tyr
145 150 155 160
Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val Val Gln Val
165 170 175
Arg Gly Glu Ala His Asp Gln Glu Phe Thr Ile His Cys Gln Val Ser
180 185 190
Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg Arg Lys Ala
195 200 205
Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu Leu Glu
210 215 220
<210> 49
<211> 672
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 49
atgaacccca tcgtaattaa tcggcttcaa cggaagctgg gctacacttt taatcatcag 60
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgcccaca atgcccgctt ggaattttta 120
ggcgactcta ttctgagcta cgttatcgcc aatgcgcttt atcaccgttt ccctcgtgtg 180
gatgaaggcg atatgagccg gatgcgcgcc acgctggtcc gtggcaatac gctggcggaa 240
ctggcgcgcg aatttgagtt aggcgagtgc ttacgtttag ggccaggtga acttaaaagc 300
ggtggatttc gtcgtgagtc aattctcgcc gacaccgtcg aagcattaat tggtggcgta 360
ttcctcgaca gtgatattca aaccgtcgag aaattaatcc tcaactggta tcaaactcgt 420
ttggacgaaa ttagcccagg cgataaacaa aaagatccga aaacgcgctt gcaagaatat 480
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gagctggaat ga 672
<210> 50
<211> 223
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（E. coli）
<400> 50
Met Asn Pro Ile Val Ile Asn Arg Leu Gln Arg Lys Leu Gly Tyr Thr
1 5 10 15
Phe Asn His Gln Glu Leu Leu Gln Gln Ala Leu Thr His Arg Ser Ala
20 25 30
His Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly Asp Ser Ile Leu Ser Tyr Val
35 40 45
Ile Ala Asn Ala Leu Tyr His Arg Phe Pro Arg Val Asp Glu Gly Asp
50 55 60
Met Ser Arg Met Arg Ala Thr Leu Val Arg Gly Asn Thr Leu Ala Glu
65 70 75 80
Leu Ala Arg Glu Phe Glu Leu Gly Glu Cys Leu Arg Leu Gly Pro Gly
85 90 95
Glu Leu Lys Ser Gly Gly Phe Arg Arg Glu Ser Ile Leu Ala Asp Thr
100 105 110
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115 120 125
Val Glu Lys Leu Ile Leu Asn Trp Tyr Gln Thr Arg Leu Asp Glu Ile
130 135 140
Ser Pro Gly Asp Lys Gln Lys Asp Pro Lys Thr Arg Leu Gln Glu Tyr
145 150 155 160
Leu Gln Gly Arg His Leu Pro Leu Pro Thr Tyr Leu Val Val Gln Val
165 170 175
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180 185 190
Gly Leu Ser Glu Pro Val Val Gly Thr Gly Ser Ser Arg Arg Lys Ala
195 200 205
Glu Gln Ala Ala Ala Glu Gln Ala Leu Lys Lys Leu Glu Leu Glu
210 215 220
<210> 51
<211> 684
<212> DNA
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 51
atgaatccgc tcgaagaccg catcggttac aagttccgca acgcgctgtt gctggaagaa 60
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acgaaactgc gctcgcggct tgtttcgcgg gaggccctcg ccgttcatgc ggcgacgctc 240
gaactgggac gctatctggc cgtcggccgc ggtgaggacg cgagcggcgg tcgcgaacgc 300
aattcgacgc tcgccgacgc tttcgaggcg ctcgtcggag cgatctatct cgatagcgat 360
ctggccacgg tgcgtcgctt tatcctggat caggcagcgg gcgatctggc gcaactcgtc 420
gacgaaccga ccgatatcaa cccgaagggt cacctgcagg aattgctcca ggcgatttcg 480
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acgtcgaccg caccttctcg gtag 684
<210> 52
<211> 227
<212> PRT
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 52
Met Asn Pro Leu Glu Asp Arg Ile Gly Tyr Lys Phe Arg Asn Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Glu Glu Ala Leu Thr His Pro Ser Val Arg His Ala Arg Leu
20 25 30
Glu Phe Leu Gly Asp Ala Val Leu Gln Leu Val Met Thr Glu His Leu
35 40 45
Phe Gly His Phe Lys Lys Glu Ala Glu Gly Thr Leu Thr Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Val Ser Arg Glu Ala Leu Ala Val His Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Glu Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Val Gly Arg Gly Glu Asp Ala Ser Gly
85 90 95
Gly Arg Glu Arg Asn Ser Thr Leu Ala Asp Ala Phe Glu Ala Leu Val
100 105 110
Gly Ala Ile Tyr Leu Asp Ser Asp Leu Ala Thr Val Arg Arg Phe Ile
115 120 125
Leu Asp Gln Ala Ala Gly Asp Leu Ala Gln Leu Val Asp Glu Pro Thr
130 135 140
Asp Ile Asn Pro Lys Gly His Leu Gln Glu Leu Leu Gln Ala Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Ser Pro Val Tyr Glu Val Ile Ser Gln Thr Gly Pro Glu His
165 170 175
Glu Lys Thr Phe Val Ile Arg Ala Val Trp Glu Gly Ile Thr Leu Gly
180 185 190
Glu Gly Thr Gly Arg Ser Lys Lys Gln Ala Glu Thr Ala Ala Ala Glu
195 200 205
Glu Ala Met Arg Gln Lys Arg Trp Glu Thr Glu Lys Thr Ser Thr Ala
210 215 220
Pro Ser Arg
225
<210> 53
<211> 684
<212> DNA
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 53
atgaatcctt tagaagaccg tattgggtat aagtttcgta atgctttact gctggaagaa 60
gctttgaccc acccatctgt gcgccacgct cgtttggagt tcttgggaga cgcggtgtta 120
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acgaaacttc gtagccgttt ggtttcccgc gaggctctgg ctgtccacgc tgccactttg 240
gaacttggac gttatttggc tgtgggccgt ggcgaggacg catccggcgg acgtgagcgt 300
aactcaacgt tagcggacgc cttcgaggct ctggtgggcg cgatttatct tgattcagac 360
ctggcaaccg ttcgtcgctt tattcttgat caggctgcag gggatttggc acagttggta 420
gatgaaccga ccgatattaa ccctaaaggt catttacagg aacttttgca ggctatctcc 480
cctcgttccc cagtatatga agttatctct caaactggtc cagaacacga aaagacattc 540
gtaatccgcg cagtatggga gggtatcact ttaggggagg gaacgggacg cagtaaaaaa 600
caagctgaga cggcagctgc tgaggaagct atgcgccaaa agcgttggga gacggagaaa 660
acttccacgg ccccttcccg ttaa 684
<210> 54
<211> 227
<212> PRT
<213> 疣微菌门（Verrucomicrobia）
<400> 54
Met Asn Pro Leu Glu Asp Arg Ile Gly Tyr Lys Phe Arg Asn Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Glu Glu Ala Leu Thr His Pro Ser Val Arg His Ala Arg Leu
20 25 30
Glu Phe Leu Gly Asp Ala Val Leu Gln Leu Val Met Thr Glu His Leu
35 40 45
Phe Gly His Phe Lys Lys Glu Ala Glu Gly Thr Leu Thr Lys Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Val Ser Arg Glu Ala Leu Ala Val His Ala Ala Thr Leu
65 70 75 80
Glu Leu Gly Arg Tyr Leu Ala Val Gly Arg Gly Glu Asp Ala Ser Gly
85 90 95
Gly Arg Glu Arg Asn Ser Thr Leu Ala Asp Ala Phe Glu Ala Leu Val
100 105 110
Gly Ala Ile Tyr Leu Asp Ser Asp Leu Ala Thr Val Arg Arg Phe Ile
115 120 125
Leu Asp Gln Ala Ala Gly Asp Leu Ala Gln Leu Val Asp Glu Pro Thr
130 135 140
Asp Ile Asn Pro Lys Gly His Leu Gln Glu Leu Leu Gln Ala Ile Ser
145 150 155 160
Pro Arg Ser Pro Val Tyr Glu Val Ile Ser Gln Thr Gly Pro Glu His
165 170 175
Glu Lys Thr Phe Val Ile Arg Ala Val Trp Glu Gly Ile Thr Leu Gly
180 185 190
Glu Gly Thr Gly Arg Ser Lys Lys Gln Ala Glu Thr Ala Ala Ala Glu
195 200 205
Glu Ala Met Arg Gln Lys Arg Trp Glu Thr Glu Lys Thr Ser Thr Ala
210 215 220
Pro Ser Arg
225
<210> 55
<211> 738
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）
<400> 55
atgccgtacc gaaaatatag agaaaaaaaa tacgaaacaa aatatcgtga agcatttaaa 60
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acgcattcat cgtatgtgaa tgagcatcga aaaaaaccgc atgaagacaa cgcccgcctc 180
gaatttcttg gagatgcagt attggaactt actgtatcgc agtatctgtt tcaaaaatat 240
ccgacaatga gcgaaggaga gttaacaaaa ctacgtgcag ctattgtatg tgagccatct 300
cttgttcgtt ttgcgaacga attgtcattt ggtagccttg ttttattagg aaaaggtgaa 360
gaaatgacag gtggacgtga acgaccagct ttattagcgg atgtctttga agcgtttatt 420
ggtgcccttt atcttgatca agggttagaa acagtttggg aattcttaaa agaaattgta 480
tatccgaaaa ttaatgaggg tgctttttct catgtgatgg attataagag tcagttacaa 540
gaattgattc agcgtgatgg tagtggcaat gttgagtatc aaattttgca agaaaaagga 600
ccagctcaca atcgagaatt tgtgtcacgt gttacgttaa ataacgtagc tttaggtctt 660
ggtagtggta agtcgaaaaa agaagcagag caacaagctg ctgcagaagc attgaaaaaa 720
ttaaaagaac aactataa 738
<210> 56
<211> 245
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）
<400> 56
Met Pro Tyr Arg Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Tyr Glu Thr Lys Tyr Arg
1 5 10 15
Glu Ala Phe Lys Val Phe Gln Glu Lys Ile Gly Ile Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Glu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Phe Thr His Ser Ser Tyr Val Asn Glu
35 40 45
His Arg Lys Lys Pro His Glu Asp Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu Gly
50 55 60
Asp Ala Val Leu Glu Leu Thr Val Ser Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Tyr
65 70 75 80
Pro Thr Met Ser Glu Gly Glu Leu Thr Lys Leu Arg Ala Ala Ile Val
85 90 95
Cys Glu Pro Ser Leu Val Arg Phe Ala Asn Glu Leu Ser Phe Gly Ser
100 105 110
Leu Val Leu Leu Gly Lys Gly Glu Glu Met Thr Gly Gly Arg Glu Arg
115 120 125
Pro Ala Leu Leu Ala Asp Val Phe Glu Ala Phe Ile Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Leu Asp Gln Gly Leu Glu Thr Val Trp Glu Phe Leu Lys Glu Ile Val
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Ile Asn Glu Gly Ala Phe Ser His Val Met Asp Tyr Lys
165 170 175
Ser Gln Leu Gln Glu Leu Ile Gln Arg Asp Gly Ser Gly Asn Val Glu
180 185 190
Tyr Gln Ile Leu Gln Glu Lys Gly Pro Ala His Asn Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ser Arg Val Thr Leu Asn Asn Val Ala Leu Gly Leu Gly Ser Gly Lys
210 215 220
Ser Lys Lys Glu Ala Glu Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Leu Lys Lys
225 230 235 240
Leu Lys Glu Gln Leu
245
<210> 57
<211> 750
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）
<400> 57
atgtcaaaac actcacatta taaagataaa aaaaagttct ataaaaaagt agaacaattt 60
aaagagtttc aagaacggat ttcggttcac tttcaaaatg aaaagctttt gtatcaagca 120
tttacacatt catcttatgt gaatgagcat cggaaaaagc cgtatgagga caacgctaga 180
cttgaatttt taggtgacgc tgttttggaa ctgacgatct ccagattctt atttgccaaa 240
tacccggcta tgagtgaagg agatttgacg aaattgagag ccgcaattgt ttgcgaaccg 300
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caggaatacg tgcagcggga cggcaaaggc tctctggagt ataaaatctc caacgaaaaa 600
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gtcggaaacg gccgttcaaa gaaagaagcc gaacagcacg ctgctcagga agctttagct 720
aaattgcaaa aacaccatac gaaacaataa 750
<210> 58
<211> 249
<212> PRT
<213> 枯草芽胞杆菌（B. subtilis）
<400> 58
Met Ser Lys His Ser His Tyr Lys Asp Lys Lys Lys Phe Tyr Lys Lys
1 5 10 15
Val Glu Gln Phe Lys Glu Phe Gln Glu Arg Ile Ser Val His Phe Gln
20 25 30
Asn Glu Lys Leu Leu Tyr Gln Ala Phe Thr His Ser Ser Tyr Val Asn
35 40 45
Glu His Arg Lys Lys Pro Tyr Glu Asp Asn Ala Arg Leu Glu Phe Leu
50 55 60
Gly Asp Ala Val Leu Glu Leu Thr Ile Ser Arg Phe Leu Phe Ala Lys
65 70 75 80
Tyr Pro Ala Met Ser Glu Gly Asp Leu Thr Lys Leu Arg Ala Ala Ile
85 90 95
Val Cys Glu Pro Ser Leu Val Ser Leu Ala His Glu Leu Ser Phe Gly
100 105 110
Asp Leu Val Leu Leu Gly Lys Gly Glu Glu Met Thr Gly Gly Arg Lys
115 120 125
Arg Pro Ala Leu Leu Ala Asp Val Phe Glu Ala Phe Ile Gly Ala Leu
130 135 140
Tyr Leu Asp Gln Gly Leu Glu Pro Val Glu Ser Phe Leu Lys Val Tyr
145 150 155 160
Val Phe Pro Lys Ile Asn Asp Gly Ala Phe Ser His Val Met Asp Phe
165 170 175
Lys Ser Gln Leu Gln Glu Tyr Val Gln Arg Asp Gly Lys Gly Ser Leu
180 185 190
Glu Tyr Lys Ile Ser Asn Glu Lys Gly Pro Ala His Asn Arg Glu Phe
195 200 205
Glu Ala Ile Val Ser Leu Lys Gly Glu Pro Leu Gly Val Gly Asn Gly
210 215 220
Arg Ser Lys Lys Glu Ala Glu Gln His Ala Ala Gln Glu Ala Leu Ala
225 230 235 240
Lys Leu Gln Lys His His Thr Lys Gln
245
<210> 59
<211> 738
<212> DNA
<213> 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）
<400> 59
atgccgtacc gaaaatatag agaaaaaaaa tacgaaacaa aatatcgtga agcatttaaa 60
gtgtttcaag aaaagatagg tattacgttt acagatgaaa aattattgat tcaagcattt 120
acgcattcat cgtatgtgaa tgagcatcga aaaaaaccgc atgaagataa tgagcgtctt 180
gaatttcttg gagatgcagt attggaactt actgtatcgc agtatctgtt tcaaaaatat 240
ccgacaatga gcgaaggaga gttaacaaaa ctacgtgcag ctattgtatg tgagccatct 300
cttgttcgtt ttgcgaacga attgtcattt ggtagccttg ttttattagg aaaaggtgaa 360
gaaatgacag gtggacgtga acgaccagct ttattagcgg atgtcttcaa ggccttcatc 420
ggtgcccttt atcttgatca agggttagaa acagtttggg aattcttaaa agaaattgta 480
tatccgaaaa ttaatgaggg tgctttttct catgtgatgg attataagag tcagttacaa 540
gaattgattc agcgtgatgg tagtggcaat gttgagtatc aaattttgca agaaaaagga 600
ccagctcaca atcgagaatt tgtgtcacgt gttacgttaa ataacgtagc tttaggtctt 660
ggtagtggta agtcgaaaaa agaagcagag caacaagctg ctgcagaagc attgaaaaaa 720
ttaaaagaac aactataa 738
<210> 60
<211> 245
<212> PRT
<213> 蜡状芽孢杆菌（B. cereus）
<400> 60
Met Pro Tyr Arg Lys Tyr Arg Glu Lys Lys Tyr Glu Thr Lys Tyr Arg
1 5 10 15
Glu Ala Phe Lys Val Phe Gln Glu Lys Ile Gly Ile Thr Phe Thr Asp
20 25 30
Glu Lys Leu Leu Ile Gln Ala Phe Thr His Ser Ser Tyr Val Asn Glu
35 40 45
His Arg Lys Lys Pro His Glu Asp Asn Glu Arg Leu Glu Phe Leu Gly
50 55 60
Asp Ala Val Leu Glu Leu Thr Val Ser Gln Tyr Leu Phe Gln Lys Tyr
65 70 75 80
Pro Thr Met Ser Glu Gly Glu Leu Thr Lys Leu Arg Ala Ala Ile Val
85 90 95
Cys Glu Pro Ser Leu Val Arg Phe Ala Asn Glu Leu Ser Phe Gly Ser
100 105 110
Leu Val Leu Leu Gly Lys Gly Glu Glu Met Thr Gly Gly Arg Glu Arg
115 120 125
Pro Ala Leu Leu Ala Asp Val Phe Lys Ala Phe Ile Gly Ala Leu Tyr
130 135 140
Leu Asp Gln Gly Leu Glu Thr Val Trp Glu Phe Leu Lys Glu Ile Val
145 150 155 160
Tyr Pro Lys Ile Asn Glu Gly Ala Phe Ser His Val Met Asp Tyr Lys
165 170 175
Ser Gln Leu Gln Glu Leu Ile Gln Arg Asp Gly Ser Gly Asn Val Glu
180 185 190
Tyr Gln Ile Leu Gln Glu Lys Gly Pro Ala His Asn Arg Glu Phe Val
195 200 205
Ser Arg Val Thr Leu Asn Asn Val Ala Leu Gly Leu Gly Ser Gly Lys
210 215 220
Ser Lys Lys Glu Ala Glu Gln Gln Ala Ala Ala Glu Ala Leu Lys Lys
225 230 235 240
Leu Lys Glu Gln Leu
245
<210> 61
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tetsac - trunc
<400> 61
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaa 45
<210> 62
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tetsac
<400> 62
gaactgttgc agcaggcatt aactcatcgt agtgccagca gtaaacataa cgagtcctaa 60
tttttgttga cactctatc 79
<210> 63
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tet-sacB38R1
<400> 63
cgcattggcg ataacgtagc tcagaataga gtcgcctaaa aattctaaac gatcaaaggg 60
aaaactgtcc atatgc 76
<210> 64
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-oligo-E38A
<400> 64
gtagctcaga atagagtcgc ctaaaaattc gaagcgggca ttgtgtttac tgctggcact 60
acgatgagtt aatgc 75
<210> 65
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E38A-1F
<400> 65
agtaaacaca atgcccgctt c 21
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E38A-1R
<400> 66
atgcttcgac ggtgtcgg 18
<210> 67
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tet-sacB117F1
<400> 67
cttaaaagcg gtggatttcg tcgtgagtca attctcgccg acaccgtcga atcctaattt 60
ttgttgacac tctatc 76
<210> 68
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tet-sacB117R1
<400> 68
taatttctcg acggtttgaa tatcactgtc gaggaatacg ccaccaatta atgcatcaaa 60
gggaaaactg tccatatgc 79
<210> 69
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-oligo-E117K
<400> 69
ttgaatatca ctgtcgagga atacgccacc gatgaaagcc ttcacggtgt cggcgagaat 60
tgactcacga cgaaa 75
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E117K-1F
<400> 70
gacaccgtga aggctttcat c 21
<210> 71
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E117K-1R
<400> 71
ttcaacgcct gttcggc 17
<210> 72
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-oligo-E38A-F2
<400> 72
gtagctcaga atagagtcgc ctaaaaattc caagcgggca ttgtgtttac tgctggcact 60
acgatgagtt aatgc 75
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E38A-2F
<400> 73
agtaaacaca atgcccgctt g 21
<210> 74
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-oligo-E117K-F2
<400> 74
ttgaatatca ctgtcgagga atacgccacc gatcaaagcc ttcacggtgt cggcgagaat 60
tgactcacga cgaaa 75
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E117K-2F
<400> 75
gacaccgtga aggctttgat c 21
<210> 76
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tet-sacB-E65F1
<400> 76
agctacgtta tcgccaatgc gctttatcac cgtttccctc gtgtggatga atcctaattt 60
ttgttgacac tctatc 76
<210> 77
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-tet-sacB-E65R1
<400> 77
cgccagcgta ttgccacgga ccagcgtggc gcgcatccgg ctcatatcgc catcaaaggg 60
aaaactgtcc atatgc 76
<210> 78
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-oligo-E65A-F1
<400> 78
cagcgtggcg cgcatccggc tcatatcgcc ggcgtcgacg cgggggaaac ggtgataaag 60
cgcattggcg ataac 75
<210> 79
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ecoli-E65A-1F
<400> 79
tttcccccgc gtcgacgc 18
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> JD-5
<400> 80
accggtaaac tgaaactgca 20
<210> 81
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Tet-sacB-JD-R1
<400> 81
tggcaagact ggcatgataa g 21
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> JD-3
<400> 82
tggagatttt ctgccccag 19
<210> 83
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F6-RNA21
<400> 83
caguucaagg ucguucccaa u 21
<210> 84
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F7-RNA23
<400> 84
ugaagauguc agcggguuuc ugu 23
<210> 85
<211> 25
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R6-RNA25
<400> 85
ccagacguuu uucaucgcgu ccugg 25
<210> 86
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R7-RNA27
<400> 86
acgacuucuu cuguaaguuc caugggc 27
<210> 87
<211> 29
<212> RNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F6-RNA29
<400> 87
caguucaagg ucguucccaa uuaugcuau 29
<210> 88
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Pveg-F1
<400> 88
atcacgaggc cctttcgtct tcaagggagt tctgagaatt ggtatgc 47
<210> 89
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Pveg-R1
<400> 89
acacctcctt tactacattt attgtacaac acgagc 36
<210> 90
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Pveg-F2
<400> 90
atcacgaggc cctttcgtct tcaagaagct tggagttctg agaattggta tgc 53
<210> 91
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Pveg-R2
<400> 91
acgcgatccc cgggtaccga gctcgctcga gacacctcct ttactacatt tattgtacaa 60
cacgagc 67
<210> 92
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E58A-F1
<400> 92
acaataaatg tagtaaagga ggtgtatgcc gtaccgaaaa tatagag 47
<210> 93
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E58A-R1
<400> 93
gaggcgggcg ttgtcttcat gcggtttttt tcg 33
<210> 94
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E58A-F2
<400> 94
accgcatgaa gacaacgccc gcctcgaatt tcttggagat gcagtattg 49
<210> 95
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E58A-R2
<400> 95
acgcgatccc cgggtaccga gctcgttata gttgttcttt taattttttc aatg 54
<210> 96
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E137K-R1
<400> 96
gatgaaggcc ttgaagacat ccgctaataa agctgg 36
<210> 97
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Bc-E137K-F1
<400> 97
agcggatgtc ttcaaggcct tcatcggtgc cctttatctt gatcaag 47
<210> 98
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAD-E58A-F1
<400> 98
caataaatgt agtaaaggag gtgtcatgcc gtaccgaaaa tatagag 47
<210> 99
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> pAD-E58A
<400> 99
gcgagctcgg tacccgggga tcgcgttata gttgttcttt taattttttc aatg 54
<210> 100
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Eco-F1
<400> 100
acgaggccct ttcgtcttca a 21
<210> 101
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> SglyA-R1
<400> 101
catgttcgct tgtgcacca 19
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ae-JD-5
<400> 102
aactaacgac atcccctgtc gt 22
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ae-JD-3
<400> 103
cgcagcttgt tcagcaccat 20
<210> 104
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针1s
<400> 104
tctcggatct tactacacag cagctgcaaa gaaaagattt cagtt 45
<210> 105
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针2as
<400> 105
tcctgggtgg ttatagcata attgggaacg accttgaact gaaat 45
<210> 106
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针3s
<400> 106
cacccaggac gcgatgaaaa acgtctggca agttttagtt aatat 45
<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针4as
<400> 107
agcggacaga aacccgctga catcttcaca tttctaatat taact 45
<210> 108
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针5s
<400> 108
ctgtccgctt tctctggagt ttgtgtcggt gtgtattgtt tatag 45
<210> 109
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针6as
<400> 109
ccctccgtct ctcacgtttg taatcttctc tctcaaacct aattt 45
<210> 110
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针8as
<400> 110
ctttgcaagc ctgatcgaca tagggacatc ttccatgaac tcatc 45
<210> 111
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVMP-探针9s
<400> 111
gtttcgatct cgaaccggaa aaaagagtga tgtccgcaaa gggaa 45
<210> 112
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F6-21
<400> 112
cagttcaagg tcgttcccaa t 21
<210> 113
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R6-21
<400> 113
gtttttcatc gcgtcctggg t 21
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F7-21
<400> 114
aagatgtcag cgggtttctg t 21
<210> 115
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R7-21
<400> 115
cttcttctgt aagttccatg g 21
<210> 116
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F7-21
<400> 116
aagatgtcag cgggtttctg t 21
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R7-21
<400> 117
cttcttctgt aagttccatg g 21
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-F4
<400> 118
ccaggacgcg atgaaaaacg 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> TMVU1-MP-R4
<400> 119
ggacagaaac ccgctgacat 20
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ec-16SrRNA-F1
<400> 120
gaatgccacg gtgaatacgt t 21
<210> 121
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<221>
<222>
<223> Ec-16SrRNA-R1
<400> 121
acccactccc atggtgtga 19

Claims (86)

1.一种遗传修饰的细胞，其表达与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述RNase III突变体被配置为用于增强从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)，其中所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细胞选自由以下组成的组：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
3.根据权利要求2所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
4.根据权利要求3所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌包含与靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
5.根据权利要求4所述的遗传修饰的细胞，其中所述靶宿主选自由以下组成的组：植物宿主和动物宿主。
6.根据权利要求5所述的遗传修饰的细胞，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
7.根据权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO.17的氨基酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
8.根据权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
9.根据权利要求6、7和8所述的遗传修饰的细胞，其中所述E38A-R107A-R108A RNaseIII突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
10.根据权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)的RNase III、来自大肠杆菌(E.coli)的RNase III、来自肠杆菌(Enterobacter)的RNase III、来自芽孢杆菌科(Bacillaceae)的RNase III、来自芽孢杆菌(Bacillus)的RNase III、来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌(B.cereus)的RNase III、来自肠道沙门菌(S.enterica)的RNase III、来自铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的RNase III、来自贝氏考克斯菌(C.burnetii)的RNase III、来自荚膜红假单胞菌(R.capsulatus)的RNase III、来自天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的RNase III、来自空肠弯曲菌(C.jejuni)的RNase III、来自幽门螺杆菌(H.pylori)的RNase III、来自金黄色葡萄球菌(S.aureus)的RNase III和来自乳酸乳球菌(L.lactis)的RNase III。
11.根据权利要求6、7和8所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌进一步共表达与编码dsRNA的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的遗传修饰的细胞，其中所述共表达的dsRNA包含针对必需病原体基因的dsRNA。
13.根据权利要求12所述的遗传修饰的细胞，其中所述必需病原体基因包含必需病毒病原体基因。
14.根据权利要求6所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在靶宿主中启动RNA干扰(RNAi)应答途径。
15.根据权利要求14所述的遗传修饰的细菌，其中将所述遗传修饰的细菌引入到靶宿主中包含将遗传修饰的细菌局部地施加至靶宿主植物。
16.根据权利要求15所述的遗传修饰的细胞，其中将所述遗传修饰的细菌引入到靶宿主中包含通过饲料将遗传修饰的细菌引入到靶宿主动物中。
17.根据权利要求6所述的遗传修饰的细胞，其中所述遗传修饰的细菌在发酵罐中生长。
18.根据权利要求17所述的遗传修饰的细胞，其中由所述遗传修饰的细菌产生的所述sRNA是分离的。
19.根据权利要求17所述的遗传修饰的细胞，其中由所述遗传修饰的细菌产生的所述分离的sRNA被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
20.一种组合物，包含：E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
22.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
24.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
25.根据权利要求24所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
26.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
28.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
30.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
32.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
34.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
36.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
37.根据权利要求36所述的组合物，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出：
-22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好；
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；和
-dsRNA切割的增强的催化效率。
38.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
39.一种组合物，包含：E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
40.一种组合物，包含：E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
41.一种组合物，包含：RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
42.一种组合物，包含：RNase III E58A突变体，其中谷氨酸在残基58处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
43.一种组合物，包含：RNase III E59A突变体，其中天冬氨酸在残基59处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
44.一种组合物，包含：RNase III Q153P突变体，其中谷氨酰胺在残基处被脯氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
45.一种组合物，包含：RNase IIID115E突变体，其中谷氨酸在残基处被赖氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
46.一种组合物，包含：RNase III E115K突变体，其中谷氨酸在残基处被赖氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
47.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
48.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
49.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
50.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
51.一种组合物，包含：与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO.17的氨基酸序列。
52.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.24的RNase III E58A突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
53.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.26的RNase III E59A突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
54.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
55.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
56.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
57.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
58.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
59.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.25的RNase III E58A突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
60.一种组合物，包含：与编码根据SEQ ID NO.27的RNase III E59A突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
61.一种产生sRNA的方法，包含以下步骤：
-对细胞进行遗传修饰以表达与至少一种启动子可操作地连接的一个或多个异源多核苷酸序列，所述启动子编码：
-RNase III突变体，其被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)；
-dsRNA，其针对必需病原体基因；
-在培养物中生长所述遗传修饰的细胞；
-用所述RNase III突变体催化切割所述dsRNA以形成sRNA的群体，以产生多个离散大小的sRNA；和
-分离所述遗传修饰的细胞或分离所述离散大小的sRNA。
62.根据权利要求60所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞包含选自由以下组成的组的遗传修饰的细胞：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
63.根据权利要求61所述的方法，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述遗传修饰的细菌包含与靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
65.根据权利要求62所述的方法，其中在培养物中生长所述遗传修饰的细胞的所述步骤包含在发酵罐中生长所述遗传修饰的细胞的步骤。
66.根据权利要求60所述的方法，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
67.根据权利要求60所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO.17的氨基酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
68.根据权利要求60所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
69.根据权利要求65、66和67所述的方法，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
70.根据权利要求60所述的方法，其中被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)的所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
71.根据权利要求62所述的方法，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科的RNase III、来自大肠杆菌的RNase III、来自肠杆菌的RNase III、来自芽孢杆菌科的RNase III、来自芽孢杆菌的RNase III、来自枯草芽孢杆菌的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌的RNase III、来自肠道沙门菌的RNase III、来自铜绿假单胞菌的RNase III、来自贝氏考克斯菌的RNase III、来自荚膜红假单胞菌的RNase III、来自天蓝色链霉菌的RNase III、来自空肠弯曲菌的RNase III、来自幽门螺杆菌的RNaseIII、来自金黄色葡萄球菌的RNase III和来自乳酸乳球菌的RNase III。
72.根据权利要求60所述的方法，其中所述分离的细胞被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
73.根据根据权利要求60所述的方法，其中所述分离的sRNA被引入到靶宿主中，并且其中所述sRNA在所述靶宿主中启动RNAi应答途径。
74.根据权利要求60所述的方法，其中所述必需病原体基因是必需病毒病原体基因。
75.一种在靶宿主中启动DICER非依赖性RNA干扰(RNAi)应答途径的方法，包含以下步骤：
-对缺乏DICER酶的细胞进行遗传修饰，以表达与至少一种启动子可操作地连接的一个或多个异源多核苷酸序列，所述启动子编码：
-RNase III突变体，其被配置为在不存在DICER酶的情况下催化切割双链RNA(dsRNA)；和
-dsRNA，其针对必需病原体基因；
-将所述遗传修饰的细胞引入到靶宿主中；
-用所述RNase III突变体催化切割表达的dsRNA，以形成能够启动DICER非依赖性RNAi应答途径的小RNA(sRNA)的群体；和
-允许所述sRNA从细胞扩散到所述靶宿主并在所述靶宿主中启动针对所述必需病原体基因的DICER非依赖性RNAi应答途径；和
-通过所述DICER非依赖性RNAi应答途径下调所述必需病原体基因。
76.根据权利要求83所述的方法，其中所述遗传修饰的细胞包含选自由以下组成的组的遗传修饰的细胞：遗传修饰的原核细胞和遗传修饰的真核细胞。
77.根据权利要求84所述的方法，其中所述遗传修饰的原核细胞包含遗传修饰的细菌。
78.根据权利要求85所述的方法，其中所述遗传修饰的细菌包含与所述靶宿主共生和/或内共生的遗传修饰的细菌。
79.根据权利要求85所述的方法，其中所述靶宿主选自由以下组成的组：植物靶宿主和动物靶宿主。
80.根据权利要求83所述的方法，其中所述RNase III突变体包含以下中的至少一种：
-E38A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-E65A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；
-RNase III E38A-E65A突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代并且谷氨酸在残基65处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体；和
-E38A-R107A-R108A RNase III突变体，其中谷氨酸在残基38处被丙氨酸替代，精氨酸在残基107处被丙氨酸替代，并且精氨酸在残基108处被丙氨酸替代，或其同源RNase III突变体。
81.根据权利要求83所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.3的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.9和13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.13的E38A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.5的E65A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列，所述E38A-E65A RNase III突变体多核苷酸序列编码根据SEQ ID NO.17的氨基酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.7的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.11的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.15的E38A-R107A-R108A RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
82.根据权利要求84所述的方法，其中与编码RNase III突变体的启动子序列可操作地连接的所述异源多核苷酸序列包含以下中的至少一种：
-与编码根据SEQ ID NO.4的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.10的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.14的E38A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.6的E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.17的E38A-E65A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.8的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；
-与编码根据SEQ ID NO.12的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列；和
-与编码根据SEQ ID NO.16的E38A-R107A-R108A RNase III突变体多肽的启动子序列可操作地连接的异源多核苷酸序列。
83.根据权利要求88、89和90所述的方法，其中所述E38A-R107A-R108A RNase III突变体表现出22和23个核苷酸(nt)的离散dsRNA切割大小偏好。
84.根据权利要求83所述的方法，其中被配置为从双链RNA(dsRNA)的催化切割产生小RNA(sRNA)的所述RNase III突变体与野生型RNase III相比表现出以下增强的特征中的至少一种：
-dsRNA切割模式的增强的稳定性；
-dsRNA切割的增强的催化效率；和
-对一种或多种离散dsRNA切割大小偏好的增强的特异性。
85.根据权利要求85所述的方法，其中所述RNase III突变体来源于选自由以下组成的组的RNase III：来自肠杆菌科的RNase III、来自大肠杆菌的RNase III、来自肠杆菌的RNase III、来自芽孢杆菌科的RNase III、来自芽孢杆菌的RNase III、来自枯草芽孢杆菌的RNase III、来自蜡状芽孢杆菌的RNase III、来自肠道沙门菌的RNase III、来自铜绿假单胞菌的RNase III、来自贝氏考克斯菌的RNase III、来自荚膜红假单胞菌的RNase III、来自天蓝色链霉菌的RNase III、来自空肠弯曲菌的RNase III、来自幽门螺杆菌的RNaseIII、来自金黄色葡萄球菌的RNase III和来自乳酸乳球菌的RNase III。
86.根据权利要求83所述的方法，其中所述必需病原体基因是必需病毒病原体基因。
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