JP2016537028A - Ｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓシステムの材料及び方法 - Google Patents

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Abstract

本発明は、Ｃａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ及び関連する特定ＰＡＭを利用するＩＩＴｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに関連する。１つの態様において、本開示は、ガイドＲＮＡ、単分子及び二重分子の双方のガイドＲＮＡ、並びにそのガイドＲＮＡ及び／またはそのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ（ベクターを含む）を使用した細胞中で、ＤＮＡを操作する方法を提供する。ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む複合体もまた、提供する。【選択図】図４

Description

本発明は、Ｃａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ及び関連する特定のＰＡＭを利用するｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムに関する。本出願は、２０１３年１１月１８日に出願され、米国仮出願第６１／９０５８３５に係る出願日の利益を主張、その全体を本明細書に参照として援用し、組み入れる。
本出願は、開示の別部分として、コンピューター読み出し可能な配列リスト（ファイル名:４８１２８＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；７，８６９，２５６バイト−ＡＳＣＩＩテキストファイル；作成２０１４年１１月１４日）を含み、その全体を本明細書に参照として援用し、組み入れる。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ−ＣＲＩＳＰＲ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の免疫原理を標的化した、ＲＮＡにガイドされたＤＮＡを利用する遺伝子編集が、過去数か月にわたり広く利用されている（１−１３）。細菌ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにより与えられる主要な利点は、設定可能なＤＮＡ干渉に対する要件（エンドヌクレアーゼ、Ｃａｓ９、カスタマイズ可能な二重分子ＲＮＡ構造）について最小限であるという点である（１４）。化膿レンサ球菌の元来の第ＩＩ種システムで主として実証された、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）（１５、１６）は、Ｃａｓ９の存在下でのＲＮａｓｅＩＩＩによるＲＮＡ共成熟（１５−１７）、及びＣａｓ９による侵入ＤＮＡの開裂（１４、１５、１７−１９）の両方に不可欠である二重分子ＲＮＡ（１４−１７）を形成する前駆体ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ）の不変リピート部に結合する。レンサ球菌で実証されたように、成熟した活性ｔｒａｃｒＲＮＡ及び標的化ｃｒＲＮＡ（１４−１６）間に形成された二本鎖によりガイドされるＣａｓ９は、侵入してくる同種ＤＮＡにおいて、部位特異定的な二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断を導く（１４、１７−１９）。Ｃａｓ９は、標的鎖（ｃｒＲＮＡのスペーサー配列に対して相補的であるとして定義される）を開裂するＨＮＨヌクレアーゼドメイン及び非標的鎖を開裂するＲｕｖＣ様ドメイン（１４、２２，２３）を使用するマルチドメイン酵素であり（１４、２０、２１）、選択的モチーフの不活性化によりｄｓＤＮＡ開裂Ｃａｓ９のニッカーゼへの変換を可能にする（２、８、１４、２４、２５）。ＤＮＡ開裂の特異性は、２つのパラメーター、すなわち、変動的であり、プロトスペーサーを標的化するｃｒＲＮＡのスペーサー由来配列（プロトスペーサーは、ｃｒＲＮＡのスペーサーに対して相補的である、当該ＤＮＡ標的上の配列として定義される）、及びショート配列である、その非標的ＤＮＡ鎖上のプロトスペーサーのすぐ下流に位置するＰＡＭ（ｔｈｅ Ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ Ａｄｊａｃｅｎｔ Ｍｏｔｉｆ）により決定される（１４、１８、２３、２６−２８）。
最近の研究により、ＲＮＡにガイドされるＣａｓ９は、ヒト細胞（１、２、８、１１）、マウス（９、１０）、ゼブラフィッシュ（６）、ショウジョウバエ（５）、ワーム（４）、植物（１２、１３）、酵母（３）及び細菌（７）における効率的なゲノム編集ツールとして使用できることが証明された。このシステムは、単純に複数のガイドＲＮＡを使用することで同時にゲノムの複数個所を編集するため、Ｃａｓ９をプログラミングすることにより、汎用的に、多重ゲノムの組換えを可能する（２、７、８、１０）。Ｃｓａ９のニッカーゼへの容易な変換は、変異原活性を減らした哺乳類のゲノムにおいて、相同組換え修復を促進することを示した（２、８、２４、２５）。さらに、Ｃａｓ９の触媒不活性変異体のＤＮＡ結合活性が、ＲＮＡのプログラム化可能な転写サイレンシング及び活性化デバイスを遺伝子工学的に作るために活用されてきた（２９、３０）。
現在までに、化膿レンサ球菌、サーモフィルス菌、髄膜炎菌及びトレポネーマ・デンティコ−ラ由来のＲＮＡにガイドされたＣａｓ９が、ゲノム操作のツールとして記述されている（１−１３、２４、２５、３１−３４及びＥｓｖｅｌｔａ ｅｔ ａｌ．ＰＭＩＤ：２４０７６７６２）。
本発明は、ＲＮＡプログラム可能なＣａｓ９を、追加のオーソロガスシステムに拡張する。系統発生的に定義されたｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓグループの８つの代表的なものの中で、本明細書では、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９の多様性及び互換性を検討する。本研究の結果は、広範囲のＣａｓ９酵素、ガイドＲＮＡ構造及び関連する特定ＰＡＭｓを導入するのみならず、当該システムの共進化及び水平伝播を含む、ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの進化的側面も明らかにする。
１つの態様において、本開示は、ガイドＲＮＡ、単分子及び二重分子の双方のガイドＲＮＡ、並びにそのガイドＲＮＡ及び／またはそのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ（ベクターを含む）を使用した細胞中で、ＤＮＡを操作する方法を提供する。ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼを含む複合体もまた、提供する。
いくつかの実施形態において、単分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含み、ここでそのタンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、またはそのタンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％が同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつか実施形態において、タンパク質結合セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含み、そのＣＲＩＳＰＲリピート部は、タンパク質結合セグメントのｔｒａｃｒＲＮＡと同種である。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡ標的化セグメントは、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に対して相補的であるＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、補足表Ｓ５に提示されるカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）ｔｒａｃｒＲＮＡ及びその同種ＣＲＩＳＰＲリピート部であり、及び当該ＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、補足表Ｓ５に提示されるカンピロバクター・ジェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及びその同種ＣＲＩＳＰＲリピート部に対して少なくとも８０％が同一であり、及び当該ＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。
いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列にハイブリダイズする配列を含む。
他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
さらに他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。
更に他の態様において、本開示は、本発明の単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞を提供する。
１つの態様において、本開示は、標的選択性（ｔａｒｇｅｔｅｒ）ＲＮＡ及びそれらの相補的な活性化因子（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）ＲＮＡ含み、ここでその活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含むか、またはその活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、二重分子ガイドＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドＲＮＡは、改変バックボーン、人工ヌクレオシド間結合、核酸の擬態、改変糖モイエティー、塩基修飾、安定性の改変または制御に備える改変または配列、細胞内トラッキングに備える改変または配列、トラッキングに備える改変または配列、またはタンパク質またはタンパク質複合体への結合部に備える改変または配列を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡは、活性化因子ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡの同種ＣＲＩＳＰＲリピート部である、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡはさらに、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に対して相補的であるＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、補足表Ｓ５に提示されるカンピロバクター・ジェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及びその同種ＣＲＩＳＰＲリピート部であり、及び当該ＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、補足表Ｓ５に提示されるカンピロバクター・ジェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及びその同種ＣＲＩＳＰＲリピート部に対して少なくとも８０％が同一であり、及び当該ＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。
いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列にハイブリダイズする配列を含む。
他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを提供する。
さらに他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。
更に他の態様において、本開示は、本発明の二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞を提供する。
１つの態様において、本開示は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体とＤＮＡとの接触を含む、細胞中のＤＮＡの操作法を提供し、ここで当該複合体は、（ａ）当該細胞対して異種のカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｂ）当該細胞に対して異種のパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはパスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡまたはＮＮＮＮＣに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｃ）当該細胞に対して異種のフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはフランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＮＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｄ）当該細胞に対して異種のストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ＊＊）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡＷに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｅ）当該細胞に対して異種のリステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはリステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＮＧＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、または（ｆ）当該細胞に対して異種のストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びＰＡＭ配列ＮＧＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、当該複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、を含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡである。当該方法に使用される複合体もまた、提供する。
当該方法のいくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣまたはＣＯＬ７Ａ１遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列は、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）の関連遺伝子であるＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２またはＮＣＦ４中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、Ｂ細胞リンパ腫／白血病ＩＩＡ（ＢＣＬ１１Ａ）タンパク質、ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ結合部位の芽球系エンハンサーをコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、前述の遺伝子の上流１，０００ヌクレオチドまでである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。
１つの態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ，ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０に示される）またはカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列に相補的な当該ＤＮＡ標的化セグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−９７３、１０７９−１２２２、１３１３−１３４８、１３７２−１４１５、１４４４−１９００、２１６３−２４８２または２６６７−２６８６の１つに示される標的配列に相補的なＲＮＡである。細胞中のＤＮＡを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。
他の態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ、ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡまたはＮＮＮＮＣへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）パスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に提示される）、またはパスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。いくつかの実施形態において、当該プロトスペーサー様配列に相補的な当該ＤＮＡ標的化セグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７４−１０７８、１２２３−１３１２、１３４９−１３７１、１４１６−１４４３、１９０１−２１６２、２４８３−２６６６または２６８７−２７０１の１つに示される標的配列に相補的なＲＮＡである。細胞中のＤＮＡを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。
さらに他の態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ，ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＮＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）フランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３に提示される）、またはフランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のＤＮＡを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。
更に他の態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ，ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡＷに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）ストレプトコッカス・サーモフィラス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィラス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のＤＮＡを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。
さらに他の態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ，ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＮＧＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）リステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に提示される）、またはリステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。細胞中のＤＮＡを操作するための当該ベクターの使用方法もまた、提供する。
そのうえ他の態様において、本開示は、（ａ）ガイドＲＮＡ，ここでそのガイドＲＮＡは、ＰＡＭ配列ＮＧＧに対するＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含み、及び（ｂ）ストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５）、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクターを提供する。
当該ベクターのいくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。
関連する態様において、本開示は、（ａ）前述のプロトスペーサー様配列のいずれかに隣接する哺乳類ゲノムＤＮＡの少なくとも７−２０塩基を同定し、及び（ｂ）（ｉ）ステップ（ａ）で特定されたＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメント、及び（ｉｉ）タンパク質結合セグメント、または（ｉ）及び（ｉｉ）をコードする核酸、及び（ｉｉｉ）ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはそのｃａｓ９エンドヌクレアーゼをコードする核酸を哺乳類細胞に接触させるか、または哺乳類に投与することにより、その哺乳類ゲノムのＤＮＡ配列を操作し、及び（ｃ）その哺乳類ゲノムＤＮＡの開裂の検出を含む、方法を提供する。
１つの態様において、本開示は、本明細書に記述されるＣａｓ９オーソログのいずれかから改変され、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の突然変異Ｅ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相当する１つ以上の突然変異を含む、改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを提供する。いくつかの実施形態において、当該改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはさらに、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の突然変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｎ９８２ＡまたはＡ９８４Ａに相当する１つ以上の突然変異を含む。
１つの態様において、本開示は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体とＤＮＡの接触を含む、細胞中のＤＮＡの操作法を提供し、ここで当該複合体は、（ａ）その細胞とは異種のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び（ｂ）補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣａｓ９エンドヌクレアーゼの同種ガイドＲＮＡ、または少なくとも２０のヌクレオチドにわたり補足表Ｓ５に提示される同種ｔｒａｃｒＲＮＡに対して少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＡＮである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。当該方法に使用される複合体もまた、提供する。
１つの態様において、本開示は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体とＤＮＡの接触を含む、細胞中のＤＮＡの操作法を提供し、ここで当該複合体は、（ａ）補足表Ｓ２におけるクラスターからの第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対応した同種ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）当該第Ｉ種ヌクレアーゼでの高い開裂効率を保持したまま互換的であり及びそれらの長さの８０％にわたり当該第Ｉ種エンドヌクレアーゼと少なくとも８０％の同一性を共有する、同じクラスターからの第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌由来であり及び当該第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、サーモフィラス＊菌由来であり及び当該第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり及び当該第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。当該方法に使用する複合体をまた、提供する。
１つの態様において、本開示は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体とＤＮＡへの接触を含む、細胞中のＤＮＡの操作法を提供し、ここで当該複合体は、（ａ）補足表Ｓ６におけるクラスターからの第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの同種ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）当該第Ｉ種ヌクレアーゼと同じかまたはより低い開裂効率を保持したまま互換的であり及びそれらの長さの７０％にわたり当該第Ｉ種エンドヌクレアーゼと少なくとも５０％のアミノ酸配列の特定を共有する、補足表Ｓ６の同じクラスターからの第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＡＮである。いくつかの実施形態において、当該第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、カンピロバクター・ジェジュニ由来であり及び当該第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。いくつかの実施形態において、当該第Ｉ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり及び当該第ＩＩ種Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラ・ムルトシダ由来である。当該方法に使用する複合体もまた、提供する。
１つの態様において、本開示は、２つ以上のＣａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を伴うＤＮＡへの接触を含む、細胞中のＤＮＡの操作法を提供し、ここで各Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、（ａ）それらの長さの７０％にわたり、当該方法の他のエンドヌクレアーゼと５０％未満のアミノ酸配列の同一性を示す、補足表Ｓ６の異なるクラスターからのＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び（ｂ）各Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと特異的に複合化するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＡＮである。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、フランシセラ・ノビシダ及び化膿レンサ球菌由来である。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌及びミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、サーモフィラス＊菌Ｃａｓ９及びサーモフィラス＊＊菌Ｃａｓ９由来である。当該方法に使用する複合体もまた、提供する。
当該操作法のいくつかの実施形態において、当該細胞中で標的化されるＤＮＡは、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣまたはＣＯＬ７Ａ１遺伝子である。いくつかの実施形態において、当該細胞中で標的化されるＤＮＡは、慢性肉芽腫性疾患（ＣＧＤ）の関連遺伝子であるＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２またはＮＣＦ４である。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、Ｂ細胞リンパ腫／白血病ＩＩＡ（ＢＣＬ１１Ａ）タンパク質、ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ結合部位の芽球系エンハンサーをコードする遺伝子中にある。いくつかの実施形態において、標的化される当該プロトスペーサー様配列は、上述で指摘された遺伝子の上流１，０００ヌクレオチドまでである。当該方法のいくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列に相補的な配列を含む。
本明細書に与えられるいずれの方法も、生体外または生体内であって良いことを意図している。
Ｃａｓ９オーソログの系統及び選択された細菌ＩＩｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの模式図。（Ａ）代表的なＣａｓ９オーソログの多重配列配置の、選択された及び有益な位置から再構成されたＣａｓ９の系統樹を示す（補足図Ｓ２及び補足表Ｓ２を参照）。ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ及びＩＩ−Ｃに分類されるＣａｓ９オーソログのサブタイプが、網掛けの囲みで強調されている。色分けされた枝部は、同じ遺伝子座構造を有する密接に関連した遺伝子座の、異なるタンパク質をグループ化している（１５）。各タンパク質は、遺伝子識別番号（ｔｈｅ ＧｅｎＩｎｆｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＧＩ））により、次いで細菌株名により表される。ブートストラップ値が、節点ごとに与えられる（物質及び方法を参照）。サブタイプＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの単系統クラスターは、高いブートストラップ値により支持されていることに留意のこと。その枝長に対する尺度バーが、アミノ酸置換／部位の予測値として与えられる。（Ｂ）化膿レンサ球菌ＳＦ３７０、ミュータンス菌ＵＡ１５９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９＊（ＣＲＩＳＰＲ３）、＊＊（ＣＲＩＳＰＲ１）、カンピロバクター・ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８、髄膜炎菌Ｚ２４９１、パスツレラ・ムルトシダＰｍ７０及びフランシセラ・ノビシダＵ１１２における、第ＩＩ種（Ｎｍｅｎｉ／ＣＡＳＳ４）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの遺伝子座。赤矢印、ｔｒａｃｒＲＮＡの転写方向；青矢印、ｃａｓ遺伝子；黒長方形、ＣＲＩＳＰＲリピート部；緑ひし形、スペーサー；太い黒線、リーダー配列；黒矢印、推定ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロモーター；ＨＰ、仮想タンパク質。左側に表示される色分けのバーは、Ｃａｓ９系統樹の枝の色に対応している。カンピロバクター・ジェジュニ及び髄膜炎菌ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡｓの転写方向及び推定リーダー位置は、既に公開済みのＲＮＡ配列データから導いた（１５）。パスツレラ・ムルトシダのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の構造は、それに非常に類似した髄膜炎菌の遺伝子座を基に推定し及び強く予測されるプロモーター及び（１５）に記述される転写ターミネーターに基づく、ｔｒａｃｒＲＮＡの生物情報学的な予測によりさらに確認した。第ＩＩ種ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの遺伝子座は、ほとんどが遺伝子の最小セット（タイプＩＩ−Ｃ、青）であるｃａｓ９、ｃａｓ１及びｃａｓ２を伴い、時として第４の遺伝子ｃｓｎ２ａ／ｂ（タイプＩＩ−Ａ、黄及び橙）またはｃａｓ４（タイプＩＩ−Ｂ、緑）を伴う当該ｃａｓ遺伝子組成において、差異化できる。このＣＲＩＳＰＲ配置は、同じ方向（タイプＩＩ−Ａ、黄及び橙）かまたは反対方向（タイプＩＩ−Ｂ及びＣ、青及び緑）のｃａｓオペロンに転写できる。ｔｒａｃｒＲＮＡの位置及びその転写方向は、そのグループ内で異なる（ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊のタイプＩＩ−Ａと、ここ（黄色）に示されるその他の種由来のタイプＩＩ−Ａとの比較及びカンピロバクター・ジェジュニのタイプＩＩ−Ｃと髄膜炎菌及びパスツレラ・ムルトシダ（青）のタイプＩＩ−Ｃとの比較）。 同上 Ｃａｓ９オーソログの系統及び選択された細菌ＩＩｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの模式図。（Ａ）代表的なＣａｓ９オーソログの多重配列配置の、選択された及び有益な位置から再構成されたＣａｓ９の系統樹を示す（補足図Ｓ２及び補足表Ｓ２を参照）。ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ及びＩＩ−Ｃに分類されるＣａｓ９オーソログのサブタイプが、網掛けの囲みで強調されている。色分けされた枝部は、同じ遺伝子座構造を有する密接に関連した遺伝子座の、異なるタンパク質をグループ化している（１５）。各タンパク質は、遺伝子識別番号（ｔｈｅ ＧｅｎＩｎｆｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（ＧＩ））により、次いで細菌株名により表される。ブートストラップ値が、節点ごとに与えられる（物質及び方法を参照）。サブタイプＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの単系統クラスターは、高いブートストラップ値により支持されていることに留意のこと。その枝長に対する尺度バーが、アミノ酸置換／部位の予測値として与えられる。（Ｂ）化膿レンサ球菌ＳＦ３７０、ミュータンス菌ＵＡ１５９、ストレプトコッカス・サーモフィルスＬＭＤ−９＊（ＣＲＩＳＰＲ３）、＊＊（ＣＲＩＳＰＲ１）、カンピロバクター・ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８、髄膜炎菌Ｚ２４９１、パスツレラ・ムルトシダＰｍ７０及びフランシセラ・ノビシダＵ１１２における、第ＩＩ種（Ｎｍｅｎｉ／ＣＡＳＳ４）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの遺伝子座。赤矢印、ｔｒａｃｒＲＮＡの転写方向；青矢印、ｃａｓ遺伝子；黒長方形、ＣＲＩＳＰＲリピート部；緑ひし形、スペーサー；太い黒線、リーダー配列；黒矢印、推定ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロモーター；ＨＰ、仮想タンパク質。左側に表示される色分けのバーは、Ｃａｓ９系統樹の枝の色に対応している。カンピロバクター・ジェジュニ及び髄膜炎菌ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡｓの転写方向及び推定リーダー位置は、既に公開済みのＲＮＡ配列データから導いた（１５）。パスツレラ・ムルトシダのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の構造は、それに非常に類似した髄膜炎菌の遺伝子座を基に推定し及び強く予測されるプロモーター及び（１５）に記述される転写ターミネーターに基づく、ｔｒａｃｒＲＮＡの生物情報学的な予測によりさらに確認した。第ＩＩ種ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの遺伝子座は、ほとんどが遺伝子の最小セット（タイプＩＩ−Ｃ、青）であるｃａｓ９、ｃａｓ１及びｃａｓ２を伴い、時として第４の遺伝子ｃｓｎ２ａ／ｂ（タイプＩＩ−Ａ、黄及び橙）またはｃａｓ４（タイプＩＩ−Ｂ、緑）を伴う当該ｃａｓ遺伝子組成において、差異化できる。このＣＲＩＳＰＲ配置は、同じ方向（タイプＩＩ−Ａ、黄及び橙）かまたは反対方向（タイプＩＩ−Ｂ及びＣ、青及び緑）のｃａｓオペロンに転写できる。ｔｒａｃｒＲＮＡの位置及びその転写方向は、そのグループ内で異なる（ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊のタイプＩＩ−Ａと、ここ（黄色）に示されるその他の種由来のタイプＩＩ−Ａとの比較及びカンピロバクター・ジェジュニのタイプＩＩ−Ｃと髄膜炎菌及びパスツレラ・ムルトシダ（青）のタイプＩＩ−Ｃとの比較）。 ＲＮａｓｅＩＩＩは、第ＩＩ種ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓにおいてｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセスを一般的に行う。化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｒｎｃ及びｒｎｃオーソログまたはｔｒａｃｒＲＮＡ（上）とｃｒＲＮＡリピート部（下）に対して精査された変異体（切り捨てられたｒｎｃ及び不活性化した（死滅した）（Ｄ５１Ａ）ｒｎｃ）と相補的な△ｒｎｃからの、トータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析。ｎｔ（ヌクレオチド）でのＲＮＡサイズ及びｔｒａｃｒＲＮＡ（赤−黒）そしてｃｒＲＮＡ（緑−黒）の模式図を、右側に示す（１６）。縦方向の黒の矢印は、プロセスの場所を示し、ｔｒａｃｒＲＮＡ−１７１ ｎｔ及びｔｒａｃｒＲＮＡ−８９ ｎｔ形成体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ一次転写産物に対応している。ｔｒａｃｒＲＮＡ−７５ ｎｔ及びｔｒａｃｒＲＮＡ３９−４２ ｎｔ形成体の存在は、ｔｒａｃｒＲＮＡとｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの共プロセスを示す。化膿レンサ球菌ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡは、全ての解析ＲＮａｓｅＩＩＩオーソログにより共プロセス化される。化膿レンサ球菌ＲＮａｓｅＩＩＩの短縮型及び触媒不活性変異体はともに、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセスには、欠失している。 Ｃａｓ９の保存モチーフは、ＤＮＡ干渉に対して必要であるが、ＲＮａｓｅＩＩＩによる二重分子ＲＮＡには必要ではない。（Ａ）化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の模式図。保存ＨＮＨ及びスプリットＲｕｖＣモチーフそして解析されたアミノ酸が示される。（Ｂ）化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｃａｓ９及びｐＥＣ３４２またはｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡリピートに対して精査された、ｃａｓ９ＷＴまたは突然変異遺伝子を含むｐＥＣ３４２と相補的な△ｃａｓ９からの、トータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析。ｔｒａｃｒＲＮＡ−７５ ｎｔ及びｃｒＲＮＡ−３９−４２ ｎｔ形成体を産生するｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの成熟が、当該ｃａｓ９変異体の相補的な全ての△ｃａｓ９株に観察される。（Ｃ）生体内のプロトスペーサーの標的化。化膿レンサ球菌ＷＴ及びｐＥＣ８５（ベクター）、ｐＥＣ８５Ωｃａｓ９（ｃａｓ９）、ｐＥＣ８５ΩｓｐｅＭ（ｓｐｅＭ）を伴う△ｃａｓ９、そしてｓｐｅＭ及びｃａｓ９変異体を含むｐＥＣ８５ΩｔｒａｃｒＲＮＡ−１７１ ｎｔプラスミドの、形質転換試験。プラスミドＤＮＡのμｇ当たりのコロニー形成ユニット（ＣＦＵ：ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）は、少なくとも３回の独立した実験により決定した。１つの代表的な実験での３連測定結果である＋／−ＳＤを示す。Ｃａｓ９Ｎ８５４Ａは、ＷＴＣａｓ９に対して観察されたこの残基が、ＤＮＡ干渉で促進されなかったことを示す、プロトスペーサープラスミド耐性を示さなかった唯一の変異体である。（Ｄ）インビトロのプラスミド開裂。等モル量の二重分子ＲＮＡ−ｓｐｅＭの存在下で、２５ｎＭのＣａｓ９ＷＴまたは変異体と共にインキュベートされたｓｐｅＭプロトスペーサー（ｐＥＣ２８７）を含む、プラスミドＤＮＡ（５ｎＭ）の寒天ゲル電気泳動（材料及び方法を参照）。その他のＣａｓ９変異体が、ニックされた産物のみを創出する一方での、Ｃａｓ９ＷＴ及びＮ８５４Ａ産生の直鎖状開裂産物。Ｍ：１ｋｂＤＮＡラダー（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、ｏｃ：開環状、ｌｉ：直鎖状、ｓｃ：スーパーコイル状。 密接な関係のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ由来のＣａｓ９は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩにより、ＲＮＡプロセス中に化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の役割を置換できる。（Ａ）選ばれた細菌種由来のＣａｓ９の模式図。保存モチーフ間（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）のタンパク質のサイズ及び距離が、スケールで描写される。補足図Ｓ１を参照のこと。（Ｂ）化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｃａｓ９及びｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡリピートに対して精査された、ｐＥＣ３４２（ｔｒａｃｒＲＮＡ−１７１ ｎｔ及び化膿レンサ球菌由来のｃａｓオペロンプロモーターを含むバックボーンベクター）またはｃａｓ９オーソログ遺伝子を含むｐＥＣ３４２ベースのプラスミドと相補的な△ｃａｓ９から抽出された、トータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析。化膿レンサ球菌ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの成熟形態は、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ＷＴまたは密接な関係の、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス由来のＣａｓ９オーソログの存在下においてのみ観察される。 Ｃａｓ９オーソログは、インビトロで、それらの同種二重分子ＲＮＡ及び特定のＰＡＭの存在下で、ＤＮＡを開裂する。（Ａ）選択された細菌種に対応したスペーサー配列のＢＬＡＳＴ解析から誘導されたプロトスペーサー隣接配列のロゴプロット。当該ロゴプロットは、当該プロトスペーサー配列の下流の最も豊富なヌクレオチドの図解表現を与える。カッコ内の数字は、解析されたプロトスペーサーの数に対応している。（Ｂ）特定ＰＡＭの検証に対応して設計されたＤＮＡ部位。各種のロゴプロットを基に、当該ｓｐｅＭプロトスペーサー及び提案されたＰＡＭを含むか（ＰＡＭ＋）または含まない（ＰＡＭ−）、その指示された配列下流を含むように、プラスミドＤＮＡ部位を設計した。予測されたＰＡＭは、活性化に必要なヌクレオチド（データは非表示）を絞り込む開裂アッセイにより検証された。したがって、使用された配列は、（Ａ）に示されたロゴプロットとはわずかに異なる。当該ＰＡＭの一部ではないその他のヌクレオチドの高存在量は、当該プロトスペーサーを含むコード配列の冗長度により、及び見出されたプロトスペーサー標的の限定数により説明できる。最後のカラムは、各種に対応したＰＡＭ配列を示しており、それらは、すでに公開済みであり（シンボルマークなし）またはこの業績から導かれる（＃）。（Ｃ）二重分子ＲＮＡによる生体内プラスミド開裂アッセイ。１０ｂｐのプロトスペーサー隣接配列を伴うプラスミドＤＮＡ上のＣａｓ９オーソログ（（Ｂ）に要約）。その二重分子ＲＮＡとの複合体中の各Ｃａｓ９オーソログは、対応する種特異的なＰＡＭを含む（ＰＡＭ＋）プラスミドを開裂する。その特定ＰＡＭを含まない（ＰＡＭ−）プラスミドには、開裂が観察されない。ｌｉ：直鎖状開裂産物、ｓｃ：スーパーコイル状プラスミドＤＮＡ。 Ｃａｓ９と二重分子ＲＮＡの共進化。（Ａ）オーソロガスな二重分子ＲＮＡを伴う複合体中の化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（上パネル）及び化膿レンサ球菌二重分子ＲＮＡを伴う複合体中のオーソロガスＣａｓ９酵素（下パネル）を使用した生体内プラスミド開裂アッセイ。プロトスペーサーｓｐｅＭ及び化膿レンサ球菌ＰＡＭ（ＮＧＧ）を含むプラスミドＤＮＡを、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を伴う複合体中の異なる二重分子ＲＮＡと共にインキュベートした。この二重分子ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ−リピート配列は、ｓｅｐＭを標的化するｃｒＲＮＡスペーサーを伴う、指定された細菌種由来である。下パネルにおいて、ｓｅｐＭ及び当該特定のＰＡＭを含むプラスミドＤＮＡを、化膿レンサ球菌二重分子ＲＮＡを伴う複合体中のＣａｓ９オーソログと共にインキュベートした。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス＊（黄色）の存在下でのみ、プラスミドＤＮＡを開裂できる。化膿レンサ球菌由来の二重分子ＲＮＡは、化膿レンサ球菌、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス＊（黄色）由来のＣａｓ９を伴ってのみ、ＤＮＡ開裂を仲介できる。（Ｂ）Ｃａｓ９及び二重分子ＲＮＡのオーソログの互換性の概要。図５に従い、特定ＰＡＭ配列を使用した。色分けは、ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓのサブグループを反映している（図１）。試験条件下で観察された、＋＋＋：１００−７５％の開裂活性、＋＋：７５−５０％の開裂活性、＋：５０−２５％の開裂活性、−：２５−０％の開裂活性。同じｔｙｐｅ ＩＩ グループ由来のＣａｓ９と二重分子ＲＮＡの二重分子は、交換可能であり、及び依然としてそのＰＡＭ配列のＣａｓ９特異性を与えるプラスミド開裂を仲介できる。補足図Ｓ１０も参照。 本研究において精製されたＣａｓ９タンパク質の生化学的特性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。（Ａ）化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ＷＴ及び変異体の生化学的特徴（ｂ遺伝子番号（ＧＩ）識別子、ｃε、吸光係数）が同一である、Ｃａｓ９オーソロガスタンパク質のａ記録の特徴の概要。（Ｂ）化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９の精製変異体のＤＳＤ ＰＡＧＥ解析。（Ｃ）精製Ｃａｓ９オーソログのＳＤＳ ＰＡＧＥ解析。Ｍ：未染色タンパク質ラダーＰａｇｅＲｕｌｅｒＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）。 代表的なＣａｓ９配列の多重配列の配置（補足表Ｓ２及び材料と方法を参照）。以下の選択されたＣａｓ９配列のＧＩ識別子を伴い、Ｊｎｅｔとして記述される行は、対応するサブグループ内のＣａｓ９の予測二次構造を与える（各Ｊｎｅｔ以下に示される配列）。保存モチーフは、その配置の下にマークされ及びその変異アミノ酸残基は、強調表示されている。アスタリスクは、当該Ｃａｓ９系統樹の再構築に対応して選択された情報の位置を示している。 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 同上 代表的なＣａｓ１配列の多重配列配置（補足表Ｓ２及び材料と方法を参照）。当該Ｃａｓ１系統樹の再構築に対応して選択された情報の位置は、この配列の下部にアスタリスクでマークされている。 同上 同上 同上 代表的なＣａｓ９及びＣａｓ１配列の系統解析。選択された、Ｃａｓ１及びＣａｓ９の多重配列配置の情報位置由来のＣａｓ１（左）及びＣａｓ９（右）の系統樹が示される（図１並びに補足図Ｓ２及びＳ３を参照）。当該Ｃａｓ１系統樹は、第Ｉ種ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの選択されたＣａｓ１オーソログの外縁グループと根が繋がっている。ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ及びＩＩ−Ｃとして分類される種の当該Ｃａｓ１及びＣａｓ９オーソログが、網掛け囲みで強調表示されている。同じ枝の色を、両系統樹の各細菌株に対して使用した。各タンパク質は、遺伝子番号（ＧＩ）識別子とそれに続く細菌株名により表示されている。各節点に対して、そのブートストラップ値が与えられている（材料と方法を参照）。その枝長に対するスケールバーが、部位あたりのアミノ酸置換の推定数として与えられている。高ブートストラップ値に支持される両系統樹上における、その樹形とサブグループＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの単一系統クラスターの類似性に留意のこと。 同上 ＲＮａｓｅ ＩＩＩは、ｔｒａｃｒＲＮＡの指示した機能を実行し、ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓにおいてｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを処理する。化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｒｎｃ及びｒｎｃオーソログまたは（Ａ）ｔｒａｃｒＲＮＡ及び（Ｂ）ｃｒＲＮＡリピートと共に精査された、ｒｎｃ変異体と相補的な△ｒｎｃからの、トータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析。（Ｂ）におけるノーザンブロッティングの下に示される破線の囲いは、高い暴露を伴ったブロッティングの場所を示す。全てのＲＮＡｓｅ ＩＩＩオーソログは、化膿レンサ球菌のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡを共進化できる。ＲＮａｓｅ ＩＩＩＩの短縮型または触媒活性の無い（死滅した）変異体に相補的な△ｒｎｃにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの成熟形態は、観測されなかった。 同上 本研究に使用した細菌エンドヌクレアーゼＩＩＩの多重配列配置。当該配置の下に示されるドメインは、大腸菌由来のＲＮａｓｅ ＩＩＩに示されるドメインに従う（５８、５９）。当該触媒不活性の「ｒｎｃ死滅」変異体において突然変異した保存触媒活性アスパラギン酸残基及び当該切り捨てられたｒｎｃ変異体の最終アミノ酸が、各々アスタリスク及び矢印で、上述の配置に示される。 Ｃａｓ９の保存された触媒活性アミノ酸残基は、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる二重分子ＲＮＡのプロセスで促進されない。化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｃａｓ９及びｐＥＣ３４２（ｔｒａｃｒＲＮＡ−１７１ ｎｔ及び化膿レンサ球菌由来の野生のｃａｓオペロンプロモーターを含むバックボーンベクター）または（Ａ）ｔｒａｃｒＲＮＡまたは（Ｂ）ｃｒＲＮＡリピートプローブと相補形成している、Ｃａｓ９ＷＴまたは変異体をコードするｐＥＣ３４２由来のプラスミドと相補的な△ｃａｓ９から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析（補足表Ｓ１）。ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの同時処理は、Ｃａｓ９点変異体をコードする全ての株で観察される。従来の研究において、我々は、ｃａｓ９欠失変異体において、低い存在量のｔｒａｃｒＲＮＡを観察したことに留意のこと（１６）。そのため、ｃａｓ９の相補性試験に使用されたプラスミドを、ｃａｓ９に加えてｔｒａｃｒＲＮＡをコードするように設計した。 Ｃａｓ９とｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの共進化。化膿レンサ球菌ＷＴ、△ｃａｓ９及びｐＥＣ３４２または（Ａ）ｔｒａｃｒＲＮＡまたは（Ｂ）ｃｒＲＮＡリピートプローブとハイブリダイズしている、Ｃａｓ９ＷＴまたは変異体をコードするｐＥＣ３４２由来のプラスミドと相補的な△ｃａｓ９から抽出されたトータルＲＮＡのノーザンブロッティング解析（補足表Ｓ１）。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ ＷＴ及び密接な関係の、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス由来のＣａｓ９オーソログだけが、化膿レンサ球菌のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの共プロセスに寄与できる。 同上 Ｃａｓ９オーソログは、それらの同種二重分子ＲＮＡ及び特定のＰＡＭの存在下においてプラスミドＤＮＡを開裂する。二重分子ＲＮＡのアガロースゲル電気泳動解析：ｓｐｅＭプロトスペーサー及び隣接するＷＴ ＰＡＭ（ＰＡＭ＋）、不完全なＰＡＭ（ＰＡＭ±）またはＰＡＭなし（ＰＡＭ−）を含む、プラスミドＤＮＡ（５ ｎＭ）へのＣａｓ９滴定（０−１００ ｎＭの二重分子ＲＮＡ−Ｃａｓ９複合体）。化膿レンサ球菌、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊及び髄膜炎菌に対しては、当該ＰＡＭ配列が、公開済みである（２７、２８、５３、５４）。その他の細菌種に対しては、研究された、または関連した菌株において特定されたプロトスペーサーの下流配列に基づいてＰＡＭは予測された（補足表Ｓ２及び材料と方法を参照）。ｓｐｅＭプロトスペーサーを標的化するｃｒＲＮＡの直下に位置する１０ｂｐの配列を示す。そのＰＡＭ配列に従って予測されるヌクレオチドを、グレーで網掛けしてある。ｌｉ：直鎖状開裂産物、ｓｃ：スーパーコイル状プラスミドＤＮＡ、Ｍ：１ｋｂのＤＮＡラダー。 二重分子ＲＮＡとの組み合わせにおけるＣａｓ９オーソログのインビトロでのプラスミド開裂アッセイの概要。開裂アッセイのアガロースゲル電気泳動。等モル濃度の各二重分子ＲＮＡオーソログとの複合体を形成した、（Ａ）ミュータンス菌Ｃａｓ９（５０ｎＭ）、（Ｂ）ストレプトコッカス・サーモフィルス＊Ｃａｓ９（２５ｎＭ）、（Ｃ）ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９（１００ｎＭ）、（Ｄ）カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９（１００ｎＭ）、（Ｅ）髄膜炎菌Ｃａｓ９（１００ｎＭ）、（Ｆ）パスツレラ・ムルトシダＣａｓ９（２５ｎＭ）、（Ｇ）フランシセラ・ノビシダＣａｓ９（１００ｎＭ）を、ｓｐｅＭプロトスペーサー配列及び解析された当該Ｃａｓ９オーソログに特異的なＰＡＭ配列を含むプラスミドＤＮＡ（５ ｎＭ）とインキュベートした。ｌｉ：直鎖状開裂産物、ｓｃ：スーパーコイル状プラスミドＤＮＡ、Ｍ：１ ｋｂのＤＮＡラダー。 Ｃａｓ９系統の樹形は、ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの水平及び垂直伝播を示唆している。図１、補足図Ｓ４及び補足表Ｓ４を参照のこと。代表的なＣａｓ９オーソログを含む細菌株の分類（門を色で）及び生息地（シンボルで）に対応したコードを示す（右パネル）。進化的に離れている細菌を分類しているが（１及び３）、主として類似の起源（クラスター１のヒト及びクラスター３周囲のサンプル）から単離されるクラスターは、ｔｙｐｅ ＩＩ システムの水平伝播を示唆する。クラスター２、４及び５は、当該システムの水平伝播を示す多様な生息地から単離された、密接に関連する細菌を分類している。 同上 ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡリピート部の二重分子は、密接に関連するＣａｓ９オーソログの遺伝子座において、類似した二次構造を形成している。プロセス処理されたｔｒａｃｒＲＮＡ（赤）及びリピート部から誘導された成熟ｃｒＲＮＡ（グレー）配列の非リピート配列は、研究された各ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座に対して、共に折りたたまれていた（材料と方法を参照）。密接に関連するＣａｓ９の遺伝子座由来の二重分子ＲＮＡを、左に示したカラーバーでグループ化している（図１及び補足図Ｓ４を参照）。同じグループに属するＲＮＡ二重分子は、構造的な類似性を表しており、Ｃａｓ９による二重分子ＲＮＡの認識における構造の役割を示唆している。
専門用語
本明細書で使用する全ての技術的及び科学的用語は、その技術的及び科学的用語を本明細書で別に定義しない限り、本発明分野に属する当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。
本明細書で互換的に使用する、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、本用語は、非限定的に、一本鎖、二本鎖、または多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリン及びピリミジン塩基またはその他の天然の、化学的にまたは生物学的に改変された、人工の、または誘導体のヌクレオチド塩基を含有するポリマーを含む。「オリゴヌクレオチド」は一般的に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの、約５から約１００ヌクレオチド間のポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的に対して、オリゴヌクレオチドの長さの上限はない。オリゴヌクレオチドはまた、「オリゴマー」または「オリゴ」として知られており、遺伝子から単離または当技術分野で公知の方法により化学的に合成されて良い。用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、記述される実施形態に応用が可能であるとして、一本鎖（センスまたはアンチセンスなどの）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
「ゲノムＤＮＡ」は、非限定的に、細菌、真菌、古細菌、植物または動物を含む生命体のゲノムのＤＮＡを指す。
ＤＮＡを「操作する」は、結合する、そのＤＮＡの単鎖をニッキングする、または二本鎖を開裂する（すなわち、切断する）を含み、またはそのＤＮＡまたはそのＤＮＡに関連するポリペプチドを改変する（例えば、段落［０１６１］または［０１６２］の改変）、ことを含む。ＤＮＡの操作では、そのＤＮＡによりコードされたＲＮＡまたはポリペプチドの発現をサイレンス、活性化、または調節（増加または減少のいずれか）できる。
「ステムループ構造」は、主として単鎖ヌクレオチドの領域（ループ部位）が片側に連結した、二本鎖（ステム部位）を形成する、既知もしくは予測されるヌクレオチド領域を含む二次構造を有する核酸を指す。用語「ヘアピン」及び「折り返し（フォールドバック）」構造はまた、ステムループ構造を指して本明細書で使用する。そのような構造は、当技術分野では公知であり及びこれらの用語は、一貫して当分野で周知の意味で使用する。当業者には公知のことだが、ステムループ構造は、正確な塩基対を必要としない。したがって、このステムは、１つ以上のミスマッチな塩基を含む。あるいは、その塩基対は正確であって良く、すなわちいかなるミスマッチをも含まない。
用語「ハイブリダイズできる（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｂｌｅ）」または「相補的な（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」または「実質的に相補的な（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）」により、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合、すなわちワトソン・クリック型塩基対及び／またはＧ／Ｕ塩基対を形成すること、配列特異、非平行、温度及び溶液のイオン強度が適切なインビトロ及び／またはインビボ条件下での方法（すなわち、相補的核酸に特異的に結合する核酸）における他の核酸への「アニール」または「ハイブリダイゼーション」を可能にする核酸の配列を含む、ことを意味する。当技術分野では公知のことであるが、標準的ワトソン・クリック型塩基対には、チミジン（Ｔ）と対を成すアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）と対を成すアデニン（Ａ）、及びシトシン（Ｃ）と対を成すグアニン（Ｇ）［ＤＮＡ、ＲＮＡ］を含む。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間、グアニン（Ｇ）とウラシル（Ｕ）の塩基対間でのハイブリダイゼーションもまた、当技術分野では公知である。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対は、ｍＲＮＡにおけるコドンと塩基対を成すｔＲＮＡアンチコドンの脈絡において、その遺伝子コードの縮退（すなわち、冗長性）に対して部分的に対応している。本開示の文脈において、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重分子）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）と相補的であると考えられ、及びその逆もある。そのように、Ｇ／Ｕ塩基対が、目的のヌクレオチドの位置で、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重分子）を形成できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされず、代わりに相補的である、とみなされる。
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、それらの中の、特に１１章及び表１１．１、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ，Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（２００１）に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「妥当性」を決定する。
ハイブリダイゼーションには、塩基間の不一致が起こり得るとしても、２つの核酸が相補的配列を含むことが必要である。２つの核酸間でのハイブリダイゼーションに適切な条件は、その核酸の長さ、相補性の度合い、当技術分野で公知の変動要因に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性度合いが大きいほど、それら配列を有する核酸ハイブリッドの溶解温度（Ｔｍ）の値は大きい。相補性の長さが短い（例えば、３５以下の、３０以下の、２５以下の、２２以下の、２０以下の、１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）核酸間のハイブリダイゼーションに対しては、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ｓｕｐｒａ，１１．７−１１．８を参照）。通常、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくとも約１０のヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸に対応した具体的な最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに、温度及び洗浄液の塩濃度は、相補領域の長さ及び相補性の度合いなどの要因により必要に応じて調整されて良いことは、当業者には理解されるであろう。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的に相補的であるまたは相補的である標的核酸の配列に対して、１００％相補的である必要がないことは、当業者には理解される。さらに、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたりハイブリダイズし、そのため介在するまたは隣接するセグメントは、そのハイブリダイゼーション（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）に関与しない。ポリヌクレオチドは、標的核酸配列が標的化された領域に対して少なくとも７０％の、少なくとも８０％の、少なくとも９０％の、少なくとも９５％の、少なくとも９９％の、または１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチドの１８が標的領域に相補的であるアンチセンス核酸は、特異的にハイブリダイゼーションをし、９０％の相補性に相当する。この例において、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと一緒にまたは組み入れられて良く及び互いにまたは相補的ヌクレオチドと隣接する必要はない。核酸内の核酸配列の、特定の長さ間の相補性パーセンテージは、当技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（基本的な局在配置探査ツール）及びパワーＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を使用し、または、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）のアルゴリズムを利用し、デフォルト設定を使用したギャッププログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ８ ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）を使用して、規定通りに決定できる。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では互換的に使用し、及び任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を示し、コードされた及び非コードのアミノ酸、化学的または生化学的に改変または誘導されたアミノ酸、及び改変されたペプチドのバックボーンを有するポリペプチドを含むことができる。
本明細書で使用する「結合している」（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメインを指して）は、高分子間（例えば、タンパク質と核酸の間）の非共有性相互作用を指す。非共有性相互作用の状態にある一方で、その高分子は、「関連している」または「相互作用している」または「結合している」といわれる（例えば、分子Ｘが、分子Ｙと相互作用しているといわれる場合、非共有的な方法で、分子Ｘは、分子Ｙに結合している）。結合相互作用の全ての成分が、配列特異性である必要は無く（例えば、ＤＮＡバックボーンのリン酸残基）、しかし結合相互作用のある部分は、配列特異性であって良い。結合相互作用は一般的に、１０−６ Ｍ未満の、１０−７ Ｍ未満の、１０−８ Ｍ未満の、１０−９Ｍ未満の、１０−１０ Ｍ未満の、１０−１１ Ｍ未満の、１０−１２ Ｍ未満の、１０−１３ Ｍ未満の、１０−１４ Ｍ未満の、または１０−１５ Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強さを指し、増加した結合親和性は、低いＫｄと相関している。「結合ドメイン」により、他の分子に非共有的に結合できるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合できる。タンパク質ドメイン−結合タンパク質の場合、それ自身（ホモダイマー、ホモトリマーなど）に結合でき及び／または異なるタンパク質または複数タンパク質の１つ以上の分子に結合できる。
用語「保存アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンから成る脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループ、セリン及びスレオニンから成る脂肪族水酸基側鎖を有するアミノ酸のグループ、アスパラギン及びグルタミンから成るアミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループ、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンから成る芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループ、リジン、アルギニン、及びヒスチジンから成る塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループ、グルタミン酸及びアスパラギン酸から成る酸性側鎖を有するアミノ酸のグループ、及びシステイン及びメチオニンから成る硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループである。例示的な保存アミノ酸置換基には、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンがある。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してあるパーセントの「配列同一性」を有し、並べた際に、及び同じ相対位置において、その２つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列同一性は、多数の異なる方法により決定できる。配列同一性を決定するために、配列を様々な方法及びコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴなど）で配置することができ、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ， ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／，ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／， ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／を含むウェブサイトが利用できる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｉ．２１５：４０３−１０を参照のこと。当業界における配列配置の標準を、別のＣａｓ９オーソログにおけるアミノ酸残基に「対応した」Ｃａｓ９オーソログにおけるアミノ酸残基を決定するために、本発明において使用する。別のＣａｓ９オーソログにおけるアミノ酸残基に対応した、Ｃａｓ９オーソログにおけるアミノ酸残基は、その配列の配置における同じ位置に現れる。
特定のＲＮＡを「コード」するＤＮＡ配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡのポリヌクレオチドは、タンパク質に転写されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードして良く、またはＤＮＡのポリヌクレオチドは、タンパク質に転写されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはガイドＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードしても良い。「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列とは、適切な調整配列の制御下に置かれた場合、インビトロまたはインビボでｍＲＮＡに転写され（ＤＮＡの場合）及びポリペプチドに翻訳される（ｍＲＮＡの場合）、核酸配列である。そのコード配列の境界は、５’末端（Ｎ末端）での開始コドン及び３’末端（Ｃ末端）での転写停止のノンセンスコドンにより決定される。コード配列には、非限定的に、原核生物または真核生物ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、及び合成核酸を含むことができる。転写終了配列は、通常はそのコード配列の３’に位置しているであろう。
本明細書で使用する場合、「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼを結合し及び下流のコード（３’方向）または非コード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的に対応して、当該プロモーター配列は、その転写開始部によりその３’末端に結合され、及び最低限の塩基または背景より高く検出可能なレベルで転写開始するのに必要な最低限のエレメントを含むように、上流（５’方向）に伸長する。当該プロモーター配列内に、ＲＮＡポリメラーゼの結合に応答するタンパク質結合ドメインと同時に、転写開始部が見出されるであろう。真核生物プロモーターは多くの場合、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含む。誘導性プロモーターを含む多様なプロモーターが、本発明の多様なベクターを誘導するために使用されて良い。
プロモーターは、常時活性型プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得て、それは、誘導性プロモーター（すなわち、活性／「ＯＮ」または非活性／「ＯＦＦ」の状態であるプロモーター）であって良く、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物またはタンパク質の存在により制御され、それは、空間的に制約されたプロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）であって良く（例えば、組織特異的プロモーター、細胞特異的プロモーターなど）、及び一時的に制約されたプロモーター（すなわち、そのプロモーターは、胚発生の特定の期間または生物学的過程、例えば、マウスの毛包サイクル、の間に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある）であって良い。
適切なプロモーターは、ウイルスから誘導でき、それゆえウイルスプロモーターと呼ばれ、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む、任意の生命体から誘導できる。適切なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩ、ｐｏｌ ＩＩＩ）による発現を誘導するために利用できる。例示的なプロモーターには、非限定的に、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などを含む。
例示的な誘導性プロモーターには、非限定的に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−調節プロモーター、ラクトース誘導プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどを含む。誘導プロモーターはそのため、非限定的に、ドキシサイクリン、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼなどＲＮＡポリメラーゼ、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体融合などを含む分子により調節できる。
いくつかの実施形態において、当該プロモーターは、空間的に制約されたプロモーター（すなわち、細胞特異的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、そのため多細胞の生命体においては、当該プロモーターは、特定の細胞のサブセットにおいて活性（すなわち「ＯＮ」）である。空間的に制約されたプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などを指して良い。任意の便利な空間的に制約されたプロモーターを利用して良く及び適切なプロモーターの選定（例えば、脳特異的プロモーター、ニューロンのサブセットに発現を誘導するプロモーター、生殖細胞に発現を誘導するプロモーター、肺に発現を誘導するプロモーター、筋肉に発現を誘導するプロモーター、膵臓の膵島細胞に発現を誘導するプロモーターなど）は、その生命体に依存するであろう。例えば、様々な空間的に制約されるプロモーターが、植物、ハエ、ワーム、哺乳類、マウス、などで知られている。したがって、空間的に制約されるプロモーターは、生命体に依存して、非常に多様な異なる組織及び細胞における、部位配向性の改変ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節するために使用できる。いくつかの空間的に制約されるプロモーターはまた、一時的に制約され、そのためそのプロモーターは、胚発生の特定の時期の間または生物学的過程の特定の時期（例えば、マウスの毛包サイクル）の間に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある。
説明のために、空間的に制約されるプロモーターの例として、非限定的に、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、視細胞特異的プロモーターなどを含む。ニューロン特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）、シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）、ｔｈｙ−１プロモーター（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７−１９、及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１−１１６６を参照）、セロトニン受容体プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）、チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７、Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４、Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９、及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３−５９４を参照）、ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２−３４０６を参照）、Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３−２２６を参照）、ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８−３６５２を参照）、エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３−３８０５を参照）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性の蛋白質キナーゼＩＩ−α（ＣａｍＫＩＭ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０、及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）、ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子−ｐプロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２−６０を参照）などを含む。
脂肪細胞特異的なの空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂから＋２１ｂｐの間の領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０、及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）、グルコーストランスポーター−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）、脂肪酸転移酵素（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６、及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）、レプチンプロモーター（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）、アディポネクチンプロモーター（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． ３３１：４８４、及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ ２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）、アジプシンプロモーター（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）、レジスチンプロモーター（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）、などを含む。
心筋細胞特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ミオシン軽鎖−２、ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心筋アクチンなど、遺伝子由来の制御配列を含む。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２−５０５、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．ｅｓ．７６：５８４５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０−１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８−６１７、及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７−４０５１を参照。
平滑筋特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Ａｋｙｉｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３、及びＵＳ７，１６９，８７４を参照）、スムーテリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）プロモーター（例えば、ＷＯ ２００１／０１８０４８を参照）、平滑筋アクチンプロモーター、などを含む。例えば、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域内には２つのＣＡｒＧエレメントが位置しており、血管平滑筋細胞に特異的な発現を仲介することが示されている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６−２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３２，８４９−８５９、及びＭｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５−２４２５を参照）。
視細胞特異的な空間的に制約されるプロモーターには、非限定的に、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）ｓｕｐｒａ）、光受容体間（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）レチノイド結合蛋白質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）ｓｕｐｒａ）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）などを含む。
本明細書で互換的に使用する用語「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、及び「調節エレメント」は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写及び翻訳制御配列を指し、及び非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位配向性の改変ポリペプチド、またはＣａｓ９ポリペプチド）の転写を与え及び／または制御し、及び／またはコードされたポリペプチドの翻訳を制御する。
核酸、ポリペプチド、細胞、または生命体に適用して、本明細書で使用する用語「自然発生の」または「非改変の」は、自然界に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生命体を指す。例えば、自然の供給源から単離でき及び研究室でヒトにより意図的に改変されていない生命体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界に発生する。
核酸またはポリペプチドに適用して、本明細書で使用する用語「キメラの」は、異なる供給源由来の構造により定義される２つの要素を指す。例えば、「キメラの」が、キメラポリペプチド（例えば、キメラＣａｓ９タンパク質）の文脈で使用される場合、そのキメラポリペプチドは、異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む。キメラポリペプチドは、改変されたまたは天然発生のポリペプチド配列（例えば、改変されたまたは非改変のＣａｓ９タンパク質由来の第１アミノ酸、及びＣａｓ９タンパク質以外の第２アミノ酸配列）のいずれかを含む。同様に、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの文脈における「キメラの」は、異なるコード領域由来のヌクレオチド配列（例えば、改変されたまたは非改変のＣａｓ９タンパク質をコードする第１ヌクレオチド配列、及びＣａｓ９タンパク質以外のポリペプチドをコードする第２ヌクレオチド配列）を含む。
用語「キメラポリペプチド」は、自然発生ではなく、人間が介在したアミノ配列の、２つの別々のセグメントの人為的な組み合わせ（すなわち「融合」）により作られる、ポリペプチドを指す。キメラアミノ酸配列を含むポリペプチドは、キメラポリペプチドである。いくつかのキメラポリペプチドは、「融合変異体」と呼ぶことができる。
本明細書で使用する「異種の」は、天然の核酸またはタンパク質の各々には見出せないヌクレオチドまたはペプチドを意味する。例えば、キメラＣａｓ９タンパク質において、自然発生の細菌Ｃａｓ９ポリペプチド（またはそれらの変異体）のＲＮＡ結合ドメインは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生命体由来のポリペプチド配列）に融合されて良い。当該異種ポリペプチドは、活性（例えば、酵素活性）を示してもよく、当該キメラＣａｓ９タンパク質により示され得る（例えば、メチル転移酵素活性、アセチル転移酵素活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸は、キメラポリペプチドをコードするキメラポリヌクレオチドを産生するために、自然発生の核酸（またはそれらの変異体）に（例えば、遺伝子工学的により）連結されて良い。他の例として、融合変異体Ｃａｓ９の部位配向性ポリペプチドにおいて、変異体Ｃａｓ９の部位配向性ポリペプチドは、異種ポリペプチド（すなわち、Ｃａｓ９以外のポリペプチド）に融合されて良く、その融合変異体Ｃａｓ９の部位配向性ポリペプチドによっても示される活性を示す。異種核酸は、融合変異体Ｃａｓ９の部位配向性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するために、変異体Ｃａｓ９の部位配向性ポリペプチドに（例えば、遺伝子工学的に）連結されて良い。本明細書で使用する「異種の」はさらに、天然細胞ではない細胞中のヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
用語「同種の」は、通常は、自然界で相互作用しまたは共存している２つの生体分子を指す。
本明細書で使用する「組換え」は、特定の核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）またはベクターがクローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び／または、自然界システムに見出される内因性核酸由来の区別可能な、構造的コードまたは非コード配列を有するコンストラクトをもたらす連結反応のステップの多様な組換えの産物である、ことを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、細胞または無細胞の転写及び翻訳システムに含まれる、組換え転写ユニットから発現され得る合成核酸を与えるように、ｃＤＮＡフラグメントまたは一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てることができる。該当する配列を含むゲノムＤＮＡはまた、組換え遺伝子または転写ユニットの形成に使用できる。非翻訳ＤＮＡの配列は、そのオープンリーディングフレームからの５’または３’に存在し、そのような配列は、そのコード領域の操作または発現と干渉せず、及び多様なメカニズムにより目的産物の産生を調整するように確実に作用する（「ＤＮＡ調節配列」以下を参照）。あるいは、翻訳されないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列はまた、組換えが考慮されて良い。したがって、例えば、用語「組換え」核酸は、自然界には発生しないもの、例えば、人間が介在した２つの別の配列セグメントの人工的な組み合わせより作られたものを指す。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、または核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。通常、そのような方法は、コドンを同じアミノ酸、保存アミノ酸、または非保存アミノ酸をコードするコドンと入れ替えて行われる。あるいは、望ましい機能を産生するように、望ましい機能の核酸セグメントと共に結合させて実施される。この人工的組み合わせは、化学的な合成手段、または核酸の単離セグメントの人工的な操作のいずれかにより、例えば、遺伝子組換え技術により、多くの場合行われる。組換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされたポリペプチドの配列は、自然に発生することができ（「野生型」）または自然発生配列の変異体（例えば、突然変異体）であり得る。したがって、用語「組換え」ポリペプチドは、その配列が自然には発生しないポリペプチドを指す必要はない。代わりに、「組換え」ポリペプチドは、組換えＤＮＡ配列によりコードされ、しかしそのポリペプチドの配列は、自然に発生することができ（「野生型」）または非自然に発生する（例えば、多様体、変異体など）ことができる。したがって、「組換え」ポリペプチドは、人間の介入の結果であり、しかし自然発生のアミノ酸配列であって良い。
「ベクター」または「発現ベクター」は、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどの、他のＤＮＡセグメントへの、すなわち「挿入」のレプリコンであり、細胞に付着したセグメントの複製をもたらすように、付着して良い。
「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。「操作可能に連結された」は、記述される成分が、意図した方法で機能することを許容する関係にある場所において、並置であることを指す。例えば、仮にそのプロモーターが、その転写または発現に影響を与えるならば、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。用語「組換え発現ベクター」、または「ＤＮＡコンストラクト」は、ベクター及び少なくとも１つの挿入を含むＤＮＡ分子を指すために本明細書では互換的に使用する。組換え発現ベクターは、挿入の発現及び／または伝播の目的で、またはその他の組換えヌクレオチド配列の構築のために通常は作製される。当該核酸は、プロモーター配列に操作可能に連結されても、されなくても良く及びＤＮＡ調節配列に操作可能に連結されても、されなくても良い。
細胞は、外因性のＤＮＡ、例えば、組換え発現ベクターにより、そのようなＤＮＡが、細胞内へ導入された場合に、「遺伝子的に改変され」または「形質転換され」または「遺伝子導入され」ている。その外因性ＤＮＡの存在は、恒久的なまたは一時的な遺伝子変化をもたらす。その形質転換ＤＮＡは、その細胞のゲノムと一体化されて（共有的に連結されて）いてもまたはいなくても良い。
例えば、原核生物、酵母、哺乳類細胞において、当該形質転換ＤＮＡは、プラスミドなどのエピソーム因子上に保持されて良い。真核細胞に対しては、当該形質転換ＤＮＡが、染色体と一体化し、そのため染色体の複製を通して娘細胞により継承されるので、安定な形質転換細胞である。この安定性は、当該形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団を含む、細胞株またはクローンを確立するその真核細胞の能力により示される。「クローン」は、単一細胞または細胞分裂により共通の祖先から誘導された細胞の集団である。「細胞株」は、多世代にわたりインビトロで安定的に増殖できる初期細胞のクローンである。
遺伝子改変の適切な方法（「形質転換」も参照）には、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、遺伝子導入（トランスフェクション）、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在トランスフェクション、ＤＥＡＥ‐デキストラン介在トランスフェクション、リポソーム介在トランスフェクション、粒子ガン技術、ダイレクト・マイクロインジェクション、ナノ粒子介在核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）などを含む。
遺伝子改変法の選択は一般的に、形質転換する細胞の型及びその形質転換が行われる環境（例えば、インビトロ、エクスビボ、インビボ）に依存する。これら方法の一般論議は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９５、に見出せる。
本明細書で使用する「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）、または単細胞実体としてインキュベートされた、多細胞の有機体由来の細胞（例えば、細胞株）を意味し、その真核または原核細胞は、核酸に対する受容体として使用でき、または使用されており、及びその核酸により形質転換された起源細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、自然に、偶発的に、または意図的な突然変異のために、形態においてまたは遺伝子的にまたはその起源細胞と相補的なトータルＤＮＡにおいて、完全に同一である必要はない。「組換え宿主細胞」（また「遺伝子的に改変された宿主細胞」と呼ばれる）は、異種核酸、例えば、発現ベクターを導入された宿主細胞である。例えば、細菌宿主細胞は、外因性核酸（例えば、プラスミドまたは組換え発現ベクター）が適切な細菌宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に改変された細菌宿主細胞であり、及び真核宿主細胞は、外因性核酸が適切な真核宿主細胞に導入されたために、遺伝子的に改変された真核宿主細胞（例えば、哺乳類生殖細胞）である。
本明細書で使用する「標的ＤＮＡ」は、「標的部位」または「標的配列」を含むＤＮＡポリヌクレオチドである。用語「標的部位」、「標的配列」、「標的プロトスペーサーＤＮＡ」または「プロトスペーサー様配列」は、結合の存在に適切な条件を与えている、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントが結合しているだろう場所に対応する、標的ＤＮＡに存在する核酸配列を指して、本明細書では互換的に使用する。例えば、標的ＤＮＡ内の標的部位（または標的配列）である５’−ＧＡＧＣＡＴＡＴＣ−３’は、当該ＲＮＡ配列の５’−ＧＡＵＡＵＧＣＵＣ−３’により標的化される（または結合される、またはハイブリダイゼーションされる、または相補的である）。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合の条件には、通常細胞に存在する生理学的な条件を含む。その他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合の条件（例えば、無細胞システムにおける条件）が、当技術分野において公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｓｕｐｒａを参照。当該ガイドＲＮＡと相補的な及びハイブリダイズする標的ＤＮＡ鎖は、「相補鎖」と呼ばれ、及びその「相補鎖」に相補的な標的ＤＮＡの鎖（及びそれゆえに、当該ガイドＲＮＡには相補的でない）は、「不相補鎖」または「非相補鎖」と呼ばれる。「部位配向性改変ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位配向性ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位配向性改変ポリペプチド」または「部位配向性ポリペプチド」により、ＲＮＡを結合するポリペプチドを意味し及び特定のＤＮＡ配列を標的にする。本明細書に記述する部位配向性改変ポリペプチドは、当該ＲＮＡ分子が、そこに結合することにより特定のＤＮＡ配列を標的にする。当該ＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ内の標的配列に結合し、ハイブリダイズし、または相補的になり、したがって、その標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定場所へ結合するポリペプチドを標的化する、配列を含む。本発明の例示的な標的配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１に提示される。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−９７３は、ヒトＣＣＲ５遺伝子におけるＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７４−１０７８は、ヒトＣＣＲ５遺伝子におけるＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１０７９−１２２２は、ヒトＣＣＲ５遺伝子のエクソンにおけるＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２３−１３１２は、ヒトＣＣＲ５遺伝子のエクソンにおけるＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１３−１３４８は、ヒトＣＣＲ５遺伝子の５’末端周辺のＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４９−１３７１は、ヒトＣＣＲ５遺伝子の５’末端周辺のＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７２−１４１５は、ヒトＣＣＲ５遺伝子におけるデルタ３２遺伝子座周辺のＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１６−１４４３は、ヒトＣＣＲ５遺伝子におけるデルタ３２遺伝子座周辺のＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４４−１９００は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０１−２１６２は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子におけるＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６３−２４８２は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子のエクソンにおけるＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８３−２６６６は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子のエクソンにおけるＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６７−２６８６は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の５’末端周辺におけるＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡに対応した、プロトスペーサー様標的配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６８７−２７０１は、ヒトＢＣＬ１１Ａ遺伝子の５’末端周辺におけるＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡに対応した、プロトスペーサー様配列５’である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１に提示される配列に、少なくとも８０％同一である標的配列がまた、考えられる。
「開裂」により、ＤＮＡ分子の共有バックボーンの破壊を意味する。開裂は、非限定的に、リン酸ジエステル結合の酵素によるまたは化学的な加水分解を含む、多様な方法により開始できる。一本鎖開裂及び二本鎖開裂の両方が可能であり、及び二本鎖開裂は、２つの異なる一本鎖開裂事象の結果から、起こすことができる。ＤＮＡ開裂は、平滑末端または付着末端の生成をもたらすことができる。特定の実施形態において、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む複合体を、標的二本鎖ＤＮＡ開裂に使用する。
「ヌクレアーゼ」及び「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡ開裂に対するエンドヌクレアーゼ触媒活性を保有する酵素の意味で、本明細書においては互換的に使用する。
ヌクレアーゼの「開裂ドメイン」または「活性ドメイン」または「ヌクレアーゼドメイン」により、ＤＮＡ開裂に対する触媒活性を保有するヌクレアーゼ内のポリペプチド配列またはドメインを意味する。開裂ドメインは、単鎖ポリペプチドに含まれ得て、または開裂活性は、２つ（またはそれ以上）のポリペプチドの会合によりもたらすことができる。単一ヌクレアーゼドメインは、目的のポリペプチド内の、単離された１つ以上のアミノ酸の長さから成って良い。
「部位配向性ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位配向性ポリペプチド」並びに「ＲＮＡ結合部位配向性ポリペプチド」により、ＲＮＡを結合し及び特定のＤＮＡ配列に対して標的化されているポリペプチドを意味する。本明細書に記述する部位配向性ポリペプチドは、当該ＲＮＡ分子が結合する場所により特定のＤＮＡ配列に対して標的化される。当該ＲＮＡ分子は、当該標的ＤＮＡ内の標的配列に対して相補的な配列を含み、したがって、その標的ＤＮＡ（標的配列）内の特定場所に結合ポリペプチドを標的化する。
部位配向性改変ポリペプチドを結合し及びそのポリペプチドを、当該ＤＮＡ内の特定の場所に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書では、「ガイドＲＮＡ」または「ガイドＲＮＡポリヌクレオチド」を指す（また、ここでは「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」を指す）。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的化セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含む。「セグメント」により、分子のセグメント／セクション／領域、例えば、ＲＮＡにおけるヌクレオチドの連続した長さを意味する。セグメントはまた、複合体の領域／セクションを意味し、そのためセグメントは、１つ以上の分子領域を含んでよい。例えば、いくつかのケースにおいて、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント（後述）は、１つのＲＮＡ分子であり及びそれらのタンパク質結合セグメントは、そのＲＮＡ分子の領域を含む。その他のケースにおいて、ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント（後述）は、相補的な領域に沿ってハイブリダイゼイズされた２つの別々の分子を含む。非限定的な例示として、２つの別々の分子を含むガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、（ｉ）長さが１００塩基対の第一ＲＮＡ分子の４０−７５の塩基対、及び（ｉｉ）長さが５０塩基対の第二ＲＮＡ分子の１０−２５の塩基対を含むことができる。特定の文脈において特別に定義されない限り、「セグメント」の定義は、トータルの塩基対の特定の数に限定されず、対象のＲＮＡ分子の塩基対のいずれの特定数にも限定されず、複合体内の個別分子の特定の数に限定されず、及びいずれの全長のＲＮＡ分子の領域を含んで良く、そしてその他の分子と相補的である領域を含んでいても、いなくとも良い。
当該ＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、本明細書における「プロトスペーサー様配列」に指定された標的ＤＮＡ（その標的ＤＮＡの相補鎖）内の、特定の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。当該タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」は、部位配向性の改変ポリペプチドと相互作用する。その部位配向性の改変ポリペプチドが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチド（より詳細は以下に記述）である場合、当該標的ＤＮＡの部位配向性開裂が、（ｉ）当該ガイドＲＮＡと当該標的ＤＮＡ間の塩基対の相補性、及び（ｉｉ）当該標的ＤＮＡのショートモチーフ（当該標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ））の両方により決定された場所で起きる。
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的に、互いに、ＲＮＡの二重らせんＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）をつくるようにハイブリダイズしている、ヌクレオチドの２つの相補的長さを含む。
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、部位配向性ポリペプチドをコードする核酸など）は、付加する望ましい特性（例えば、改変されたまたは調節された安定性、細胞内標的、トラッキング、例えば、蛍光標識、タンパク質またはタンパク質複合体に対応した結合部位など）を与える改変または配列を含む。非限定例として、５’キャップ構造（例えば、７−メチルグアニレートキャップ構造（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリＡテール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節された接近性を許容するため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、当該ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変または配列、トラッキング（例えば、蛍光分子の直接抱合、蛍光の検出を促進するモイエティーの抱合、蛍光検出を可能にする配列など）に備える改変または配列、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチル基転移酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、などを含むＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を与える改変または配列、及びそれらの組み合わせ、を含む。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、上述のいずれの特性にも対応して備える５’または３’末端のいずれかにおいて、追加セグメントを含むことができる。例えば、適切な第三のセグメントには、５’キャップ構造（例えば、７−メチルグアニレートキャップ構造（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリＡテール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節された接近性を許容するため）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖（すなわち、ヘアピン）を形成する配列、当該ＲＮＡを、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する配列、トラッキング（例えば、蛍光分子の直接抱合、蛍光の検出を促進するモイエティーの抱合、蛍光検出を可能にする配列など）に備える改変または配列、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチル基転移酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストン・アセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素、などを含むＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を与える改変または配列、及びそれらの組み合わせ、を含むことができる。
ガイドＲＮＡ及び部位配向性の改変ポリペプチド（すなわち、部位配向性ポリペプチド）は、複合体（すなわち、非共有相互作用を介した結合）を形成する。そのガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、その複合体に標的特異性を与える。その複合体の部位配向性の改変ポリペプチドは、部位に特異的な活性を与える。換言すると、当該部位配向性の改変ポリペプチドは、そのガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントに関連した効力により、標的ＤＮＡ配列（例えば、染色体核酸中の標的配列、染色体外核酸、例えば、エピソーム核酸、小環などにおける標的配列、ミトコンドリア核酸中の標的配列、葉緑体核酸中の標的配列、プラスミド中の標的配列）にガイドされる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、二つの個別のＲＮＡ分子（ＲＮＡポリヌクレオチド：「活性化因子ＲＮＡ」及び「標的選択性ＲＮＡ」、以下を参照）を含み及び、本明細書では、「二重分子ガイドＲＮＡ」または「２分子ガイドＲＮＡ」と呼ぶ。その他の実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、単一のＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり及び本明細書では、「単分子ガイドＲＮＡ」または「単一ガイドＲＮＡ」、または「ｓｇＲＮＡ」と呼ぶ。用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、二重分子ガイドＲＮＡ及び単分子ガイドＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の両方を含み、指す。
二重分子ガイドＲＮＡは、二つの個別のＲＮＡ分子（「標的選択性ＲＮＡ」及び「活性化因子ＲＮＡ」）を含む。二重分子ガイドＲＮＡの２つのＲＮＡ分子の各々は、互いに相補的であり、そのため２つのＲＮＡ分子の相補的ヌクレオチドが、そのタンパク質結合セグメントの二重らせんＲＮＡ二本鎖を作るようにハイブリダイズする、ヌクレオチドの長さを含む。
例示的な２分子ガイドＲＮＡには、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「標的選択性ＲＮＡ」）分子（ＣＲＩＳＰＲリピート部またはＣＲＩＳＰＲリピート様配列を含む）及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡ様分子（標的選択性ＲＮＡ）は、当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及び当該ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖の半分を形成するヌクレオチドの長さ（「二本鎖形成セグメント」）の両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子（活性化因子ＲＮＡ）は、当該ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖のその他の半分を形成するヌクレオチドの長さ（「二本鎖形成セグメント」）を含む。換言すると、ｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの長さは、当該ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二本鎖を作るｔｒａｃｒＲＮＡ様分子のヌクレオチドの長さと相補的であり及びハイブリダイズする。したがって、各ｃｒＲＮＡ様分子は、対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を有する、と言うことができる。当該ｃｒＲＮＡ様分子はさらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントを与える。したがって、ｃｒＲＮＡ様分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ様分子は（対応ペアーとして）、ガイドＲＮＡを作るようにハイブリダイズする。二重分子ガイドＲＮＡは、任意の対応するｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡペアーを含むことができる。
２分子ガイドＲＮＡは、活性化因子ＲＮＡを伴う標的選択性ＲＮＡの制御された（すなわち、条件付きの）結合ができるように設計できる。なぜなら、２分子ガイドＲＮＡは、その活性化因子ＲＮＡと標的選択性ＲＮＡの両方が、Ｃａｓ９と共に機能性複合体に結合されないかぎり、機能的ではなく、２分子ガイドＲＮＡは、その活性化因子ＲＮＡと標的選択性ＲＮＡの間を誘導可能な結合状態にすることにより、誘導可能に（例えば、薬剤による誘導可能に）できる。１つの非限定的な例示として、ＲＮＡアプタマーは、当該標的選択性ＲＮＡと活性化因子ＲＮＡの結合を調節する（すなわち、制御する）ために使用できる。したがって、当該活性化因子ＲＮＡ及び／または標的選択性ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマー配列を含むことができる。
単分子ガイドＲＮＡは、互いに相補的である２つのヌクレオチド（標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡ）の長さを含み、共有結合を成し（直接的に、またはヌクレオイチドの介在により）、及びそのタンパク質結合セグメントの二重らせんＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を作るようにハイブリダイゼーションを成し、したがってステムループ構造をもたらす。当該標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡは、その標的選択性ＲＮＡの３’末端とその活性化因子ＲＮＡの５’末端により共有結合できる。あるいは、標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡは、その標的選択性ＲＮＡの５’末端とその活性化因子ＲＮＡの３’末端により共有結合できる。
例示的な単分子ガイドＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ二本鎖を作るようにハイブリダイズするヌクレオイチドの２つの相補的な長さを含む。いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的長さの１つが、少なくとも８つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、補足表Ｓ５に提示される活性化因子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の１つに、少なくとも約６０％同一である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオイチドの２つの相補的長さの１つが、隣接する少なくとも８つの、隣接する少なくとも９つの、隣接する少なくとも１０つの、隣接する少なくとも１１つの、隣接する少なくとも１２つの、隣接する少なくとも１３つの、隣接する少なくとも１４つの、または隣接する少なくとも１５つのヌクレオチドの長さにわたり、補足表Ｓ５に提示される活性化因子ＲＮＡの１つに、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡの１つの、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である。ヌクレオチド配列の一連のパーセントの同一性及び一連の長さは、オプションとして設定されており、ヌクレオチド配列のパーセント同一性と長さ（例えば、８、９、１０、１２、１３、１４、１５ヌクレオチド）の各々及び全ての組み合わせが意図されていることは理解されよう。
いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的長さの１つが、少なくとも８の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、補足表Ｓ５に明記される標的選択性ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート部）配列の１つに、少なくとも約６０％同一である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的長さの１つが、隣接する少なくとも８、隣接する少なくとも９、隣接する少なくとも１０、隣接する少なくとも１１、隣接する少なくとも１２、隣接する少なくとも１３、隣接する少なくとも１４、または隣接する少なくとも１５のヌクレオチドの長さにわたり、補足表Ｓ５に提示されるｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート部配列の１つに、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、または１００％同一である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部配列の１つの、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでも良い。ヌクレオチド配列の一連のパーセント同一性及び一連の長さは、オプションとして設定されており、ヌクレオチド配列のパーセント同一性と長さ（例えば、８、９、１０、１２、１３、１４、１５ヌクレオチド）の各及び全ての組み合わせが意図されていることは理解されよう。
用語「活性化因子ＲＮＡ」は、二重分子ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ様分子を意味するとして、本明細書では使用する。用語「標的選択性ＲＮＡ」は、二重分子ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ様分子を意味するとして、本明細書では使用する。用語「二本鎖形成セグメント」は、対応する活性化因子ＲＮＡまたは標的選択性ＲＮＡの分子のヌクレオチドの長さにハイブリダイズにより当該ｄｓＲＮＡ二本鎖の形成に寄与する、活性化因子ＲＮＡまたは標的選択性ＲＮＡのヌクレオチドの長さを意味するとして、本明細書では使用する。換言すれば、活性化因子ＲＮＡは、対応する標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントと相補的な二本鎖形成セグメントを含む。または、活性化因子ＲＮＡは、二本鎖形成セグメントを含む一方、標的選択性ＲＮＡは、二本鎖形成セグメント及び当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントの両方を含む。したがって、二重分子ガイドＲＮＡは、任意の対応する活性化因子ＲＮＡ及び標的選択性ＲＮＡのペアーを含むことができる。
当技術分野では公知のＲＮＡアプタマーは、一般的にはリボスイッチの合成型である。用語「ＲＮＡアプタマー」及び「リボスイッチ」は、互いに一部であるＲＮＡ分子の構造（及びそれゆえに特定配列の利用性）の誘導調節に備える、合成及び天然の両核酸を網羅するとして、本明細書では使用する。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の構造（例えば、ヘアピン）に折り込まれる配列を含み、特定の薬剤（例えば、小分子）を特異的に結合する。当該薬剤の結合は、ＲＮＡの折り込み構造に変化を起こし、そのアプタマーが一部である核酸の特性を変化させる。非限定的な例示として、（ｉ）アプタマーを伴う活性化因子ＲＮＡは、そのアプタマーが、適切な薬剤に結合されるまでは、同種の標的選択性ＲＮＡに結合できなくて良く、（ｉｉ）アプタマーを伴う標的選択性ＲＮＡは、そのアプタマーが、適切な薬剤に結合されるまでは、同種の活性化因子ＲＮＡに結合できなくて良く、及び（ｉｉｉ）異なる薬剤を結合する異なるアプタマーを含む、標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡは互いに、両薬剤が存在する限り、互いに結合できなくて良い。これらの例示に説明の通り、２分子ガイドＲＮＡは、誘導的に設計できる。
アプタマー及びリボスイッチの例示は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ｍａｙ；１７（５）：３４４−６４、Ｖａｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１２ Ｍａｙ；８（３）：３７１−８２、Ｃｉｔａｒｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１２ Ａｐｒ １５；３４（１）：１−１１、及びＬｉｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．２０１２ Ｍａｙ−Ｊｕｎ；３（３）：３６９−８４に見出され、それらのすべては、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
用語「幹細胞」は、自己再生し及び分化した細胞型（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２８７−２９８を参照）を産生する両能力を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指し、本明細書で使用する。細胞の個体発生の文脈においては、形容詞「分化した」、または「分化している」は、相対的な用語である。「分化した細胞」は、その細胞と比較して、発達経路がさらに進化した細胞である。したがって、多能性幹細胞（後述）は、血統制限前駆細胞（例えば、胚葉幹細胞）に分化でき、次々と、さらに制限された細胞（例えば、ニューロン前駆細胞）に分化でき、最終段階の細胞（すなわち、神経細胞、心筋細胞などの終末分化細胞）に分化でき、特定の組織型における特徴的な役割を果たし、及びさらに増殖する能力を保持していても、していなくても良い。幹細胞は、特定マーカーの存在（例えば、タンパク質、ＲＮＡなど）及び特定マーカーの欠失の両方により特徴づけられて良い。幹細胞はまた、インビトロ内及びインビボの両方の機能アッセイ、特に、複数の分化した子孫を増加させる幹細胞の能力に関連したアッセイにより同定されて良い。
関心のある幹細胞には、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含む。用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、生命体の全ての細胞型を産生することができる幹細胞を意味して、本明細書で使用する。したがって、ＰＳＣは、生命体の全ての胚層の細胞（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の増加をもたらすことができる。多能性細胞は、奇形種の形成及び生きている生命体の外胚葉、中胚葉、または内胚葉への寄与が可能である。植物の多能性幹細胞は、その植物の全ての細胞型（例えば、根、幹、葉などの細胞）の増加をもたらすことができる。
動物のＰＳＣは、多数の異なる方法で誘導できる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の内部細胞塊から派生し（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８ Ｎｏｖ ６；２８２（５３９１）：１１４５−７）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞から派生する（Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ，Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１−７２、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ．ａｌ，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１−９、Ｙｕ ｅｔ．ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７ Ｄｅｃ ２１；３１８（５８５８）：１９１７−２０．Ｅｐｕｂ ２００７ Ｎｏｖ ２０）。用語ＰＳＣは、その由来に関係なく多能性幹細胞を指すので、用語ＰＳＣは、用語ＥＳＣ及びｉＰＳＣ、同時に、ＰＳＣの他の例である、用語の胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）をも包含する。ＰＳＣは、確立された細胞株の形態で良く、１次胚組織から直接取得して良く、または体細胞から誘導して良い。ＰＳＣは、本明細書に記述する方法の標的細胞であり得る。
「胚性幹細胞」（ＥＳＣ）により、胚から、通常は胚盤胞の内部細胞塊から単離されたＰＳＣを意味する。ＥＳＣ株は、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）のヒト胚性幹細胞レジストリにリスト化されており、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）、ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、及び Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））である。関心のある幹細胞にはまた、アカゲザル（Ｒｈ）幹細胞及びマーモセット幹細胞などの、その他の霊長類由来の胚性幹細胞を含む。当該幹細胞は、任意の哺乳類、例えば、ヒト、馬、牛、豚、犬、猫、齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類などから取得して良い（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９２：７８４４、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。培養において、ＥＳＣは、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、及びＳＳＥＡ−１ではないアルカリホスファターゼを発現する。ＥＳＣを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、ＵＳ７，０２９，９１３、ＵＳ５，８４３，７８０及びＵＳ６，２００，８０６に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。未分化形態のｈＥＳＣを増殖する方法は、ＷＯ ９９／２０７４１、ＷＯ ０１／５１６１６、及びＷＯ ０３／０２０９２０に記述されている。「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」とは、生殖細胞及び／または生殖細胞前駆細胞、例えば、始原生殖細胞、すなわち精子及び卵になる細胞から派生したＰＳＣを意味する。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上述の胚性幹細胞に似た性質を持つと考えられる。ＥＧを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、ＵＳ７，１５３，６８４、Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｃｅｌｌ ７０：８４１、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１１３、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１３７２６、及びＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２２：１２３５に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。
「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣではない細胞から（すなわち、ＰＳＣに対して相対的に分化した細胞から）派生したＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣは、終末分化細胞を含む、複数の異なる細胞型から誘導できる。ｉＰＳＣは、ＥＳ様形態を有し、大きな核−細胞質比を持つフラットコロニーとして成長し、境界及び突出した核小体として定義される。さらに、ｉＰＳＣは、非限定的に、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａｌ、ＴＥＲＴ、及びｚｆｐ４２を含む、当業者には公知の１つ以上の主要な多能性マーカーを発現する。ｉＰＳＣを産生し及び特徴づける方法の例示は、例えば、アメリカ公開特許番号ＵＳ２００９００４７２６３、ＵＳ２００９００６８７４２、ＵＳ２００９０１９１１５９、ＵＳ２００９０２２７０３２、ＵＳ２００９０２４６８７５、及びＵＳ２００９０３０４６４６に見出され、本開示は、参照としてそれらを援用し、本明細書に組み入れる。一般的に、ｉＰＳＣを産生するためには、多能性幹細胞になる体細胞を再プログラム化するために、当技術分野では公知の再プログラム化因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８）が与えられる。
「体細胞」とは、実験操作なしの条件下で、通常は、生命体の全ての細胞型の増加をもたらさない生命体の任意の細胞を意味する。換言すると、体細胞は、３つの全ての胚葉体、すなわち外胚葉、中胚葉、内胚葉の細胞を、自然には産生しない十分に分化した細胞である。例えば、体細胞は、神経細胞及び神経前駆細胞の両方を含み、中枢神経系の全てのまたはいくつかの細胞型を自然に増加させることができる後者はしかし、胚葉及び内胚葉系統の細胞の増加をもたらすことができない。
「分裂細胞」により、細胞が分裂を起こすことを意味する。分裂は、真核細胞が、その核の中の染色体を、２つの別々の核の中の、２つの同じセットに分割することによるプロセスである。一般的には、細胞質分裂が即座に続き、核、細胞質、細胞小器官及び細胞膜を、これらの細胞成分のほぼ等しい振り分を含むように２つの細胞中に分割する。
「ポスト分裂細胞」とは、分裂が終了した、すなわち、「静止した」、すわなち、もはや分裂しない細胞を意味する。この静止状態は、一時的で、すなわち可逆的であって良く、または恒久的であって良い。
「減数分裂細胞」とは、減数分裂が行われている細胞を意味する。減数分裂は、細胞が、配偶子または胞子を産生する目的で、その核物質を分割することによるプロセスである。細胞分裂とは異なり、減数分裂においては、当該染色体が、染色体間の遺伝物質をシャッフルで組換えるステップを取る。さらに、分裂から生み出される２つの（遺伝的には同じ）２倍体細胞と比較して、減数分裂の結果、４つの（遺伝的には独特な）半数体細胞になる。
「組換え」とは、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換プロセスを意味する。本明細書で使用する、「相同配向性修復（ＨＤＲ）」は、例えば、細胞の二重らせん破壊の修復中に行われる特別形態のＤＮＡ修復を指す。このプロセスは、配列が相同のヌクレオチドを必要とし、「標的」分子（すなわち、二重らせん破壊を経験した分子）のテンプレート修復に対応した「ドナー」分子を使用し、及びそのドナーから標的への遺伝情報伝達に導く。相同配向性修復は、その標的分子の配列の変更（例えば、挿入、欠損、変異）をもたらし、仮にそのドナーポリヌクレオチドが、その標的分子と異なる場合、そのドナーポリヌクレオチドの一部または全ての配列が、その標的ＤＮＡに組み込まれる。いくつかの実施形態において、当該ドナーポリヌクレオチド、当該ドナーポリヌクレオチドの一部、当該ドナーポリヌクレオチドの複製、または当該ドナーポリヌクレオチドの複製の一部は、その標的ＤＮＡに統合される。
「非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）」により、相同テンプレートの必要性がなく、破壊末端を互いに直接連結することにより、ＤＮＡの二重らせん破壊を修復することを意味する（修復をガイドするために相同配列が必要な、相同配向性修復とは対照をなす）。ＮＨＥＪはしばしば、その二重らせん破壊部分の近くのヌクレオチド配列の欠損（削除）をもたらす。
用語「治療」、「治療する」などは、一般に望ましい薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味して、本明細書で使用する。その効果とは、疾患またはそれらの症状を完全にまたは部分的に防ぐ観点からの予防のためであって良く、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する悪影響を部分的にまたは完全に治す観点からの治療のためであって良い。本明細書で使用する「治療」は、哺乳類における疾患または症状の任意の治療を対象とし、及び（ａ）その疾患または症状をもたらす傾向があるが、しかし未だそれを引き起こしたとして診断されていない対象者に起こる疾患または症状を予防すること、（ｂ）その疾患または症状を抑制すること、すなわち、その促進を抑止すること、（ｃ）その疾患を緩和すること、すなわち、その疾患の回復の原因を探ることを含む。当該治療薬は、疾患または傷害の発症前、その間またはその後に投与されて良い。当該治療が、患者の望ましくない臨床的症状を安定化させまたは軽減する場合の、進行中の疾患の治療は、特に興味深い治療である。そのような治療は、影響を受ける細胞の機能が完全に失われる前に、望ましくは行われる。当該治療は、その疾患の症候性段階の間に、及びいくつかのケースにおいては、その疾患の症候性段階の後で、望ましくは投与される。
用語「個人」「対象者」「宿主」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用し、及び診断を受ける、治療を受ける、または治療が望まれる任意の哺乳類対象者、特にヒトを指す。
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９９）、Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９７）、及びＣｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ １９９８）などの、標準的な教科書に見出され、その開示物を参照によりそれらを援用し、本明細書に組み入れる。
値に範囲が与えられる場合、その文脈が明確に指示しない限り下限単位の１０分の１までの各中間値、その範囲の上限と下限の間及びその提示された範囲における任意のその他の指示値または中間値が、本発明内に包含されることは理解されよう。これらのより狭い範囲の上下限は、独立してそのより狭い範囲に含まれて良く、及びその提示された範囲における特定の除外制限に依存して、本発明内にまた包含される。その提示された範囲が、１つのまたは両方の制限を含む場合、制限を含むそれらのいずれかをまたは両方を除外した範囲もまた、本発明に含まれる。
フレーズ「から本質的に成る」は、特異的に活性な成分またはシステムの複数成分ではない任意の成分、または特異的に活性な部分または分子の複数部分ではない任意の部分を除外することを、本明細書では意味する。
ある特定の範囲は、用語「約」が頭についている数値で本明細書に提示される。用語「約」は、それが頭につく正確な数字を文字通り支持し、同時にその用語がつく数字に近いかまたはおおよそその数字であることを与えるとして、本明細書で使用する。ある数字が、特に記載された数字に近いかまたはおおよそその数字であるかを決定するには、その近くのまたはおおよその記載されていない数字が、それが存在する文脈において、その特に記載された数字に本質的に等価である数字であれば良い。
わかりやすくするために、別々の実施形態の文脈において記述される本発明の特定の特性が、単一の実施形態において組み合わせて与えられて良いことは、受け入れられよう。あるいは、簡素にするために、単一の実施形態の文脈において記述される本発明の多様な特性が、別々にまたは任意の適切な二次的な組み合わせで与えられても良い。本発明に関わる実施形態の全ての組み合わせを、本発明により特別に受け入れ、及びあたかも各及び全ての実施形態が、独立して及び明確に開示されているかのように、本明細書に開示する。さらに、多様な実施形態及びそれらの要素の全ての二次的組み合わせをまた、本発明により特別に受け入れ、及びあたかも各及び全ての二次的組み合わせが、独立して及び明確に開示されているかのように、本明細書に開示する。
本開示の態様−パートＩ
核酸
ガイドＲＮＡ
本開示は、関連ポリペプチド（例えば、部位配向性改変ポリペプチド）を標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に向かわせるガイドＲＮＡを提供する。ガイドＲＮＡは、第一セグメント（本明細書ではまた、「ＤＮＡ標的化セグメント」または「ＤＮＡ標的化配列」を指す）及び第二セグメント（本明細書ではまた、「タンパク質結合セグメント」または「タンパク質結合配列」を指す）を含む。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントには、標的ＤＮＡの配列に相補的であるヌクレオチド配列を含む。換言すると、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介した配列特異的方法により、標的ＤＮＡと相互作用する。または、当該ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、当該ガイドＲＮＡ及び当該標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を、変化させ及び決定して良い。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の、任意の望ましい配列にハイブリダイズするように改変（例えば、遺伝子工学により）できる。
当該ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該ＤＮＡ標的化セグメントは、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約３０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約２５ｎｔまでの、約１２ｎｔから約２０ｎｔまでの、または約１２ｎｔから約１９ｎｔまでの長さを有することができる。例えば、当該ＤＮＡ標的化セグメントは、約１９ｎｔから約２０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約２５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約３０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約３５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約４５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約６０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約７０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約８０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約９０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約１００ｎｔまでの、約２０ｎｔから約２５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約３０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約３５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約４０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約４５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約５０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約６０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約７０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約８０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約９０ｎｔまでの、または約２０ｎｔから約１００ｎｔまでの長さを有することができる。当該標的ＤＮＡのヌクレオチド配列（標的配列）に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（当該ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。例えば、当該標的ＤＮＡの標的配列に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、少なくとも約１２ｎｔの、少なくとも約１５ｎｔの、少なくとも約１８ｎｔの、少なくとも約１９ｎｔの、少なくとも約２０ｎｔの、少なくとも約２５ｎｔの、少なくとも約３０ｎｔの、少なくとも約３５ｎｔの、または少なくとも約４０ｎｔの長さを有することができる。例えば、当該標的ＤＮＡの標的配列に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、約１２ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約４５ｎｔまでの、約１２ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約３５ｎｔまでの、約１２ｎｔから約３０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約２５ｎｔまでの、約１２ｎｔから約２０ｎｔまでの、約１２ｎｔから約１９ｎｔまでの、約１９ｎｔから約２０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約２５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約３０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約３５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約４５ｎｔまでの、約１９ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１９ｎｔから約６０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約２５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約３０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約３５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約４０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約４５ｎｔまでの、約２０ｎｔから約５０ｎｔまでの、または約２０ｎｔから約６０ｎｔまでの長さを有することができる。当該標的ＤＮＡの標的配列に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列（当該ＤＮＡ標的化配列）は、少なくとも約１２ｎｔの長さを有することができる。
いくつかのケースにおいて、当該標的ＤＮＡの標的配列に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、２０ヌクレオチドの長さである。いくつかのケースにおいて、当該標的ＤＮＡの標的配列に相補的である当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列は、１６ヌクレオチドの、１７ヌクレオチドの、１８ヌクレオチドのまたは１９ヌクレオチドの長さである。
当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と当該標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント同一性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）である。例えば、当該ＤＮＡ標的化配列は、当該標的配列の、約１０の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１１の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１２の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１３の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１４の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１５の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１６の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一、または約１７の隣接するヌクレオチド対して少なくとも約８０％同一であって良い。いくつかのケースにおいて、当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と当該標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、最も５’寄りの７つの隣接するヌクレオチドにわたり１００％である。いくつかのケースにおいて、当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と当該標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント同一性は、約２０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも６０％である。いくつかのケースにおいて、当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と当該標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、最も５’寄りの１４の隣接するヌクレオチドにわたり１００％であり、及びその他のヌクレオチドに対しては可能な限り０％である。そのようなケースの場合、当該ＤＮＡ標的化配列は、１４ヌクレオチドの長さであると考えることができる。いくつかのケースにおいて、当該ＤＮＡ標的化セグメントのＤＮＡ標的化配列と当該標的ＤＮＡの標的配列の間のパーセント同一性は、その標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の、最も５’寄りの７つの隣接するヌクレオチドにわたり１００％であり、及びその他のヌクレオチドに対しては可能な限り０％である。そのようなケースの場合、当該ＤＮＡ標的化配列は、７ヌクレオチドの長さであると考えることができる。
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部位特異的な改変ポリペプチドと相互作用する。当該ガイドＲＮＡは、前述のＤＮＡ標的化セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特異的な核酸配列に、その結合されたポリペプチドを導く。ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的である２つのヌクレオチドの長さを含む。そのタンパク質結合セグメントの相補的なヌクレオチドは、ハイブリダイズして二重らせんＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。
二重分子ガイドＲＮＡは、２つの別々のＲＮＡ分子を含む。二重分子ガイドＲＮＡの２つのＲＮＡ分子のそれぞれは、互いに相補的であるヌクレオチドの長さを含み、そのためその２つのＲＮＡ分子の相補的なヌクレオチドは、そのタンパク質結合セグメントの二重らせんＲＮＡ二本鎖を形成するためにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態において、当該活性化因子ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、補足表Ｓ５に提示される当該活性化因子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つに、少なくとも約６０％同一であるか、または少なくとも８つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらに相補的である。例えば、当該活性化因子ＲＮＡの二本鎖形成セグメント（または当該活性化因子ＲＮＡの二本鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、補足表Ｓ５に提示される当該ｔｒａｃｒＲＮＡの１つに、少なくとも約６０％同一である、少なくとも約６５％同一である、少なくとも約７０％同一である、少なくとも約７５％同一である、少なくとも約８０％同一である、少なくとも約８５％同一である、少なくとも約９０％同一である、少なくとも約９５％同一である、少なくとも約９８％同一である、少なくとも約９９％同一である、もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８つの隣接する長さにわたり、少なくとも９つの隣接する長さにわたり、少なくとも１０の隣接する長さにわたり、少なくとも１１の隣接する長さにわたり、少なくとも１２の隣接する長さにわたり、少なくとも１３の隣接する長さにわたり、少なくとも１４の隣接する長さにわたり、もしくは少なくとも１５の隣接する長さにわたり、それらに相補的である。例えば、当該活性化因子ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示される当該ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つに、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでよい。
いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、補足表Ｓ５に提示される標的選択性ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート部）の１つに、少なくとも約６０％同一であるか、または少なくとも８つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメント（または当該標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントをコードするＤＮＡ）は、補足表Ｓ５に提示されるｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート部の１つに、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一もしくは１００％同一であるか、または、少なくとも８つの隣接する、少なくとも９つの隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該標的選択性ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部配列の１つに、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１３の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１４の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１５の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１６の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、または少なくとも１７の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列を含む。
２分子ガイドＲＮＡは、標的選択性ＲＮＡと活性化因子ＲＮＡの制御された（すなわち、条件付きの）結合ができるように設計できる。２分子ガイドＲＮＡは、当該活性化因子ＲＮＡ及び当該標的選択性ＲＮＡが、Ｃａｓ９と共に、機能性複合体に結合されるまでは、機能的ではないので、２分子ガイドＲＮＡを、その活性化因子ＲＮＡ及び標的選択性ＲＮＡを誘導可能に結合させることにより、誘導可能（例えば、薬剤の誘導が可能）にできる。非限定的な一例として、当該活性化因子ＲＮＡと当該標的選択性ＲＮＡとの結合を調節する（すなわち、制御する）ために、ＲＮＡアプタマーを使用できる。したがって、当該活性化因子ＲＮＡ及び／または当該標的選択性ＲＮＡは、ＲＮＡアプタマーを含み得る。
ＲＮＡアプタマーは、当技術分野では公知であり及び一般には、リボスイッチの合成型である。一部分を成すＲＮＡ分子の構造（及びそれゆえに特異的配列の利用能）の誘導調節を提供する、合成及び天然の両核酸配列を包含するために、用語「ＲＮＡアプタマー」及び「リボスイッチ」を、本明細書では互換的に使用する。ＲＮＡアプタマーは通常、特定の薬剤（例えば、小分子）を特異的に結合する、特定の構造（例えば、ヘアピン）に折りたたむ配列を含む。そうした薬剤の結合は、当該ＲＮＡの折りたたみに変化をもたらし、そのアプタマーを一部とする核酸の特性を変化させる。非限定的な例示としての、（ｉ）当該アプタマーが、適切な薬剤により結合されるまでは、同種の標的選択性ＲＮＡに結合できないアプタマーを伴う活性化因子ＲＮＡ、（ｉｉ）当該アプタマーが、適切な薬剤により結合されるまでは、同種の活性化因子ＲＮＡに結合できないアプタマーを伴う標的選択性ＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）互いに異なる薬剤を結合した異なるアプタマーを含む、標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡは、両薬剤が存在する限り、互いに結合できなくて良い。これらの例示に説明の通り、２分子ガイドＲＮＡは、誘導可能に設計できる。
アプタマー及びリボスイッチの例示は、例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２０１２ Ｍａｙ，０７（５）：３４４−６４、Ｖａｖａｌｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１２ Ｍａｙ，８（３）：３７１−８２、Ｃｉｔａｒｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．２０１２ Ａｐｒ １５，３４（１）：１−１１、及びＬｉｂｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．２０１２ Ｍａｙ−Ｊｕｎ，３（３）：３６９−８４に見出せ、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
２分子ガイドＲＮＡに含むことができる核酸配列の非限定的な例示には、補足表Ｓ５に提示される配列、または補足表Ｓ５に提示される任意の配列とペアーとなる相補的配列、またはタンパク質結合セグメントを形成するためにハイブリダイズできる相補的配列のいずれかを含む。
単分子ガイドＲＮＡは、互いに相補的であり、共有結合をし（直接的に、または「リンカー」または「リンカーヌクレオチド」と称されるヌクレオチドの介在により）、及びそのタンパク質結合セグメントの二重らせんＲＮＡ二本鎖（ｄｓＲＮＡ二本鎖）を形成するために相補的に結合し、その結果、ステムループ構造をもたらす、ヌクレオチド（標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡ）の２つの長さを含む。当該標的選択性ＲＮＡ及び当該活性化因子ＲＮＡは、その標的選択性ＲＮＡの３’末端及びその活性化因子ＲＮＡの５’末端を介して共有結合できる。あるいは、標的選択性ＲＮＡ及び当該活性化因子ＲＮＡは、その標的選択性ＲＮＡの５’末端及びその活性化因子ＲＮＡの３’末端を介して共有結合できる。
単分子ガイドＲＮＡのリンカーは、約３ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該リンカーは、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約９０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約７０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約６０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約５０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約４０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約３０ｎｔまでの、約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約２０ｎｔまでの、または約３ヌクレオチド（ｎｔ）から約１０ｎｔまでの長さを有することができる。例えば、当該リンカーは、約３ｎｔから約５ｎｔまでの、約５ｎｔから約１０ｎｔまでの、約１０ｎｔから約１５ｎｔまでの、約１５ｎｔから約２０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約２５ｎｔまでの、約２５ｎｔから約３０ｎｔまでの、約３０ｎｔから約３５ｎｔまでの、約３５ｎｔから約４０ｎｔまでの、約４０ｎｔから約５０ｎｔまでの、約５０ｎｔから約６０ｎｔまでの、約６０ｎｔから約７０ｎｔまでの、約７０ｎｔから約８０ｎｔまでの、約８０ｎｔから約９０ｎｔまでの、または約９０ｎｔから約１００ｎｔまでの長さを有することができる。いくつかの実施形態において、単分子ガイドＲＮＡのリンカーは、４ｎｔである。
例示的な単分子ガイドＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチドの２つの相補的長さを含む。いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的な長さの１つが、補足表Ｓ５に提示される当該活性化因子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子の１つと、少なくとも約６０％同一であるか、または少なくとも８つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的な長さの１つが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つと、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８つの隣接する、少なくとも９つの隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、もしくは少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列の１つと、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的な長さの１つは、補足表Ｓ５に提示される当該標的選択性ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート）配列の１つと、少なくとも約６０％同一であるか、または少なくとも８つの隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡ（またはその長さをコードするＤＮＡ）のヌクレオチドの２つの相補的な長さの１つは、補足表Ｓ５に提示される当該標ｃｒＲＮＡ／ＣＲＩＳＰＲリピート配列の１つと、少なくとも約６５％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約７５％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、もしくは１００％同一であるか、または少なくとも８の隣接する、少なくとも９の隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、もしくはは少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、それらと相補的である。例えば、当該単分子ガイドＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示される当該ＣＲＩＳＰＲリピート配列の１つに、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一、または少なくとも約１３の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約８０％同一、または少なくとも約１４の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約８０％同一、または少なくとも約１５の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約８０％同一、または少なくとも約１６の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約８０％同一、または少なくとも約１７の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも約８０％同一であるヌクレオチドを含んで良い。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの、適切な自然発生の同種ペアーは、適切な同種ペアーの決定に際し、（当該タンパク質結合領域のｄｓＲＮＡ二本鎖に対する）その種名及び塩基対を考慮して慣例的に決定できる。非同種ペアもまた、本発明での利用に検討される。非同種ペアのいくつかの実施形態において、各ＲＮＡは、本明細書おけるＣａｓ９クラスター由来であり、ここでそのＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、それらのアミノ酸配列の８０％にわたり８０％の同一性を共有する。
自然発生のｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡに対し、非常に低い同一性（おおよそ５０％同一、あるいはタンパク質全長の約５０％にわたり約７０％の同一）を共有する人工的な配列は、当該ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメインの構造が保存されている限り、Ｃａｓ９と共に機能して標的ＤＮＡを開裂する。したがって、自然発生のＤＮＡ標的化ＲＮＡのタンパク質結合ドメインのＲＮＡ折りたたみ構造は、（２分子または単分子型のいずれかの）人工的なタンパク質結合ドメインの設計のために考慮される。いずれかからの任意の自然発生ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡペアの構造は、当業者により容易に作り出せるので、人工的なＤＮＡ標的化ＲＮＡは、対象の種に対する天然構造を、その種由来のＣａｓ９（または近縁のＣａｓ９）を使用して、模倣的に設計できる。したがって、適切なガイドＲＮＡは、自然発生ガイドＲＮＡのタンパク質結合ドメイン構造を模倣して設計されたタンパク質結合ドメインを含む、人工的に設計されたＲＮＡ（非自然発生の）であり得る。
当該タンパク質結合セグメントは、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約３０ｎｔまでの、または約１５ｎｔから約２５ｎｔまでの長さを有することができる。
また、単分子ガイドＲＮＡ及び二重分子ガイドＲＮＡの両方に関して、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６塩基対（ｂｐ）から約５０ｂｐまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約６ｂｐから約４０ｂｐまでの、約６ｂｐから約３０ｂｐまでの、約６ｂｐから約２５ｂｐまでの、約６ｂｐから約２０ｂｐまでの、約６ｂｐから約１５ｂｐまでの、約８ｂｐから約４０ｂｐまでの、約８ｂｐから約３０ｂｐまでの、約８ｂｐから約２５ｂｐまでの、約８ｂｐから約２０ｂｐまでの、または約８ｂｐから約１５ｂｐまでの長さを有することができる。例えば、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、約８ｂｐから約１０ｂｐまでの、約１０ｂｐから約１５ｂｐまでの、約１５ｂｐから約１８ｂｐまでの、約１８ｂｐから約２０ｂｐまでの、約２０ｂｐから約２５ｂｐまでの、約２５ｂｐから約３０ｂｐまでの、約３０ｂｐから約３５ｂｐまでの、約３５ｂｐから約４０ｂｐまでの、または約４０ｂｐから約５０ｂｐまでの長さを有することができる。いくつかの実施形態において、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖は、３６塩基対の長さを有する。当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、少なくとも約６０％であり得る。例えば、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であり得る。いくつかのケースにおいて、当該タンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するためにハイブリダイズするヌクレオチド配列間のパーセント相補性は、１００％である。
部位配向性改変ポリペプチド
ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドは、複合体を形成する。当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ（前述）の配列と相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、その複合体に標的特異性を与える。当該部位配向性改変ポリペプチドは、少なくともそのガイドＲＮＡ（前述）のタンパク質結合セグメントとの関連のために、ＤＮＡ配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、小環状配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）へ導かれる。
部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（例えば、標的ＤＮＡの開裂またはメチル化）及び／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）を改変する。部位配向性改変ポリペプチドはまた、「部位配向性ポリペプチド」または「ＲＮＡ結合部位配向性改変ポリペプチド」と、本明細書では呼ぶ。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、自然発生の改変ポリペプチドである。その他のケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、自然発生の改変ポリペプチド（例えば、以下で討議するキメラポリペプチドまたは、例えば、突然変異、欠損、挿入で改変された自然発生のポリペプチド）ではない。
自然発生の部位配向性改変ポリペプチドは、ガイドＲＮＡを結合し、そのため標的ＤＮＡ内の特定配列へ配向し、及び二重らせん切断を生み出すため、その標的ＤＮＡを開裂する。例示的な自然発生のＣａｓ９部位配向性改変ポリペプチドオーソログのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示される。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に提示される。部位配向性改変ポリペプチドは、ＲＮＡ結合部及び活性部の２つの部位を含む。いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部、ここで当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び（ｉｉ）部位配向性の酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化に対する活性、ＤＮＡ開裂に対する活性、ヒストンのアセチル化に対する活性、ヒストンのメチル化に対する活性など）を示す活性部を含み、ここでその酵素活性部位は、当該ガイドＲＮＡにより決定される。
その他の実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部、ここで当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列と相補的なヌクレオチド配列を含み、及び（ｉｉ）その標的ＤＮＡ内で転写を調節（例えば、転写を促進するまたは抑制する）する活性部を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節調節の部位は、当該ガイドＲＮＡにより決定される。
いくつかのケースにおいて、部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活動、スーパーオキシドジスムターゼ活性、アルキル化活動、脱プリン反応活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性またはグリコシラーゼ活性）を有する。
その他のケースにおいて、部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。
例示的な部位配向性改変ポリペプチド
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００として提示される任意のアミノ酸配列に相当する部位に、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
核酸の改変
いくつかの実施形態において、新しいまたは強化された性質（例えば、改善された安定性）を持つ核酸を提供するために、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、１つ以上の改変、例えば、塩基修飾、主鎖修飾などを含む。当技術分野では公知であるが、ヌクレオシドは、塩基―糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常は複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の、最も一般的な２つの分類は、プリンとプリミジンである。ヌクレオチドは、そのヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含む、ヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドに対して、そのリン酸基は、その糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部位に結合され得る。オリゴヌクレオチドの形成において、当該リン酸基は、互いに直鎖状のポリマー化合物を形成するために、隣接するヌクレオシドに共有結合する。次に、この直鎖状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、環状化合物を、しかしながら直鎖状化合物が一般には適切であるが、形成するためにさらに結合できる。さらに、直鎖状化合物は、ヌクレオチド内部の塩基相補性を有し、及び完全なまたは部分的な二本鎖化合物を生じるように、折りたたまれて良い。オリゴヌクレオチド内においては、当該リン酸基は通常、そのオリゴヌクレオチドの内部ヌクレオシド主鎖の形成を指す。通常のＲＮＡ及びＤＮＡの結合または主鎖は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。
改変された主鎖及び改変されたヌクレオシド間結合
改変を含む適切な核酸の例示には、改変された主鎖または人工のヌクレオシド間結合を含有する核酸を含む。改変された主鎖を有する核酸は、その主鎖中にリン原子を保持するもの及びその主鎖中にリン原子を保持しないものを含む。
そこにリン原子を含む、適切に改変されたオリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸トリエステル、アミノアルキルリン酸トリエステル、３’−アルキレンホスホン酸塩、５’−アルキレンホスホン酸塩及びキラルホスホン酸塩を含む、メチル及びその他のアルキルホスホン酸塩、ホスフィン酸塩、３１アミノホスホロアミド酸及びアミノアルキルホスホロアミド酸を含むホスホロアミド酸、ホスホロジアミド酸、チオノホスホロアミド酸、チオノアルキルホスホン酸塩、チオノアルキルリン酸トリエステル、セレノリン酸、及び１つ以上のヌクレオチド間結合が、３’から３’、５’から５’または２’から２’の結合である、正常３’−５’結合を有するボラノリン酸塩、それらの２’−５’結合類似体、及び反転極性を有するもの、を含む。反転極性を有する適切なオリゴヌクレオチドには、最も３’寄りのヌクレオチド間結合における単一の３’から３’の結合、すなわち（その核酸塩基が存在しないかまたはそれらの場所にヒドロキシル基を有する）塩基である単一の反転ヌクレオシド残基を含む。多様な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩及び遊離酸形体もまた、含まれる。
いくつかの実施形態において、核酸は、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子のヌクレオシド間結合、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（ メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ主鎖として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここで天然のホスホジエステル内部ヌクレオチド結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−で表される）を含む。ＭＭＩ型のヌクレオシド間結合は、先に参照のＵＳ５，４８９，６７７に開示される。適切なアミドヌクレオシド間結合は、ＵＳ５，６０２，２４０に開示される。
また、例えば、ＵＳ５，０３４，５０６に開示される、モルホリノ主鎖構造を有する核酸も適切である。例えば、いくつかの実施形態において、核酸は、リボース環の代わりに６員環のモルモリノ環を含む。いくつかのこれらの実施形態において、ホスホロジアミド酸またはその他の非ホスホジエステルのヌクレオシド間結合でホスホジエステル結合を置換する。
そこにリン原子を含まない適切な改変ポリヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環式のヌクレオシド間結合により形成される、主鎖である。これらは、シロキサンの主鎖、硫化物、スルホキシド及びスルホンの主鎖、ホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖、メチレンのホルムアセチル及びチオホルムアセチルの主鎖、リボアセチルの主鎖、アルケン含有の主鎖、スルファミン酸の主鎖、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノの主鎖、スルホン酸及びスルホン酸アミドの主鎖、アミドの主鎖、及びＮ、０、Ｓ及びＣＨ２の混合部分を有するその他の主鎖などの、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分の一部に形成される）を有するものを含む。
模倣体
核酸は、核酸の模倣体であり得る。ポリヌクレオチドに適用される用語「模倣体」には、ポリヌクレオチドを含むことを意図しており、ここでフラノース環だけ、またはフラノース環とヌクレオチド間結合の両方が、非フラノース基と置き換えられ、フラノース環だけの置き換えはまた、当技術分野では糖代替（ｓｕｇａｒ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）と呼ばれる。複素環式塩基部分または改変複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために保持される。１つのそのような核酸、優れたハイブリダイゼーションの特性を持つことが示されたポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡにおいて、ポリペプチドの糖主鎖は、アミドを含有する主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖と置き換えられる。そのヌクレオチドは、その主鎖のアミド部位のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合され、及び保持される。
優れたハイブリダイゼーション特性を持つと報告されているポリヌクレオチド模倣体の１つが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物における主鎖には、アミド含有主鎖にＰＮＡを与える、２つ以上のアミノエチルグリシンのユニットが結合する。この複素環式塩基部分は、その主鎖のアミド部位のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製調製を記述した代表的な米国特許には、ＵＳ５，５３９，０８２、ＵＳ５，７１４，３３１、及びＵＳ５，７１９，２６２が含まれるが、これらに限定されない。
これまで研究されたポリヌクレオチド模倣体の別の分類は、モリホリノ環に結合した複素環式塩基を有する結合モルホリノユニット（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホリノ核酸におけるモルホリノ単量体ユニットを結合する多数の結合基が、報告されている。非イオン性オリゴマー化合物を与えるために、結合基の１分類が選ばれている。非イオン性モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞内タンパク質と望ましくない相互作用をする可能性は低い。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、細胞内タンパク質と望ましくない相互作用をする可能性が低い、オリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３４５１０）。モルホリノベースのポリヌクレオチドは、ＵＳ５，０３４，５０６に開示される。ポリヌクレオチドのモルホリノ分類内の多様な化合物は、そのモノマーサブユニットに繋がる多様な異なる結合基を有するように、調製調製される。
ポリヌクレオチド模倣体のさらなる分類を、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と呼ぶ。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環は、シクロヘキセニル環と入れ替わる。ＣｅＮＡ ＤＭＴ保護されたホスホラミダイトモノマーは、以下の古典的なホスホラミダイトの化学作用に従うオリゴマー化合物合成を利用して調製されている。完全改変のＣｅＮＡオリゴマー化合物及びＣｅＮＡで改変された特定の部位を有するオリゴヌクレオチドが、調製され及び研究されている（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５８６０２を参照）。一般的に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性を増加させる。ＲＮＡ及びＤＮＡと複合体を形成するＣｅＮＡオリゴアデニル酸は、その天然の複合体と同様の安定性を補う。天然の核酸構造へのＣｅＮＡ構造の組み込みの研究は、構造適応が容易に進むことを、ＮＭＲ及び円偏光二色性分析により示した。
さらなる改変には、その２’ヒドロキシル基が、糖環の４’炭素原子に結合し、そのために２’−Ｃ，４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、そして二環式糖部分を形成する、ロック核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ））を含む。この結合は、ｎが１または２である、２’酸素原子と４’炭素原子のブリッジを形成するメチレン（−ＣＨ２−）基であり得る（Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、ＤＮＡ及びＲＮＡと相補的な二本鎖の非常に高い熱安定性（Ｔｍ＝＋３から＋１０℃）、３’エキソヌクレアーゼ分解に向かう安定性及び良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含む強力かつ無毒のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、開示されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
当該ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルの、それらのオリゴマー重合に従った合成及び調製、ならびに核酸認識特性が開示されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びそれらの調製はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６に記述される。
改変された糖部分
核酸はまた、１つ以上の置換された糖部分を含むことができる。適切なポリヌクレオチドには、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選ばれる糖置換基を含み、ここで、当該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、Ｃ１からＣ１０アルキルまたはＣ２からＣ１０アルケニル及びアルキニルに置換されて良い。特に適切なものは、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２であり、ここで、ｎ及びｍは、１から約１０である。その他の適切なポリヌクレオチドには、Ｃ１からＣ１０の低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性改善のための基、または、オリゴヌクレオチドの薬力学的特性改善のための基、及び同様の性質を有するその他置換基から選ばれる、糖置換基を含む。適切な改変には、−２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｙ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６−５０４）すなわち、アルコキシアルコキシ基として知られる、２’−メトキシエトキシ２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３を含む。さらなる適切な改変には、２’−ＤＭＡＯＥとして知られ、本明細書の以下の例示に記述される、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとして、当技術分野ではまた公知の）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
その他の適切な糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−Ｏ−−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）を含む。２’糖置換基は、アラビノ位（上部）またはリボ位（下部）にあって良い。適切な２’−アラビノ改変は、２’−Ｆである。同様の改変はまた、オリゴマー化合物の別の位置においてなされて良く、特に３’末端ヌクレオシド上の糖の３’位またはオリゴヌクレオチドに結合する２’−５’及び５’末端ヌクレオチドの５’位においてなされて良い。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖に代わるシクロブチル部分などの、糖模倣体を有して良い。
塩基修飾及び置換
核酸はまた、核酸塩基（当技術分野ではしばしば、単純に「塩基」と呼ぶ）の修飾または置換を含んでよい。本明細書で使用する、「非修飾の」または「天然の」核酸塩基は、プリン塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）とピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）を含む。修飾された核酸塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及びその他アルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及びその他アルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシンそしてその他アルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（疑似ウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及びその他８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及びその他５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−脱アザグアニン及び７−脱アザアデニン、及び３−脱アザグアニンそして３−脱アザアデニンなどの、その他の合成及び天然核酸塩基を含む。さらなる修飾核酸塩基には、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環系ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンズオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３’，２’：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）などのＧ−クランプを含む。
複素環式塩基部分はまた、そのプリンまたはピリミジン塩基が、その他の複素環で置き換えられる場所において、例えば、７−脱アザアデニン、７−脱アザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンを含んで良い。さらに核酸塩基は、ＵＳ３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３により開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３により開示されるものを含む。これら核酸塩基のあるものは、オリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有用である。これらには、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン及びＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を、０．６−１．２℃まで増加することが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）及び例えば２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾を組み合わされた場合には、適切な塩基置換である。
「相補性」は、自然または人工的に生じる（例えば、前述のように修飾された）塩基（ヌクレオシド）またはそれらの類似体を含む２つの配列間での、塩基スタッキング及び特定の水素結合を介した、ペアーを組む能力を指す。例えば、核酸の１つの位置における塩基は、標的の対応する位置における塩基と水素結合する能力があり、そのためその塩基は、その位置で互いに相補的であると考えられる。核酸は、ユニバーサル塩基、または水素結合の位置を与えないまたは不活性な脱塩基のスペーサーを含む。塩基対は、正規のワトソン・クリック型塩基対及び非ワトソン・クリック型塩基（例えば、ウォッブル塩基対及びフーグスティーン塩基対）の両方を含んで良い。相補的塩基対として、アデノシン型塩基（Ａ）は、チミジン型塩基（Ｔ）またはウラシル型塩基（Ｕ）と相補的であり、シトシン型塩基（Ｃ）は、グアノシン型塩基（Ｇ）と相補的であり、及び３−ニトロピロールまたは５−ニトロインドールなどのユニバーサル塩基は、Ａ、Ｃ、Ｕ，またはＴのいずれとも相補的に結合できると考えられることは理解されよう。 Ｎｉｃｈｏｌｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４；３６９：４９２−４９３ ａｎｄ Ｌｏａｋｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９４；２２：４０３９−４０４３。当技術分野では、イノシン（Ｉ）もまたユニバーサル塩基であると考えられ、及びＡ、Ｃ、Ｕ，またはＴのいずれともハイブリダイズする。Ｗａｔｋｉｎｓ ａｎｄ ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００５；３３（１９）：６２５８−６２６７を参照。
共役体
可能な他の核酸の改変には、ポリヌクレオチドの１つまたは多数の部分との、またはオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布または細胞内への取り込みを高める共役体との化学的な結合を含む。これらの部分または共役体には、第一級または第二級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合した共役体を含めることができる。共役基にはまた、非限定的に、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を強化する基、オリゴマーの薬物動態学的特性を高める基を含む。適切な共役基には、非限定的に、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、蛍光色素、ローダミン、クマリン、及び染料を含む。薬力学的特性を強化する基には、取り込み量を向上させる、抗分解性を高める、及び／または標的核酸と配列特異の相補的結合を強化する基を含む。薬物動態学的特性を高める基には、核酸の取り込み、分布、代謝または排泄を改善する基を含む。
共役部分には、非限定的に、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールまたはウンデシル基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘクサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホン酸塩（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタンカルボン酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレスレロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）などの、脂質部分を含む。
共役体には、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞貫通ペプチドとしても知られる）を含み、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二重層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、または小胞膜を横断することを促す有機または無機の化合物を指して良い。別の分子に結合したＰＴＤは、小さな極性分子から大きなマクロ分子及び／またはナノ粒子までの範囲であり得て、例えば分子を、細胞外空間から細胞内空間を通り、細胞質から細胞小器官内に行き、膜を通過するように促す。いくつか実施形態において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、部位選択性改変ポリペプチド）のアミノ末端に共有結合する。いくつか実施形態において、ＰＴＤは、外因性ポリペプチド（例えば、部位配向性改変ポリペプチド）のカルボキシル末端に共有結合する。いくつか実施形態において、ＰＴＤは、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、部位配向性改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）に共有結合する。例示的なＰＴＤには、非限定的に、最小限のウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（相応するＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲを含むＨＩＶ−１ ＴＡＴの４７−５７残基）、細胞に入るのに十分な多数のアルギニンを含むポリアルギニン配列（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０−５０のアルギニン）、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２（７）：１７３２−１７３７）、切り捨てられたヒト・カルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２１：１２４８−１２５６）、ポリリシン（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３００３−１３００８）、ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ、トランスポート＝ＧＷＴＬＮＳＡＧＹＬＬＧＫＩＮＬＫＡＬＡＡＬＡＫＫＩＬ、ＫＡＬＡＷＥＡＫＬＡＫＡＬＡＫＡＬＡＫＨＬＡＫＡＬＡＫＡＬＫＣＥＡ、及びＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含む。例示的なＰＴＤには、非限定的に、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、３アルギニン残基から５０アルギニン残基までのアルギニンホモポリマーを含む。例示的なＰＴＤドメインのアミノ酸配列には、非限定的に、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ、ＲＫＫＲＲＱＲＲ、ＹＡＲＡＡＡＲＱＡＲＡ、ＴＨＲＬＰＲＲＲＲＲＲ及びＧＧＲＲＡＲＲＲＲＲＲのいずれかを含む。いくつかの実施形態において、当該ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、開裂リンカーを介して一致するポアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に結合したポリカチオンＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、その正味電荷をほぼゼロまで減らし及びそのため細胞への接着及び取り込みを阻害する。当該リンカーの開裂により、そのポリアニオンが遊離し、当該ポリアルギニン及び固有の接着性が局所的に非マスキングされ、したがって膜を横断するように当該ＡＣＰＰを「活性化」する。
例示的なガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、２つの個別ＲＮＡポリヌクレオチド分子を含む。その２つの個別ＲＮＡポリヌクレオチド分子の第一分子（活性化因子ＲＮＡ）は、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の任意の１つ、またはそれらの補体に対し、少なくとも８の隣接する、少なくとも９の隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、少なくとも約６０％の、少なくとも約６５％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または１００％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。その２つの個別ＲＮＡポリヌクレオチド分子の第二分子（標的選択性ＲＮＡ）は、補足表Ｓ５に提示される同種ＣＲＩＳＰＲリピート部のヌクレオチド配列、またはそれらの補体に対し、少なくとも８の隣接する、少なくとも９の隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、少なくとも約６０％の、少なくとも約６５％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または１００％のヌクレオチドの配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、適切なガイドＲＮＡは、単分子ガイドＲＮＡポリヌクレオチドであり、及び補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列の任意の１つに対し、少なくとも８つの隣接する、少なくとも９つの隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、少なくとも約６０％の、少なくとも約６５％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または１００％のヌクレオチドの配列同一性を有する第一ヌクレオチド配列、及び補足表Ｓ５に提示される同種ＣＲＩＳＰＲリピート部のヌクレオチド配列、またはそれらの補体に対し、少なくとも８つの隣接する、少なくとも９つの隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、少なくとも約６０％の、少なくとも約６５％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または１００％のヌクレオチドの配列同一性を有する第二ヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及びそれらに相補的なタンパク質結合セグメントを含み、ここで、そのタンパク質結合セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、またはそのタンパク質結合セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０ヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、または補足表Ｓ５に提示される当該ｔｒａｃｒＲＮＡヌクレオチド配列の任意の１つに対して、少なくとも８つの隣接する、少なくとも９つの隣接する、少なくとも１０の隣接する、少なくとも１１の隣接する、少なくとも１２の隣接する、少なくとも１３の隣接する、少なくとも１４の隣接する、または少なくとも１５の隣接するヌクレオチドの長さにわたり、少なくとも約６０％の、少なくとも約６５％の、少なくとも約７０％の、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または１００％のヌクレオチドの配列同一性を有するｔｒａｃｒＲＮＡを含む。例えば、当該タンパク質結合セグメントは、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、少なくとも１０の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、少なくとも１１の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一である、少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも７０％同一である、または少なくとも１２の隣接するヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。
いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡは、ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含み、ここで、そのタンパク質結合セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、またはそのタンパク質結合セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０ヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該タンパク質結合セグメントは、そのタンパク質結合セグメントのｔｒａｃｒＲＮＡと同種であるＣＲＩＳＰＲリピート部である、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該ＤＮＡ標的化セグメントは、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、カンピロバクタージェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるそれと同種のＣＲＩＳＰＲリピート部であり、及びそのＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は、カンピロバクタージェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるそれと同種のＣＲＩＳＰＲリピート部に各々、少なくとも８０％同一であり、及びそのＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該単分子ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列とハイブリダイズする配列を含む。
いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドＲＮＡは、標的化ＲＮＡ及びそれらに相補的な活性化因子ＲＮＡを含み、ここでその活性化因子ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、またはここでその活性化因子ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０ヌクレオチドにわたり少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドＲＮＡは、改変された主鎖、非天然ヌクレオシド間結合、核酸の模倣体、改変糖部分、塩基修飾、改変または調節された安定性を提供する改変または配列、細胞内トラッキングを提供する改変または配列、トラッキングを提供する改変または配列、またはタンパク質またはタンパク質複合体の結合部位を提供する改変または配列を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡは、当該活性化因子ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡと同種のＣＲＩＳＰＲリピート部である、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む。いくつかの実施形態において、当該標的選択性ＲＮＡは、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は各々、カンピロバクタージェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるそれと同種のＣＲＩＳＰＲリピート部であり、及びそのＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部は、カンピロバクタージェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるそれと同種のＣＲＩＳＰＲリピート部に各々、少なくとも８０％同一であり、及びそのＰＡＭ配列は、ＮＮＮＮＡＣＡである。いくつかの実施形態において、当該二重分子ガイドＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−２７０１の１つに提示されるプロトスペーサー様配列とハイブリダイズする配列を含む。
ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸
本開示は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡコード核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターである。
いくつかの実施形態において、方法は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸の、標的ＤＮＡへの接触または細胞（または細胞集団）への導入に関与する。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む細胞は、生体内である。いくつかの実施形態において標的ＤＮＡを含む細胞は、試験管内である。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここでガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、当該組換え発現ベクターは、ウイルスコンストラクト、例えば、組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクト（例えばＵＳ７，０７８，３８７号を参照）、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクト、組換えレトロウイルスコンストラクト、などである。
適切な発現ベクターには、非限定的に、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ ９４／１２６４９、ＷＯ ９３／０３７６９、ＷＯ ９３／１９１９１、ＷＯ ９４／２８９３８、ＷＯ ９５／１１９８４及びＷＯ ９５／００６５５を参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイの肉腫のウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトルウイルス由来のベクター）など）を含む。
多数の適切な発現ベクターが、当業者に知られており、及び多くは、商業的に入手可能である。真核生物の宿主細胞に対しては、例えば、次のベクター、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が、例示として与えられる。しかしながら、その宿主細胞と互換性がある限り、その他の任意のベクターが使用されて良い。利用する宿主／ベクター系に応じて、構造性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなど含む、多数の適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用されて良い（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照）。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに操作を加えて結合できる。その転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて、機能的であって良い。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、原核及び真核の両細胞において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする多重制御エレメントに、操作を加えて結合できる。
非限定的な、適切な真核プロモーター（真核細胞に機能的なプロモーター）の例示には、前初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ、初期と後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来のロング末端リピート部（ＬＴＲ）、及びマウスのメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者のレベル内で行って良い。当該発現ベクターはまた、翻訳開始および転写ターミネーターに対するリボソーム結合部位を含んで良い。当該発現ベクターはまた、増幅発現に対する適切な配列を含んで良い。当該発現ベクターはまた、その部位配向性改変ポリペプチドと融合し、したがってキメラポリペプチドをもたらすタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、緑色蛍光タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列を含んでよい。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに、操作を加えて結合される。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構造性プロモーターに、操作を加えて結合される。
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当技術分野では公知であり、及び任意の公知の方法が、核酸（例えば、発現コンストラクト）の細胞への導入に使用できる。適切な方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、共役結合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、カルシウムリン酸塩沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガン法、直接マイクロ注入、ナノ粒子媒介の核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）などを含む。
キメラポリペプチド
本開示は、キメラ部位配向性改変ポリペプチドを提供する。キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（前述）と相互作用（例えば、結合）する。当該ガイドＲＮＡは、そのキメラ部位配向性改変ポリペプチドを、標的ＤＮＡ内の標的配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、小環配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列など）へと導く。キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの開裂またはメチル化）及び／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）を改変する。
キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（標的ＤＮＡの開裂またはメチル化）及び／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）を改変する。キメラ部位配向性改変ポリペプチドはまた、本明細書では、「キメラ部位配向性ポリペプチド」または「キメラＲＮＡ結合部位配向性改変ポリペプチド」と呼ぶ。
キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、ＲＮＡ結合部及び活性化部の２つの部分を含む。キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、少なくとも２つの異なるポリペプチド由来のアミノ酸配列を含む。キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、改変及び／または自然発生ポリペプチド配列（例えば、改変または非改変Ｃａｓ９タンパク質由来の第一アミノ酸配列、及びそのＣａｓ９タンパク質以外の第二アミノ酸配列）を含むことができる。
ＲＮＡ結合タンパク質
いくつかのケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドのＲＮＡ結合部位は、自然発生ポリペプチドである。その他のケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドのＲＮＡ結合部位は、自然発生ポリペプチドではない（例えば、突然変異、欠損、挿入で改変された）。関心のある自然発生ＲＮＡ結合タンパク質は、当技術分野では公知の部位配向性改変ポリペプチド由来である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００は、部位配向性改変ポリペプチドとして使用可能な、自然発生のＣａｓ９エンドヌクレアーゼの非限定的なセットを与える。いくつかのケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドのＲＮＡ結合タンパク質は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００に提示されるポリペプチドのＲＮＡ結合タンパク質と、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の７−１６６及び／または７３１−１００３のアミノ酸、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００に提示されるアミノ酸配列のいずれかにおける相当する部分に、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
活性部分
当該ＲＮＡ結合タンパク質に加えて、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、「活性部分」を含む。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、自然発生の部位配向性改変ポリペプチドの活性部分（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）である。その他の実施形態において、対象となるキメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、自然発生の部位配向性改変ポリペプチドの活性部分の改変アミノ酸配列（例えば、置換、欠損、挿入）を含む。関心のある自然発生の活性部分は、当技術分野では公知の部位配向性改変ポリペプチド由来である。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００は、部位配向性改変ポリペプチドとして使用可能な、自然発生のＣａｓ９エンドヌクレアーゼの非限定的なセットである。キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、変化し、及び本明細書に開示される方法に有用である、任意の異種ポリペプチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の７−１６６のアミノ酸に少なくとも９０％同一、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の７３１−１００３のアミノ酸に少なくとも９０％同一である、Ｃａｓ９オーソログ（非限定的に、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００の１つに提示されるＣａｓ９オーソログを含む）の一部分を含む。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでそのガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、及び（ｉｉ）部位配向性酵素活性を示す活性部分（例えば、ＤＮＡメチル化に対する活性、ＤＮＡ開裂に対する活性、ヒストンのアセチル化に対する活性、ヒストンのメチル化に対する活性、など）、ここで、その酵素活性の部位は、当該ガイドＲＮＡにより決定される部位を含む。
その他の実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、（ｉ）ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、ここでそのガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と相補的であるヌクレオチド配列を含み、及び（ｉｉ）その標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分（例えば、転写を促進するまたは抑える）、ここで、その標的ＤＮＡ内の調節された転写部位は、当該ガイドＲＮＡにより決定される部位を含む。
いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、標的ＤＮＡを改変する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチル転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン反応活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ阻害活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する。
その他のケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、標的ＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性（例えば、メチル転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する。
いくつかのケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、酵素活性（前述）を示す。その他のケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、標的ＤＮＡ（前述）の転写を調節する。キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、変動的であり、及び本明細書に開示される方法に有用である、任意の異種ポリペプチド配列を含んでよい。
例示的なキメラ部位配向性改変ポリペプチド
いくつかの実施形態において、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００などの、本明細書に記述のＣａｓ９オーソログのいずれかの改変形態を含む、Ｃａｓ９タンパク質の改変形態を含む。いくつかの例示において、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態には、自然発生のＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ活性を低減させるアミノ酸の変化（例えば、欠損、挿入、または置換）を含む。例えば、いくつかの例示において、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態は、対応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。いくつかのケースにおいて、当該Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を有しない。
いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態は、当該標的ＤＮＡの相補鎖を開裂でき、しかし当該標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂する能力を低減させる、Ｄ１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸位１０におけるアスパラギン酸からアラニン）の突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００に存在するいずれかのタンパク質の相応する突然変異）である。いくつかのケースにおいて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＣａｓ９ポリペプチドの改変形態は、当該標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂でき、しかし当該標的ＤＮＡの相補鎖を開裂する能力を低減させる、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位８４０におけるヒスチジンからアラニン）の突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００として提示されるいずれかのタンパク質の相応する突然変異）である。いくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＣａｓ９ポリペプチドの改変形態は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００として提示されるいずれかのタンパク質の相応する突然変異）の両方を抱え、そのためそのポリペプチドは、当該標的ＤＮＡの相補及び非相補鎖の両方を開裂する能力を低減する。その他の残基は、前述の効果（すなわち、ヌクレアーゼ部分のどちらか一方を不活性化する）を達成するために、突然変異を起こすことができる。非限定的な例示として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９残基である、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＤ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００として提示されるいずれかのタンパク質の相応する突然変異）は、変更（すなわち置換）できる。アラニン置換以外の突然変異をも意図している。
いくつかの実施形態において、改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における化膿レンサ球菌Ｃａｓ９突然変異のＥ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相応する、１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、当該改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはさらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における化膿レンサ球菌Ｃａｓ９突然変異のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｎ９８２ＡまたはＡ９８４Ａに相応する、１つ以上の突然変異を含む。例えば、当該改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における突然変異のＥ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相応する１つ以上の突然変異、及び／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における突然変異のＤ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｎ９８２ＡまたはＡ９８４Ａに相応する１つ以上の突然変異を含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００のいずれに対しても少なくとも約７５％の同一性を含んで良い。いくつかの実施形態において、そのような変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３の相応する領域に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％のまたは１００％のアミノ酸配列が同一である領域を含む。
いくつかのケースにおいて、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのアミノ酸配列における相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかのケースにおいて、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、表１に網羅される４モチーフのいずれかに、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのアミノ酸配列における相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する各アミノ酸配列を伴う、（表１に網羅される）４モチーフを含む。いくつかのケースにおいて、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのアミノ酸配列における相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、ＤＮＡ改変活性、及び／または転写因子活性、及び／またはＤＮＡ関連ポリペプチド改変活性を有する異種ポリペプチドを含む。いくつかのケースにおいて、異種ポリペプチドは、ヌクレアーゼ活性を与えるＣａｓ９ポリペプチドの部分を置き換える。その他の実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドは、通常はヌクレアーゼ活性を与えるＣａｓ９ポリペプチドの部分（及びその部分は、完全に活性であるかまたはその代わりに相応する野生型活性の１００％未満を有するように改変できる）及び異種ポリペプチドの、両方を含む。換言すれば、いくつかのケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、通常はヌクレアーゼ活性を与えるＣａｓ９ポリペプチドの部分と異種ポリペプチドの両方を含む、融合ポリペプチドである。その他のケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、そのＣａｓ９ポリペプチドの活性部分の改変された変異体（例えば、アミノ酸変更、欠損、挿入）と異種ポリペプチドとを含む、融合ポリペプチドである。さらに別のケースにおいて、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、異種ポリペプチドと自然発生のＲＮＡ結合部分または改変された部位配向性改変ポリペプチドとを含む融合ポリペプチドである。
例えば、キメラＣａｓ９タンパク質において、自然発生の（または改変の、例えば、突然変異、欠損、挿入）細菌Ｃａｓ９ポリペプチドは、異種ポリペプチド配列（すなわち、Ｃａｓ９以外のタンパク質由来のポリペプチド配列または別の生命体由来のポリペプチド配列）と融合されて良い。当該異種ポリペプチド配列は、当該キメラＣａｓ９タンパク質により示されるであろう活性（例えば、酵素活性）を示して良い（例えば、メチル基転移酵素活性、アセチル基転移酵素活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を作製するために、別の核酸配列に（例えば、遺伝子工学的に）結合されて良い。いくつかの実施形態において、キメラＣａｓ９ポリペプチドは、Ｃａｓ９ポリペプチド（例えば、野生型Ｃａｓ９またはＣａｓ９変異体、例えば、ヌクレアーゼ活性を低減させたまたは不活化したＣａｓ９）と細胞内局在化を提供する異種配列（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、小胞体保持シグナル、など）との融合により作製される。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、トラッキングまたは精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど、ＨＩＳタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなどの）を提供することができる。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、向上したまたは低下した安定性を提供することができる。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、結合ドメインを与えることができる（例えば、関心のある別のタンパク質、例えば、ＤＮＡまたはヒストン改変タンパク質、転写因子または転写リプレッサー、リクルートタンパク質などに、キメラＣａｓ９ポリペプチドを結合する能力を与えるために）。
キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸
本開示は、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターである。
いくつかの実施形態において、方法は、キメラ部位配向性改変ポリペプチドを含む１つ以上の核酸の、標的ＤＮＡとの接触または細胞（または細胞集団）への導入に関与する。キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここでキメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、当該組換え発現ベクターは、ウイルスコンストラクト、例えば、組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクト （例えば、ＵＳ７，０７８，３８７参照）、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクト、などである。
適切な発現ベクターには、非限定的に、ウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、 アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、 Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、 ＷＯ ９４／１２６４９、ＷＯ ９３／０３７６９、 ＷＯ ９３／１９１９１、 ＷＯ ９４／２８９３８、 ＷＯ ９５／１１９８４及びＷＯ ９５／００６５５を参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、 及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａ１．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、 Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイ肉腫のウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどの、レトロウイルス由来のベクター）、などを含む。
多数の適切な発現ベクターが、当業者には公知であり、及び多くは、商業的に入手可能である。真核宿主細胞に対しては、次のベクター、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が、例として与えられる。しかしながら、その宿主細胞に互換性がある限り、その他の任意のベクターが使用されて良い。
利用する宿主／ベクター系に応じて、構造性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含む、多数の適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用されて良い（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照）。
いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに操作を加えて結合できる。その転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて、機能的であって良い。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、原核及び真核の両細胞において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする複数の制御エレメントに、操作を加えて結合できる。
非限定的な、適切な真核プロモーター（真核細胞に機能的なプロモーター）の例示には、前初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）のチミジンキナーゼ、初期と後期のＳＶ４０、レトロウイルス由来のロング末端リピート部（ＬＴＲ）、及びマウスのメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は、当業者のレベル内で行って良い。当該発現ベクターはまた、翻訳開始および転写ターミネーターに対するリボソーム結合部位を含んで良い。当該発現ベクターはまた、増幅発現に対する適切な配列を含んで良い。当該発現ベクターはまた、当該キメラ部位配向性改変ポリペプチドと融合するタンパク質タグ（例えば、６ｘＨｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）をコードする、ヌクレオチド配列を含んでよい。
いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーター、など）に、操作を加えて結合される。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、空間制限及び／または一時制限プロモーター（例えば、組織特異プロモーター、細胞型特異的プロモーター、など）に、操作を加えて結合される。いくつかの実施形態において、キメラ部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、構造性プロモーターに、操作を加えて結合される。
核酸を宿主細胞に導入する方法が、当技術分野では公知であり、及び任意の公知の方法が、核酸（例えば、発現コンストラクト）の幹細胞または前駆細胞への導入に使用できる。適切な方法には、例えば、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、トランスフェクション、共役結合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、カルシウムリン酸塩沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、パーティクルガンの技術、直接マイクロ注入、ナノ粒子媒介の核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：５０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）などを含む。
方法
本開示は、標的ＤＮＡ及び／または標的ＤＮＡ関連ポリペプチドを改変する方法を提供する。一般的には、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む複合体（「標的化複合体」）を、標的ＤＮＡとの接触に導く方法である。
上記の、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドは、複合体を形成する。当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、その複合体に特異的な配列を与える。当該複合体の部位配向性改変ポリペプチドは、部位特異活性を与える。いくつかの実施形態において、複合体は、標的ＤＮＡを、例えば、ＤＮＡ開裂、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡ損傷、ＤＮＡ修復などへ導き、改変する。その他の実施形態において、複合体は、標的ＤＮＡ関連の標的ポリペプチド（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を、例えば、ヒストンのメチル化、ヒストンのアセチル化、ヒストンのユビキチン化などへ導き、改変する。当該標的ＤＮＡは、例えば、試験管内の裸のＤＮＡ、試験管内細胞の染色体ＤＮＡ、生体内細胞の染色体ＤＮＡなどであって良い。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、そのガイドＲＮＡ及びその標的ＤＮＡ間の相補性領域により定められる標的ＤＮＡ配列において、標的ＤＮＡを切断するヌクレアーゼ活性を示す。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドが、Ｃａｓ９またはＣａｓ９関連ポリペプチドである場合、その標的ＤＮＡの部位特異的な開裂は、（ｉ）当該ガイドＲＮＡと当該標的ＤＮＡ間の塩基対相補性、及び（ｉｉ）当該標的ＤＮＡのショートモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる］、の両方により決定される場所で起こる。いくつかの実施形態において（例えば、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９を使用する場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＸＧＧ−３’であり、ここでＸは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、及びＸは直接に、その標的ＤＮＡの非相補鎖の標的配列の３’である。したがって、その相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＹ−３’であり、ここでＹは、任意のＤＮＡヌクレオチドであり、及びＹは直接に、その標的ＤＮＡの相補鎖の標的配列の５’である（ここで非相補鎖のＰＡＭは、５’−ＧＧＧ−３’であり、及び相補鎖のＰＡＭは、５’−ＣＣＣ−３’である）。いくつかの、そのような実施形態において、Ｘ及びＹは、相補的であり得て及びＸ−Ｙ塩基対は、任意の塩基対であり得る（例えば、Ｘ＝Ｃ及びＹ＝Ｇ、Ｘ＝Ｇ及びＹ＝Ｃ、Ｘ＝ＡおよびＹ＝Ｔ、Ｘ＝Ｔ及びＹ＝Ａ）。
いくつかのケースにおいて、異なるＣａｓ９タンパク質（すなわち、多様な種からのＣａｓ９タンパク質）は、その異なるＣａｓ９タンパク質の多様な酵素特性を活用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列の選択性に対して、増加したまたは減少した酵素活性に対して、細胞毒性の増加したまたは減少したレベルに対して、ＮＨＥＪ、相同配向性修復、一本鎖切断、二本鎖切断、などの間のバランスの変更のために）、与えられた様々な方法に使用するのは有効であろう。
多様な種由来のＣａｓ９タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００を参照）は、その標的ＤＮＡにおいて、異なるＰＡＭ配列を必要として良い。したがって、特定のＣａｓ９タンパク質の選択に対して、当該ＰＡＭ配列の要求は、前述の５’−ＸＧＧ−３’以上に異なっていて良い。本開示は、例えば、カンピロバクタージェジュニのＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡ、パスツレラムルトシダのＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡまたはＮＮＮＮＣ、フランシセラノビシダのＰＡＭ配列ＮＧ、ストレプトコッカスサーモフィルス＊＊のＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡＷ、リステリアイノキュアのＰＡＭ配列ＮＧＧ、ストレプトコッカス・ディスガラクティエのＰＡＭ配列ＮＧＧを提供する。
例示的な方法は、以下を含むＣａｓ９オーソログの特徴の活用を提供する。
細胞中のＤＮＡを操作する方法は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体と当該ＤＮＡとの接触を含み、ここでその複合体は、（ａ）補足表Ｓ２のクラスター由来の第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼに対応する同種ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）高い開裂活性を保持したまま、その第一エンドヌクレアーゼと交換可能であり、及びその長さの８０％にわたり第一エンドヌクレアーゼと少なくとも８０％の同一性を共有するクラスター由来の、第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、化膿レンサ球菌由来であり、及び第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカスサーモフィルス＊由来であり、及び第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態において、第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり、及び第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラムルトシダ由来である。
細胞中のＤＮＡを操作する方法は、Ｃａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体と当該ＤＮＡとの接触を含み、ここでその複合体は、（ａ）補足表Ｓ６のクラスター由来の第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの同種ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）低減された開裂活性を保持したまま、その第一エンドヌクレアーゼと交換可能であり、及びその長さの７０％にわたり第一エンドヌクレアーゼと少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性を共有する補足表Ｓ６のクラスター由来の、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、カンピロバクタージェジュニ由来であり、及び第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラムルトシダ由来である。いくつかの実施形態において、第一Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌由来であり、及び第二Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、パスツレラムルトシダ由来である。
細胞中のＤＮＡを操作する方法は、２つ以上のＣａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体と当該ＤＮＡとの接触を含み、ここで各Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体は、（ａ）それらの長さの７０％にわたり、その方法の別のエンドヌクレアーゼと、５０％未満のアミノ酸配列の同一性を示す、補足表Ｓ６における異なるクラスター由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び（ｂ）各Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと特異的に複合するガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドは、単分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、フランシセラノビシダ及び化膿レンサ球菌由来である。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、髄膜炎菌及びミュータンス菌由来である。いくつかの実施形態においては、ストレプトコッカスサーモフィルス＊及びストレプトコッカスサーモフィルス＊＊由来のＣａｓ９エンドヌクレアーゼである。
幅広い種からの多数のＣａｓ９オーソログが、本明細書において特定されている。全ての特定されたＣａｓ９オーソログは、中央ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメイン及び分割されたＲｕｖＣ／ＲＮＡａｓｅＨドメインを伴う同じドメイン構造を有する。Ｃａｓ９タンパク質は、保存構造を持つ４つの主要モチーフを共有する。モチーフ１、２及び４は、ＲｕｖＣモチーフである一方、モチーフ３は、ＨＮＨモチーフである。いくつかのケースにおいて、適切な部位配向性改変ポリペプチドは、表１に描かれるＣａｓ９アミノ酸配列のモチーフ１−４に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのアミノ酸配列の相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するモチーフ１−４の各々である、４つのモチーフを有するアミノ酸配列を含む。いくつかのケースにおいて、適切な部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのアミノ酸配列の相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
ヌクレアーゼ活性は、二本鎖切断を生成するように標的ＤＮＡを開裂する。これらの切断は次いで、非相同性末端結合、及び相同配向性修復の２つの方法の１つで、細胞により修復される。非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）においては、当該二本鎖切断は、互いの切断端部の直接結合により修復される。したがって、たとえいくつかの核酸が喪失するとしても、新しい核酸がその細胞に挿入されることは無く、欠損をもたらす。相同配向性修復においては、開裂したＤＮＡ配列と相同であるドナーのポリヌクレオチドが、その開裂したＤＮＡ配列の修復の鋳型として使われ、そのドナーポリヌクレオチドから標的ＤＮＡへの遺伝子情報の伝達をもたらす。したがって、新規の核酸が、その部位に挿入／複製されるであろう。いくつかのケースにおいて、標的ＤＮＡは、ドナーのポリヌクレオチドと接触させられる。いくつかのケースにおいて、ドナーのポリヌクレオチドは、細胞に導入される。ＮＨＥＪ及び／または相同配向性修復による当該標的ＤＮＡの改変は、例えば、遺伝子修正、遺伝子交換、遺伝子タグ付け、導入遺伝子挿入、ヌクレオチド欠損、遺伝子切断、遺伝子突然変異、配列交換などを引き起こす。したがって、部位配向性改変ポリペプチドによるＤＮＡ開裂は、外から与えられたドナーポリヌクレオチドが無い場合には、その標的ＤＮＡ配列を開裂し及び配列を修復するよう細胞に働きかけることにより、標的ＤＮＡ配列から核酸物質を除去するため（例えば、細胞に感染を受け入れやすくする遺伝子（例えば、Ｔ細胞にＨＩＶ感染をしやすくするＣＣＲＳまたはＣＸＣＲ４遺伝子）の切断のため、神経細胞における疾患原因となるトリヌクレオチドリピート配列を取り除くため、研究の疾患モデルとしての遺伝子ノックアウト及び突然変異の創出のため、など）に、利用して良い。したがって、当該方法は、遺伝子をノックアウトするために（完全に欠損した転写または変更された転写をもたらす）、またはその標的ＤＮＡの選択された遺伝子座に遺伝物質をノックインするために利用できる。
あるいは、仮にガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドが、少なくとも標的ＤＮＡ配列に相同であるセグメント含むドナーポリヌクレオチド配列とともに、細胞に共投与されるならば、その対象となる方法は、核酸物質を標的配列に添加、すなわち挿入または置き換えるために（例えば、タンパク質をコードする核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなどを「ノックイン」するために）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質など）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧなど）を加えるために、遺伝子に調節配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、終止コドン、スプライスシグナル、局在化シグナルなど）を加えるために、核酸配列を改変する（例えば、突然変異を導入する）などのために使用して良い。または、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む複合体は、すなわち、例えば、遺伝子治療、例えば、疾患または抗ウイルス剤の治療、抗病原性または抗ガン治療、農業における遺伝子組み換え有機物の生産、治療のための細胞によるタンパク質の大規模生産、診断、または研究目的、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠損に対応する病原体遺伝子の標的化、または交換などに利用される、例えば、遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子のタグ付け、配列交換などの方法で「標的化する」などで、部位配向性にＤＮＡを改変するのに望ましい、任意の試験管内または生体内の用途に有用である。
いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態を含む。いくつかの例示において、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態は、そのＣａｓ９タンパク質の自然発生ヌクレアーゼ活性を減減するアミノ酸変更（例えば、欠損、挿入、または置換）を含む。例えば、いくつかの例示において、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態は、相応する野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのヌクレアーゼ活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、または１％未満を有する。いくつかのケースにおいて、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態は、実質的なヌクレアーゼ活性を持たない。部位配向性改変ポリペプチドが、実質的にヌクレアーゼ活性を持たない当該Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態である場合、それを「ｄＣａｓ９」と呼ぶことができる。
いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９ポリペプチドの改変形態は、その標的ＤＮＡの相補鎖を開裂することができるが、その標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂する能力を低減させる（したがって、ＤＳＢの代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす）、Ｄ１０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸位１０におけるアスパラギン酸からアラニン）の突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）である。いくつかの実施形態において、当該Ｃａｓ９タンパク質の改変形態は、その標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂することができ、しかしその標的ＤＮＡの相補鎖を開裂する能力を低減させる（したがって、ＤＳＢの代わりに一本鎖切断（ＳＳＢ）をもたらす）、Ｈ８４０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸位８４０におけるヒスチジンからアラニン）の突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）である。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＣａｓ９の当該Ｄ１０ＡまたはＨ８４０Ａ変異体（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）は、期待する生物学的成果を変更できる。ＤＳＢｓが存在する場合、ＳＳＢとは対照的に非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、より起こりやすいからである。したがって、いくつかのケースにおいて、ＤＳＢの可能性（及びそれゆえ、ＮＨＥＪの可能性）を減らしたい場合には、Ｃａｓ９のＤ１０ＡまたはＨ８４０Ａが利用できる。その他の残基を、同様の効果を達成するために突然変異させることができる（すなわち、不活性部またはその他のヌクレアーゼ部分）。非限定的な例示として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の化膿レンサ球菌Ｃａｓ９残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）を変更（すなわち置換）できる。また、アラニン置換以外の突然変異も考慮される。いくつかの実施形態において、部位配向性ポリペプチド（例えば、部位配向性改変ポリペプチド）が、低減した触媒活性を有する場合（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａを有する場合）、そのポリペプチドは、そのガイドＲＮＡと相互作用する能力を保持する限り、部位特異的な方法（ガイドＲＮＡにより、標的ＤＮＡに依然としてガイドされるので）で、依然として標的ＤＮＡに結合できる。
いくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＣａｓ９ポリペプチドの改変形態は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ突然変異の両方（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）を抱え、そのためそのポリペプチドは、標的ＤＮＡの相補鎖及び非相補鎖の両方を開裂する能力は低い（すなわち、その変異体は、実質的なヌクレアーゼ活性を持つことができない）。その他の残基を、同様の効果を達成するために突然変異させることができる（すなわち、ヌクレアーゼ部分のどちらか一方を不活化）。非限定的な例示として、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかのタンパク質に相応する突然変異）を変更（すなわち置換）できる。また、アラニン置換以外の突然変異も考慮される。
いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、異種配列（例えば、融合）を含む。いくつかの実施形態において、異種配列は、当該部位配向性改変ポリペプチドの細胞内局在化（例えば、核への標的化のための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアへの標的化のためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体への標的化のための葉緑体局在化シグナル、小胞体保持シグナルなど）を提供することができる。いくつかの実施形態において、異種配列は、トラッキングまたは精製を容易にするためのタグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど、ｈｉｓタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）を与えることができる。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、向上したまたは低下した安定性を与えることができる。
いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドは、コドンを最適化できる。このタイプの最適化は、当技術分野では公知であり及び意図した宿主生命体または細胞のコドン選択性を模倣する一方、同じタンパク質をコードする外来ＤＮＡの突然変異を伴う。したがって、そのコドンは変化し、しかしコードされたタンパク質は、変化せずに残る。例えば、仮に意図した標的細胞が、ヒト細胞である場合、ヒトコドン最適化Ｃａｓ９（または、変異体、例えば、酵素的に不活性の変異体）が、適切な部位配向性改変ポリペプチドであろう。任意の適切な部位配向性改変ポリペプチド（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるいずれかの配列などの任意のＣａｓ９）が、コドンを最適化できる。他の非限定的な例示として、仮に意図した宿主細胞が、マウス細胞である場合、マウスコドン最適化Ｃａｓ９（または、変異体、例えば、酵素的に不活性の変異体）が、適切な部位配向性改変ポリペプチドであろう。一方でコドン最適化が必要でない場合、いくつかのケースでは、それは許容され好まれるであろう。
ポリアデニル化シグナルをまた、意図した宿主における発現を最適化するために選択できる。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドは、細菌細胞において遺伝子発現を遮断する誘導システムとして使用される。いくつかのケースにおいて、適切なガイドＲＮＡ及び／または適切な部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸は、標的細胞の染色体に組み込まれ及び誘導プロモーターの制御下にある。当該ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドが誘導される場合、その標的ＤＮＡは、そのガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドの両方が存在し及び複合体を形成する場合に、関心のある場所において（例えば、分離プラスミドの標的遺伝子）開裂（さもなくば改変）される。または、いくつかのケースにおいて、細菌性発現株は、その細菌ゲノム中の適切な部位配向性改変ポリペプチド及び／またはプラスミドの適切なガイドＲＮＡ（例えば、誘導プロモーターの制御下にある）をコードする核酸配列を含むように遺伝子工学的に設計され、任意の標的遺伝子（その株に誘導された分離プラスミドから発現する）の発現が、そのガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドの発現を誘導することにより制御できる実験を可能にする。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、二本鎖切断を導入する以外の方法で標的ＤＮＡを改変する酵素活性を有する。標的ＤＮＡを改変する（例えば、酵素活性のある異種ポリペプチドを部位配向性改変ポリペプチドと融合することにより、キメラ部位配向性改変ポリペプチドを産生する）ために、使用して良い関心のある酵素活性には、非限定的に、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジンダイマー形成活性、インテグラーゼ阻害活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、光回復酵素活性、またはグリコシラーゼ活性を含む。メチル化及び脱メチル化は、エピジェネティックな遺伝子発現制御の重要なモードであるとして当技術分野では認識されている一方、ＤＮＡ損傷及び修復活性は、環境ストレスに応答した細胞の生存及び適切なゲノムの維持のために不可欠である。
または、本明細書の方法は、標的ＤＮＡのエピジェネティックな改変における利用を見出し、及びガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントに、望ましい相補的な核酸配列を遺伝子工学的に組み入れることにより、標的ＤＮＡの任意の場所における標的ＤＮＡのエピジェネティックな改変を制御するために採用して良い。本明細書の方法は、当該標的ＤＮＡの任意の望ましい箇所において、ＤＮＡの意図的及び制御された損傷の利用を見出した。本明細書の方法はまた、当該標的ＤＮＡの任意の望ましい場所において、ＤＮＡの配列特異的かつ制御された修復の利用を見出した。標的ＤＮＡの特定場所で、標的ＤＮＡの酵素活性を改変する方法を、研究及び臨床応用の両方において利用することを見出した。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡの転写を調節する活性（例えば、キメラ部位配向性改変ポリペプチドなど）を有する。いくつかのケースにおいて、転写を増やすまたは減らす能力を示す異種ポリペプチド（例えば、転写活性化因子または転写リプレッサーポリペプチド）を含む、キメラ部位配向性改変ポリペプチドは、当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントによりガイドされた、標的ＤＮＡの特定の場所における標的ＤＮＡの転写を増やすまたは減らすために利用する。転写調節活性を伴うキメラ部位配向性改変ポリペプチドに対応するポリペプチド源の例示には、非限定的に、光誘導型転写制御因子、小分子／薬物応答性転写制御因子、転写因子、転写リプレッサーなどを含む。いくつかのケースにおいて、当該方法は、標的コード化ＲＮＡ（遺伝子をコードするタンパク質）及び／または標的非コード化ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、sｎｏＲＮＡ、sｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、長鎖ｎｃＲＮＡなど）を制御するために使用する。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＤＮＡ関連ポリペプチド（例えば、ヒストン）を改変する酵素活性を有する。いくつかの実施形態において、当該酵素活性は、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性（すなわち、ユビキチン化活性）、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、脱ミリストイル化活性、グリコシル化活性（例えば、ＧｌｃＮＡｃ転写酵素由来）、または脱グリコシル化活性である。本明細書に網羅される酵素活性は、タンパク質への共有結合に触媒作用する。標的タンパク質の安定性または活性を変更する、そのような改変が、当技術分野では公知である（例えば、キナーゼ活性によるリン酸化は、その標的タンパク質に応じてタンパク質活性を刺激または沈静化できる）。タンパク質標的として特別な関心は、ヒストンである。ヒストンタンパク質は、ＤＮＡを結合し及びヌクレオソームとして知られる複合体を形成することが、当技術分野では公知である。ヒストンは、周辺のＤＮＡに構造変化を引き起こすように（例えば、メチル化、アセチル化、ユビキチン化、リン酸化により）改変でき、したがって、ＤＮＡの潜在的に大きな部分の、転写因子、ポリメラーゼなどの相互作用因子への接近性を制御できる。単一ヒストンは、多数の異なる方法及び多数の異なる方法で改変できる（例えば、ヒストン３、Ｈ３Ｋ２７のリシン２７のトリメチル化は、転写抑制化のＤＮＡ領域と関連している一方、ヒストン３、Ｈ３Ｋ４のリシン４のトリメチル化は、転写活性化のＤＮＡ領域と関連している）。したがって、ヒストンの改変活性を伴う部位配向性改変ポリペプチドは、ＤＮＡ構造の部位の特異的制御における利用が可能で、及び標的ＤＮＡの選択領域におけるヒストン改変パターンを変更するために利用できる。そのような方法を、研究及び臨床応用の両方において利用することを見出した。
いくつかの実施形態において、複数のガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡ上の異なる場所を同時に改変するために、同時に使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写産物または遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる関連しない遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なるが関連する遺伝子座を標的化する。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、タンパク質として直接与えられる。非限定的な例示として、菌類（例えば、酵母）は、外因性タンパク質及び／またはスフェロプラスト形質転換を使用した核酸で、形質転換できる（Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｅｎｇ Ｂｕｇｓ．２０１０ Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１（６）：３９５−４０３：“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ：ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ”、及びＴａｎｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００４ Ｍａｒ １８；４２８（６９８０）：３２３−８：“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｐｒｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ”を参照。両者は、それらの全体を参照として、本明細書に組み込む）。したがって、部位配向性改変ポリペプチドは（例えば、Ｃａｓ９）は、（ガイドＲＮＡをコードする核酸の有無で及びドナーポリヌクレオチドの有無で）スフェロプラストに組み込むことができ、及びそのスフェロプラストは、酵母細胞にその内容を導入するために利用できる。部位配向性改変ポリペプチドは、当業者に公知の方法などの、任意の簡便な方法により、細胞に導入（その細胞に提供）できる。他の非限定的な例示として、部位配向性改変ポリペプチドは、（例えば、ガイドＲＮＡをコードする核酸の有無で及びドナーポリヌクレオチドの有無で）細胞、例えば、ゼブラフィッシュの胚細胞、マウスの受精卵の前核などに直接注入できる。
関心のある標的細胞
前述の用途のいくつかにおいて、当該方法は、ＤＮＡの開裂、ＤＮＡの改変、及び／または生体内のまたは生体外及び／または試験管内の細胞分裂または細胞分裂後の細胞における転写調節のために（例えば、個体に再導入できる遺伝子改変細胞の作製のために）採用されて良い。当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡにハイブリダイズすることにより、特異性を与えるので、本開示の方法における関心のある細胞分裂または細胞分裂後の細胞は、任意の生命体由来の細胞を含んで良い（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞の真核生物細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ 、ホンダワラ ヒメツリガネゴケＣ．ホンダワラなど、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来細胞（例えばミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、脊椎動物由来細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）、哺乳類由来細胞、齧歯動物由来細胞、霊長類由来細胞、ヒト由来細胞など）。
任意の種類の細胞が関心の対象となって良い（例えば、萌芽期の幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞などの幹細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞などの体細胞、例えば、１−細胞、２−細胞、４−細胞、８−細胞などの段階のゼブラフィッシュの胚などの、試験管内または生体内の、任意段階の胚の胚性細胞）。細胞は、樹立細胞株由来でも良く、または一次細胞であって良く、ここで「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養」は、限定された継代数、すなわち培養の株分けに対応して試験管内の増殖を可能にし、そこから誘導された、細胞及び細胞培養を指して、本明細書では互換的に使用する。例えば、一次培養は、クライシス段階に至るまでには不十分な回数の、ゼロ回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回の継代を経て良い培養である。通常は、本発明の一次細胞株は、試験管内で１０回未満の継代を維持される。標的細胞は、多くの実施形態においては単細胞生命体であり、または培養で増殖する。
仮に当該細胞が、一次細胞であれば、それらは、任意の簡便な方法により個体から採取されて良い。例えば、白血球は、血液浄化療法、白血球搬出法、密度勾配分離法などにより簡便に採取されて良い一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、生研により、最も簡便に採取されて良い。その採取された細胞の分散または懸濁には、適切な溶液が使用されて良い。そのような溶液は一般に、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液などの平衡塩溶液であり、ウシ胎児血清からまたはその他の自然発生因子から簡便に補充され、一般には５−２５ｍＭの低い濃度の許容される緩衝液との組み合わせで使用される溶液である、簡便な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含む。当該細胞は、即座に使用されて良く、または長期間にわたり、貯蔵され、冷凍され、再利用できるように解凍されて良い。そのようなケースにおいて、当該細胞は通常、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝媒体中で、またはそのような冷凍温度に細胞を維持するために、当技術分野で普通に使用されるいくつかのその他のそうした溶液中で冷凍され、及び冷凍培養細胞の解凍に対応した当技術分野で公知の方法で解凍される。
ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸
いくつかの実施形態において、方法は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を、標的ＤＮＡに接触または細胞（または細胞集団）に導入することに関与する。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここでガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、当該組換え発現ベクターは、ウイルスコンストラクトであり、例えば、組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクト（例えば、ＵＳ７，０７８，３８７号を参照）、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクトなどである。
適切な発現ベクターには、非限定的に、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、 アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ ９４／１２６４９、ＷＯ ９３／０３７６９、ＷＯ ９３／１９１９１、ＷＯ ９４／２８９３８、ＷＯ ９５／１１９８４及びＷＯ ９５／００６５５を参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイの肉腫のウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトルウイルス由来のベクター）などを含む。
多数の適切な発現ベクターが、当業者に知られており、及び多くは、商業的に入手可能である。真核生物の宿主細胞に対しては、例えば、次のベクター、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が、例示として与えられる。しかしながら、その宿主細胞と互換性がある限り、その他の任意のベクターが使用されて良い。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに操作を加えて結合できる。その転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかにおいて、機能的であって良い。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核及び真核の両細胞に、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントに操作を加えて結合できる。
利用する宿主／ベクター系に応じて、構造性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなど含む、多数の適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクター（例えば、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーターなど、前述参照）に使用されて良い（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照）。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドは、ＲＮＡとして提供され得る。そのようなケースにおいて、当該ガイドＲＮＡ及び当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするＲＮＡは、直接的な化学合成で生産でき、またはそのガイドＲＮＡをコードするＤＮＡから、試験管内で転写されて良い。ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成する方法は、当技術分野では公知である。いくつかのケースにおいて、当該ガイドＲＮＡ及び当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼ酵素（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなど）を使用した試験管内で合成される。一旦合成されると、そのＲＮＡは、標的ＤＮＡに直接接触して良く、または核酸を細胞に導入する任意の公知技術（例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、トランスフェクションなど）により、細胞に導入されて良い。
（ＤＮＡまたはＲＮＡのどちらかとして導入された）ガイドＲＮＡ及び／または（ＤＮＡまたはＲＮＡとして導入された）部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードするヌクレオチドは、良く発達したトランスフェクション技術を使用して細胞に提供されて良い。Ａｎｇｅｌ ａｎｄ Ｙａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ １１７５６、及び商業的に入手可能な、Ｑｉａｇｅｎ社からのＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ社からのＳｔｅｍｆｅｃｔＴＭ ＲＮＡトランスフェクションキット、及びＭｉｍｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ社からのＴｒａｎｓｌＴ（登録商標）−ｍＲＮＡトランスフェクションキットを参照のこと。また、Ｂｅｕｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００８）ジンクフィンガーヌクレアーゼの直接胚注入による、ショウジョウバエにおける効果的な遺伝子の標的化、ＰＮＡＳ １０５（５０）：１９８２１−１９８２６を参照のこと。あるいは、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸は、ＤＮＡベクターに与えられて良い。標的細胞に核酸を導入するのに有用な多数のベクター、例えば、プラスミド、コスミド、小環状物、ファージ、ウイルスなどが利用可能である。当該核酸を含むベクターは、例えば、プラスミド、小環状ＤＮＡ、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルスとして、エピソームに保持されて良く、またはそれらは、相同組換えまたはランダム統合、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来のベクターを介して、標的細胞遺伝子に統合されて良い。
ベクターは、直接、細胞に提供されて良い。換言すれば、当該細胞は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含む、ベクターに接触され、そのため当該ベクターが、その細胞に取り込まれる。エレクトロポレーション、塩化カルシウムトランスフェクション、マイクロインジェクション、及びリポフェクションを含む、プラスミドである核酸ベクターと細胞を接触させる方法は、当技術分野では公知である。ウイルスベクターの送達に対応して、当該細胞は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を含むウイルス粒子と接触する。レトルウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示の方法に特に適切である。通常使用されるレトロウイルスベクターは、「欠陥」である、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質の産生ができない。むしろ、そのベクターの複製には、パッケージングされた細胞株中での増殖が必要である。関心のある核酸を含むウイルス粒子を産生するために、当該核酸を含むレトロウイルスの核酸が、パッケージング細胞株により、ウイルスカプシドにパッケージングされる。異なるパッケージング細胞株は、そのカプシドに組み込まれるために、異なるエンベロープタンパク質（同種指向性の、両種指向性のまたは異種指向性の）を与え、このエンベロープタンパク質が、当該細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットの同種指向性、ヒト、イヌ及びマウスを含むほとんどの哺乳類細胞型の両種指向性、及びマウス細胞を除くほとんどの哺乳類細胞型の異種指向性）。適切なパッケージング細胞株を、細胞が、そのパッケージされたウイルス粒子により標的化されることを確かなものにするために使用して良い。再プログタミング因子をコードする核酸を含むレトルウイルスをパッケージング細胞株に導入し、及びそのパッケージング株により産生されるウイルス粒子を収集する方法は、当技術分野では公知である。核酸はまた、直接のマイクロ注入（例えば、ＲＮＡのゼブラフィッシュの胚への注入）により導入され得る。
当該細胞に、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸を与えるために、使用されるベクターには、通常は、関心のある核酸の発現、つまり転写活性化を加速するために、適切なプロモーターを含む。換言すると、関心のある核酸は、プロモーターに操作を加えて結合される。これは、普遍的活性プロモーター、例えば、ＣＭＶ−１３−アクチンプロモーター、または誘導性プロモーターなどの特定細胞集団中で活性なプロモーター、またはテトラサイクリンのような薬剤の存在に応答するプロモーターを含む。転写活性化により、転写が、その標的細胞において、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、より一般的には少なくとも１０００倍まで、基底レベルを上回って増加することを意図している。さらに、当該細胞に、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドを与えるために使用されるベクターは、そのガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドが取り込まれた細胞と同一であるように、当該標的細胞に選択的なマーカーをコードする核酸配列を含む。
ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはキメラ部位配向性改変ポリペプチドは、ＤＮＡに接触するために使用され、ＲＮＡの代わりとして細胞に導入されれる。細胞にＲＮＡを導入する方法は、当技術分野では公知であり、及び、例えば、直接注入、トランスフェクション、またはＤＮＡの導入に対して使用される任意のその他の方法を含んで良い。部位配向性改変ポリペプチドは、ポリペプチドの代わりとして、細胞に与えられる。そのようなポリペプチドは、その物質の溶解性を高めるポリペプチドドメインに、任意で融合されて良い。当該ドメインは、定められたプロテアーゼ開裂部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼにより開裂する、ＴＥＶ配列を介して、そのポリペプチドに結合されて良い。そのリンカーはまた、１つ以上の可変長配列、例えば、１から１０のグリシン残基を含む。いくつかの実施形態において、当該融合タンパク質の開裂は、例えば、０．５から２Ｍの尿素の存在下において、溶解性を高めるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下において、その物質の溶解性を保持する緩衝液中で行われる。関心のあるドメインには、インフルエンザＨＡドメイン、及びＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメインなどの、作製を助けるその他のポリペプチドなどの、エンドソームドメインを含む。当該ポリペプチドは、安定性改善のために、処方されてよい。例えば、このペプチドは、ＰＥＧ化されて良く、そのポリエチレンオキシ基は、血流中で、寿命の延長を与える。
さらにまたはあるいは、当該部位配向性改変ポリペプチドは、その細胞による取り込みを促進するために、ポリペプチド透過性ドメインに融合されて良い。多数の透過性ドメインが、当技術分野で公知であり、及びペプチド、ペプチド模倣薬、及び非ペプチドキャリアーを含む、本発明の非統合ポリペプチドに使用されて良い。例えば、透過性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを含み、貫通性と呼ばれる、キイロショウジョウバエの転写因子の３番目のαヘリックス由来であって良い。他の例示として、当該透過性ペプチドは、例えば、自然発生ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９−５７を含む、ＨＩＶ−１ｔａｔ基本領域のアミノ酸配列を含む。その他の透過性ドメインは、ポリアルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１ ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４−５６の領域、ノナアルギニン、オクタアルギニンなどを含む（例えば、Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｅｐｔ Ｓｃｉ．２００３ Ａｐｒ；４（２）：８７−９ ａｎｄ ４４６、及びＷｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ ２０００ Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、ＵＳ２００３０２２０３３４、２００３００８３２５６、２００３００３２５９３、及び２００３００２２８３１を参照。翻訳ペプチド及びペプトイドの技術に対する参照を、特に本明細書に組み込む）。ノナアルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けられた最も効率的なＰＴＤの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２）。融合が行われる部位は、そのポリペプチドの生物学的活性、分泌または結合特性を最適化するために選択されて良い。最適な部位は、通常の実験により決定されるであろう。
部位配向性改変ポリペプチドは、試験管内でまたは真核細胞によりまたは原核細胞により産生されて良く、及び例えば、熱変性、ＤＴＴ低減などのアンフォールディングによりさらに加工されて良く、及び当技術分野で公知の方法で、さらにリフォールディングされて良い。
一次配列を変更しない関心のある改変には、ポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化などを含む。またその他に、例えば、合成及び改変プロセス中の、またはさらなるプロセス段階においてのポリペプチドのグリコシル化パターンの改変により、例えば、哺乳類のグリコシル化または脱グリコシル化酵素などの、グリコシル化に影響する酵素に、そのポリペプチドを暴露することにより作られるもの、などのグリコシル化による改変を含む。またその他に、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、ホスホトレオニンなどのリン酸化アミノ酸残基を有する配列の採用がある。
また、本発明に含まれるものには、ガイドＲＮＡ及び、タンパク質分解に対する耐性改善のために、標的配列特異性の変更のために、溶解性の最適化のために、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性など）の変更のために、またはそれらを治療薬としてより適切にするために、普通の分子生物学的技術及び合成化学を使用して改変された部位配向性改変ポリペプチドがある。自然発生のＬ−アミノ酸以外、例えば、Ｄ−アミノ酸または非自然発生の合成アミノ酸の残基を含む、ポリペプチド類似体を包含する。Ｄ−アミノ酸は、そのアミノ酸残基のいくつかまたは全てで置換されて良い。当該部位配向性改変ポリペプチドは、当技術分野で公知の従来の方法を使用して、試験管内の合成で調製されて良い。多様な合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｂｅｃｋｍａｎ社などの自動合成装置が、商業的に入手可能である。合成装置の使用により、自然発生アミノ酸が、非天然アミノ酸で置換されて良い。当該特定配列及び調製方法は、利便性、経済性、要求される純度などにより決定されるであろう。
もし必要であれば、多様な基が、合成または発現時にそのペプチドに導入されて良く、別の分子または表面への結合が許容される。したがって、チオエーテル、金属イオン複合体に結合するためのヒスチジン、アミドやエステル形成のためのカルボキシル基、アミド形成のためのアミノ基などを作るために、システインを利用できる。
当該部位配向性改変ポリペプチドはまた、従来の組換え合成法に従って、単離され及び精製されて良い。溶解物は、当該発現宿主及びＨＰＬＣ、排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、またはその他の精製技術を使用して精製されたその溶解物で調製されて良い。ほとんどの部分において、使用する組成物は、当該物質の調製及びその精製法による不純物との関連で、目的物質の重量で少なくとも２０％、より一般的には重量で少なくとも約７５％、より好ましくは重量で少なくとも約９５％、及び治療目的に対しては、通常は少なくとも約９９．５％を含む。通常、そのパーセンテージは、総タンパク質を基にしている。ＤＮＡ開裂及び組換え、または標的ＤＮＡへの望ましい改変、または標的ＤＮＡ関連のポリペプチド任意の望ましい改変を導入するために、核酸またはポリヌクレオチドとして導入される、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、約３０分から約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分から約２４時間の間の任意のその他の時間で当該細胞に提供され、約１日から約４日毎、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎の頻度、または約１日から約４日毎の間の任意のその他の頻度で繰り返される。当該試薬は、当該細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または３回以上与えられて良く、及びその細胞は、各接触機会に従うある時間量、例えば１６−２４時間に対応して、当該試薬と共に培養され、その後培養培地を新鮮な培地と交換し及びその細胞は、さらに培養される。２つ以上の異なる標的化複合体が、当該細胞に与えられる場合（例えば、同じまたは異なる標的ＤＮＡ内の異なる配列に相補的な、２つの異なるガイドＲＮＡ）、その複合体は、同時に与えられて良く（例えば、２つのポリペプチド及び／または核酸として）、または同時に送達されて良い。あるいは、それらは、連続して、例えば、当該標的化複合体が最初に与えられ、次いで第二標的化複合体が与えられるなど、またはその逆に、与えられて良い。
通常は、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの有効量が、標的の改変を誘導するために、その標的ＤＮＡまたは細胞に与えられる。当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの有効量は、ネガティブコントロール、例えば、空のベクターまたは無関係ポリペプチドと接触する細胞を基準にして、２つの相同配列間に観察される標的改変量において、２倍以上の増殖を誘導する量である。換言すると、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドはの効果的な量または投与量は、２倍増殖、３倍増殖、４倍増殖またはそれ以上の標的ＤＮＡ領域において観察される標的改変量、例えば、５倍増殖、６倍増殖またはそれ以上、時には７倍または８倍増殖またはそれ以上の観察される組換え量、例えば、１０倍、５０倍、または１００倍またはそれ以上の増殖、例えば、２００倍、５００倍、７００倍、または１０００倍またはそれ以上の増殖、例えば、５０００倍、または１０，０００倍増殖の観察される組換え量を、誘導するであろう。標的改変の量は、任意の簡便な方法で測定されて良い。例えば、組換えの際に、活性レポーターをコードする核酸を再構成するリピート配列により、並べられたガイドＲＮＡの標的化セグメント（標的化配列）に相補的な配列を含む不活性なレポーターコンストラクトは、その細胞に同時に遺伝子導入され、及び当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドとの接触後、例えば２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、またはそれ以上後に評価されたレポータータンパク質の量である。他に、例えばより高感度のアッセイでは、標的ＤＮＡ配列を含むゲノムＤＮＡの関心領域における組換えの度合いは、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドとの接触後、例えば２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、７２時間、またはそれ以降の、その領域のＰＣＲまたはサザンブロッティングの相補的結合により、評価されて良い。
ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドと当該細胞との接触は、任意の培養培地及びその細胞の生存を促進する任意の培養条件下において行われて良い。例えば、細胞は、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清または非働化ヤギ血清（約５−１０％）の添加、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、及びペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質などの、簡便で適切な栄養培地に懸濁されて良い。当該培養には、その細胞が反応する増殖因子を含んで良い。本明細書で定義する増殖因子は、膜貫通受容体上の特異的な効果を介して、培養またはインタクトなインタクトな組織のどちらかにおいて、細胞の生存、増殖及び／または分化を促すことができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子を含む。細胞の生存を促進する条件は、非相同性末端結合及び相同配向性修復の通常の許容範囲内である。ポリヌクレオチド配列の標的ＤＮＡへの挿入が望ましい用途において、挿入されたドナー配列を含むポリヌクレオチド配列がまた、当該細胞に与えられる。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」は、部位配向性改変ポリペプチドに誘導された開裂部位に挿入された核酸配列を意味する。当該ドナーポリヌクレオチドは、それと相同性を生じるゲノム配列間の相同配向性修復を支えるために、その開裂部位におけるゲノム配列との適切な相同性、例えば、その開裂部位に並ぶヌクレオチド配列、例えば、その開裂部位の約５０以下の塩基内の、例えば、約３０塩基内の、約１５塩基内の、約１０塩基内の、約５塩基内の、またはその開裂部位に直に並ぶヌクレオチド配列との、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含む。約２５、５０、１００または２００ヌクレオチド、もしくは２００以上（または１０から２００、もしくはそれ以上のヌクレオチド間の任意の整数値）のヌクレオチドの、ドナーとゲノム配列間の配列相同性が、相同配向性修復に必要であろう。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチドまたはそれ以上、５０ヌクレオチドまたはそれ以上、１００ヌクレオチドまたはそれ以上、２５０ヌクレオチドまたはそれ以上、５００ヌクレオチドまたはそれ以上、１０００ヌクレオチドまたはそれ以上、５０００ヌクレオチドまたはそれ以上、などの長さであり得る。
通常、ドナー配列は、置き換わるゲノム配列と同一でなはい。むしろ、そのドナー配列は、適切な相同性が相同配向性修復を支えるために存在する限り、そのゲノム配列に対する、少なくとも１つ以上の単一塩基変化、挿入、欠損、逆転または再編成を含んで良い。いくつかの実施形態において、当該ドナー配列は、２つの相同領域と並んだ非相同配列を含み、そのため当該標的ＤＮＡ領域とその２つの並んだ配列間の相同配向性修復が、その標的領域での非相同配列の挿入をもたらす。ドナー配列はまた、関心のあるＤＮＡ領域と相同ではなく及びその関心のあるＤＮＡ領域への挿入を意図していない配列を含む、ベクターバックボーンを含んで良い。一般に、ドナー配列の相同領域は、組換えが望ましいゲノム配列と、少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。特定の実施形態において、６０％の、７０％の、８０％の、９０％の、９５％の、９８％の、９９％の、または９９．９％の配列同一性が存在する。そのドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％から１００％の配列同一性の間の任意の値が存在し得る。当該ドナー配列は、そのゲノム配列との比較で、特定の配列における差異、例えば、制限部位、ヌクレオチドの多型、選択可能マーカー（例えば、薬剤抵抗性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素など）などを含み、それらは、その開裂部位におけるドナー配列の正常な挿入を評価するために利用され、またはその他の目的（例えば、その標的ゲノム遺伝子座での発現を示すために）で利用されて良い。いくつかのケースにおいて、仮にコード領域に位置するならば、そのようなヌクレオチド配列の差異は、アミノ酸配列を変化させないであろうし、不活性なアミノ酸変化（すなわち、そのタンパク質の構造または機能に影響を与えない変化）を生むであろう。あるいは、これらの配列差異には、そのマーカー配列の除去の後で活性化され得る、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列などの隣接する組換え配列を含んで良い。
当該ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、または二本鎖ＲＮＡとして、細胞に与えられる。それは、直鎖状または環状形態で、細胞に導入されて良い。仮に、直鎖状形態で導入される場合、そのドナー配列の末端は、当業者には公知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護されて良い。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に加えられ及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドが、片方または両末端に結合される。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６−８８９を参照のこと。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護する追加の方法には、非限定的に、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、及び０−メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの、末端アミノ基の添加及び改変ヌクレオチド間結合を含む。直鎖状ドナー配列の末端を保護する選択肢として、組換えに影響を与えずに分解可能な相同領域の外側に、配列の追加の長さを含めて良い。ドナー配列は、例えば、複製の原型、抗生物質耐性をコードするプロモーター及び遺伝子などの、追加の配列を有するベクター分子の一部分として細胞に導入され得る。さらに、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドに対して前述したように、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームまたはポロキサマーなどの試薬と複合化した核酸として導入され得て、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）により送達され得る。
前述の方法に従って、関心のあるＤＮＡ領域は、開裂され及び改変され、すなわち、生体外で、「遺伝子的に改変され」て良い。いくつかの実施形態において、選択可能マーカーが、その関心のあるＤＮＡ領域に挿入された場合、遺伝子的に改変された細胞が、残りの集団から単離されることにより、その遺伝子改変を含む細胞集団が濃縮されて良い。濃縮に先立ち、その「遺伝子的に改変された」細胞は、その細胞集団のわずか約１％またはそれ以上（例えば、２％またはそれ以上、３％またはそれ以上、４％またはそれ以上、５％またはそれ以上、６％またはそれ以上、７％またはそれ以上、８％またはそれ以上、９％またはそれ以上、１０％またはそれ以上、１５％またはそれ以上、または２０％またはそれ以上）で構成されて良い。「遺伝子的に改変された」細胞の単離は、使用された選択可能カーカーに対して適切な、任意の簡便な単離技術により達成されて良い。例えば、仮に蛍光マーカーが挿入された場合、蛍光活性化細胞選別により、細胞が単離されて良く、ここで仮に細胞表面マーカーが挿入された場合、アフィニティ分離技術、例えば、磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、固相に付着したアフィニティ試薬を伴う「パニング」、またはその他の簡便な技術により、細胞がその異種集団から単離されて良い。正確な単離を提供する技術には、複数カラーチャンネル、ローアングル及び鈍角の光散乱検出チャンネル、インピーダンスチャンネルなどの、精巧さの度合いを変更できる蛍光活性化細胞選別を含む。当該細胞は、死滅細胞に関連付けられた染料（例えば、プロピジウムヨウ化物）を取り入れることにより、死滅細胞に対して選択されて良い。当該遺伝子改変細胞の生存能力を不当に決定しない、任意の技術が採用されて良い。改変ＤＮＡを含む細胞を高濃縮した細胞組成物は、この方法で達成される。「高濃縮」により、当該遺伝子改変細胞が、その細胞組成物の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上であり、例えば、約９５％以上、または９８％以上であることを意味する。換言すれば、当該組成物は、遺伝子改変細胞の実質的に純粋な組成物であって良い。
本明細書に記述される方法により産生される遺伝子的改変細胞は、即座に使用されて良い。あるいは、当該細胞は、液体窒素の温度で冷凍され及び、解凍されて再利用できるように、長期間貯蔵されて良い。そのようなケースにおいて、当該細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝液中で、またはそのような冷凍温度で細胞を保存するために当技術分野で一般に使用され、及び冷凍培養細胞の解凍に対して通常、当技術分野で公知の方法で解凍される、いくつかのその他のそうした溶液中で冷凍される。
当該遺伝子改変細胞は、多様な培養条件下の試験管内で、培養されて良い。当該細胞は、培養で拡大、すなわち、それらの増殖を促す条件下で成長して良い。培養培地は、例えば、寒天、メチルセルロースなどを含む、液体または半固体であって良い。当該細胞集団は、イスコフ改変ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０、ウシ胎児血清（約５−１０％）の通常の補充、Ｌ−グルタミン、チオール、特に２−メルカプトエタノール、及びペニシリンやストレプトマイシンなどの抗生物質などの、適切な栄養培地に懸濁されて良い。当該培養には、制御性Ｔ細胞が反応する増殖因子を含んで良い。本明細書で定義する増殖因子は、膜貫通受容体上の特異的な効果を介して、培養またはインタクトな組織のどちらかにおいて、細胞の生存、増殖及び／または分化を促すことができる分子である。増殖因子には、ポリペプチド及び非ポリペプチド因子を含む。
この方法で遺伝子的に改変された細胞は、遺伝子治療目的、例えば、病気を治療するために、抗ウイルス、抗病原性、または抗がん剤治療として、農業における遺伝子組み換え生物の作製のために、または生物学的研究のために、対象に移植されて良い。当該対象は、新生児、未成年、または大人であって良い。特に関心があるのは、哺乳類の対象である。本方法により治療されて良い哺乳類の種には、イヌ、ネコ科の動物、ウマ、ウシ、ヒツジなど、及び霊長類、特にヒトを含む。動物モデル、特に小さい哺乳類（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ目（例えば、ウサギ）など）は、実験的検討に使用されて良い。
細胞は、その対象に、例えば、それらが移植された組織において、それらの増殖及び／または組織化を支えるために、単独でまたは適切な物質基剤またはマトリクスとともに提供されて良い。通常は、少なくとも１×１０３細胞が、例えば、５×１０３細胞が、１×１０４細胞が、５×１０４細胞が、１×１０５細胞が、１×１０６細胞が、投与される。当該細胞は、静脈、皮下、静脈内投与、頭蓋内、脊柱、眼内、または髄液へなどの、いずれかの経路を介して、その対象に導入されて良い。当該細胞は、注射、カテーテルなどで導入されて良い。局所送達、すなわち、傷害部位への送達に対応した例示的な方法には、例えば、オマヤレザバー（Ｏｍｍａｙａ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を通して、例えば、髄腔内配信のために（例えば、ＵＳ５，２２２，９８２及び第５３８５５８２、参照により本明細書に組み込む）、静脈内注入により、例えば、関節へ注射器による継続的な点滴により、例えば穿刺により、例えば対流を伴い（例えば、ＵＳ２００７０２５４８４２、参照により本明細書に組み込む）、または、当該細胞が、可逆的に装着されているデバイスをはめ込むことにより（例えば、ＵＳ２００８００８１０６４及び ２００９０１９６９０３、参照により本明細書に組み込む）を含む。細胞はまた、遺伝子組み換え動物（例えば、遺伝子組み換えマウス）を作製する目的に対して、胚（例えば、胚盤胞）に導入されて良い。
対象への治療のための投与回数は、異なっていて良い。当該遺伝子改変細胞の対象への導入は、一度で良いが、しかし特別な状況によっては、そのような治療が、限られた期間に改善を引き出し及び進行中の一連の反復治療を必要として良い。その他の状況において、当該遺伝子改変細胞の複数回投与は、その効果が観察される前に必要とされて良い。正確な手順は、治療されている個々の対象の疾患または症状、その疾患の段階及びパラメーターに依存する。
本開示のその他の態様において、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、例えば、病気を治療するために、または抗ウイルス、抗病原性、または抗がん剤治療として、農業における遺伝子組み換え生物の生産のために、または生物学的研究のためなどの遺伝子治療などの目的に対してまた、生体内での細胞ＤＮＡの改変に採用される。これらの生体内の実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、その個体に直接投与される。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、対象へのペプチド、小分子及び核酸の投与に対応した、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって投与されて良い。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、多様な処方に組み込まれ得る。より詳細には、本発明のガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な薬学的に許容される担体または希釈剤との組み合わせにより医薬組成物に処方され得る。
医薬調製品とは、薬学的に許容される賦形剤中に１つ以上の本発明のガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドを含む組成物である。「薬学的に許容される賦形剤」とは、ヒトなどの哺乳類への使用に対して、連邦政府または州政府の規制機関により認められた、またはアメリカ薬局方またはその他の一般に認められた薬局方で登録された賦形剤である。用語「賦形剤」は、哺乳類への投与に対して、本発明の化合物が処方されることに伴う希釈剤、補助剤、添加剤、または担体を指す。そのような薬学的賦形剤は、例えばリポソーム、例えばリポソームデンドリマー、などの脂質、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ごま油など、石油、動物、野菜や合成原料などに含まれる水や油などの液体、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプン糊、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定化剤、肥厚剤、潤滑油および着色剤が、使用されて良い。医薬組成物は、固体、半固体、タブレット、カプセル、粉末、顆粒、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入、ゲル、微粒子、及びエアロゾルなどの、液体または気体形態の調製品に処方されて良い。または、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの投与は、経口、頬、直腸、静脈、腹腔内、皮内注射、経皮吸収型、気管、眼内などの投与を含む、多様な方法で達成できる。当該有効薬は、投与後に全身に、または局所的投与、壁内投与、または埋め込み部位で有効投与量を保持するように作用するインプラントの使用により局在化されて良い。当該有効薬は、即時活性のために処方されて良く、または持続的放出のために処方されて良い。
いくつかの症状に対しては、特に中枢神経系の症状には、血液脳関門（ＢＢＢ）に薬剤を行き渡らせる処方が必要である。そのＢＢＢを通って薬剤を送達する１つの戦略は、マンニトールまたはロイコトリエンなどの浸透手段によるか、もしくはブラジキニンなどの血管作動性物質の使用による生化学的な手段のどちらかによる、ＢＢＢの通過を必要とする。脳腫瘍への標的特異の試薬に対し、ＢＢＢを開くように使用する潜在力はまた、任意である。ＢＢＢ破壊薬は、本発明の治療組成物が血管注射により投与される場合、当該組成物との共投与が可能である。ＢＢＢを通過するその他の戦略は、カベオリン−１介在トランスサイトーシス、グルコース及びアミノ酸キャリアーなどのキャリアー介在トランスポーター、インスリンまたはトランスフェリンのための受容体介在トランスサイトーシス、及びｐ−糖蛋白質など活性排出トランスポーターを含む、内因性の送達システムの使用を伴って良い。活性トランスポート部分がまた、血管の内皮細胞の壁を越える輸送を容易にするために、本発明の利用に対応して当該治療組成物と共役されて良い。あるいは、ＢＢＢの背後にある治療薬の送達は、局所送達により、例えば、髄腔内送達により、例えば、オマヤレザーバーを通して（例えば、ＵＳ５，２２２，９８２及び５３８５５８２、参照により本明細書に組み込む）、静脈内注射により、例えば、注射器により、硝子体内に、頭蓋内に、継続的な点滴により、例えば穿刺により、例えば対流を伴い（例えば、Ｕ．Ｓ．出願Ｎｏ：２００７０２５４８４２、参照により本明細書に組み込む）、または、可逆的に装着されているデバイスをはめ込むことにより（例えば、Ｕ．Ｓ．出願Ｎｏ：２００８００８１０６４及び２００９０１９６９０３、参照により本明細書に組み込む）、行われて良い。
通常は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの有効量が与えられる。生体外の方法に関連し前述したように、生体内におけるガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効投与量は、ネガティブコントロール、例えば、空のベクターまたは無関係なポリペプチドと比較して、２つの相同配列間に観察される組換え量において、２倍増加以上を誘導する量である。当該組換え量は、任意の簡便な方法、例えば、前述の当技術分野で公知の方法で測定されて良い。投与されるガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの有効量または有効投与量の計算は、当業者内には規定通りである。投与される最終量は、投与の経路及び治療される障害または症状の性質に依存するであろう。
特定の患者に与えられる有効量は、患者により異なる、多様な複数の要因に依存するであろう。有能な臨床医であれば、患者の疾患症状の進行を望ましく止める、または戻すために投与する、治療薬の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０の動物データ、及び薬剤に利用可能なその他の情報を活用して、臨床医は、投与の経路に応じた、個人の最大安全投与量を決定することができる。例えば、静脈内に投与される用量は、髄腔内投与用量より多くて良く、当該治療組成物が投与される場所に、より多くの液体物質が投与される。同様に、体内から急速に排出される組成物は、治療濃度を維持するために、高い用量で、または反復用量で投与されて良い。普通のスキルを活用して、有能な臨床医は、規定の臨床試験のコースにおける、特定の治療の投与量を最適化できるであろう。
薬剤への内包に対応して、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドは、適切な商業的供給源から入手されて良い。一般的な命題として、当該ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの、投与当たり非経口的に投与された総薬学的有効量は、用量応答曲線により測定できる範囲内である。
ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療、すなわち、治療投与に使用するガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドの調製は、無菌状態でなければならない。無菌状態は、無菌ろ過膜（例えば、０．２μｍの膜）を通したろ過により実現する。治療組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパー弁を持つ静脈注射用溶液のバッグまたは小瓶に収められる。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドに基づく治療薬は、水溶液としてまたは再構成のための凍結乾燥製剤として、単一ユニットまたは複数回投与の容器、例えば、密封アンプルまたは小瓶に蓄えられて良い。凍結乾燥製剤の例示として、１０−ｍｌ小瓶を、無菌ろ過された化合物の１％（ｗ／ｖ）水溶液５ｍｌで満たし、及びその混合物を凍結乾燥する。当該輸液は、静菌的な注射用水を使用して凍結乾燥化合物を再構成することによって調製される。
医薬組成物には、望ましい処方に応じて、動物またはヒトへの投与に対する医薬組成物の処方に、通常使用される賦形剤として定義され、薬学的に許容された、非毒性担体の希釈剤を含むことができる。その希釈剤は、その組み合わせの生物学的活性に影響しないものとして選択される。そのような希釈剤の例示には、蒸留水、緩衝水、生理食塩水、ＰＢＳ、リンゲル液、ブドウ糖溶液、ハンクス液がある。さらに、当該医薬組成物または処方物には、その他の担体、補助剤、または非毒性、非治療性、非免疫原性の安定剤、賦形剤などを含むことができる。当該組成物はまた、ｐＨ調整及び緩衝液、毒性調整剤、湿潤剤及び界面活性剤などの、適切な生理的条件への追加物質を含むことができる。
当該組成物はまた、多様な安定剤、例えば、抗酸化剤などを含むことができる。当該医薬組成物が、ポリペプチドを含む場合、そのポリペプチドは、そのポリペプチドの安定性を生体内で高める、またはさもなければ、その薬学的特性を高める（例えば、そのポリペプチドの半減期を増加する、その毒性を減らす、安定性または吸収性を高める）、多様な公知の化合物と複合化できる。そのような改変または複合化試薬の例示には、硫酸塩、グルコン酸、クエン酸、及びリン酸塩を含む。組成物の核酸またはポリペプチドはまた、それらの生体内特性を高める分子と複合化できる。そのような分子には、例えば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）、および脂質を含む。
多様なタイプの投与に適した処方に関するさらなる助言は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に、見出すことができる。薬剤送達法の概説は、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
当該医薬組成物は、予防及び／または治療法に対して投与できる。当該有効成分の毒性及び治療効果は、ＬＤ５０（その集団の５０％致死用量）及びＥＤ５０（その集団の５０％治療有効用量）の決定を含む、細胞培養及び／または実験動物における標準の薬学的手順に従って決定できる。毒性と治療効果間の投与量比率が、治療指数であり、及びＬＤ５０／ＥＤ５０の比率として示される。大きな治療指数を示す治療法が、好ましい。
細胞培養及び／または動物から得られたデータは、ヒトへの投与量範囲の処方に、利用できる。当該有効成分の投与量は、低毒性のＥＤ５０を含む計算濃度の範囲内にある。当該投与量は、採用した投与形態及び活用する投与の経路に応じた範囲内で、変動できる。当該医薬組成物を処方するために使用した成分は、好ましくは高純度であり及び潜在的に有害な不純物質を実質的に含まない（例えば、少なくとも公式機関が定める食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｏｄ−ＮＦ）グレード、一般には、少なくとも分析可能なグレード、及びより通常は、少なくとも医薬品グレード）。さらに、体内使用を意図された成分は、通常は無菌状態である。目的の化合物が、使用前に合成されなければならないという限りにおいて、その結果をもたらす物質は通常、その合成または精製過程に存在するであろう、いかなる潜在的毒性試薬、特にいかなるエンドトキシンをも本質的に含まない。非経口投与のための組成物はまた、無菌状態であり、実質的に等張性であり及びＧＭＰ管理の条件下で作られる。
特定の患者に与えられる治療組成物の有効量は、多様な、患者間で異なる複数の要因に依存するであろう。有能な臨床医であれば、患者の疾患症状の進行を望ましく止めまたは戻すために投与する、治療薬の有効量を決定することができるであろう。ＬＤ５０動物データ、及び薬剤に利用可能なその他情報を活用して、臨床医は、投与の経路に応じた、個人の最大安全投与量は決定することができる。例えば、静脈内に投与される用量は、髄腔内投与用量より多くて良く、当該治療組成物が投与される場所に、より多くの液体物質が投与される。同様に、体内から急速に排出される組成物は、治療濃度を維持するために、高い用量で、または反復用量で投与されて良い。普通のスキルを活用して、有能な臨床医は、規定の臨床試験のコースにおける、特定の治療の投与量を最適化できるであろう。
遺伝子改変宿主細胞
本開示は、単離された遺伝子改変宿主細胞を含む、遺伝子改変宿主細胞を提供し、ここで遺伝子改変宿主細胞は、１）外因性ガイドＲＮＡ、２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、３）外因性部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体のＣａｓ９、キメラＣａｓ９など）、４）部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、または５）前述の任意の組み合わせで遺伝子的に改変された細胞を含む。遺伝子改変細胞は、例えば、１）外因性ガイドＲＮＡ、２）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、３）外因性部位配向性改変ポリペプチド、４）部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、または５）前述の任意の組み合わせ、と宿主細胞を遺伝子的に改変することにより産生される。
標的細胞に適切な全ての細胞はまた、遺伝子改変宿主細胞として適切である。例えば、関心のある遺伝子改変宿主細胞は、例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、緑藻クロレラ、ホンダワラ、ヒメツリガネゴケＣ．アガルドなど、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊髄動物由来細胞（例えば、ミバエ、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、脊椎動物由来細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）、哺乳類由来細胞（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、齧歯類、ラット、マウス、ヒト以外の霊長類、ヒトなど）などの、任意の生命体由来の細胞であり得る。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子的に改変されている。遺伝子改変宿主細胞のＤＮＡは、その細胞へのガイドＲＮＡ（または改変されるゲノム位置／配列を決定するガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意でドナー核酸の導入による改変に対応して、標的化され得る。いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作を加えて誘導プロモーター（例えば、ヒートショック プロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）に結合される。いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作を加えて空間制約及び／または一時制限プロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的、プロモーターなど）に結合される。いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、操作を加えて構成的プロモーターに結合される。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、試験管内である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、生体内である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、原核細胞であるか、または原核細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、細菌細胞であるか、または細菌細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、古細菌細胞であるか、または古細菌細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、真核細胞であるか、または真核細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、植物細胞であるか、または植物細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、動物細胞であるか、または動物細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、無脊椎動物細胞であるか、または無脊椎動物細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、脊椎動物細胞であるか、または脊椎動物細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、哺乳類細胞であるか、または哺乳類細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、齧歯動物細胞であるか、または齧歯動物細胞由来である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、ヒト細胞であるか、またはヒト細胞由来である。
本開示はさらに、遺伝子改変細胞の子孫を与え、ここでその子孫は、それが誘導された遺伝子改変細胞と同じ外因性核酸またはポリペプチドを含むことができる。本開示はさらに、遺伝子改変宿主細胞を含む組成物を提供する。
遺伝子改変幹細胞及び遺伝子改変前駆細胞
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、遺伝子改変幹細胞または前駆細胞である。適切な宿主細胞には、例えば、幹細胞（成体幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞など）及び前駆細胞（例えば、心臓前駆細胞、神経前駆細胞など）を含む。適切な宿主細胞には、例えば、齧歯動物の幹細胞、齧歯動物の前駆細胞、ヒトの幹細胞、ヒトの前駆細胞などを含む、哺乳類の幹細胞及び前駆細胞を含む。適切な宿主細胞には、試験管内の宿主細胞、例えば、単離された宿主細胞を含む。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、外因性ガイドＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、外因性部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。
いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるアミノ酸配列のいずれかの相応する部分に対して、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
組成物
本開示は、ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性改変ポリペプチドを含む組成物を提供する。いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、キメラポリペプチドである。組成物は、本開示の方法、例えば、標的ＤＮＡの部位配向性改変の方法、標的ＤＮＡ関連ポリペプチドの部位配向性改変の方法を実施するために有用である。
ガイドＲＮＡを含む組成物
本開示は、ガイドＲＮＡを含む組成物を提供する。当該組成物は、当該ガイドＲＮＡに加えて、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４などの塩、例えば、Ｔｒｉｓバッファー、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、ＭＥＳナトリウム塩、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル１−３−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）などの緩衝液、可溶化剤、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、ヌクレアーゼ阻害剤などの、１つ以上を含むことができる。例えば、いくつかのケースにおいて、組成物は、ガイドＲＮＡ及び、核酸を安定化するための緩衝液を含む。
いくつかの実施形態において、組成物に存在するガイドＲＮＡは、純粋であり、例えば、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または少なくとも約９９％以上の純度であり、ここで、「％純度」は、ガイドＲＮＡが、その他のマクロ分子、またはそのガイドＲＮＡの作製中に存在する不純物質を含まないで列挙されるパーセントである。
キメラポリペプチドを含む組成物
本開示は、キメラポリペプチドを含む組成物を提供する。当該組成物は、当該ガイドＲＮＡに加えて、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４などの塩、例えば、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳ などの緩衝液、可溶化剤、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤（例えば、ジチオスレイトール）などの、１つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態において、組成物に存在するキメラポリペプチドは、純粋であり、例えば、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または少なくとも約９９％以上の純度であり、ここで、「％純度」は、当該部位配向性改変ポリペプチドが、その他のタンパク質、その他のマクロ分子、またはそのキメラポリペプチドの生産中に存在する不純物質を含まないで列挙されるパーセントである。
ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む組成物
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、及（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、キメラ部位配向性改変ポリペプチドである。その他のケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、自然発生の部位配向性改変ポリペプチドである。いくつかの例示において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡを改変する酵素活性を示す。その他のケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを改変する酵素活性を示す。さらにその他のケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、当該標的ＤＮＡの転写を調節する。
本開示は、（ｉ）前述のガイドＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）当該ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここでその酵素活性部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される、組成物を提供する。
いくつかの例示において、組成物が、（ｉ）ガイドＲＮＡを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここでその酵素活性部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される。
その他の実施形態において、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメント含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここでその酵素活性部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される。
いくつかの実施形態において、組成物は、二重分子ガイドＲＮＡの両ＲＮＡ分子を含む。あるいは、いくつかの実施形態において、組成物は、標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントに相補的な二本鎖形成セグメントを含む活性化因子ＲＮＡを含む。当活性化因子ＲＮＡ及び標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、当該ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二本鎖を形成するようにハイブリダイズする。当該標的選択性ＲＮＡはさらに、当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）を与え及びそれゆえに、その標的化ＤＮＡ内の標的配列に対して、当該ガイドＲＮＡを標的化する。１つの非限定的な例示として、当該活性化因子ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも約７０％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。他の非限定的な例示として、当該標的選択性ＲＮＡの二本鎖形成セグメントは、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部配列と少なくとも約７０％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
本開示は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメント含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される、組成物を提供する。
例えば、いくつかのケースにおいて、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメント含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される。
他の例示として、いくつかのケースにおいて、組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部位が、そのガイドＲＮＡにより決定される。組成物は、（ｉ）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡポリヌクレオチド、及び（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチドまたは部位配向性改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに加えて、例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４などの塩、例えば、Ｔｒｉｓバッファー、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳナトリウム塩、ＭＯＰＳ、ＴＡＰＳなどの緩衝液、可溶化剤、Ｔｗｅｅｎ−２０などの非イオン性界面活性剤などの界面活性剤、プロテアーゼ阻害剤、還元剤（例えば、ジチオトレイトール）などの、１つ以上を含むことができる。
いくつかのケースにおいて、当該組成物の成分は、各々純粋であり、例えば、各成分は、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または少なくとも９９％の純度である。いくつかのケースにおいて、組成物の個別の成分は、その組成物への添加前に、純粋である。
例えば、いくつかの実施形態において、組成物に存在する部位配向性改変ポリペプチドは、純粋であり、例えば、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９８％の、少なくとも約９９％の、または９９％以上の純度であり、ここで「％純度」は、当該部位配向性改変ポリペプチドが、その他のタンパク質（例えば、その部位配向性改変ポリペプチド以外のタンパク質を含まない）、その他のマクロ分子、またはその部位配向性改変ポリペプチドの生産中に存在する不純物質を含まないで列挙されるパーセントである。
キット
本開示は、方法を実施するためのキットを提供する。キットには、部位配向性改変ポリペプチド、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化因子ＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、標的選択性ＲＮＡ、及び標的選択性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の、１つ以上を含むことができる。部位配向性改変ポリペプチド、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化因子ＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、標的選択性ＲＮＡ、及び標的選択性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、詳細が前述されている。キットは、部位配向性改変ポリペプチド、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ガイドＲＮＡ、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、活性化因子ＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、標的選択性ＲＮＡ、及び標的選択性ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の、２つ以上を含む複合体を含んで良い。いくつかの実施形態において、キットは、部位配向性改変ポリペプチド、または部位配向性改変ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドは、（ａ）当該ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部分が、そのガイドＲＮＡにより決定される。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、低いまたは不活性のヌクレアーゼ活性を示す。いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、キメラ部位配向性改変ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、キットには、部位配向性改変ポリペプチド、または部位配向性改変ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド、及びその部位配向性改変ポリペプチドを再構成及び／または希釈するための試薬を含む。別の実施形態において、キットには、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、キットには、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びその部位配向性改変ポリペプチドを再構成及び／または希釈するための試薬を含む。
部位配向性改変ポリペプチド、または部位配向性改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むキットにはさらに、当該部位配向性改変ポリペプチドを細胞に誘導するための緩衝液、洗浄用緩衝液、コントロール試薬、制限発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからの当該部位配向性改変ポリペプチドの試験管内生産のための試薬などから選択され得る、１つ以上の追加試薬を含むことができる。いくつかのケースにおいて、キットに含まれる当該部位配向性改変ポリペプチドは、前述の、キメラ部位配向性改変ポリペプチドである。
いくつかの実施形態において、キットには、ガイドＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含む。いくつかの実施形態において、当該ガイドＲＮＡはさらに、第三セグメント（前述）を含む。いくつかの実施形態において、キットには、（ｉ）ガイドＲＮＡ、またはそれををコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここでその酵素活性部位は、当該ガイドＲＮＡにより決定される。いくつかの実施形態において、当該部位配向性改変ポリペプチドの活性部分は、酵素活性を示さない（例えば、突然変異を介した不活性ヌクレアーゼを含む）。いくつかのケースにおいて、当該キットは、ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む。その他のケースにおいて、当該キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。別の例示として、キットは、（ｉ）（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、またはそれをコードするＤＮＡポリヌクレオチドを含み、及び（ｉｉ）（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含む、当該部位配向性改変ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部分は、そのガイドＲＮＡにより決定される。いくつかのケースにおいて、当該キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡ及び部位配向性改変ポリペプチドを含む。その他のケースにおいて、当該キットは、（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。本開示は、（１）（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここでその酵素活性部位が、そのガイドＲＮＡにより決定され、及び（２）その発現ベクターを再構成及び／または希釈のための試薬を含む、キットを提供する。
本開示は、（１）（ｉ）ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含み、そのガイドＲＮＡが、（ａ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｂ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含み、及び（ｉｉ）当該部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、その部位配向性改変ポリペプチドが、（ａ）そのガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここでその標的ＤＮＡ内の転写調節部分が、そのガイドＲＮＡにより決定され、及び（２）当該組換え発現ベクターの再構成及び／または希釈のための試薬を含む、キットを提供する。
本開示は、（１）（ｉ）標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、及び（ｉｉ）部位配向性改変ポリペプチドと相互作用する第二セグメントを含む、ＤＮＡ標的化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、組換え発現ベクター、及び（２）その組換え発現ベクターの再構成及び／または希釈のための試薬を含む、キットを提供する。このキットのいくつかの実施形態において、当該キットは、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含み、ここで当該部位配向性改変ポリペプチドは、（ａ）当該ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）部位配向性酵素活性を示す活性部分を含み、ここで酵素活性部位は、そのガイドＲＮＡにより決定される。このキットのその他の実施形態において、当該キットは、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを含み、ここで当該部位配向性改変ポリペプチドは、（ａ）当該ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び（ｂ）当該標的ＤＮＡ内の転写を調節する活性部分を含み、ここで当該標的ＤＮＡ内の転写調節部位は、そのガイドＲＮＡにより決定される。
上記キットのいずれかにおけるいくつかの実施形態において、当該キットは、活性化因子ＲＮＡまたは標的選択性ＲＮＡを含む。上記キットのいずれかにおけるいくつかの実施形態において、当該キットは、単分子ガイドＲＮＡを含む。上記キットのいずれかにおけるいくつかの実施形態において、当該キットは、２つ以上の二重分子または単分子ガイドＲＮＡを含む。上記キットのいずれかにおけるいくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ（例えば、２つ以上のガイドＲＮＡを含む）は、アレイ（例えば、ＲＮＡ分子のアレイ、当該ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子のアレイなど）として提供され得る。そのようなキットは、例えば、部位配向性改変ポリペプチドを含む、前述の遺伝子改変宿主細胞との組み合わせでの使用に、有用である。上記キットのいずれかにおけるいくつかの実施形態において、当該キットはさらに、望ましいい遺伝子改変をもたらすドナーポリヌクレオチドを含む。キットの成分は、別々の容器中に在り得て、または１つの容器中に組み合わせることができる。
いくつかのケースにおいて、キットはさらに、野生型Ｃａｓ９との比較で、低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す、１つ以上の変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドを含む。
いくつかのケースにおいて、キットはさらに、野生型Ｃａｓ９との比較で、低いエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す、変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、１つ以上の核酸を含む。
前述のキットのいずれかはさらに、１つ以上の追加試薬を含むことができ、ここでそのような追加試薬は、希釈緩衝液、再構築溶液、洗浄緩衝液、コントロール試薬、制限発現ベクターまたはＲＮＡポリヌクレオチド、ＤＮＡからの当該部位配向性改変ポリペプチドの試験管内生産のための試薬などから選定できる。
上記成分に加えて、キットにはさらに、方法を実践するためのキット成分の使用に対する指示書を含めることができる。当該方法の実践に対応した指示書は一般に、適切な記録媒体に記録される。例えば、当該指示書は、紙またはプラスチックなどの部材上に印刷されて良い。あるいは、当該指示書は、パッケージとしてキットに内装されて、そのキットの容器またはそれらの成分のラベルに（すなわち、パッケージまたはサブパッケージに関連した）、存在して良い。その他の実施形態において、当該指示書は、適切なコンピューター記録媒体、例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、ディスク、フラッシュメモリドライブなどに存在する電子記録データとして存在する。さらにその他の実施形態において、実際の指示書は、当該キットには無く、遠隔地の情報源から指示書を得る手段、例えば、インターネットを介して供給される。この実施形態の例示には、当該指示書が画像で見られる及び／または当該指示書がダウンロードできるｗｅｂアドレスを含む。指示書と同様に、当該指示書を入手する手段が、適切な部材上に記録される。
ヒト以外の遺伝子改変生命体
いくつかの実施形態において、遺伝子改変宿主細胞は、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子的に改変されている。仮に、そのような細胞が、真核単細胞生命体であれば、その時その改変細胞は、遺伝子的に改変された生命体であると考えることができる。いくつかの実施形態において、当該ヒト以外の遺伝子改変生命体は、Ｃａｓ９遺伝子組み換え多細胞生命体である。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたヒト以外の宿主細胞（例えば、部位配向性改変ポリペプチド、例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などをコードする、ヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子的に改変された細胞）は、遺伝子改変されたヒト以外の生命体（例えば、マウス、魚類、カエル、ハエ、ワームなど）を作製できる。例えば、仮に遺伝子改変宿主細胞が、多能性幹細胞（すなわち、ＰＳＣ）または生殖細胞（例えば、精子、卵子など）の場合、その遺伝子改変宿主細胞から、完全な遺伝子改変生命体が、誘導できる。いくつかの実施形態において、当該遺伝子改変宿主細胞は、多能性幹細胞（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、多能性植物幹細胞など）または生殖細胞（例えば、精子細胞、卵子など）であり、生体内または試験管内のいずれかにおいて、遺伝改変生命体まで行きつくことができる。いくつかの実施形態において、当該遺伝子改変宿主細胞は、脊椎動物のＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣなど）であり、及び遺伝子改変生命体（例えば、ＰＳＣを胚盤胞に注入することで、キメラ／モザイク動物を生み出し、次いで非キメラ／モザイク遺伝子改変生命体を生み出すために、植物の場合は移植で、一体となることができる）を産生するために使用される。本明細書に記述の方法を含む、遺伝子改変生命体を産生する任意の簡便な方法／手順は、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む、遺伝子改変宿主細胞の作製に適切である。遺伝子改変生命体を産生する方法は、当技術分野では公知である。例えば、Ｃｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２００９ Ｍａｒ、Ｃｈａｐｔｅｒ １９：Ｕｎｉｔ １９．１１：Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ、Ｇａｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｆｕｎｃｔ．２０１０ Ｍａｒ、２１４（２−３）：９１−１０９．Ｅｐｕｂ ２００９ Ｎｏｖ ２５：Ａｎｉｍａｌ ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ、 Ｈｕｓａｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＧＭ Ｃｒｏｐｓ．２０１１ Ｊｕｎ−Ｄｅｃ、２（３）：１５０−６２．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｊｕｎ １：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｌａｎｔｓを参照のこと。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変生命体は、本発明の方法に対応した標的細胞を含み、及びしたがって標的細胞の供給源となり得る。例えば、仮に部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む遺伝子改変細胞が、遺伝子改変生命体作製に使用される場合、その時その遺伝子改変生命体の細胞は、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含む。そのようないくつかの実施形態において、当該遺伝子改変生命体の細胞または複数細胞のＤＮＡは、その細胞または複数細胞にガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意でドナー核酸を導入することによる改変に対して、標的化され得る。例えば、ガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）の、当該遺伝子改変生命体の細胞（例えば、脳細胞、腸細胞、腎細胞、肺細胞、血液細胞など）への導入は、改変に対するそのような細胞のＤＮＡ、導入されるガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存するゲノム位置を標的化できる。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変生命体は、本発明の方法に対応した標的細胞の供給源である。例えば、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸で遺伝子的に改変された細胞を含む、遺伝子改変生命体は、遺伝子改変細胞、例えば、ＰＳＣ（例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、精子、卵子など）、神経細胞、前駆細胞、心筋細胞などの供給源を与えることができる。
いくつかの実施形態において、遺伝子改変細胞は、部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸を含むＰＳＣである。あるいは、当該ＰＳＣは、標的細胞になり得て、そのためそのＰＳＣのＤＮＡは、そのＰＳＣへのガイドＲＮＡ（またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）及び任意でドナー核酸の導入による改変に対して標的化され得て、及びその改変のゲノム位置は、導入されるガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化配列に依存するであろう。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記述の方法は、遺伝子改変生命体由来のＰＳＣのＤＮＡの改変（例えば、欠失及び／または任意の望ましいゲノム位置への置換）に使用できる。次いで、そのような改変ＰＳＣは、（ｉ）部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸、及び（ｉｉ）そのＰＳＣに導入されたＤＮＡ改変の、両方を有する生命体を産生するために使用できる。
部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸は、（すなわち、操作を加えて結合された）未知のプロモーター（例えば、その核酸が、ランダムに宿主細胞のゲノムに相互作用する場合）の制御下であり得て、または（すなわち、操作を加えて結合された）既知のプロモーターの制御下であり得る。適切な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり得て、及び恒常活性プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を含み、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体制限プロモーターなど）を含み、空間的制限及び／または一時制限のプロモーター （例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含む。
遺伝子改変生命体（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を有する生命体）は、例えば、植物、藻類、無脊椎動物（例えば、刺胞動物、棘皮動物、ワーム、ハエなど）、脊椎動物（例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、フグ、キンギョなど）、両生類（例えば、サンショウウオ、カエルなど）、爬虫類、鳥類、哺乳動物、など）、有蹄類（例えば、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシなど）、 齧歯動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット）、ウサギ目（例えば、ウサギなど）などを含む任意の生命体であり得る。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００のアミノ酸配列のいずれかにおける相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
遺伝子組換えのヒト以外の動物
前述のように、いくつかの実施形態において、核酸（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）または組換え発現ベクターは、部位配向性改変ポリペプチドを産生する遺伝子組換え動物を生み出すための組換え遺伝子として利用できる。したがって、本開示はさらに、遺伝子組換えされたヒト以外の動物を提供し、その動物は、前述の、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む組換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換えされたヒト以外の動物のゲノムは、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換えヒト以外動物は、その遺伝子改変に対してホモ型である。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換えヒト以外動物は、その遺伝子改変に対してヘテロ型である。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換えヒト以外動物は、脊椎動物、例えば、魚類（例えば、ゼブラフィッシュ、キンギョ、フグ、ドウクツギョなど）、両生類（カエル、サンショウウオなど）、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウなど）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲなど）、哺乳類（例えば、有蹄類、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど、ウサギ目（例えば、ウサギ）、齧歯動物（例えば、ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類など）などである。
部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９など）をコードするヌクレオチド配列を含む外因性核酸は、（すなわち、操作を加えて結合された）未知のプロモーター（例えば、その核酸が、ランダムに宿主細胞のゲノムに組み込む場合）の制御下であり得て、または（すなわち、操作を加えて結合された）既知のプロモーターの制御下であり得る。適切な既知のプロモーターは、任意の既知プロモーターであり得て、及び恒常活性プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を含み、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなど）を含み、空間的制限及び／または一時制限のプロモーター （例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）などを含む。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００のアミノ酸配列のいずれかにおける相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
遺伝子組換え植物
前述のように、いくつかの実施形態において、核酸（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列）または組換え発現ベクターは、部位配向性改変ポリペプチドを産生する遺伝子組換え植物を生み出すための組換え遺伝子として利用できる。したがって、本開示はさらに、遺伝子組換え植物を提供し、その植物は、前述の、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸を含む組換え遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換え植物のゲノムは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換え植物は、その遺伝子改変に対してホモ型である。いくつかの実施形態において、当該遺伝子組換え植物は、その遺伝子改変に対してヘテロ型である。
外因性核酸を植物細胞に導入する方法は、当技術分野では公知である。そのような植物細胞は、前述のように、「形質転換された」と考えられる。適切な方法には、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、遺伝子導入、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、ダイレクト・マイクロインジェクション、炭化ケイ素ウイスカー技術、アグロバクテリウム媒介形質転換などを含む。方法の選択は一般に、形質転換される細胞型及びその形質転換が行われる（すなわち、生体内、生体外、または試験管内）環境に依存する。土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）に基づく形質転換法が、維管束植物に外因性核酸分子を導入するため特に有用である。アグロバクテリウムの野生型形態は、宿主植物に腫瘍形成能のある植物えい瘤の増殖産生を指示する、Ｔｉ（腫瘍を誘発する）プラスミドを含む。そのＴｉプラスミドの腫瘍誘発Ｔ−ＤＮＡ領域の植物ゲノムへの転写には、Ｔ−ＤＮＡボーダーと同様にＴｉプラスミドがコードした病原性遺伝子が必要であり、それらは、転送される領域を記述する直接のＤＮＡリピート部のセットである。アグロバクテリウムに基づくベクターは、Ｔｉプラスミドの改変形態であり、その腫瘍誘発機能は、その植物宿主へ導入される当該核酸配列により置き換えられる。
アグロバクテリウム媒介の形質転換は一般に、当該Ｔｉプラスミドの成分が、ヘルパーベクター間で分割され、アグロバクテリウム宿主に永久に残り、及び病原性遺伝子とシャトルベクターを運び、Ｔ−ＤＮＡ配列により結合された関心のある遺伝子を含む、共組換えベクターまたはバイナリーベクターシステムを取り入れる。多様なバイナリーベクターが、当技術分野で公知であり、及び例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社 （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）から、商業的に入手できる。培養植物細胞または、例えば、葉の組織、根の移植片、多子葉植物、幹片または塊茎などの創傷組織とアグロバクテリウムを共培養する方法は、当技術分野で公知である。例えば、Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．：ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照のこと。
マイクロプロジェクタイル媒介形質転換はまた、遺伝子組換え植物の産生に使用できる。Ｋｌｅｉｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３（１９８７））により初めて記述されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジンまたはポリエチレングリコールの沈殿物によって望ましい核酸分子でコーティングした金またはタングステンなどのマイクロプロジェクタイルに依存している。このマイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ ＰＤ−１０００（Ｂｉｏｒａｄ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ Ｃａｌｉｆ．）などの装置を使用して、被子植物組織に向けて、高速で加速される。
核酸は、例えば、生体内または生体外の手順を介して、核酸が植物細胞に挿入され得る方法で、植物に導入されて良い。「生体内で」は、核酸が、植物の生体に、例えば浸潤で、投与されることを意味する。「生体外で」は、細胞または外植体が、その植物の外で改変され、及びそのような細胞または器官が、植物に再生することを意味する。遺伝子組換え植物の確立のために、植物細胞の安定的な形質転換に適切な多数のベクターが、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及びＧｅｌｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記述されたものを含めて記述されている。特定の例示には、Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ ３０３：２０９、 Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、Ｋｌｅｅ（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ３：６３７−６４２により記述されるものと同様に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミド由来のものを含める。あるいは、非Ｔｉベクターが、インタクトなのＤＮＡ送達技術を使用して、当該ＤＮＡを植物及び細胞に転送するために使用できる。これらの方法を使用して、コムギ、コメ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：９５７−９ ａｎｄ ４４６２）及びトウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ（１９９０）Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：６０３−６１８）を生産できる。未熟胚もまた、パーティクルガンを使用した直接 ＤＮＡ送達技術に対応して、単子葉植物の良い標的組織となり得る（Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０２：１０７７−１０８４、 Ｖａｓｉｌ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ １０：６６７−６７４、 Ｗａｎ ａｎｄ Ｌｅｍｅａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ １０４：３７−４８ ａｎｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ（Ｉｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １４： ７４５−７５０））。葉緑体にＤＮＡを導入するための例示的な方法には、遺伝子パーティクルガン、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションがある（Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：３４５−３４８，１９９８、Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １８： ３３−３３８，２０００、 Ｏ‘Ｎｅｉｌｌ ｅｔ ａｌ Ｐｌａｎｔ Ｊ．３：７２９−７３８，１９９３、 Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：９０６−９０９、ＵＳ５，４５１，５１３、５，５４５，８１７、５，５４５，８１８、及び５，５７６，１９８、ＷＯ９５／１６７８３、及びｉｎ Ｂｏｙｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２１７：５１０−５３６（１９９３）、Ｓｖａｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：９１３−９１７（１９９３）、及び ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７３０１−７３０５（１９９４））。遺伝子パーティクルガン、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションの方法に適切な任意のベクターは、葉緑体の形質転換にとっての標的化ベクターとして適切であろう。任意の二本鎖のＤＮＡベクターは、特にその導入方法が、アグロバクテリウムを利用しない場合、形質転換ベクターとして使用されて良い。
遺伝子的に改変できる植物には、穀物、飼料作物、果物、野菜、油種子作物、ヤシの木、森林植物、及びツル植物を含む。改変可能な植物の特定の例示として、トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、サヤエンドウ、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、コムギ、オオムギ、オートムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーション、ソルガム、ルピナス、及びコメがある。
本開示による提供されるのはまた、形質転換された植物細胞、組織、植物及びその形質転換植物細胞を含む産物である。形質転換細胞、及び組織そしてそれらを含む産物の特徴は、そのゲノムに統合された核酸の存在であり、及び例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの、部位配向性改変ポリペプチドの植物細胞による産生である。本発明の組換え植物細胞は、組換え細胞の集団として、または組織、種子、植物全体、幹、実、葉、根、花、塊茎、穀物、動物用飼料、植物分野などとして、有用である。
部位配向性改変ポリペプチド（例えば、自然発生Ｃａｓ９、改変された、すなわち突然変異のまたは変異体Ｃａｓ９、キメラＣａｓ９などの）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、（操作を加えて結合された）未知のプロモーターの制御下に在り得て（例えば、その核酸が、宿主細胞ゲノムにランダムに統合される場合）、または（操作を加えて結合された）既知のプロモーターの制御下に在り得る。適切な既知のプロモーターは、任意の既知プロモーターであり得て、及び恒常活性プロモーター、誘導性プロモーター、空間的制限及び／または一時制限のプロモーターなどを含む。
いくつかのケースにおいて、当該部位配向性改変ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００のアミノ酸配列のいずれかにおける相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。本開示により提供されるものはまた、遺伝子組換え植物の繁殖産物であり、ここで繁殖産物には、種、子孫植物及びクローン植物を含む。
詳細な説明−パートＩＩ
本開示は、宿主細胞中の標的核酸の転写を調節する方法を提供する。当該方法は一般に、当該標的核酸と、酵素的に不活性なＣａｓ９ポリペプチド及び単分子ガイドＲＮＡとの接触を含む。当該方法は、多様な用途に有用であり、そのような用途をもまた提供する。
本開示の転写の調節法は、ＲＮＡｉを含む方法の欠点のいくつかを克服する。本開示の転写調節法は、研究用途、創薬（例えば、ハイスループットスクリーニング）、標的検証、産業用途（作物システム工学、微生物工学など）、診断用途、治療用途、及び映像化技術を含む、広範囲な用途への利用を見出す。
転写調節法
本開示は、宿主細胞中の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する方法を提供する。当該方法は一般に、ａ）当該宿主細胞へのｉ）ガイドＲＮＡ、またはそのガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及びｉｉ）変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチド（「変異型Ｃａｓ９ポリペプチド」）、またはその変異型Ｃａｓ９ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の導入に関与し、ここで当該変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、低減したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す。
当該ガイドＲＮＡ（本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とも呼ぶ）は、ｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、ｉｉ）部位配向性ポリペプチドと相互作用する第二セグメント、及びｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。標的ＤＮＡ中の標的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメントは、本明細書では「標的化セグメント」と呼ぶ。部位配向性ポリペプチドと相互作用する第二セグメントはまた、本明細書では「タンパク質結合配列」または「ｄＣａｓ９結合ヘアピン」または「ｄＣａｓ９ハンドル」と呼ぶ。「セグメント」により、分子のセグメント／セクション／領域は、例えば、ＲＮＡ内の連続したヌクレオチドの長さを意味する。特定の文脈において特に定めない限り、「セグメント」の定義は、総塩基対の特定数に限定されず、及び任意の全長の及びその他と相補的な領域を含んでも含まなくても良い、ＲＮＡ分子の領域を含んで良い。前述のように、本開示におけるガイドＲＮＡは、単分子ガイドＲＮＡまたは２分子ガイドＲＮＡであり得る。用語「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、２分子ガイドＲＮＡ及び単分子ガイドＲＮＡ（すなわち、ｓｇＲＮＡ）の両方を指して、包括的である。
当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、ｉ）当該ガイドＲＮＡと相互作用するＲＮＡ結合部分、及び低減したエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を示す活性部分を含む。
当該ガイドＲＮＡ及び変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、当該宿主細胞中に複合体を形成し、その複合体は、その宿主細胞中の標的ＤＮＡの転写を選択的に調節する。
いくつかのケースにおいて、本開示の転写調節法は、宿主細胞中の標的核酸の選択的調節（例えば、抑制または促進）を与える。例えば、標的核酸の転写の「選択的」抑制は、ガイドＲＮＡ／変異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体が存在しない標的核酸の転写のレベルとの比較で、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または９０％以上までその標的核酸の転写を抑制する。標的核酸の転写の選択的抑制は、その標的核酸の転写を抑制するが、しかし非標的核酸の転写は、実質的に抑制しない、例えば、そのガイドＲＮＡ／変異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体が存在しない非標的核酸の転写のレベルとの比較で、非標的核酸の転写を、仮に抑制しても、１０％未満までしか抑制しない。
促進された転写
標的ＤＮＡの「選択的」に促進された転写は、ガイドＲＮＡ／変異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体が存在しない標的ＤＮＡの転写のレベルとの比較で、その標的ＤＮＡの転写を、少なくとも約１．１倍（例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１５倍、または少なくとも約２０倍）まで促進させることができる。標的ＤＮＡの転写の選択的増加は、その標的ＤＮＡの転写を促進させ、しかし非標的ＤＮＡの転写は、実質的に促進させない、例えば、そのガイドＲＮＡ／変異型Ｃａｓ９ポリペプチド複合体が存在しない非標的ＤＮＡの転写のレベルとの比較で、非標的ＤＮＡの転写を、仮に促進しても、約５倍未満（例えば、約４倍未満、約３倍未満、約２倍未満、約１．８倍未満、約１．６倍未満、約１．４倍未満、約１．２倍未満、または約１．１倍未満）までしか促進させない。
非限定的な例示として、促進された転写は、ｄＣａｓ９と異種配列との融合により達成できる。適切な融合相手には、非限定的に、その標的ＤＮＡまたはその標的ＤＮＡ関連のポリペプチド（例えば、ヒストンまたはその他のＤＮＡ結合タンパク質）への直接作用により、転写を間接的に促進させる活性を与えるポリペプチドを含む。適切な融合相手には、非限定的に、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチドを含む。
追加の適切な融合相手には、非限定的に、当該標的核酸の促進した転写を直接的に提供するポリペプチド（例えば、転写活性化因子またはそれらのフラグメント、タンパク質または転写活性化因子を採用するそれらのフラグメント、小分子／薬剤応答性転写調節因子など）を含む。
原核生物における転写を促進させるための、ｄＣａｓ９融合タンパク質を使用した方法の非限定的な例示には、細菌の１−ハイブリッド（Ｂ１Ｈ）または２−ハイブリッド（Ｂ２Ｈ）システムを含める。Ｂ１Ｈシステムにおいて、ＤＮＡ結合ドメイン（ＢＤ）は、細菌転写活性化ドメイン（ＡＤ、例えば、エシェリキア属大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰａ）のαサブユニット）と融合される。したがって、ｄＣａｓ９は、ＡＤを含む異種配列と融合され得る。当該ｄＣａｓ９融合タンパク質が、プロモーターの上流域に到達する場合（当該ガイドＲＮＡによりそこが標的化される）、そのｄＣａｓ９融合タンパク質のＡＤ（例えば、ＲＮＡＰａ）は、転写活性に導く、ＲＮＡＰホロ酵素を採用する。Ｂ２Ｈシステムにおいて、当該ＢＤは、当該ＡＤと直接的には融合せず、代わりに、タンパク質−タンパク質相互作用（例えば、ＧＡＬ１１Ｐ−ＧＡＬ４相互作用）による、それらの相互作用が媒介される。当該方法で利用するため、そのようなシステムを改変するために、ｄＣａｓ９は、タンパク質−タンパク質相互作用を与える第一タンパク質配列（例えば、酵母ＧＡＬ１１Ｐ及び／またはＧＡＬ４タンパク質）と融合でき、及びＲＮＡａが、タンパク質−タンパク質相互作用を完成させる第二タンパク質配列（例えば、仮にＧＡＬ１１ＰがｄＣａｓ９に融合されているならばＧＡＬ４、仮にＧＡＬ４がｄＣａｓ９に融合されているならばＧＡＬ１１Ｐ）と融合できる。ＧＡＬ１１ＰとＧＡＬ４間の結合親和性は、結合効率及び転写射程率を増加させる。
真核生物の転写を促進するための、ｄＣａｓ９融合タンパク質を使用する方法の非限定的な例示には、ｄＣａｓ９の活性化ドメイン（ＡＤ）（例えば、ＣＡＬ４、ヘウペスウイルス活性化プロテインＶＰ１６またはＶＰ６４、ヒト核因子ＮＦ−ｋＢ ｐ６５サブユニットなど）への融合を含める。当該システムに誘導性を与えるために、ｄＣａｓ９融合タンパク質の発現は、誘導プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）により制御できる。当該ガイドＲＮＡは、既知の転写応答エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）、既知の上流活性化配列（ＵＡＳ）、その標的ＤＮＡの発現を制御できると疑われる未知または既知機能の配列などを標的化するために設計できる。
追加の融合相手
転写の促進または抑制を達成する融合相手の非限定的な例示には、転写活性化因子及び転写リプレッサードメイン（クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）、Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＤＲ）など）を含む。いくつかのそのようなケースにおいて、当該ｄＣａｓ９融合タンパク質は、当該ガイドＲＮＡにより、その標的ＤＮＡの特定位置（すなわち、配列）に標的化され、及びプロモーターに結合しているＲＮＡポリメラーゼを（転写活性化機能を選択的に阻害して）ブロッキングし、及び／またはその遺伝子座のクロマチン状態を改変する（例えば、融合配列が、その標的ＤＮＡを改変するまたはその標的ＤＮＡ関連ポリペプチドを改変するために使用される場合）などの、遺伝子座特異的抑制を発揮する。いくつかのケースにおいて、その変化は一時的である（例えば、転写抑制または活性化）。いくつかのケースにおいて、その変化は継承的である（例えば、エピジェネティックな改変が、その標的ＤＮＡにまたはその標的ＤＮＡ関連タンパク質、例えば、ヌクレオソームのヒストンに行われた場合）。
いくつかの実施形態において、当該異種配列は、当該ｄＣａｓ９ポリペプチドのＣ末端と融合できる。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、当該ｄＣａｓ９ポリペプチドのＮ末端と融合できる。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、当該ｄＣａｓ９ポリペプチドの内部（すなわち、ＮまたはＣ末端以外の部分）と融合できる。
ｄＣａｓ９融合タンパク質を用いた方法の生物学的効果は、任意の簡便な方法（例えば、遺伝子発現アッセイ、例えば、クロマチン免疫沈降 （ＣｈｉＰ）、クロマチン生体内分析（ＣｉＡ）などのクロマチンに基づくアッセイ、など）で検出できる。
いくつかのケースにおいて、方法は、２つ以上の異なるガイドＲＮＡの使用を含む。例えば、２つの異なるガイドＲＮＡは、単一の宿主細胞中で使用でき、ここでその２つの異なるガイドＲＮＡは、同じ標的核酸中の２つの異なる標的配列を標的化する。
したがって、例えば、転写調節法はさらに、第二ガイドＲＮＡ、またはその第二ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の宿主細胞への導入を含み、ここでその第二ガイドＲＮＡは、ｉ）当該標的ＤＮＡにおける第二標的配列と相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、ｉｉ）当該部位配向性ポリペプチドと相互作用する第二セグメント、及びｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。いくつかのケースにおいて、同じ標的核酸における２つの異なる標的化配列を標的化している２つの異なるガイドＲＮＡの使用が、その標的核酸における転写に、増加した調節（例えば、抑制または促進）を与える。
他の例示として、２つの異なるガイドＲＮＡは、単一の宿主細胞中で使用でき、ここで、その２つの異なるガイドＲＮＡは、２つの異なる標的核酸を標的化する。したがって、例えば、転写調節法はさらに、第二ガイドＲＮＡ、またはその第二ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の、その宿主細胞への導入を含み、ここで、その第二ガイドＲＮＡは、ｉ）少なくとも第二標的ＤＮＡにおいて、標的配列と相補的なヌクレオチド配列を含む第一セグメント、ｉｉ）当該部位配向性ポリペプチドと相互作用する第二セグメント、及びｉｉｉ）転写ターミネーターを含む。
いくつかの実施形態において、核酸（例えば、単分子ガイドＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡ，標的選択性ＲＮＡなどのガイドＲＮＡ、ドナーポリヌクレオチド、部位配向性改変ポリペプチドをコードする核酸など）は、追加の望ましい性質（例えば、改変または調節された安定性、細胞内標的、例えば蛍光ラベルなどのトラッキング、タンパク質またはタンパク質複合体の結合部位など）を与える改変または配列を含む。非限定的な例示には、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレート キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）、リボスイッチ配列またはアプタマー配列（例えば、タンパク質及び／またはタンパク質複合体による制限された安定性及び／または制限された接近性を可能にするために）、ターミネーター配列、ｄｓＲＮＡ二本鎖 （すなわち、ヘアピン）を形成する配列、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に当該ＲＮＡを標的化する改変または配列、トラッキングを提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接共役、蛍光検出を容易にする部分への共役、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチル基転移酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンのアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、などを含むＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を与える改変または配列、及びそれらの組み合わせを含む。
ＤＮＡ標的化セグメント
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（または「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特定配列に相補的なヌクレオチド配列（その標的ＤＮＡの相補鎖）を含む。
換言すると、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対）を介した配列特異的な方法において、標的ＤＮＡと相互作用する。あるいは、当該ＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列は、変化して良く、及びそのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の場所を決定する。ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の望ましい配列へハイブリダイズするために（例えば、遺伝子工学的に）改変できる。
安定性制御配列（例えば、転写ターミネーターセグメント）
安定性制御配列は、ＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ、標的選択性ＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡなど）の安定性に影響を与える。適切な安定性制御配列の一例として、転写ターミネーターセグメント（すなわち、転写終止配列）がある。ガイドＲＮＡの転写ターミネーターセグメントは、約１０ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドまでの、例えば、約１０ヌクレオチド（ｎｔ）から約２０ｎｔまでの、約２０ｎｔから約３０ｎｔまでの、約３０ｎｔから約４０ｎｔまでの、約４０ｎｔから約５０ｎｔまでの、約５０ｎｔから約６０ｎｔまでの、約６０ｎｔから約７０ｎｔまでの、約７０ｎｔから約８０ｎｔまでの、約８０ｎｔから約９０ｎｔまでの、または約９０ｎｔから約１００ｎｔまでの全長を有することができる。例えば、当該転写ターミネーターセグメントは、約１５ヌクレオチド（ｎｔ）から約８０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約５０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約４０ｎｔまでの、約１５ｎｔから約３０ｎｔまでの、または約１５ｎｔから約２５ｎｔまでの全長を有することができる。
いくつかのケースにおいて、当該転写終止配列は、真核細胞中で機能的な配列の１つである。いくつかのケースにおいて、当該転写終止配列は、原核細胞中で機能的な配列の１つである。
安定性制御配列（例えば、転写終止セグメント、または向上した安定性を提供するガイドＲＮＡの任意のセグメント）に含むことができるヌクレオチド配列は、例えば、５’−ＵＡＡＵＣＣＣＡＣＡＧＣＣＧＣＣＡＧＵＵＣＣＧＣＵＧＧＣＧＧＣＡＵＵＵＵ−５’（Ｒｈｏ−独立ｔｒｐ終止部位）を含む。
追加の配列
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、５’または３’末端のいずれかに、少なくとも１つの追加セグメントを含む。例えば、適切な追加セグメントには、５’キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化尾部（すなわち、３’ポリ（Ａ）尾部）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及びタンパク質複合体による調節された安定性及び／または調節された接近性を可能にするために）、ｄｓＲＮＡ二本鎖 （すなわち、ヘアピン）を形成する配列、細胞内の場所（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に当該ＲＮＡを標的化する配列、トラッキングを提供する改変または配列（例えば、蛍光分子への直接共役、蛍光検出を容易にする部分への共役、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、転写活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡメチル基転移酵素、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンのアセチル基転移酵素、ヒストン脱アセチル化酵素、などを含むＤＮＡに作用するタンパク質）に結合部位を与える改変または配列、高められた、低められた及び／または制御可能な安定性を提供する改変または配列、及びそれらの組み合わせを含む。
多重同時ガイドＲＮＡ
いくつかの実施形態において、多重ガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡまたは異なる標的ＤＮＡｓでの異なる位置における転写を同時に調節するのために、同じ細胞中で同時に使用される。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、同じ遺伝子または転写産物または遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる無関係の遺伝子座を標的化する。いくつかの実施形態において、２つ以上のガイドＲＮＡは、異なる、しかし関連する遺伝子座を標的化する。
当該ガイドＲＮＡは、小さく及び堅牢なので、同じ発現ベクターに同時に存在でき、及びもし必要であれば同じ転写制御下でさえ、存在し得る。いくつかの実施形態において、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、３５以上、４０以上、４５以上、または５０以上）のガイドＲＮＡは、標的細胞中で、同時に（同じまたは異なるベクターから）発現する。その発現したガイドＲＮＡは、例えば、化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、リステリア・イノキュア、及び髄膜炎菌などの異なる細菌由来のＣａｓ９タンパク質により、別々に認識され得る。
いくつかのケースにおいて、多重ガイドＲＮＡは、標的選択性ＲＮＡ及び相応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）の自然発生ＣＲＩＳＰＲアレイを模倣するアレイにおいて、コードされ得る。その標的化セグメントは、約３０ヌクレオチド長の配列（約１６から約１００ｎｔであり得る）としてコードされ、及びＣＲＩＳＰＲリピート部配列により分離される。いくつかのケースにおいて、当該アレイ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、そのＲＮＡをコードするＤＮＡにより細胞に導入される。いくつかのケースにおいて、それらは、ＲＮＡとしてその細胞に導入される。
多重ガイドＲＮＡを発現するために、Ｃｓｙ４エンドリボヌクレアーゼにより媒介された人工的なＲＮＡ加工システムを使用できる。多重ガイドＲＮＡは、前駆体転写産物（例えば、Ｕ６プロモーターから発現した）上のタンデムアレイに結合され得て、及びＣｓｙ４特異的なＲＮＡ配列により分離され得る。共発現Ｃｓｙ４タンパク質は、その前駆体転写産物を、多重ガイドＲＮＡに開裂する。ＲＮＡ加工システムを利用する利点は、第一に、多重プロモーターを使用する必要がない、第二に、全てのガイドＲＮＡは、前駆体転写産物から加工されるので、同じｄＣａｓ９結合に対して、それらの濃度が正規化される。
Ｃｓｙ４は、緑膿菌由来の小さなエンドリボヌクレアーゼ（ＲＮＡａｓｅ）タンパク質である。Ｃｓｙ４は、最小の１７−ｂｐＲＮＡヘアピンを特異的に認識し、及び急速（＜１分）かつ高効率（＞９９．９％）なＲＮＡ開裂を示す。ほとんどのＲＮＡａｓｅと異なり、その開裂されたＲＮＡフラグメントは、安定性及び機能的な活性を保持している。当該Ｃｓｙ４に基づくＲＮＡ開裂は、人工的なＲＮＡ加工システム中で、再び目的を果たすことができる。このシステムにおいて、当該１７−ｂｐＲＮＡヘアピンは、単一プロモーターからの前駆体転写産物として転写される多重ＲＮＡフラグメント間に挿入される。Ｃｓｙ４の共発現は、個別のＲＮＡフラグメントの産生に効果的である。
部位配向性ポリペプチド
前述のように、ガイドＲＮＡ及び変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、複合体を形成する。そのガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの配列に相補的なヌクレオチド配列を含むことにより、その複合体を特異的に標的化する。その変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、エンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を抑制している。例えば、本開示の転写調節法に使用するのに適切な変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドの、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に提示されるアミノ酸配列を含む野生型Ｃａｓ９ポリペプチドのエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性の、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、または約０．１％未満を示す。いくつかの実施形態において、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、実質的に検出可能なエンドデオキシリボヌクレアーゼ活性を持たない。いくつかの実施形態において、部位配向性ポリペプチドが、触媒活性を抑制している場合（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の化膿レンサ球菌Ｃａｓ９タンパク質が、Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７突然変異、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／またはＤ９８６Ａを有する場合）、そのポリペプチドは、そのガイドＲＮＡと相互作用する能力がある限り、部位特異的な方法で依然として標的ＤＮＡに結合できる（なぜなら、それはガイドＲＮＡにより標的ＤＮＡ配列に依然としてガイドされるから）。
いくつかのケースにおいて適切な変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸７−１６６及び／または７３１−１００３に、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００のアミノ酸配列のいずれかの相応する部分に、少なくとも約７５％の、少なくとも約８０％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、少なくとも約９９％の、または１００％のアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を含む。
いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、その標的ＤＮＡの相補鎖を開裂でき、しかしその標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂する能力が抑制されたニッカーゼである。例えば、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、そのＲｕｖＣドメインの機能を抑制した突然変異（アミノ酸置換）を有することができる。非限定的な例示として、いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＤ１０Ａ（アスパラギン酸からアラニン）突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるアミノ酸配列のいずれかの相応する部分）である。
いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、その標的ＤＮＡの非相補鎖を開裂でき、しかしその標的ＤＮＡの相補鎖を開裂する能力が抑制されたニッカーゼである。例えば、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、そのＨＮＨドメイン（ＲｕｖＣ／ＨＮＨ／ＲｕｖＣドメインモチーフ、「ドメイン２」）の機能を抑制する突然変異（アミノ酸置換）を有することができる。非限定的な例示として、いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、Ｈ８４０Ａ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のアミノ酸位８４０におけるヒスチジンからアラニン）（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるアミノ酸配列のいずれかの相応する突然変異）である。
いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、その標的ＤＮＡの相補鎖及び非相補鎖の両方の開裂に対して抑制された能力を有する。非限定的な例示として、いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａの両突然変異（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるアミノ酸配列のいずれかの相応する突然変異）を含む。その他の残基は、同様の効果を達成するために突然変異化され得る（すなわち、不活性またはその他のヌクレアーゼ部分）。非限定的な例示として、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９残基であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８のＤ１０、 Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ：１−８００に提示されるタンパク質のいずれかの相応する突然変異）は、変更（すなわち置換）できる（Ｃａｓ９アミノ酸残基の保存の例示に対応した表１を参照）。また、アラニン置換以外の突然変異が考慮される。
いくつかの実施形態において、変異型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９突然変異Ｅ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相応する１つ以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態において、この改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼはさらに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８における、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９突然変異Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｎ９８２ＡまたはＡ９８４Ａに相応する１つ以上の突然変異を含む。
いくつかのケースにおいて、当該変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、融合ポリペプチド（「変異型Ｃａｓ９融合ポリペプチド」）、すなわち、ｉ）変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチド、及びｉｉ）共有結合した異種ポリペプチド（また「融合相手」と呼ぶ）を含む融合ポリペプチドである。
当該異種ポリペプチドは、当該変異型Ｃａｓ９融合ポリペプチドにより示される活性（例えば、メチル基転移酵素活性、アセチル基転移酵素活性、キナーゼ活性、ユビキチン化活性など）を示して良い（例えば、酵素活性）。異種核酸配列は、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を作製するために、別の核酸配列に（例えば、遺伝子工学的に）結合して良い。いくつかの実施形態において、変異型Ｃａｓ９融合ポリペプチドは、細胞内局在化（すなわち、当該異種配列が、例えば、核を標的化するための核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的化するためのミトコンドリア局在化シグナル、葉緑体を局在化するための葉緑体局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなど細胞内局在配列である）を提供する異種配列と、変異型Ｃａｓ９ポリペプチドとの融合により作製される。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、トラッキング及び／または精製を容易にするために、タグ（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏなど、ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなど）を与えることができる（すなわち、当該異種配列は、検出可能な標識である）。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、促進されたまたは抑制された安定性を提供できる（すなわち、当該異種配列は、安定性制御ペプチド、例えば、デグロンであり、いくつかのケースでは制御可能である（例えば、温度感応性または薬剤制御可能デグロン配列、以下を参照））。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、その標的ＤＮＡからの促進されたまたは抑制された転写を与えることができる（すなわち、当該異種配列は、転写調節配列であり、例えば、転写因子／活性化因子またはそれらのフラグメント、転写因子／活性化因子を採用するタンパク質またはそれらのフラグメント、転写リプレッサーまたはそれらのフラグメント、転写リプレッサーを採用するタンパク質またはそれらのフラグメント、小分子／薬剤応答性転写制御因子などである）。いくつかの実施形態において、当該異種配列は、結合ドメインを与えることができる（すなわち、当該異種配列は、例えば、ＤＮＡまたはヒストン改変タンパク質、転写因子または転写リプレッサー、リクルートタンパク質などの、関心のある別のタンパク質にキメラｄＣａｓ９ポリペプチドを結合する能力を与えるための、タンパク質結合配列である）。
促進されたまたは抑制された安定性を与える適切な融合相手には、非限定的にデグロン配列を含む。デグロンは、それらが一部であるタンパク質の安定性を制御するアミノ酸配列であることは、当業者には容易に理解されよう。例えば、デグロン配列を含むタンパク質の安定性は、そのデグロン配列により、少なくとも部分的に制御される。いくつかのケースにおいて、適切なデグロンは、そのデグロンが、実験制御において、タンパク質の安定性自身に影響を発揮するような構造である（すなわち、デグロンは、薬剤誘発性、温度誘発性などではない）。いくつかのケースにおいて、当該デグロンは、当該変異型Ｃａｓ９ポリペプチドに制御可能な安定性を与え、そのためその変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、望ましい条件に応じて「機能開始」（すなわち、安定に）または「機能終止」（すなわち不安定に）になり得る。例えば、仮にそのデグロンが、温度感応性デグロンであれば、当該変異型Ｃａｓ９ポリペプチドは、閾値温度以未満で（例えば、４２℃、４１℃、４０℃、３９℃、３８℃、３７℃、３６℃、３５℃、３４℃、３３℃、３２℃、３１℃、３０℃など）で機能的に（すなわち「機能開始する」、安定に）、しかしその閾値温度超では非機能的に（すなわち、「機能終止する」、分解され）であって良い。他の例示として、仮にそのデグロンが、薬剤誘発性デグロンであれば、薬剤の有無が、そのタンパク質を、「機能終止」（すなわち、不安定な）状態から「機能開始」（すなわち、安定な）状態まで、またはその逆に切り替えることができる。例示的な薬剤誘導性デグロンは、ＦＫＢＰ１２タンパク質から誘導される。当該デグロンの安定性は、そのデグロンに結合した小分子の有無により制御される。
適切なデグロンの例示には、非限定的に、Ｓｈｉｅｌｄ−１、ＤＨＦＲ、オーキシン、及び／または温度により制御されるデグロンを含む。適切なデグロンの非限定的な例示は、当技術分野で公知である（例えば、Ｄｏｈｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４．２６３（５１５１）：ｐ．１２７３−１２７６：Ｈｅａｔ−ｉｎｄｕｓｈｉｂｌｅ ｄｅｇｒｏｎ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｕｔａｎｔｓ、 Ｓｃｈｏｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｒｅｎａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００９ Ｊａｎ、２９６（１）：Ｆ２０４−１１：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｆａｓｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ ＴＲＰＶ５ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｓｈｉｅｌｄ−１、Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ．２００８ Ｎｏｖ １５、１８（２２）：５９４１−４：Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｗｈｉｔｈ ＦＫＢＰ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ、Ｋａｎｅｍａｋｉ，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．２０１２ Ｄｅｃ ２８：Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｈｉｔｈ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｅｇｒｏｎｓ、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１２ Ｎｏｖ ３０、４８（４）：４８７−８：Ｔｉｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ：ｔｈｅ ｍｅｔｈｙｌ ｄｅｇｒｏｎ、Ｂａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１３ Ｊａｎ １８、３３（１）．：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｐａｒｔｉｔｅ ｄｅｇｒｏｎ ｔｈａｔ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ、及びＧｒｅｕｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１２ Ｎｏｖ １０、（６９）：Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｕｌｉｔｙ ｉｎ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｄｅｇｒｏｎ （ｄｇｎ）−ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）−ｂａｓｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ、これらの全体を、参照として本明細書に組み入れる）。
例示的なデグロン配列は、良好に特徴付けられており、及び細胞と動物の両方で試験されている。したがって、Ｃａｓ９のデグロン配列への融合は、「調節可能な」及び「誘発可能な」Ｃａｓ９ポリペプチドを産生する。本明細書に記述する融合相手のいずれも、任意の望ましい組み合わせに使用できる。この点を説明する非限定的な１つの例示として、Ｃａｓ９融合タンパク質は、検出に対応したＹＦＰ配列、安定性のためのデグロン配列、及び当該標的ＤＮＡの転写を促進するための転写活性化因子配列を含むことができる。さらに、Ｃａｓ９融合タンパク質に使用できる多数の融合相手は、特に限定されない。いくつかのケースにおいて、Ｃａｓ９融合タンパク質は、１つ以上の（例えば、２つ以上の、３つ以上の、４つ以上の、または５つ以上の）異種配列を含む。
適切な融合相手には、非限定的に、メチル基転移酵素活性、脱メチル化酵素活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化酵素活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性を提供するポリペプチド、ＤＮＡの直接的な改変（例えば、ＤＮＡのメチル化）またはＤＮＡ関連ポリペプチドの改変（例えば、ヒストンまたはＤＮＡ結合タンパク質）を指示できるいずれかのものを含む。さらに適切な融合相手には、非限定的に、境界（例えば、ＣＴＣＦ）、タンパク質及び周辺での採用を与えるそれらのフラグメント（例えば、ラミンＡ、ラミンＢなど）、タンパク質結合エレメント（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１など）を含む。
いくつかの実施形態において、部位配向性改変ポリペプチドは、最適化されたコドンであり得る。このタイプの最適化は、当技術分野では公知であり、及びその同じタンパク質をコードする一方で、意図した宿主生命体または細胞のコドン選好性を模倣するために、外来誘導ＤＮＡの突然変異を伴う。したがって、当該コドンは変化するが、コードされたタンパク質は変化せずに残る。例えば、仮に意図した標的細胞が、ヒト細胞の場合、ヒトコドン最適化ｄＣａｓ９（またはｄＣａｓ９変異体）は、適切な部位配向性改変ポリペプチドであろう。他の非限定的な例示として、仮に意図した標的細胞が、マウス細胞の場合、マウスコドン最適化Ｃａｓ９（または変異体、例えば、酵素不活性変異体）は、適切なＣａｓ９部位配向性ポリペプチドであろう。一方、コドン最適化が必要でない場合も、特定のケースでは許容可能であり、好ましい。
ポリアデニル化シグナルをまた、意図した宿主細胞における発現を最適化するために選ぶことができる。
宿主細胞
転写を調節する本開示の方法は、生体内及び／または生体外及び／または試験管内での分裂または分裂後細胞における転写調節を誘発するために取り入れられて良い。当該ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡとのハイブリダイズにより特異性を与えるので、分裂または分裂後細胞は、多様な宿主細胞のいずれかであり得る。ここで適切な宿主細胞には、非限定的に、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞の真核生物、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、コナミドリムシ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ、ホンダワラ、ヒメツリガネゴケＣ．ホンダワラなど、真菌細胞、動物細胞、無脊椎動物由来細胞（例えば、昆虫、刺胞動物、棘皮動物、線虫など）、真核生物の寄生虫（例えば、マラリアの寄生虫、例えば、熱帯熱マラリア原虫 、蠕虫など）、脊椎動物由来細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類）、哺乳動物細胞、例えば、齧歯動物細胞、ヒト細胞、ヒト以外の霊長類細胞などを含む。適切な宿主細胞には、自然発生細胞、遺伝子改変細胞（例えば、実験室で、例えば「人間の手」によって、遺伝子的に改変された細胞）、及びに任意の方法において試験管内で操作された細胞を含む。いくつかのケースにおいて、宿主細胞は、単離される。
任意の種類の細胞が、関心の対象であって良い（例えば、萌芽期の幹 （ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、神経細胞、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞などの体細胞、例えば、１−細胞、２−細胞、４−細胞、８−細胞などの段階のゼブラフィッシュの胚などの、試験管内または生体内の、任意段階の胚の胚性細胞）。細胞は、樹立細胞株由来であって良く、または一次細胞であって良く、ここで「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養」は、限定された継代数、すなわち培養の株分けに対応して試験管内の増殖を可能にし、そこから誘導された、細胞及び細胞培養を指して、本明細書では互換的に使用する。例えば、一次培養は、クライシス段階に至るには不十分な回数の、ゼロ回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回の継代を経て良い培養である。一次細胞株は、試験管内で１０回未満の継代を維持され得る。標的細胞は、多くの実施形態においては単細胞生命体であり、または培養で増殖する。
仮に、当該細胞が、一次細胞であるならば、そのような細胞は、任意の簡便な方法により個体から採取されて良い。例えば、白血球は、血液浄化療法、白血球搬出法、密度勾配分離法などにより簡便に採取されて良い一方、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などの組織由来の細胞は、生研により、最も簡便に採取されて良い。その採取された細胞の分散または懸濁には、適切な溶液が使用されて良い。そのような溶液は一般に、通常の生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩溶液などの緩衝塩溶液であり、ウシ胎児血清からまたはその他の自然発生因子から簡便に補充され、例えば、５−２５ｍＭの低い濃度の許容される緩衝液との組み合わせで、使用される溶液である。簡便な緩衝液には、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを含む。当該細胞は、即座に使用されて良く、または長期間にわたり、貯蔵され、冷凍され、再利用できるように解凍されて良い。そのようなケースにおいて、当該細胞は通常、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、５０％血清、４０％緩衝媒体中で、またはそのような冷凍温度に細胞を維持するために、当技術分野で普通に使用される、いくつかのその他のそうした溶液中で冷凍され、及び冷凍培養細胞の解凍に対応した当技術分野で公知の方法で解凍される。
核酸の宿主細胞への導入
ガイドＲＮＡ、またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、多様な公知の方法のいずれかにより宿主細胞へ導入できる。同様に、この方法は、変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸の、宿主細胞への導入を含み、そのような核酸は、多様な公知の方法のいずれかにより宿主細胞へ導入され得る。
核酸を宿主細胞へ導入する方法は、当技術分野では公知であり、及び任意の公知の方法を、核酸（例えば、発現コンストラクト）を幹細胞または前駆細胞に導入するために使用できる。適切な方法には、ウイルスまたはバクテリオファージ感染、遺伝子導入、接合、プロトプラスト融合、リポフェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）介在遺伝子導入、ＤＥＡＥ― デキストラン介在遺伝子導入、リポソーム介在遺伝子導入、パーティクル・ガン技術、ダイレクト・マイクロインジェクション、ナノ粒子介在核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ ｅｔ．，ａｌ Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．２０１２ Ｓｅｐ １３．ｐｉｉ：５０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）などを含む。
核酸
本開示は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。いくつかのケースにおいて、核酸はまた、変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態において、この方法は、ガイドＲＮＡ及び変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸の、宿主細胞（または宿主細胞の集団）への導入を取り込む。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む細胞は、試験管内である。いくつかの実施形態において、標的ＤＮＡを含む細胞は、生体内である。ガイドＲＮＡ及び／または部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む適切な核酸は、発現ベクターを含み、ここでガイドＲＮＡ及び／または部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターは、「組換え発現ベクター」である。
いくつかの実施形態において、当該組換え発現ベクターは、ウイルスコンストラクト、例えば、組換えアデノ随伴ウイルスコンストラクト（例えば、ＵＳ７，０７８，３８７を参照）、組換えアデノウイルスコンストラクト、組換えレンチウイルスコンストラクト、組換えレトロウイルスコンストラクトなどである。適切な発現ベクターには、非限定的に、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルスに基づくウイルスベクター（例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３５：２５４３ ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ６：５１５ ５２４，１９９９、Ｌｉ ａｎｄ Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ ９２：７７００ ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：１０８８ １０９７，１９９９、ＷＯ ９４／１２６４９、ＷＯ ９３／０３７６９、ＷＯ ９３／１９１９１、ＷＯ ９４／２８９３８、ＷＯ ９５／１１９８４及びＷＯ ９５／００６５５を参照）、アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ９：８１ ８６，１９９８，Ｆｌａｎｎｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：６９１６ ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ ３８：２８５７ ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ４：６８３ ６９０，１９９７，Ｒｏｌｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：６４１ ６４８，１９９９、Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ５：５９１ ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｉｎ ＷＯ ９３／０９２３９，Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ９４：１０３１９ ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３：７８１２ ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、ハーヴェイの肉腫のウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄肉腫ウイルス、及び乳腺腫瘍ウイルスなどのレトルウイルス由来のベクター）など）を含む。
多数の適切な発現ベクターが、当業者に知られており、及び多くは、商業的に入手可能である。真核生物の宿主細胞に対しては、例えば、次のベクター、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、及びｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）が、例示として与えられる。しかしながら、その宿主細胞と互換性がある限り、その他の任意のベクターが使用されて良い。
利用する宿主／ベクター系に応じて、構造性及び誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなど含む、多数の適切な転写及び翻訳制御エレメントのいずれかが、発現ベクターに使用されて良い（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６−５４４を参照）。
いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御エレメント、例えば、プロモーターなどの転写制御エレメントに操作を加えて結合できる。その転写制御エレメントは、真核細胞、例えば哺乳類細胞、または原核細胞（例えば、細菌または古細菌細胞）のいずれかに機能的であって良い。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及び／または変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、原核及び真核の両細胞に、ガイドＲＮＡ及び／または変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、多重制御エレメントに操作を加えて結合できる。
プロモーターは、恒常活性プロモーター（すなわち、恒常的に活性／「ＯＮ」状態のプロモーター）であり得て、誘導性プロモーター（すなわち、活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」状態の、外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在で、制御されるプロモーター）であって良く、空間制約プロモーター（すなわち、転写制御エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異のプロモーター、細胞型特異のプロモーターなど）であって良く、及び一時的制限プロモーター（すなわち、このプロモーターは、特定の萌芽期の成長段階の間または特定の生物学的過程段階の間、例えば、マウスの毛包サイクルの間、「ＯＮ」または「ＯＦＦ」状態）であって良い。
適切なプロモーターは、ウイルス由来であり得て、及びそれゆえウイルスプロモーターと呼ばれ、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生命体由来であり得る。適切なプロモーターは、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、ｐｏｌＩＩＩ）により発現を推進するために使用できる。例示的なプロモーターには、非限定的に、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスロングターミナル繰り返し（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルスの主要後期プロモーター（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ 即時初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などの、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター （例えば、 Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００３ Ｓｅｐ １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）などを含む。
誘導プロモーターの例示には、非限定的に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）−調節プロモーター、乳糖誘導プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、Ｔｅｔ−ＯＮ、Ｔｅｔ−ＯＦＦなど）、ステロイド調節プロモーター、金属調節プロモーター、エストロゲン受容体調節プロモーターなどを含む。誘導性プロモーターはそのため、非限定的に、ドキシサイクリン、ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、エストロゲン受容体、エストロゲン受容体融合などを含む分子により調節できる。
いくつかの実施形態において、当該プロモーターは、空間的に制約されたプロモーター（すなわち、細胞型特異の的プロモーター、組織特異的プロモーターなど）であり、そのため多細胞の生命体においては、当該プロモーターは、特定細胞のサブセットにおいて活性（すなわち「ＯＮ」）である。空間的に制約されたプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御エレメント、制御配列などを指して良い。任意の簡便な空間的制約プロモーターを利用して良く、及び適切なプロモーターの選定（例えば、脳特異的プロモーター、神経細胞のサブセットに発現を推進するプロモーター、生殖細胞に発現を推進するプロモーター、肺に発現を推進するプロモーター、筋肉に発現を推進するプロモーター、膵臓の膵島細胞に発現を推進するプロモーターなど）は、その生命体に依存するであろう。例えば、様々な空間的制約プロモーターが、植物、ハエ、ワーム、哺乳類、マウス、などで知られている。したがって、空間的制約プロモーターは、生命体に依存して、非常に多様な異なる組織及び細胞型における、部位配向性ポリペプチドをコードする核酸の発現を調節するために使用できる。いくつかの空間的制約プロモーターはまた、一時的に制約され、そのためそのプロモーターは、胚発生の特定段階の間または生物学的過程の特定段階（例えば、マウスの毛包サイクル）の間に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態にある。
説明のために、空間的制約プロモーターの例として、非限定的に、ニューロン特異的プロモーター、脂肪細胞特異的プロモーター、心筋細胞特異的プロモーター、平滑筋特異的プロモーター、視細胞特異的プロモーターなどを含む。ニューロン特異的な空間的制約プロモーターには、非限定的に、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーター（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２、Ｘ５１９５６を参照）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＤＣ）プロモーター、ニューロフィラメントプロモーター （例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ、Ｌ０４１４７を参照）、シナプシンプロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ、Ｍ５５３０１を参照）、ｔｈｙ−１プロモーター （例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７−１９、及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１−１１６６を参照）、セロトニン受容体プロモーター （例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）、チロシン水酸化酵素プロモーター（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７、Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４、Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １８：９９８９、及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３−５９４を参照）、ＧｎＲＨプロモーター（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２−３４０６を参照）、Ｌ７プロモーター（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３−２２６を参照）、ＤＮＭＴプロモーター（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８−３６５２を参照）、エンケファリンプロモーター（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３−３８０５を参照）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、Ｃａ２＋−カルモジュリン依存性のタンパク質キナーゼＩＩ−α（ＣａｍＫＩＩａ）プロモーター（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０、及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）、ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子−０プロモーター（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２−６０を参照）などを含む。
脂肪細胞に特異的な空間的制約プロモーターには、非限定的に、ａＰ２遺伝子プロモーター／エンハンサー、例えばヒトａＰ２遺伝子の−５．４ｋｂから＋２１ｂｐの間の領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４、Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０、及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）、グルコース輸送体−４（ＧＬＵＴ４）プロモーター（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）、脂肪酸転移酵素（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモーター（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６、及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）、ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）プロモーター（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）、レプチンプロモーター（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３、及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）、アディポネクチンプロモーター（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４、及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ ２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）、アジプシンプロモーター（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）、レジスチンプロモーター（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）などを含む。
心筋細胞に特異的な空間的制約プロモーターには、非限定的に、ミオシン軽鎖−２、ミオシン重鎖、ＡＥ３、心筋トロポニンＣ、心筋アクチンなど、遺伝子由来の制御配列を含む。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０−５６６、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２−５０５、Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．ｅｓ．７６：５８４５９１、Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０−１８８５、Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８−６１７、及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７−４０５１を参照。
平滑筋に特異的な空間的制約プロモーターには、非限定的に、ＳＭ２２ａプロモーター（例えば、Ａｋｙｉｉｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３、及びＵＳ７，１６９，８７４を参照）、スムーセリン（ｓｍｏｏｔｈｅｌｉｎ）プロモーター（例えば、ＷＯ ２００１／０１８０４８を参照）、平滑筋アクチンプロモーター、などを含む。例えば、２つのＣＡｒＧエレメント間の、ＳＭ２２ａプロモーターの０．４ｋｂ領域は、血管平滑筋細胞に特異的な発現を仲介することが示されている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６−２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２，８４９−８５９、及び Ｍｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５−２４２５を参照）
視細胞に特異的な空間的制約プロモーターには、非限定的に、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性症遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）ｓｕｐｒａ）、光受容体間（ｉｎｔｅｒｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）ｓｕｐｒａ）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）などを含む。
ライブラリー
本開示は、ガイドＲＮＡのライブラリーを提供する。本開示は、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む核酸のライブラリーを提供する。ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む核酸のライブラリーは、そのガイドＲＮＡをコードするヌクレオチドを含む組換え発現ベクターのライブラリーを含むことができる。
ライブラリーは、約１０の個別構成員から約１０１２までの個別構成員を含むことができ、例えば、ライブラリーは、約１０の個別構成員から約１０２までの個別構成員、約１０２の個別構成員から約１０３までの個別構成員、約１０３の個別構成員から約１０５までの個別構成員、約１０５の個別構成員から約１０７までの個別構成員、約１０７の個別構成員から約１０９までの個別構成員、または約１０９の個別構成員から約１０１２までの個別構成員を含むことができる。
ライブラリーの「個別構成員」は、当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列において、そのライブラリーのその他の構成員とは異なる。したがって、例えば、ライブラリーの各個別構成員は、そのライブラリーの全ての他の構成員がそうであるように、同じかもしくは実質的に同じ当該タンパク質結合セグメントのヌクレオチド配列を含むことができ、及びそのライブラリーの全ての他の構成員がそうであるように、同じかもしくは実質的に同じ当該転写終止セグメントのヌクレオチド配列を含むことができ、しかし当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントのヌクレオチド配列において、そのライブラリーのその他の構成員とは異なる。この方法で、当該ライブラリーは、標的核酸を差異化するために結合する構成員を含むことができる。
利用
本開示における転写調節の方法は、多様な用途での利用を見出し、それらを提供する。用途には、研究用途、診断用途、工業用途、及び治療用途を含む。
研究用途には、例えば、成長、代謝、下流遺伝子の発現などにおける標的核酸の転写の促進または抑制効果の決定を含む。
ハイスループットゲノム解析は、転写調節法を利用して実施でき、そこでは、当該ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメントだけが、変動する必要がある一方で、当該タンパク質結合セグメント及び転写終止セグメントは、（いくつかの実施形態において）一定に保つことができる。このゲノム解析に使用する複数の核酸を含むライブラリー（例えば、ライブラリー）は、核酸配列をコードするガイドＲＮＡに操作を加えて結合したプロモーター、ここで各核酸は、異なるＤＮＡ標的化セグメントを含み、一般的なタンパク質結合セグメント、及び一般的な転写終止セグメントを含む。チップは、５×１０４を超える固有のガイドＲＮＡを含む。用途には、大規模な表現型解析、遺伝子の機能マッピング、及びメタゲノム解析を含む。
本明細書に開示の方法は、代謝工学の分野における利用を見出す。転写レベルは、適切なガイドＲＮＡの設計により、効果的に及び予測可能に制御できるので、本明細書に記述のように、代謝経路の活性（例えば、生合成経路）が予測可能に制御され、及び関心のある代謝経路内の特定酵素のレベルを（例えば、促進されたまたは抑制された転写を介して）制御することにより、調節できる。関心のある代謝経路には、化学的（ファインケミカル、燃料、抗生物質、毒素、アゴニスト、アンタゴニストなど）及び／または薬剤生産に利用されるものを含む。
生合成経路には、非限定的に、（１）メバロン酸経路（例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ経路）（アセチル−ＣｏＡを、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換し、テルペノイド／イソプレノイドを含む広範囲な生体分子の生合成に使用される）、（２）非メバロン酸経路（すなわち、「２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸／１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸経路」または「ＭＥＰ／ＤＯＸＰ経路」または「ＤＸＰ経路」）（メバロン酸経路の代替経路を介して、ピルビン酸とグリセルアルデヒド３−リン酸のＤＭＡＰＰ及びＩＰＰへの転換による代わりに、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰを産生する）、（３）ポリケチド合成経路（多様なポリケチド合成酵素を介して、多様なポリケチドを産生する）を含む。ポリケチドには、化学療法に使用される自然発生の小分子を含み（例えば、テトラサイクリン及びマクロライド）、及び工業的に重要なポリケチドには、ラパマイシン（免疫抑制剤）、エリスロマイシン（抗生物質）、ロバスタチン（抗コレステロール薬）、エポチロンＢ（抗がん剤）を含み、（４）脂肪酸合成経路、（５）ＤＡＨＰ（３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸７リン酸塩）合成経路、（６）潜在的なバイオ燃料（短鎖アルコール及びアルカン、脂肪酸メチルエステルと脂肪族アルコール、イソプレノイドなど）を産生する経路などを含む。
ネットワーク及びカスケード
本明細書に開示の方法は、統合ネットワーク（すなわち、カスケードまたは複数カスケード）の設計に利用できる。例えば、ガイドＲＮＡ／変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドは、別のＤＮＡ標的化ＲＮＡまたは別の変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドの発現の制御（すなわち、調節、例えば、促進、抑制）に使用されて良い。例えば、第一ガイドＲＮＡは、第一変異型Ｃａｓ９部位配向性ポリペプチドとは異なる機能を有する第二キメラｄＣａｓ９ポリペプチドの転写の調節を標的化するために設計されて良い（例えば、メチル基転移酵素活性、脱メチル化活性、アセチル基転移酵素活性、脱アセチル化活性など）。さらに、異なるｄＣａｓ９タンパク質（例えば、異なる種由来の）は、異なるＣａｓ９ハンドル（すなわち、タンパク質結合セグメント）が必要なので、第二キメラｄＣａｓ９ポリペプチドは、前述の第一ｄＣａｓ９ポリペプチドとは異なる種から誘導できる。したがって、いくつかのケースにおいて、第二キメラｄＣａｓ９ポリペプチドは、第一ガイドＲＮＡと相互作用しないように選択できる。その他のケースにおいて、第二キメラｄＣａｓ９ポリペプチドは、第一ガイドＲＮＡと相互作用するように選択できる。いくつかのそのようなケースにおいて、当該２つの（またはそれ以上の）ｄＣａｓ９タンパク質の活性は、競合して良く（例えば、仮にそのポリペプチドが、反対の活性を有する）、または相乗的であって良い（例えば、仮にそのポリペプチドが、類似のまたは相乗活性を有する）。前述と同様に、ネットワーク中の複合体（すなわち、ガイドＲＮＡ／ｄＣａｓ９ポリペプチド）のいずれかは、その他のガイドＲＮＡまたはｄＣａｓ９ポリペプチドを制御するために設計できる。ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９部位配向性ポリペプチドは、任意の望ましいＤＮＡ配列に標的化できるので、本明細書に記述の方法は、任意の望ましい標的の発現を制御し及び制限するために利用できる。非常に単純なものから非常に複雑なものまでの範囲で設計できる、当該統合ネットワーク（すなわち、相互作用のカスケード）には、限定がない。
２つ以上の成分（例えば、ガイドＲＮＡ、活性化因子ＲＮＡ、標的選択性ＲＮＡ、またはｄＣａｓ９ポリペプチド）が、互いに別のＲＮＡ／ｄＣａｓ９ポリペプチド複合体の調節管理下にあるネットワークにおいて、そのネットワークの１成分の発現レベルは、そのネットワークの別の成分の発現レベルに影響を与えて（例えば、その発現を促進してまたは抑制して）良い。このメカニズムを通して、１成分の発現は、同じネットワークの異なる成分の発現に影響を与えて良く、及びそのネットワークは、その他の成分の発現を促進する成分と、同時にその他の成分の発現を抑制する成分の混合を含んで良い。当業者には容易に理解されることだが、１成分の発現レベルが、１つ以上の異なる成分の発現レベルに影響を与えて良いという前述の例示は、説明目的のためであり、及びそれに限定されない。１つ以上の成分を、操作可能なように（すなわち、実験管理下で、例えば、温度制御、薬剤制御、すなわち、薬剤誘発制御、光制御など）、（前述のように）改変する場合は、複雑性の追加レイヤーを、ネットワークに任意で導入して良い。
非限定的な例示として、第一ガイドＲＮＡは、第二ガイドＲＮＡのプロモーターに結合でき、標的治療／代謝遺伝子の発現を制御する。そのようなケースにおいて、当該第一ガイドＲＮＡの条件発現は、その治療／代謝遺伝子を直接活性化する。このタイプのＲＮＡカスケードは有用であり、例えば、リプレッサーの容易な活性化因子への転換に対応し、及び標的遺伝子の発現理論または発現動態の制御に活用できる。
転写調節法はまた、創薬及び標的検証に利用できる。
本発明の多様な態様は、以下の材料及び方法に活用され、及び以下の非限定的な例示により説明され、ここで実施例１は、Ｃａｓ９オーソログに関し、実施例２は、細菌ＲＮＡａｓｅ ＩＩＩ酵素の互換性に関し、実施例３は、当該Ｃａｓ９ＨＮＨ及びＲｕｖＣドメインに関し、実施例４は、ＲＮＡａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ配向性ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ熟成におけるＣａｓ９エンドヌクレアーゼの互換性に関し、実施例５は、Ｃａｓ９オーソログのＰＡＭに関し、及び実施例６は、ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９エンドヌクレアーゼの互換性に関する。
材料及び方法
細菌株及び培養条件
補足表Ｓ１は、本研究に使用した細菌株を網羅する。化膿レンサ球菌、ミュータンス菌、カンピロバクター・ジェジュニ、髄膜炎菌、大腸菌及びフランシセラ・ノビシダを、前述のように増殖した（１５、１６）。ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）寒天培地及び１％グルコース及び１％ラクトースで補給されるＢＨＩ肉汁培地を、４２℃の５％ ＣＯ２環境で、ストレプトコッカス・サーモフィルスに使用した（１６）。パスツレラ・ムルトシダ及び黄色ブドウ球菌を、３７℃のＢＨＩ寒天プレート上で増殖させ、及びＢＨＩ肉汁培地中で振動を加えた。細胞増殖を、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ ＰｏｗｅｒＷａｖｅ社）を使用した６２０ｎｍ（ＯＤ６２０）で、培養の光学密度を測定することによりモニターした。
細菌の形質転換
大腸菌を、標準手順（３５）に従い、プラスミドＤＮＡで形質転換した。化膿レンサ球菌の形質転換を、前述のいくつかの改変（３６）により実施した。化膿レンサ球菌の前培養を、新鮮なＴＨＹ培地で１対１００に希釈し、及びＯＤ６２０が０．３になるまで、３７℃、５％ ＣＯ２で増殖した。グリシンを、１０％最終濃度までその培地に添加し、及び増殖をさらに１時間、維持した。細胞を、４℃の２５００×ｇで、遠心沈降させ、及びエレクトロポレーション緩衝液（５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、０．４Ｍ Ｄ−ソルビトール、１０％グリセロール、ｐＨ４．５）で３回洗浄し、最終的に同じ緩衝液に懸濁し、及び同じＯＤ６２０まで均質化した。エレクトロポレーションに対応して、１μｇのプラスミドとそのコンピテント細胞を、氷上で１０分間培養した。その条件は、１ｍｍのエレクトロポレーション用キュベット（Ｂｉｏｒａｄ社）を使用し、２５μＦ、６００Ω及び１．５Ｖであった。３時間の再生後、細菌を、カナマイシン（３００μｇ／ｍｌ）で補充した寒天培地に広げた。形質転換アッセイを、三連測定により少なくとも独立して３回実施した。その効果を、プラスミドＤＮＡのμｇ当たりのＣＦＵ（コロニー形成ユニット）として計算した。正及び負のコントロールの形質転換を、主鎖プラスミドｐＥＣ８５及び滅菌Ｈ２Ｏと共に、各々実施した。
ＤＮＡ操作
ＤＮＡ調製（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社）、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標） Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ社）、ＤＮＡ消化（制限酵素、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、ＤＮＡ結合反応（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）、ＤＮＡ精製（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 精製キット、Ｑｉａｇｅｎ社）、及び寒天ゲル電気泳動含むＤＮＡ操作を、いくつかの改変についての標準的な技術または製造者の手順に従って実施した（３５）。部位配向性突然変異誘発を、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ ＸＬキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、またはＰＣＲベース突然変異誘発を使用して実施した（３７）。本研究に使用し及び産生した合成オリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ＆ Ｂｉｏｍｅｒｓ社）及びプラスミドを、補足表Ｓ１に網羅する。全ての構築プラスミドの完全性を、酵素消化及びＬＧＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ社の配列により検証した。
化膿レンサ球菌における相補性研究に対応したプラスミドの構築
バックボーンシャトルベクターｐＥＣ８５を、相補性研究に使用した（３８、３９）。化膿レンサ球菌、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、カンピロバクター・ジェジュニ、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ、フランシセラ・ノビシダ、大腸菌、黄色ブドウ球菌の遺伝子（ｒｎｃ遺伝子）をコードするＲＮａｓｅ ＩＩＩ、及び化膿レンサ球菌の切り捨てられた及び不活性のＲＮａｓｅ ＩＩＩ変異体（切り捨てられた及び不活性の（Ｄ５１Ａ）ｒｎｃ突然変異体）をコードする遺伝子が、Ｎｃｏｌ及びＥｃｏＲＩ制限部位（補足表Ｓ１、補足図Ｓ６）を使用したｐＥＣ４８３（化膿レンサ球菌ｒｎｃの天然プロモーター）にクローンされた。オーソログ及び突然変異体ｃａｓ９遺伝子を、ＳａｌＩ及びＳｍａＩ制限部位を使用したｐＥＣ３４２（ｔｒａｃｒＲＮＡ−１７１ｎｔ（１６）をコードする配列及び化膿レンサ球菌のｃａｓオペロンの天然プロモーターを含むｐＥＣ８５）にクローンした（補足表Ｓ１）。従来の研究に、我々は、当該ｃａｓ９欠損突然変異体に、ｔｒａｃｒＲＮＡの個体数が少ないことを観察したことに留意のこと。この理由で、ｃａｓ９相補性研究に使用したプラスミドを、ｃａｓ９に加えてｔｒａｃｒＲＮＡをコードするように設計した（１６）。産生したｒｎｃ及びｃａｓ９組換えプラスミドを、化膿レンサ球菌△ｒｎｃ及び△ｃａｓ９株に、各々導入した（補足表Ｓ１）。全ての相補株におけるプラスミドの完全性を、プラスミドＤＮＡ抽出及び消化により確認した。
化膿レンサ球菌における形質転換研究に対応したプラスミドの構築
プラスミドｐＥＣ８５を、形質転換研究のバックボーンベクターとして使用した。ＷＴ ｓｐｅＭプロトスペーサー配列を含むＤＮＡフラグメントを、ＷＴのコード配列または化膿レンサ球菌由来の突然変異ｃａｓ９を含む、プラスミドのＰｓｔＩ部位にクローンした（補足表Ｓ１）。
タンパク質の精製に対応したプラスミドの構築
過剰発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を、３か所の追加制限部位（ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＮｏｔＩ）の、ｐＥＣ６２１を産生するＮｄｅＩ制限部位への挿入により改変した。オーソロガスＣａｓ９タンパク質をコードする遺伝子を、ＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限部位を含むプライマーを使用した相応する株のゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅した（補足表Ｓ１）。化膿レンサ球菌ｃａｓ９突然変異遺伝子を、前述の相補的プラスミドからＰＣＲ増幅した。全てのオーソロガス及び突然変異ｃａｓ９遺伝子を、ｐＥＣ６２１のＳａｌＩ及びＮｏｔＩ制限部位にクローンした。
試験管内開裂アッセイに対応した基質プラスミドの構築
ｓｐｅＭプロトスペーサー配列を含むｐＥＣ２８７プラスミドを、全ての基質プラスミドを構築するベクターとして使用した。当該ｓｐｅＭプロトスペーサーのｃｒＲＮＡ標的配列のすぐ隣の３’に位置するＰＡＭ配列（このプラスミド上のＧＧＧ）を、スクリーニングの目的として、ＸｂａＩ制限部位を導入または排除した、１つの標準オリゴヌクレオチド（ＯＬＥＣ３１４０またはＯＬＥＣ３１９４）、及びそのプロトスペーサー隣接配列（補足表Ｓ１）を交換するために第二変異原性オリゴヌクレオチドを使用した、ＰＣＲ介在の部位配向性突然変異誘発（３７）により改変した。
ＲＮＡ調製
化膿レンサ球菌ＳＦ３７０ＷＴ、欠損変異体及び相補株由来のトータルＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を使用した増殖の、中間対数段階で収集した培養サンプルから調製した。この総ＲＭＡサンプルを、製造者の指示に従って、ＤＮａｓｅＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）で処置した。各サンプルのＲＮＡ濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐを使用して測定した。
ノーザンブロッティング解析
ノーザンブロッティング解析を、基本的には前述のように実施した（４０−４２）。総ＲＮＡを、１０％ポリアクリルアミドの８ Ｍ尿素ゲル上で分離し、及びさらに、ナイロン膜上でのブロッティング（Ｈｙｂｏｎｄ（商標）Ｎ＋，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、 Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標） ＳＤ ｓｅｍｉ−ｄｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｂｉｏｒａｄ、１Ｘ ＴＢＥ、１０Ｖ／ｃｍで２時間）、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）（４１）での化学架橋、及びプレハイブリダイゼーション（Ｒａｐｉｄ−ｈｙｂ ｂｕｆｆｅｒ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、４２℃で１時間）に対応した加工を行った。オリゴヌクレオチドのプローブ（４０ｐｍｏｌ）を、Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）を使用した３２Ｐ（２０μＣｉ）で標識化し、及び使用前に、Ｇ−２５カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して精製した。フォスフォイメージャーを使用して、放射性シグナルの可視化を実施した。５Ｓ ｒＲＮＡは、ローディング・コントロールとしての役割を果たした。

タンパク質の精製
大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）及び大腸菌ＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を、化膿レンサ球菌ＷＴ及び突然変異体またはオーソロガスＣａｓ９をそれぞれコードする過剰発現プラスミドで、形質転換した。細胞を、３７℃でＯＤ６００が０．７−０．８に達するように増殖し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．５ｍＭまで添加して、タンパク質発現を誘発し、及び培養を、１３℃で一晩さらに増殖した。その細胞を、遠心分離で捕集し、及びそのペレットを、溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、５００ｍＭ ＫＣｌ［ストレプトコッカス・サーモフィルス＊Ｃａｓ９に対して１Ｍ］、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２５ｍＭ イミダゾール）中に再懸濁し、及び超音波処理により溶解した。その溶解物を、遠心分離（＞２０，０００×ｇ）で清澄化し、及びＮｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ社）で、４℃で１時間かけインキュベートした。そのＮｉ−ＮＴＡを、溶解緩衝液及び洗浄緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、３００ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、２５ｍＭ イミダゾール）で洗浄した後、その組換えタンパク質を、溶出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、０．１ｍＭ ＤＴＴ、２５０ｍＭ イミダゾール、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出し、及びその溶出分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９ＷＴ及び突然変異体のケースにおいて、溶出分を含むタンパク質を集めて、及びさらにＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）陽イオン交換クロマトグラフィーを介して精製した。簡単に説明すると、そのタンパク質を、ＦＰＬＣシステム（Aｋｔａ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用した緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＫＣｌ）で平衡化したカラムに詰めた。Ｃａｓ９を、１２ｍｌを超える緩衝液Ｂ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ ７．５、１Ｍ ＫＣｌ）の勾配液により溶出した。１ｍｌの溶出分を集め、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。画分を含むタンパク質を集め、及び一晩透析した（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、５０％グリセロール）。Ｃａｓ９オーソログに対して、Ｎｉ−ＮＴＡ精製からの溶出物で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認した。不純物質のケースにおいて、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社からのＮｉＣｏ２１（ＤＥ３）細胞に対応したマニュアルに記述されるように、キチン質ビーズを通して第二精製を実施した。概説すると、緩衝液Ｂで平衡化した１ｍｌのキチン質ビーズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）を、Ｎｉ２＋−ＩＭＡＣ溶出物と、４℃で１時間培養した。その後、そのビーズをカラムに入れ及びそのＣａｓ９含有流体を集め、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を再確認した（補足図Ｓ１）。その精製タンパク質を、一晩透析した。そのタンパク質濃度を、吸光係数を使用したＯＤ２８０の測定により計算した。精製タンパク質の詳細な特徴を、補足図Ｓ１Ａにまとめる。
試験管内転写
試験管内ＤＮＡ開裂アッセイに対応したＲＮＡを、製造者の指示に従い、ＡｍｐｌｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７−Ｆｌａｓｈ（商標）転写キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を使用した試験管内転写により産生した。鋳型として使用するＰＣＲ産物または合成オリゴヌクレオチドを、補足表Ｓ１に網羅する。各細菌種由来の合成ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡのリピート領域は、ディープＲＮＡシーケンス（１５）または生物情報学的な予測により決定されるＲＮＡの成熟形態に対応している。本研究に使用される全ｃｒＲＮＡのスペーサー領域は、ｓｐｅＭプロトスペーサーを標的化する（スーパー抗原をコードしており、化膿レンサ球菌ＳＦ３７０ ＣＲＩＳＰＲアレイのスペーサー２により標的化される、Ｓｐｙｏ１ｈ＿００２（１６））。転写ＲＮＡを、沈殿させ、及びさらに１０％ポリアクリルアミドの８Ｍ尿素変性ゲルで精製した。このＲＮＡ濃度を、ＯＤ２６０の測定で決定し、及びモル濃度を計算した。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの等モル量を、５×ＲＮＡのアニーリング緩衝液（１Ｍ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５）中で混合し、９５℃まで５分間加熱し及び使用前に、ゆっくり室温まで冷却した。
試験管内のＤＮＡ開裂アッセイ
Ｃａｓ９突然変異タンパク質を使用した開裂アッセイに対応して、２５ｎＭのＣａｓ９を、プレハイブリダイゼーションの化膿レンサ球菌二重分子ＲＮＡの等モル量と、開裂緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で、３７℃で１５分間培養した。ｓｐｅＭ（ＮＧＧ ＰＡＭ）を含むプラスミドＤＮＡ（５ｎＭ）を加え、及びさらに３７℃で１時間培養した。５×のローディング緩衝液（２５０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％グリセロール、１．２％ ＳＤＳ、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）の添加でその反応を止め、及び１×のＴＡＥ中で、１％アガロースゲル電気泳動により解析した。開裂産物を、臭化エチジウム染色により可視化した。全てのその他の開裂アッセイを、以下の改変と共に同じ条件を使用して実施した。ＫＧＢ（４３）（１００ｍＭカリウムグルタミン酸、２５ｍＭトリス／酢酸塩 ｐＨ７．５、１０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ ＢＳＡ）を、開裂の緩衝液として使用し、及び二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体の異なる濃度を解析した。プラスミドＤＮＡの濃度は、全ての実験において一定、すなわち５ ｎＭに保たれた。
ＰＡＭモチーフの探索
当該選択された細菌種のスペーサー配列を、ＣＲＩＳＰＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／ｃｒｉｓｐｒ／）から抽出し、及びｍｅｇａＢＬＡＳＴ（Ｈｔｔｐ：／／Ｂｌａｓｔ．Ｎｃｂｉ．Ｎｉｈ．Ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ）に使用する同種のプロトスペーサー候補を見出すために使用した。プロトスペーサー候補を、当該ｃｒＲＮＡスペーサー配列に９０％以上類似かつ当該標的化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの細菌種に関連するファージ、プラスミドまたはゲノムＤＮＡ由来である配列を含むとして定義した。検討されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座に対応して、転写の向きを、ＲＮＡ配列またはノーザンブロッティング解析により事前に決定した（１５、１６）。先にタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓでも示したが、当該ＰＡＭ配列は、非標的鎖上の、同種ｃｒＲＮＡにより標的化された配列と並置の、プロトスペーサー配列の３’に位置する（１４、１８、２３、４４）。各細菌種に可能性のあるＰＡＭｓを特定するために、各プロトスペーサー配列のすぐ下流の、その非標的鎖上の１０ｎｔ配列を並べた。最も豊富なヌクレオチドを示すロゴプロット（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕ／）を創出し、及びＰＡＭ配列を予測した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓのケースにおいて、適切なプロトスペーサー配列がない遺伝子座が特定でき（ミュータンス菌ＵＡ１５９、カンピロバクター・ジェジュニＮＣＴＣ １１１６８、パスツレラ・ムルトシダＰｍ７０、フランシセラ・ノビシダＵ１１２）、同じ種の緊密に関連する株を選定した（補足表Ｓ２）。選択された株におけるタイプＩＩＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアレイのスペーサーの内容を解析した（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｕ−ｐｓｕｄ．ｆｒ／Ｓｅｒｖｅｒ／）。次いで、そのスペーサー配列を、前述の同種プロトスペーサー配列の選択に使用した。
タンパク質配列の解析
ＮＣＢＩ ｎｒデータベースでＣａｓ９ファミリーのオーソログを検索するために、位置に特異的な繰り返し（ＰＳＩ）−ＢＬＡＳＴプログラム（４５）を使用した。８００アミノ酸より短い配列は、破棄した。ＢＬＡＳＴＣｌｕｓｔプログラム（４６）に、長さ範囲で０．８のカットオフ値を設定し、及び０．８のスコアー閾値（配列長により分割したｂｉｔスコアー）を、残った配列をクラスター化するために使用した（補足図Ｓ２）。この手順で、８２のクラスターを生み出した。本研究に報告された配列のケースにおいて、各クラスターから１つまたは複数の代表を選択し、及び既定パラメーターを伴うＭＵＳＣＬＥプログラム（４７）を使用して、次いでＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（４５）及びＨＨｐｒｅｄプログラム（４８）を使用して得られた局在配置に基づいて手動で集めて、配置した。情報位置２８５の有力な配置ブロック（補足図Ｓ２）を、既定パラメーターを伴うＦａｓｔＴｒｅｅプログラム（４９）を使用した最尤度の系統樹再構築に使用した：ＪＴＴ進化モデル、２０の比率カテゴリーを伴う離散ガンマモデル。同じプログラムを、そのブートストラップ値を計算するために使用した。相応するｃａｓオペロンからＣａｓ１配列を選択した（補足表Ｓ２）。いくつかの不完全な配列を、同じＣａｓ９クラスターの別のＣａｓ１配列で置き換えた（補足表Ｓ２）。サブタイプＩ−Ａ、Ｂ、Ｃ及びＥからの複数のＣａｓ１タンパク質を、外集団に含めた。前述と同じやり方で、Ｃａｓ１配列を配置し、及び２５２情報位置（補足図Ｓ３）を、ＦａｓｔＴｒｅｅプログラムを使用した最尤度の系統樹再構築に使用した。ＭＵＳＣＬＥプログラムを使用して、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ多重配列配置を準備した。
ＲＮＡ配列及び構造解析
ＲＮＡ二本鎖の二次構造を、Ｖｉｅｎｎａ ＲＮＡパッケージ（５０、５１）及びＲＮＡハイブリッドのＲＮＡ共折りたたみを使用して予測した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｂｉｓｅｒｖ．ｔｅｃｈｆａｋ．ｕｎｉ−ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ．ｄｅ／ｒｎａｈｙｂｒｉｄ／）。 次いで、その構造予測を、ＶＡＲＮＡ（５２）を使用して可視化した。
実施例１。
Ｃａｓ９オーソログの多様性
二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９システムの進化及び多様性を検討するために、公開されているゲノムを、先に検索要求として検索したＣａｓ９配列（１５）を使用した多回数のＢＬＡＳＴ検索に取り込んだ。Ｃａｓ９オーソログを、３４７種を代表する６５３細菌株で特定した（補足表Ｓ２）。不完全なまたは非常に類似した配列を取り除いた後、多重配列配置及び系統樹再構築に対応したＣａｓ９オーソログを代表する、８３の多様な配列を選定した（図１Ａ、補足表Ｓ２、補足図Ｓ２及びＳ４、材料及び方法を参照）。当該Ｃａｓ９の樹形は、相応するＣａｓ１タンパク質の系統に、非常によく一致し（補足表Ｓ２、補足図Ｓ３及びＳ４）、及び前述したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの３つのサブタイプ、ＩＩ−Ａ（ｃｓｎ２により特異的な）、ＩＩ−Ｂ（長く及び最も相違したｃａｓ９変異体（旧ｃｓｘ１２）及びｃａｓ４により特徴づけられる）、及びＩＩ−Ｃ（３−ｃａｓ遺伝子オペロン）の分類を完全に支持している（１５）。
ｃａｓ遺伝子の組成分析、ｃａｓオペロンの転写方向に関するＣＲＩＳＰＲアレイの転写方向、及びｔｒａｃｒＲＮＡの位置と向きは、サブタイプの、特にサブタイプＩＩ−Ａ内での、異なる遺伝子座の特徴によるグループへの分割をもたらした（図１、異なる色でマークされたクラスター）（１５）。我々は、主要なタイプＩＩグループを代表するＣａｓ９酵素を選定した。化膿レンサ球菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊（ＣＲＩＳＰＲ３）及びミュータンス菌のＣａｓ９オーソログは、短い、２２０までのアミノ酸のＣｓｎ２変異体（Ｃｓｎ２ａ）に関連するタイプＩＩ−Ａシステムに対応して選択した。ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊（ＣＲＩＳＰＲ１）のＣａｓ９は、長い、３５０までのアミノ酸のＣｓｎ２オーソログ（Ｃｓｎ２ｂ）に関連するタイプＩＩ−Ａ配列の異なるグループを代表する。フランシセラ・ノビシダのＣａｓ９は、タイプＩＩ−Ｂに対して選択した。パスツレラ・ムルトシダ及び髄膜炎菌の緊密に関連するＣａｓ９オーソログ、そして異なる、短いカンピロバクター・ジェジュニのＣａｓ９を、タイプＩＩ−Ｃに対して選んだ（図１Ｂ）。化膿レンサ球菌、ミュータンス菌、フランシセラ・ノビシダ、髄膜炎菌及びカンピロバクター・ジェジュニにおける関連ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの発現は、ディープＲＮＡシーケンスにより既に検証されている（１５、１６）。ストレプトコッカス・サーモフィルス及びパスツレラ・ムルトシダのＲＮＡは、同じタイプＩＩグループ内の関連種からの配列に基づいて、生物情報学的に予測されている。図１Ｂは、８つの選択されたタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の関連図を示し、及びそのタイプＩＩ遺伝子座の構造が、サブグループ間で非常に多様であり、しかも各グループ内で保存されていることを示す我々の以前の知見を、強調表示している（１５）。これらの変化は、Ｃａｓ９及びＣａｓ１系統樹より導いたクラスター化とよく一致している（図１Ａ、補足図Ｓ４）。
したがって、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９の多様性を評価するために、利用可能なゲノムからのタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの生物情報学的解析により、１２の門に属する多数の細菌種におけるＣａｓ９オーソログを特定し、及び多様な環境から単離した（補足表Ｓ２及びＳ４）。タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（及びその結果のＣａｓ９）を含むほとんどの菌株は、脊椎動物の病原体及び共生生物である。これら菌株の大部分は、哺乳類、魚類及び鳥類の消化管及び糞のみならず、敗血症患者の傷、膿瘍及び脊髄小脳液から単離された。菌株は、純水及び海水、植物材料、土壌及び醗酵過程で使用する種を含む食品を含む、無脊椎動物及び環境サンプルから単離された。Ｃａｓ９はまた、深海の堆積物、温泉や南極氷床などの極端な環境からの種に存在し、細菌におけるタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの広範囲な広がりをさらに示している。Ｃａｓ９配列の系統樹クラスター化に伴う代表的系統の分類と生息地は、ほとんど相関がない（補足図Ｓ１１）。特に、類似した生息地から単離された分類的に離れた細菌から、Ｃａｓ９遺伝子のクラスターが特定された。例示には、多様なフィルミクテス門、モリクテス綱、スピロヘータ、フソバクテリウム門を含み、それらは全て哺乳類の消化管から単離され、及び異なるプロテオバクテリア門、フィルミクテス門、及びフソバクテリウム門ファミリーの構成員は、環境サンプル中にほとんど見出せた（補足図Ｓ１１、クラスター１及び３）。いくつかの例外が、ヒト及びイヌ種のみならず温泉からも単離される放線菌などの、多様な生息地から単離された緊密関連種からの、Ｃａｓ９遺伝子のグループ化に関与する（補足図Ｓ１１、クラスター２、４及び５）。細菌ゲノムを横断するＣａｓ９のこの複雑な分布は、細菌における二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９システムの進化が、水平及び垂直の両伝播で起こることを示している（５５）。
実施例２
細菌ＲＮａｓｅＩＩＩは、二重分子ＲＮＡ成熟において、交換可能である。
化膿レンサ球菌及びストレプトコッカス・サーモフィルスで記述したように、ＲＮａｓｅ ＩＩＩは、二本鎖の抗リピート：リピートレベルにおけるｔｒａｃｒＲＮＡ及びｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの共プロセスによる、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９システムの生合成において、本質的な役割を果たす（１６、１７）。化膿レンサ球菌ＲＮａｓｅ ＩＩＩと細菌種から選定したＲＮａｓｅ ＩＩＩの互換性を、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを欠損する系統（黄色ブドウ球菌ＣＯＬ、大腸菌ＴＯＰ１０）を含む、化膿レンサ球菌ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの共プロセスにおいて解析した。ノーザンブロッティング解析は、研究した全てのＲＮａｓｅ ＩＩＩは、当該ＲＮＡ二本鎖を共プロセス化でき（図２、補足図Ｓ５）、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ開裂に対して、種の特異性がないことを示した。ＲＮａｓｅ ＩＩＩオーソログの多重配列配置は、ＲＮＡ共プロセス（図２、補足図Ｓ６）に共に必要な、触媒的なアスパラギン酸残基及びｄｓＲＮＡ結合ドメイン（図２、補足図Ｓ５）の保存を示している。これらのデータは、細菌ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ共プロセスの保存は、水平伝播時の多重種において、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９システムの機能性を可能にする柔軟度合いを与えることを意味する。
したがって、細菌間のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓモジュールの水平伝播に対する基礎を検討するために、二重分子ＲＮＡ成熟に対応したタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに利用されるＲＮａｓｅ ＩＩＩの特異性を解析した。相補性解析は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを欠く細菌を含む、多様な種からのＲＮａｓｅ ＩＩＩが、化膿レンサ球菌のｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡをプロセス化できることを示し、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが、任意の二重らせんＲＮＡ開裂活性を活用できることを示唆している。この知見は、宿主ＲＮａｓｅが介在しているように見えるヒト細胞における、化膿レンサ球菌の二重分子ＲＮＡ成熟の観察に一貫している（２）。
実施例３。
Ｃａｓ９ＨＮＨ及び分割ＲｕｖＣドメインは、ＤＮＡ干渉に対する触媒部分である。
Ｃａｓ９配列の比較は、アミノ酸組成及び長さにおいて（カンピロバクター・ジェジュニに対する９８４アミノ酸から、フランシセラ・ノビシダの１６４８アミノ酸まで）、特に、高度に保存されたＮ末端のＲｕｖＣ及び中央のＲｕｖＣ−ＨＮＨ−ＲｕｖＣ領域間のリンカー配列において、及びＣ末端の伸張において、高度な多様性を明らかにした（補足図Ｓ２）。複数の研究は、当該ＲｕｖＣドメインのＮ末端モチーフにおける１つのアスパラギン酸、及び当該Ｃａｓ９酵素のＨＮＨドメインに予測される触媒モチーフにおける１つ以上の残基を突然変異させることにより、ｄｓＤＮＡの開裂活性に対するヌクレアーゼモチーフの重要性を示した（１４、２２、２３）。ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセス化及び／またはＤＮＡ干渉に対する全ての触媒モチーフの関連性を検討するために、選択した残基のアラニン置換を行った（図３Ａ）。既に公開されている触媒活性アミノ酸に加えて、中央ＲｕｖＣモチーフ（１４）に保存されたアミノ酸残基のＣａｓ９点変異体を作成した（図３Ａ、補足図Ｓ２）。各ｃａｓ９点変異体で補充した化膿レンサ球菌ｃａｓ９欠損変異体のノーザンブロッティング解析は、成熟したｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ形成体の存在を明らかにし、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる二重分子ＲＮＡ成熟において、触媒モチーフが関与していないことを示した。これは、ＲＮａｓｅ ＩＩＩが、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ二本鎖を特異的に開裂する酵素であることを示した、先のデータと一致する（１６）。Ｃａｓ９は、二重分子ＲＮＡ上で安定化機能を有しているように見受けられる。我々は、当該触媒モチーフが、ＲＮＡ二本鎖の安定化に関与していないことを示す（図３Ｂ、補足図Ｓ７）。
生体内のＤＮＡ干渉における、Ｃａｓ９の保存モチーフの関与を検討するために、前述のプラスミドに基づく読み出しシステムを、プロトスペーサー含有ＤＮＡエレメントに侵入する模倣感染に使用した（１６）。当該ｓｐｅＭプロトスペーサー遺伝子（化膿レンサ球菌ＳＦ３７０のタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲアレイ（１６）の第二スペーサーに相補的）及びＷＴまたは突然変異ｃａｓ９を含むプラスミドを使用して、化膿レンサ球菌ＷＴまたはｃａｓ９欠損変異体に、形質転換アッセイを実施した（図３Ｃ）。このアッセイにおいて、細菌細胞へのプラスミド送達に従うように発現したＣａｓ９は、活性時には、それ自身のベクター開裂に対して触媒化する。コントロール実験は、当該ｓｐｅＭプロトスペーサー含有プラスミドは、ＷＴ化膿レンサ球菌に耐えられなかったことを示し、ＷＴ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの活性を示した。同様に、当該ｓｐｅＭプロトスペーサーを含有し及びＷＴＣａｓ９をコードするプラスミドは、当該ｃａｓ９欠損変異体に保持されず、Ｃａｓ９が、その発現からプラスミドを開裂できることを示した。Ｃａｓ９ Ｎ８５４Ａを除いて、Ｃａｓ９突然変異体をコードする全てのプラスミドは、ｃａｓ９欠損株に耐えて、これらの変異体に対応するＣａｓ９干渉活性の抑止を示した。
生体内ＤＮＡ標的化データを、試験管内のＤＮＡ開裂アッセイにて、確認した。精製ＷＴ及び突然変異体Ｃａｓ９タンパク質を、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ標的化ｓｐｅＭと培養し、及びそのｓｐｅＭプロトスペーサーを含むプラスミドＤＮＡの開裂に供した。ＷＴ及びＮ８５４Ａ Ｃａｓ９は、ｄｓＤＮＡ開裂活性を示し、それに対してその他のＣａｓ９突然変異体は、そのｄｓＤＮＡ部位の一本鎖のみを開裂し、ニッキングで開かれた環状プラスミドＤＮＡを生み出す（図３Ｄ）。このことは、生体内で得られた結果が、Ｃａｓ９によるＤＮＡ干渉に対する保存ヌクレアーゼモチーフの重要性を示すことを裏付けている。Ｎ末端ＲｕｖＣモチーフ及びＨＮＨ触媒モチーフの重要性を示す、従来から公開されているデータに加えて、我々は、このようにその中央ＲｕｖＣモチーフに、新規の触媒残基を定めた。
二重分子ＲＮＡ及びＣａｓ９配列は、細菌中で、広範囲に進化してきた（１５）。しかしながら、Ｃａｓ９配列間の高い配列変動性にもかかわらず、特定のモチーフは保護されている。これまでに特定された中央ＨＮＨ及びＮ末端ＲｕｖＣ触媒モチーフに加えて（２０、２１、４４、５６）、我々は、２つの中間ＲｕｖＣモチーフが、生体内及び試験管内の干渉活性に必要であることを示す。従来の知見と一致して、触媒モチーフ（ＲｕｖＣ及びＨＮＨ）の互いの１つの非活性化が、その他のモチーフを起源とするＣａｓ９のニッキング活性をもたらす（２、８、２４、２５）。これらの保存モチーフに導入された突然変異は、生体内ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ成熟における、Ｃａｓ９の役割に影響を与えなかった。
実施例４。
緊密に関連するＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムからのＣａｓ９だけが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ成熟における、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９に代わることができる。
当該ＨＮＨ及び分割ＲｕｖＣドメインの保存が、ＤＮＡ開裂に関わることのほかに（１４、１５）、Ｃａｓ９オーソログの長さ及びＣａｓ９のアミノ酸配列は、タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの異なるグループ間では、非常に変動する（図４Ａ、補足図Ｓ２）。したがって、この変動性が、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ二本鎖及び成熟ｃｒＲＮＡの安定性に関連したＣａｓ９の特異性に、役割を果たしているかどうかを検討した。化膿レンサ球菌ｃａｓ９欠損変異体を、多様なタイプＩＩグループから選択された細菌種の代表由来のＣａｓ９で補完し、及びノーザンブロッティング解析によりｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセスを解析した。ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス由来のＣａｓ９タンパク質は、ＲＮａｓｅＩＩＩによるＲＮＡプロセスにおける化膿レンサ球菌Ｃａｓ９の安定化の役割に対して、代わりに機能することができる（図４Ｂ、補足図Ｓ８）。対照的に、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊、髄膜炎菌、パスツレラ・ムルトシダ及びフランシセラ・ノビシダ由来のＣａｓ９は、化膿レンサ球菌のｃａｓ９突然変異体におけるＲＮＡプロセスの欠損にとって代わることはできなかった。これらの系統において、ｔｒａｃｒＲＮＡの７５−ｎｔプロセス化形成体が、Ｃａｓ９不在における、ＲＮａｓｅＩＩＩによりプロセス化される二重分子ＲＮＡのバックグランドレベルの非常に弱いシグナルとして、観察される。全体として、当該タイプＩＩ-Ａクラスターにおいて、化膿レンサ球菌の緊密関連システム由来のＣａｓ９だけが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによる二重分子ＲＮＡの安定化及び配列成熟において、内因性のＣａｓ９の役割を、代わりに機能できる。
したがって、内因性化膿レンサ球菌Ｃａｓ９に対する、選択種由来のオーソログの交換は、化膿レンサ球菌由来のＣａｓ９タンパク質だけが、ＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡプロセス化を手助けできることを示す。この結果は、Ｃａｓ９サブグループの基礎となる、低保存内部モチーフ領域が、特定の二重分子ＲＮＡに特異的なＣａｓ９に対して応答できたことを示している。
実施例５。
Ｃａｓ９オーソログは、ＤＮＡ開裂活性に対して、それらに特異的ＰＡＭ配列が必要である。
化膿レンサ球菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス＊のタイプＩＩ―Ａにおいて、ＰＡＭを、ＮＧＧ及びＮＧＧＮＧとして特定した。これら２種において、そのＰＡＭを変異させることで、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９によるＤＮＡ干渉を無効にする（１４、２２、２３）。化膿レンサ球菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス以外の細菌種由来のＣａｓ９に対応する機能性ＰＡＭを特定するために、選択したＣＲＩＳＰＲアレイにおけるスペーサー配列とマッチする潜在的プロトスペーサーを、ＢＬＡＳＴを使用して探索した。ミュータンス菌ＵＡ１５９、カンピロバクター・ジェジュニＮＣＴＣ１１１６８、パスツレラ・ムルトシダＰｍ７０及びフランシセラ・ノビシダＵ１１２に対して、潜在的プロトスペーサーを特定した。したがって、Ｃａｓ９の緊密関連変異体を含む系統（補足表Ｓ２）を探索し、及びそれらのスペーサー配列を、同様のアプローチで解析した（補足表Ｓ３）。プロトスペーサー配列の直下に位置する、特定した１０ｎｔ配列を配置し、及びＰＡＭ配列を表す最も一般的なヌクレオチドを描写した。ロゴプロット（図５Ａ）で可視化したデータに基づき、プラスミドＤＮＡ部位を、そのｓｐｅＭプロトスペーサー、次いで互いにその予測ＰＡＭを含有または含有しない異なる隣接配列を含むように設計した（図５Ｂ）。当該Ｃａｓ９オーソロガスタンパク質を生成し（補足図Ｓ１）、及び二重分子ＲＮＡオーソログを、ディープＲＮＡ配列データを基に、ｃｒＲＮＡ標的化ｓｐｅＭのスペーサー配列を伴うように設計した（１５）。効果的なＤＮＡ標的化に重要なプロトスペーサー隣接配列を決定するために、精製Ｃａｓ９オーソログ及びそれらと同種の二重分子ＲＮＡを、異なるプラスミド部位を伴うＤＮＡ開裂アッセイに使用した（図５Ｃ、補足表Ｓ９）。従来公開されている、化膿レンサ球菌（ＮＧＧ）、ミュータンス菌（ＮＧＧ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊（ＮＧＧＮＧ）及び髄膜炎菌（ＮＮＮＮＧＡＴＴ）由来のＣａｓ９に対応したＰＡＭ（２７、２８、５３、５４）を、多重配列配置及び試験管内アッセイ、我々のアプローチの検証により確認した。しかしながら、二重分子ＲＮＡにガイドされたストレプトコッカス・サーモフィルス＊由来のＣａｓ９は、ＮＧＧＮＧに代わるＮＧＧのみの存在で、標的ＤＮＡを効率的に開裂できた（補足図Ｓ９）。この点は、第三Ｇの突然変異が、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊のＣａｓ９による干渉を無効にした、生体内で得られたデータと対照的である（２３）。ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊に対しては、当該ＰＡＭは、ＮＮＡＧＡＡＷとして公開されており（２７）、我々が誘導した配列（ＮＮＡＡＡＡＷ）とは１塩基分異なる。これら２つの配列を伴う試験管内開裂アッセイで、「ＮＮＡＡＡＡＷ」ＰＡＭを有するＤＮＡ部位は、その「ＮＮＡＧＡＡＷ」ＰＡＭとの比較で、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊のＣａｓ９により、より効率的に開裂することを示した（補足図Ｓ９）。
同様のアプローチで、カンピロバクター・ジェジュニ、フランシセラ・ノビシダ及びパスツレラ・ムルトシダに対応する最も一般的なプロトスペーサー下流配列を、試験管内開裂アッセイで検証し、最も可能性の高いＰＡＭ配列が、ＮＮＮＮＡＣＡ（カンピロバクター・ジェジュニ）、ＧＮＮＮＣＮＮＡ（パスツレラ・ムルトシダ）及びＮＧ（フランシセラ・ノビシダ）であるという結果を得た（図５Ｃ、補足図Ｓ９）。カンピロバクター・ジェジュニ由来のプロトスペーサー隣接配列の解析は、そのプロトスペーサーの５位置下流における、Ｃ及びＡ（「ＮＮＮＮＣＣＡ」または「ＮＮＮＮＡＣＡ」）の同じ頻度を示す（補足表Ｓ３）。したがって、カンピロバクター・ジェジュニの二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９の開裂活性に対して、両部位を試験した。この位置においては、Ａを含むＤＮＡ標的のみが、効率的に開裂された（補足図Ｓ９）。この結果は、当該「ＮＮＮＮＣＣＡ」ＰＡＭが、ゲノムＤＮＡまたはカンピロバクター属株のプロファージにほとんど見出せるにこと付随して、当該プロトスペーサーの起源により説明できた。このケースにおいて、プロトスペーサーに存在する染色体上の突然変異ＰＡＭ配列は、自己標的化を防ぐ。当該パスツレラ・ムルトシダＰＡＭは、当該多重配列配置が、たった２つのプロトスペーサー配列から誘導されたことを与えるさらなる検証が必要である。このように、試験管内の異なる細菌種由来の二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体により、ｄｓＤＮＡの開裂を可能にする、一連の特定ＰＡＭを同定した。遺伝子編集の目的に対しては、目的外の影響を制限して効率的な標的化を可能にするこれらＰＡＭを選択するために、潜在的なモチーフの範囲が解析されねばならないことが考えられる。
補足表Ｓ５−例示されたタイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム関連のｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部
実施例６
Ｃａｓ９の系統樹のクラスター化で、二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９の互換性を定める。
前述のように、Ｃａｓ９オーソログのクラスター化は、生体内のＲＮａｓｅ ＩＩＩによるｔｒａｃｒＲＮＡ：ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのプロセス化における、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＲＮＡ安定化の役割に対応した置換能力と相関する（図４Ｂ）。密接に関連したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおける、Ｃａｓ９と二重分子ＲＮＡ間の互換性を、ＤＮＡ干渉のレベルで検討した。
タイプＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムのクラスター化の選択されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの代表由来の、二重分子ＲＮＡと複合化した化膿レンサ球菌Ｃａｓ９を使用して、プラスミド開裂アッセイを実施した。図６Ａ（上パネル）に示すように、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス＊（タイプＩＩ−Ａ、黄色サブクラスター）由来の二重分子ＲＮＡ配列において、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡを開裂できたが、その他のいずれの種由来の二重分子ＲＮＡ配列においても、開裂できなかった。化膿レンサ球菌からの二重分子ＲＮＡを、異なる細菌由来のＣａｓ９オーソログと培養した場合に、同様の結果が観察された（図６Ａ、下パネル）。同種及び非同種の二重分子ＲＮＡと培養した全てのＣａｓ９オーソログで、それらのＰＡＭに特異的なプラスミドＤＮＡ上での開裂アッセイを実施した。同じタイプＩＩサブクラスター内のＣａｓ９と二重分子ＲＮＡの組み合わせだけが、ｄｓＤＮＡの開裂活性を授かった（図６Ｂ、補足図Ｓ１０）。より印象的なことは、相応するタイプＩＩグループにおいて、当該種がどの程度密接に関連しているかに依存して、活性の勾配があることであった。この影響は、パスツレラ・ムルトシダ及び髄膜炎菌由来の二重分子ＲＮＡの存在下において、ＤＮＡを開裂できるカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９に対して観測でき、しかしそれ自身のＲＮＡについては同じようには影響しなかった（タイプＩＩ−Ｃ、青のサブクラスター）。この知見は、系統樹の全てのＣａｓ９オーソログが、タイプＩＩ―Ｃに属すが、カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９は、パスツレラ・ムルトシダ及び髄膜炎菌Ｃａｓ９からより離れたクラスターであることを示す、Ｃａｓ９の系統樹（図１Ａ）と良く一致する。この影響は、化膿レンサ球菌、ミュータンス菌及びストレプトコッカス・サーモフィルス＊と共にタイプＩＩ−Ａに属す、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９に対しては、さらに大きかった。しかしながら、後者３つの遺伝子座由来の二重分子ＲＮＡはどれも、ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９により、ＤＮＡ開裂に向かわせることはできなかった。この結果は、二重分子ＲＮＡ結合に関連したストレプトコッカス・サーモフィルスＤＧＣＣ７７１０のＣＲＩＳＰＲ１及びＣＲＩＳＰＲ３由来のＣａｓ９間の互換性の欠如を表す、最近の知見を支持している（１７）。Ｃａｓ９とｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡの互換性が、二重分子ＲＮＡとＣａｓ９の共進化からの結果を直接的に予期させ、及び当該Ｃａｓ９の系統が、水平伝播のために、各々の細菌種の系統とは異なっていることに従っている。
したがって、ＤＮＡ干渉のレベルにおける、タイプＩＩのサブグループ間の互換性の検討のために、８つの選択されたＣａｓ９オーソログの各々に特異的なＰＡＭ（２８）を決定した。潜在的ｃｒＲＮＡ標的化配列の配置により、全ての選択種におけるプロトスペーサーに隣接する保存モチーフを特定した。次いで、これらのモチーフは、試験管内の同種の二重分子ＲＮＡ：Ｃａｓ９複合体のＤＮＡ干渉活性に、不可欠であることを示した。異なるサブクラスターからの二重分子ＲＮＡとＣａｓ９間の互換性を、プラスミド開裂アッセイを利用して試験した。緊密に関連するＣａｓ９タンパク質だけが、それらの同種二重分子ＲＮＡと交換でき、及びそのＣａｓ９に特異的なＰＡＭの使用に際し開裂活性を依然として発揮できる。二重分子ＲＮＡに向かうＣａｓ９の特異性は、そのＣａｓ９配列の関連性に、非常に敏感である。その感受性は、同種の二重分子ＲＮＡに対してはフルに開裂活性を発揮するが、異なるタイプＩＩ−Ｃのサブクラスターに属する髄膜炎菌及びパスツレラ・ムルトシダ由来の二重分子ＲＮＡには低い活性を発揮する、カンピロバクター・ジェジュニ由来のＣａｓ９に観察される。Ｃａｓ９は、二重分子ＲＮＡの二次構造に対する特異性を保持していると考えられ、生物情報学的な予測は、緊密に関連するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおけるリピート部：抗リピート部二本鎖の類似構造の示唆を与えている（補足図Ｓ１２）。
本発明は、特定の実施形態について記述してきたが、変形及び修正が起こることは、当業者には理解されるであろう。したがって、本請求項に現れるそのような制限だけが、本発明に加えられるべきである。
引用文献。
本明細書に引用する全ての公開物及び特許は、各個別の公開物または特許が、参照により組み込まれることを特に及び個別に示されているかのように、参照として本明細書に組み入れ、及びその公開物の引用に関連して、当該方法及び／または物質を開示し及び記述するために参照として援用し、本明細書に組み入れる。任意の公開物の引用は、出願日に先立つ開示のためであり、及び先行発明によるそのような公開に先立つ権利はないことを認めるとして解釈されるべきではない。さらに、与えられる開示の日付は、個別に確認する必要がある実際の公開日とは異なっている場合がある。
１． Ｃｈｏ， Ｓ．Ｗ．， Ｋｉｍ， Ｓ．， Ｋｉｍ， Ｊ．Ｍ． ａｎｄ Ｋｉｍ， Ｊ．Ｓ． （２０１３） Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｃａｓ９ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ２３０−２３２．
２． Ｃｏｎｇ， Ｌ．， Ｒａｎ， Ｆ．Ａ．， Ｃｏｘ， Ｄ．， Ｌｉｎ， Ｓ．， Ｂａｒｒｅｔｔｏ， Ｒ．， Ｈａｂｉｂ， Ｎ．， Ｈｓｕ， Ｐ．Ｄ．， Ｗｕ， Ｘ．， Ｊｉａｎｇ， Ｗ．， Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ， Ｌ．Ａ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８１９−８２３．
３． ＤｉＣａｒｌｏ， Ｊ．Ｅ．， Ｎｏｒｖｉｌｌｅ， Ｊ．Ｅ．， Ｍａｌｉ， Ｐ．， Ｒｉｏｓ， Ｘ．， Ａａｃｈ， Ｊ． ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． （２０１３） Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４１， ４３３６−４３４３．
４． Ｆｒｉｅｄｌａｎｄ， Ａ．Ｅ．， Ｔｚｕｒ， Ｙ．Ｂ．， Ｅｓｖｅｌｔ， Ｋ．Ｍ．， Ｃｏｌａｉａｃｏｖｏ， Ｍ．Ｐ．， Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ Ｃａｌａｒｃｏ， Ｊ．Ａ． （２０１３） Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ｖｉａ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １０， ７４１−７４３．
５． Ｇｒａｔｚ， Ｓ．Ｊ．， Ｃｕｍｍｉｎｇｓ， Ａ．Ｍ．， Ｎｇｕｙｅｎ， Ｊ．Ｎ．， Ｈａｍｍ， Ｄ．Ｃ．， Ｄｏｎｏｈｕｅ， Ｌ．Ｋ．， Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｍ．Ｍ．， Ｗｉｌｄｏｎｇｅｒ， Ｊ． ａｎｄ Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ−Ｇｉｌｅｓ， Ｋ．Ｍ． （２０１３） Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９４， １０２９−１０３５．
６． Ｈｗａｎｇ， Ｗ．Ｙ．， Ｆｕ， Ｙ．， Ｒｅｙｏｎ， Ｄ．， Ｍａｅｄｅｒ， Ｍ．Ｌ．， Ｔｓａｉ， Ｓ．Ｑ．， Ｓａｎｄｅｒ， Ｊ．Ｄ．， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ， Ｒ．Ｔ．， Ｙｅｈ， Ｊ．Ｒ． ａｎｄ Ｊｏｕｎｇ， Ｊ．Ｋ． （２０１３） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｕｓｉｎｇ ａ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ２２７−２２９．
７． Ｊｉａｎｇ， Ｗ．， Ｂｉｋａｒｄ， Ｄ．， Ｃｏｘ， Ｄ．， Ｚｈａｎｇ， Ｆ． ａｎｄ Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ， Ｌ．Ａ． （２０１３） ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ２３３−２３９．
８． Ｍａｌｉ， Ｐ．， Ｙａｎｇ， Ｌ．， Ｅｓｖｅｌｔ， Ｋ．Ｍ．， Ａａｃｈ， Ｊ．， Ｇｕｅｌｌ， Ｍ．， Ｄｉｃａｒｌｏ， Ｊ．Ｅ．， Ｎｏｒｖｉｌｌｅ， Ｊ．Ｅ． ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． （２０１３） ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ８２３−８２６．
９． Ｓｈｅｎ， Ｂ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｗｕ， Ｈ．， Ｗａｎｇ， Ｊ．， Ｍａ， Ｋ．， Ｌｉ， Ｚ．， Ｚｈａｎｇ， Ｘ．， Ｚｈａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， Ｘ． （２０１３） Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２３， ７２０−７２３．
１０． Ｗａｎｇ， Ｈ．， Ｙａｎｇ， Ｈ．， Ｓｈｉｖａｌｉｌａ， Ｃ．Ｓ．， Ｄａｗｌａｔｙ， Ｍ．Ｍ．， Ｃｈｅｎｇ， Ａ．Ｗ．， Ｚｈａｎｇ， Ｆ． ａｎｄ Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｒ． （２０１３） Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｃｅｌｌ， １５３， ９１０−９１８．
１１． Ｊｉｎｅｋ， Ｍ．， Ｅａｓｔ， Ａ．， Ｃｈｅｎｇ， Ａ．， Ｌｉｎ， Ｓ．， Ｍａ， Ｅ． ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ． （２０１３） ＲＮＡ−ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． ｅＬＩＦＥ， ２， ｅ００４７１．
１２． Ｌｉ， Ｊ．Ｆ．， Ｎｏｒｖｉｌｌｅ， Ｊ．Ｅ．， Ａａｃｈ， Ｊ．， ＭｃＣｏｒｍａｃｋ， Ｍ．， Ｚｈａｎｇ， Ｄ．， Ｂｕｓｈ， Ｊ．， Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｈｅｅｎ， Ｊ． （２０１３） Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｎｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｕｓｉｎｇ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ６８８−６９１．
１３． Ｎｅｋｒａｓｏｖ， Ｖ．， Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ， Ｂ．， Ｗｅｉｇｅｌ， Ｄ．， Ｊｏｎｅｓ， Ｊ．Ｄ． ａｎｄ Ｋａｍｏｕｎ， Ｓ． （２０１３） Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｄｅｌ ｐｌａｎｔ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ６９１−６９３．
１４． Ｊｉｎｅｋ， Ｍ．， Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｆｏｎｆａｒａ， Ｉ．， Ｈａｕｅｒ， Ｍ．， Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． （２０１２） Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３７， ８１６−８２１．
１５． Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｌｅ Ｒｈｕｎ， Ａ． ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． （２０１３） Ｔｈｅ ｔｒａｃｒＲＮＡ ａｎｄ Ｃａｓ９ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｏｆ ｔｙｐｅ ＩＩ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｓｙｓｔｅｍｓ． ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．， １０， ７２６−７３７．
１６． Ｄｅｌｔｃｈｅｖａ， Ｅ．， Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ， Ｋ．， Ｓｈａｒｍａ， Ｃ．Ｍ．， Ｇｏｎｚａｌｅｓ， Ｋ．， Ｃｈａｏ， Ｙ．， Ｐｉｒｚａｄａ， Ｚ．Ａ．， Ｅｃｋｅｒｔ， Ｍ．Ｒ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｊ． ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． （２０１１） ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｒａｎｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｆａｃｔｏｒ ＲＮａｓｅ ＩＩＩ． Ｎａｔｕｒｅ， ４７１， ６０２−６０７．
１７． Ｋａｒｖｅｌｉｓ， Ｔ．， Ｇａｓｉｕｎａｓ， Ｇ．， Ｍｉｋｓｙｓ， Ａ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｓｎｙｓ， Ｖ． （２０１３） ｃｒＲＮＡ ａｎｄ ｔｒａｃｒＲＮＡ ｇｕｉｄｅ Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ． ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．， １０， ８４１−８５１．
１８． Ｇａｒｎｅａｕ， Ｊ．Ｅ．， Ｄｕｐｕｉｓ， Ｍ．Ｅ．， Ｖｉｌｌｉｏｎ， Ｍ．， Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ．Ａ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｂｏｙａｖａｌ， Ｐ．， Ｆｒｅｍａｕｘ， Ｃ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ．， Ｍａｇａｄａｎ， Ａ．Ｈ． ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ． （２０１０） Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｃｌｅａｖｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ． Ｎａｔｕｒｅ， ４６８， ６７−７１．
１９． Ｍａｇａｄａｎ， Ａ．Ｈ．， Ｄｕｐｕｉｓ， Ｍ．Ｅ．， Ｖｉｌｌｉｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ． （２０１２） Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ ｂｙ ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ３−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ７， ｅ４０９１３．
２０． Ｈａｆｔ， Ｄ．Ｈ．， Ｓｅｌｅｎｇｕｔ， Ｊ．， Ｍｏｎｇｏｄｉｎ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｎｅｌｓｏｎ， Ｋ．Ｅ． （２００５） Ａ ｇｕｉｌｄ ｏｆ ４５ ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ （Ｃａｓ） ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｅｘｉｓｔ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｇｅｎｏｍｅｓ． ＰＬｏＳ Ｃｏｍｐｕｔ． Ｂｉｏｌ．， １， ｅ６０．
２１． Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ｇｒｉｓｈｉｎ， Ｎ．Ｖ．， Ｓｈａｂａｌｉｎａ， Ｓ．Ａ．， Ｗｏｌｆ， Ｙ．Ｉ． ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ， Ｅ．Ｖ． （２００６） Ａ ｐｕｔａｔｉｖｅ ＲＮＡ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ： ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｍａｃｈｉｎｅｒｙ， ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｏｇｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ＲＮＡｉ， ａｎｄ ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ａｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ， １， ７．
２２． Ｇａｓｉｕｎａｓ， Ｇ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｓｎｙｓ， Ｖ． （２０１２） Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １０９， Ｅ２５７９−２５８６．
２３． Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ， Ｒ．， Ｇａｓｉｕｎａｓ， Ｇ．， Ｆｒｅｍａｕｘ， Ｃ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｓｉｋｓｎｙｓ， Ｖ． （２０１１） Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３９， ９２７５−９２８２．
２４． Ｍａｌｉ， Ｐ．， Ａａｃｈ， Ｊ．， Ｓｔｒａｎｇｅｓ， Ｐ．Ｂ．， Ｅｓｖｅｌｔ， Ｋ．Ｍ．， Ｍｏｏｓｂｕｒｎｅｒ， Ｍ．， Ｋｏｓｕｒｉ， Ｓ．， Ｙａｎｇ， Ｌ． ａｎｄ Ｃｈｕｒｃｈ， Ｇ．Ｍ． （２０１３） Ｃａｓ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３１， ８３３−８３８．
２５． Ｒａｎ， Ｆ．Ａ．， Ｈｓｕ， Ｐ．Ｄ．， Ｌｉｎ， Ｃ．Ｙ．， Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ， Ｊ．Ｓ．， Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ， Ｓ．， Ｔｒｅｖｉｎｏ， Ａ．Ｅ．， Ｓｃｏｔｔ， Ｄ．Ａ．， Ｉｎｏｕｅ， Ａ．， Ｍａｔｏｂａ， Ｓ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． （２０１３） Ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ． Ｃｅｌｌ， １５４， １３８０−１３８９．
２６． Ｄｅｖｅａｕ， Ｈ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｇａｒｎｅａｕ， Ｊ．Ｅ．， Ｌａｂｏｎｔｅ， Ｊ．， Ｆｒｅｍａｕｘ， Ｃ．， Ｂｏｙａｖａｌ， Ｐ．， Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ．Ａ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ． （２００８） Ｐｈａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＣＲＩＳＰＲ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９０， １３９０−１４００．
２７． Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ．， Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ．Ａ．， Ｃｏｕｔｅ−Ｍｏｎｖｏｉｓｉｎ， Ａ．Ｃ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｍ．， Ｄｅｖｅａｕ， Ｈ．， Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ．， Ｂｏｙａｖａｌ， Ｐ．， Ｆｒｅｍａｕｘ， Ｃ． ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ． （２００８） Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ， ａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ｌｏｃｉ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９０， １４０１−１４１２．
２８． Ｍｏｊｉｃａ， Ｆ．Ｊ．， Ｄｉｅｚ−Ｖｉｌｌａｓｅｎｏｒ， Ｃ．， Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ｊ． ａｎｄ Ａｌｍｅｎｄｒｏｓ， Ｃ． （２００９） Ｓｈｏｒｔ ｍｏｔｉｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ＣＲＩＳＰＲ ｄｅｆｅｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １５５， ７３３−７４０．
２９． Ｂｉｋａｒｄ， Ｄ．， Ｊｉａｎｇ， Ｗ．， Ｓａｍａｉ， Ｐ．， Ｈｏｃｈｓｃｈｉｌｄ， Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｆ． ａｎｄ Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ， Ｌ．Ａ． （２０１３） Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ４１， ７４２９−７４３７．
３０． Ｑｉ， Ｌ．Ｓ．， Ｌａｒｓｏｎ， Ｍ．Ｈ．， Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｌ．Ａ．， Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ．， Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｊ．Ｓ．， Ａｒｋｉｎ， Ａ．Ｐ． ａｎｄ Ｌｉｍ， Ｗ．Ａ． （２０１３） Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ． Ｃｅｌｌ， １５２， １１７３−１１８３．
３１． Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． ａｎｄ Ｄｏｕｄｎａ， Ｊ．Ａ． （２０１３） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｒｅｗｒｉｔｉｎｇ ａ ｇｅｎｏｍｅ． Ｎａｔｕｒｅ， ４９５， ５０−５１．
３２． Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ． （２０１３） ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａ ｌａ ｃａｒｔｅ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２３， ７３３−７３４．
３３． ｖａｎ ｄｅｒ Ｏｏｓｔ， Ｊ． （２０１３） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ． Ｎｅｗ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｓｕｒｇｅｒｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３３９， ７６８−７７０．
３４． Ｈｏｕ， Ｚ．， Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｐｒｏｐｓｏｎ， Ｎ．Ｅ．， Ｈｏｗｄｅｎ， Ｓ．Ｅ．， Ｃｈｕ， Ｌ．Ｆ．， Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ， Ｅ．Ｊ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． （２０１３） Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｃａｓ９ ｆｒｏｍ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ．， １１０， １５６４４−１５６４９．
３５． Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ． Ｙ． ｅｄ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．
３６． Ｃａｐａｒｏｎ， Ｍ．Ｇ． ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， Ｊ．Ｒ． （１９９１） Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２０４， ５５６−５８６．
３７． Ｋｉｒｓｃｈ， Ｒ．Ｄ． ａｎｄ Ｊｏｌｙ， Ｅ． （１９９８） Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ＰＣＲ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｗｏ−ｓｉｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｗａｐｐｉｎｇ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６， １８４８−１８５０．
３８． Ｓｉｌｌｅｒ， Ｍ．， Ｊａｎａｐａｔｌａ， Ｒ．Ｐ．， Ｐｉｒｚａｄａ， Ｚ．Ａ．， Ｈａｓｓｌｅｒ， Ｃ．， Ｚｉｎｋｌ， Ｄ． ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． （２００８） Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｌｕｘＳ／ＡＩ−２ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ， ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌｓ． ＢＭＣ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ８， １８８．
３９． Ｍａｎｇｏｌｄ， Ｍ．， Ｓｉｌｌｅｒ， Ｍ．， Ｒｏｐｐｅｎｓｅｒ， Ｂ．， Ｖｌａｍｉｎｃｋｘ， Ｂ．Ｊ．， Ｐｅｎｆｏｕｎｄ， Ｔ．Ａ．， Ｋｌｅｉｎ， Ｒ．， Ｎｏｖａｋ， Ｒ．， Ｎｏｖｉｃｋ， Ｒ．Ｐ． ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ． （２００４） Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｇｒｏｕｐ Ａ ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｓ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｂｙ ａ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ＲＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ． Ｍｏｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５３， １５１５−１５２７．
４０． Ｈｅｒｂｅｒｔ， Ｓ．， Ｂａｒｒｙ， Ｐ． ａｎｄ Ｎｏｖｉｃｋ， Ｒ．Ｐ． （２００１） Ｓｕｂｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｌｉｎｄａｍｙｃｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ． Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．， ６９， ２９９６−３００３．
４１． Ｐａｌｌ， Ｇ．Ｓ． ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ａ．Ｊ． （２００８） Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｔｏｃ．， ３， １０７７−１０８４．
４２． Ｕｒｂａｎ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌ， Ｊ． （２００７） Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３５， １０１８−１０３７．
４３． ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ， Ｍ．， Ｈａｎｉｓｈ， Ｊ．， Ｎｅｌｓｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， Ｙ． （１９８８） ＫＧＢ： ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ ａｌｌ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １６， ３６４．
４４． Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ｈａｆｔ， Ｄ．Ｈ．， Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｂｒｏｕｎｓ， Ｓ．Ｊ．， Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ， Ｅ．， Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ．， Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ．， Ｍｏｊｉｃａ， Ｆ．Ｊ．， Ｗｏｌｆ， Ｙ．Ｉ．， Ｙａｋｕｎｉｎ， Ａ．Ｆ． ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｎａｔ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ９， ４６７−４７７．
４５． Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．Ｆ．， Ｍａｄｄｅｎ， Ｔ．Ｌ．， Ｓｃｈａｆｆｅｒ， Ａ．Ａ．， Ｚｈａｎｇ， Ｊ．， Ｚｈａｎｇ， Ｚ．， Ｍｉｌｌｅｒ， Ｗ． ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ， Ｄ．Ｊ． （１９９７） Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ： ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５， ３３８９−３４０２．
４６． Ｗｈｅｅｌｅｒ， Ｄ． ａｎｄ Ｂｈａｇｗａｔ， Ｍ． （２００７） ＢＬＡＳＴ ＱｕｉｃｋＳｔａｒｔ： ｅｘａｍｐｌｅ−ｄｒｉｖｅｎ ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ ＢＬＡＳＴ ｔｕｔｏｒｉａｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ３９５， １４９−１７６．
４７． Ｅｄｇａｒ， Ｒ．Ｃ． （２００４） ＭＵＳＣＬＥ： ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３２， １７９２−１７９７．
４８． Ｓｏｄｉｎｇ， Ｊ．， Ｂｉｅｇｅｒｔ， Ａ． ａｎｄ Ｌｕｐａｓ， Ａ．Ｎ． （２００５） Ｔｈｅ ＨＨｐｒｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｓｅｒｖｅｒ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３３， Ｗ２４４−２４８．
４９． Ｐｒｉｃｅ， Ｍ．Ｎ．， Ｄｅｈａｌ， Ｐ．Ｓ． ａｎｄ Ａｒｋｉｎ， Ａ．Ｐ． （２０１０） ＦａｓｔＴｒｅｅ ２−−ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｍａｘｉｍｕｍ−ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｔｒｅｅｓ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ， ５， ｅ９４９０．
５０． Ｂｅｒｎｈａｒｔ， Ｓ．Ｈ．， Ｔａｆｅｒ， Ｈ．， Ｍｕｃｋｓｔｅｉｎ， Ｕ．， Ｆｌａｍｍ， Ｃ．， Ｓｔａｄｌｅｒ， Ｐ．Ｆ． ａｎｄ Ｈｏｆａｃｋｅｒ， Ｉ．Ｌ． （２００６） Ｐａｒｔｉｔｉｏｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂａｓｅ ｐａｉｒｉｎｇ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ＲＮＡ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ． Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １， ３．
５１． Ｈｏｆａｃｋｅｒ， Ｉ．Ｌ．， Ｆｅｋｅｔｅ， Ｍ． ａｎｄ Ｓｔａｄｌｅｒ， Ｐ．Ｆ． （２００２） Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｌｉｇｎｅｄ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ， ３１９， １０５９−１０６６．
５２． Ｄａｒｔｙ， Ｋ．， Ｄｅｎｉｓｅ， Ａ． ａｎｄ Ｐｏｎｔｙ， Ｙ． （２００９） ＶＡＲＮＡ： Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ ｄｒａｗｉｎｇ ａｎｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ， ２５， １９７４−１９７５．
５３． Ｂｈａｙａ， Ｄ．， Ｄａｖｉｓｏｎ， Ｍ． ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ． （２０１１） ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ： ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｆｏｒ ａｄａｐｔｉｖｅ ｄｅｆｅｎｓｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， ４５， ２７３−２９７．
５４． Ｚｈａｎｇ， Ｙ．， Ｈｅｉｄｒｉｃｈ， Ｎ．， Ａｍｐａｔｔｕ， Ｂ．Ｊ．， Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ， Ｃ．Ｗ．， Ｓｅｉｆｅｒｔ， Ｈ．Ｓ．， Ｓｃｈｏｅｎ， Ｃ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｊ． ａｎｄ Ｓｏｎｔｈｅｉｍｅｒ， Ｅ．Ｊ． （２０１３） Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ ｌｉｍｉｔ ｎａｔｕｒａｌ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ， ５０， ４８８−５０３．
５５． Ｔａｋｅｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｗｏｌｆ， Ｙ．Ｉ．， Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ． ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ， Ｅ．Ｖ． （２０１２） Ｎａｔｕｒｅ ａｎｄ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｏｎ ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９４， １２１６−１２２５．
５６． Ｍａｋａｒｏｖａ， Ｋ．Ｓ．， Ａｒａｖｉｎｄ， Ｌ．， Ｗｏｌｆ， Ｙ．Ｉ． ａｎｄ Ｋｏｏｎｉｎ， Ｅ．Ｖ． （２０１１） Ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｉｅｓ ａｎｄ ａ ｓｉｍｐｌｅ ｓｃｅｎａｒｉｏ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｂｉｏｌ． Ｄｉｒｅｃｔ．， ６， ３８．
５７． Ｂａｒｒａｎｇｏｕ， Ｒ．， Ｆｒｅｍａｕｘ， Ｃ．， Ｄｅｖｅａｕ， Ｈ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｍ．， Ｂｏｙａｖａｌ， Ｐ．， Ｍｏｉｎｅａｕ， Ｓ．， Ｒｏｍｅｒｏ， Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｐ． （２００７） ＣＲＩＳＰＲ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ３１５， １７０９−１７１２．
５８． Ｓｕｎ， Ｗ．， Ｌｉ， Ｇ． ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ａ．Ｗ． （２００４） Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ａｃｉｄｉｃ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４３， １３０５４−１３０６２．
５９．Ｓｕｎ， Ｗ．， Ｊｕｎ， Ｅ． ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ， Ａ．Ｗ． （２００１） Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ−ＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｄｓＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４０， １４９７６−１４９８４

Claims (63)

  1. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記ガイドＲＮＡ。
  2. 前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート配列を含み、それが該タンパク質結合セグメントのｔｒａｃｒＲＮＡの同種のＣＲＩＳＰＲリピート配列である、請求項１に記載の単分子ガイドＲＮＡ。
  3. 前記ＤＮＡ標的化セグメントが、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＲＮＡをさらに含む、請求項１または２に記載の単分子ガイドＲＮＡ。
  4. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニのｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート配列に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であり、及び前記ＰＡＭ配列がＮＮＮＮＡＣＡである、請求項３に記載の前記単分子ガイドＲＮＡ。
  5. プロトスペーサー様配列に相補的な前記ＲＮＡが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−９７３、１０７９−１２２２、１３１３−１３４８、１３７２−１４１５、１４４４−１９００、２１６３−２４８２または２６６７−２６８６の１つに提示される、標的配列に相補的なＲＮＡである、請求項４または８に記載の単分子ガイドＲＮＡ。
  6. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記単分子ガイドＲＮＡ。
  7. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記ガイドＲＮＡ。
  8. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に、各々が少なくとも８０％同一であり、及び前記ＰＡＭ配列がＮＮＮＮＡＣＡである、請求項７に記載の単分子ガイドＲＮＡ。
  9. 前記ＤＮＡ標的化セグメントと前記タンパク質結合セグメントの間にリンカーを含む、請求項１または６に記載の単分子ガイドＲＮＡ。
  10. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記ＤＮＡ。
  11. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記ＤＮＡ。
  12. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記ベクター。
  13. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターであって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記ベクター。
  14. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞であって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記細胞。
  15. ＤＮＡ標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む単分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞であって、ここで前記タンパク質結合セグメントが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記細胞。
  16. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらに相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含み、及びここで前記ガイドＲＮＡが、改変バックボーン、人工ヌクレオチド間の連結、核酸の擬態、改変糖モイエティー、塩基修飾、改変または調節された安定性に備える改変または配列、細胞内トラッキングに備える改変または配列、トラッキングに備える改変または配列、またはタンパク質またはタンパク質複合体の結合部位に備える改変または配列を含む、前記二重分子ガイドＲＮＡ。
  17. 前記標的選択性ＲＮＡが補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部を含み、それは前記タンパク質結合セグメントのｔｒａｃｒＲＮＡの同種ＣＲＩＳＰＲリピート部である、請求項１６に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  18. 前記標的選択性ＲＮＡが、ＰＡＭ配列への標的ＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＲＮＡをさらに含む、請求項１６または１７に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  19. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニのｔｒａｃｒＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であり、及び前記ＰＡＭ配列がＮＮＮＮＡＣＡである、請求項１８に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  20. プロトスペーサー様配列に相補的な前記ＲＮＡが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０１−９７３、１０７９−１２２２、１３１３−１３４８、１３７２−１４１５、１４４４−１９００、２１６３−２４８２または２６６７−２６８６の１つに提示される標的配列に相補的なＲＮＡである、請求項１９または請求項２３に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  21. 標的選択性ＲＮＡ及び活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記二重分子ガイドＲＮＡ。
  22. 前記標的選択性ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部、補足表Ｓ５に提示される活性化因子ＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡの同種ＣＲＩＳＰＲリピート部、または補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部を含む、請求項２１に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  23. 前記ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲリピート部が、カンピロバクター・ジェジュニｔｒａｃｒのＲＮＡ及び補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、それぞれ少なくとも８０％同一であり、及び前記ＰＡＭ配列がＮＮＮＮＡＣＡである、請求項２１に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  24. 前記標的選択性ＲＮＡと前記活性化因子ＲＮＡの間にリンカーを含む、請求項１６または２１に記載の二重分子ガイドＲＮＡ。
  25. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記ＤＮＡ。
  26. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記ＤＮＡ。
  27. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記ベクター。
  28. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むベクターであって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記ベクター。
  29. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞であって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む、前記細胞。
  30. 標的選択性ＲＮＡ及びそれらと相補的な活性化因子ＲＮＡを含む二重分子ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含む細胞であって、ここで前記活性化因子ＲＮＡが、補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡ、補足表Ｓ５に提示されるＣＲＩＳＰＲリピート部に対し、少なくとも８０％同一であるＣＲＩＳＰＲリピート部、またはその両方を含む、前記細胞。
  31. 細胞中でＤＮＡを操作する方法であって、前記ＤＮＡをＣａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体に接触させることを含み、ここで前記複合体が、（ａ）前記細胞に対して異種のカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたはカンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｂ）前記細胞に対して異種のパスツレラ・ムルトシダ（Ｐ．ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはパスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記ＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡまたはＮＮＮＮＣへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｃ）前記細胞に対して異種のフランシセラ・ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはフランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及び前記ＰＡＭ配列ＮＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｄ）前記細胞に対して異種のストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ＊＊）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡＷへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、（ｅ）前記細胞に対して異種のリステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはリステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのＰＡＭ配列ＮＧＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡ、または（ｆ）前記細胞に対して異種のストレプトコッカス・ディスガラクティエ（Ｓ．ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｅ）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、またはストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対して少なくとも９０％同一である活性部分を有するエンドヌクレアーゼ、及びそのＰＡＭ配列ＮＧＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に、前記複合体を標的化しているガイドＲＮＡを含む、前記方法。
  32. 前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ガイドＲＮＡが、単分子ガイドＲＮＡである、請求項３１に記載の方法。
  34. 前記ガイドＲＮＡが、二重分子ガイドＲＮＡである、請求項３１に記載の方法。
  35. 前記エンドヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項３１に記載の方法。
  36. 前記エンドヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌Ｅ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相当する突然変異を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 前記エンドヌクレアーゼが、タンパク質を結合する死滅した突然変異体／ＤＮＡである、請求項３１に記載の方法。
  38. 標的化された前記プロトスペーサー様配列が、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣまたはＣＯＬ７Ａ１遺伝子にある、請求項３１に記載の方法。
  39. 前記プロトスペーサー様配列が、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）関連の遺伝子ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２またはＮＣＦ４にある、請求項３１に記載の方法。
  40. 標的化された前記プロトスペーサー様配列が、Ｂ細胞リンパ腫／白血病ＩＩＡ（ＢＣＬ１１Ａ）タンパク質、ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ結合部位の赤芽球系エンハンサーをコードする遺伝子にある、またはその遺伝子の１０００ヌクレオチドまでの上流にある、請求項３１に記載の方法。
  41. 前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡをコードするものと同じかまたは異なる組換えベクターにより、前記細胞に導入される、請求項３１に記載の方法。
  42. 少なくとも１つの組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、請求項３１に記載の方法。
  43. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＮＮＮＮＡＣＡへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該カンピロバクター・ジェジュニＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  44. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＧＮＮＮＣＮＮＡまたはＮＮＮＮＣへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）パスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該パスツレラ・ムルトシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  45. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＮＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）フランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該フランシセラ・ノビシダＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  46. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＮＮＡＡＡＡＷへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該ストレプトコッカス・サーモフィルス＊＊Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  47. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＮＧＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）リステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該リステリア・イノキュアＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  48. （ａ）前記ＰＡＭ配列ＮＧＧへのＤＮＡ５’におけるプロトスペーサー様配列に相補的なＤＮＡ標的化セグメントを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｂ）ストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたは当該ストレプトコッカス・ディスガラクティエＣａｓ９エンドヌクレアーゼの活性部分に対し、少なくとも９０％同一の活性部分を有するエンドヌクレアーゼをコードする、組換えベクター。
  49. 前記組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、請求項４３、４４、４５、４６、４７または４８に記載の組換えベクター。
  50. 化膿レンサ球菌Ｅ７６２Ａ、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相当する１つ以上の突然変異を含む、改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ。
  51. 化膿レンサ球菌変異体Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｎ９８２ＡまたはＡ９８４Ａに相当する１つ以上の突然変異をさらに含む、請求項５０に記載の改変Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ。
  52. 細胞中でＤＮＡを操作する方法であって、前記ＤＮＡをＣａｓ９オーソログ−ガイドＲＮＡ複合体に接触させることを含み、ここで前記複合体が、（ａ）前記細胞に対して異種であるＣａｓ９エンドヌクレアーゼ、及び（ｂ）補足表Ｓ５に提示されるｔｒａｃｒＲＮＡを含む前記Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼと同種のガイドＲＮＡ、または少なくとも２０のヌクレオチドにわたり、補足表Ｓ５に提示される同種のｔｒａｃｒＲＮＡに対し、少なくとも８０％同一であるｔｒａｃｒＲＮＡを含むガイドＲＮＡを含む、前記方法。
  53. 前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、古細菌細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記ガイドＲＮＡが、単分子ガイドＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記ガイドＲＮＡが、二重分子ガイドＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
  56. 前記エンドヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項５２に記載の方法。
  57. 前記エンドヌクレアーゼが、化膿レンサ球菌突然変異Ｅ７６２、ＨＨ９８３ＡＡまたはＤ９８６Ａに相当する突然変異を含む、請求項５２に記載の方法。
  58. 前記エンドヌクレアーゼが、タンパク質を結合する死滅した突然変異体／ＤＮＡである、請求項５２に記載の方法。
  59. 前記標的化されたプロトスペーサー様配列が、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４、ＫＲＴ５、ＫＲＴ１４、ＰＬＥＣまたはＣＯＬ７Ａ１遺伝子にあるか、またはその遺伝子の上流１０００ヌクレオチドまでの配列にある、請求項５２に記載の方法。
  60. 前記プロトスペーサー様配列が、慢性肉芽腫症（ＣＧＤ）関連の遺伝子ＣＹＢＡ、ＣＹＢＢ、ＮＣＦ１、ＮＣＦ２またはＮＣＦ４にあるか、またはその遺伝子の上流１０００ヌクレオチドまでの配列にある、請求項５２に記載の方法。
  61. 前記標的化されたプロトスペーサー様配列が、Ｂ細胞リンパ腫／白血病ＩＩＡ（ＢＣＬ１１Ａ）タンパク質、ＢＣＬ１１ＡまたはＢＣＬ１１Ａ結合部位の赤芽球系エンハンサーをコードする遺伝子にあるか、またはその遺伝子の１０００ヌクレオチドまでの上流にある、請求５２に記載の方法。
  62. 前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡが、前記エンドヌクレアーゼ及び前記ガイドＲＮＡをコードするものと同じかまたは異なる組換えベクターにより前記細胞に導入される、請求項５２に記載の方法。
  63. 少なくとも１つの組換えベクターが、組換えウイルスベクターである、請求項５２に記載の方法。
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