CN114835816B

CN114835816B - 一种调控植物基因组dna特定区域甲基化水平的方法

Info

Publication number: CN114835816B
Application number: CN202110046860.9A
Authority: CN
Inventors: 李家洋; 宋晓光; 余泓; 孟祥兵
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2021-01-14
Publication date: 2023-12-22
Anticipated expiration: 2041-01-14
Also published as: CN114835816A

Abstract

本发明公开了一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法。本发明提供了用于调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的产品，包含1)甲基化调控融合蛋白(包含核酸酶失活的Cas9结构域和甲基化调控结构域)或其表达构建体；和2)向导RNA或其表达构建体；所述甲基化调控结构域是Tet1cd结构域或OsSUVH2结构域。本发明对于深入研究物种间及物种内DNA甲基化的不同特征及其对重要农艺性状的调控作用，及DNA甲基化的维持机制等具有重要意义。通过在不改变基因序列前提下调控基因时空表达模式和水平能精细调控作物在不同环境条件及逆境压力下的表型特点及胁迫响应，从而培育优良的作物品种，有助于保障世界粮食安全。

Description

一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法。

背景技术

甲基化是植物基因组DNA修饰的一种重要形式，对染色质结构及邻近基因表达具有重要的调控作用，参与沉默转座子元件维持基因组稳定性，进而影响植物的生长发育。同时DNA甲基化是一种表观遗传修饰，部分DNA甲基化修饰状态可以遗传到下一代，形成稳定的表观等位基因，例如拟南芥中的FLOWERINGWAGENINGEN基因(Gallego-Bartolomé,Gardiner et al.2018)和水稻中的Epi-d1位点(Miura,Agetsuma et al.2009)。DNA甲基化在高等真核生物、真菌、细菌中都广泛存在，在高等真核生物中主要以5mC的形式存在，分布于异染色质区、转座子区和部分基因的启动子区，可以调控异染色质形成和维持、维持转座子沉默状态、参与基因表达调控。研究发现DNA甲基化调控在水稻种子发育过程、非生物胁迫响应中具有重要作用(Kim,Ono et al.2019,Rajkumar,Shankar et al.2019)。但是在植物中尤其是重要粮食作物如水稻、小麦、玉米中，对DNA甲基化的修饰位点、对临近基因的调控作用和作用机制等了解的不十分清楚。CRISPR/Cas9系统是近年发展的一种基因编辑方法，Cas9蛋白可通过sgRNA上的特异性序列结合到基因组特定位点，并通过Cas9蛋白中的RuvC和HNH结构域切割DNA的两条链，形成DNA双链断裂,通过在RuvC和HNH结构域中引入点突变可使其失去切割DNA的活性。使失活的Cas9蛋白与具有其他功能的蛋白融合表达，例如与提高转录水平的蛋白融合表达，可通过Cas9结合特定基因组DNA位点从而提高下游基因的转录水平。在之前的研究中，研究者通过将人的去甲基化酶TEN-ELEVENTRANSLOCATION1(TET1cd)与人工锌指蛋白融合表达靶向FWA基因的启动子，可以高效的在拟南芥FWA基因启动子区去甲基化，使FWA基因表达量上调，并产生可遗传的晚花表型(Johnson,Du etal.2014)。在另一项研究中，将拟南芥RdDM途径中的一个蛋白SU(VAR)3-9HOMOLOG 9(SUVH9)与人工锌指蛋白融合表达靶向FWA基因的启动子，可以提高FWA基因启动子的甲基化水平，抑制FWA基因表达，并恢复fwa-4突变体的晚花表型。

水稻是一种主要粮食作物，也是基因功能研究中一种重要的单子叶模式植物。与拟南芥相比水稻DNA甲基化具有如下特点：1.水稻中CG、CHG、CHH三种甲基化水平远高于拟南芥。2.CG和CHG甲基化主要集中在异染色质区，修饰转座元件，CHH甲基化主要集中在水稻的常染色质区，修饰一些长度较短的转座元件。水稻基因组中有大量分布于基因间区的MITEs(Miniature Inverted-repeat Transposable Elements)短小DNA转座元件，MITEs主要发生CHH甲基化修饰，并且CHH甲基化修饰在调控附近基因表达中起着非常重要的作用。3.水稻中很多功能基因都有甲基化修饰，说明甲基化修饰可能参与抑制这些基因的表达。DNA甲基化修饰可通过影响染色质状态调控附近基因表达，从而影响生长发育及对环境条件的响应，已鉴定出的参与DNA甲基化调控的因子参与了种子发育、组织器官建成、花发育等，从而对水稻产量产生影响。通过CRISPR系统特异的改变特异基因区域的甲基化水平是研究DNA甲基化修饰调控基因表达的一种重要方式，但是在水稻等单子叶植物中并未有类似的工具可以特异调控靶向位点的甲基化水平。

发明内容

本发明的目的是提供一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法。

第一方面，本发明要求保护一种用于调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的系统(产品)。所述特定区域为靶序列及其附近区域。

本发明要求保护的用于调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的系统，包含(或为)以下中任一项：

i、甲基化调控融合蛋白，和向导RNA。

ii、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体1)，和向导RNA。

iii、甲基化调控融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体。

iv、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体(即表达构建体1)，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体2)。

v、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体(记为表达构建体3)。

所述甲基化调控融合蛋白包含核酸酶失活的Cas9结构域(即失去核酸内切酶活性但是保留靶DNA结合活性的Cas9蛋白，如dCas9)和甲基化调控结构域。进一步地，所述甲基化调控融合蛋白由所述核酸酶失活的Cas9结构域和所述甲基化调控结构域融合而成。

所述向导RNA能够将所述甲基化调控融合蛋白靶向植物基因组DNA中的靶序列。依靠所述向导RNA上的间隔序列(spacer)识别植物基因组DNA中的靶序列。

所述甲基化调控结构域为上调甲基化水平的Tet1cd结构域或下调甲基化水平的OsSUVH2结构域。

进一步地，所述核酸酶失活的Cas9结构域的氨基酸序列可如SEQ ID No.12的第742-2243位(或者SEQ ID No.14的第685-2186位)。

进一步地，所述Tet1cd结构域的氨基酸序列可如SEQ ID No.12的第1-741位所示；所述OsSUVH2结构域的氨基酸序列可如SEQ ID No.14的第1-684位所示。

更进一步地，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列可如SEQ ID No.12或SEQ IDNo.14所示。

当所述甲基化调控结构域是上调甲基化水平的Tet1cd结构域时，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。当所述甲基化调控结构域是下调甲基化水平的OsSUVH2结构域时，所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。

对应于基因水平，编码所述核酸酶失活的Cas9结构域的核苷酸序列可如SEQ IDNo.11的第2224-6732位(或者SEQ ID No.13的第2053-6561位)所示；编码所述Tet1cd结构域的核苷酸序列可如SEQ ID No.11的第1-2223位所示；编码所述OsSUVH2结构域的核苷酸序列如SEQ ID No.13的第1-2052位所示。

进一步地，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列可如SEQ ID No.11或SEQID No.13所示。

当所述甲基化调控结构域是上调甲基化水平的Tet1cd结构域时，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。当所述甲基化调控结构域是下调甲基化水平的OsSUVH2结构域时，编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。

在所述表达构建体1和所述表达构建体3中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是Ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达构建体2和所述表达构建体3中，启动编码所述向导RNA的核苷酸序列转录启动子可以是U3启动子(如水稻U3启动子)。

在本发明中，所述表达构建体具体可为表达载体。

第二方面，本发明要求保护一种表达载体。

本发明要求保护的表达载体包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A用于表达前文第一方面中所述的甲基化调控融合蛋白；

所述表达盒B用于表达不含有间隔序列(spacer)的向导RNA骨架。

进一步地，在所述表达盒B中，可含有用于插入编码间隔序列(spacer)的DNA序列的酶切位点(如BsaI)。

进一步地，在所述表达盒A中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是Ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达盒B中，启动编码所述不含有间隔序列(spacer)的向导RNA骨架的核苷酸序列转录启动子可以是U3启动子(如水稻U3启动子)。

第三方面，本发明要求保护成套表达载体。

本发明要求保护的成套表达载体由表达载体甲和表达载体乙组成。

所述表达载体甲用于表达前文第一方面中所述的甲基化调控融合蛋白；

所述表达载体乙用于表达不含有间隔序列(spacer)的向导RNA骨架。

进一步地，在所述表达载体乙中，可含有用于插入编码间隔序列(spacer)的DNA序列的酶切位点(如BsaI)。

进一步地，在所述表达载体甲中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子可以是Ubi启动子(即玉米泛素启动子)。在所述表达载体乙中，启动编码所述不含有间隔序列(spacer)的向导RNA骨架的核苷酸序列转录启动子可以是U3启动子(如水稻U3启动子)。

第四方面，本发明要求保护如下任一应用：

P1、前文第一方面所述的系统或前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在调控植物基因组DNA特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平中的应用。

P2、前文第一方面所述的系统或前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在植物育种中的应用。

P3、前文第二方面所述的表达载体或前文第三方面所述的成套表达载体在制备前文第一方面所述的系统中的应用。

第五方面，本发明要求保护一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法。所述特定区域为靶序列及其附近区域。

本发明要求保护的调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法，可包括将前文第一方面所述系统导入受体植物中得到转基因植物的步骤。

进一步地，将所述系统导入所述受体植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

当将所述系统导入受体植物中后，由所述向导RNA将所述甲基化调控融合蛋白靶向所述植物基因组DNA中的靶序列，导致靶序列及附近区域甲基化水平发生改变。

当要上调植物基因组DNA特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平时，所述甲基化调控结构域选择上调甲基化水平的所述Tet1cd结构域。当要下调植物基因组DNA特定区域(即靶序列及其附近区域)甲基化水平时，所述甲基化调控结构域选择下调甲基化水平的所述OsSUVH2结构域。

第六方面，本发明要求保护一种植物育种方法，包括如下步骤：将通过前文第五方面所述方法获得的在特异位点(即所述特定区域)甲基化水平改变的第一植物与所述特异位点(即所述特定区域)的甲基化水平没有改变的第二植物杂交，从而将所述特异位点(即所述特定区域)的甲基化水平的改变导入所述第二植物。

其中，所述第一植物和所述第二植物为可杂交的植物，优选为同种植物。

在上述各方面中，所述植物可为单子叶植物；优选为禾本科植物；更优选为水稻。

在上述各方面中，所述特定区域可为IPA1基因启动子区；所述靶序列如SEQ IDNo.1(高甲基化水平区靶点)或SEQ ID No.2(低甲基化水平区靶点)所示。

进一步地，所述向导RNA如SEQ ID No.3(对应SEQ ID No.1)或SEQ ID No.7(对应SEQ ID No.2)所示。

相应地，编码所述向导RNA的核苷酸序列如SEQ ID No.4(对应SEQ ID No.3)或SEQID No.8(对应SEQ ID No.7)所示。

在本发明的具体实施方式中，SEQ ID No.3所示的所述向导RNA与用于上调甲基化水平的所述甲基化调控融合蛋白配合使用；SEQ ID No.4所示的所述向导RNA与用于下调甲基化水平的所述甲基化调控融合蛋白配合使用。

实验证明，本发明所提供的系统和方法能够有效调控植物如水稻基因组DNA特定区域甲基化水平，本发明对于研究植物特别是水稻DNA甲基化修饰调控基因表达，进而培育植物如水稻新品种具有重要意义。对于深入研究物种间及物种内DNA甲基化的不同特征及其对重要农艺性状的调控作用，及DNA甲基化的维持机制等具有重要意义。通过调控基因组DNA甲基化可在不改变基因序列的前提下调控基因的时空表达模式和水平，从而能精细调控作物在不同环境条件及逆境压力下的表型特点及胁迫响应，进而培育优良的作物品种，有助于保障世界粮食安全。

附图说明

图1为构建体A1的质粒图谱。

图2为构建体A2的质粒图谱。

图3为B1转化水稻原生质体中靶点附近甲基化水平。

图4为B2转化水稻原生质体中靶点附近甲基化水平。

图5为B1转基因当代水稻群体的生长情况。

图6为B2转基因当代水稻群体的生长情况。

图7为B1转基因当代水稻和B2转基因当代水稻的分子鉴定。

图8为B1转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平。

图9为B2转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平。

具体实施方式

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的生物化学、分子生物学、遗传学等相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的重组DNA技术和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold Spring Harbor，1989。本发明中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(如包含Cas9的核酸内切酶结构域和/或向导RNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白)基因组编辑系统的组分，能通过向导RNA指导靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。

“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，通常由CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)通过部分互补形成的复合物构成，其中crRNA包含能与靶序列互补并特异性指导CRISPR复合体(Cas9+crRNA+tracrRNA)与靶序列结合的序列，在使用CRISPR系统进行基因编辑及其他应用时，可人工设计单向导RNA(sgRNA)，在一条RNA链中同时包含crRNA和tracrRNA的特征，并指导CRISPR复合体特异与靶序列结合。

“甲基化调控酶”是提高或降低基因组DNA甲基化水平的酶。在本发明中，所述甲基化调控酶指人的去甲基化酶TEN-ELEVEN TRANSLOCATION1(TET1cd)或水稻的甲基化酶SU(VAR)3-9homologs 2(LOC_Os07g25450)，其分别具有降低和提高基因组DNA甲基化水平的作用。

“基因组”用于植物时不仅指细胞核中的染色体DNA，还包括存在于叶绿体、线粒体等细胞器中的DNA。

水稻品种中花11，属于粳型常规稻品种，用ZH11表示。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例将从以下几方面展开：

1、设计甲基化调控酶与失去核酸内切酶活性的Cas9蛋白的融合蛋白，并创制表达构建体。分别设计了降低和提高靶点及附近区域甲基化水平的两种表达构建体，在降低甲基化的构建体A1中将来源于人的去甲基化酶TEN-ELEVENTRANSLOCATION1(Tet1CD)与失去核酸内切酶活性的dCas9蛋白融合表达。在提高甲基化的构建体A2中将水稻SU(VAR)3-9homologs 2(LOC_Os07g25450)(OsSUVH2)与失去核酸内切酶活性的dCas9蛋白融合表达。调控甲基化的Cas9融合蛋白通过玉米泛素(Ubiquitin)启动子驱动表达，同时在此表达构建体中还含有由水稻U3启动子驱动的可表达单向导RNA的序列，并可通过BsaI酶切位点插入靶向特异基因组DNA位点的靶序列，使构建体能靶向特异基因组DNA位点调控附近区域甲基化水平。

2、设计靶向选定基因的靶点并将靶点互补序列连入所述表达构建体A1或A2中，制成可靶向基因组特定位点的表达构建体B1和B2。

3、将靶向特定位点的表达构建体B1和B2在原生质体中瞬时表达，评估调控甲基化水平的效果。

4、将表达构建体B1和B2分别通过转基因方法转入植物中，获得当代转基因植物，并评估在植物体内特异位点的甲基化调控效果，观察记录甲基化水平改变对植物表型的影响。并检测多个单独转基因当代植株中靶点及附近区域的甲基化变化情况，评估各构建体在不同个体中的甲基化调控效率。

实施例1、调控水稻基因组DNA特定区域甲基化水平

一、构建体A1和构建体A2

构建体A1的质粒图谱如图1所示，构建体A1为用于降低靶点及附近区域甲基化水平的表达构建体，能够表达Tet1CD-dCas9融合蛋白，Tet1CD-dCas9核酸序列如SEQ IDNo.11所示，Tet1CD-dCas9氨基酸序列如SEQ ID No.12所示。SEQ ID No.12的第1-741位为Tet1CD结构域(编码核酸为SEQ ID No.11的第1-2223位)；第742-2243位为dCas9结构域(编码核酸为SEQ ID No.11的第2224-6732位)。此构建体的原始载体为常规水稻转化用CRISPR/Cas9载体(pH-nCas9-PBE，记载在“Zong,Yuan,et al."Precise base editing inrice,wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion."Naturebiotechnology 35.5(2017):438.”一文中)，通过将原始载体中的Cas9蛋白编码区替换为Tet1CD-dCas9编码区得到构建体A1。

构建体A2的质粒图谱如图2所示，构建体A2为用于提高靶点及附近区域甲基化水平的表达构建体，能够表达OsSUVH2-dCas9融合蛋白，OsSUVH2-dCas9核酸序列如SEQ IDNo.13所示，OsSUVH2-dCas9氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。SEQ ID No.14的第1-684位为OsSUVH2结构域(编码核酸为SEQ ID No.13的第1-2052位)；第685-2186位为dCas9结构域(编码核酸为SEQ ID No.13的第2053-6561位)。此构建体的原始载体为常规水稻转化用CRISPR/Cas9载体(pH-nCas9-PBE，记载在“Zong,Yuan,et al."Precise base editing inrice,wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion."Naturebiotechnology 35.5(2017):438.”一文中)，通过将原始载体中的Cas9蛋白编码区替换为OsSUVH2-dCas9编码区得到构建体A2。

二、表达构建体B1和表达构建体B2的制备

靶标区域：水稻基因组IPA1基因启动子区。

1、靶点的选择

根据spCas9的PAM序列NGG找出IPA1启动子区上的靶点，使用BLAST检索水稻基因组DNA排除可能靶向基因组其他位置的靶点，并结合之前文献中对IPA1启动子区甲基化修饰状态的描述，选出1个位于高甲基化水平区域的靶点T1(SEQ ID No.1)验证甲基化调控构建体A1，选出一个位于低甲基化水平区域的靶点T2(SEQ ID No.2)验证提高甲基化水平的构建体A2。靶点序列如表1所示。

表1、使用的靶点

2、构建体的制备

根据表1中的序列，分别设计T1、T2对应的gRNA及其编码序列，如表2所示(SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8)。

以SEQ ID No.5和SEQ ID No.6为引物，将退火后形成的退火产物(所述退火产物为带有粘性末端的双链DNA)与经过限制性内切酶BsaI酶切后的步骤一制备的构建体A1连接，得到构建体B1。所述构建体B1为在构建体A1的BsaI酶切位点处插入T1对应的gRNA编码序列(即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6退火后的片段)并保持构建体A1其他部分序列不变的重组构建体。

以SEQ ID No.9和SEQ ID No.10为引物，将退火后形成的退火产物(所述退火产物为带有粘性末端的双链DNA)与经过限制性内切酶BsaI酶切后的步骤一制备的构建体A2连接，得到构建体B2。所述构建体B2为在构建体A2的BsaI酶切位点处插入T2对应的gRNA编码序列(即SEQ ID No.9和SEQ ID No.10退火后的片段)并保持构建体A2其他部分序列不变的重组构建体。

表2、两个靶点的gRNA以及引物信息

3、水稻原生质体中甲基化调控活性的验证

将构建体B1转入水稻品种中花11(ZH11)的原生质体，从转化的原生质体中提取基因组DNA，使用Zymo research公司的EZ DNA Methylation-Lightning Kit试剂盒(货号：D5030)对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，使用如下特异性引物进行PCR测序检测靶点T1附近的甲基化水平：

BSPSeq1-F1：5’-GGTTCGTCGGAGTAGGGG-3’；

BSPSeq1-R1：5’-ATATCATTAATTATCTTCTTAT-3’；

BSPSeq1-F2：5’-TAGGGGCGTTCGGGGAGTTTT-3’；

BSPSeq1-R2：5’-TTTAACAAAATACAAAACAATAA-3’。

构建体B1转化后的原生质体在T1位点附近的甲基化水平较中花11(ZH11)原生质体发生了下降，如图3所示，B1转化原生质体在靶点附近的甲基化水平显著下调(Student’st-test,*P<0.05)，说明B1构建体能在靶点附近负调控甲基化水平。

将构建体B2转入水稻品种中花11(ZH11)的原生质体，从转化的原生质体中提取基因组DNA，使用Zymo research公司的EZ DNA Methylation-Lightning Kit试剂盒(货号：D5030)对基因组DNA进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物进行PCR测序检测靶点T2附近的甲基化水平：

BSPSeq2-F：5’-TGTGGGTGYAGTGTYATTTAGAGTT-3’；

BSPSeq2-R：5’-CCTCCTCCACTRRCCATCTCCATT-3’。

其中，Y为T或C。

构建体B2转化后的原生质体在T2位点附近的甲基化水平较中花11(ZH11)原生质体发生了上升，如图4所示，B2转化原生质体在靶点附近的甲基化水平显著上调(Student’st-test,***P<0.001)，说明B2构建体能在靶点附近正调控甲基化水平。

4、转基因水稻的制备

将构建体B1导入农杆菌EHA105中，得到农杆菌B1，使用农杆菌B1转染中花11(ZH11)水稻的愈伤组织，得到B1转基因当代水稻群体。所述B1转基因当代水稻群体的生长情况如图5所示。

将构建体B2导入农杆菌EHA105中，得到农杆菌B2，使用农杆菌B2转染中花11(ZH11)水稻的愈伤组织，得到B2转基因当代水稻群体。所述B2转基因当代水稻群体的生长情况如图6所示。

从图5和图6中可以看出与中花11(ZH11)相比，B1转基因当代水稻的分蘖更少，B2转基因当代水稻的分蘖更多。与之前文献中的描述一致(Lin Zhang et al.,2016,NatCommun)。

5、转基因阳性材料的鉴定

使用CTAB法提取步骤4中B1转基因当代水稻和B2转基因当代水稻叶片组织中的基因组DNA，通过PCR扩增T-DNA中的潮霉素基因，具体引物如下：

Hpt-F：5’-atgaaaaagcctgaactcaccgcgacgt-3’；

Hpt-R：5’-ctatttctttgccctcggacgagt-3’。

转基因阳性植株可扩增出1kb的片段，不含转基因的植株不能扩增出此片段，凝胶电泳结果如图7所示，表明所获得的B1转基因当代植株和B2转基因当代植株全部为转基因阳性植株。

6、转基因当代水稻材料中靶点附近甲基化水平的测定

分别使用中花11(ZH11)、B1转基因当代水稻的基因组DNA进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物(见上文步骤3中相关序列)进行PCR测序检测靶点T1附近的甲基化水平。如图8所示，B1转基因当代水稻在靶点附近的甲基化水平显著下调(Student’s t-test,***P<0.001)。

分别使用中花11(ZH11)、B2转基因当代水稻的基因组DNA进行亚硫酸盐处理，使用特异性引物(见上文步骤3中相关序列)进行PCR测序检测靶点T2附近的甲基化水平。如图9所示，B2转基因水稻在靶点附近的甲基化水平显著上调(Student’s t-test,***P<0.001)。

由图8和图9所示，可见B1转基因当代水稻在T1位点附近的甲基化水平较中花11(ZH11)发生了下降，B2转基因当代水稻在T2位点附近的甲基化水平较中花11(ZH11)发生了上升。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法

<130> GNCLN210212

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

ccaagcggcg ctgtcgtcga cgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

cttcttatag cagggtacaa ggg 23

<210> 3

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

ccaagcggcg ctgtcgtcga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106

<210> 4

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

ccaagcggcg ctgtcgtcga gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttt 106

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

ggcgccaagc ggcgctgtcg tcga 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

aaactcgacg acagcgccgc ttgg 24

<210> 7

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 7

cttcttatag cagggtacaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uuuuuu 106

<210> 8

<211> 106

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cttcttatag cagggtacaa gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt tttttt 106

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 9

ggcgcttctt atagcagggt acaa 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

aaacttgtac cctgctataa gaag 24

<210> 11

<211> 6732

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 11

atgccgaaga agaagaagaa ggtcctgcct acatgctctt gcctcgaccg cgtgatccag 60

aaggataagg gaccttacta cacccacctg ggcgccggac catcagtggc ggcggtccgc 120

gagatcatgg agaaccggta cggccagaag ggcaatgcca tccgcattga gatcgtggtc 180

tacaccggca aggagggcaa gtccagccat ggctgcccta ttgccaagtg ggtgctcagg 240

cgctcatctg acgaggagaa ggtgctctgc ctggtccgcc agaggacagg acaccattgc 300

ccaaccgccg tgatggtggt cctgattatg gtctgggacg gcatccctct cccgatggcc 360

gataggctct acacagagct gaccgagaac ctcaagtcct acaatggcca cccaacagac 420

cggaggtgca ccctcaacga gaatcgcaca tgcacctgcc agggcatcga tcctgagaca 480

tgcggcgcgt ccttcagctt cggctgctca tggtctatgt acttcaacgg ctgcaagttc 540

ggaaggtccc caagccctcg ccggttccgc attgacccat ccagccctct gcatgagaag 600

aacctcgagg ataatctcca gagcctggcc accaggctgg cacctatcta caagcagtac 660

gcgccggtcg cctaccagaa ccaggtggag tacgagaatg tcgccaggga gtgccgcctg 720

ggcagcaagg agggccgccc attctcaggc gtgacagcgt gcctcgactt ctgcgcccac 780

cctcatcggg atattcacaa catgaacaat ggctctaccg tggtctgcac actgacccgc 840

gaggacaatc ggtccctcgg cgtcatccca caggatgagc agctgcatgt gctccctctg 900

tacaagctct ctgacacaga tgagttcggc tccaaggagg gcatggaggc caagattaag 960

tcaggagcca ttgaggtcct ggccccaagg cgcaagaagc ggacatgctt cacccagccg 1020

gtgccaaggt ccggcaagaa gcgcgcggcc atgatgacag aggtgctcgc gcacaagatt 1080

cgcgccgtcg agaagaagcc tattccgcgg atcaagagga agaacaattc taccacaacc 1140

aacaattcca agccttcatc tctcccgaca ctgggcagca acacagagac agtgcagccg 1200

gaggtcaagt cagagacaga gccacacttc atcctgaagt ccagcgataa tacaaagacc 1260

tactccctca tgccgagcgc gccacatcct gtcaaggagg cctctccagg cttctcatgg 1320

tccccgaaga cagcgtcagc caccccagcg ccactcaaga atgacgccac agcgtcatgc 1380

ggcttctctg agcggtcatc tacacctcac tgcacaatgc catcaggacg gctctcagga 1440

gcaaatgcgg ccgcggccga tggaccagga atttcacagc tgggagaggt ggcgcctctc 1500

ccaaccctgt cagccccagt gatggagcct ctgatcaact cagagccatc tacaggcgtg 1560

accgagccgc tcacaccaca ccagcctaat catcagccgt cattcctgac ctctccacag 1620

gacctcgcgt ccagcccgat ggaggaggat gagcagcatt cagaggcgga tgagccgcca 1680

tcagatgagc cgctgagcga cgatccgctc tcaccagcgg aggagaagct gccacacatt 1740

gacgagtact ggtccgatag cgagcatatc ttcctcgacg ccaacattgg cggcgtcgca 1800

attgccccag cacatggatc agtgctgatt gagtgcgcca ggagggagct ccatgcaaca 1860

accccggtcg agcacccaaa ccggaatcat cctaccaggc tctccctggt gttctaccag 1920

cacaagaacc tgaataagcc gcagcatggc ttcgagctca acaagattaa gttcgaggcg 1980

aaggaggcca agaataagaa gatgaaggcg agcgagcaga aggaccaggc cgcgaatgag 2040

ggccctgagc agtcatctga ggtgaacgag ctgaatcaga tcccgagcca caaggccctc 2100

acactgaccc atgataacgt ggtcacagtg tcaccatacg ccctcaccca tgtggcggga 2160

ccatacaatc attgggtggc gggcgagcag aagctgatct ccgaggagga tctcgccccg 2220

ggcaagtccg gcagcgagac gccaggcacg tccgagagcg ctacgccaga gctgaaggac 2280

aagaagtact cgatcggcct cgccattggg actaactctg ttggctgggc cgtgatcacc 2340

gacgagtaca aggtgccctc aaagaagttc aaggtcctgg gcaacaccga tcggcattcc 2400

atcaagaaga atctcattgg cgctctcctg ttcgacagcg gcgagacggc tgaggctacg 2460

cggctcaagc gcaccgcccg caggcggtac acgcgcagga agaatcgcat ctgctacctg 2520

caggagattt tctccaacga gatggcgaag gttgacgatt ctttcttcca caggctggag 2580

gagtcattcc tcgtggagga ggataagaag cacgagcggc atccaatctt cggcaacatt 2640

gtcgacgagg ttgcctacca cgagaagtac cctacgatct accatctgcg gaagaagctc 2700

gtggactcca cagataaggc ggacctccgc ctgatctacc tcgctctggc ccacatgatt 2760

aagttcaggg gccatttcct gatcgagggg gatctcaacc cggacaatag cgatgttgac 2820

aagctgttca tccagctcgt gcagacgtac aaccagctct tcgaggagaa ccccattaat 2880

gcgtcaggcg tcgacgcgaa ggctatcctg tccgctaggc tctcgaagtc tcggcgcctc 2940

gagaacctga tcgcccagct gccgggcgag aagaagaacg gcctgttcgg gaatctcatt 3000

gcgctcagcc tggggctcac gcccaacttc aagtcgaatt tcgatctcgc tgaggacgcc 3060

aagctgcagc tctccaagga cacatacgac gatgacctgg ataacctcct ggcccagatc 3120

ggcgatcagt acgcggacct gttcctcgct gccaagaatc tgtcggacgc catcctcctg 3180

tctgatattc tcagggtgaa caccgagatt acgaaggctc cgctctcagc ctccatgatc 3240

aagcgctacg acgagcacca tcaggatctg accctcctga aggcgctggt caggcagcag 3300

ctccccgaga agtacaagga gatcttcttc gatcagtcga agaacggcta cgctgggtac 3360

attgacggcg gggcctctca ggaggagttc tacaagttca tcaagccgat tctggagaag 3420

atggacggca cggaggagct gctggtgaag ctcaatcgcg aggacctcct gaggaagcag 3480

cggacattcg ataacggcag catcccacac cagattcatc tcggggagct gcacgctatc 3540

ctgaggaggc aggaggactt ctaccctttc ctcaaggata accgcgagaa gatcgagaag 3600

attctgactt tcaggatccc gtactacgtc ggcccactcg ctaggggcaa ctcccgcttc 3660

gcttggatga cccgcaagtc agaggagacg atcacgccgt ggaacttcga ggaggtggtc 3720

gacaagggcg ctagcgctca gtcgttcatc gagaggatga cgaatttcga caagaacctg 3780

ccaaatgaga aggtgctccc taagcactcg ctcctgtacg agtacttcac agtctacaac 3840

gagctgacta aggtgaagta tgtgaccgag ggcatgagga agccggcttt cctgtctggg 3900

gagcagaaga aggccatcgt ggacctcctg ttcaagacca accggaaggt cacggttaag 3960

cagctcaagg aggactactt caagaagatt gagtgcttcg attcggtcga gatctctggc 4020

gttgaggacc gcttcaacgc ctccctgggg acctaccacg atctcctgaa gatcattaag 4080

gataaggact tcctggacaa cgaggagaat gaggatatcc tcgaggacat tgtgctgaca 4140

ctcactctgt tcgaggaccg ggagatgatc gaggagcgcc tgaagactta cgcccatctc 4200

ttcgatgaca aggtcatgaa gcagctcaag aggaggaggt acaccggctg ggggaggctg 4260

agcaggaagc tcatcaacgg cattcgggac aagcagtccg ggaagacgat cctcgacttc 4320

ctgaagagcg atggcttcgc gaaccgcaat ttcatgcagc tgattcacga tgacagcctc 4380

acattcaagg aggatatcca gaaggctcag gtgagcggcc agggggactc gctgcacgag 4440

catatcgcga acctcgctgg ctcgccagct atcaagaagg ggattctgca gaccgtgaag 4500

gttgtggacg agctggtgaa ggtcatgggc aggcacaagc ctgagaacat cgtcattgag 4560

atggcccggg agaatcagac cacgcagaag ggccagaaga actcacgcga gaggatgaag 4620

aggatcgagg agggcattaa ggagctgggg tcccagatcc tcaaggagca cccggtggag 4680

aacacgcagc tgcagaatga gaagctctac ctgtactacc tccagaatgg ccgcgatatg 4740

tatgtggacc aggagctgga tattaacagg ctcagcgatt acgacgtcga tgctatcgtt 4800

ccacagtcat tcctgaagga tgactccatt gacaacaagg tcctcaccag gtcggacaag 4860

aaccggggca agtctgataa tgttccttca gaggaggtcg ttaagaagat gaagaactac 4920

tggcgccagc tcctgaatgc caagctgatc acgcagcgga agttcgataa cctcacaaag 4980

gctgagaggg gcgggctctc tgagctggac aaggcgggct tcatcaagag gcagctggtc 5040

gagacacggc agatcactaa gcacgttgcg cagattctcg actcacggat gaacactaag 5100

tacgatgaga atgacaagct gatccgcgag gtgaaggtca tcaccctgaa gtcaaagctc 5160

gtctccgact tcaggaagga tttccagttc tacaaggttc gggagatcaa caattaccac 5220

catgcccatg acgcgtacct gaacgcggtg gtcggcacag ctctgatcaa gaagtaccca 5280

aagctcgaga gcgagttcgt gtacggggac tacaaggttt acgatgtgag gaagatgatc 5340

gccaagtcgg agcaggagat tggcaaggct accgccaagt acttcttcta ctctaacatt 5400

atgaatttct tcaagacaga gatcactctg gccaatggcg agatccggaa gcgccccctc 5460

atcgagacga acggcgagac gggggagatc gtgtgggaca agggcaggga tttcgcgacc 5520

gtcaggaagg ttctctccat gccacaagtg aatatcgtca agaagacaga ggtccagact 5580

ggcgggttct ctaaggagtc aattctgcct aagcggaaca gcgacaagct catcgcccgc 5640

aagaaggact gggatccgaa gaagtacggc gggttcgaca gccccactgt ggcctactcg 5700

gtcctggttg tggcgaaggt tgagaagggc aagtccaaga agctcaagag cgtgaaggag 5760

ctgctgggga tcacgattat ggagcgctcc agcttcgaga agaacccgat cgatttcctg 5820

gaggcgaagg gctacaagga ggtgaagaag gacctgatca ttaagctccc caagtactca 5880

ctcttcgagc tggagaacgg caggaagcgg atgctggctt ccgctggcga gctgcagaag 5940

gggaacgagc tggctctgcc gtccaagtat gtgaacttcc tctacctggc ctcccactac 6000

gagaagctca agggcagccc cgaggacaac gagcagaagc agctgttcgt cgagcagcac 6060

aagcattacc tcgacgagat cattgagcag atttccgagt tctccaagcg cgtgatcctg 6120

gccgacgcga atctggataa ggtcctctcc gcgtacaaca agcaccgcga caagccaatc 6180

agggagcagg ctgagaatat cattcatctc ttcaccctga cgaacctcgg cgcccctgct 6240

gctttcaagt acttcgacac aactatcgat cgcaagaggt acacaagcac taaggaggtc 6300

ctggacgcga ccctcatcca ccagtcgatt accggcctct acgagacgcg catcgacctg 6360

tctcagctcg ggggcgacaa gcggccagcg gcgacgaaga aggcggggca ggcgaagaag 6420

aagaagaccc gcgactccgg cggcagcacg aacctctccg acatcatcga gaaggagacg 6480

ggcaagcagc tcgtgatcca ggagagcatc ctcatgctgc cggaggaggt ggaggaggtc 6540

atcggcaaca agcccgagtc cgacatcctc gtgcacaccg cctacgacga gtccacggac 6600

gagaacgtca tgctcctgac gagcgacgct ccagagtaca agccatgggc tctcgtgatc 6660

caggacagca acggcgagaa caagatcaag atgctgtccg gcggctcccc gaagaagaag 6720

cgcaaggtct ga 6732

<210> 12

<211> 2243

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 12

Met Pro Lys Lys Lys Lys Lys Val Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp

1 5 10 15

Arg Val Ile Gln Lys Asp Lys Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala

20 25 30

Gly Pro Ser Val Ala Ala Val Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly

35 40 45

Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly Lys

50 55 60

Glu Gly Lys Ser Ser His Gly Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Leu Arg

65 70 75 80

Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys Val Leu Cys Leu Val Arg Gln Arg Thr

85 90 95

Gly His His Cys Pro Thr Ala Val Met Val Val Leu Ile Met Val Trp

100 105 110

Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met Ala Asp Arg Leu Tyr Thr Glu Leu Thr

115 120 125

Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn Gly His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr

130 135 140

Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys Thr Cys Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr

145 150 155 160

Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe Gly Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn

165 170 175

Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp

180 185 190

Pro Ser Ser Pro Leu His Glu Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser

195 200 205

Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala

210 215 220

Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu

225 230 235 240

Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp

245 250 255

Phe Cys Ala His Pro His Arg Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser

260 265 270

Thr Val Val Cys Thr Leu Thr Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val

275 280 285

Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser

290 295 300

Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys

305 310 315 320

Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys

325 330 335

Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met

340 345 350

Thr Glu Val Leu Ala His Lys Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile

355 360 365

Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys

370 375 380

Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro

385 390 395 400

Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp

405 410 415

Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu Met Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys

420 425 430

Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr

435 440 445

Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp Ala Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu

450 455 460

Arg Ser Ser Thr Pro His Cys Thr Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly

465 470 475 480

Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp Gly Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu

485 490 495

Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile

500 505 510

Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln

515 520 525

Pro Asn His Gln Pro Ser Phe Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser

530 535 540

Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro

545 550 555 560

Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys

565 570 575

Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu

580 585 590

Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val

595 600 605

Leu Ile Glu Cys Ala Arg Arg Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu

610 615 620

His Pro Asn Arg Asn His Pro Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln

625 630 635 640

His Lys Asn Leu Asn Lys Pro Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile

645 650 655

Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu

660 665 670

Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val

675 680 685

Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His

690 695 700

Asp Asn Val Val Thr Val Ser Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly

705 710 715 720

Pro Tyr Asn His Trp Val Ala Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu

725 730 735

Asp Leu Ala Pro Gly Lys Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu

740 745 750

Ser Ala Thr Pro Glu Leu Lys Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala

755 760 765

Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys

770 775 780

Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser

785 790 795 800

Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr

805 810 815

Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg

820 825 830

Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met

835 840 845

Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu

850 855 860

Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile

865 870 875 880

Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu

885 890 895

Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile

900 905 910

Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile

915 920 925

Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile

930 935 940

Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn

945 950 955 960

Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys

965 970 975

Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys

980 985 990

Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro

995 1000 1005

Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln

1010 1015 1020

Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala

1025 1030 1035

Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn

1040 1045 1050

Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr

1055 1060 1065

Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr

1070 1075 1080

Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg

1085 1090 1095

Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser

1100 1105 1110

Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu

1115 1120 1125

Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

1130 1135 1140

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

1145 1150 1155

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His

1160 1165 1170

Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr

1175 1180 1185

Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr

1190 1195 1200

Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser

1205 1210 1215

Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro

1220 1225 1230

Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser

1235 1240 1245

Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu

1250 1255 1260

Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val

1265 1270 1275

Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg

1280 1285 1290

Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp

1295 1300 1305

Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys

1310 1315 1320

Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile

1325 1330 1335

Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His

1340 1345 1350

Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu

1355 1360 1365

Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

1370 1375 1380

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

1385 1390 1395

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg

1400 1405 1410

Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile

1415 1420 1425

Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser

1430 1435 1440

Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp

1445 1450 1455

Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly

1460 1465 1470

Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser

1475 1480 1485

Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp

1490 1495 1500

Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val

1505 1510 1515

Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys

1520 1525 1530

Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu

1535 1540 1545

Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln

1550 1555 1560

Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg

1565 1570 1575

Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp

1580 1585 1590

Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp

1595 1600 1605

Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

1610 1615 1620

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

1625 1630 1635

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg

1640 1645 1650

Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu

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Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg

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Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn

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Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val

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Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe

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Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His

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Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys

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Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val

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Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly

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Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe

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Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg

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Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp

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Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro

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Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe

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Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

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Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp

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Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu

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Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly

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Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp

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Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg

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Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu

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Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser

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Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile

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Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys

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Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu

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Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr

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Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala

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Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys

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Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Thr Arg Asp Ser Gly Gly

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Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln

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Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu

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Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr

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Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser

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Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser

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Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly Ser Pro Lys

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<212> DNA

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tccatcgacc tcaacttcct gccgttcctc aagagggagc ccaagtcgga gccggcttca 120

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caagggaagt ttgctgaggg tggtggcggg tgtgagtgca ctgagaattg ctcaattgga 1440

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Pro Ala Ala Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro

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Pro Asp Leu Ser Ala Ala Ala Val Met Thr Pro Leu Gln Ser Leu Pro

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Thr Leu Tyr Leu Ser Ser Ala Gly Ala Ala Gly Val Ile Val Pro Ala

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Ala Ala Pro Glu Ala Ser Ala Gly Ala Val Ala Gln Pro Gly Ser Gly

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Ser Gly Ala Lys Lys Arg Arg Pro Arg Ser Ser Glu Leu Val Arg Val

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Ser Ser Leu Ser Val Gln Asp Gln Ile Tyr Phe Arg Asp Leu Val Arg

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Arg Ala Arg Ile Thr Phe Glu Ser Leu Arg Gly Ile Leu Leu Arg Asp

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Asp Glu Arg Ala Glu Val Leu Gly Leu Thr Gly Val Pro Gly Phe Gly

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Ala Val Asp Arg Arg Arg Val Arg Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ala Leu

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Met Gly Asp Arg Asp Leu Trp Leu Asn Arg Asp Arg Arg Ile Val Gly

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Pro Ile Pro Gly Ile Ser Val Gly Asp Ala Phe Phe Phe Arg Met Glu

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Val Thr Ala Gly Gln Ser Ser Ser Gly Glu Pro Ile Ala Thr Ser Ile

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Ile Val Ser Gly Gly Tyr Glu Asp Asp Asp Asp Arg Gly Asp Val Leu

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Val Tyr Thr Gly His Gly Gly Arg Asp Pro Asn Leu His Lys His Cys

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Val Asp Gln Lys Leu Glu Gly Gly Asn Leu Ala Leu Glu Arg Ser Met

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Ser Pro Val Gly Lys Val Tyr Phe Tyr Asp Gly Leu Tyr Lys Val Val

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Asp Tyr Trp Leu Asp Arg Gly Lys Ser Gly Phe Gly Val Tyr Lys Tyr

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Lys Met Leu Arg Ile Glu Gly Gln Glu Ser Met Gly Ser Val Asn Phe

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Arg Leu Ala Glu Gln Leu Lys Val Asn Ala Leu Thr Phe Arg Pro Thr

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Gly Tyr Leu Gly Phe Asp Ile Ser Met Gly Arg Glu Ile Met Pro Val

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Ala Leu Tyr Asn Asp Val Asp Asp Asp Arg Asp Pro Leu Leu Phe Glu

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Ala Glu Gly Gly Gly Gly Cys Glu Cys Thr Glu Asn Cys Ser Ile Gly

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Cys Tyr Cys Ala Gln Arg Asn Gly Gly Glu Phe Ala Tyr Asp Lys Leu

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Gly Ala Leu Leu Arg Gly Lys Pro Leu Val Tyr Glu Cys Gly Pro Tyr

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Cys Arg Cys Pro Pro Ser Cys Pro Asn Arg Val Ser Gln Lys Gly Leu

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Arg Asn Arg Leu Glu Val Phe Arg Ser Arg Glu Thr Gly Trp Gly Val

530 535 540

Arg Ser Leu Asp Leu Ile Lys Ala Gly Thr Phe Ile Cys Glu Phe Ser

545 550 555 560

Gly Ile Val Leu Thr His Gln Gln Ser Glu Ile Met Ala Ala Asn Gly

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Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala

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Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala

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Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu

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Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr

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Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys

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1370 1375 1380

Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile

1385 1390 1395

His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln

1400 1405 1410

Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu

1415 1420 1425

Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys

1430 1435 1440

Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu

1445 1450 1455

Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys

1460 1465 1470

Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly

1475 1480 1485

Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu

1490 1495 1500

Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

1505 1510 1515

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

1520 1525 1530

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp Ala Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu

1535 1540 1545

Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys

1550 1555 1560

Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys

1565 1570 1575

Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile

1580 1585 1590

Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly

1595 1600 1605

Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val

1610 1615 1620

Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser

1625 1630 1635

Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu

1640 1645 1650

Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg

1655 1660 1665

Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His

1670 1675 1680

His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu

1685 1690 1695

Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp

1700 1705 1710

Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln

1715 1720 1725

Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile

1730 1735 1740

Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile

1745 1750 1755

Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1760 1765 1770

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu

1775 1780 1785

Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr

1790 1795 1800

Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp

1805 1810 1815

Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly

1820 1825 1830

Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala

1835 1840 1845

Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu

1850 1855 1860

Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn

1865 1870 1875

Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys

1880 1885 1890

Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu

1895 1900 1905

Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys

1910 1915 1920

Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr

1925 1930 1935

Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn

1940 1945 1950

Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp

1955 1960 1965

Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu

1970 1975 1980

Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His

1985 1990 1995

Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

2000 2005 2010

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe

2015 2020 2025

Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val

2030 2035 2040

Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu

2045 2050 2055

Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala

2060 2065 2070

Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys Thr Arg Asp

2075 2080 2085

Ser Gly Gly Ser Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr

2090 2095 2100

Gly Lys Gln Leu Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu

2105 2110 2115

Glu Val Glu Glu Val Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu

2120 2125 2130

Val His Thr Ala Tyr Asp Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu

2135 2140 2145

Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile

2150 2155 2160

Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile Lys Met Leu Ser Gly Gly

2165 2170 2175

Ser Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val

2180 2185

Claims

1.一种用于调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的产品，包含以下中任一项：

i、甲基化调控融合蛋白，和向导RNA；

ii、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体1，和向导RNA；

iii、甲基化调控融合蛋白，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体2；

iv、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列的表达构建体1，和包含编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体2；

v、包含编码甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列和编码向导RNA的核苷酸序列的表达构建体3；

所述甲基化调控融合蛋白包含核酸酶失活的Cas9结构域和甲基化调控结构域；

所述向导RNA能够将所述甲基化调控融合蛋白靶向植物基因组DNA特定区域中的靶序列；

所述甲基化调控结构域是下调甲基化水平的Tet1cd结构域或上调甲基化水平的OsSUVH2结构域；所述甲基化调控融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.12或SEQ ID No.14所示；

所述特定区域为IPA1基因启动子区；所述靶序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；所述植物为水稻。

2.根据权利要求1所述的产品，其特征在于：编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.11或SEQ ID No.13所示。

3.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：在所述表达构建体1和所述表达构建体3中，启动编码所述甲基化调控融合蛋白的核苷酸序列转录启动子是Ubi启动子。

4.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：在所述表达构建体2和所述表达构建体3中，启动编码所述向导RNA的核苷酸序列转录启动子是U3启动子。

5.根据权利要求1或2所述的产品，其特征在于：所述向导RNA如SEQ ID No.3或SEQ IDNo.7所示。

6.权利要求1-5中任一所述的产品在调控植物基因组DNA中所述特定区域甲基化水平中的应用；

所述植物为水稻。

7.权利要求1-5中任一所述的产品在植物育种中的应用；

所述植物为水稻。

8.一种调控植物基因组DNA特定区域甲基化水平的方法，其特征在于：所述特定区域为IPA1基因启动子区，所述方法包括将权利要求1-5中任一所述产品导入受体植物中的步骤；

所述植物为水稻。

9.一种植物育种方法，包括如下步骤：将通过权利要求7所述方法获得的在IPA1基因启动子区特异位点甲基化水平改变的第一植物与所述特异位点的甲基化水平没有改变的第二植物杂交，从而将所述特异位点的甲基化水平的改变导入所述第二植物；

所述植物为水稻。