CN106133138A - 使用引导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的基因组修饰及其使用方法 - Google Patents

使用引导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的基因组修饰及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开提供用于细胞基因组中的靶序列的基因组修饰的组合物和方法。所述方法和组合物采用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变细胞或生物体的基因组内的靶位点的有效系统。一旦鉴定了基因组靶位点，便可采用多种方法来进一步修饰所述靶位点，使得它们包含多种感兴趣的多核苷酸。还提供了用于编辑细胞的基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。还公开了使用双组分RNA多核苷酸和Cas内切核酸酶系统的育种方法和用于选择植物的方法。

Description

使用引导多核苷酸/CAS内切核酸酶系统的基因组修饰及其使 用方法
本申请要求2013年8月22日提交的美国临时申请61/868706、2013年9月25日提交的美国临时申请61/882532、2014年2月7日提交的美国临时申请61/937045、2014年3月14日提交的美国临时申请61/953090和2014年7月11日提交的美国临时申请62/023239的权益，所有申请据此全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及分子生物学领域，具体地，涉及改变细胞的基因组的方法。
以电子方式递交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表递交，该文件名称为“20140815_BB2344PCT_ST25_SequenceListing”，创建日期为2014年8月15日，文件大小为82千字节，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
背景技术
重组DNA技术已使得可以将外来DNA序列插入到生物体的基因组中，从而改变该生物体的表型。
一种插入或修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。美国专利5,527,695描述了用靶向真核生物DNA的预定序列的DNA序列转化真核生物细胞。具体地，讨论了使用位点特异性重组。转化的细胞通过使用选择性标记来鉴定，该选择性标记作为所引入的DNA序列的一部分而被包含。
已证实，在植物细胞中人工诱导的位点特异性基因组双链断裂通过使用两个不同的途径用外源供应的DNA进行同源重组而得到修复。(Puchta等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：5055-5060；2005年8月4日公布的美国专利申请公布2005/0172365A1；2006年12月14日公布的美国专利申请公布2006/0282914；2005年6月2日公布的WO 2005/028942)。
由于DNA区段(包括编码序列和非编码序列在内)的分离、克隆、转移和重组用限制性内切核酸酶进行最便利。许多研究集中在研究和设计内切核酸酶，诸如2004年8月12日公布的WO 2004/067736；1998年8月11日授予Dujon等人的美国专利5,792,632；2003年8月26日授予Dujon等人的美国专利6,610,545B2；Chevalier等人，(2002)Mol Cell 10：895-905；Chevalier等人，(2001)Nucleic AcidsRes 29：3757-3774；Seligman等人，(2002)NucleicAcids Res 30：3870-3879。
虽然已开发了若干种方法来靶向特异性位点以用于细胞基因组中的修饰，但仍然需要用于制备具有改变基因组的生物体的更高效和有效的方法，所述生物体诸如但不限于酵母和能育植物，所述改变的基因组在细胞基因组的限定区域中包含特异性修饰。
发明内容
提供了使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，用于对细胞或生物体的基因组中的靶序列进行基因组修饰，用于基因编辑，以及用于将感兴趣的多核苷酸插入到细胞或生物体的基因组中。所述方法和组合物采用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰或改变靶位点以及编辑细胞基因组内感兴趣的核苷酸序列的有效系统，其中引导多核苷酸由DNA、RNA或DNA-RNA组合序列构成。细胞包括但不限于非人类、动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞。一旦鉴定了基因组靶位点，便可采用多种方法来进一步修饰靶位点，使得它们包含多种感兴趣的多核苷酸。公开了使用引导多核苷酸和Cas内切核酸酶系统的育种方法和选择植物的方法。还提供了具有引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸构建体、细胞、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷粒。还提供了用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。待编辑的核苷酸序列(感兴趣的核苷酸序列)可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
因此在本公开的第一实施例中，组合物包含引导多核苷酸，该引导多核苷酸包含：(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；以及(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。第一核苷酸序列结构域(可变靶向结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)包含12至30个核苷酸的连续片段。
在一个实施例中，引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和第二核苷酸序列结构域位于单个分子上。在另一个实施例中，第二核苷酸序列结构域(Cas内切核酸酶识别结构域)包含能够沿着互补区域杂交的两个单独分子。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域为DNA序列，并且第二核苷酸序列结构域选自DNA序列、RNA序列、以及它们的组合。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域和/或第二核苷酸序列结构域包含至少一种修饰，该修饰任选地提供另外的有益特征，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。另外的益处可为改变的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、改变的互补靶序列结合亲和力、改变的细胞降解抗性、或提高的细胞渗透性。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中引导多核苷酸包括(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；以及(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域和/或第二核苷酸序列结构域包含至少一种修饰，该修饰任选地提供另外的有益特征，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。
在另一个实施例中，组合物包括包含本公开的引导多核苷酸或引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物的植物或种子。
在另一个实施例中，方法包括用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括将引导多核苷酸引入到具有Cas内切核酸酶的细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
在另一个实施例中，方法包括用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括将引导多核苷酸和Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
在另一个实施例中，方法包括用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，该方法包括：a)向细胞提供引导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
在另一个实施例中，方法包括用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)向细胞提供cr核苷酸、能够表达tracrRNA的第一重组DNA构建体、能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA，其中所述cr核苷酸为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸序列的组合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意组合。
在另一个实施例中，方法包括用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)向细胞提供tracr核苷酸、能够表达crRNA的第一重组DNA构建体、能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA，其中所述tracr核苷酸选自脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸序列的组合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意组合。
在另一个实施例中，方法包括用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，该方法包括：a)将能够表达引导多核苷酸的第一重组DNA构建体、以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
在另一个实施例中，方法包括用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括将引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中Cas内切核酸酶在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
在另一个实施例中，组合物包括包含引导多核苷酸和Cas内切核酸酶的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
在另一个实施例中，组合物包括包含重组DNA构建体和引导多核苷酸的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化Cas内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化Cas内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
在另一个实施例中，方法包括用于选择植物的方法，所述植物在其植物基因组中包含改变的靶位点，该方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂；b)获得包含引导多核苷酸的第二植物，所述引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中该引导多核苷酸不单独包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的所需改变的子代植物。
本公开的方法和组合物的另外实施例在下文公开。
附图和序列表简述
由以下的“具体实施方式”及构成本申请的一部分的附图和序列表可以更完全地理解本公开。本申请随附的序列说明和序列表符合美国联邦法规37C.F.R.§§1.821-1.825中关于专利申请中的核苷酸和氨基酸序列公开的指导规则。序列说明包含37C.F.R.§§1.821-1.825中定义的氨基酸三字母代码，将其以引用方式并入本文。
附图
图1A示出含有双分子的双链引导多核苷酸，该双链引导多核苷酸包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。双链引导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独分子。这两个单独分子可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。包含连接到CER结构域的VT结构域的双链引导多核苷酸的第一分子(示为cr核苷酸)被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。包含CER结构域的双链引导多核苷酸的第二分子(示为tracr核苷酸)被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。
图1B示出单链引导多核苷酸，该单链引导多核苷酸包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)。所谓“结构域”，意指核苷酸的连续片段，该连续片段可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。单链引导多核苷酸包含通过连接子核苷酸序列(示为环)连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含连接到CER结构域的VT结构域)。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单链引导多核苷酸可被称为“单链引导RNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“单链引导DNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“单链引导RNA-DNA”(当由RNA核苷酸和DNA核苷酸的组合构成时)。
图2A至图2C示出用于Cas9、crRNA和tracrRNA表达的表达盒。图2A示出含有马铃薯ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位序列(SV40 NLS)和VirD2羧基末端NLS(VirD2 NLS)的玉米密码子优化的Cas9基因(编码Cas9内切核酸酶)，其可操作地连接至植物泛素启动子(UBI Pro)(SEQ ID NO：5)。玉米优化的Cas9基因(仅为Cas9编码序列，没有NLS)对应于SEQID NO：5的第2037-2411位和第2601-6329位核苷酸，其中马铃薯内含子存在于SEQ ID NO：5的第2412-2600位处。SV40 NLS存在于SEQ ID NO：5的第2010-2036位处。VirD2 NLS位于SEQID NO：5的第6330-6386位处。图2B示出可操作地连接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III启动子，该核苷酸序列编码可操作地连接至玉米U6终止子的crRNA分子。所得玉米优化的crRNA表达盒以SEQ ID NO：8列出。图2C示出可操作地连接至核苷酸序列的玉米U6聚合酶III启动子，该核苷酸序列编码可操作地连接至玉米U6 PolIII终止子的tracrRNA分子。所得玉米优化的tracrRNA表达盒以SEQ ID NO：9列出。
图3A示出相对于在玉米LIGCas-3靶序列处适当取向的PAM序列(AGG)(SEQ ID NO：14，表1)的双链引导RNA/Cas9内切核酸酶系统和靶DNA复合物。双链引导RNA(浅灰色背景)包含含有与LIGCas-3靶序列的互补链碱基配对的可变靶向结构域(VT结构域)的crRNA分子(SEQ ID NO：10)，以及含有CER结构域的一部分的tracrRNA分子(SEQ ID NO：11)。Cas9内切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期DNA裂解位点。
图3B示出相对于在玉米基因组LIGCas-3靶位点处适当取向的PAM序列(AGG)(SEQID NO：14，表1)与基因组LIGCas-3靶位点相互作用的单链引导RNA/Cas9内切核酸酶复合物。该单链引导RNA(浅灰色背景，SEQ ID NO：96)是crRNA和tracrRNA之间的融合体并且包含与双链DNA基因组靶位点的一条DNA链互补的可变靶向结构域。Cas9内切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期DNA裂解位点。
图4A至图4C示出由本文所述在玉米基因组无叶舌1基因座处的玉米优化的引导RNA/Cas内切核酸酶系统诱导的前10个最常见NHEJ突变的比对和计数。所述突变通过深度测序进行鉴定。还指示了PAM序列和预期的裂解位点。由NHEJ不完整导致的缺失或插入分别以“-”或标有下划线且为斜体的核苷酸示出。在图4A中，参考序列(SEQ ID NO：23)表示靶位点标有下划线的未修饰LIGCas-1基因座。包含LIGCas-1靶位点的第1-10个突变的序列分别对应于SEQ ID NO：24-33。在图4B中，参考序列(SEQ ID NO：23)表示靶位点标有下划线的未修饰LIGCas-2基因座。包含LIGCas-2靶位点的第1-10个突变的序列分别对应于SEQ ID NO：34-43。在图4C中，参考序列(SEQ ID NO：44)表示靶位点标有下划线的未修饰LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位点的第1-10个突变的序列分别对应于SEQ ID NO：45-54。
图5示出相对于在玉米LIGCas-3靶序列处适当取向的PAM序列(SEQ ID NO：14，表1)的双链引导多核苷酸/Cas9内切核酸酶系统和靶DNA复合物。双链引导RNA(浅灰色背景)包含含有与LIGCas-3靶序列的互补链碱基配对的可变靶向结构域(VT结构域)的crDNA分子(SEQ ID NO：55)，以及含有CER结构域的一部分的tracrRNA分子(SEQ ID NO：11)。Cas9内切核酸酶以深灰色示出。三角形指向有义DNA链和反义DNA链两者上的预期DNA裂解位点。
图6A至图6B示出由本文所述在玉米基因组无叶舌1基因座处的玉米优化的双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统(图6A)或玉米优化的双链引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统(图6B)诱导的前3个最常见NHEJ突变的比对和计数。所述突变通过深度测序进行鉴定。还指示了PAM序列和预期的裂解位点。由NHEJ不完整导致的缺失或插入分别以“-”或标有下划线且为斜体的核苷酸示出。在图6A中，NHEJ突变源自合成crRNA加tracrRNA和Cas9表达盒。参考序列(SEQ ID NO：44)表示靶位点标有下划线的未修饰LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位点的第1-3个突变的序列分别对应于SEQ ID NO：56-58。在图6B中，NHEJ突变源自合成crDNA加tracrRNA和Cas9表达盒。参考序列(SEQ ID NO：44)表示靶位点标有下划线的未修饰LIGCas-3基因座。包含LIGCas-3靶位点的第1-3个突变的序列分别对应于SEQ ID NO：59-61。
图7示出通过URA3编码序列和305bp的重复ADE2基因序列破坏15号染色体上的酵母ADE2基因，产生ADE：URA3：DE2酵母筛选菌株。
图8示出可用于在酵母ADE：URA3：DE2筛选菌株中监测裂解活性的方案。如果URA3靶位点被切断，则URA3编码序列旁侧的ADE2序列重复可用作DNA双链断裂的同源重组修复的模板。如从ADE：URA3：DE2构型中的ADE2序列重复区域引向ADE2构型的虚线所示，双链断裂的同源重组介导的修复将去掉URA3基因编码序列并获得功能性ADE2基因。
图9示出用于定量裂解活性的酵母菌落的数值刻度和相应的红色/白色扇形菌落。由于扇形菌落表型是裂解活性的定性度量，因此实施0-4数值评分系统。0分表示未观察到白色扇形菌落(无切割)；4分表示完全白色菌落(识别位点的完全切割)；1-3分表示中间白色扇形菌落表型(以及中等程度的识别位点切割)。
序列
SEQ ID NO：1为来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)M1 GAS(SF370)的Cas9基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2为马铃薯ST-LS1内含子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：3为SV40氨基N末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)双分体VirD2 T-DNA边界内切核酸酶羧基末端的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为表达玉米优化的Cas9的表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6为玉米U6聚合酶III启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7为SV40核定位信号的氨基酸序列。SEQ ID NO：8为包含靶向LIGCas-3靶序列的可变靶向结构域的玉米优化crRNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：9为玉米优化的tracrRNA表达盒的核苷酸序列。
SEQ ID NO：10为包含靶向LIGCas-3靶序列的可变靶向结构域的crRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：11为来自酿脓链球菌MI GAS(SF370)＞的tracrRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为玉米基因组靶位点LIGCas-1的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：13为玉米基因组靶位点LIGCas-2的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：14为玉米基因组靶位点LIGCas-3的核苷酸序列加PAM序列。
SEQ ID NO：15-22为PCR引物的核苷酸序列。
SEQ ID NO：23为LIGCas-1和LIGCas-2基因座的未修饰参考序列的核苷酸序列(图4A至图4B)。
SEQ ID NO：24-33为LIGCas-1基因座的第1-10个突变的核苷酸序列(图4A)。
SEQ ID NO：34-43为LIGCas-2基因座的第1-10个突变的核苷酸序列(图4B)。
SEQ ID NO：44为LIGCas-3的未修饰参考序列的核苷酸序列(图4C)。
SEQ ID NO：45-54为LIGCas-3基因座的第1-10个突变的核苷酸序列(图4C)。
SEQ ID NO：55为包含靶向LIGCas-3靶序列的可变靶向结构域的crDNA(由脱氧核糖核酸构成)的核苷酸序列。
SEQ ID NO：56-58为LIGCas-3基因座(源自合成crRNA加tracrRNA和Cas9表达盒)的第1-3个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：59-61为LIGCas-3基因座(源自合成crDNA加tracrRNA和Cas9表达盒)的第1-3个突变的核苷酸序列。
SEQ ID NO：62为不包含对其核糖核苷酸序列的任何修饰的cr核苷酸(crRNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：63为不包含对其核糖核苷酸序列的任何修饰的cr核苷酸(crRNA)的CER结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：64为在其核苷酸序列的5’端包含硫代磷酸酯键的cr核苷酸(crRNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端处的第一个N代表具有硫代磷酸酯键的G核糖核苷酸，第二个N代表具有硫代磷酸酯键的C核糖核苷酸，并且第三个N代表具有硫代磷酸酯键的G核糖核苷酸。
SEQ ID NO：65为在其核苷酸序列的3’端附近包含硫代磷酸酯键的cr核苷酸(crRNA)的CER结构域的核苷酸序列(U*U*U*)。在序列表中，在第十九、第二十和第二十一位处的N代表具有硫代磷酸酯键的U核糖核苷酸。
SEQ ID NO：66为在其5’端处包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列(mGmCmG)。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，第二个N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：67为在其核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER结构域的核苷酸序列(mUmUmG)。在序列表中，在第二十位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位处的N代表G 2’-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：68为对于每个核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：69为对于每个核苷酸包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crRNA)的CER结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第四位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位处的N代表U2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十六位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十八位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十九位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：70为不包含对其脱氧核糖核苷酸序列的任何修饰的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：71为不包含对其脱氧核糖核苷酸序列的任何修饰的cr核苷酸(crDNA)的CER结构域的核苷酸序列。
SEQ ID NO：72为在其核苷酸序列中包含一个锁核酸核苷酸(+T)的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第十六位处的N代表T锁核酸碱基。
SEQ ID NO：73为在其核苷酸序列中包含三个锁核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位处的N代表C锁核酸碱基，在第十四位处的N代表T锁核酸碱基，并且在第十六位处的N代表T锁核酸碱基。
SEQ ID NO：74为在其核苷酸序列中包含六个锁核酸核苷酸(+C、+C、+T、+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位处的N代表C锁核酸碱基，在第八位处的N代表C锁核酸碱基，在第十位处的N代表T锁核酸碱基，在第十二位处的N代表C锁核酸碱基，在第十四位处的N代表T锁核酸碱基，并且在第十六位处的N代表T锁核酸碱基。
SEQ ID NO：75为在其核苷酸序列以及其核苷酸序列的5’端附近的硫代磷酸酯键中包含三个锁核酸核苷酸(+C、+T、+T)的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列(G*C*G*)。在序列表中，在5′端处的第一个N代表具有硫代磷酸酯键的G脱氧核糖核苷酸，在第二位处的N代表具有硫代磷酸酯键的C脱氧核糖核苷酸，在第三位处的N代表具有硫代磷酸酯键的G脱氧核糖核苷酸，在第十二位处的N代表C锁核酸碱基，在第十四位处的N代表T锁核酸碱基，并且在第十六位处的N代表T锁核酸碱基。
SEQ ID NO：76为在核苷酸序列的3’端附近包含三个锁核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER结构域的核苷酸序列(T*T*T)。在序列表中，在第十九位、第二十位和第二十一位处的N代表具有硫代磷酸酯键的T脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：77为在其核苷酸序列中包含一个5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第十二位处的N代表5-甲基dC脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：78为在其核苷酸序列中包含三个5-甲基dC核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第六位、第八位和第十二位处的N代表5-甲基dC脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：79为在其核苷酸序列中包含一个2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第十一位处的N代表2，6-二氨基嘌呤脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：80为在其核苷酸序列中包含两个2，6-二氨基嘌呤核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第五位和第十一位处的N代表2，6-二氨基嘌呤脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：81为在其核苷酸序列的5’端附近包含锁核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G锁核酸碱基，第二个N代表C锁核酸碱基，并且第三个N代表G锁核酸碱基。
SEQ ID NO：82为在核苷酸序列的3’端附近包含锁核酸核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位处的N代表T锁核酸碱基，在第二十一位处的N代表T锁核酸碱基，并且在第二十二位处的N代表G锁核酸碱基。
SEQ ID NO：83为在其核苷酸序列的5’端附近包含硫代磷酸酯键的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表具有硫代磷酸酯键的G脱氧核糖核苷酸，第二个N代表具有硫代磷酸酯键的C脱氧核糖核苷酸，并且第三个N代表具有硫代磷酸酯键的G脱氧核糖核苷酸。
SEQ ID NO：84为在其核苷酸序列的5’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，第二个N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且第三个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：85为在核苷酸序列的3’端附近包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER结构域的核苷酸序列。在序列表中，在第二十位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二十一位处的N代表U 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第二十二位处的N代表G2’-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：86为在其核苷酸序列的除T之外的每个核苷酸处包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的可变靶向结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第二位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第三位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第五位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十一位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十三位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在第十七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：87为在核苷酸序列的除T之外的每个核苷酸处包含2’-O-甲基RNA核苷酸的cr核苷酸(crDNA)的CER结构域的核苷酸序列。在序列表中，在5′端处的第一个N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第六位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第七位处的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第八位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第九位处的N代表G2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十二位处的N代表A 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十四位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十五位处的N代表C 2′-O-甲基核糖核苷酸，在第十七位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸，并且在二十二位处的N代表G 2′-O-甲基核糖核苷酸。
SEQ ID NO：88为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)密码子优化的Cas9的核苷酸序列。
SEQ ID NO：89为来自噬菌体T7的T7启动子的核苷酸序列。
SEQ ID NO：90为ADE：URA3：DE2靶序列的核苷酸序列(不包括PAM序列)。
SEQ ID NO：91-95为Cas9内切核酸酶的核苷酸序列。
SEQ ID NO：96为靶向LIGCas-3靶序列的单链引导RNA的核苷酸序列(图3B)。
具体实施方式
本公开包括用于细胞基因组中的靶序列的基因组修饰的组合物和方法。该方法和组合物采用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统来提供用于修饰细胞基因组内的靶位点的有效系统。细胞包括但不限于动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞以及通过本文所述的方法制备的植物和种子。一旦鉴定了基因组靶位点，便可采用多种方法来进一步修饰靶位点，使得它们包含多种感兴趣的多核苷酸。还公开了使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的育种方法。还提供了用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的组合物和方法。待编辑的核苷酸序列(感兴趣的核苷酸序列)可位于由Cas内切核酸酶识别的靶位点之内或之外。
CRISPR基因座(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats，规律成簇间隔短回文重复序列)(也称为SPIDRs--SPacer Interspersed DirectRepeats，间隔区散在同向重复序列))构成最近描述的DNA基因座的家族。CRISPR基因座由短且高度保守的DNA重复序列(通常24至40bp，重复1至140次，也称CRISPR重复序列)组成，所述DNA重复序列是部分回文的。重复的序列(通常是物种特异性的)被恒定长度的可变序列(通常20至58bp，取决于CRISPR基因座(2007年3月1日公布的WO2007/025097))间隔。
CRISPR基因座首先在大肠杆菌(E.coli)中确认(Ishino等人(1987)J.Bacterial.169：5429-5433；Nakata等人(1989)J.Bacterial.171：3553-3556)。在地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)、酿脓链球菌、鱼腥藻属(Anabaena)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)中已鉴定出类似的散在短序列重复序列(Groenen等人(1993)Mol.Microbiol.10：1057-1065；Hoe等人(1999)Emerg.Infect.Dis.5：254-263；Masepohl等人(1996)Biochim.Biophys.Acta1307：26-30；Mojica等人(1995)Mol.Microbiol.17：85-93)。CRISPR基因座与其他SSR不同之处在于重复序列的结构，所述重复序列也被命名为短规则间隔重复序列(SRSR)(Janssen等人(2002)OMICSJ.Integ.Biol.6：23-33；Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。所述重复序列是成簇出现的短元件，其通常被恒定长度的可变序列规则地间隔(Mojica等人(2000)Mol.Microbiol.36：244-246)。
“Cas基因”包括这样的基因，该基因通常与旁侧CRISPR基因座偶联、相关或接近或在旁侧CRISPR基因座的附近。术语“Cas基因”、“CRISPR相关(Cas)基因”在本文中可互换使用。Cas蛋白质家族的全面综述在Haft等人(2005)Computational Biology，PLoS ComputBiol 1(6)：e60.doi：10.1371/journal.pcbi.0010060中提出。如该文献中所描述，除了四个之前已知的基因家族外，还描述了41个CRISPR相关(Cas)基因家族。该文献表明，CRISPR系统属于不同的类别，具有不同的重复序列模式、不同组的基因以及不同物种范围。给定的CRISPR基因座中的Cas基因的数目可随物种而不同。
Cas内切核酸酶与由Cas基因编码的Cas蛋白质相关，其中所述Cas蛋白质能够将双链断裂引入到DNA靶序列中。Cas内切核酸酶接近基因组靶位点解旋DNA双链并且在识别靶序列时通过引导多核苷酸裂解两条DNA链，但唯一条件是正确的原间隔序列相邻基元(PAM)大致在靶序列的3′端处取向(图3A，图3B)。
在一个实施例中，Cas内切核酸酶为能够在DNA靶位点处引入双链断裂的Cas9内切核酸酶，其中在特定位置处的DNA裂解通过以下方式实现：a)在DNA靶位点和引导多核苷酸的可变靶向结构域之间碱基配对互补，以及b)存在紧邻DNA靶位点的短原间隔序列相邻基元(PAM)。
在一个实施例中，Cas内切核酸酶基因为Cas9内切核酸酶，诸如但不限于2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097的SEQ ID NO：462、474、489、494、499、505和518中列出的Cas9基因。在另一个实施例中，Cas内切核酸酶基因为植物如玉米或大豆优化的Cas9内切核酸酶(图1A)。在另一个实施例中，Cas内切核酸酶基因可操作地连接至Cas密码子区域上游的SV40核靶向信号以及Cas密码子区域下游的双分体VirD2核定位信号(Tinland等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：7442-6)。
在一个实施例中，Cas内切核酸酶基因为SEQ ID NO：1、91、92、93、94、95的Cas9内切核酸酶基因或SEQ ID NO：5的第2037-6329位核苷酸、或它们的任意功能片段或变体。
术语“功能片段”、“功能上等同的片段”和“功能等同片段”在本文中可互换使用。这些术语是指其中产生双链断裂的能力得以保持的Cas内切核酸酶序列的一部分或亚序列。
术语“功能变体”、“功能上等同的变体”和“功能等同变体”在本文中可互换使用。这些术语是指其中产生双链断裂的能力得以保持的Cas内切核酸酶的变体。片段和变体可通过诸如定点诱变和合成构建之类的方法来获得。
在一个实施例中，Cas内切核酸酶基因为植物密码子优化的酿脓链球菌Cas9基因，其可识别原则上N(12-30)NGG可被靶向的形式的任何基因组序列。
内切核酸酶是裂解多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，包括裂解DNA成特异性位点而不损伤碱基的限制性内切核酸酶。限制性内切核酸酶包括I型、II型、III型和IV型内切核酸酶，它们进一步包括亚型。在I型和III型系统中，甲基化酶活性和限制酶活性两者都包含在单一复合物中。内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(HEases)，其如同限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合和切割，然而大范围核酸酶的识别位点通常较长，约18bp或更长。(2012年3月22日提交的专利申请WO-PCT PCT/US12/30061)大范围核酸酶已基于保守序列基元分为四个家族(Belfort M，和Perlman P S J.Biol.Chem.1995(270)：30237-30240)。这些基元参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。HE酶的显著之处在于它们的识别位点长，并且能容忍它们的DNA底物中有一定的序列多态性。大范围核酸酶的命名规范与其他限制性内切核酸酶的规范相似。对于分别由独立式ORF、内含子和内含肽编码的大范围核酸酶，它们也通过前缀F-、I-或PI-进行表征。重组过程中的一个步骤涉及在识别位点之处或附近进行多核苷酸裂解。这个裂解活性可用来产生双链断裂。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，参见Sauer(1994)Curr Op Biotechnol 5：521-7；以及Sadowski(1993)FASEB 7：760-7。在一些例子中，重组酶来自整合酶或解离酶家族。
TAL效应物核酸酶是新一类序列特异性核酸酶，可用来在植物或其他生物体的基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。(Miller等人(2011)Nature Biotechnology 29：143-148)。锌指核酸酶(ZFN)包括工程改造的双链断裂诱导剂，由锌指DNA结合结构域和双链断裂诱导剂结构域构成。识别位点特异性由锌指结构域赋予，锌指结构域通常包含两个、三个或四个例如具有C2H2结构的锌指，但是其他锌指结构也是已知的并被工程构建。锌指结构域易于设计特异性结合选定的多核苷酸识别序列的多肽。ZFN由工程改造的DNA结合锌指结构域与非特异性内切核酸酶结构域连接组成，所述非特异性内切核酸酶结构域例如来自II型内切核酸酶(如FokI)的核酸酶结构域。可将另外的功能性融合到锌指结合结构域，包括转录激活因子结构域、转录阻遏蛋白结构域和甲基化酶。在一些例子中，核酸酶结构域的二聚化为裂解活性所需。每个锌指能识别靶DNA中的三个连续碱基对。例如，一个3锌指结构域识别9个连续核苷酸的序列，由于该核酸酶要求二聚化，使用两组锌指三联体来结合一条18个核苷酸的识别序列。
在本公开的一个实施例中，组合物包括包含引导多核苷酸和Cas9内切核酸酶的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas9内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
细菌和古细菌已进化出适应性免疫防御机制，又称为规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关联的(Cas)系统，其使用短RNA来指导外源核酸的降解(2007年3月1日公布并且以引用方式并入本文中的WO2007/025097)。来自细菌的II型CRISPR/Cas系统采用crRNA和tracrRNA来将Cas内切核酸酶引导至其DNA靶标。crRNA(CRISPR RNA)包含与双链DNA靶标中的一条链互补的区域并且与tracrRNA(反式激活CRISPR RNA)碱基配对，从而形成指导Cas内切核酸酶裂解DNA靶标的RNA双链体。
如本文所用，术语“引导多核苷酸”涉及如下多核苷酸序列，该多核苷酸序列可与Cas内切核酸酶形成复合物并且使Cas内切核酸酶能够识别并且任选地裂解DNA靶位点。引导多核苷酸可为单分子或双分子。引导多核苷酸序列可为RNA序列、DNA序列、或它们的组合(RNA-DNA组合序列)。任选地，引导多核苷酸可包含至少一个核苷酸、磷酸二酯键或键修饰，诸如但不限于锁核酸(LNA)、5-甲基dC、2，6-二氨基嘌呤、2’-氟A、2’-氟U、2′-O-甲基RNA、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18(六乙二醇链)分子)、或导致环化的5’至3’共价键。在本公开的一些实施例中，引导多核苷酸不单独包含核糖核酸(RNA)。单独包含核糖核酸的引导多核苷酸也称为“引导DNA”。
引导多核苷酸可为双分子(也称为双链引导多核苷酸)，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)(图1A)。双分子引导多核苷酸的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独分子(图1A)。这两个单独分子可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。在本公开的一个实施例中，双链引导多核苷酸不单独包含核糖核酸(RNA)，如例如但不限于图3A所示。在一些实施例中，包含连接到CER结构域的VT结构域的双链引导多核苷酸的第一分子(在图1A中示为“cr核苷酸”)被称为“crDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“crRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)，或“crDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。在一些实施例中，包含CER结构域的双链引导多核苷酸的第二分子(在图1A中示为tracr核苷酸)被称为“tracrRNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“tracrDNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)，或“tracrDNA-RNA”(当由DNA核苷酸和RNA核苷酸的组合构成时)。
引导多核苷酸也可为单分子，其包含与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或VT结构域)以及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为Cas内切核酸酶识别结构域或CER结构域)(图1B)。所谓“结构域”，意指核苷酸的连续片段，该连续片段可为RNA、DNA和/或RNA-DNA组合序列。单链引导多核苷酸的VT结构域和/或CER结构域可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一些实施例中，单链引导多核苷酸包括连接到tracr核苷酸(包含CER结构域)的cr核苷酸(包含连接到CER结构域的VT结构域)，其中所述键为包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列的核苷酸序列(图1B)。由来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列构成的单链引导多核苷酸可被称为“单链引导RNA”(当由RNA核苷酸的连续片段构成时)或“单链引导DNA”(当由DNA核苷酸的连续片段构成时)或“单链引导RNA-DNA”(当由RNA核苷酸和DNA核苷酸的组合构成时)。
使用单链引导多核苷酸与双链引导多核苷酸相比的一个优点是仅需要形成一个表达盒即可表达单链引导多核苷酸。
术语“可变靶向结构域”或“VT结构域”在本文中可互换使用并且指与双链DNA靶位点的一条链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列。第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域的长度可为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸。在一些实施例中，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续片段。可变靶向结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)、或它们的任何组合构成。
术语引导多核苷酸的“Cas内切核酸酶识别结构域”或“CER结构域”在本文中可互换使用并且涉及与Cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(诸如引导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。CER结构域可由DNA序列、RNA序列、修饰的DNA序列、修饰的RNA序列(参见例如本文所述的修饰)、或它们的任何组合构成。
连接单链引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含RNA序列、DNA序列或RNA-DNA组合序列。在一个实施例中，连接单链引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列的长度可为至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸。在另一个实施例中，连接单链引导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可包含四环序列，诸如但不限于GAAA四环序列。
引导多核苷酸、VT结构域和/或CER结构域的核苷酸序列修饰可选自但不限于5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。这些修饰可产生至少一种另外的有益特征，其中所述另外的有益特征选自改变的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、改变的互补靶序列结合亲和力、改变的细胞降解抗性、和提高的细胞渗透性。
在本公开的一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸，该引导多核苷酸包括：(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(VT结构域)；以及(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域(CER结构域)，其中第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。第一核苷酸序列结构域(可变靶向结构域)和靶序列之间的互补性％可为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
在本公开的一个实施例中，引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和第二核苷酸序列结构域(CER结构域)位于单个分子上。在另一个实施例中，第二核苷酸序列结构域(Cas内切核酸酶识别结构域)包含能够沿着互补区域杂交的两个单独分子。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域为DNA序列，并且第二核苷酸序列结构域选自DNA序列、RNA序列、以及它们的组合。
在一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域(VT结构域)为DNA序列，并且第二核苷酸序列结构域(CER结构域)选自DNA序列、RNA序列、以及它们的组合。
引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成称为“引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物”的复合物，该复合物使Cas内切核酸酶能够在DNA靶位点处引入双链断裂。
在一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中引导多核苷酸包括(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；以及(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
在另一个实施例中，组合物包含引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域(VT结构域)和第二核苷酸序列结构域(CER结构域)由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
在一个实施例中，引导多核苷酸可使用粒子轰击直接引入到植物细胞中。
当引导多核苷酸仅由RNA序列(也称为“引导RNA”)组成时，其可通过引入包含有效连接到植物特异性启动子的相应引导DNA序列的重组DNA分子而间接引入，该植物特异性启动子能够转录所述植物细胞中的引导多核苷酸。术语“相应引导DNA”是指如下DNA分子，该DNA分子与RNA分子相同但是RNA分子的每个“U”替换为“T”。
在一些实施例中，引导多核苷酸通过粒子轰击或包含可操作地连接至植物U6聚合酶III启动子的相应引导DNA的重组DNA构建体的农杆菌(Agrobacterium)转化来引入。
术语“靶位点”、“靶序列”、”靶DNA”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”和“基因组靶基因座”在本文中可互换使用并且指细胞的基因组(包括叶绿体和线粒体DNA)中的多核苷酸序列，在细胞基因组中在该多核苷酸序列处通过Cas内切核酸酶诱导双链断裂。靶位点可为细胞或生物体的基因组中的内源位点，或者另选地，靶位点可与细胞或生物体是异源的，从而不天然存在于基因组中，或靶位点与其天然出现的位置相比可存在于异源基因组位置中。如本文所用，术语“内源靶序列”和“天然靶序列”可在本文中互换使用并且是指这样的靶序列，该靶序列对细胞或生物体的基因组为内源或天然的并且位于该靶序列在细胞或生物体的基因组中的内源或天然位置处。细胞包括但不限于动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞以及通过本文所述的方法制备的植物和种子。
在一个实施例中，靶位点可类似于DNA识别位点或由双链断裂诱导剂特异性识别和/或结合的靶位点，所述双链断裂诱导剂诸如LIG3-4内切核酸酶(2009年5月21日公布的美国专利公布2009-0133152A1)或MS26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)。
“人工靶位点”或“人工靶序列”在本文中可互换使用并且指已被引入到细胞或生物体(诸如但不限于植物或酵母)的基因组中的靶序列。这种人工靶序列可在序列上与细胞基因组中的内源或天然靶序列相同，但可位于细胞或生物体的基因组中的另一不同位置(即，非内源或非天然位置)。
“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”、“修饰的靶序列”在本文中可互换使用，并且指如本文所公开的当与未改变的靶序列相比时包含至少一种改变的靶序列。此类“改变”包括例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
本文中公开了用于修饰生物体(诸如但不限于植物或酵母)的基因组靶位点的方法。
在一个实施例中，用于修饰植物细胞基因组中的靶位点的方法包括将引导多核苷酸引入到具有Cas内切核酸酶的细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。该方法可进一步包括鉴定至少一个在所述靶标处具有修饰的细胞，其中在所述靶位点处的修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。该方法还可进一步包括将供体DNA引入到所述细胞中，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸。
还提供了用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括将引导多核苷酸和Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。该方法可进一步包括鉴定至少一个在所述靶标处具有修饰的细胞，其中在所述靶位点处的修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。该方法还可进一步包括将供体DNA引入到所述细胞中，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸。
还提供了用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)将cr核苷酸、能够表达tracrRNA的第一重组DNA构建体、能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA引入到细胞中，其中所述cr核苷酸为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸序列的组合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意组合。
还提供了用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：a)将tracr核苷酸、能够表达crRNA的第一重组DNA构建体、以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA引入到细胞中，其中所述tracr核苷酸选自脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸序列的组合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任意组合。
靶位点的长度可改变，并且包括例如长度为至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸的靶位点。靶位点还有可能是回文的，即一条链上的序列在互补链上从相反方向读起来是一样的。切口/裂解位点可在靶序列内，或切口/裂解位点可在靶序列之外。在另一个变型形式中，裂解可发生在互相正对着的核苷酸位置处以产生平端切口，或在其他情况中，切口可交错以产生单链突出端，也称“粘性末端”，可以为5′突出端或3′突出端。
还可使用基因组靶位点的活性变体。此类活性变体可与给定靶位点具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性，其中活性变体保留生物活性并且因此能够由Cas内切核酸酶识别和裂解。通过内切核酸酶测量靶位点的双链断裂的测定法是本领域中已知的，并且通常测量该试剂对含有识别位点的DNA底物的总体活性和特异性。
各种方法和组合物均可用于获得具有插入到Cas内切核酸酶的靶位点中的感兴趣的多核苷酸的细胞或生物体。此类方法可采用同源重组来提供感兴趣的多核苷酸在靶位点处的整合。在提供的一种方法中，向供体DNA构建体中的细胞提供感兴趣的多核苷酸。如本文所用，“供体DNA”是包含待插入到cas内切核酸酶的靶位点中的感兴趣的多核苷酸的DNA构建体。任选地，供体DNA构建体还可包含感兴趣的多核苷酸旁侧的第一同源性区域和第二同源性区域。供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域分别与存在于植物基因组的靶位点中或旁侧的第一基因组区域和第二基因组区域共享同源性。所谓“同源性”是指类似的DNA序列。例如，存在于供体DNA上的“基因组区域的同源性区域”是与植物基因组中的给定“基因组区域”具有类似序列的DNA区域。同源性区域可具有任何长度，该长度足以促进裂解靶位点处的同源重组。例如，同源性区域的长度可为至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得同源性区域具有充分的同源性与相应的基因组区域发生同源重组。“充分的同源性”表明两个多核苷酸序列具有充分的结构相似性以充当同源重组反应的底物。结构相似性包括每个多核苷酸片段的总体长度，以及多核苷酸的序列相似性。序列相似性可通过序列的总长度上的序列同一性百分数，和/或通过包含局部化相似性的保守区域(如具有100％序列同一性的连续核苷酸)以及序列长度的一部分上的序列同一性百分数来描述。
靶标和供体多核苷酸共享的同源性或序列同一性的量可变，包括总长度和/或具有在以下范围内的单位整数值的区域：约1-20bp、20-50bp、50-100bp、75-150bp、100-250bp、150-300bp、200-400bp、250-500bp、300-600bp、350-750bp、400-800bp、450-900bp、500-1000bp、600-1250bp、700-1500bp、800-1750bp、900-2000bp、1-2.5kb、1.5-3kb、2-4kb、2.5-5kb、3-6kb、3.5-7kb、4-8kb、5-10kb、或直到并包括该靶位点的总长度。这些范围包括该范围内的每个整数，例如1-20bp的范围包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20bp。同源性的量也可通过两个多核苷酸的完全比对长度上的序列同一性百分数来描述，所述序列同一性百分数包括约至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性百分数。充分的同源性包括多核苷酸长度、全局序列同一性百分数和连续核苷酸的任选保守区域或局部序列同一性百分数的任何组合，例如充分的同源性可描述为75-150bp的与靶基因座区域具有至少80％序列同一性的区域。充分的同源性还可通过所预测的两个多核苷酸在高严格条件下特异性杂交的能力来描述，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等人编辑(1994)CurrentProtocols，(Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley&Sons，Inc)；以及Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，(Elsevier，New York)。
如本文所用，“基因组区域”是植物细胞基因组中的染色体的区段，该区段存在于靶位点的任一侧上，或者另选地，还包含靶位点的一部分。基因组区域可包含至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多个碱基，使得基因组区域具有充分的同源性与相应的同源性区域发生同源重组。
供体DNA上的同源性区域可与靶位点旁侧的任何序列具有同源性。虽然在一些实施例中，同源性区域与紧邻靶位点旁侧的基因组序列共享显著的序列同源性，但应当认识到，同源性区域可被设计为与如下区域具有充分的同源性，该区域可进一步位于靶位点的5′或3′处。在另外的实施例中，同源性区域还可与靶位点的片段连同下游基因组区域具有同源性。在一个实施例中，第一同源性区域还包含靶位点的第一片段并且第二同源性区域包含靶位点的第二片段，其中第一片段和第二片段不相似。
如本文所用，“同源重组”是指两个DNA分子之间在同源性位点处的DNA片段交换。同源重组的频率受多个因素影响。不同的生物体在同源重组的量和同源与非同源重组的相对比例方面不同。一般地讲，同源性区域的长度影响同源重组事件的频率，同源性区域越长，频率越高。为观察到同源重组而需要的同源性区域的长度也是随物种而异的。在许多情况下，至少5kb的同源性已被利用，但在少至25-50bp的同源性的情况下就已观察到同源重组。参见例如Singer等人，(1982)Cell 31：25-33；Shen和Huang，(1986)Genetics 112：441-57；Watt等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：4768-72；Sugawara和Haber，(1992)MolCell Biol 12：563-75；Rubnitz和Subramani，(1984)Mol Cell Biol 4：2253-8；Ayares等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5199-203；Liskay等人，(1987)Genetics115：161-7。
植物细胞基因组的改变，例如通过同源重组(HR)改变，是遗传工程的强大工具。尽管高等植物中的同源重组频率低，但还是有植物内源基因同源重组的少数成功例子。植物中同源重组的参数已主要通过拯救(rescue)所引入的截短的选择性标记基因进行了研究。在这些实验中，同源DNA片段通常在0.3kb至2kb之间。观察到的同源重组频率大约为10-4至10-5。参见例如Halfter等人，(1992)Mol Gen Genet 231：186-93；Offringa等人，(1990)EMBO J 9：3077-84；Offringa等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：7346-50；Paszkowski等人，(1988)EMBO J 7：4021-6；Hourda和Paszkowski，(1994)Mol Gen Genet243：106-11；以及Risseeuw等人，(1995)Plant J 7：109-19。
同源重组在昆虫中已得到证明。Dray和Gloor在果蝇中发现，少至3kb的总模板：靶标同源性就足够以适当的效率将大的非同源DNA区段复制到靶标中(Dray和Gloor，(1997)，Genetics，147：689-99)。Golic等人采用在果蝇中的靶标FRT处进行FLP介导的DNA整合，证实了当供体和靶标共享4.1kb的同源性时，与1.1kb的同源性时相比，整合效率大约高10倍(Golic等人，(1997)，Nucleic Acids Res，25：3665)。来自果蝇的数据表明，2-4kb的同源性对于有效靶向是充足的，但是有一些证据证明低得多的同源性-约30bp至约100bp范围内-可能就足够(Nassif和Engels，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1262-6；Keeler和Gloor，(1997)Mol Cell Biol 17：627-34)。
也在其他生物体中实现了同源重组。例如，在寄生性原生动物利什曼虫中进行同源重组需要至少150-200bp的同源性(Papadopoulou和Dumas，(1997)Nucleic Acids Res25：4278-86)。在丝状真菌构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中，用少至50bp旁侧同源性实现了基因替换(Chaveroche等人，(2000)Nucleic Acids Res 28：e97)。在纤毛虫嗜热四膜虫(Tetrahymena thermophila)中也证明了所靶向基因替换(Gaertig等人，(1994)NucleicAcids Res 22：5391-8)。在哺乳动物中，使用可培养生长、转化、选择和引入到小鼠胚胎中的多能胚胎干细胞系(ES)，同源重组在小鼠中已经是最成功的。带有插入的转基因ES细胞的胚胎发育成遗传后代。通过将同胞小鼠进行杂种繁殖，可获得携带选定的基因的纯合小鼠。该方法的概述在以下文献中提供：Watson等人，(1992)Recombinant DNA，第2版，(Scientific American Books，WH Freeman&Co.出版)；Capecchi，(1989)Trends Genet 5：70-6；以及Bronson，(1994)J Biol Chem 269：27155-8。由于缺乏能够移植到卵母细胞或发育的胚胎中的干细胞，在小鼠以外的哺乳动物中的同源重组曾是有限的。但是，McCreath等人，Nature 405：1066-9(2000)报道了通过在原代胚胎成纤维细胞中进行转化和选择在绵羊中成功进行了同源重组。
一旦在DNA中诱导产生双链断裂，细胞的DNA修复机制就被激活以修复断裂。易错DNA修复机制可在双链断裂位点产生突变。将断裂端连到一起的最常用修复机制是非同源末端连接(NHEJ)途径(Bleuyard等人，(2006)DNA Repair 5：1-12)。染色体的结构完整性通常通过修复来保持，但缺失、插入或其他重排都是可能发生的(Siebert和Puchta，(2002)Plant Cell 14：1121-31；Pacher等人，(2007)Genetics 175：21-9)。一个双链断裂的两个末端是NHEJ的最普遍的底物(Kirik等人，(2000)EMBO J 19：5562-6)，但是，如果出现两个不同的双链断裂，则来自不同断裂的游离末端可连接并导致染色体缺失(Siebert和Puchta，(2002)Plant Cell 14：1121-31)，或不同染色体之间的染色体易位(Pacher等人，(2007)Genetics 175：21-9)。
也可将附加型DNA分子连接到双链断裂中，例如将T-DNA整合到染色体双链断裂中(Chilton和Que，(2003)Plant Physiol 133：956-65；Salomon和Puchta，(1998)EMBO J 17：6086-95)。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，则基因转换途径可恢复原始结构，如果有同源序列的话，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)Plant Cell 16：342-52)。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics152：1173-81)。
另选地，双链断裂可通过同源DNA序列之间的同源重组来修复。一旦双链断裂周围的序列被改变，例如被参与双链断裂成熟的外切核酸酶活性改变，如果有同源序列的话，如非分裂的体细胞中的同源染色体，或DNA复制后的姊妹染色单体(Molinier等人，(2004)Plant Cell 16：342-52)，则基因转换途径可恢复原始结构。异位的和/或表成的DNA序列也可充当DNA修复模板用于同源重组(Puchta，(1999)Genetics 152：1173-81)。
DNA双链断裂似乎是刺激同源重组途径的有效因子(Puchta等人，(1995)PlantMol Biol 28：281-92；Tzfira和White，(2005)Trends Biotechnol 23：567-9；Puchta，(2005)J Exp Bot 56：1-14)。使用DNA断裂剂，在植物中人工构建的同源DNA重复序列之间观察到同源重组提高两倍至九倍(Puchta等人，(1995)Plant Mol Biol 28：281-92)。在玉米原生质体中，用线状DNA分子进行实验证明了质粒之间的同源重组增强(Lyznik等人，(1991)Mol Gen Genet 230：209-18)。
在一些实施例中，本文中提供的方法包括使细胞与供体DNA和Cas内切核酸酶接触。一旦通过Cas内切核酸酶将双链断裂引入靶位点中，则供体DNA的第一同源性区域和第二同源性区域可经历与其相应的同源性基因组区域的同源重组，从而在供体和基因组之间进行DNA交换。
因此，所提供的方法使供体DNA的感兴趣的多核苷酸整合到细胞或生物体基因组的靶位点处的双链断裂中，从而改变原始靶位点并产生改变的基因组靶位点。
在本公开的一个实施例中，方法包括用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，该方法包括：a)将引导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。可通过本领域中已知的任何方式引入引导多核苷酸、Cas内切核酸酶和供体DNA。这些方式包括但不限于通过粒子轰击直接递送每种组分，通过一个或多个重组DNA表达盒递送，或它们的任意组合。
在本公开的一些实施例中，该方法包括用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，其中使用能够表达供体DNA和/或Cas内切核酸酶的至少一个重组DNA构建体将供体DNA和Cas内切核酸酶引入到所述细胞中；并且/或其中引导多核苷酸通过粒子轰击直接引入。
在本公开的另一个实施例中，方法包括用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，该方法包括：a)将能够表达引导多核苷酸的第一重组DNA构建体、以及能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
可通过本领域已知的任何方式引入供体DNA。例如，提供了细胞或生物体，诸如但不限于具有靶位点的植物或酵母。供体DNA可通过本领域中已知的任何转化方法来提供，所述转化方法包括例如农杆菌介导的转化或基因枪粒子轰击。供体DNA可瞬时地存在于细胞中或其可通过病毒复制子引入。在Cas内切核酸酶和靶位点的存在下，供体DNA被插入到转化的基因组中。
另一个方法采用对现有的归巢内切核酸酶进行蛋白质工程改造以改变它们的靶标特异性。归巢内切核酸酶，如I-SceI或I-CreI，能结合和裂解相对较长的DNA识别序列(分别为18bp和22bp)。这些序列据预测在基因组中很少天然发生，通常仅1或2个位点/基因组。归巢内切核酸酶的裂解特异性可通过合理设计在DNA结合结构域处的氨基酸替换和/或突变单体的组合装配和选择来改变(参见例如Arnould等人，(2006)J Mol Biol 355：443-58；Ashworth等人，(2006)Nature 441：656-9；Doyon等人，(2006)J Am Chem Soc 128：2477-84；Rosen等人，(2006)Nucleic Acids Res 34：4791-800；以及Smith等人，(2006)NucleicAcids Res 34：e149；Lyznik等人(2009)美国专利申请公布20090133152A1；Smith等人(2007)美国专利申请公布20070117128A1)。已证明了经工程改造的大范围核酸酶能裂解同族突变位点而不扩大它们的特异性。将对野生型酵母I-SceI归巢核酸酶具有特异性的人工识别位点引入到玉米基因组中，检测到当转基因I-SceI通过杂交引入并且通过基因切除激活时，在1％的被分析的F1植物中存在识别序列的突变(Yang等人，(2009)Plant Mol Biol70：669-79)。更实际的是，使用基于I-CreI大范围核酸酶序列进行设计的工程改造的单链内切核酸酶靶向玉米无舌叶基因座(liguleless locus)。当设计的归巢核酸酶通过农杆菌介导转化不成熟胚来引入时，在3％的TO转基因植物中检测到选定的无舌叶基因座识别序列的突变(Gao等人，(2010)Plant J 61：176-87)。
感兴趣的多核苷酸在本文中进一步描述并且反映出作物开发参与者的商业市场和利益。感兴趣的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解逐渐深入，基因工程的选择将相应地变化。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行的基因组编辑。
如本文所述，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸修饰模板结合使用，允许编辑感兴趣的基因组核苷酸序列。虽然存在许多双链断裂制造系统，但其实际应用于基因编辑可能由于所诱导的双链断裂(DSB)的频率相对较低而受限。迄今为止，许多基因组修饰方法依赖于同源重组系统。同源重组(HR)可提供用于找到感兴趣的基因组DNA序列并且根据实验规范修饰它们的分子方法。同源重组以低频率在植物体细胞中发生。该过程可通过在所选择的内切核酸酶靶位点处引入双链断裂(DSB)而增强到用于基因组工程的实际水平。所面临的挑战是有效地在感兴趣的基因组位点处形成DSB，因为两个相互作用的DNA分子之间的信息传递的方向性存在偏差(断裂的分子充当遗传学信息的受体)。本文描述了引导多核苷酸/Cas系统的用途，即，提供灵活的基因组裂解特异性并且在DNA靶位点处产生高频率的双链断裂，从而实现在感兴趣的核苷酸序列中的高效基因编辑，其中待编辑的感兴趣的核苷酸序列可位于由Cas内切核酸酶识别和裂解的靶位点之内或之外。
“修饰的核苷酸”或“编辑的核苷酸”是指在与未修饰的核苷酸序列相比时包含至少一种改变的感兴趣的核苷酸序列。此类“改变”包括例如：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
术语“多核苷酸修饰模板”是指当与待编辑的核苷酸序列相比时包含至少一种核苷酸修饰的多核苷酸。核苷酸修饰可为至少一个核苷酸的替换、添加或缺失。任选地，多核苷酸修饰模板还可包含至少一种核苷酸修饰旁侧的同源核苷酸序列，其中旁侧同源核苷酸序列向待编辑的所需核苷酸序列提供充分的同源性。
在一个实施例中，本公开描述了用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括将引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。细胞包括但不限于动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞以及通过本文所述的方法制备的植物和种子。待编辑的核苷酸可位于由Cas内切核酸酶识别和裂解的靶位点之内或之外。在一个实施例中，所述至少一种核苷酸修饰不是在由Cas内切核酸酶识别和裂解的靶位点处的修饰。在另一个实施例中，待编辑的至少一个核苷酸与基因组靶位点之间存在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、900或1000个核苷酸。
待编辑的核苷酸序列可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的序列。例如，细胞基因组中的核苷酸序列可为稳定地掺入到细胞基因组中的转基因。编辑这样的转基因可得到另外的所需表型或基因型。细胞基因组中的核苷酸序列还可为突变的或预先存在的序列，其为从诸如感兴趣的内源基因或突变基因之类的起源内生或人造的。
在一个实施例中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的启动子活性、提高的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。
在一个实施例中，核苷酸序列可为细胞基因组中的调控序列。调控序列为能够提高或降低生物体内特定基因的表达的核酸分子的区段。调控序列的例子包括但不限于转录激活因子、转录阻遏子和翻译阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、CAAT盒、CCAAT盒、普里布诺盒、TATA盒、SECIS元件和聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，编辑调控元件导致改变的蛋白质翻译、RNA裂解、RNA剪接或转录终止。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的调控序列修饰
在一个实施例中，待修饰的核苷酸序列可为调控序列，诸如启动子，其中编辑启动子包括将启动子或启动子片段替换(也称为“启动子交换”或“启动子替换”)为不同的启动子(也称为替换启动子)或启动子片段(也称为替换启动子片段)，其中启动子替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的启动子活性、提高的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗、同一细胞层或其他细胞层中基因表达的时机或发育进度的修饰(诸如但不限于延长玉米花药的绒毡层中基因表达的时机(1998年11月17日公布的US 5,837,850))、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的启动子(或启动子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子片段)。替换启动子(或替换启动子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子片段)。
在一个实施例中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将ARGOS 8启动子替换为玉蜀黍(Zea mays)GOS2PRO：GOS2-内含子启动子。
在一个实施例中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将天然EPSPS1启动子替换为植物泛素启动子。
在一个实施例中，核苷酸序列可为启动子，其中编辑启动子包括将内源玉米NPK1启动子替换为胁迫诱导型玉米RAB17启动子。
在一个实施例中，核苷酸序列可为启动子，其中待编辑的启动子选自玉蜀黍-PEPCI启动子(Kausch等人，Plant Molecular Biology，45：1-15，2001)、玉蜀黍泛素启动子(UBI1ZM PRO，Christensen等人，plant Molecular Biology 18：675-689，1992)、玉蜀黍-Rootmet2启动子(US 7,214,855)、稻肌动蛋白启动子(OS-ACTIN PRO，US5641876；McElroy等人，The Plant Cell，第2卷，163-171，1990年2月)、高粱RCC3启动子(2012年2月13日提交的US 2012/0210463)、玉蜀黍-GOS2启动子(US 6,504,083)、玉蜀黍-ACO2启动子(2014年3月14日提交的美国申请14/210,711)或玉蜀黍-油质蛋白启动子(US 8466341 B2)。
在另一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列结合使用以允许将启动子或启动子元件插入到感兴趣的基因组核苷酸序列中，其中启动子插入(或启动子元件插入)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的启动子活性(提高的启动子强度)、提高的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待插入的启动子元件可为但不限于启动子核心元件(诸如但不限于CAAT盒、CCAAT盒、普里布诺盒和/或TATA盒)、用于诱导型表达的翻译调控序列和/或阻遏子系统(诸如TET操纵子阻遏子/操纵子/诱导物元件、或磺酰脲类(Su)阻遏子/操纵子/诱导物元件)。脱水响应元件(DRE)首先经鉴定为干旱响应基因rd29A的启动子中的顺式作用启动子元件，其包含9bp保守核心序列TACCGACAT(Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(1994)Plant Cell6，251-264)。将DRE插入到内源启动子中可赋予下游基因干旱诱导型表达。另一个例子是ABA响应元件(ABRE)，其包含据发现存在于许多ABA和/或胁迫调节的基因中的(C/T)ACGTGGC共有序列(Busk P.K.，Pages M.(1998)Plant Mol.Biol.37：425-435)。将35S增强子或MMV增强子插入到内源启动子区中将提高基因表达(美国专利5196525)。待插入的启动子(或启动子元件)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的启动子(或启动子元件)。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于在内源FMT1启动子前面插入增强子元件(诸如但不限于花椰菜花叶病毒35S增强子)以增强FTM1的表达。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于将TET操纵子阻遏子/操纵子/诱导物系统的组分、或磺酰脲类(Su)阻遏子/操纵子/诱导物系统的组分插入到植物基因组中，以生成或控制诱导型表达系统。
在另一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许启动子或启动子元件的缺失，其中启动子缺失(或启动子元件缺失)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：永久失活的基因座、提高的启动子活性(提高的启动子强度)、提高的启动子组织特异性、降低的启动子活性、降低的启动子组织特异性、新的启动子活性、诱导型启动子活性、延长的基因表达窗、基因表达的时机或发育进度的修饰、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的启动子元件可为但不限于启动子核心元件、启动子增强子元件或35S增强子元件(如实例32中所述)。待缺失的启动子或启动子片段对于正在编辑的细胞可为内源、人工、预先存在、或转基因的。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于缺失存在于玉米基因组中的ARGOS 8启动子，如本文所述。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于缺失存在于植物基因组中的35S增强子元件，如本文所述。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的终止子修饰
在一个实施例中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中编辑终止子包括将终止子或终止子片段替换(也称为“终止子交换”或“终止子替换”)为不同的终止子(也称为替换终止子)或终止子片段(也称为替换终止子片段)，其中终止子替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的终止子活性、提高的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的缺失或添加。待修饰的终止子(或终止子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子片段)。替换终止子(或替换终止子片段)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子片段)。
在一个实施例中，待修饰的核苷酸序列可为终止子，其中待编辑的终止子选自：来自玉米Argos 8或SRTF18基因的终止子，或其他终止子，诸如马铃薯PinII终止子、高粱肌动蛋白终止子(SB-ACTIN TERM，2013年12月公布的WO 2013/184537 A1)、高粱SB-GKAF TERM(WO2013019461)、稻T28终止子(OS-T28 TERM，WO 2013/012729 A2)、AT-T9 TERM(WO 2013/012729 A2)或GZ-W64A TERM(US7053282)。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸修饰模板或供体DNA序列结合使用以允许将终止子或终止子元件插入到感兴趣的基因组核苷酸序列中，其中终止子插入(或终止子元件插入)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的终止子活性(提高的终止子强度)、提高的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。
待插入的终止子(或终止子元件)可为对于正在编辑的细胞为内源、人工、预先存在、或转基因的终止子(或终止子元件)。
在另一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许终止子或终止子元件的缺失，其中终止子缺失(或终止子元件缺失)导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的终止子活性(提高的终止子强度)、提高的终止子组织特异性、降低的终止子活性、降低的终止子组织特异性、DNA结合元件的突变和/或DNA结合元件的添加。待缺失的终止子或终止子片段对于正在编辑的细胞可为内源、人工、预先存在、或转基因的。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的另外的调控序列修饰
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞基因组中的调控序列。调控序列为能够提高或降低生物体内特定基因的表达并且/或能够改变生物体内基因的组织特异性表达的核酸分子的区段。调控序列的例子包括但不限于3’UTR(非翻译区)区、5’UTR区、转录激活因子、转录增强子、转录阻遏子、翻译阻遏子、剪接因子、miRNA、siRNA、人工miRNA、启动子元件、CAMV 35S增强子、MMV增强子元件(2013年3月11日提交的PCT/US14/23451)、SECIS元件、聚腺苷酸化信号，以及聚泛素化位点。在一些实施例中，编辑(修饰)或替换调控元件导致改变的蛋白质翻译、RNA裂解、RNA剪接、转录终止或翻译后修饰。在一个实施例中，可鉴定启动子内的调控元件并且可编辑或修饰这些调控元件，从而优化这些调控元件对启动子的上调或下调。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的基因组序列是聚泛素化位点，其中聚泛素化位点的修饰改变了蛋白质降解速度。泛素标签使蛋白质通过蛋白酶体或自体吞噬降解。已知蛋白酶体抑制剂导致蛋白质生产过剩。对编码感兴趣的蛋白质的DNA序列的修饰可产生感兴趣的蛋白质的至少一种氨基酸修饰，其中所述修饰允许蛋白质的聚泛素化(翻译后修饰)，从而导致对蛋白质降解的修饰。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的基因组序列为玉米EPSPS基因上的聚泛素化位点，其中聚泛素化位点经修饰后，由于EPSPS蛋白质降解速度减慢，所以蛋白质含量提高。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的基因组序列为内含子位点，其中该修饰包括将内含子增强基元插入到内含子中，这引起对包含所述内含子的基因的转录活性的调节。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的基因组序列为内含子位点，其中该修饰包括将大豆EPSP1内含子替换为大豆泛素内含子1，如本文所述(实例25)。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的基因组序列为内含子或UTR位点，其中该修饰包括将至少一个微RNA插入到所述内含子或UTR位点，其中包含内含子或UTR位点的基因的表达还引起所述微RNA的表达，这继而可沉默由微RNA靶向的任何基因而不破坏包含所述内含子的天然/转基因的基因表达。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于允许锌指转录因子的缺失或突变，其中锌指转录因子的缺失或突变导致或允许形成显性负性锌指转录因子突变体(Li等人2013Rice zinc finger protein DST enhances grain production throughcontrolling Gnla/OsCKX2expression PNAS 110：3167-3172)。在锌指结构域下游插入单个碱基对将导致移码并且产生新蛋白质，该新蛋白质可在没有转录活性的情况下仍结合到DNA。突变型蛋白将竞争结合到细胞分裂素氧化酶基因启动子并且阻断细胞分裂素氧化酶基因的表达。细胞分裂素氧化酶基因表达的减少将提高细胞分裂素水平并且促进稻中的稻穗生长和玉米中的穗生长，并且提高在正常和胁迫条件下的产量。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统修饰剪接位点和/或引入替代剪接位点
蛋白质合成使用由前mRNA分子经受成熟过程产生的mRNA分子。通过添加多A尾对前mRNA分子进行加帽、剪接和稳定化。真核细胞进化出复杂的剪接过程，该过程产生原始前mRNA分子的备选变体。真核细胞中的一些可能不产生用于蛋白质合成的功能模板。在玉米细胞中，剪接过程受外显子-内含子连接位点处的剪接位点影响。典型的剪接位点的例子是AGGT。基因编码序列可包含多个替代剪接位点，其可影响前mRNA成熟过程的总体效率，因而可限制细胞中的蛋白质积累。引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸修饰模板结合使用来编辑感兴趣的基因，从而在剪接位点的所述连接点或任何变体处引入典型的剪接位点，所述剪接位点改变前mRNA分子的剪接模式。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的核苷酸序列为玉米EPSPS基因，其中基因的修饰包括修饰可选的剪接位点，从而提高功能基因转录物和基因产物(蛋白质)的产量。
在一个实施例中，待修饰的感兴趣的核苷酸序列为基因，其中基因的修饰包括编辑可选地剪接的基因的内含子边界以改变剪接变体的积累。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行的编码感兴趣的蛋白质的核苷酸序 列的修饰
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于修饰或替换细胞基因组中的编码序列，其中修饰或替换导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的蛋白质(酶)活性、提高的蛋白质功能性、降低的蛋白质活性、降低的蛋白质功能性、位点特异性突变、蛋白质结构域交换、蛋白质敲除、新的蛋白质功能性、修饰的蛋白质功能性。
在一个实施例中，蛋白质敲除是由于将终止密码子引入到感兴趣的编码序列中造成的。
在一个实施例中，蛋白质敲除是由于感兴趣的编码序列中的起始密码子的缺失造成的。
使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的氨基酸和/或蛋白质融合
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码第一蛋白质的第一编码序列融合到编码细胞基因组中的第二蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合导致以下情况中的任一种或以下情况的任一组合：提高的蛋白质(酶)活性、提高的蛋白质功能性、降低的蛋白质活性、降低的蛋白质功能性、新的蛋白质功能性、修饰的蛋白质功能性、新的蛋白质定位、新的蛋白质表达时机、修饰的蛋白质表达模式、嵌合蛋白质，或具有显性表型功能性的修饰蛋白质。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号的第一编码序列融合到编码感兴趣的蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合将感兴趣的蛋白质靶向到叶绿体。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号的第一编码序列融合到编码感兴趣的蛋白质的第二编码序列，其中蛋白质融合将感兴趣的蛋白质靶向到叶绿体。
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸序列一起使用或不一起使用以将编码叶绿体定位信号(例如，叶绿体转运肽)的第一编码序列融合到第二编码序列，其中蛋白质融合产生具有显性表型功能性的修饰蛋白质。
通过使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统在感兴趣的基因中表达反向重复进 行的基因沉默
在一个实施例中，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可与共同递送的多核苷酸序列结合使用以将反向基因片段插入到生物体基因组的感兴趣的基因中，其中插入反向基因片段可允许在体内创建反向重复(发夹)并且导致所述内源基因的沉默。
在一个实施例中，插入反向基因片段可导致在基因的天然(或修饰的)启动子和/或天然基因的天然5’端中形成体内创建的反向重复(发夹)。反向基因片段还可包含内含子，其可导致所靶向基因的增强沉默。
用于性状基因座表征的基因组缺失
植物育种中的性状定位通常会检测其中含有控制感兴趣的性状表达的一个或多个基因的染色体区域。对于质量性状，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除所鉴定的染色体区域中的候选基因，以确定所述基因的缺失是否影响性状的表达。对于数量性状，感兴趣的性状的表达取决于在一个或多个染色体上效应量、复杂性和统计显著性不同的多个数量性状基因座(QTL)。在负面效应或有害QTL区域影响复杂性状的情况下，引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统可用于消除由标记辅助的精细定位界定的整个区域，以及用于靶向特定区域来进行其选择性消除或重排。类似地，存在/不存在变异(PAV)或拷贝数变异(CNV)可使用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统通过选择性基因组缺失操纵。
在一个实施例中，感兴趣的区域可在旁侧带有两个独立的引导多核苷酸/CAS内切核酸酶靶序列。裂解将同时进行。缺失事件将为不具有感兴趣的区域的两个染色体末端的修复。可选结果将包括感兴趣的区域的倒位，在切割位点处的突变以及感兴趣的区域的重复。
用于鉴定在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸的至少一 个植物细胞的方法。
还提供了用于鉴定在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸的至少一个植物细胞的方法。有多种方法可用于鉴定在靶位点处或附近具有对基因组的插入的那些植物细胞，而无须使用可筛选的标记表型。这种方法可认为是直接分析靶序列以检测靶序列中的任何变化，包括但不限于PCR方法、测序方法、核酸酶消化、DNA印迹法以及它们的任何组合。参见例如，美国专利申请12/147,834以本文所述方法所需的程度并入本文中。
该方法还包括由包含整合到其基因组中的感兴趣的多核苷酸的植物细胞再生植物。该植物可为不育的或能育的。已经认识到任何感兴趣的多核苷酸均可在靶位点处提供、整合到植物基因组中，并且在植物中表达。
感兴趣的多核苷酸/多肽包括但不限于除草剂耐受性编码序列、杀昆虫编码序列、杀线虫编码序列、抗微生物编码序列、抗真菌编码序列、抗病毒编码序列、非生物和生物胁迫耐受性编码序列、或修饰植物性状例如产量、谷粒质量、营养成分、淀粉质量和数量、固氮和/或氮利用、脂肪酸以及含油量和/或油组成的序列。更具体的感兴趣的多核苷酸包括但不限于改善作物产量的基因，改善作物合意性的多肽，编码赋予对非生物压力例如干旱、氮、温度、盐度、有毒金属或微量元素的抗性的蛋白或赋予对毒素例如杀虫剂和除草剂的抗性的那些蛋白或赋予对生物压力例如真菌、病毒、细菌、昆虫和线虫入侵的抗性及对与这些生物体相关疾病的发展的抗性的那些蛋白的基因。感兴趣的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及管家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、能育性或不育性、谷粒特性和商业产品重要的性状的基因。一般而言，感兴趣的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些以及影响籽粒大小、蔗糖载量等的那些，所述性状可与其他性状堆叠或组合使用，所述其他性状诸如但不限于本文所述的除草剂抗性。
除了使用传统的育种方法外，还可通过遗传方式改变农艺上重要的性状，比如油脂含量、淀粉含量和蛋白质含量。修饰包括提高油酸、饱和油脂与不饱和油脂的含量，提升赖氨酸和硫的水平，提供必需氨基酸，以及修饰淀粉。美国专利5,703,049、5,885,801、5,885,802和5,990,389描述了大麦硫堇(Hordothionin)蛋白质修饰法，这些专利都以引用方式并入本文。另一个例子是美国专利5,850,016中所述的由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或富含硫的种子蛋白，以及Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106中描述的来自大麦的胰凝乳蛋白酶抑制剂，这些文献的公开内容都以引用方式并入本文。
还可在感兴趣的多核苷酸上编码可提高例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质的表达的商业性状。经转化植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，如美国专利5,602,321中所述。诸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
可通过定点诱变产生编码序列的衍生物，由此提高预选氨基酸在所编码的多肽中的水平。举例来说，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因源自大麦胰凝乳蛋白酶抑制剂(1996年11月1日提交的美国申请序列号08/740,682，以及WO 98/20133，这些专利的公开内容以引用方式并入本文)。其他蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白质，诸如来自葵花籽的蛋白质(Lilley等人(1989)Proceedings of the World Congress on Vegetable ProteinUtilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite编辑(American OilChemists Society，Champaign，Illinois)，第497-502页；该文献以引用方式并入本文)；来自玉米的蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等人(1988)Gene71：359，这两篇文献均以引用方式并入本文)和来自稻的蛋白质(Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.12：123，该文献以引用方式并入本文)。其他农艺上重要的基因编码胶乳、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。
改善作物产量的多核苷酸包括矮化基因，如Rht1和Rht2(Peng等人(1999)Nature400：256-261)以及提高植物生长的那些，如铵诱导型谷氨酸脱氢酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允许植物具有减少的饱和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物营养价值的那些多核苷酸、以及提高籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善盐耐受性的多核苷酸是提高或允许植物在与已引入耐盐基因的该植物的天然环境相比更高盐度的环境中生长的那些多核苷酸。
影响氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如邻氨基苯甲酸合酶(AS；EC4.1.3.27)，该酶催化植物、真菌和细菌中从芳族氨基酸途径分支到色氨酸生物合成的第一反应。在植物中，色氨酸生物合成的化学过程处于叶绿体区室中。参见例如美国公布20080050506，这篇文献以引用方式并入本文。另外的感兴趣的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指编码催化分支酸转化为丙酮酸和pHBA的酶的基因。表征最充分的CPL基因已从大肠杆菌中分离并具有GenBank登录号M96268。参见美国专利7,361,811，将其以引用的方式并入本文。
这些感兴趣的多核苷酸序列可编码涉及提供病害或害虫抗性的蛋白。所谓“病害抗性”或“害虫抗性”意指植物避开作为植物-病原体相互作用的后果的有害症状。害虫抗性基因可编码对严重影响产量的害虫如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等的抗性。病害抗性基因和昆虫抗性基因，如用于抗细菌保护的溶菌酶或天蚕抗菌肽(cecropin)，或用于抗真菌保护的蛋白质如防御素、葡聚糖酶或几丁质酶，或用于防治线虫或昆虫的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)内毒素、蛋白酶抑制剂、胶原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因产物的例子。编码病害抗性性状的基因包括解毒基因，如抗伏马毒素(美国专利5,792,931)；无毒性(avr)和病害抗性(R)基因(Jones等人(1994)Science 266：789；Martin等人(1993)Science 262：1432；和Mindrinos等人(1994)Cell 78：1089)等等。昆虫抗性基因可编码针对会导致产量大跌的害虫(诸如根虫、切根虫、欧洲玉米螟等)的抗性。这种基因包括例如苏云金芽孢杆菌毒蛋白基因(美国专利5,366,892；5,747,450；5,736,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene 48：109)等等。
“除草剂抗性蛋白”或由“除草剂抗性编码核酸分子”表达生成的蛋白质包括这样的蛋白质，其赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比耐受更高浓度除草剂的能力，或赋予细胞与未表达该蛋白质的细胞相比对某种浓度除草剂耐受更长时间的能力。除草剂抗性性状可通过如下基因引入到植物中：编码对乙酰乳酸合酶(ALS)起到抑制作用的除草剂(特别是磺酰脲类除草剂)的抗性的基因、编码对谷氨酰胺合酶起到抑制作用的除草剂例如膦丝菌素或basta的抗性的基因(如，bar基因)、对草甘膦的抗性的基因(如，EPSP合酶基因和GAT基因)、对HPPD抑制剂的抗性的基因(如，HPPD基因)或本领域已知的其他这类基因。参见例如美国专利7,626,077、5,310,667、5,866,775、6,225,114、6,248,876、7,169,970、6,867,293和美国临时申请61/401,456，将所述专利每一者以引用的方式并入本文。bar基因编码对除草剂basta的抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。
不育基因也可编码在表达盒中，为物理去雄提供备选方案。以此类方式使用的基因的例子包括雄性育性基因，诸如MS26(参见例如美国专利7,098,388、7,517,975、7,612,251)、MS45(参见例如美国专利5,478,369、6,265,640)或MSCA1(参见例如美国专利7,919,676)。玉米植物(玉蜀黍(Zea mays L.))可通过自花授粉和异花授粉两种技术来进行育种。在同一植株上，玉米具有位于雄穗上的雄花，以及位于雌穗上的雌花。其可自花授粉(“自交”)或异花授粉。当风将花粉从雄穗吹至从初始雌穗顶部突出的穗丝时在玉米中发生天然的授粉。授粉可通过本领域的技术人员已知的技术容易地控制。玉米杂交体的开发需要纯合近交系的开发、这些近交系的杂交和杂交的评估。谱系选择和轮回选择是用于从群体开发近交系的两种育种方法。育种程序将来自两种或更多种近交系或各种广泛来源的所需性状结合到育种库中，从育种库中通过自交并选择所需表型来开发新的近交系。杂交玉米品种是两个此类近交系的杂交，所述近交系中的每个可能具有一种或多种在另一近交系中缺乏的所需特性，或补充另一近交系的所需特性。使新的近交株与其他近交系杂交，并且对来自这些杂交的杂交体进行评价以确定哪些具有商业潜力。第一代杂交子代称为F1。F1杂交体比其自交亲本更有活力。该杂交体活力(或杂种优势)可以多种方式体现，包括提高的营养生长和提高的产量。
杂交玉米种子可通过结合了人工去雄的雄性不育系统产生。为了产生杂交种子，将雄穗从生长的雌性近交亲本移除，其可以与雄性近交亲本成交替行的多种模式种植。因此，在与外来玉米花粉的来源充分隔离的前提条件下，磁性近交株的雌穗将仅通过来自雄性近交株的花粉受精。因此所得种子是杂交体(F1)并且将形成杂交植物。
影响植物发育的田地变化可导致植物在雌性亲本的人工去雄完成之后抽穗。或者，雌性近交植物雄穗可能无法在去雄过程期间被完全移除。在任何情况下，结果是雌性植物将成功地散出花粉并且一些雌性植物将自花授粉。这将导致雌性近交株的种子连同正常产生的杂交种子一起收获。雌性近交株种子不表现出杂种优势并且因此不如F1种子高产。此外，雌性近交株种子的存在对于生产杂交体的公司可能意味着种质安全风险。
另选地，雌性近交株可通过机器机械地去雄。机械去雄大致如手工去雄一样可靠，但是更快并且成本更低。然而，大多数去雄机器比手工去雄对植物产生更多损害。因此，目前没有一种去雄形式是完全令人满意的，并且仍然需要进一步降低生产成本的替代品以及消除杂交种子生产中雌性亲本的自花授粉。
造成植物中雄性不育的突变有潜力可用于作物植物(诸如玉米)的杂交种子生产的方法中，并且可通过以下方式来降低生产成本：消除耗费劳力地从用作杂交亲本的母本植物移除雄花(也称为去雄)的需要。已有多种方法可产生造成玉米中雄性不育的突变，诸如X射线或紫外线照射、化学处理或转座元件插入(ms23、ms25、ms26、ms32)(Chaubal等人(2000)Am J Bot 87：1193-1201)。通过育性/不育性“分子开关”对育性基因进行条件调控可增强设计用于作物改良的新雄性不育性系统的选择性(Unger等人(2002)TransgenicRes 11：455-465)。
除了鉴定影响雄性育性的新型基因之外，还需要提供产生遗传雄性不育性的可靠系统。
在美国专利5,478,369中，描述了一种方法，通过该方法将Ms45雄性育性基因加标签并克隆在玉米9号染色体上。此前，已描述了9号染色体上的从未被克隆和测序的雄性育性基因ms2。该基因不是‘369专利中提到的基因的等位基因。参见Albertsen，M.和Phillips，R.L.，“Developmental Cytology of 13Genetic Male Sterile Loci inMaize”Canadian Journal of Genetics&Cytology 23：195-208(1981年1月)。在此之前克隆的仅有的育性基因是Aarts等人(出处同上)描述的拟南芥(Arabidopsis)基因。
随后发现的对于雄性育性重要的基因的例子有很多并且包括拟南芥败育小孢子(AMS)基因(Sorensen等人，The Plant Journal(2003)33(2)：413-423)；拟南芥MS1基因(Wilson等人，The Plant Journal(2001)39(2)：170-181)；NEF1基因(Ariizumi等人，ThePlant Journal(2004)39(2)：170-181)；拟南芥AtGPAT1基因(Zheng等人，The Plant Cell(2003)15：1872-1887)；拟南芥dde2-2突变被示为缺乏丙二烯氧合酶基因(Malek等人，Planta(2002)216：187-192)；拟南芥匿名(faceless)花粉-1基因(flp1)(Ariizumi等人，Plant Mol.Biol.(2003)53：107-116)；拟南芥雄性性母细胞死亡1基因(Yang等人，ThePlant Cell(2003)15：1281-1295)；绒毡层特异性锌指基因TAZ1(Kapoor等人，The PlantCell(2002)14：2353-2367)；以及绒毡层决定子1基因(Lan等人，The Plant Cell(2003)15：2792-2804)。
其他已知的来自玉蜀黍的雄性育性突变体或基因在美国专利7,919,676中列出，该专利以引用方式并入本文。
其他基因包括激酶和编码对雄性或雌性配子体发育有毒的化合物的那些基因。
此外，已经认识到感兴趣的多核苷酸可还包含与所靶向的感兴趣的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互补的反义序列。构建反义核苷酸以与对应的mRNA杂交。可对反义序列作出修饰，只要该序列能杂交对应的mRNA并干扰其表达。以此方式，可使用与对应的反义序列具有70％、80％或85％序列同一性的反义构建体。此外，反义核苷酸的部分可用来破坏靶基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸或更多个核苷酸的序列。
另外，感兴趣的多核苷酸还可以以有义取向使用来抑制植物中的内源基因的表达。用有义取向的多核苷酸抑制植物中的基因表达的方法是本领域已知的。该方法通常涉及用包含这样的启动子的DNA构建体转化植物，该启动子可操作地连接至对应于该内源基因的转录物的核苷酸序列的至少一部分，能驱动在植物中的表达。通常，这种核苷酸序列与内源基因的转录物的序列具有实质的序列同一性，通常高于约65％的序列同一性、约85％的序列同一性或高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323；将这些专利以引用方式并入本文。
感兴趣的多核苷酸还可以是表型标记。表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择标记，无论它是阳性还是阴性选择标记。可使用任何表型标记。具体地，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴别或选取或不选取含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。
选择性标记的例子包括但不限于包含限制性酶位点的DNA区段；编码提供对于有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素，诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码另外缺乏受体细胞的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷标记)；编码可易于鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位点(例如，之前尚未并置的两个DNA序列的并置)的DNA区段；包含未受限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学品等作用或受其作用的DNA序列的DNA区段；以及包含特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA区段，该特异性修饰使得可以鉴别该DNA序列。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)Curr Opin Biotech 3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff，(1992)Mol Microbiol 6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell 49：603-12；Figge等人，(1988)Cell 52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-21；Labow等人，(1990)Mol Cell Biol 10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-6；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res 19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)Topics Mol Struc Biol 10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob Agents Chemother 35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-51；Oliva等人，(1992)AntimicrobAgents Chemother 36：913-9；Hlavka等人，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-4。也可以在一种或多种基因上编码商业性状，所述基因可提高例如用于乙醇生产的淀粉，或提供蛋白质表达。经转化植物的另一个重要商业用途是生产聚合物和生物塑料，如美国专利5,602,321中所述。诸如β-酮基硫解酶、PHBase(聚羟基丁酸合酶)和乙酰乙酰基-CoA还原酶的基因(参见Schubert等人(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达。
外源产物包括植物酶和植物产物，以及来自包括原核生物和其他真核生物在内的其他来源的那些产物。这类产物包括酶、辅因子、激素等。可提高蛋白质，特别是具有能够提高植物营养价值的改善氨基酸分布的经修饰蛋白质的水平。这可通过表达具有提高的氨基酸含量的这类蛋白质来实现。
感兴趣的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及感兴趣的多核苷酸可包含一个或多个用于基因沉默的DNA序列。涉及在植物中表达DNA序列的基因沉默方法是本领域已知的，包括但不限于共抑制、反义抑制、双链RNA(dsRNA)干扰、发夹RNA(hpRNA)干扰、含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰、转录基因沉默以及微RNA(miRNA)干扰。
本文所用的“核酸”是指多核苷酸，包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸也可包括片段和修饰的核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，表示单链或双链的RNA和/或DNA聚合物，其任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过它们的单字母命名指代如下：“A”指代腺苷或脱氧腺苷(分别对于RNA或DNA)，“C”指代胞嘧啶或脱氧胞嘧啶，“G”指代鸟苷或脱氧鸟苷，“U”指代尿苷，“T”指代脱氧胸苷，“R”指代嘌呤(A或G)，“Y”指代嘧啶(C或T)，“K”指代G或T，“H”指代A或C或T，“I”指代肌苷，“N”指代任何核苷酸。
“开放阅读框”缩写为ORF。
术语“功能上等同的亚片段”和“功能等同亚片段”在本文中可互换使用。这些术语指代分离核酸片段的这样的部分或亚序列，其中改变基因表达或产生某种表型的能力得到保持，无论该片段或亚序列是否编码活性酶。例如，该片段或亚片段可用于设计基因以在转化的植物中产生所需的表型。可通过将核酸片段或其亚片段——无论其是否编码活性酶——相对于植物启动子序列以有义或反义方向进行连接，来设计基因用于抑制。
术语“保守结构域”或“基元”是指在进化上相关的蛋白质的经比对的序列上特定位置处保守的一组氨基酸。虽然其他位置处的氨基酸在同源蛋白质之间可变，但在特定位置处高度保守的氨基酸表示对于蛋白质的结构、稳定性或活性而言必需的氨基酸。由于它们因其在蛋白质同源物家族的经比对的序列中的高保守度而被鉴定，它们可用作鉴定物或“识别标志(signature)”，以鉴定具有新确定的序列的蛋白质是否属于之前鉴定的蛋白质家族。
多核苷酸和多肽序列、其变体以及这些序列的结构关系，可用术语“同源性”、“同源的”、“实质上相同的”、“实质上相似的”和“实质上对应”描述，这些术语在本文中可互换使用。这些是指多肽或核酸片段，其中一个或多个氨基酸或核苷酸碱基的变化不影响分子的功能，如介导基因表达或产生某种表型的能力。这些术语还指核酸片段的这样的修饰，相对于初始的未修饰的片段，所述修饰不实质上改变所得的核酸片段的功能性质。这些修饰包括在核酸片段中缺失、替换和/或插入一个或多个核苷酸。
所涵盖的实质上相似的核酸序列，可通过其与本文所例示的序列杂交，或与本文所公开的且与任何本文所公开的核酸序列在功能上等同的核苷酸序列的任何部分杂交(在中等严格条件下，例如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)的能力来定义。可调整严格性条件以筛选中等相似片段，如来自远缘关系生物的同源序列，以及高度相似片段，如来自近缘关系生物的复制功能酶的基因。杂交后的洗涤决定了严格性条件。
术语“选择性杂交”包括指涉在严格杂交条件下核酸序列与指定的核酸靶序列杂交的程度比其与非靶序列杂交的程度可检测地更高(例如，至少2倍于背景)，并且实质上排除非靶核酸。选择性杂交的序列通常相互具有约至少80％的序列同一性，或90％的序列同一性，最多至100％并包括100％的序列同一性(即完全互补性)。
术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括指代在体外杂交测定中探针将与其靶序列选择性杂交的条件。严格条件是序列依赖性的，在不同的情况中将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。另选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般地讲，探针长度小于约1000个核苷酸，任选地长度小于500个核苷酸。
通常，严格条件将为其中盐浓度低于约1.5M钠离子，通常为约0.01至1.0M钠离子浓度(或其他盐)，pH为7.0至8.3，对短探针(例如，10至50个核苷酸)而言温度为至少30℃，对长探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少约60℃的那些条件。严格条件还可以通过添加去稳定剂如甲酰胺来实现。示例性的低严格条件包括用30％-35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃下杂交并在1倍至2倍SSC(20倍SSC＝3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中在50-55℃下洗涤。示例性的中等严格条件包括在40％-45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.5倍至1倍SSC中在55-60℃下洗涤。示例性的高严格条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃下杂交并在0.1倍SSC中在60-65℃下洗涤。
在核酸或多肽序列的情形中，“序列同一性”或“同一性”是指在指定的比较窗范围为获得最大对应而比对时两条序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基。
术语“序列同一性百分数”意指通过在比较窗上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸或多肽序列在比较窗中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通过以下方式计算这种百分数：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗中位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。序列同一性百分数的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％的任何整数百分数。这些同一性可用本文描述的任何程序确定。
序列比对和百分比同一性或相似性计算可用多种被设计用于检测同源序列的比较方法来确定，包括但不限于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。在本申请的上下文中，应理解，在使用序列分析软件进行分析的情况中，除非另有指明，否则分析的结果将基于所提到的程序的“默认值”。本文所用的“默认值”将意指软件第一次初始化时原始装载在该软件中的任何数值或参数组。
“Clustal V比对方法”对应于标记为Clustal V的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191)并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTM程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)。对于多序列比对，默认值对应于GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝10。使用Clustal方法进行蛋白质序列的双序列比对和同一性百分数计算的默认参数是KTUPLE＝1、GAP PENALTY＝3，WINDOW＝5，以及DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数是KTUPLE＝2、GAP PENALTY＝5，WINDOW＝4，以及DIAGONALS SAVED＝4。在用Clustal V程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
“Clustal W比对方法”对应于标记为Clustal W的比对方法(通过以下文献描述：Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5：151-153；Higgins等人，(1992)Comput Appl Biosci 8：189-191)并且可见于LASERGENE生物信息学计算软件包的MegAlignTMv6.1程序(DNASTARInc.，Madison，WI)。用于多序列比对的默认参数(GAP PENALTY＝10，GAP LENGTH PENALTY＝0.2，Delay Divergen Seqs(％)＝30，DNA转换权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet系列，DNA权重矩阵＝IUB)。在用Clustal W程序进行序列比对后，可以通过观察同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”。
除非另有规定，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys，San Diego，CA)用以下参数获得的值：使用空位产生罚分权重50和空位长度延伸罚分权重3以及nwsgapdna.cmp打分矩阵获得的核苷酸序列的同一性％和相似性％；使用空位产生罚分权重8和空位长度延伸罚分2以及BLOSUM62打分矩阵获得的氨基酸序列的同一性％和相似性％(Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。GAP利用Needleman和Wunsch，(1970)J Mol Biol 48：443-53的算法来寻找两个完整序列的比对，该比对使匹配数最大而使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并使用以匹配碱基为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分产生出具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。
“BLAST”是美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的用于寻找生物序列之间的相似性区域的搜索算法。该程序将核苷酸或蛋白质序列与序列数据库比较，并计算各匹配的统计学显著性以鉴定出与查询序列具有足够的相似性的序列，使得相似性不会被预测为随机发生。BLAST报告所鉴定的序列以及它们与查询序列的局部比对。
本领域的技术人员熟知，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的或经天然修饰或合成法修饰的多肽，其中这种多肽具有相同或相似的功能或活性。同一性百分数的有用例子包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％，或50％至100％之间的任何整数百分数。实际上，50％至100％之间的任何整数氨基酸同一性可用于描述本公开，如51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
“基因”包括表达功能性分子(诸如但不限于特定蛋白质)的核酸片段，包括位于编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调控序列。“天然基因”指如自然界中找到那样具有其自身调节序列的基因。
“突变基因”是已通过人为干预被改变的天然基因。这种“突变基因”的序列与相应的非突变基因的序列不同之处在于至少一个核苷酸的添加、缺失或替换。在本公开的某些实施例中，突变基因包含由本文所公开的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统引起的改变。突变植物是包含突变基因的植物。
本文所用的“靶向突变”是天然基因中的通过如下方式产生的突变：使用涉及本文所公开的或本领域已知的能够在靶序列的DNA中引起双链断裂的双链断裂诱导剂的方法，对天然基因内的靶序列进行改变。
在一个实施例中，靶向突变是引导多核苷酸/Cas内切核酸酶诱导的基因编辑的结果，如本文所述。引导多核苷酸/Cas内切核酸酶诱导的靶向突变可发生于位于基因组靶位点之内或之外的核苷酸序列中，该基因组靶位点由Cas内切核酸酶识别和裂解。
术语“基因组”应用于植物细胞时，不仅涵盖细胞核内存在的染色体DNA，也涵盖细胞的亚细胞组分(例如线粒体或质体)中存在的细胞器DNA。
“密码子修饰的基因”或“密码子偏好的基因”或“密码子优化的基因”是这样的基因，其密码子用法的频率被设计成模拟宿主细胞的偏好密码子用法的频率。
“等位基因”是基因的占据染色体上特定基因座的几种另选形式之一。当染色体上特定基因座处存在的所有等位基因都相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果染色体上特定基因座处存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。
“编码序列”指编码特定氨基酸序列的多核苷酸序列。“调控序列”指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部、或下游(3′非编码序列)并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于：启动子、翻译前导序列、5′非翻译序列、3′非翻译序列、内含子、聚腺苷酸化靶序列、RNA加工位点、效应物结合位点和茎环结构。
“植物优化核苷酸序列”是已经过优化以提高在植物中的表达、特别是提高在植物中或一种或多种感兴趣的植物中的表达的核苷酸序列。例如，可通过使用一个或多个用于改进表达的植物偏好密码子，对本文所公开的编码蛋白质例如双链断裂诱导剂(例如内切核酸酶)的核苷酸序列进行修饰，来合成植物优化核苷酸序列。有关宿主偏好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。
合成植物偏好基因的方法是本领域现成的。参见例如美国专利5,380,831和5,436,391，以及Murray等人(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，这些专利和文献以引用方式并入本文。已知有另外的序列修饰可增强在植物宿主中的基因表达。这些修饰包括例如消除以下序列：一个或多个编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列，一个或多个转座子样重复序列，以及其他这种得到很好表征的可能对基因表达有害的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的植物宿主的平均水平，这通过参考在宿主植物细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免一个或多个预测的发夹二级mRNA结构。因此，本公开的“植物优化核苷酸序列”包含一个或多个这种序列修饰。
“启动子”指能够控制编码序列或功能RNA的表达的DNA序列。启动子序列由近端上游元件和更远端的上游元件组成，后一类元件经常称作增强子。因此，“增强子”是这样的DNA序列，其可以刺激启动子活性，并且可以是启动子的固有元件或经插入以增强启动子的水平或组织特异性的异源元件。启动子可以整体源自天然基因，或由源自自然界中存在的不同启动子的不同元件构成，或甚至包含合成的DNA区段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以引导基因在不同组织或细胞类型中或在不同的发育阶段或应答于不同的环境条件时表达。还认识到，由于在大多数情况下调节序列的确切界限仍未完全确定，因此存在一定变异的各DNA片段可以具有相同的启动子活性。造成基因在大多数时间在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。
已经证实，某些启动子能够以高于其他启动子的速率指导RNA合成。这些被称为“强启动子”。已经证实，某些其他启动子仅在特定类型的细胞或组织中以较高水平指导RNA合成，并且如果启动子优选地在某些组织中指导RNA合成，但在其他组织中以降低的水平指导RNA合成，则其通常被称为“组织特异性启动子”或“组织偏好启动子”。由于引入到植物中的一个或多个嵌合基因的表达模式使用启动子来控制，因此人们对下述新型启动子的分离一直有兴趣，该新型启动子能够在特定组织类型中或在特定植物发育阶段以一定水平控制一个或多个嵌合基因的表达。
不断发现可用于植物细胞中的各种类型的新启动子，在以下汇编物中可以找到许多例子：Okamuro和Goldberg，(1989)The Biochemistry of Plants，第115卷，Stumpf和Conn编辑(New York，NY：Academic Press)，第1-82页。
“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的多核苷酸序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列上游的充分加工的mRNA中。翻译前导序列可以影响初级转录物加工成mRNA、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的例子已有描述(例如Turner和Foster，(1995)Mol Biotechnol 3：225-236)。
“3′非编码序列”、“转录终止子”或“终止序列”指位于编码序列下游的DNA序列，包括聚腺苷酸化识别序列和其他编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的序列。多腺苷酸化信号通常以影响添加多腺苷酸串至mRNA前体3′末端为特征。不同的3′非编码序列的用途由Ingelbrecht等人，(1989)Plant Cell 1：671-680例举。
“RNA转录物”指由RNA聚合酶催化的DNA序列的转录所产生的产物。当RNA转录物是DNA序列的完美互补拷贝时，它被称为初级转录物。当RNA转录物是由初级转录物的转录后加工衍生的RNA序列时，它被称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”指没有内含子且可被细胞翻译成蛋白质的RNA。“cDNA”指与mRNA模板互补且用反转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可为单链的或通过使用DNA聚合酶I的Klenow片段转化成双链形式。“有义”RNA是指包含mRNA并且可被翻译成细胞内或体外的蛋白质的RNA转录物。“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并且能阻断靶基因的表达的RNA转录物(参见例如美国专利5,107,065)。反义RNA的互补性可存在于特定基因转录物的任何部分，即在5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列。“功能RNA”指反义RNA、核酶RNA或其他可能不被翻译但仍对细胞过程具有作用的RNA。术语“互补序列”或“反向互补序列”在本文中可互换地用来指涉mRNA转录物，并且意在定义该信息(message)的反义RNA。
术语“有效连接”指各核酸序列结合在单一核酸片段上，使得一个核酸序列的功能被另一个核酸序列调节。例如，当启动子能够调节编码序列的表达时(即，该编码序列处于该启动子的转录控制下)，则该启动子与该编码序列有效连接。编码序列可以以有义或反义方向与调节序列有效连接。在另一个例子中，互补的RNA区域可以直接或间接地与靶mRNA的上游(5′)有效连接，或与靶mRNA的下游(3′)有效连接，或在靶mRNA内部有效连接，或第一互补区域在靶mRNA的上游(5′)，并且其互补序列在靶mRNA的下游(3′)。
本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域公知的，在以下文献中有更完全的描述：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)。转化方法是本领域技术人员公知的，并在下文中描述。
“PCR”或“聚合酶链反应”是一项用于合成特定DNA区段的技术，由一系列的重复的变性、退火和延伸循环组成。通常，将双链DNA进行热变性，并将两条与靶区段的3′边界互补的引物与该DNA在低温下退火，然后在中等温度下延伸。一组这三个连续步骤称为一个“循环”。
术语“重组的”指序列的两个本来分开的区段例如通过化学合成人工组合在一起，或通过遗传工程技术对核酸的分离的区段进行操纵。
术语“质粒”、“载体”和“盒”指这样的染色体外元件，其通常携带不是细胞的中心代谢的一部分的基因，并且通常为双链DNA的形式。这种元件可以是衍生自任何来源的、单链或双链DNA或RNA的、线状或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中多个核苷酸序列已连接或重组成能够将感兴趣的多核苷酸引入到细胞中的独特构建体。“转化盒”指含有外来基因并且除该外来基因之外还具有能促进特定宿主细胞的转化的元件的特定载体。“表达盒”指含有外来基因并且除该外来基因之外还具有使该基因可以在外来宿主中表达的元件的特定载体。
术语“重组DNA分子”、“重组构建体”、“表达构建体”、“构建体”、“构建体”和“重组DNA构建体”在本文中可互换使用。重组构建体包含在自然界中不全部在一起的核酸片段(例如调节序列和编码序列)的人工组合。例如，构建体可以包含源自不同来源的调控序列和编码序列，或源自相同来源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的调控序列和编码序列。这种构建体可单独使用或可与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将被用来转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员公知的。例如，可以使用质粒载体。技术人员熟知为了成功地转化、选择和扩增宿主细胞而必须在载体上存在的遗传元件。技术人员还将认识到，不同的独立转化事件可导致不同的表达水平和表达模式(Jones等人，(1985)EMBO J 4：2411-2418；De Almeida等人，(1989)Mol Gen Genetics 218：78-86)，因此通常对多个事件进行筛选以获得显示所需表达水平和表达模式的细胞系。这种筛选可通过标准的分子生物学测定法、生物化学测定法和其他测定法完成，所述测定法包括DNA印迹分析、mRNA表达的RNA印迹分析、PCR、实时定量PCR(qPCR)、反转录PCR(RT-PCR)、蛋白质表达的免疫印迹分析、酶或活性测定和/或表型分析。
本文所用的术语“表达”指产生前体形式或成熟形式的功能性最终产物(例如mRNA、引导多核苷酸或蛋白质)。
术语“引入”意指向细胞提供核酸(例如表达构建体)或蛋白质。引入包括指代核酸掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入到该细胞的基因组中，并且包括指代核酸或蛋白质短暂提供到细胞。引入包括指代稳定的或短暂的转化方法，以及有性杂交。因此，在将核酸片段(例如，重组DNA构建体/表达构建体)插入细胞中的语境中，“引入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指代将核酸片段掺入到真核或原核细胞中，其中该核酸片段可掺入到细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
“成熟”蛋白质指翻译后加工的多肽(即，已从初级翻译产物移除了任何存在的原肽或前肽所得的多肽)。“前体”蛋白质指mRNA的翻译的初级产物(即，仍存在原肽和前肽)。原肽和前肽可以是但不限于胞内定位信号。
“稳定转化”指核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，包括核基因组和细胞器基因组在内，从而导致遗传上稳定的遗传。相反，“瞬时转化”指核酸片段转移到宿主生物体的细胞核或其他含DNA的细胞器中，导致基因表达，但不存在整合或稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体称作“转基因”生物体。
遗传改良种质的商业开发也已进展到将多种性状引入作物植物的阶段，通常称为基因堆叠方法。在该方法中，可以将赋予不同感兴趣的特性的多个基因引入植物。基因堆叠可通过许多方法实现，包括但不限于共转化、再转化以及使具有不同感兴趣的基因的株系的杂交。
术语“植物”指整株植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、及其种子和子代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物部分包括分化的和未分化的组织，包括但不限于根、茎、苗、叶、花粉、种子、瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如，单细胞、原生质体、胚和愈伤组织)。植物组织可以在植物中或在植物器官、组织或培养物中。术语“植物器官”指构成植物的形态上和功能上不同的部分的植物组织或一组植物组织。术语“基因组”指生物体每个细胞或病毒或细胞器中存在的全部互补遗传材料(基因和非编码序列)；以及/或者作为(单倍体)单位从一个亲本继承的完整组的染色体。“子代”包含植物的任何后续各代。
转基因植物包括例如这样的植物，该植物在其基因组内包含通过转化步骤引入的异源多核苷酸。异源多核苷酸可稳定地整合在基因组内，使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。转基因植物还可在其基因组内包含不止一个异源多核苷酸。每个异源多核苷酸可赋予转基因植物不同性状。异源多核苷酸可包括源自外来物种的序列，或者，如果源自相同物种，则可为对其天然形式进行了实质性修饰的序列。“转基因”可包括其基因型已因异源核酸的存在而改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初经如此改变的转基因植物以及通过有性杂交或无性繁殖从最初的转基因植物产生的那些。通过常规植物育种方法，通过本文所述的不导致外来多核苷酸插入的基因组编辑程序，或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变不旨在被认为是转基因的。
在本公开的一个实施例中，组合物包括包含重组DNA构建体和引导多核苷酸的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化Cas内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化Cas内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
在本公开的另一个实施例中，组合物还包含整合到所述植物的基因组靶位点中的感兴趣的多核苷酸。
在本公开的另一个实施例中，组合物还包含在基因组靶位点处的修饰，其中该修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
在本公开的另一个实施例中，组合物包括包含至少一个改变的靶序列的植物或种子，其中所述至少一个改变的靶序列源自由引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物识别和裂解的相应靶序列，其中Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的所述靶位点处引入双链断裂，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
在本公开的另一个实施例中，组合物包括包含修饰的核苷酸序列的植物或种子，其中修饰的核苷酸序列通过向细胞提供引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶而产生，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
在本公开的某些实施例中，能育植物是能产生活的雄配子和雌配子并且自身能育的植物。这种自身能育植物可在没有任何其他植物贡献配子及其中所含的遗传材料的情况下产生子代植物。本公开的其他实施例可涉及使用不是自身能育的植物，因为该植物不产生活的或能够授/受精的雄配子或雌配子，或两者。本文所用的“雄性不育植物”是不产生活的或能够授精的雄配子的植物。本文所用的“雌性不育植物”是不产生活的或能够受精的雌配子的植物。应当认识到，雄性不育和雌性不育植物可以分别是雌性能育和雄性能育的。还应认识到，雄性能育(但雌性不育)植物当与雌性能育植物杂交时可产生活的子代，而雌性能育(但雄性不育)植物当与雄性能育植物杂交时可产生活的子代。
“厘摩”(cM)或“图距单位(map unit)”是两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或它们的任何配对之间的距离，其中1％的减数分裂产物是重组的。因此，一厘摩与等于两个连接的基因、标记、靶位点、基因座或它们的任何配对之间的1％平均重组频率的距离相当。
使用双组分引导RNA和Cas内切核酸酶系统的育种方法和选择植物的方法。
本公开可用于培育包含一种或多种转基因性状的植物。最通常地，转基因性状是作为基于农杆菌法、基因枪法或其他常用程序的转化系统的结果而随机插入在植物基因组当中。最近，已开发出了能够定向插入转基因的基因打靶方案。一种重要的技术即位点特异性整合(SSI)能使转基因靶向与之前插入的转基因相同的染色体位置。定制的大范围核酸酶和定制的锌指大范围核酸酶使研究者可以设计核酸酶以靶向特定的染色体位置，并且这些试剂使得可以将转基因靶向于被这些核酸酶裂解的染色体位点。
真核基因组(例如，植物基因组)的精确遗传工程目前所使用的系统依赖于归巢内切核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶、以及转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，这需要对每个新靶基因座进行从头蛋白质工程改造。
本文所述的高度特异性引导多核苷酸/Cas9内切核酸酶系统更易于定制，并且因此在以许多不同靶序列的修饰为目标时更有用。在一个实施例中，本公开进一步利用引导多核苷酸/Cas系统的多组分性质，其中其恒定蛋白质组分为Cas内切核酸酶，并且其可变和易于重复编程的靶向组分为引导多核苷酸。如本文所述，引导多核苷酸可包含DNA、RNA或DNA-RNA组合序列，从而使其完全可定制并且因此在以一个或许多不同靶序列的修饰为目标时更有用。
在其中核酸酶脱靶切割对于靶细胞可能有毒的情况下，本文所述的引导多核苷酸/Cas系统对于基因组工程(尤其是植物基因组工程)特别有用。在本文所述的引导多核苷酸/Cas系统的一个实施例中，将表达优化的Cas9基因形式的恒定组分稳定地整合到靶基因组(诸如植物基因组)中。Cas9基因的表达处于启动子(例如，植物启动子)的控制下，该启动子可为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子，例如温度诱导型、胁迫诱导型、发育阶段诱导型、或化学诱导型启动子。在不存在引导多核苷酸的可变靶向结构域的情况下，Cas蛋白质不能够识别和切割DNA，并且因此其在植物细胞中的存在应具有很小影响或没有影响。因此，本文所述的引导多核苷酸/Cas系统的关键优点是形成和维护细胞系或转基因生物体的能力，所述细胞系或转基因生物体能够有效地表达对于细胞活力具有很小影响或没有影响的Cas蛋白质。为了诱导在所需基因组位点处的切割实现靶向遗传修饰，可通过多种方法将引导多核苷酸引入到包含稳定整合和表达的Cas基因的细胞中。例如，引导多核苷酸可通过化学或酶促合成，并且通过直接递送方法(诸如粒子轰击或电穿孔)引入到Cas表达细胞中。
另选地，能够在靶细胞中有效地表达引导多核苷酸的基因可通过化学合成、酶促合成或在生物系统中合成，并且这些基因可通过直接递送方法(诸如粒子轰击、电穿孔)或生物递送方法(诸如农杆菌介导的DNA递送)引入到Cas表达细胞中。
本公开的一个实施例是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂；b)获得包含引导多核苷酸的第二植物，该引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中该引导多核苷酸不单独包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的所需改变的子代植物。
本公开的另一个实施例是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得包含至少一种能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶的第一植物；b)获得包含引导多核苷酸和供体DNA的第二植物，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择包含在所述靶位点处插入的感兴趣的多核苷酸的子代植物。
本公开的另一个实施例是用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括选择至少一种在其植物基因组中的靶位点处包含改变的子代植物，其中所述子代植物通过使表达至少一种Cas内切核酸酶的第一植物与包含引导多核苷酸和供体DNA的第二植物杂交而获得，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸。
如本文所公开，引导多核苷酸/Cas系统介导的基因靶向可在用于指导转基因插入和/或用于制备包含多个转基因的复合转基因性状基因座的方法中以类似于WO2013/0198888(2013年8月1日公布)中公开的方式使用，其中使用如本文所公开的引导多核苷酸/Cas系统代替使用双链断裂诱导剂来引入感兴趣的基因。在一个实施例中，复合转基因性状基因座是具有多个彼此遗传连锁的转基因的基因座。通过在彼此0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2或甚至5厘摩(cM)的距离内插入独立的转基因，转基因可作为单个遗传基因座培育(参见例如，美国专利申请13/427,138或PCT申请PCT/US2012/030061)。在选择包含转基因的植物之后，包含(至少)一个转基因的植物可杂交以形成包含两个转基因的F1。在来自这些F1的子代(F2或BC1)中，1/500的子代会具有被重组到同一染色体上的两个不同转基因。该复合基因座然后可被培育成为具有两种转基因性状的单个遗传基因座。可重复这个过程以按需堆积尽可能多的性状。
蛋白质可以各种方式进行改变，包括氨基酸替换、缺失、截短和插入。用于这类操作的方法是公知的。例如，可通过在DNA中作出突变来制备蛋白质的氨基酸序列变体。诱变和核苷酸序列改变的方法包括例如Kunkel，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92；Kunkel等人，(1987)Meth Enzymol 154：367-82；美国专利4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，NewYork)以及其中引用的参考文献。有关不太可能影响蛋白质的生物活性的氨基酸替换的指导，见于例如Dayhoff等人，(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(NatlBiomed Res Found，Washington，D.C.)的模型。保守替换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可以是优选的。保守缺失、插入和氨基酸替换预期不会造成蛋白质特征的根本性变化，并且任何替换、缺失、插入或它们的组合的效应可通过常规筛选测定法进行评估。测定双链断裂诱导活性的测定法是已知的，一般是测量该试剂对含有靶位点的DNA底物的总体活性和特异性。
已知有多种方法可用来将核苷酸序列和多肽引入到生物体中，包括例如转化、有性杂交在内，以及将多肽、DNA或mRNA引入细胞中。
用于接触、提供和/或引入组合物到各种生物体中的方法是已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法、病毒介导的方法和有性育种。稳定转化表示所引入的多核苷酸整合到生物体的基因组中并能够被其子代遗传。瞬时转化表示所引入的组合物仅仅在生物体中暂时表达或存在。
用于将多核苷酸或多肽引入得到植物中的方案可根据作为转化目标的植物或植物细胞的类型(如单子叶植物或双子叶植物)而异。将多核苷酸和多肽引入到植物细胞中并随后插入到植物基因组中的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)Biotechniques4：320-34，以及美国专利6,300,543)、分生组织转化(美国专利5,736,369)、电穿孔(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-6)，农杆菌介导的转化(美国专利5,563,055和5,981,840)，直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J 3：2717-22)，以及弹道粒子加速法(美国专利4,945,050、5,879,918、5,886,244、5,932,782；Tomes等人，(1995)“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via MicroprojectileBombardment”，Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑(Springer-Verlag，Berlin)；McCabe等人，(1988)Biotechnology 6：923-6；Weissinger等人，(1988)Ann Rev Genet 22：421-77；Sanford等人，(1987)ParticulateScience and Technology 5：27-37(洋葱)；Christou等人，(1988)Plant Physiol 87：671-4(大豆)；Finer和McMullen，(1991)In Vitro Cell Dev Biol 27P：175-82(大豆)；Singh等人，(1998)Theor Appl Genet 96：319-24(大豆)；Datta等人，(1990)Biotechnology 8：736-40(稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-9(玉米)；Klein等人，(1988)Biotechnology 6：559-63(玉米)；美国专利5,240,855、5,322,783和5,324,646；Klein等人，(1988)Plant Physiol 91：440-4(玉米)；Fromm等人，(1990)Biotechnology 8：833-9(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人，(1984)Nature 311：763-4；美国专利5,736,369(谷类)；Bytebier等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-9(百合科(Liliaceae))；De Wet等人，(1985)，The Experimental Manipulation of OvuleTissues，Chapman等人编辑，(Longman，New York)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，(1990)Plant Cell Rep 9：415-8和Kaeppler等人，(1992)Theor Appl Genet 84：560-6(触须介导的转化)；D′Halluin等人，(1992)Plant Cell 4：1495-505(电穿孔)；Li等人，(1993)Plant Cell Rep 12：250-5；Christou和Ford(1995)Annals Botany 75：407-13(稻)以及Osjoda等人，(1996)Nat Biotechnol 14：745-50(通过根瘤农杆菌转化的玉米)。
另选地，可通过使植物与病毒或病毒核酸接触来将多核苷酸引入到植物中。一般地讲，这种方法涉及将多核苷酸掺入在病毒DNA或RNA分子内。在一些例子中，可最初将感兴趣的多肽作为病毒聚蛋白的一部分合成，后者然后在体内或体外通过蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。涉及病毒DNA或RNA分子的、用于将多核苷酸引入到植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是已知的，参见例如美国专利5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367和5,316,931。瞬时转化方法包括但不限于直接引入多肽如双链断裂诱导剂到生物体中、引入多核苷酸如DNA和/或RNA多核苷酸、引入RNA转录物如编码双链断裂诱导剂的mRNA到生物体中。这类方法包括(例如)显微注射法或粒子轰击法。参见例如Crossway等人，(1986)Mol Gen Genet 202：179-85；Nomura等人，(1986)Plant Sci 44：53-8；Hepler等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：2176-80；以及Hush等人，(1994)J Cell Sci 107：775-84。
术语“双子叶植物”是指也称为“双子叶植物纲”的被子植物的亚类并且包括提及整株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞及其子代。本文所用的植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
在本公开的上下文中的术语“杂交的”或“杂交”或“正在杂交”意指配子通过授粉而融合以产生子代(即，细胞、种子或植物)。该术语既涵盖有性杂交(一株植物由另一株植物授粉)，也涵盖自交(自花授粉，即，当花粉和胚珠来自相同植物或遗传上相同的植物时)。
术语“基因渗入”是指遗传基因座的所需等位基因从一种遗传背景传递到另一种遗传背景的现象。例如，所需等位基因在指定基因座处的基因渗入可通过两个亲本植物之间有性杂交传递到至少一个子代植物，其中亲本植物中的至少一个在其基因组内具有所需等位基因。另选地，例如，等位基因的传递可通过例如在融合原生质体中的两个供体基因组之间的重组而发生，其中供体原生质体中的至少一个在其基因组中具有所需等位基因。所需等位基因可为例如转基因或所选的标记或QTL的等位基因。
标准的DNA分离、纯化、分子克隆、载体构建和验证/表征方法是确立的，参见例如Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)。载体和构建体包括包含感兴趣的多核苷酸和任选其他组分的环状质粒和线状多核苷酸，所述其他组分包括连接子、衔接子、调控区、内含子、限制位点、增强子、隔离子、选择性标记、感兴趣的核苷酸序列、启动子和/或其他有助于载体构建或分析的位点。在一些例子中，识别位点和/或靶位点可包含在内含子、编码序列、5′UTR、3′UTR和/或调控区内。
本公开还提供了表达构建体，所述表达构建体用于在酵母或植物、植物细胞或植物部分中表达能够结合到靶位点并在靶位点中产生双链断裂的引导多核苷酸/Cas系统。在一个实施例中，本公开的表达构建体包含可操作地连接至编码Cas基因的核苷酸序列的启动子以及可操作地连接至本公开的引导多核苷酸的启动子。该启动子能够驱动有效连接的核苷酸序列在植物细胞中的表达。
启动子是参与RNA聚合酶和其他蛋白质的识别和结合以起始转录的DNA区域。植物启动子是能够在植物细胞中起始转录的启动子，有关植物启动子的综述参见Potenza等人，(2004)In Vitro Cell Dev Biol 40：1-22。组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子以及WO99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature 313：810-2)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)PlantCell 2：163-71)；泛素(Christensen等人，(1989)Plant Mol Biol 12：619-32；Christensen等人，(1992)Plant Mol Biol 18：675-89)；pEMU(Last等人，(1991)TheorAppl Genet 81：581-8)；MAS(Velten等人，(1984)EMBO J 3：2723-30)；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子在例如美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中有所描述。在一些例子中，可使用诱导型启动子。病原体感染后被诱导的病原体诱导型启动子包括但不限于那些调节PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等的表达的启动子。
可将化学调控启动子用于通过施用外源化学调控剂来调节基因在植物中的表达。该启动子可以是化学诱导启动子，其中化学剂的施加可诱导基因表达，或是化学阻遏启动子，其中化学剂的施加可阻遏基因表达。化学诱导启动子包括但不限于玉米In2-2启动子，其由苯磺酰胺除草剂安全剂激活(De Veylder等人，(1997)Plant Cell Physiol 38：568-77)；玉米GST启动子(GST-II-27，WO93/01294)，其由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活；以及烟草PR-1a启动子(Ono等人，(2004)Biosci Biotechnol Biochem 68：803-7)，其由水杨酸激活。其他化学调控启动子包括类固醇响应性启动子(参见例如糖皮质类固醇诱导型启动子(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10421-5；McNellis等人，(1998)Plant J 14：247-257)；四环素诱导型和四环素阻遏型启动子(Gatz等人，(1991)MolGen Genet 227：229-37；美国专利5,814,618和5,789,156)。
组织偏好的启动子可用来靶向特定植物组织内的增强的表达。组织偏好性启动子包括(例如)下列文献中提出的那些：
Kawamaa等人，(1997)Plant Cell Physiol 38：792-803；Hansen等人，(1997)MolGen Genet 254：337-43；Russell等人，(1997)Transgenic Res 6：157-68；Rinehart等人，(1996)Plant Physiol 112：1331-41；Van Camp等人，(1996)Plant Physiol 112：525-35；Canevascini等人，(1996)Plant Physiol 112：513-524；Lam，(1994)Results Probl CellDiffer 20：181-96；以及Guevara-Garcia等人，(1993)Plant J 4：495-505。叶偏好的启动子包括(例如)下列文献中提出的那些：Yamamoto等人，(1997)Plant J 12：255-65；Kwon等人，(1994)Plant Physiol 105：357-67；Yamamoto等人，(1994)Plant Cell Physiol 35：773-8；Gotor等人，(1993)Plant J 3：509-18；Orozco等人，(1993)Plant Mol Biol 23：1129-38；Matsuoka等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：9586-90；Simpson等人，(1958)EMBO J 4：2723-9；Timko等人，(1988)Nature 318：57-8。根偏好的启动子包括(例如)下列文献中提出的那些：Hire等人，(1992)Plant Mol Biol 20：207-18(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Miao等人，(1991)Plant Cell 3：11-22(胞质谷氨酰胺合成酶(GS))；Keller和Baumgartner，(1991)Plant Cell 3：1051-61(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人，(1990)Plant Mol Biol 14：433-43(根瘤农杆菌甘露氨酸合酶(MAS)的根特异性启动子)；BoguSz等人，(1990)Plant Cell 2：633-41(从榆科山黄麻(Parasponia andersonii)和鸡屎藤山麻黄(Trema tomentosa)分离的根特异性启动子)；Leach和Aoyagi，(1991)Plant Sci 79：69-76(毛根农杆菌(A.rhizogenes)rolC和rolD根诱导基因)；Teeri等人，(1989)EMBO J 8：343-50(农杆菌创伤诱导的TR1′和TR2’基因)；VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人，(1995)Plant Mol Biol 29：759-72)；以及rolB启动子(Capana等人，(1994)Plant Mol Biol 25：681-91)；菜豆素基因(Murai等人，(1983)Science 23：476-82；Sengopta-Gopalen等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3320-4)。还可参见美国专利5,837,876、5,750,386、5,633,363、5,459,252、5,401,836、5,110,732和5,023,179。
种子偏好的启动子包括种子发育过程中活跃的种子特异性启动子和在种子萌发过程中活跃的种子萌发启动子。参见Thompson等人，(1989)BioEssays 10：108。种子偏好的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；以及milps(肌醇-1-磷酸合酶)；(WO00/11177和美国专利6,225,529)。对于双子叶植物，种子偏好的启动子包括但不限于豆类β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白、β-伴球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等。对于单子叶植物，种子偏好启动子包括但不限于玉米15kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、22kDa玉米醇溶蛋白基因启动子、27kDaγ玉米醇溶蛋白基因启动子、waxy基因启动子、shrunken 1基因启动子、shrunken 2基因启动子、球蛋白1基因启动子，油质蛋白基因启动子以及nuc1基因启动子。另参见WO00/12733，其中公开了来自END1和END2基因的种子偏好启动子。
表型标记是可筛选或可选择的标记，其包括可视标记和选择性标记，无论它是阳性还是阴性选择性标记。可使用任何表型标记。具体地，可选择的或可筛选的标记包含这样的DNA区段，该DNA区段使得可以常常在特定条件下鉴别或选取或不选取含有它的分子或细胞。这些标记可编码活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白质的产生，或可为RNA、肽、蛋白质、无机和有机化合物或组合物等提供结合位点。
选择性标记的例子包括但不限于包含限制性酶位点的DNA区段；编码提供对于有毒化合物的抗性的产物的DNA区段，所述有毒化合物包括抗生素，诸如壮观霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、Basta、新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)；编码另外缺乏受体细胞的产物的DNA区段(例如，tRNA基因、营养缺陷标记)；编码可易于鉴定的产物的DNA区段(例如，表型标记，诸如β-半乳糖苷酶、GUS；荧光蛋白，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，青色荧光蛋白(CFP)，黄色荧光蛋白(YFP)，红色荧光蛋白(RFP)，以及细胞表面蛋白)；生成用于PCR的新引物位点(例如，之前尚未并置的两个DNA序列的并置)的DNA区段；包含未受限制性内切核酸酶或其他DNA修饰酶、化学品等作用或受其作用的DNA序列的DNA区段；以及包含特异性修饰(例如，甲基化)所需的DNA序列的DNA区段，该特异性修饰使得可以鉴别该DNA序列。
另外的选择性标记包括能赋予对除草化合物如草铵膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的抗性的基因。参见例如Yarranton，(1992)Curr Opin Biotech 3：506-11；Christopherson等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：6314-8；Yao等人，(1992)Cell 71：63-72；Reznikoff,(1992)Mol Microbiol 6：2419-22；Hu等人，(1987)Cell48：555-66；Brown等人，(1987)Cell 49：603-12；Figge等人，(1988)Cell 52：713-22；Deuschle等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-4；Fuerst等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2549-53；Deuschle等人，(1990)Science 248：480-3；Gossen，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Reines等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-21；Labow等人，(1990)Mol Cell Biol 10：3343-56；Zambretti等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-6；Baim等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-6；Wyborski等人，(1991)Nucleic Acids Res 19：4647-53；Hillen和Wissman，(1989)Topics Mol Struc Biol 10：143-62；Degenkolb等人，(1991)Antimicrob Agents Chemother 35：1591-5；Kleinschnidt等人，(1988)Biochemistry 27：1094-104；Bonin，(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg；Gossen等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-51；Oliva等人，(1992)Antimicrob Agents Chemother 36：913-9；Hlavka等人，(1985)Handbook of ExperimentalPharmacology，第78卷(Springer-Verlag，Berlin)；Gill等人，(1988)Nature 334：721-4。
可采用常规条件将具有所引入的序列的细胞生长或再生成植物，参见例如McCormick等人，(1986)Plant Cell Rep 5：81-4。然后可使这些植物生长，并用相同转化株或用不同转化株或未转化株进行授粉，并鉴定出具有所需特性和/或包含所引入的多核苷酸或多肽的所得子代。可生长两代或更多代以确保多核苷酸得到稳定保持和遗传，并收获种子。
可使用任何植物，包括单子叶植物和双子叶植物。可使用的单子叶植物的例子包括但不限于玉米(Zea mays)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghumbicolor，Sorghum vulgare)、粟(例如珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicummiliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、小麦(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、菠萝(Ananas comosus)、香蕉(Musa spp.)、棕榈、观赏植物、草坪草和其他草类。可使用的双子叶植物的例子包括但不限于大豆(Glycine max)、卡诺拉(Brassicanapus和B.campestris)、苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、向日葵(Helianthus annuus)、棉花(Gossypium arboreum)和花生(Arachis hypogaea)、西红柿(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)等。
感兴趣的转基因、重组DNA分子、DNA序列以及感兴趣的多核苷酸可包含一个或多个感兴趣的基因。这种感兴趣的基因可编码例如为植物提供农艺优势的蛋白质。
植物的标记辅助选择和育种
开发作物物种中的分子标记的主要动机是有可能通过标记辅助选择(MAS)提高植物育种效率。遗传标记等位基因，或者另选地，数量性状基因座(QTL)等位基因用于鉴定如下植物，该植物包含一个或多个基因座处的所需基因型，并且预期将所需基因型连同所需表型传递到其子代。遗传标记等位基因(或QTL等位基因)可用于鉴定如下植物，该植物包含一个基因座或若干非连锁或连锁的基因座处的所需基因型(例如，单倍型)，并且预期将所需基因型连同所需表型传递到其子代。应当理解，出于MAS的目的，术语标记可涵盖标记和QTL基因座两者。
在确定所需表型和多态性染色体基因座(例如，标记基因座或QTL)同时分离之后，可以使用那些多态性基因座来选择对应于所需表型的等位基因一称为标记辅助选择(MAS)的过程。简而言之，在来自待选择的植物的生物样品中检测对应于标记核酸的核酸。该检测可采取探针核酸与标记杂交的形式，例如使用等位基因特异性杂交、DNA印迹分析、RNA印迹分析、原位杂交、引物的杂交然后是PCR扩增标记区域等。用于检测标记的各种程序是本领域中已知的。在生物样品中的特定标记的存在(或不存在)被验证之后，选择植物，即，用于通过选择性育种形成子代植物。
植物育种需要结合感兴趣的性状与高产基因并结合其他所需性状以开发改良的植物品种。筛选大量样品可能是昂贵、耗时且不可靠的。使用标记和/或遗传连锁的核酸是用于在育种程序中选择具有所需性状的植物的有效方法。例如，经过田地评价的标记辅助选择的一个优点在于，MAS可无论生长季节如何而在一年中的任何时候进行。此外，环境效应与标记辅助选择无关。
当群体根据影响一种或多种性状的多个基因座而分离时，MAS的效率与表型筛选相比变得甚至更高，因为在实验室中可对来自单个DNA样品的所有基因座一起加工。
细胞的DNA修复机制是引入外源DNA或在内源基因中诱导突变的基础。DNA同源重组是细胞使用同源序列修复DNA损伤的专门DNA修复方式。在植物中，DNA同源重组发生频率过低而不能按常规用于基因靶向或基因编辑，后来发现该过程可通过DNA双链断裂刺激(Bibikova等人，(2001)Mol.Cell Biol.21：289-297；Puchta和Baltimore，(2003)Science300：763；Wright等人，(2005)Plant J.44：693-705)。
缩写含义如下：“sec”指秒，“min”指分钟，“h”指小时，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升、“L”指升、“μM”指微摩尔浓度、“mM”指毫摩尔浓度、“M”指摩尔浓度、“mmol”指毫摩尔、“μmole”指微摩尔、“g”指克、“μg”指微克、“ng”指纳克、“U”指单位、“bp”指碱基对，并且“kb”指千碱基。
本文所公开的组合物和方法的非限制性例子如下：
1.一种引导多核苷酸，所述引导多核苷酸包含：
(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；和
(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
2.根据实施例1所述的引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域位于单个分子上。
3.根据实施例1所述的引导多核苷酸，其中第二核苷酸序列结构域包含能够沿着互补区域杂交的两个单独分子。
4.根据实施例1-3中任一项所述的引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域为DNA序列，并且第二核苷酸序列结构域选自DNA序列、RNA序列、以及它们的组合。
5.根据实施例1所述的引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域为DNA序列。
6.根据实施例1所述的引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域和/或第二核苷酸序列结构域包含至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。
7.根据实施例1所述的引导多核苷酸，其中第一核苷酸序列结构域和/或第二核苷酸序列结构域包含至少一种提供另外的有益特征的修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟i核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。
8.根据实施例7所述的引导多核苷酸，其中所述另外的有益特征选自改变的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、改变的互补靶序列结合亲和力、改变的细胞降解抗性、和提高的细胞渗透性。
9.一种包含实施例1-8中任一项所述的引导多核苷酸的植物或种子。
10.一种引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中引导多核苷酸包括(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；和(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
11.根据实施例10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域和第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
12.根据实施例10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述引导多核苷酸的第一核苷酸序列结构域和/或第二核苷酸序列结构域包含至少一种提供另外的有益特征的修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、或它们的任何组合。
13.根据实施例10-12中任一项所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中Cas内切核酸酶为Cas9内切核酸酶。
14.一种包含实施例10-13中任一项所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物的植物或种子。
15.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括将引导多核苷酸引入到具有Cas内切核酸酶的细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
16.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括将引导多核苷酸和Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
17.根据实施例15-16中任一项所述的方法，所述方法还包括将供体DNA引入到所述细胞中，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸。
18.根据实施例15-17中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定至少一个在所述靶标处具有修饰的细胞，其中在所述靶位点处的修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
19.一种用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，该方法包括：
a)将引导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；
b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
20.根据实施例19所述的方法，其中供体DNA和Cas内切核酸酶使用至少一个能够表达供体DNA和/或Cas内切核酸酶的重组DNA构建体引入到所述细胞中。
21.根据实施例15-20中任一项所述的方法，其中引导多核苷酸通过粒子轰击直接引入。
22.根据实施例15-20中任一项所述的方法，其中引导多核苷酸通过粒子轰击或包含U6聚合酶III的重组DNA构建体的农杆菌转化来引入。
23.根据实施例15-20中任一项所述的方法，其中引导多核苷酸为包含可变靶向结构域和cas内切核酸酶识别结构域的单链引导多核苷酸。
24.根据实施例15-20中任一项所述的方法，其中引导多核苷酸为包含cr核苷酸分子和tracr核苷酸分子的双链引导多核苷酸。
25.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：
a)将cr核苷酸、能够表达tracrRNA的第一重组DNA构建体、和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA引入到细胞中，其中所述cr核苷酸为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的组合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及
b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
26.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，该方法包括：
a)将tracr核苷酸、能够表达crRNA的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA引入到细胞中，其中所述tracr核苷酸被选为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的组合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及
b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
27.一种用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方
法，该方法包括：
a)将能够表达引导多核苷酸的第一重组DNA构建体、和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；
b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，该细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
28.一种用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，该方法包括将引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中Cas内切核酸酶在所述细胞基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
29.根据实施例15-28中任一项所述的方法，其中细胞选自非人类动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞。
30.根据实施例29所述的方法，其中植物细胞选自单子叶植物和双子叶植物细胞。
31.根据实施例29所述的方法，其中植物细胞选自玉米、稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、或柳枝稷、大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、和红花细胞。
32.一种包含引导多核苷酸和Cas9内切核酸酶的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas9内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
33.一种包含重组DNA构建体和引导多核苷酸的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化Cas内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化Cas内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
34.根据实施例32-33中任一项所述的植物，所述植物还包含整合到所述植物的所述基因组靶位点中的感兴趣的多核苷酸。
35.根据实施例32-33中任一项所述的植物或种子，所述植物或种子还包含在所述基因组靶位点处的修饰，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
36.一种包含至少一个改变的靶序列的植物或种子，其中所述至少一个改变的靶序列源自由引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物识别和裂解的相应靶序列，其中Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的所述靶位点处引入双链断裂，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
37.一种包含修饰的核苷酸序列的植物或种子，其中修饰的核苷酸序列通过向细胞提供引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶而产生，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
38.根据实施例29所述的植物或植物细胞，其中所述至少一种核苷酸修饰不是在所述靶位点处的修饰。
39.根据实施例32-38中任一项所述的植物，其中所述植物为单子叶植物或双子叶植物。
40.根据实施例39所述的植物，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、或柳枝稷。
41.根据实施例39所述的植物，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、或红花。
42.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂；b)获得包含引导多核苷酸的第二植物，该引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中该引导多核苷酸不单独包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的所需改变的子代植物。
一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得包含能够在植物基因组中的靶位点处引入双链断裂的至少一种Cas内切核酸酶的第一植物；b)获得包含引导多核苷酸和供体DNA的第二植物，其中引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择包含在所述靶位点处插入的感兴趣的多核苷酸的子代植物。
实例
以下实例进一步说明本公开，其中份和百分数是以重量计，度是指摄氏度，除非另有规定。应理解，这些实例虽然说明本公开的各实施例，但仅以举例说明的方式给出。根据以上讨论和这些实例，本领域技术人员可确定本公开的必要特征，并且在不脱离本公开的实质和范围的情况下，可对本公开作出各种变化和修改以使其适合于各种应用和条件。此类修改形式也旨在落入所附实施例的范围内。
实例1
用于对玉米植物基因组修饰的双链引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的玉米优 化表达盒
在该实例中，将Cas9内切核酸酶和成熟的经完全加工的天然CRISPR-RNA(crRNA)以及如以下文献所述属于II型适应性病毒免疫系统的来自酿脓链球菌的反式激活CRISPRRNA(tracrRNA)的表达盒进行玉米优化以检测其在玉米中作为基因组工程工具的用途：Deltcheva等人(2011)Nature 471：602-7和Jinek等人(2012)Science 337：816-21。
如图1A所示，在该实例中完全由RNA核苷酸构成的cr核苷酸和tracr核苷酸分子形成由称为“可变靶向”(VT)结构域的第一核苷酸序列结构域和称为“Cas内切核酸酶识别”(CER)结构域的第二核苷酸序列结构域构成的双链体。crRNA和tracrRNA多核苷酸双链体的CER结构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子(位于cr核苷酸和tracr核苷酸上的VT结构域的核苷酸序列3’)(图1A)。VT结构域有助于促进DNA靶位点识别，而CER结构域通过Cas9蛋白质促进识别。连同所需的原间隔序列相邻基元(PAM)序列，crRNA/tracrRNA多核苷酸双链体的两个结构域用于引导Cas内切核酸酶DNA靶位点裂解并且将在本文中称为“双链引导多核苷酸”、“双链引导RNA”或“crRNA/tracrRNA双链体”，如2013年8月22日提交的美国临时申请61/868706的实例1所述。
为了测试玉米中的双链引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统，将来自酿脓链球菌M1GAS(SF370)的Cas9基因(SEQ ID NO：1)按本领域所知的标准技术进行玉米密码子优化，并且引入马铃薯ST-LS1内含子(SEQ ID NO：2)以便消除其在大肠杆菌和农杆菌中的表达(图2A)。为了有利于Cas9蛋白质在玉米细胞中的核定位，将猿猴病毒40(SV40)单分体(MAPKKKRKV，SEQ ID NO：3)和根瘤农杆菌双分体VirD2T-DNA边界内切核酸酶(KRPRDRHDGELGGRKRAR，SEQ ID NO：4)核定位信号分别掺入到Cas9开放阅读框的氨基末端和羧基末端处(图2A)。将玉米优化Cas9基因通过标准分子生物学技术可操作地连接至玉米组成型启动子或调节型启动子。玉米优化的Cas9表达盒(SEQ ID NO：5)的例子示于图2A中，该表达盒包含玉米优化的Cas9基因、以及ST-LS1内含子、SV40氨基末端核定位信号(NLS)和VirD2羧基末端NLS，该表达盒由植物泛素启动子驱动。
为了赋予玉米细胞高效的crRNA和tracrRNA表达以使得crRNA/tracrRNA多核苷酸双链体可引导Cas9蛋白质裂解体内DNA靶位点，使用标准分子生物学技术将位于8号染色体上的玉米U6聚合酶III启动子(SEQ ID NO：6)和玉米U6聚合酶III终止子(TTTTTTTT)分离并且将二者分别作为5’端融合体和3’端融合体有效融合到crRNA和tracrRNA DNA编码序列两者，从而生成如图2B和图2C所示的表达盒。所得玉米优化的crRNA和tracrRNA表达盒的序列可见于SEQ ID NO：8(crRNA表达盒，其中VT结构域靶向LIGCas-3靶位点(表1))和SEQ IDNO：9(tracrRNA表达盒)。
如图3A所示，crRNA分子需要与DNA靶标互补的区域(VT结构域)，其长度为大约12-30个核苷酸并且在用于靶位点识别和裂解的PAM序列的上游(Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science 337：816-21，Mali等人(2013)Science 339：823-26，以及Cong等人(2013)Science 339：819-23)。为了有利于将玉米基因组DNA靶序列快速引入到crRNA表达构建体中，将两个IIS型BbsI限制性内切核酸酶靶位点以反向串联取向引入，其中裂解以向外方向取向，如Cong等人(2013)Science339：819-23所述。在裂解时，IIS型限制性内切核酸酶将其靶位点从crRNA表达质粒切除，生成突出端，以便允许将包含所需玉米基因组DNA靶位点的双链寡核苷酸框内定向克隆到VT结构域中。在示出的实例中，仅将开始于G核苷酸的靶序列用于促进crRNA的聚合酶III的有利表达。
然后Cas内切核酸酶基因以及crRNA和tracrRNA分子两者的表达允许示于图3A中的双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统(也称为crRNA/tracrRNA/Cas内切核酸酶复合物)的形成(SEQ ID NO：10-11)。
实例2
双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统裂解玉米中的染色体DNA并且通过不完整非同 源末端连接引入突变
为了测试实例1中描述的玉米优化的双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统是否可识别、裂解以及通过不精确的非同源末端连接(NHEJ)修复途径突变玉米染色体DNA，对三个不同的基因组靶序列进行裂解(参见表1)并且通过深度测序来检测NHEJ突变的存在。
表1.引入到crRNA表达盒中的玉米基因组靶序列。
LIG＝在无叶舌1基因起始密码子上游的大约600bp处
将玉米优化的Cas9内切核酸酶表达盒、包含与表1中列出的玉米基因组靶序列的反义链互补的特定玉米VT结构域的crRNA表达盒、以及tracrRNA表达盒在BBM和WUS2基因的存在下通过粒子介导的递送(参见实例7)共同递送到60-90Hi-II未成熟玉米胚(参见实例8)。用靶向LIGCas-3基因组靶位点进行裂解的Cas9和长链引导RNA表达盒(如2013年8月22日提交的美国临时专利申请61/868706中所述)转化的Hi-II玉米胚用作阳性对照，而仅用Cas9表达盒转化的胚用作阴性对照。在7天之后，合并来自每个处理的20-30个最均匀转化的胚并且提取总基因组DNA。用高保真PCR扩增预混试剂(New England Biolabs，M0531L)对预期靶位点周围的区域进行PCR扩增，从而添加上扩增子特异性条形码所必需的序列，由此使用“加尾”引物通过两轮PCR进行Illumnia测序。用于一级PCR反应中的引物示于表2中，用于二级PCR反应中的引物为AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACG(正向，SEQ ID NO：21)和CAAGCAGAAGACGGCATA(反向，SEQ ID NO：22)。
表2.PCR引物序列
所得PCR扩增用Qiagen PCR纯化离心柱进行纯化，采用基于Hoechst染料的荧光测定法，以等摩尔比结合测量浓度，并且在Illumina的MiSeq个人测序仪上用PhiX对照v3(Illumina，FC-110-3001)的30-40％(v/v)加标(用于抵消序列偏差)来进行100核苷酸长度的深度单端(single read)测序。只有在以预期的裂解位点为中心的10核苷酸窗内出现的核苷酸插入与缺失(indel)≥1，并且不以类似的水平存在于阴性对照中的那些读段(read)才被归类为NHEJ突变。对具有相同突变的NHEJ突变读段计数并将其折合成单个读段，并且前10个最普遍的突变经目视确认为出现在预期的裂解位点内。然后使用经目视确认的NHEJ突变的总数，基于包含与条形码和正向引物的完全匹配的适当长度读段的总数来计算突变读段的百分比(％)。
将靶向三个LIGCas靶标(SEQ ID NO：12-14)的双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统与靶向相同基因座的单个长链引导RNA/Cas内切核酸酶系统相比，通过深度测序恢复的NHEJ突变的频率示于表3中。基于双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统恢复的前十个最普遍类型的NHEJ突变示于图4A(对应于SEQ ID NO：24-33，其中SEQ ID NO：23为包含LIGCas-1靶位点的参考玉米序列)、图4B(对应于SEQ ID NO：34-43，其中SEQ ID NO：23为包含LIGCas-2靶位点的参考玉米序列)和图4C(对应于SEQ ID NO：45-54，其中SEQ ID NO：44为包含LIGCas-3靶位点的参考玉米序列)中。
综合上述内容的数据表明，本文所述的玉米优化的双链引导RNA/Cas内切核酸酶系统裂解玉米染色体DNA并且生成不完整NHEJ突变。
表3.与长链引导RNA/Cas内切核酸酶系统相比在由双链引导RNA/Cas内切核酸酶 系统在玉米无叶舌1靶基因座处产生的突变读段的百分比(％)
实例3
脱氧核糖核酸(DNA)可用于引导Cas9蛋白质裂解玉米染色体DNA并且通过不完整 非同源末端连接引入突变
如之前在以下文献中所述：Gasiunas等人(2012)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 109：E2579-86，Jinek等人(2012)Science 337：816-21，Mali等人(2013)Science 339：823-26，以及Cong等人(2013)Science 339：819-23，核糖核酸或RNA已成为被描述为引导Cas9内切核酸酶识别和裂解特定DNA靶位点的仅有分子。在该实例中，我们提供了以下证据：一类新的分子即脱氧核糖核酸(DNA)也可用于引导Cas内切核酸酶识别和裂解染色体DNA靶位点，从而可恢复不完整NHEJ突变。
在该实例中，我们使用包含称为“可变靶向”(VT)结构域的第一核苷酸序列结构域以及称为“Cas内切核酸酶识别”(CER)结构域的第二核苷酸序列结构域的双链引导多核苷酸，其中可变靶向结构域为脱氧核糖核酸(DNA)的连续片段。双链引导多核苷酸的CER结构域包含两个单独的分子、一个DNA分子，该DNA分子连接到cr核苷酸分子的VT结构域(图1B)并且沿着互补区域与由核糖核酸(RNA)核苷酸(称为tracrRNA)的连续片段组成的第二分子(tracr核苷酸，图1A)杂交。在该实例中，双链引导多核苷酸的cr核苷酸(图1A)单独地由DNA核苷酸组成并且在本文中称为crDNA。
将包含靶向LIGCas-3靶位点的VT结构域的crDNA序列(表1)(SEQ ID No：55)在Integrated DNA Technologies，Inc.用5’磷酸基团合成并且通过PAGE纯化，然后用于测试如图5所示的双链引导crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物是否可识别和裂解玉米染色体DNA靶位点，从而恢复NHEJ突变。
为了确定用于合成crDNA分子的最佳递送浓度，将crDNA以不同浓度(20ng、50ng、100ng、1μg和5μg)连同玉米优化的tracrRNA和Cas9表达盒共同递送到60-90Hi-II未成熟玉米胚，然后测定NHEJ突变的存在，如实例2所述。仅用Cas9和tracrRNA表达盒转化的胚用作阴性对照。如表4所示，用接近50ng的最佳crDNA递送浓度检测NHEJ突变。
为了比较双链引导crDNA-tracrRNA多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物(图5)与双链引导RNA(crRNA-tracrRNA)/Cas内切核酸酶复合物(图3A)的NHEJ突变活性，将包含靶向LIGCas-3靶位点的VT结构域的crRNA(表1)在Bio-Synthesis，Inc.用5’磷酸基团合成并且通过PAGE纯化(SEQ ID NO：10)。然后将50ng的合成crDNA和crRNA二者独立地连同玉米优化的tracrRNA和Cas9DNA表达盒共同递送，并且测定NHEJ突变，如前所述。进行两次转化实验以证实重现性。阴性对照由用50ng的crDNA、Cas9表达盒或50ng的crDNA加tracrRNA表达盒转化的Hi-II玉米胚组成。
如表4和表5所示，与仅使用Cas9的对照、仅使用crDNA的对照、仅使用crDNA加tracrRNA的对照和仅使用tracrRNA加Cas9的对照中不存在NHEJ突变相比，当与tracrRNA和Cas9DNA表达盒一起递送crDNA时，鉴定出由双链引导crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas内切核酸酶系统产生的NHEJ突变。前3个最丰富的crRNA NHEJ突变示于图6A(SEQ ID NO：56、57、58，其中SEQ ID NO：44为LIGCas-3基因座的未修饰参考序列)中，并且前3个最丰富的crDNANHEJ突变示于图6B(SEQ ID NO：59、60、61，其中SEQ ID NO：44为LIGCas-3基因座的未修饰参考序列)中，比较鉴定出的这些NHEJ突变并且示于图6(SEQ ID NO：44、56-61)中。
综合上述内容的数据表明，脱氧核糖核酸(DNA)也可用于引导双链引导crDNA-tracRNA多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物中的Cas内切核酸酶(图4)裂解玉米染色体DNA，产生不精确的NHEJ突变。
表4.在由与tracrRNA和Cas9 DNA表达盒共同递送的瞬时递送的crDNA分子以不同 浓度在玉米无叶舌1靶基因座处产生的突变读段的百分比(％)
递送的crDNA的量 递送的DNA表达盒 读段的总数 突变读段的数目
0 Cas9，tracrRNA 1,046,553 0
20ng Cas9，tracrRNA 926,915 0
50ng Cas9，tracrRNA 1,032,080 18
100ng Cas9，tracrRNA 860,565 8
1μg Cas9，tracrRNA 398,996 0
5μg Cas9，tracrRNA 394,959 0
表5.在由与tracrRNA和Cas9DNA表达盒共同递送的瞬时递送的crDNA或crRNA分子 在玉米无叶舌1靶基因座处产生的突变读段的百分比(％)的比较
实例4
修饰引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分以提高裂解活性和特异性。
在该实例中，描述了通过修饰引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的引导核酸组分的核苷酸碱基、磷酸二酯键键合或分子形貌来提高裂解活性和特异性。
如图1A和图1B所示，引导多核苷酸的核酸组分包含可变靶向(VT)结构域和Cas内切核酸酶识别(CER)结构域。VT结构域负责通过核苷酸-核苷酸直接碱基配对与DNA靶位点相互作用，而CER结构域是正确识别Cas内切核酸酶所需的(图3A和图3B)。引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分的两个结构域连同所需PAM序列用于将DNA靶位点识别与Cas内切核酸酶靶位点裂解相关联(图3A和图3B)。
鉴于VT结构域与DNA靶位点的直接相互作用，VT结构域内的核苷酸碱基修饰可用于改变核苷酸-核苷酸碱基配对关系，从而有利于Cas内切核酸酶靶位点识别。此类修饰可用于加强与互补DNA靶序列的结合亲和力，从而增强引导多核苷酸/Cas内切核酸酶靶位点识别和/或特异性。当引入到引导多核苷酸的VT结构域中时可增强靶位点结合亲和力和/或特异性的核苷酸碱基修饰的非限制性例子列于表6中。这些修饰可单独使用或在VT结构域内结合使用。
表6.用于增强与互补DNA靶序列的核苷酸碱基配对的核苷酸碱基修饰
类似于表6中示出的那些的核苷酸修饰也可在单链或双链引导多核苷酸的CER结构域中形成(图1A和图1B)。这些修饰可用于加强或稳定双链cr核苷酸分子(例如，但不限于crRNA、crDNA、或它们的组合)和tracr核苷酸分子(例如，tracrRNA、tracrDNA、或它们的组合)的CER结构域中分子间的相互作用(图3A)。这些修饰还可帮助重现在由单个分子构成的引导多核苷酸的二级结构中正确识别Cas内切核酸酶所需的cr核苷酸和tracr核苷酸(诸如但不限于crRNA/tracrRNA、crDNA/tracrRNA、crRNA/tracrDNA、crDNA/tracrDNA)结构(图3A和图3B)。
表达或瞬时递送到细胞的核酸经受周转或降解。为了提高体内引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分的有效寿命或稳定性，可引入核苷酸和/或磷酸二酯键修饰以减少不希望的降解。抗核酸酶核苷酸和磷酸二酯键修饰的例子示于表7中并且可引入到引导多核苷酸的VT和/或CER结构域中的任一者中。可在包含VT或CER结构域的任一个核酸残基的5’端和3’端处引入修饰以抑制外切核酸酶裂解活性，可在包含VT或CER结构域的核酸序列中间引入修饰以降低内切核酸酶裂解活性，或可在包含VT或CER结构域的整个核酸序列中引入修饰以提供对外切核酸酶和内切核酸酶的保护。
表7.用于减少不希望的核酸酶降解的核苷酸碱基和磷酸二酯键修饰。
为了提供对细胞中周转和降解的抗性，引导多核苷酸的核酸组分还可被环化，其中5’端和3’端共价连接在一起。环状RNA可具有比线性RNA更强的对核酸酶降解的抗性并且可在相应线性转录之后在细胞中存留很长时间(Jeck等人(2013)RNA 19：141-157)。
还可引入对引导多核苷酸核酸组分中任一者的修饰以提高其细胞渗透性或递送到细胞中的能力。此类修饰将包括但不限于键合到胆固醇、聚乙二醇和间隔区18(六乙二醇链)。
许多上述经修饰的引导多核苷酸可被合成并且通过基因枪粒子介导的转化、转染或电穿孔瞬时递送。形成能够结合和/或裂解染色体DNA靶位点的功能性复合物所需的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的剩余组分可作为DNA表达盒、RNA、mRNA(5′加帽和聚腺苷酸化)或蛋白质的任意组合共同递送。还可建立如下细胞系或转化体，所述细胞系或转化体稳定表达形成功能性引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物所需的全部组分(其中的一种或两种组分除外)，使得在瞬时递送上述经修饰的引导核酸时，可形成功能性引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物。上述经修饰的引导多核苷酸还可多路同时递送，以靶向用于裂解或产生切口的多个染色体DNA序列。
上述经修饰的引导多核苷酸可用于植物、动物、酵母和细菌中或用于接受利用引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统进行的基因组修饰的任何生物体中，以及用于将不精确NHEJ突变引入到染色体DNA中，切除由转基因或内源DNA中任一者构成的染色体DNA片段，通过用供体DNA修复模板的同源重组修复来编辑天然或转基因的基因的密码子构成，通过用供体DNA修复模板的同源重组修复来位点特异性插入转基因或内源DNA序列。
实例5
检测玉米中引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的引导多核苷酸组分的核苷酸碱 基和磷酸二酯键修饰的效应
在该实例中，将实例4中所述的核苷酸碱基和磷酸二酯键修饰中的一些引入到cr核苷酸的VT结构域和/或CER结构域中，并且将讨论用于评价这些修饰对双链引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统裂解玉米染色体DNA的能力的影响。
如表8中所示，将核苷酸碱基和磷酸二酯键修饰单独地或以组合形式引入到靶向LIGCas-3位点(参见表1)进行裂解的双链引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的cr核苷酸(crRNA或crDNA)组分的VT结构域和CER结构域中。虽然在此处检测了多个不同组合形式的核苷酸碱基和磷酸二酯键修饰，但可预期还有其他可能的组合。
引入形成于VT结构域中的锁核酸(+)、5-甲基dC(iMe-dC)和2，6-二氨基嘌呤(i6diPr)核苷酸碱基修饰以提高与互补DNA靶序列的结合亲和力，并且就锁核酸修饰而言还提高对体内核酸酶的抗性。在crRNA或crDNA序列的5’端和3’端处或在整个crRNA或crDNA序列中引入在VT和CER结构域二者中设计的所有其他修饰，以降低体内核酸酶的效应，并且延长crRNA或crDNA组分的有效寿命。
为了检测表8中所述的经修饰crRNA或crDNA组分对其相关联的经修饰引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物识别和裂解LIGCas-3位点(参见表1)的能力的效应，将经修饰的crRNA和crDNA分子与tracrRNA和Cas9表达盒共同递送到HiII未成熟玉米胚，如实例3中所述。与tracrRNA和Cas9表达盒共同递送的未修饰crRNA或crDNA分子用作比较物。阴性对照由仅用相应经修饰的crRNA或crDNA或Cas9表达盒转化的未成熟玉米胚组成。如实例2中所述测定的不完整NHEJ突变的频率用于评价相对于进行比较的未修饰crRNA或crDNA实验，每个crRNA或crDNA修饰对Cas内切核酸酶裂解活性的效应。
表8.crRNA和crDNA核苷酸碱基和磷酸二酯键修饰。
1：核苷酸之前的“+”表示锁核酸碱基修饰，核苷酸之后的“*”表示硫代磷酸酯键主链修饰，核苷酸之前的“m”表示2’-0-甲基RNA碱基修饰，“iMe-dC”表示5-甲基dC碱基修饰，并且“i6diPr”表示2，6-二氨基嘌呤碱基修饰
实例6
用于检测酵母中引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统核酸组分的修饰的效应的方 法
在该实例中，酵母筛选方法被设计为鉴定对引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分的导致裂解活性增强的最佳修饰。
A.ADE：URA3：DE2酵母筛选菌株
为了鉴定对实例4中概述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分的最佳修饰或其组合，培育出用于仔细监测引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的裂解活性的酿酒酵母菌株。这通过将酵母菌株BY4247的15号染色体上的天然ADE2基因替换为由酵母URA3基因破坏的非功能性的部分重复ADE2基因(ADE：URA3：DE2)而实现，如图7所示。然后针对插入的URA3基因设计与适当PAM序列相邻的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶靶位点，使得在裂解时，包含305bp重叠序列的被破坏的ADE2基因可通过分子内同源重组途径而被修复，从而去掉URA3基因并获得功能性ADE2基因，如图8所示。然后可将包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基或缺乏腺嘌呤的培养基用于选择其中已发生裂解的细胞。然后可将选择之后酵母细胞的恢复频率用于在检测对引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分的不同修饰时定量引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的裂解效率。
还可对包含由于裂解和修复ADE：URA3：DE2基因座而产生的功能性ADE2基因的酵母细胞进行有关裂解活性的目测表型筛选。在不存在5-FOA或缺乏腺嘌呤的选择的情况下，功能性ADE2基因产物产生白色表型，而非功能性产物产生红色表型(Ugolini等人(1996)Curr.Genet.30：485-492)。为了能够观察到白色或红色表型，可将单独酵母细胞转化体接种在固体培养基上并且使其生长成足够大以供目视检查的菌落。白色到红色扇形菌落的量提供了关于裂解活性的量的指示。由于扇形菌落表型是定性度量，因此可实施0-4数值评分系统。如图9所示，0分表示未观察到白色扇形菌落(无靶位点裂解)；4分表示完全白色菌落(识别位点的完全切割)；1-3分表示中间白色扇形菌落表型(以及中等程度的靶位点裂解)。
B.引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的Cas9组分
为了稳定地表达用于与实例4中所述的瞬时递送的经修饰核酸组分配对的Cas内切核酸酶，可将来自酿脓链球菌M1 GAS(SF370)的Cas9基因按本领域中已知的标准技术进行酿酒酵母密码子优化(SEQ ID NO：88)，并且可将SV40(猿猴病毒40)核定位信号(SRADPKKKRKV，SEQ ID NO：7)掺入到羧基末端处以有利于核定位。然后将所得Cas9开放阅读框有效融合到酵母诱导型GAL1启动子和CYC1终止子。然后将所得Cas9表达盒置于包含LEU2选择性标记的CEN6自主复制酵母载体中。
为了能够测试实例4中所述的Cas9组分和经修饰核酸组分的瞬时递送，还可将Cas9基因作为mRNA递送。为了生成酿酒酵母优化的Cas9mRNA，可使用PCR扩增酿酒酵母优化的Cas9开放阅读框以及在所需T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID NO：89)上加尾(刚好在翻译ATG起始位点的5’端)的相关联核定位信号。然后可将包含T7启动子的所得线性模板用于在进行或未进行体外多腺苷酸化的情况下转录未加帽或加帽的Cas9 mRNA。
Cas9组分还可作为蛋白质瞬时递送并且与经修饰的核酸组分配对。具有相关联的羧基末端核定位信号的Cas9蛋白质可按照类似于以下文献所述的标准技术或通过其他方法表达和纯化：Fonfara等人(2013)Nucl.Acids Res.doi：10.1093/nar/gkt1074。
C.引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的核酸组分
将瞬时递送的经修饰crRNA或tracrRNA组分与相应稳定表达的未修饰crRNA或tracrRNA配对可为有利的。为了促进酵母中crRNA和tracrRNA的稳定表达，可生成酿酒酵母优化的crRNA和tracrRNA表达盒。酵母RNA聚合酶III SNR52启动子和SUP4终止子可以有效融合到DNA片段的端部，所述DNA片段编码通过酿脓链球菌Cas9蛋白质进行的识别所需的适当crRNA和tracrRNA序列。所有crRNA表达盒将包含VT结构域中的ADE：URA3：DE2靶序列(GCAGACATTACGAATGCACA，SEQ ID NO：90)并且靶向ADE：URA3：DE2基因座进行裂解。然后将所得表达盒置于包含HIS3选择性标记的CEN6自主复制酵母载体中。
为了递送未修饰的crRNA、tracrRNA或引导RNA，可使用PCR扩增在所需T7启动子序列(TAATACGACTCACTATAGGG，SEQ ID NO：89)上加尾(刚好在转录起始位点的5′端)的相应crRNA、tracrRNA或引导RNA序列。然后可将包含T7启动子的所得线性模板用于转录相应的crRNA、tracrRNA或长链引导RNA。
还将瞬时递送如实例4中概述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的经修饰核酸组分。可将类似于实例5表8中示出的那些的核苷酸碱基和/或磷酸二酯键修饰单独地或以组合形式引入到引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的crRNA、crDNA、tracrRNA、tracrDNA、长链引导RNA或长链引导DNA核酸组分并且按照标准技术合成。
另外在实例4中讨论的包含能够与Cas内切核酸酶形成功能性复合物的必要VT和CER结构域的环状RNA可在体外生成，如Diegleman等人(1998)Nucl.Acids Res.26：3235-3241所述，并且瞬时递送到酵母细胞。
D.将引导多核苷酸/Cas内切核酸酶组分转化到ADE：URA3：DE2酵母菌株中
可使用标准乙酸锂、聚乙二醇(PEG)、电穿孔或基因枪转化方法将引导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组分递送到ADE：URA3：DE2酵母细胞并且监测其裂解ADE：URA3：DE2靶标的能力。实例6的B节和C节中讨论的酵母优化的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶组分可作为低拷贝自主复制质粒DNA载体上的表达盒、作为非复制瞬时分子(诸如mRNA、蛋白质、RNA或经修饰的引导核酸)或以质粒DNA载体表达盒和瞬时分子的任意组合递送。
实例7
玉米不成熟胚的转化
可通过各种已知在植物中有效的方法来完成转化，包括粒子介导的递送、农杆菌介导的转化、PEG介导的递送和电穿孔。
a.粒子介导的递送
如下使用粒子递送进行玉米不成熟胚的转化。培养基配方见下文。
将穗去壳并在30％Clorox漂白剂加0.5％Micro洗涤剂中表面灭菌20分钟，然后用无菌水漂洗两次。将不成熟胚分离，并以胚轴一侧朝下(盾片一侧朝上)放置，每板25个胚，在560Y培养基上放置4小时，然后在2.5cm靶区内排成一行准备进行轰击。另选地，将分离的胚放在560L(起始培养基)上，并在暗处在26℃至37℃温度下放置8-24小时，然后在560Y上26℃下放置4小时后如上所述进行轰击。
使用标准分子生物学技术构建包含双链断裂诱导剂和供体DNA的质粒并且与包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252 A1)和Wushel(US2011/0167516)的质粒共轰击。
使用水溶性阳离子脂质转染试剂按如下方式将感兴趣的质粒和DNA沉淀到0.6μm(平均直径)金丸上。使用1μg的质粒DNA以及任选地使用用于共轰击的其他构建体在冰上制备DNA溶液，所述其他构建体诸如50ng(0.5μl)的包含发育基因ODP2(AP2结构域转录因子ODP2(胚珠发育蛋白2)；US20090328252 A1)和Wushel的每个质粒。为了得到预混的DNA，将20μl的制备的金粒子(15mg/ml)和5μl的水溶性阳离子脂质转染试剂添加在水中并且仔细混合。将金粒子在微量离心机中以10,000rpm离心1分钟并且移除上清液。用100ml的100％EtOH在不使小丸重悬的情况下仔细清洗所得小丸，然后小心移除EtOH洗液。添加105μl的100％EtOH并且通过短暂超声处理使粒子重悬。然后，将10μl点滴到每个巨载体的中央上，让其干燥约2分钟后进行轰击。
另选地，使用氯化钙(CaCl2)沉淀程序，通过混合100μl在水中制备的钨粒子、10μl(1μg)DNA/Tris EDTA缓冲液(1μg总DNA)、100μl2.5M CaCl2、10μl 0.1M亚精胺，将感兴趣的质粒和DNA沉淀到1.1μm(平均直径)钨丸上。每种试剂依序加到钨粒子悬浮液，同时进行混合。将最终的混合物进行短暂超声处理，并且让其在恒定漩涡混合下温育10分钟。在沉淀期间，将管短暂离心，移除液体，将粒子用500ml 100％乙醇洗涤，然后进行30秒离心。再次移除液体，将105μL 100％乙醇加至最终的钨粒子小丸。对于粒子枪轰击，将钨/DNA粒子进行短暂超声处理。将10μl的钨/DNA粒子点滴到每个巨载体(macrocarrier)的中央上，然后让点滴的粒子干燥约2分钟再进行轰击。
用Biorad氦枪以水平#4对样品板进行轰击。所有样品接受450PSI的单次射击，每管的制备粒子/DNA共取十个等分试样。
在轰击后，将胚在560P(维持培养基)上在26℃至37℃的温度下温育12-48小时，然后置于26℃下。在5-7天后，将胚转移到含有3mg/L双丙氨膦的560R选择培养基，每隔2个星期在26℃下进行传代培养。在进行大约10个星期的选择后，将抗选择的愈伤组织克隆转移到288J培养基以引发植物再生。在体细胞胚成熟后(2-4个星期)，将发育良好的体细胞胚转移到培养基中进行发芽并转移到有光照的培养室。大约7-10天后，将发育的小植株转移到管中的272V无激素培养基7-10天，直到小植株完全长好。然后将植物转移到含有盆栽土的浅箱嵌块(inserts in flats)(相当于2.5英寸盆)，在生长室中生长1个星期，随后在温室中另外生长1-2个星期，然后转移到Classic 600盆(1.6加仑)并生长至成熟。对植物进行监测并进行转化效率的打分和/或进行再生能力的修饰的打分。
起始培养基(560L)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、20.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l Gelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
维持培养基(560P)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l 2，4-D和0.69g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite(在用去离子水定容后加入)和0.85mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；2.0g/l Gelrite(在用去离子水定容后加入)和8.5mg/l硝酸银(在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基础盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson维生素混合物(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺、30.0g/l蔗糖和2.0mg/l 2，4-D(用KOH调至pH 5.8后用去离子水定容)；3.0g/l Gelrite(在用去离子水定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l双丙氨膦(两者均在将培养基灭菌并冷却到室温后加入)。
植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)(Murashige和Skoog，(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l的0.1mM脱落酸(在调至pH 5.6后用精制去离子水定容)；3.0g/lGelrite(在用去离子水定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l双丙氨膦(在将培养基灭菌并冷却到60℃后加入)。
无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素母液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆辛和0.40g/l甘氨酸，用精制去离子水定容)、0.1g/l肌醇和40.0g/l蔗糖(在调至pH 5.6后用精制去离子水定容)和6g/l细菌培养用琼脂(在用精制去离子水定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。
b.农杆菌介导的转化
农杆菌介导的转化基本上如Djukanovic等人(2006)Plant Biotech J 4：345-57中所述进行。简单地讲，从经灭菌的种仁切下10-12日龄的不成熟胚(尺寸0.8-2.5mm)并放入液体培养基(4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson维生素混合物(SigmaE-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺、1.5mg/l 2，4-D、0.690g/l L-脯氨酸、68.5g/l蔗糖、36.0g/l葡萄糖、pH5.2)中。在收集胚后，用1ml浓度为0.35-0.45OD550的农杆菌更换培养基。将玉米胚与农杆菌在室温下温育5分钟，然后将该混合物倒到培养基板上，该培养基板含有4.0g/lN6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson维生素混合物(Sigma E-1511)、1.0mg/l盐酸硫胺、1.5mg/l 2，4-D、0.690g/l L-脯氨酸、30.0g/l蔗糖、0.85mg/l硝酸银、0.1nM乙酰丁香酮和3.0g/l Gelrite，pH 5.8。将胚以胚轴朝下在暗处20℃下温育3天，然后在暗处28℃下温育4天，然后转移到新的培养基板上，该培养基板含有4.0g/l N6基础盐(Sigma C-1416)、1.0ml/L Eriksson复合维生素(Sigma E-1511)、1.0mg/L盐酸硫胺、1.5mg/L 2，4-D、0.69g/L L-脯氨酸、30.0g/L蔗糖、0.5g/L MES缓冲液、0.85mg/L硝酸银、3.0mg/L双丙氨膦、100mg/L羧苄西林和6.0g/L琼脂，pH 5.8。将胚每隔三个星期进行传代培养，直到鉴定到转基因事件。通过将小量的组织转移到再生培养基(4.3g/L MS盐(Gibco 11117)、5.0ml/L MS维生素母液、100mg/L肌醇、0.1μM ABA、1mg/L IAA、0.5mg/L玉米素、60.0g/L蔗糖、1.5mg/L双丙氨膦、100mg/L羧苄西林、3.0g/L Gelrite、pH 5.6)并且在暗处在28℃下温育两个星期来诱导体细胞胚胎发生。将具有可见苗和根的所有材料转移到含有4.3g/L MS盐(Gibco 11117)、5.0ml/L MS维生素母液、100mg/L肌醇、40.0g/L蔗糖、1.5g/L Gelrite，pH为5.6的培养基上，并且在人造光下28℃温育。一星期之后，将小植株移到含有相同培养基的玻璃管中并且生长直到将其取样以及/或者移植到土壤中。
实例8
BBM的瞬时表达能增强转化
可对转化方案的参数进行修改以确保BBM活性是瞬时的。一个这种方法涉及例如使用化学品PEL将含BBM的质粒进行沉淀，使得可以进行转录和表达，但又排除随后DNA释放。在一个例子中，将BBM质粒用PEI沉淀到金粒子上，同时将待整合的转基因表达盒(UBI：：moPAT～GFPm：：PinII；moPAT为玉米优化的PAT基因)使用标准氯化钙方法沉淀到金粒子上。
简单地讲，如下用PEI包覆金粒子。首先，洗涤金粒子。称取35mg平均直径为1.0的金粒子(A.S.I.#162-0010)到微量离心管中，加入1.2ml无水乙醇并漩涡混合一分钟。将管在室温下温育15分钟，然后使用微量离心机在4℃下高速离心15分钟。弃去上清液，加入新鲜的1.2ml乙醇等分试样，漩涡混合一分钟，离心一分钟，再次弃去上清液(重复这一操作两次)。加入新鲜的1.2ml乙醇等分试样，将此悬浮液(金粒子在乙醇中)在-20℃下保存数星期。为了用聚乙基亚胺(PEI；Sigma#P3143)涂覆粒子，将250μl的经洗涤的金粒子/乙醇混合物离心，然后弃去乙醇。将粒子在100μl双蒸水中洗涤一次以除去残余乙醇，加入250μl的0.25mM PEI，接着进行脉冲超声处理以使粒子悬浮，然后将管投入干冰/乙醇浴中以将悬浮液快速冷冻，然后将悬浮液冷冻干燥过夜。此时，干燥的涂覆粒子可在-80℃下保存至少3个星期。在使用前，将粒子用2.5mM HEPES缓冲液(pH 7.1)的250μl等分试样漂洗3次，进行1次脉冲超声处理，然后每次离心前进行快速漩涡混合。然后将粒子悬浮于最终体积250μlHEPES缓冲液中。将25μl粒子等分试样加到新鲜管中，以便随后连接DNA。为连接未包覆的DNA，将粒子进行脉冲超声处理，然后加入1μg的DNA(在5μl水中)，接着用Pipetteman上下吹吸几次进行混合，然后温育10分钟。将粒子短暂离心(即，10秒)，移除上清液，并且添加60μl乙醇。将具有PEI沉淀的DNA-1的粒子在60μl乙醇中洗涤两次。将粒子离心，弃去上清液，然后将粒子重新悬浮于45μl水中。为连接第二DNA(DNA-2)，利用水溶性阳离子脂质转染试剂进行沉淀。将45μl的粒子/DNA-1悬浮液稍作超声处理，然后加入5μl的100ng/μl DNA-2和2.5μl的水溶性阳离子脂质转染试剂。将溶液置于旋转摇荡器上10分钟，在10,000g下离心1分钟。去除上清液，将粒子重新悬浮于60μl的乙醇中。将溶液点滴到巨载体上，使用用于PDS-1000的标准方案将其上依序连接了DNA-1和DNA-2的金粒子递送到10DAP Hi-II不成熟胚的小盾片细胞中。对于这个实验，DNA-1质粒含有UBI：：RFP：：pinII表达盒，DNA-2含有UBI：：CFP：：pinII表达盒。轰击后两天，观察到CFP和RFP荧光标记都有瞬时表达，因为在未成熟胚表面上有许多红色和蓝色细胞。然后将胚放在非选择性培养基上，让其生长3个星期后对稳定集落进行打分。在这个3星期期间后，观察到10个多细胞的稳定表达的蓝色集落，相比之下只有一个红色集落。这证明PEI沉淀可用来有效引入DNA进行瞬时表达，同时大大减少PEI引入的DNA的整合，从而减少表达RFP的转基因事件的恢复。这样，PEI沉淀可用来递送BBM和/或WUS2的瞬时表达。
例如，首先使用PEI使粒子包覆上UBI：：BBM：：pinII，接着使用水溶性阳离子脂质转染试剂包覆上UBI：：moPAT～YFP，然后轰击到不成熟胚的表面上的小盾片细胞中。PEI介导的沉淀导致在未成熟胚表面上瞬时表达细胞的高频率以及恢复稳定转化体的极低频率。因此，预期PEI沉淀的BBM盒瞬时表达并且刺激组织的轰击表面(即，小盾片表面)上的胚发生生长的突发，但该质粒将不会整合。从Ca++/金粒子释放的PAT～GFP质粒预期会发生整合并以会导致转基因事件的实质上改进的恢复的频率表达选择性标记。作为对照处理，将含有UBI：：GUS：：pinII(代替BBM)的PEI沉淀的粒子与PAT～GFP/Ca++粒子混合。将来自两个处理的不成熟胚移到含有3mg/l双丙氨膦的培养基上。6-8个星期后，预期在PEI/BBM处理中观察到的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织的频率要比对照处理(PEI/GUS)高得多。
作为一个可供选择的方法，用PEI将BBM质粒沉淀到金粒子上，然后引入到不成熟胚的表面上的小盾片细胞中，随后BBM基因的瞬时表达引发胚发生生长的快速增殖。在这个诱导的生长期间，使用用于玉米的标准方法(参见实例1)，用农杆菌处理外植体，T-DNA递送到细胞中，引入转基因表达盒如UBI：：moPAT～GFPm：：pinII。在进行了共培养后，让外植体在正常生长培养基上恢复，然后移到含有3mg/l双丙氨膦的培养基上。6-8个星期后，预期在PEI/BBM处理中观察到的GFP+、双丙氨膦抗性愈伤组织的频率要比对照处理(PEI/GUS)高得多。
通过瞬时表达BBM和/或WUS2多核苷酸产物来“启动”愈伤组织生长可能是合宜的。这可通过递送BBM和WUS25′加帽的聚腺苷酸化RNA、含有BBM和WUS2DNA的表达盒或BBM和/或WUS2蛋白来完成。所有这些分子可用生物射弹粒子枪来递送。例如，5′加帽的聚腺苷酸化BBM和/或WUS2 RNA可容易地使用Ambion公司的mMessage mMachine试剂盒在体外制备。将RNA与含有感兴趣的多核苷酸和用于选择/筛选的标记如Ubi：：moPAT～GFPm：：PinII的DNA一起进行共递送。预期接受了RNA的细胞将立即开始更快速地分裂，并且这些细胞中有很大一部分将整合了该农艺基因。这些事件可进一步被确认为转基因克隆集落，因为它们也将表达PAT～GFP融合蛋白(从而将在适当的照明下显示绿色荧光)。然后可对从这些胚再生的植物筛选感兴趣的多核苷酸的存在。

Claims (43)

1.一种引导多核苷酸，所述引导多核苷酸包含：
(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；和
(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，
其中所述第一核苷酸序列结构域和所述第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
2.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列结构域和所述第二核苷酸序列结构域位于单个分子上。
3.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第二核苷酸序列结构域包含能够沿着互补区域杂交的两个单独分子。
4.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列结构域为DNA序列，并且所述第二核苷酸序列结构域选自DNA序列、RNA序列、以及它们的组合。
5.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列结构域和所述第二核苷酸序列结构域为DNA序列。
6.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列结构域和/或所述第二核苷酸序列结构域包含至少一种修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使所述引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、以及它们的任何组合。
7.根据权利要求1所述的引导多核苷酸，其中所述第一核苷酸序列结构域和/或所述第二核苷酸序列结构域包含至少一种提供另外的有益特征的修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使所述引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、以及它们的任何组合。
8.根据权利要求7所述的引导多核苷酸，其中所述另外的有益特征选自改变的或调节的稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、改变的互补靶序列结合亲和力、改变的细胞降解抗性、和提高的细胞渗透性。
9.一种包含权利要求1所述的引导多核苷酸的植物或种子。
10.一种引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述引导多核苷酸包含：
(i)与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域；和
(ii)与Cas内切核酸酶相互作用的第二核苷酸序列结构域，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
11.根据权利要求10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述引导多核苷酸的所述第一核苷酸序列结构域和所述第二核苷酸序列结构域由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、或它们的组合构成，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
12.根据权利要求10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述引导多核苷酸的所述第一核苷酸序列结构域和/或所述第二核苷酸序列结构域包含至少一种提供另外的有益特征的修饰，其中所述至少一种修饰选自5′帽、3′多腺苷酸化尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsRNA双链体的序列、使所述引导多核苷酸靶向到亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(LNA)、5-甲基dC核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2’-氟A核苷酸、2’-氟U核苷酸、2′-O-甲基RNA核苷酸、硫代磷酸酯键(键合到胆固醇分子、键合到聚乙二醇分子、键合到间隔区18分子)、5’至3’共价键、以及它们的任何组合。
13.根据权利要求10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物，其中所述Cas内切核酸酶为Cas9内切核酸酶。
14.一种包含权利要求10所述的引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物的植物或种子。
15.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向具有Cas内切核酸酶的细胞提供引导多核苷酸，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
16.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，所述方法包括向细胞提供引导多核苷酸和Cas内切核酸酶，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括向所述细胞提供供体DNA，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸。
18.根据权利要求16中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定至少一个在所述靶标处具有修饰的细胞，其中在所述靶位点处的修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
19.一种用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，
所述方法包括：
a)向细胞提供引导多核苷酸、供体DNA和Cas内切核酸酶，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；
b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，所述细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述供体DNA和Cas内切核酸酶使用至少一个能够表达所述供体DNA和/或所述Cas内切核酸酶的重组DNA构建体引入到所述细胞中。
21.根据权利要求16所述的方法，其中所述引导多核苷酸通过粒子轰击直接提供。
22.根据权利要求16所述的方法，其中所述引导多核苷酸通过粒子轰击或包含U6聚合酶III启动子的重组DNA构建体的农杆菌(Agrobacterium)转化来提供。
23.根据权利要求16所述的方法，其中所述引导多核苷酸为包含可变靶向结构域和cas内切核酸酶识别结构域的单链引导多核苷酸。
24.根据权利要求16所述的方法，其中所述引导多核苷酸为包含cr核苷酸分子和tracr核苷酸分子的双链引导多核苷酸。
25.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，所述方法包括：
a)向细胞提供cr核苷酸、能够表达tracrRNA的第一重组DNA构建体、和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA，其中所述cr核苷酸为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的组合，其中所述cr核苷酸、所述tracrRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及
b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
26.一种用于修饰细胞基因组中的靶位点的方法，所述方法包括：
a)向细胞提供tracr核苷酸、能够表达crRNA的第一重组DNA构建体、和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA，其中所述tracr核苷酸被选为脱氧核糖核苷酸序列或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸序列的组合，其中所述tracr核苷酸、所述crRNA和所述Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；以及
b)鉴定至少一个在所述靶位点处具有修饰的细胞，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
27.一种用于将感兴趣的多核苷酸引入到细胞基因组的靶位点中的方法，
所述方法包括：
a)向细胞提供能够表达引导多核苷酸的第一重组DNA构建体和能够表达Cas内切核酸酶的第二重组DNA构建体，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸和Cas内切核酸酶能够形成使所述Cas内切核酸酶能够在所述靶位点处引入双链断裂的复合物；
b)使(a)的细胞与包含感兴趣的多核苷酸的供体DNA接触；以及
c)鉴定至少一个来自(b)的细胞，所述细胞在其基因组中包含在所述靶位点处整合的感兴趣的多核苷酸。
28.一种用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列的方法，所述方法包括将引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶引入到细胞中，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas内切核酸酶在所述细胞的基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
29.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞选自非人类动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物细胞选自单子叶植物和双子叶植物细胞。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述植物细胞选自玉米、稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、或柳枝稷、大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、和红花细胞。
32.一种包含引导多核苷酸和Cas9内切核酸酶的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas9内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
33.一种包含重组DNA构建体和引导多核苷酸的植物或种子，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述重组DNA构建体包含可操作地连接至编码植物优化Cas内切核酸酶的核苷酸序列的启动子，其中所述植物优化Cas内切核酸酶和引导多核苷酸能够形成复合物并且在所述植物的基因组靶位点中产生双链断裂。
34.根据权利要求33所述的植物，所述植物还包含整合到所述植物的所述基因组靶位点中的感兴趣的多核苷酸。
35.根据权利要求33所述的植物或种子，所述植物或种子还包含在所述基因组靶位点处的修饰，其中所述修饰选自(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，以及(iv)(i)-(iii)的任何组合。
36.一种包含至少一个改变的靶序列的植物或种子，其中所述至少一个改变的靶序列源自由引导多核苷酸/Cas内切核酸酶复合物识别和裂解的相应靶序列，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的所述靶位点处引入双链断裂，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸。
37.一种包含修饰的核苷酸序列的植物或种子，其中所述修饰的核苷酸序列通过向细胞提供引导多核苷酸、多核苷酸修饰模板和至少一种Cas内切核酸酶而产生，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂，其中所述多核苷酸修饰模板包含所述核苷酸序列的至少一种核苷酸修饰。
38.根据权利要求29所述的植物或植物细胞，其中所述至少一种核苷酸修饰不是在所述靶位点处的修饰。
39.根据权利要求32所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物。
40.根据权利要求39所述的植物，其中所述单子叶植物选自玉米、稻、高粱、黑麦、大麦、小麦、粟、燕麦、甘蔗、草坪草、或柳枝稷。
41.根据权利要求39所述的植物，其中所述双子叶植物选自大豆、卡诺拉、苜蓿、向日葵、棉花、烟草、花生、马铃薯、烟草、拟南芥、或红花。
42.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂；b)获得包含引导多核苷酸的第二植物，所述引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择具有所述靶位点的所需改变的子代植物。
43.一种用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，所述方法包括：a)获得包含至少一种Cas内切核酸酶的第一植物，所述至少一种Cas内切核酸酶能够在所述植物基因组中的靶位点处引入双链断裂；b)获得包含引导多核苷酸和供体DNA的第二植物，其中所述引导多核苷酸不单独包含核糖核酸，其中所述引导多核苷酸能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物，其中所述供体DNA包含感兴趣的多核苷酸；c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评价(c)的子代的靶位点改变；以及e)选择包含在所述靶位点处插入的感兴趣的多核苷酸的子代植物。
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