JP2003507438A - オリゴアルギニン部分を使用する上皮組織を横切るおよび上皮組織内への薬物送達の増強 - Google Patents

オリゴアルギニン部分を使用する上皮組織を横切るおよび上皮組織内への薬物送達の増強

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、上皮組織（皮膚、胃腸経路、肺上皮などを含む）を横切る薬物および他の薬剤の送達を増強するための組成物および方法を提供する。この組成物および方法はまた、内皮組織（血液脳関門を含む）を横切る送達に有用である。この組成物および方法は、結合体化されていない化合物と比較して、組織の１以上の層を横切る、試薬に結合体化された化合物の送達を増強するに十分なグアニジノ側鎖部分またはアミジノ側鎖部分を有する送達増強輸送体を用いる。この送達増強ポリマーは、例えば、好ましくは、約６と２５残基長との間のポリアルギニン分子を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （関連出願の相互参照） 本出願は、１９９９年８月２４日に提出された米国仮特許出願第６０／１５０
，５１０号に対する優先権を主張する。本出願は、ＴＴＣ代理人整理番号第０１
９８０１−０００２２０ＵＳ号として本明細書と共に同日に提出された米国特許
出願第 号に関連する。これらの出願は両方とも、全ての目的のために、
本明細書中で参照として援用される。
【０００２】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、薬物および真皮および上皮膜（例えば、皮膚、胃腸上皮および気管
支上皮を含む）を横切る他の化合物の送達を増強する組成物ならびに方法の分野
に関する。
【０００３】 （背景） 経皮または経粘膜薬物送達は、いくつかの理由のため、薬物送達の魅力的な経
路である。胃腸の薬物分解および肝の第１通過効果が避けられる。さらに、経皮
および経粘膜薬物送達は、制御された、持続された送達によく適合する（例えば
、Ｅｌｉａｓ、Ｉｎ Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：Ｍｅ
ｃｈａｎｉｓｍｓ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ−Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｂ
ｒｏｎａｕｇｈ ＆ Ｍａｉｂａｃｈ、編、ｐｐ１−１２、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅ
ｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８９を参照のこと）。多くの適用に対して、
薬物投与の伝統的な方法は、薬物の非常に高い初期濃度のために、最適ではない
。経皮送達は、より独特な、より遅い速度の薬物送達を可能とし得る。さらに、
このような送達方法は、使用しやすく、快適で、便利が良く、しかも非侵襲性で
あるので、患者の服薬も奨励される。
【０００４】 経皮および経粘膜送達のこれらの利点は、薬物に対する上皮膜（特に皮膚）の
低い透過性のために、多くの臨床的適用に至らなかった。皮膚を横切って薬物送
達する際の難しさは、皮膚の障壁的な性質から生じる。皮膚は、外側の厳しい環
境に対する体の境界を意味する、構造的に複雑な厚い膜である。皮膚は、表皮、
真皮、皮下組織、および腺構造体（上皮の付属体）からなる。皮膚の最も外側の
上皮組織である表皮は、それ自体が数層（角質層、顆粒層、有棘層、および基底
層）からなる。
【０００５】 インタクトな皮膚の中へかつ皮膚を横切って環境から移動する化合物は、最初
に、皮膚の最も外側の層である角質層に浸透しなければならず、この層は、緻密
でかつ高度に角質化されている。角質層は、コレステロールおよび脂肪酸からな
る「グルー（ｇｌｕｅ）」によって共に密接に結合された、数層のケラチンで満
たされた皮膚細胞からなる。角質層の厚さは、体の位置に依存して変化する。薬
学的因子に対する皮膚の非浸透性を引き起こすのは、この角質層の存在である。
角質層は、細胞が基底層から皮膚表面に向って移動することによって自然に形成
され、皮膚表面で細胞は最終的に剥がれ落ちる。細胞が表面に向って移動するに
つれて、細胞は徐々により疎水化され、そして角質化される。この角質層を横切
る浸透は、通常、皮膚を横切る薬物透過の律速段階である。例えば、Ｆｌｙｎｎ
，Ｇ．Ｌ．、Ｉｎ Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：Ｍｅｃ
ｈａｎｉｓｍｓ−Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ−Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、前出
、頁２７〜５３を参照のこと。
【０００６】 角質層を通る浸透の後、次いで、全身的に作用する薬物分子は、表皮、真皮の
中へ入り、そしてそれらを横切って通過し、そして最終的に血流の毛細管壁を通
過しなくてはならない。角質層の下にある表皮は、３つの層からなる。これらの
層の最も外側は、角質層に隣接してある顆粒層であり、基底細胞およびケラチノ
サイトから分化した細胞からなり、これらの細胞は、さらなる獲得ケラチン（ａ
ｑｕｉｒｅｄ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｋｅｒａｔｉｎ）およびより平らな形を
有する、基礎をなす層を形成する。表皮のこの層の細胞は、大部分がタンパク質
フィラグリンからなる顆粒を含む。このタンパク質は、ケラチンフィラメントに
結合し、ケラチン複合体を形成すると考えられている。この細胞はまた、細胞を
一緒に保つための「接着剤」として機能する脂質を合成する。表皮、特に顆粒層
は、アミノペプチダーゼのような酵素を含む。
【０００７】 表皮の２番目に外側にある層は、有棘層であり、この層の基本的な細胞は、基
底細胞層を含む基底細胞由来のケラチノサイトである。有棘層でも発見されるラ
ンゲルハンス細胞は、抗原提示細胞であり、従って、皮膚の中へ通過する抗原に
対する免疫反応の開始に関与する。この層の細胞は、通常、接触過敏皮膚炎に関
与する。
【０００８】 最も内側の表皮層は、基底層、または基底細胞層であり、この層は、基底細胞
層を下にある真皮から分離する薄い基底膜に、半接着斑によって接着された、立
方細胞の単一細胞層からなる。基底層の細胞は、表皮の外側の層の前駆体として
働く、比較的に未分化な、増殖する細胞である。基底細胞層は、基底細胞に加え
て、メラノサイトを含む。
【０００９】 真皮は、表皮の下に見い出され、これは、連結する乳頭間隆起および真皮乳頭
からなる基底膜によって、真皮と分離される。真皮自体は、２つの層（乳頭真皮
および網状真皮）からなる。真皮は、線維芽、組織球、内皮細胞、脈管周囲のマ
クロファージおよび樹状突起細胞、肥満細胞、平滑筋細胞、ならびに末梢神経細
胞およびそれらの末端器官レセプターからなる。真皮はまた、コラーゲンおよび
レチクリンのような繊維物質ならびに基底物質（基本的には、ヒアルロン酸、コ
ンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸を含むグリコサミノグリカン）を含む。
【００１０】 薬物の経皮輸送を増強するために、いくつかの方法が提案された。例えば、化
学的エンハンサー（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，Ｒ．Ｒ．Ｉｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
ａｌ Ｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅｓ；Ｈ
ａｄｇｒａｆｔ，Ｊ．、編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ：１９８９；ｐｐ．２
４７−２８８）、イオン導入法、および他の方法が用いられた。しかし、特に皮
膚を横切る薬物送達への３０年以上にわたる研究にもかかわらず、現在、１２よ
り少ない薬物しか、例えば、皮膚パッチでの経皮投与のために利用可能でない。
【００１１】 血液脳関門を横切る薬物および他の分子の輸送はまた、問題が多い。血液脳関
門を形成する脳の毛細管は、内皮細胞間で接着結合を形成する、内皮細胞からな
る（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２５５
：７４−８３（１９８６）；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ Ｗ．Ｍ．、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ
．Ｒｅｖ．７：３１４−３３０（１９８６））。内皮細胞および細胞と結合する
細胞内接着結合は、血液から脳への多くの分子の受動的移動に対して障壁を形成
する。血液脳関門の内皮細胞は、いくつかの飲小胞を有し、この飲小胞は、他の
組織において、毛細管壁を横切るいくぶん非選択的な輸送を可能とし得る。血液
脳関門もまた、連続する間隙または細胞を通じて拡がるチャネルによって妨げら
れず、従って、薬物および他の分子の無制限な通過を可能とする。
【００１２】 従って、皮膚および血液脳関門のような上皮組織および内皮組織を横切っての
化合物（薬物を含む）の送達を増強するための改良された試薬および方法に対す
る必要性が存在する。本発明は、この必要性および他の必要性を満足する。
【００１３】 （発明の要旨） 本発明は、動物の上皮組織または内皮組織の１以上の層の中への、そしてその
層を横切っての化合物の送達を増強するための方法を提供する。この方法は、組
織を化合物および送達増強輸送体を含む結合体と接触させることを含む。本発明
によってまた提供される送達増強輸送体は、送達増強輸送体の非存在下での化合
物の送達と比較して、１以上のインタクトな上皮組織層または内皮組織層への、
そしてその層を横切る結合体の送達を増加させるために十分なグアニジノ部分ま
たはアミジノ部分を有する。代表的に、送達増強輸送体は、６〜２５のグアニジ
ノ部分またはアミジノ部分を有し、そしてより好ましくは、７と１５の間のグア
ニジノ部分を有する。
【００１４】 本発明の送達増強輸送体および方法は、薬物、診断剤、および他の目的の化合
物を、皮膚および粘膜のような上皮組織を横切って送達するために有用である。
血液脳関門を横切る送達はまた、本発明の結合体および方法によって増強される
。本発明の方法および組成物は、化合物を特定の投与部位に送達するためのみで
なく、全身送達を提供するためにも使用され得る。
【００１５】 いくつかの実施形態において、送達増強輸送体は、７〜１５のアルギニン残基
またはアルギニンのアナログを含む。送達増強輸送体は、Ｄ−アルギニンである
少なくとも１つのアルギニンを有し得、そしていくつかの実施例において、全て
のアルギニンがＤ−アルギニンである。送達増強輸送体は、本質的に、５〜５０
のアミノ酸からなり得、その少なくとも５０％はアルギニンである。いくつかの
実施例において、アミノ酸の少なくとも７０％は、アルギニンまたはアルギニン
のアナログである。いくつかの実施例において、送達増強輸送体は、少なくとも
５つの連続したアルギニンまたはアルギニンのアナログを含む。
【００１６】 送達されるべき化合物は、リンカーによって送達増強輸送体に結合され得る。
いくつかの実施例において、リンカーは、放出可能なリンカーであり、化合物が
上皮組織および／または内皮組織の１以上の層の中へ通り、そしてその層を通過
した後に、生物学的に活性な形態で、送達増強輸送体から化合物を放出する。い
くつかの実施形態において、この化合物は、溶媒に媒介される切断によって、リ
ンカーから放出される。いくつかの実施形態において、結合体は、酸性ｐＨで実
質的に安定であるが、化合物は生理学的なｐＨで送達増強輸送体から実質的に放
出される。いくつかの実施形態において、この結合体の半減期は、皮膚あるいは
他の上皮組織または内皮組織と接触して、５分と２４時間との間である。例えば
、この半減期は、皮膚あるいは他の上皮組織または内皮組織と接触して、３０分
と２時間との間であり得る。
【００１７】 本発明の結合体の構造の例として、以下の３、４、または５のような構造を有
する結合体が挙げられる：
【００１８】
【化７】 ここで、Ｒ1−Ｘは、この化合物を含み；Ｘは、リンカーが結合される化合物に
おける官能基であり；Ｙは、ＮまたはＣであり；Ｒ2は、水素、アルキル、アリ
ール、アシル、またはアリルであり；Ｒ3は、送達増強輸送体を含み；Ｒ4は、置
換または無置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり；Ｒ5はＯＨ、ＳＨ、またはＮＨＲ6 であり；Ｒ6は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；ｋお
よびｍは、１および２から各々独立に選択され；そしてｎは１〜１０である。好
ましくは、Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ7Ｒ8からなる群から選択され、ここで
、Ｒ7およびＲ8は、Ｈおよびアルキルからなる群から各々独立に選択される。い
くつかの実施形態において、Ｒ4はＳであり；Ｒ5はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は
水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである。いくつかの実施形態にお
いて、Ｒ2はベンジルであり；ｋ、ｍ、およびｎは各々１であり、そしてＸはＯ
である。いくつかの実施形態において、結合体は構造３を含み、そしてＲ2は、
５分と２４時間の間の結合体半減期を得るように選択される。いくつかの実施形
態において、Ｒ2は、５分と２４時間の間の結合体半減期を得るために選択され
る。いくつかの実施形態において、結合体は構造４を含み；Ｒ4はＳであり；Ｒ5 はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルで
ある。いくつかの実施形態において、結合体は構造４を含み；Ｒ5はＮＨＲ6であ
り；Ｒ6は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そしてｋおよ
びｍは各々１である。結合体の1つの例は、以下：
【００１９】
【化８】 であり、ここで、ｐｈはフェニルである。
【００２０】 本発明はまた、生物学的薬剤からのリンカーの放出が第１律速分子内反応を含
み、その後より速い分子内反応が続き、その結果、リンカーの放出が起こる、結
合体を提供する。律速反応は、リンカーの置換基の適切な選択によって、生理学
的なｐＨより高い、または低いｐＨで安定であるために行われ得る。しかし、一
旦結合体が上皮組織または内皮組織の１以上の層の中へ入り、またはそれを横切
って通過してしまうと、リンカーは薬剤から切断される。この型のリンカーを有
する化合物の１つの例は、以下のような構造６である：
【００２１】
【化９】 ここで、Ｒ1−Ｘは、上皮組織および／または内皮組織の１以上の層を横切って
送達されるべき化合物を含み；Ｘは、リンカーが結合される化合物における官能
基であり；Ａｒは、結合される基がオルト配置またはパラ配置に配置されるアリ
ール基であり、このアリール基は置換され得るか、または無置換であり得；Ｒ3
は送達増強輸送体を含み；Ｒ4は置換または無置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり
；Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨＲ6であり；Ｒ6は水素、アルキル、アリール
、アシルまたはアリルであり；そしてｋおよびｍは、１および２から各々独立に
選択される。いくつかの実施形態において、Ｘは、Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＲ7Ｒ8か
らなる群から選択され、ここで、Ｒ7およびＲ8は、Ｈおよびアルキルからなる群
から各々独立に選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ4はＳであり；Ｒ5 はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニル
である。いくつかの実施形態において、結合体は、以下：
【００２２】
【化１０】 を含む。
【００２３】 好ましい実施形態において、本発明の組成物は、溶媒に媒介された切断に感受
性のリンカーを含む。例えば、好ましいリンカーは、酸性ｐＨで実質的に安定で
あるが、生理学的ｐＨで実質的に切断される。
【００２４】 本発明のさらなる実施形態は、経皮薬物処方物を提供する。これらの処方物は
、治療的に有効量の治療剤、送達増強輸送体（これは、非結合形態での生物学的
に活性な薬剤の経上皮組織送達と比較して、動物の上皮組織の1以上の層を横切
って結合体の送達を増加するために十分なグアニジノ側鎖部分またはアミジノ側
鎖部分を含む）；および経皮薬物投与に適合されたビヒクルを含む。
【００２５】 （詳細な説明） （定義） 「上皮組織」は、身体の表面、空間および腔の表面領域を覆う基本的な組織で
ある。上皮組織は、主に、お互いに結合し、細胞によって代表的に生成される細
胞外マトリックス（基底膜）にある上皮細胞で構成される。上皮組織は、細胞の
形状に基づく３つの一般的な型を含む：扁平上皮、立方上皮および円柱上皮。扁
平上皮（これは、肺および血管の輪郭となる）は、平らな細胞で作製される。立
方上皮は、腎臓細管の輪郭となり、立方形状の細胞で構成されるが、円柱上皮細
胞は、消化管の輪郭となり、円柱状の外見を有する。上皮組織はまた、その組織
における細胞層の数に基づいて分類され得る。例えば、単純な上皮組織は、細胞
の単一の層で構成され、これらの各々は基底膜上にある。「層状の」上皮組織は
、お互いに積み重なったいくつかの組織で構成され；すべての細胞が基底膜と接
触しているわけではない。「偽層状の」上皮組織は、すべて基底膜と接触するが
、層状に見える細胞を有する。なぜなら、核が種々のレベルにあるからである。
【００２６】 用語「経上皮」送達または投与は、局所投与による、身体表面または組織（例
えば、インタクトな皮膚または粘膜）の１以上の層を介した浸透による薬剤の送
達または投与をいう。従って、この用語は、経皮投与（例えば、経皮吸収（ａｄ
ｓｏｒｐｔｉｏｎ））および経粘膜投与の両方を含むことが意図される。送達は
、例えば、組織のより深い層までであり得、そして／または血流への送達であり
得る。
【００２７】 本明細書中で使用される場合、「送達増強」、「透過増強」または「浸透増強
」は、上皮組織または内皮組織の１以上の層へ、そして上皮組織または内皮組織
の１以上の層を横切って送達される化合物の送達の量および／または速度におけ
る増加に関する。送達の増強は、動物またはヒトの皮膚または他の組織の１以上
の層を通過する化合物の速度および／または量を測定することによって、観察さ
れ得る。送達増強はまた、化合物が送達される組織への深さにおける増加、およ
び／または上皮組織もしくは他の組織の１つ以上の細胞型への送達の程度におけ
る増加（例えば、皮膚または他の組織の線維芽細胞、免疫細胞、および内皮細胞
への増加した送達）を含み得る。このような測定は、例えば、米国特許第５，８
９１，４６２号に記載されるような拡散細胞装置を用いることによって、容易に
得られる。
【００２８】 皮膚または他の上皮膜もしくは内皮膜を横切る薬剤の送達および／または皮膚
または他の上皮膜もしくは内皮膜への薬剤の送達の量または速度は、しばしば、
皮膚または他の組織の所定の面積を通過する化合物の量という点で定量される。
この面積は、インタクトな連続した生きている皮膚組織または粘膜組織の規定さ
れた面積である。この面積は、一般的には、約５ｃｍ2〜約１００ｃｍ2の範囲、
より一般的には、約１０ｃｍ2〜約１００ｃｍ2の範囲、なおより一般的には、約
２０ｃｍ2〜約６０ｃｍ2の範囲である。
【００２９】 用語「グアニジル」、「グアニジニル」および「グアニジノ」は、式−ＨＮ＝
Ｃ（ＮＨ2）ＮＨ（非プロトン化形態）を有する部分をいうために、交換可能に
使用される。例として、アルギニンは、グアニジル（グアニジノ）部分を含み、
そして２−アミノ−５−グアニジノ吉草酸またはα−アミノ−δ−グアニジノ吉
草酸ともいう。「グアニジウム」とは、正に荷電した共役酸形態をいう。用語「
グアニジノ部分」は、例えば、グアニジン、グアニジニウム、グアニジン誘導体
（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＲ’））、一置換グアニジン、モノグアニド
、ビグアニド、ビグアニド誘導体（例えば、（ＲＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨＣ（ＮＨ）
ＮＨＲ’））などを含む。さらに、用語「グアニジノ部分」は、グアニジン単独
、または異なるグアニドの組み合わせのうちの任意の１つ以上を含む。
【００３０】 「アミジニル」および「アミジノ」とは、式−Ｃ（＝ＮＨ（ＮＨ2）を有する
部分をいう。「アミジニウム」とは、正に荷電した共役酸形態をいう。
【００３１】 用語「経障壁（ｔｒａｎｓ−ｂａｒｒｉｅｒ）濃度」または「経組織（ｔｒａ
ｎｓ−ｔｉｓｓｕｅ）濃度」とは、特定の組成物が加えられた組織の側面に対し
て反対または「トランス」にある、上皮障壁組織または内皮障壁組織の１つ以上
の層の側面に存在する化合物の濃度をいう。例えば、化合物が皮膚に適用される
場合、皮膚の１つ以上の層を横切って引き続いて測定される化合物の量は、その
化合物の経障壁濃度である。
【００３２】 「生物学的に活性な薬剤」または「生物学的に活性な物質」とは、低分子、高
分子、または金属イオンのような化学物質をいい、これらは、細胞による取り込
みの際に、その細胞の構造、機能または組成に観察可能な変化をもたらす。観察
可能な変化としては、１つ以上のｍＲＮＡの増加または減少した発現、１つ以上
のタンパク質の増加または減少した発現、タンパク質または他の細胞成分のリン
酸化、酵素の阻害または活性化、結合対のメンバー間の結合の阻害または活性化
、代謝産物の合成の増加または減少した速度、増加または減少した細胞増殖など
が挙げられる。
【００３３】 用語「治療剤」、「治療組成物」および「治療物質」とは、限定はないが、哺
乳動物種の利益のために使用され得る任意の組成物をいう。このような薬剤は、
例えば、イオン、有機低分子、ペプチド、タンパク質またはポリペプチド、オリ
ゴヌクレオチド、およびオリゴ糖の形態をとり得る。
【００３４】 本明細書中で使用される場合、用語「高分子」とは、大きい分子（１０００ダ
ルトンよりも大きい分子量）をいい、生物学的起源または合成的起源のペプチド
、タンパク質、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドにより例示されるが
、これらに限定されない。
【００３５】 「有機低分子」とは、１０００ダルトン以下の分子量（ＭＷ）を有する炭素含
有薬剤をいう。
【００３６】 用語「非ポリペプチド薬剤」および「非ポリペプチド治療薬剤」とは、送達増
強輸送体を含まず、かつポリペプチド以外の生物学的に活性な薬剤である結合体
の部分をいう。非ポリペプチド薬剤の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドで
あり、これは、ポリアルギニンペプチドと結合して、上皮組織もしくは内皮組織
の１つ以上の層への、または上皮組織もしくは内皮組織の１つ以上の層を横切っ
た増強された送達のための結合体を形成し得る。
【００３７】 本明細書中で使用される場合、「サブユニット」とは、結合してより大きなポ
リマー化合物を形成するモノマーユニットをいう。アミノ酸の組は、サブユニッ
トの例である。各アミノ酸は、共通の骨格（−Ｃ−Ｃ−Ｎ−）を共有し、そして
異なるアミノ酸はそれらの側鎖において異なる。この骨格は、ポリペプチドにお
いて繰り返される。サブユニットは、ポリマー骨格中の要素の最も短い繰り返し
パターンを表す。例えば、２つのアミノ酸のペプチドは、ペプチドとは考えられ
ない。なぜなら、２つのアミノ酸は、ポリマー骨格中の要素の最も短い繰り返し
パターンを有さないからである。
【００３８】 用語「ポリマー」とは、共有結合によって結合した２つ以上の同一または異な
るサブユニットの直鎖をいう。ペプチドは、ポリマーの例である；ペプチドは、
ペプチド連結（アミド結合）によって結合した同一または異なるアミノ酸サブユ
ニットで構成され得る。
【００３９】 本明細書中で使用される場合、用語「ペプチド」とは、ペプチド結合によって
結合した、Ｄ−アミノ酸もしくはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸とＬ−アミノ
酸との混合物の単鎖から作製される化合物をいう。一般的に、ペプチドは、少な
くとも２つのアミノ酸残基を含み、そして約５０アミノ酸未満の長さである。本
明細書中でＤ−アミノ酸は、小文字の１文字アミノ酸記号（例えば、Ｄ−アルギ
ニンに対しては、ｒ）で表され、一方、Ｌ−アミノ酸は、大文字の１文字アミノ
酸記号（例えば、Ｌ−アルギニンに対しては、Ｒ）で表される。ホモポリマーペ
プチドは、１文字アミノ酸記号、続いてそのペプチド中のそのアミノ酸の連続し
た出現の数によって表される（例えば、Ｒ７は、Ｌ−アルギニン残基で構成され
るヘプタマーを表す）。
【００４０】 本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」とは、ペプチド結合によっ
て連結した線形に配列されたアミノ酸で構成されるが、ペプチドとは対照的に、
明確な高次構造を有する化合物をいう。タンパク質は、ペプチドとは反対に、一
般的に５０以上のアミノ酸の鎖からなる。
【００４１】 本明細書中で使用される場合、「ポリペプチド」とは、少なくとも２つのアミ
ノ酸残基のポリマーをいい、これは１つ以上のペプチド結合を含む。「ポリペプ
チド」は、そのポリペプチドが明確な高次構造を揺するか否かに関わらず、ペプ
チドおよびタンパク質を含む。
【００４２】 （好ましい実施形態の説明） 本発明は、動物の上皮組織または内皮組織の１つ以上の層へ、および動物の上
皮組織または内皮組織の１つ以上の層を横切る、化合物（薬物および他の生物学
的に活性な化合物を含む）の輸送を増強させる組成物および方法を提供する。こ
の方法は、組織を、送達増強輸送体に連結した目的の化合物を含む結合体と接触
させる工程を包含する。本発明によって提供される送達増強輸送体は、１以上の
インタクトな上皮組織層および内皮組織層へ、および１以上のインタクトな上皮
組織層および内皮組織層を横切る、この結合体の送達を増加させるために十分な
グアニジノ部分またはアミジノ部分を含む分子である。この方法および組成物は
、薬物および他の生物学的に活性な分子の経上皮送達および経内皮送達のため、
ならびにまた、画像分子および診断分子の送達のために有用である。本発明の方
法および組成物は、それらの生物学的効果を示すために、経上皮輸送または経内
皮輸送を必要とし、かつ（送達増強輸送体との結合も、いくつかの他の改変もな
しで）それら自体では、このような組織を横切り、従って生物学的活性を示すこ
とができないか、またはほとんどできない化合物の送達のために、特に有用であ
る。
【００４３】 本発明の送達増強輸送体および方法は、目的の化合物の経上皮組織送達および
経内皮組織送達を得るために以前に利用可能な方法に対して、有意な利点を提供
する。この輸送体は、以前はその薬物を浸透させなかった組織を横切る、薬物お
よび他の薬剤の送達を可能にする。例えば、皮膚を横切る薬物の送達は、２、３
の化合物を除いて以前はほとんど不可能であったが、本発明の方法は、皮膚のよ
うな上皮組織の第１層の細胞へのみでなく、皮膚の１以上の層をも横切って化合
物を送達し得る。血液脳関門はまた、薬物ならびに他の診断試薬および治療試薬
の輸送に対して抵抗性があり；本発明の方法および輸送体は、このような輸送を
得るための手段を提供する。
【００４４】 送達増強輸送体は、この送達増強輸送体の非存在下での化合物の送達と比較し
て、１以上のインタクトな上皮組織層または内皮組織層へ、および１以上のイン
タクトな上皮組織層または内皮組織層を横切る、結合体の送達を増加させる。い
くつかの実施形態においては、この送達増強輸送体は、ＨＩＶ−１のｔａｔタン
パク質を用いて得られる送達増強輸送体（Ｆｒａｎｋｅｌら（１９９１）ＰＣＴ
公開ＷＯ９１／０９９５８）よりも、結合体の送達を有意に増加させる。送達は
また、ｔａｔ基本領域（配列ＲＫＫＲＲＱＲＲＲを有する残基４９〜５７）を含
むｔａｔタンパク質のより短いフラグメント（Ｂａｒｓｏｕｍら（１９９４）Ｗ
Ｏ９４／０４６８６およびＦａｗｅｌｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６６４−６６８）の使用よりも、有意に増加
される。好ましくは、本発明の輸送体を用いて得られる送達は、ｔａｔ残基４９
〜５７を用いて得られる送達よりも、２倍よりも多く増加され、なおより好まし
くは、６倍よりも多く、なおより好ましくは、１０倍よりも多く、そしてなおよ
り好ましくは２０倍よりも多く増加される。
【００４５】 同様に、本発明の送達増強輸送体は、培養されたニューロンによって容易にイ
ンターナライズされるＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメイン由来の１６アミ
ノ酸のペプチド−コレステロール結合体（Ｂｒｕｇｉｄｏｕら（１９９５）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２１４：６８５−９３）
と比較して、増加した送達を提供し得る。この領域（最小で残基４３〜５８）は
、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫを有する。Ｈｅｒｐｅｓ ｓ
ｉｍｐｌｅｘタンパク質ＶＰ２２は、ｔａｔおよびＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａド
メインと同様に、細胞への輸送を増強させることが以前に知られていたが、上皮
膜および内皮膜へ、ならびに上皮膜および内皮膜を横切る輸送を増強させること
は知られていなかった（ＥｌｌｉｏｔおよびＯ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ
８８：２２３−３３；Ｄｉｌｂｅｒら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：
１２−２１；Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
．１６：４４０−３）。現在好ましい実施形態においては、この送達増強輸送体
は、ＡｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａホメオドメインおよびＶＰ２２タンパク質と比較
して、有意に増加した送達を提供する。
【００４６】 （送達増強輸送体の構造） 本発明の送達増強輸送体は、上皮組織（例えば、皮膚または粘膜）または内皮
組織（例えば、血液脳関門）の１つ以上の層へ、およびこれらの１つ以上の層を
横切る、この送達増強輸送体が結合した化合物の送達を、増加させるために十分
なグアニジノおよび／またはアミジノ部分を有する分子である。この送達増強輸
送体は、一般的に、グアニジノおよび／またはアミジノ側鎖部分が結合した骨格
構造を含む。いくつかの実施形態においては、この骨格は、サブユニットのうち
の少なくともいくつかがグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、サブユニッ
ト（例えば、繰り返しモノマーユニット）からなるポリマーである。
【００４７】 （Ａ．グアニジノおよび／またはアミジノ部分） この送達増強輸送体は、代表的に、少なくとも５グアニジノおよび／またはア
ミジノ部分、より好ましくは７以上のこのような部分を示す。好ましくは、この
送達増強輸送体は、２５以下のグアニジノおよび／またはアミジノ部分を有し、
しばしば１５以下のこのような部分を有する。いくつかの実施形態においては、
この送達増強輸送体は、本質的に５０以下のサブユニットからなり、そして本質
的に２５以下、２０以下、または１５以下のサブユニットからなり得る。この送
達増強輸送体は、５サブユニット程度に短くあり得、この場合において、すべて
のサブユニットは、グアニジノまたはアミジノ側鎖部分を含む。この送達増強輸
送体は、例えば、少なくとも６のサブユニットを有し得、いくつかの実施形態に
おいては、少なくとも７または１０のサブユニットを有し得る。一般的にこのサ
ブユニットの少なくとも５０％は、グアニジノまたはアミジノ側鎖部分を含む。
より好ましくは、この送達増強輸送体におけるこのサブユニットの少なくとも７
０％、しばしばこのサブユニットの少なくとも９０％は、グアニジノまたはアミ
ジノ側鎖部分を含む。
【００４８】 送達増強輸送体中のグアニジノおよび／またはアミジノ部分のいくつかまたは
すべては、隣接し得る。例えば、この送達増強輸送体は、６〜２５の連続したグ
アニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットを含み得る。７以上の連続し
たグアニジノおよび／またはアミジノ含有サブユニットが、いくつかの実施形態
において存在する。いくつかの実施形態においては、少なくとも６個の連続した
アルギニン残基を含むポリマーによって例示されるように、グアニジノ部分を含
む各サブユニットは連続している。
【００４９】 送達増強輸送体は、ペプチドによって例示される。アルギニン残基またはアル
ギニンのアナログは、グアニジノ部分を有するサブユニットを構築し得る。この
ようなアルギニン含有ペプチドは、全てＤ体のアミノ酸、全てＬ体のアミノ酸、
または混合したＤ体アミノ酸およびＬ体アミノ酸のいずれかから構成され得、そ
してさらなるアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはアルギニン残基間の他の分子
を含み得る。必要に応じて、この送達増強輸送体はまた、非アルギニン残基を含
み得、送達されるべき化合物は、直接またはリンカーを介してのいずれかで結合
される。送達増強輸送体中の少なくとも１つのＤアルギニンの使用は、その生物
学的標的への結合体の輸送の間、この輸送体の生物学的な安定性を増強し得る。
いくつかの場合において、この送達増強輸送体は、少なくとも約５０％のＤアル
ギニン残基であり、そしてさらにより安定な輸送体（ここで、このサブユニット
の全てがＤアルギニン残基である）が使用される。送達増強輸送体分子がペプチ
ドである場合、この輸送体は、アミノ酸配列に結合せず、この送達増強輸送体分
子は構成するアミノ酸は天然に存在するタンパク質に結合される。
【００５０】 好ましくは、この送達増強輸送体は、直鎖である。好ましい実施形態において
、上皮組織の１以上の層中におよびその層を通過して送達されるべき薬剤は、送
達増強輸送体の末端に結合される。いくつかの実施形態において、この薬剤は、
単一の輸送ポリマーに結合され、結合体を形成する。他の実施形態において、こ
の結合体は、１つの薬剤に連結した１以上の送達増強輸送体、または単一の送達
増強輸送体に連結された複数の薬剤を含み得る。
【００５１】 より一般的に、各サブユニットは、高度に塩基性の側鎖部分を含むことが好ま
しく、高度に塩基性の側鎖部分は、（ｉ）１１より大きい、より好ましくは、１
２．５以上のｐＫａを有し、そして（ｉｉ）プロトン化状態において、共役安定
化正電荷を共有する、少なくとも２個のジェミナルアミノ基（ＮＨ2）を含み、
この部分に二座特性を提供する。
【００５２】 グアニジノまたはアミジノ部位は、側鎖リンカーによって骨格に連結されるこ
とによって骨格から離れて伸びる。この側鎖原子は、好ましくは、メチレン炭素
原子として提供されるが、１以上の他の原子（例えば、酸素、硫黄または窒素）
がまた、提供され得る。例えば、グアニジノ部分を骨格に結合するリンカーは、
以下に示され得る：
【００５３】
【化１１】 これらの式において、ｎは、好ましくは、少なくとも２であり、そして好ましく
は、２と７との間である。いくつかの実施形態において、ｎは３（構造１のアル
ギニン）である。他の実施形態において、ｎは、４と６との間であり、最も好ま
しくは、ｎは、５または６である。例示された式中の側鎖は、ペプチド骨格（す
なわち、側鎖が、カルボニル基に対してα位にある炭素原子に結合される繰返し
アミド（サブユニット１））およびペプトイド骨格（すなわち、側鎖が、カルボ
ニルに対してβ位にある窒素原子に結合される繰返しアミド（サブユニット２）
）に結合されるように示されるが、他の非ペプチド骨格がまた、本明細書中でよ
り詳細に記載されるように適切である。従って、同様の側鎖リンカーが、非ペプ
チド骨格（例えば、ペプトイド骨格）に結合され得る。
【００５４】 いくつかの実施形態において、送達増強輸送体は、連結されたサブユニットか
ら構成され、これらの少なくともいくつかは、グアニジノおよび／またはアミジ
ノ部分を含む。グアニジノおよび／またはアミジノ部分を有する適切なサブユニ
ットの例が、以下に記載される。
【００５５】 （アミノ酸） いくつかの実施形態において、この送達増強輸送体は、Ｄ体ま
たはＬ体のアミノ酸残基から構成される。このアミノ酸は、天然に存在するアミ
ノ酸または天然に存在しないアミノ酸であり得る。アルギニン（α−アミノ−δ
−グアニジノ吉草酸）およびα−アミノ−ε−アミジノ−ヘキサン酸（等配電子
のアミノアナログ）は、適切なグアニジノおよびアミノ含有アミノ酸サブユニッ
トの例である。グアニジン中のグアニジニウム基は、約１２．５のｐＫａを有す
る。いくつかの好ましい実施形態において、この輸送体は、少なくとも６個の連
続するアルギニン残基から構成される。
【００５６】 別のアミノ酸（例えば、α−アミノ−β−グアニジノ−プロピオン酸、α−ア
ミノ−γ−グアニジノ−酪酸、またはα−アミノ−ε−グアニジノ−カプロン酸
（それぞれ、２，３，または５個の側鎖リンカー原子を、骨格鎖とグアニジニウ
ムの中心炭素との間に含む））がまた使用され得る。
【００５７】 Ｄ体のアミノ酸はまた、送達増強輸送体に使用され得る。排他的にＤ体のアミ
ノ酸を含有する組成物は、酵素学的分解が減少するという利点を有する。しかし
、Ｄ体のアミノ酸はまた、標的細胞中で大部分、インタクトなままであり得る。
このポリマーがさらに結合される場合、この薬剤が生物学的に活性であるとして
も、このような安定性は、一般に問題がない。結合形態において不活性である薬
剤に対して、作用部位において切断（例えば、細胞内での酵素または溶媒媒介切
断）されるリンカーは、細胞または小器官中でこの薬剤の放出を促進するために
結合体内に含まれるべきである。
【００５８】 （他のサブユニット） アミノ酸以外のサブユニットがまた、輸送体ポリマー
を形成する際の使用に選択され得る。このようなサブユニットには、ヒドロキシ
アミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ酸、アミノアルデヒドなどが挙げられるが、これ
らに限定されない。このサブユニットにより、結果として、ポリマー中に減少し
たペプチド結合が得られる。次の節で議論されるように、選択された骨格の性質
に依存して、他のサブユニット型が使用され得る。
【００５９】 （Ｂ．骨格） 送達増強輸送体中に含まれるグアニジノおよび／またはアミジノ部分は、一般
に、リンカー骨格に結合される。この骨格は、炭素、窒素、酸素、硫黄およびリ
ンを含む種々の原子型を含み得、この骨格鎖原子の大部分は、代表的に炭素から
なる。末端グアニジノまたはアミジノ基を含む複数の側鎖部分は、骨格に結合さ
れる。隣接する側鎖部分間の間隔は、代表的に一定であるが、本発明において使
用される送達増強輸送体は、この骨格に沿って側鎖部分間の種々の間隔を含み得
る。
【００６０】 より詳細な骨格のリストとしては、Ｎ置換アミド（ＣＯＮＨ結合から置換され
るＣＯＮＲ）、エステル（ＣＯ2）、還元されたケト−メチレン（ＣＯＣＨ2）ま
たはメチレンアミノ（ＣＨ2ＮＨ）、チオアミド（ＣＳＮＨ）、ホスフィン酸（
ＰＯ2ＲＣＨ2）、ホスホンアミデートおよびホスホンアミデートエステル（ＰＯ 2 ＲＮＨ）、レトロペプチド（ＮＨＣＯ）、トランス−アルケン（ＣＲ＝ＣＨ）
、フルオロアルケン（ＣＦ＝ＣＨ）、ジメチレン（ＣＨ2ＣＨ2）、チオエーテル
（ＣＨ2Ｓ）、ヒドロキシエチレン（ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ2）、メチレンオキシ（Ｃ
Ｈ2Ｏ）、テトラゾール（ＣＮ4）、レトロチオアミド（ＮＨＣＳ）、レトロ還元
された（ＮＨＣＨ2）、スルホンアミド（ＳＯ2ＮＨ）、メチレンスルホンアミド
（ＣＨＲＳＯ2ＮＨ）、レトロスルホンアミド（ＮＨＳＯ2）、およびペプトイド
（Ｎ置換アミド）、ならびにマロン酸および／またはｇｅｍ−ジアミノ−アルキ
ルサブユニットを有する骨格（例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら（１９９８）Ｃｈｅ
ｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３）により概説され、そして本明細書中で引用された参
考文献により詳述される）が挙げられる。多くの上記の置換基により、結果とし
て、α−アミノ酸から形成された骨格に対して、ほぼ等配電子のポリマー骨格が
得られた。
【００６１】 上記のように、ペプトイド骨格中において、この側鎖は、炭素原子ではなく骨
格窒素原子に結合される（例えば、Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９３）Ａｎｇｅｗ．Ｃ
ｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３２：５４３；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎら（１９
９２）Ｃｈｅｍｔｒａｃｔｓ−Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．４：８０；および
Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８９：９３６７を参照のこと）。適切なペプトイド骨格の例は、ポリ−（Ｎ−置
換）グリシン（ｐｏｌｙ−ＮＳＧ）である。ペプトイドの合成は、例えば、米国
特許第５，８７７，２７８号に記載される。この用語が本明細書中で使用れる場
合、ペプトイド骨格を有する輸送体は、「非ペプチド」輸送体と考えられる。な
ぜならば、この輸送体は、天然に存在する側鎖位置を有するアミノ酸から構成さ
れないからである。非ペプトイド骨格（ペプトイド骨格を含む）は、増強した生
物学的安定性（例えば、インビボでの酵素学的分解に対する耐性）を提供する。
【００６２】 （Ｃ．送達増強輸送体の合成） 送達増強輸送体は、当該分野で公知の任意の方法によって構築される。例示的
なペプチドポリマーは、好ましくは、ペプチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４３３）を使用して、合成的に生成され
得るか、または当該分野で周知の方法により組換え合成され得る。組換え合成は
、一般に、送達増強輸送体が目的のポリペプチドまたはタンパク質に融合される
ペプチドである場合に使用される。
【００６３】 Ｎ−メチルおよびヒドロキシ−アミノ酸は、固相ペプチド合成における従来の
アミノ酸と置き換えられ得る。しかし、減少したペプチド結合を有する送達増強
輸送体の生成は、減少したペプチド結合を含むアミノ酸のダイマーの合成を必要
とする。このようなダイマーは、標準的な固相合成手順を使用してポリマー中に
取り込まれる。他の合成手順は周知であり、そして例えば、Ｆｌｅｔｃｈｅｒら
（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８：７６３，Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７、および本明細
書中で引用された参考文献に見出され得る。
【００６４】 本発明の送達増強輸送体は、１以上の非グアニジノ／非アミジノサブユニット
（例えば、グリシン、アラニン、およびシステイン）、またはリンカー（例えば
、アミノカプロン酸基）によって隣接され得る。これは、結合体を含む対応する
送達増強輸送体のトランス組織層の輸送速度に有意に影響を与えない。また、任
意の遊離アミノ末端基は、保護基（例えば、アセチル基またはベンジル基）でキ
ャップされ、インビボでのユビキチン結合を防止し得る。
【００６５】 この輸送体は、ペプトイドポリマーであり、１合成方法は、以下の工程を包含
する：１）ペプトイドポリアミンを塩基およびピラゾール−１−カルボキサミジ
ンで処理し、混合物を提供する工程；２）この混合物を加熱し、次いで冷却させ
る工程；３）この冷却した混合物を酸性化する工程；および４）この酸性化した
混合物を精製する工程。好ましくは、工程１において使用される塩基は、炭酸塩
（例えば、炭酸ナトリウム）であり、そして加熱工程２は、約２４時間と約４８
時間との間で約５０℃まで混合物を加熱する工程を包含する。この精製工程は、
好ましくは、クロマトグラフィー（例えば、逆相ＨＰＬＣ）を含む。
【００６６】 （Ｄ．輸送体ポリマーの生物学的活性剤への結合） 輸送される薬剤は、複数の実施形態に従って送達増強輸送体に連結され得る。
１実施形態において、この薬剤は、送達増強輸送体の末端への結合を介して単一
送達増強輸送体へまたは適切な結合基を介して試薬内の内部サブユニットへのい
ずれかで、連結される。
【００６７】 第２の実施形態において、この薬剤は、上記と同じ方法で１以上の送達増強輸
送体に結合される。この実施形態は、この薬剤は隣接細胞との架橋に導き得るの
で、いくらか弱いのが好ましい。
【００６８】 第３の実施形態において、この結合体は、送達増強輸送体の各末端に結合され
た２つの薬剤部分を含む。この実施形態において、この薬剤が１０ｋＤａ未満の
分子量を有することが、現在好ましい。
【００６９】 まさに記載された第１および第３の実施形態に関して、この薬剤は、グアニジ
ノまたはアミジノ側鎖のいずれの１つにも一般に結合されない。その結果、この
側鎖は、標的の膜と自由に相互作用する。
【００７０】 本発明の結合体は、率直に、合成スキームによって合成され得る。さらに結合
体生成物は、長さおよび組成において通常実質的に同質である。その結果、この
生成物は、異質な混合物よりも、それらの効果においてより大きな一貫性および
再現性を提供する。
【００７１】 本発明の重要な局面に従って、単一の送達増強輸送体の、任意の種々の型の生
物学的活性剤への結合は、結合体中に大きな疎水性部分の存在を必要としなくて
も、上皮組織および内皮組織の１以上の層へおよびその層を横切る試薬の取り込
み速度を実質的に増強するのに十分であることが、出願人によって見出された。
実際に、大きな疎水性部分の結合は、上皮組織または内皮組織を形成する組織の
脂質二重層への疎水性部分の接着に起因して、横断層の輸送を有意に防止または
予防し得る。従って、本発明は、実質的に疎水性部分（例えば、脂質分子および
脂肪酸分子）を含有しない結合体を含む。
【００７２】 本発明の送達増強輸送体は、化学的方法または組換え方法によって生物学的に
活性な薬剤に対して共有結合され得る。
【００７３】 （１．化学結合） 生物学的に活性な薬剤（例えば、小さな有機分子および高分子）は、当該分野
で公知の複数の方法（例えば、Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｓ．編、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏ
ｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋ
ｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９
１）を参照のこと）を介して、直接的（例えば、カルボジイミド）または連結部
分を介してのいずれかで、本発明の送達増強輸送体に連結され得る。特に、カル
バメート、エステル、チオエステル、ジスルフィド、およびヒドラゾンの連結は
、一般に形成し易く、そしてほとんどの適用に対して適切である。エステルおよ
びジスルフィド結合は、この結合が、細胞膜を横切る物質の輸送後に、サイトゾ
ル中で容易に分解される場合に、好ましい。
【００７４】 種々の官能基（ヒドロキシル、アミノ、ハロゲンなど）は、生物学的活性剤を
輸送ポリマーに結合するために使用され得る。特に、ポリペプチドまたはその任
意の部分は、送達後にこの物質に結合されたままである場合、生物学的活性剤の
活性部位の部分であると公知でない基が、好ましい。
【００７５】 ポリマー（例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公開番号ＷＯ９８５２
６１４）に記載されるように生成されたペプチド）は、アミノ末端保護基（例え
ば、ＦＭＯＣ）を用いて一般に生成される。合成樹脂からポリペプチドを切断し
、側鎖を脱保護するために使用される状態に耐え得る生物学的な活性剤に対して
、このＦＭＯＣは、完全な樹脂結合ポリペプチドのＮ末端から切断され得、その
結果、この薬剤は、遊離のＮ末端アミンに結合され得る。このような場合、結合
される薬剤は、代表的に、当該分野で周知の方法で活性化され、ポリマーアミノ
基を有する、それぞれアミド結合またはカルバメート結合を形成するのに効果的
な活性エステルまたは活性炭酸部分を生成する。当然、他の化学結合もまた、使
用され得る。
【００７６】 副反応の最小化を助けるために、グアニジノおよびアミノ部分は、従来の保護
基（例えば、カルボベンジルオキシ基（ＣＢＺ）、ジ−ｔ−ＢＯＣ、ＰＭＣ、Ｐ
ｂｆ、Ｎ−ＮＯ2など）を使用して保護され得る。
【００７７】 カップリング反応は、溶媒（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ
）、Ｎ−メチルピロリジノン、ジクロロメタン、水など）の任意のアレイ中で公
知のカップリング方法によって実施される。例示的なカップリング試薬としては
、例えば、Ｏ−ベンゾトリアゾリルオキシテトラメチルウロニウムヘキサフルオ
ロホスフェート（ＨＡＴＵ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ブロモ−トリ
ス（ピロリジノ）ホスホニウムブロミド（ＰｙＢｒｏＰ）などが挙げられる。他
の試薬としては、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、４−
ピロリジノピリジン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシベンゾト
リアゾールなどが挙げられ得る。
【００７８】 （２．融合ポリペプチド） 本発明の送達増強輸送体は、当該分野で周知の方法に従って、目的のポリペプ
チドおよび送達増強輸送体を含む融合タンパク質のためのベクターを構築するこ
とによる組換え方法によって、生物学的活性ポリペプチド剤に結合され得る。一
般に、この送達増強輸送体の成分は、必要に応じて短いペプチドリンカーを介し
て、目的のポリペプチドのＣ末端またはＮ末端で結合される。
【００７９】 （３．放出可能なリンカー） 現在の好ましい実施形態において、この生物学的活性剤は、特異的に切断可能
かまたは放出可能である結合を使用して、送達増強輸送体に結合される。このよ
うな結合の使用は、結合された送達増強輸送体が放出されるまで不活性である生
物学的活性剤に対して特に重要である。いくつかの場合において、送達増強輸送
体に結合している薬物分子からなるこのような結合体は、プロドラックと呼ばれ
得、ここで、この薬物からの送達増強輸送体の放出の結果、不活性形態から活性
形態へのこの薬物の変換を生じる。本明細書において使用される場合、結合体ま
たはリンカーの「切断された」または「切断」とは、輸送体分子からの生物学的
試薬の放出、これによる活性な生物学的薬剤の放出を言う。「特異的に切断可能
な」または「特異的に放出可能な」とは、輸送体が分解される（例えば、タンパ
ク分解性の分解）のではなく、輸送体と切断される薬剤との間の結合を言う。
【００８０】 いくつかの実施形態において、この結合は、容易に切断可能な結合であり、こ
れは、インビボで見出される条件下での切断に対して感受性であることを意味す
る。従って、上皮組織および／または内皮組織の１以上の層へおよびその層を通
って通過する際に、この薬剤は、送達増強輸送体から放出される。容易に切断可
能な結合は、例えば、特異的な活性を有する酵素（例えば、エステラーゼ、プロ
テアーゼ、ホスファターゼ、ペプチダーゼなど）または加水分解によって切断さ
れる結合であり得る。この目的のために、カルボン酸エステルおよびジスルフィ
ド結合を含むリンカーが、しばしば、好ましく、このカルボン酸エステル基は、
酵素学的または化学的に加水分解され、そしてジスルフィド結合は、ジスルフィ
ド交換（例えば、グルタチオンの存在下）によってなされる。この結合が上皮組
織または内皮組織の１以上の層に存在することで公知である酵素活性によって切
断可能であるであるように選択され得る。例えば、皮膚の顆粒層は、比較的高濃
度のＮ−ペプチダーゼ活性を有する。
【００８１】 特異的に切断可能なリンカーは、輸送体分子上に設計され得る。例えば、プロ
ステアーゼ認識部位、または他のこのような特異的に認識される酵素切断部位を
構成するアミノ酸は、輸送体をこの薬剤に結合するために使用され得る。あるい
は、例えば、光または他の刺激に曝すことにより切断可能であるリンカーの化学
的型または他の型を使用して、目的の薬剤に輸送体を結合し得る。
【００８２】 送達されるべき薬剤および送達増強輸送体が、特異的に切断可能なリンカーま
たは特異的に放出可能なリンカーによって結合されている結合体は、半減期を有
する。この文脈中で用語「半減期」は、結合体を上皮膜または内皮膜に適用後に
、結合体の半分の量が分離され、遊離薬剤を放出するのに必要とされる時間の量
を言う。いくつかの実施形態についての半減期は、代表的に５分と２４時間との
間であり、そしてより好ましくは、３０分と２時間との間である。結合体の半減
期は、以下に記載されるように本発明に従って、「調整」または改変され得る。
【００８３】 いくつかの実施形態において、このリンカーの切断速度は、ｐＨに依存する。
例えば、リンカーは、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満、より好ましくは、約
６未満、そしてなおより好ましくは、約５．５未満）において薬剤と送達増強輸
送体との間で安定な結合を形成し得る。しかし、この結合体が、生理学的ｐＨ（
例えば、ｐＨ７以上、好ましくは、約ｐＨ７．４）に置かれる場合、このリンカ
ーは、薬剤を放出するために切断を受ける。このようなｐＨの感度は、例えば、
プロトン化（すなわち、酸性ｐＨにおいて）される場合、求核試薬として作用し
ない官能基を含むことによって得られ得る。より高い（例えば、生理学的）ｐＨ
において、官能基はもはやプロトン化されず、従って、求核試薬として作用する
。適切な官能基の例は、例えば、ＮおよびＳを含む。自己切断が起こるｐＨを上
手に調整するためにこのような官能基を使用し得る。
【００８４】 切断可能なリンカーは、自己犠牲的であり得る。このようなリンカーは、この
薬剤から遠位の求核試薬（例えば、酸素、窒素または硫黄）およびこの試薬から
近位の切断可能基（例えば、エステル、カルボネート、カルバメート、チオカル
バメート）を含む。直接的または間接的のいずれかでの切断可能基上における求
核試薬の分子内攻撃により、薬剤を放出する。一般に、求核試薬は、切断基から
５〜６原子だけ遠位にあり、これにより、犠牲生成物として５〜６員環を形成す
る。
【００８５】 このようなリンカーとしては、以下のような構造３、４または５を有するリン
カーが挙げられる：
【００８６】
【化１２】 ここで： Ｒ1−Ｘは、送達されるべき薬剤を含み； Ｘは、薬剤上の官能基であり、この官能基に対してリンカーが結合され； Ｙは、ＮまたはＣであり； Ｒ2は、水素、アルキル、アリール、アシル、またはアリルであり； Ｒ3は、送達増強輸送体であり； Ｒ4は、置換されるか、または置換されていないＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨＲ6であり； Ｒ6は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり； ｋおよびｍは、１および２から各々独立して選択され；そして ｎは、１〜１０である。
【００８７】 送達される因子（例えば、薬物または診断剤）は、一般に、官能基（上記の式
でＸと表示される）を含み、これによってリンカーが送達増強輸送体に結合され
る。Ｘについての適切な官能基の例として、例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ7
Ｒ8が挙げられ、ここで、Ｒ7およびＲ8は、各々独立して、Ｈおよびアルキルか
らなる群から選択される。例えば、ＸがＯである場合、送達増強輸送体およびリ
ンカーからの因子の放出は遊離アルコール形態の因子を生成し；ＸがＮである場
合、遊離アミンが生じる。同様に、ＸがＳである場合、リンカーの放出はチオー
ル形態の因子を生成する。
【００８８】 構造３を有するリンカーの場合、Ｒ2置換基の選択によって、リンカーを含む
結合体の半寿命を調節することができる。増大または減少したサイズのＲ2を使
用することによって、それぞれ、より長いまたはより短い半寿命を有する結合体
を得ることができる。Ｒ2は、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、ブチル
、アリル、ベンジルまたはフェニルである。半寿命の同様の調節は、他のリンカ
ー（例えば、構造４のＲ5）と類似の様式で達成され得る。
【００８９】 構造３はまた、どのようにリンカー構造が結合体のｐＨ感受性に影響を及ぼし
得るかについての例を提供する。骨格アミノ基は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．
５）でプロトン化され、従って、アミンが強力な求核剤として機能しないという
点で安定である。しかし、ｐＨを生理学的ｐＨ（例えば、７．４）上昇させる際
に、アミンは、全くプロトン化されず、従って、求核剤として作用し得る。次い
で、目的の因子に隣接したカルボニルに対するアミンによる得られる求核攻撃は
、リンカーおよび送達増強輸送体からの因子の放出を生じる。再び、この原理は
また、他のリンカー構造に適用する。構造３の好ましいリンカーの例において、
Ｒ2はベンジルであり；ｋ、ｍ、およびｎは、各々１であり、そしてＸはＯであ
る。
【００９０】 構造４の適切なリンカーの例は、ＮＨＲ6のようなＲ5を有し；Ｒ6は、水素、
メチル、アリル、ブチルまたはフェニルから選択され；そしてｋおよびｍは、各
々１である。
【００９１】 自己犠牲リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒ）の別の
例は、上記のように構造５によって表される。この構造のリンカーを含む現在好
ましい結合体において、Ｒ4はＳであり、そしてＲ5はＮＨＲ6であり、ここで、
Ｒ6は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであり；そしてｋは２で
ある。
【００９２】 例えば、現在好ましい結合体は、以下の構造を含み：
【００９３】
【化１３】 ここで、Ｐｈはフェニルである。
【００９４】 本発明はまた、切断が二段階で生じるリンカーを提供する。切断の第１段階は
、律速であり、そしてまた、ｐＨ感受性および半寿命について微調整され得る。
一旦、この初期の再配列が起こると、分子内反応の第２段階が比較的迅速に起こ
る。この型のリンカーを有する結合体の例は、構造６と表される。
【００９５】
【化１４】 ここで： Ｒ1−Ｘは、送達される因子であり； Ｘは、因子の官能基であり、この官能基にリンカーが結合され； Ａｒは、オルト配置またはパラ配置で整列した結合基を有するアリール基であ
り、このアリール基は置換または非置換であり得； Ｒ3は、送達増強輸送体であり； Ｒ4は、置換または非置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ6であり； Ｒ6は、水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり、そして ｋおよびｍは、各々独立して、１および２から選択される。
【００９６】 構造６の好ましい結合体の例として、Ｒ4がＳであり、Ｒ5がＮＨＲ6であり、
そしてＲ6が水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルである結合体が挙げ
られる。例えば、構造６の適切な結合体は、以下：
【００９７】
【化１５】 である。
【００９８】 自己犠牲リンカーは、代表的には、およそ７．４のｐＨの水中で、約１０分と
約２４時間との間の半寿命で分子内切断を起こす。好ましくは、切断半寿命は、
およそ７．４のｐＨの水中で、約２０分と約４時間との間である。より好ましく
は、切断半寿命は、および７．４のｐＨの水中で、約３０分と約２時間との間で
ある。
【００９９】 別の好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは、因子に対して遠位で
ある第１の切断可能な基、および因子に対して近位である第２の切断可能な基を
含み、その結果、第１の切断可能な基の切断は、第２の切断可能な基を切断する
ために分子内で反応し得る求核性部分を含むリンカー−因子結合体を生じ、それ
によって、リンカーおよびポリマーから因子を放出する。この実施形態は、以下
およびＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公報番号ＷＯ９８５２６１４）に議論
される種々の小分子結合体によって例示される。
【０１００】 １アプローチにおいて、結合体は、図５Ａに例示されるようなジスルフィド結
合を含み得（また、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１（公報番号ＷＯ９８５２６
１４）を参照のこと）、これは、リンカーとして作用するＮ−アセチル−保護シ
ステイン基によって細胞傷害因子、すなわち６−メルカプトプリンに結合される
輸送ポリマーＴを含む結合体（Ｉ）を示す。従って、細胞傷害因子は、６−メル
カプト基にジスルフィド結合によって結合され、そしてこの輸送ポリマーは、ア
ミド結合を介してシステインカルボニル部分に結合される。還元またはジスルフ
ィド交換によるジスルフィド結合の切断は、遊離の細胞傷害因子の放出を生じる
。
【０１０１】 ジスルフィド含有結合体を合成するための方法は、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０
５７１の実施例９Ａに提供される。この生成物は、Ｎ−アセチル−Ｃｙｓ−Ａｌ
ａ−Ａｌａリンカーによって６−メルカプトプリンに結合されるＡｒｇ残基の七
量体を含み、ここで、このＡｌａ残基は、チオールにアクセスしやすいジスルフ
ィドを付与するための追加のスペーサ−および細胞内切断のための還元剤として
含まれる。この例におけるリンカーはまた、アミド結合の使用を例示し、これは
、細胞内で酵素的に切断され得る。
【０１０２】 別のアプローチにおいて、結合体は、電磁放射に対する曝露の際に切断される
光切断可能なリンカーを含む。例示的な連結は、図５Ｂに例示され、これは、メ
タ−ニトロベンゾエート連結部分を介して６−メルカプトプリンに連結される輸
送ポリマーＴを含む結合体（ＩＩ）を示す。ポリマーＴは、ベンゾエートカルボ
ニル基に対するアミド結合によってニトロベンゾエート部分に連結され、そして
細胞傷害因子は、その６−メルカプト基を介してｐ−メチレン基に結合される。
この化合物は、ＮａＯＣＨ3／メタノールの存在下、加熱下で、６−メルカプト
プリンをｐ−ブロモメチル−ｍ−ニトロ安息香酸と反応させ、続いて、安息香酸
カルボン酸をトランスポートポリマーにカップリングすることによって（ポリマ
ーに結合したγ−アミノ酪酸リンカーのアミノ基のように）形成され得る（例え
ば、ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｂを参照のこと）。結合体の光
照射は、メルカプトメチル部分に対してオルト位のニトロ基によって６−メルカ
プトプリンの放出を引き起こす。このアプローチは、当業者に公知である光療法
において、特に身体の選択された領域への薬物活性化の局在化に対して、有用性
を見出す。
【０１０３】 好ましくは、以下のアプローチによって例示されるように、切断可能なリンカ
ーは、生物学的に活性な因子からポリマーを切断するために協同し得る第１およ
び第２の切断可能な基を含む。すなわち、切断可能なリンカーは、因子に対して
遠位にある第１の切断可能な基、および因子に対して近位にある第２の切断可能
な基を含み、その結果、第１の切断可能な基の切断は、第２の切断可能な基を切
断するために分子内で反応し得る求核性部分を含むリンカー−因子結合体を生じ
、その結果、リンカーおよびポリマーから因子を放出する。
【０１０４】 図５Ｃは、抗癌剤、すなわち５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に連結した輸送
ポリマーＴを含む結合体（ＩＩＩ）を示す。本明細書中において、連結は、改変
リジル残基によって提供される。輸送ポリマーは、α−アミノ基に連結され、そ
して５−フルオロウラシルは、α−カルボニルを介して連結される。リシルε−
アミノ基は、ｏ−ヒドロキシメチルニトロベンゼンのカルバメートエステルに修
飾されており、これは、結合体内に第１の光不安定で切断可能な基を含む。光照
射は、結合体からニトロベンゼン部分を切断し、また迅速に分解し、遊離α−ア
ミノ基、有効な求核剤を与えるためにカルバメートを切断する。ε−アミノ基の
、５−フルオロウラシル基に対するアミド連結との分子内反応は、５−フルオロ
ウラシル基の放出と共に環化を導く。
【０１０５】 図５Ｄは、抗癌剤、パクリタキセルの２’−酸素に連結した送達増強輸送体Ｔ
を含む結合体（ＩＶ）を例示する。この連結は、以下の含む連結部分によって提
供される：（ｉ）送達増強輸送体に結合した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子に対し
てパラ位に位置するリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子に対してメ
タ位のカルボキシメチル基であり、これは、カルボキシレートエステル結合によ
ってパクリタキセルの２’−酸素に結合される。結合体からのリン酸基の酵素的
切断は、遊離したフェノールヒドロキシル基を与える。次いで、この求核基は、
カルボキシレートエステルと分子内反応し、その生物学的標的に完全に結合し得
る。ＰＣＴ出願ＵＳ９８／１０５７１の実施例９Ｃは、この型の結合体を調製す
るための合成プロトコールについて記載する。
【０１０６】 図５Ｅは、送達増強輸送体が生物学的活性因子（例えば、パクリタキセル）に
、アミノアルキルカルボン酸によって連結される、さらに別のアプローチを例示
する。好ましくは、リンカーアミノ基は、３〜５個の鎖原子（ｎ＝３〜５）、好
ましくは、３個または４個の鎖原子（これらは、好ましくは、メチレン炭素によ
って提供される）によって、リンカーカルボキシル炭素に連結される。図５Ｅに
見られるように、リンカーアミノ基は、アミド連結によって送達増強輸送体に結
合され、エステル結合によってパクリタキセル部分に結合される。アミド結合放
出の酵素的切断は、送達増強輸送体を放出し、そして遊離した求核アミノ基を生
成する。次いで、この遊離したアミノ基は、エステル基と分子内反応し、パクリ
タキセルからリンカーを放出する。
【０１０７】 別のアプローチにおいて、結合体は、あるｐＨで不安定であるが、別のｐＨで
安定であるリンカーを含む。例えば、図６は、生理学的ｐＨで切断されるが、酸
性ｐＨで安定であるリンカーとの結合体を合成する方法を例示する。好ましくは
、このリンカーは、約６．６〜約７．６のｐＨの水中において、切断される。好
ましくは、このリンカーは、約４．５〜約６．５のｐＨの水中において安定であ
る。
【０１０８】 （送達増強輸送体の使用） 送達増強輸送体は、治療的適用、予防的適用および診断的適用における使用を
見出す。この送達増強輸送体は、１層以上の皮膚または他の上皮組織（例えば、
胃腸、肺など）内に、またはそれらにわたって、あるいは、血液脳バリアのよう
な内皮組織にわたって、診断的または生物学的に活性な試薬を運搬し得る。この
特性により、この試薬は、それらの生物学的効果を発揮するために１層以上の組
織層にわたって貫入しなければならない因子を送達することによって状態を処置
するのに有用となる。
【０１０９】 本発明の組成物および方法は、ヒトおよび動物の治療の分野において、特に有
用性を有する。一般的に、投与される用量は、エフェクタ−部位にピコＭ〜μＭ
の濃度の治療用組成物を送達するのに有効である。適切な用量および濃度は、治
療組成物または薬物のような因子、意図される送達の部位、および投与の経路に
依存し、これらの全ては、当該分野で周知の方法に従って経験的に誘導され得る
。さらなる誘導は、当該分野で公知であるように、用量を評価するための実験的
動物モデルを使用する研究から得られ得る。
【０１１０】 本発明の化合物の、必要に応じて適切な薬学的賦形剤との投与は、任意の投与
の受容された形態を介して実行され得る。従って、投与は、例えば、静脈内投与
、局所的投与、皮下投与、経皮投与、筋肉内投与、経口投与、関節内投与、非経
口投与、腹膜投与、鼻内投与または吸入であり得る。従って、投与の適切な部位
として、皮膚、気管支、胃腸、肛門、膣、眼、および耳が挙げられるが、これら
に限定されない。これらの処方物は、好ましくは、正確な用量の単回投与に適切
な単位用量形態において、例えば、錠剤、ピル、カプセル、散剤、溶液、懸濁液
、エマルジョン、坐剤、保持浣腸、クリーム、軟膏、ローション、エアロゾルな
どのような、固体、半固体、凍結乾燥した散剤、または液体投与形態の形態をと
り得る。
【０１１１】 組成物は、代表的には、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤を含み、さらに、
他の医薬剤、キャリア、賦形剤などを含み得る。好ましくは、この組成物は、本
発明の化合物（単数または複数）の重量を基準に、約５％〜７５％であり得、残
りは適切な薬学的賦形剤からなる。適切な賦形剤は、当業者に周知の方法（例え
ば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ
ｓ、第１８編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ
（１９９０））によって、特定の組成物および投与の経路に合わせられ得る。
【０１１２】 経口投与の場合、このような賦形剤として、薬学的等級のマンニトール、ラク
トース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルカ
ム（ｔａｌｃｕｍ）、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マ
グネシウムなどが挙げられる。この組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプ
セル、散剤、持続性放出処方物などの形態をとり得る。
【０１１３】 幾つかの実施形態において、薬学的組成物は、丸剤、錠剤またはカプセルの形
態をとり得、従って、この組成物は、生物学的に活性な結合体と共に、以下のい
ずれかを含み得る：ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどのような
希釈剤；デンプンまたはそれらの誘導体のような崩壊剤；ステアリン酸マグネシ
ウムなどのような潤滑剤；およびデンプン、アラビアゴム、ポリビニルピロリド
ン、ゼラチン、セルロースおよびそれらの誘導体のような結合剤。
【０１１４】 処方物の活性化合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）キャリア
（例えば、ＰＥＧ１０００［９６％］およびＰＥＧ４０００［４％］）中に処理
される、例えば、約０．５％〜約５０％の本発明の化合物を含む坐剤中に処方さ
れ得る。
【０１１５】 液体組成物は、キャリア（例えば、生理食塩水（例えば、０．９％ｗ／ｖ塩化
ナトリウム）、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなど）中に化合
物（約０．５％〜約２０％）、および任意の薬学的賦形剤を溶解または分散する
ことによって調製され、例えば、静脈内投与のための溶液または懸濁液を形成し
得る。この活性化合物はまた、保持浣腸内に処方され得る。
【０１１６】 所望される場合、投与される組成物はまた、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤
（例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、またはトリエタノール
アミンオレアート）のような少量の非毒性補助物質を含み得る。
【０１１７】 局所投与の場合、組成物が、ローションまたは経皮パッチのような任意の適切
な形式で投与される。吸入による送達の場合、この組成物は、乾燥散剤（例えば
、吸入治療剤）として、または噴霧器を介する液体形態で、送達され得る。
【０１１８】 このような投与形態を調製するための方法は、公知であるか、または当業者に
明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ
ｌ Ｓｃｉｎｃｅｓ、前出および同様の公報を参照のこと。投与される組成物は
、任意の場合において、本発明の教示に従って投与される際に処置される状態の
軽減のために薬学的に有効な量で、一定量のプロドラッグおよび／活性化合物を
含む。
【０１１９】 一般に、本発明の化合物は、治療的に有効な量、すなわち、処置を実施するの
に十分な用量で投与され、この用量は、処置される個体および状態に依存して変
更する。代表的には、治療的に有効な１日の用量は、１日あたり、体重１ｋｇあ
たり０．１〜１００ｍｇの薬物である。ほとんどの状態が、１日あたり体重１ｋ
ｇあたり約１〜約３０ｍｇ、すなわち７０ｋｇのヒトの場合、１日あたり、約７
０ｍｇ〜２１００ｍｇの総用量の投与に応答する。
【０１２０】 結合体の安定性は、組成および送達増強輸送体の骨格および側鎖の立体化学に
よってさらに制御され得る。ペプチド送達増強輸送体の場合、Ｄ−異性体は、一
般に内在性プロテアーゼに対して耐性があり、それ故に、血清および細胞内のよ
り長い半寿命を有する。それ故に、Ｄ−ポリペプチドポリマーは、より長い期間
の作用が所望される場合、適切である。Ｌ−ポリペプチドポリマーは、プロテア
ーゼに対するそれらの感受性に起因して、より短い半寿命を有し、それ故に、よ
り短い作用効果を付与するために選択される。このことによって、副作用が観察
されるとすぐに、治療を中止するこよによってより容易に副作用が回避され得る
。Ｄ−残基およびＬ−残基の混合物を含むポリペプチドは、中間安定性を有する
。ホモ−Ｄ−ポリマーが、一般的に好ましい。
【０１２１】 （Ａ．皮膚への適用） 本発明の送達増強輸送体は、生物学的に活性かつ診断的な因子の皮膚を横切る
送達を可能にする。驚くべきことに、この輸送体は、角質層を横切って因子を送
達し得、これは、以前に薬物送達に対して貫入不可能なバリアであった。角質層
、すなわち皮膚の最外層は、コレステロールおよび脂肪酸からなる「糊剤（ｇｌ
ｕｅ）」によって一緒に、しっかり結合される、死んだケラチン充填皮膚細胞の
幾つかの層から構成される。一旦、この因子が本発明の輸送体によって角質層を
通して送達されると、この因子は生存可能な表皮に侵入し得、これは、角質層と
ともに表皮を構成する顆粒層、淡明層および胚芽層（ｓｔｒａｔｕｍ ｇｅｒｍ
ｉｎａｔｉｖｕｍ）からなる。本発明の幾つかの実施形態における送達は、表皮
を通り、そして真皮（乳頭真皮および網様真皮の１つまたは両方を含む）に入る
。
【０１２２】 皮膚の１層以上の層の貫入を得る能力は、抗細菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤
、抗増殖剤、免疫抑制剤、ビタミン、鎮痛剤、ホルモンなどのような化合物の効
力を非常に増強し得る。莫大なこのような化合物は、当業者に公知である（例え
ば、Ｈａｒｄｍａｎ ａｎｄ Ｌｉｍｂｉｒｄ，Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍ
ａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈ
ｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９６
を参照のこと）。
【０１２３】 幾つかの実施形態において、因子は、上皮組織内に存在する血管内に送達され
、従って、この因子の送達のための手段を全身的に提供する。送達は、濾胞内ま
たは濾胞外、またはその両方のいずれかであり得る。皮膚の前処置は、結合体の
送達に必要とされない。
【０１２４】 他の実施形態において、送達増強輸送体は、化粧品および皮膚状態を処置し得
る因子を送達するために有用である。目的の皮膚内の標的細胞として、例えば、
線維芽細胞、上皮細胞および免疫細胞が挙げられる。例えば、輸送体は、真皮内
に見られる免疫細胞に対する抗炎症剤のような化合物を送達する能力を提供する
。
【０１２５】 糖質コルチコイド（アドレノコルチコイドステロイド）は、皮膚を横切る送達
が本発明の送達増強輸送体によって増強され得る、皮膚を横切る送達のための化
合物に挙げられる。本発明の結合した糖質コルチコイドは、例えば、炎症性皮膚
疾患を処置するのに有用である。例示的な糖質コルチコイドとして、例えば、ヒ
ドロコルチゾン、プレニゾン（ｐｒｅｎｉｓｏｎｅ（デルタゾン（ｄｅｌｔａｓ
ｏｎｅ）））およびプレドリゾンロン（ｐｒｅｄｒｉｓｏｎｌｏｎｅ）（ハイデ
ルタゾル（ｈｙｄｅｌｔａｓｏｌ））が挙げられる。特定の状態の例として、湿
疹（アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎を含む）、水疱性疾
患、コラーゲン脈管疾患、サルコイドーシス、スウィート病、壊疽性膿皮症、Ｉ
型反応性らい病、毛細血管性血管腫、扁平苔癬、剥脱性皮膚炎、結節性紅斑、ホ
ルモン異常（挫瘡および多毛症）、ならびに毒性表皮壊死症、多形性紅斑、皮膚
性Ｔ細胞リンパ腫、円板状エリテマトーデスなどが挙げられる。
【０１２６】 レチノイドは、１層以上の皮膚または他の上皮組織もしくは内皮組織内に横切
る送達を増強するために本発明の送達増強輸送体を使用し得る生物学的に活性な
因子の別の例である。現在使用されるレチノイドとして、例えば、レチノール、
トレチノイン、イソトレチノイン、エトレチナート、アチトレチン（ａｃｉｔｒ
ｅｔｉｎ）、およびアロチノイド（ａｒｏｔｉｎｏｉｄ）が挙げられる。本発明
の送達増強輸送体に結合したレチノイドを使用して処置可能である状態として、
挫瘡、角質化障害、皮膚癌、前癌状態、乾癬、皮膚老化、円板状エリテマトーデ
ス、硬化性粘液水腫、いぼ状表皮神経、角層下膿疱性皮膚疾患、ライター症候群
、いぼ、扁平苔癬、黒色表皮肥厚症、サルコイドーシス、グロヴァー病、汗孔角
化症などが挙げられる。
【０１２７】 細胞傷害性免疫抑制薬物は、本発明の送達増強輸送体が有用であるさらなるク
ラスの薬物を構成する。これらの因子は、乾癬のような過剰増殖疾患、ならびに
水疱性皮膚疾患および白血球破砕性血管炎のような免疫疾患を処置するために通
常使用される。本発明の送達増強輸送体に結合し得るこのような化合物の例とし
て、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、アザチオプリン、フルオロウラシ
ル、ヒドロキシ尿素、６−チオクアニン（ｔｈｉｏｑｕａｎｉｎｅ）、ミコフェ
ノレート（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）、クロランブシル、ビニクリスチン（
ｖｉｎｉｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチンおよびダクチノマイシン）が挙げ
られるが、これらに限定されない。他の例は、アルキル化剤（例えば、シクロホ
スファミド、メクロロエタミン塩酸塩（ｍｅｃｈｌｏｒｏｅｔｈａｍｉｎｅ ｈ
ｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、カルムスチン、タキソール、タクロリムス（ｔａ
ｃｒｏｌｉｍｕｓ）およびビンブラスチン（ダプソンおよびスルファサラジンの
ように、有用な生物学的因子のさらなる例である））である。アスコマイシン（
ａｓｃｏｍｙｃｉｎ）（例えば、シクロスポリン、ＦＫ５０６（タクロリムス）
、およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）（例えば、米国特許第５，９１２
，２５３号））ならびにこのような化合物のアナログが、特に関心がある（例え
ば、Ｍｏｌｌｉｓｏｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓｉｇｎ ４（５
）：３６７−３８０（１９９８）；米国特許第５，６１２，３５０号；同第５，
５９９，９２７号；同第５，６０４，２９４；同第５，９９０，１３１号；同第
５，５６１，１４０号；同第５，８５９，０３１号；同第５，９２５，６４９号
；同第５，９９４，２９９号；同第６，００４，９７３号および同第５，５０８
，３９７号）。シクロスポリンとして、シクロスポリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇおよ
びＭが挙げられる。例えば、米国特許第６，００７，８４０号；および同第６，
００４,９７３号を参照のこと。例えば、このような化合物は、乾癬、湿疹（ア
トピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎）および円形脱毛症の処置
に有用である。
【０１２８】 送達増強輸送体は、紅斑性狼瘡（円板状および全身性の両方）、皮膚筋炎、晩
発性皮膚ポルフィリン症および多形光線疹のような状態を処置するために有用な
薬剤と結合体化され得る。このような状態を処置するために有用な薬剤としては
、例えば、キニーネ、クロロキン、ヒドロキシクロロキンおよびキナクリンが挙
げられる。
【０１２９】 本発明の送達増強輸送体はまた、抗感染剤の経皮送達のために有用である。例
えば、抗細菌剤、抗真菌剤および抗ウイルス剤はまた、送達増強輸送体に結合体
化され得る。抗細菌剤は、挫瘡、皮膚感染などのような状態を処置するために有
用である。抗真菌薬剤を用いて、体部白癬、足部白癬、爪真菌症、カンジダ症、
でん風などを処置し得る。この結合体の送達増強特性に起因して、これらの結合
体は、局所化した感染および広範に広がった感染の両方を処置するために有用で
ある。抗真菌薬剤はまた、爪真菌症を処置するために有用である。抗真菌薬剤の
例としては、イトラコナゾール、ミコナゾール（ｍｙｃｏｎａｚｏｌ）およびフ
ルコナゾールのようなアゾール抗真菌剤が挙げられるがこれらに限定されない。
抗ウイルス薬剤の例としては、アシクロビル、ファンシクロビル（ｆａｍｃｉｃ
ｌｏｖｉｒ）およびバラシクロビル（ｖａｌａｃｙｃｌｏｖｉｒ）が挙げられる
がこれらに限定されない。このような薬剤は、ウイルス性疾患（例えば、ヘルペ
ス）を処置するために有用である。
【０１３０】 本発明の送達増強輸送体への結合体化による送達の増強が望ましい、生物学的
に活性な薬剤の別の例は、抗ヒスタミン剤である。これらの薬剤は、蕁麻疹に起
因するかゆみ、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬などのような状態を処置す
るために有用である。このような試薬の例としては例えば、テルフェナジン、ア
ステミゾール、ロロタジン（ｌｏｒｏｔａｄｉｎｅ）、セチリジン、アクリバス
チン、テメラスチン（ｔｅｍｅｌａｓｔｉｎｅ）、シメチジン、ラニチジン、フ
ァモチジン、ニザチジンなどが挙げられる。三環系抗うつ剤もまた、本発明の送
達増強輸送体を用いて送達され得る。
【０１３１】 表面抗乾癬薬物（ｔｏｐｉｃａｌ ａｎｔｉｐｓｏｒｉａｓｉｓ ｄｒｕｇ）
もまた目的のものである。コルチコステロイド、カルシポトリエン（ｃａｌｃｉ
ｐｏｔｒｉｅｎｅ）およびアントラリンのような薬剤は、本発明の送達増強輸送
体に結合体化され得、そして皮膚に塗布され得る。
【０１３２】 本発明の送達増強輸送体はまた、皮膚および他の上皮組織の１以上の層内への
、ならびに皮膚および他の上皮組織の１以上の層を通しての光化学療法剤の送達
を増強するために有用である。このような化合物としては例えば、ソラレンなど
が挙げられる。遮光剤成分もまた目的のものである；これらとしては、ｐ−アミ
ノ安息香酸エステル、シナメートおよびサリシレート、ならびにベンゾフェノン
、アントラニレート（ａｎｔｈｒａｎｉｌａｔｅｓ）およびアボベンゾンが挙げ
られる。
【０１３３】 疼痛軽減剤および局所麻酔剤は、本発明の送達増強輸送体が処置を増強し得る
別のクラスの化合物を構成する。リドカイン、ブポバカイン、ノボカイン、プロ
カイン、テトラカイン、ベンゾカイン、コカインおよびオピエートはとりわけ、
本発明の送達増強輸送体を結合し得る化合物である。
【０１３４】 目的の他の生物学的薬剤としては例えば、ミノキシジル、角質溶解剤、破壊剤
（例えば、ポドフィリン、ヒドロキノン、カプサイシン、マソプロコール、コル
ヒチンおよび金が挙げられる。
【０１３５】 （Ｂ．胃腸投与） 本発明の送達増強輸送体はまた、胃腸投与による結合体化薬物の送達のために
有用である。胃腸投与は、全身的に活性な薬物および胃腸上皮において作用する
薬物の両方について用いられ得る。
【０１３６】 送達増強輸送体に結合体化した適切な試薬を用いて処置され得る胃腸状態の中
でも、クローン病（例えば、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）、潰瘍性大腸炎
、胃腸の潰瘍、消化性潰瘍疾患、塩および水の吸収の失調（ｉｍｂａｌａｎｃｅ
ｏｆ ｓａｌｔ ａｎｄ ｗａｔｅｒ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）（便秘、下痢
または栄養失調をもたらし得る）、異常増殖疾患などである。潰瘍の処置として
は例えば、胃酸分泌を減少させる薬物（例えば、Ｈ2ヒスタミンインヒビター（
例えば、シメチジンおよびラニチジン）およびプロトン−カリウムＡＴＰａｓｅ
のインヒビター（例えば、ランソプラゾールおよびオメプラゾール））ならびに
Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉに対する抗生物質が挙げられる。
【０１３７】 抗生物質（特に、侵襲性の細菌（例えば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｓａｌｍｏｎｅ
ｌｌａおよびＹｅｒｓｉｎｉａ）に対して作用する抗生物質）はとりわけ、本発
明の送達増強輸送体に結合体化した場合に有用である、生物学的に活性な薬剤で
ある。このような化合物としては例えば、ノルフロキサシン、シプロフロキサシ
ン、トリメトプリム、スルファメチロキサゾールなどが挙げられる。
【０１３８】 抗新生物剤もまた、本発明の送達増強輸送体に結合体化され得、そして胃腸経
路によって投与され得る。これらとしては例えば、シスプラチン、メトトレキサ
ート、タキソール、フルオロウラシル、メルカプトプリン、ドキソルビシン（ｄ
ｏｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシンなどが挙げられる。
【０１３９】 （Ｃ．気道投与） 本発明の送達増強輸送体をまた用いて、気道を通した薬物の投与を増強し得る
。気道（これは、鼻粘膜、下咽頭ならびに大気道構造および小気道構造を含む）
は、薬物吸収のための大きな粘膜表面を提供する。本発明の送達増強輸送体によ
って提供される結合体化された薬剤の、上皮組織の１以上の層内へのおよび上皮
組織の１以上の層を通しての増強された浸透は、気道送達が他の送達方法に対し
て有する利点の増幅をもたらす。例えば、低い用量の薬剤がしばしば、所望の効
果を得るために必要とされ、局腫治療効果はより迅速に生じ得、そしてその薬剤
の全身の治療血液レベルが迅速に得られる。薬理学的活性の迅速な発生は、気道
投与から生じ得る。さらに、気道投与は一般に比較的副作用が少ない。
【０１４０】 本発明の輸送体を用いて、肺の状態の処置のために有用である、生物学的薬剤
を送達し得る。鼻投与によって処置され得る状態の例としては例えば喘息が挙げ
られる。これらの化合物としては、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド、ク
ロモリンおよびネドロクロミル（ｎｅｄｏｃｒｏｍｉｌ））、気管支拡張剤（例
えば、β２選択的アドレナリン作用性薬物およびテオフィリン）ならびに免疫抑
制薬物（例えば、シクロスポリンおよびＦＫ５０６）が挙げられる。他の状態と
しては例えば、アレルギー性鼻炎（これは、グルココルチコイドを用いて処置さ
れ得る）および慢性閉塞性肺疾患（気腫）が挙げられる。肺組織に作用し、そし
て本発明の輸送体を用いて送達され得る他の薬物としては、β−アゴニスト、脂
肪細胞安定剤、抗生物質、抗真菌剤および抗ウイルス剤、界面活性剤、血管作用
性薬物、鎮静剤およびホルモンが挙げられる。
【０１４１】 気道投与は、肺状態を処置するためだけでなく、循環器系を介して遠位の標的
器官へと薬物を送達するためにも有用である。このような広範な種々の薬物およ
び診断剤が、本発明の送達増強輸送体への結合体化後に、気道を通して投与され
得る。
【０１４２】 （Ｄ．血液脳関門を横切った薬剤の送達） 送達増強輸送体はまた、生物学的に活性な薬剤および診断薬剤を、血液脳関門
を横切って送達するために有用である。これらの薬剤は、（例えば、抗アポトー
シス薬物を用いて）虚血を処置するため、ならびに神経伝達物質および種々の状
態（例えば、精神分裂病、パーキンソン病、疼痛）を処置するための他の薬剤（
例えば、モルヒネ、オピエート）を送達するために有用である。５−ヒドロキシ
トリプタミンレセプターアンタゴニストは、片頭痛および不安のような状態を処
置するために有用である。
【０１４３】 （Ｅ．診断的画像化剤および造影剤） 本発明の送達増強輸送体はまた、上皮組織および／または内皮組織の１以上の
層内にならびに上皮組織および／または内皮組織の１以上の層を横切った診断的
画像化剤および造影剤の送達のために有用である。診断薬剤の例としては、放射
能で標識された物質（例えば、99ｍＴｃグルコヘプトネート（ｇｌｕｃｏｈｅｐ
ｔｏｎａｔｅ））または磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）手順において用いられる物質
（例えば、ガドリニウムドープキレート剤（例えば、Ｇｄ ＤＴＰＡ））が挙げ
られる。診断薬剤の他の例としては、細胞中で発現された場合に容易に検出可能
であるタンパク質をコードするマーカー遺伝子（β−ガラクトシダーゼ、グリー
ン蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含むがこれらに限定されない）が挙げ
られる。広範な種々の標識（例えば、放射性核種、ほたる石（ｆｌｕｏｒ）、酵
素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、リガンド（特にハプテン）など
）が用いられ得る。
【０１４４】 （送達増強輸送体について有用な生物学的に活性な分子および診断分子） 送達増強輸送体は、診断用途を有する、広範な種々の生物学的に活性な薬剤お
よび分子に結合体化され得る。
【０１４５】 （Ａ．有機低分子） 有機低分子治療薬剤は、本明細書中に記載されるような直鎖状ポリマー性組成
物に有利に結合されて、上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切った輸送を
容易にまたは増強し得る。例えば、高度に荷電した薬剤（例えば、レボドーパ（
Ｌ−３，４−ジヒドロキシ−フェニルアラニン；Ｌ−ＤＯＰＡ））の送達は、本
明細書中に記載されるような送達増強輸送体への結合によって利益を受け得る。
ペプトイドおよびペプチド模倣物薬剤もまた意図される（例えば、Ｌａｎｇｓｔ
ｏｎ（１９９７）ＤＤＴ ２：２５５；Ｇｉａｎｎｉｓら（１９９７）Ａｖａｎ
ｃｅｓ Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．２９：１）。また、本発明は、水性液体（例えば、
血清および水性生理食塩水）中で乏しい溶解度を有する有機低分子を送達するた
めに有利である。従って、低い溶解度によって治療効力が制限される化合物は、
本発明によって、より高い投薬量で投与され得、そして細胞による、より高い取
り込みレベルに起因して、結合体形態のモルに基づいて、非結合体形態と比較し
て、より有効であり得る。
【０１４６】 低分子の位相表面のかなりの部分がしばしば生物学的活性に関与し、それゆえ
、生物学的活性に必要とされるので、特定の場合の結合体の低分子部分は、標的
上皮組織を横切った後に低分子薬剤が生物学的活性を発揮するために、結合した
送達増強輸送体およびリンカー部分（存在する場合）から分離される必要があり
得る。このような状況では、結合体は好ましくは、上皮組織を介して通った後に
遊離薬物を放出するための切断可能なリンカーを含む。
【０１４７】 図５Ｄおよび図５Ｅは、本発明の別の局面の例示である。この局面は、対応す
る非結合体化形態と比較して増強された経上皮組織輸送率を有する、タキサンお
よびタキソイド抗癌結合体を含む。この結合体は特に、癌細胞の増殖を阻害する
ために有用である。タキサンおよびタキソイドは、細胞機能に対して有害である
程度まで微小管の重合を促進すること（および脱重合を阻害すること）によって
細胞の複製を阻害し、そして最終的に細胞死をもたらすことによってそれらの抗
癌効果を表すと考えられる。
【０１４８】 用語「タキサン」とは、パクリタキセル（図５Ｆ、Ｒ’＝アセチル、Ｒ”＝ベ
ンジル）（商標「ＴＡＸＯＬ」のもとで公知でもある）、ならびに図５Ｇにおい
て例示したような、パクリタキセルのＡ環、Ｂ環、Ｃ環およびＤ環を含む骨格コ
アを有する、天然に存在するアナログ、合成アナログまたは生物工学アナログを
いう。図５Ｆもまた、「ＴＡＸＯＴＥＲＥTM」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝ＢＯＣ）の構
造を示す。これは、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃによって販売される、パクリタ
キセルのいくらかより可溶性の合成アナログである。「Ｔａｘｏｉｄ」とは、図
５Ｈに示すような、パクリタキセルの基本的Ａ環、Ｂ環およびＣ環を含む、パク
リタキセルの天然に存在するアナログ、合成アナログまたは生物工学アナログを
いう。実質的な合成情報および生物学的情報は、Ｓｕｆｆｎｅｓｓ（１９９５）
Ｔａｘｏｌ：Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２３７−２３９頁、特に第１２章〜第１４
章に、ならびにその後のパクリタキセルの文献に概説されるように、種々のタキ
サンおよびタキソイド化合物の合成および活性について利用可能である。さらに
、細胞株の宿主は、例えば、Ｓｕｆｆｎｅｓｓの第８章および第１３章にに記載
されるように、特定の癌の型に対するこれらの化合物の抗癌活性を予測するため
に利用可能である。
【０１４９】 送達増強輸送体は、タキサンまたはタキソイド中の任意の適切な結合部位を介
してタキサンまたはタキソイド部分に結合体化される。便利に、輸送ポリマーは
、上記の通りの連結ストラテジーを用いてＣ２’酸素原子、Ｃ７酸素原子を介し
て連結される。Ｃ７酸素を介した輸送ポリマーの結合体化は、その位置での結合
体化にもかかわらず、抗癌活性および抗腫瘍活性を有するタキサン結合体をもた
らす。従って、リンカーは、切断可能であっても切断可能でなくてもよい、Ｃ２
’酸素を介した結合体化は、抗癌活性を顕著に低下させ、その結果、切断可能な
リンカーは、この部位への結合体化のために好ましい。他の結合部位（例えば、
Ｃ１０）もまた用いられ得る。
【０１５０】 本発明のタキサン結合体およびタキソイド結合体が、タキソール（約０．２５
μｇ／ｍＬ）およびタキソテレ（６〜７μｇ／ｍＬ）に対して改善された水溶性
を有することが認識される。それゆえ、大量の可溶化剤（例えば、「ＣＲＥＭＯ
ＰＨＯＲ ＥＬ」（ポリオキシエチル化ヒマシ油）、ポリソルベート８０（ポリ
オキシエチレンソルビタンモノオレエート、「ＴＷＥＥＮ ８０」としても公知
）およびエタノール）は必要でなく、その結果、これらの可溶化剤に代表的に関
連した副作用（例えば、アナフィラキシー、呼吸困難、低血圧および紅潮）が減
少し得る。
【０１５１】 （Ｂ．金属） 金属は、実施例によって例示されるように、本発明の送達増強輸送体に結合体
化されたキレート剤（例えば、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）または
ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ））を用いて、上皮組織および内皮組織
の１以上の層内に、ならびに上皮組織および内皮組織の１以上の層を横切って輸
送され得る。これらの結合体は、画像化または治療のために金属イオンを送達す
るために有用である。例示的な金属イオンとしては、Ｅｕ、Ｌｕ、Ｐｒ、Ｇｄ、
Ｔｃ９９ｍ、Ｇａ６７、Ｉｎｌ１１、Ｙ９０、Ｃｕ６７およびＣｏ５７が挙げら
れる。結合体候補を用いての予備的な膜輸送研究は、以下の実施例の節に記載さ
れる通りの、細胞に基づくアッセイを用いて行われ得る。例えば、ユーロピウム
イオンを用いて、時間分解型蛍光測定によって細胞取り込みがモニタリングされ
得る。細胞傷害性である金属イオンについては、取り込みは、細胞傷害性によっ
てモニタリングされ得る。
【０１５２】 （Ｃ．高分子） 本発明の増強輸送方法は、上皮組織または内皮組織の１以上の層内への、およ
び上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切った、多数の高分子についての輸
送を増強するために特に適切である。このような高分子としては、タンパク質、
核酸、多糖およびそれらのアナログが挙げられるがこれらに限定されない。例示
的な核酸としては、相補的標的（例えば、一本鎖標的または二本鎖標的について
のアンチセンス配列）へのハイブリダイゼーションのために、またはこれらの配
列によってコードされる核酸転写物もしくはタンパク質の発現のために設計され
た選択された配列を有する、ＤＮＡおよびＲＮＡから形成されたオリゴヌクレオ
チドおよびポリヌクレオチド、ならびにそれらのアナログが挙げられる。アナロ
グとしては、荷電した骨格アナログ、そして好ましくは非荷電の骨格アナログ（
例えば、ホスホネート（好ましくは、メチルホスホネート））、ホスホルアミデ
ート（Ｎ３’またはＮ５’）、チオホスフェート、非荷電モルホリノベースのポ
リマーおよびタンパク質核酸（ＰＮＡ））が挙げられる。このような分子は、種
々の治療レジメン（例えば、酵素置換治療、遺伝子治療およびアンチセンス治療
が挙げられる）において用いられ得る。
【０１５３】 例として、タンパク質核酸（ＰＮＡ）は、骨格がデオキシリボース骨格と構造
的に同形であるＤＮＡのアナログである。この骨格は、核塩基が結合しているＮ
−（２−アミノエチル）グリシン単位からなる。４つの天然の核塩基全てを含む
ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合の法則に従って相補的なオリゴヌ
クレオチドにハイブリダイズし、そして塩基対認識に関して真のＤＮＡ模倣物で
ある（Ｅｇｈｏｌｍら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６５：５６６−５６８）。
ＰＮＡの骨格は、リン酸エステルによってではなく、ペプチド結合によって形成
されて、これをアンチセンス適用に十分に適切にする。骨格は非荷電であるので
、形成するＰＮＡ／ＤＮＡ二重鎖またはＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、通常よりも高
い熱安定性を示す。ＰＮＡは、ヌクレアーゼによってもプロテアーゼによっても
認識されないというさらなる利点を有する。さらに、ＰＮＡは、標準的なｔ−Ｂ
ｏｃ化学を用いて自動化ペプチド合成機で合成され得る。次いで、ＰＮＡは、本
発明の輸送ポリマーに容易に連結される。
【０１５４】 上皮組織および内皮組織内への、ならびに上皮組織および内皮組織を横切った
輸送が、本発明の方法を用いて増強され得るアンチセンスオリゴヌクレオチドの
例は、例えば、米国特許第５，５９４，１２２号に記載される。このようなオリ
ゴヌクレオチドは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を処置するために標的化さ
れる。アンチセンスオリゴヌクレオチドへの輸送ポリマーの結合体化は、例えば
、十分に確立された方法に従って、ペプチドとオリゴヌクレオチドの５’末端と
の間にスクシネートリンカーを介してアミド結合を形成することによってもたら
され得る。ＰＮＡ結合体の使用はさらに、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／１０５
７１の実施例１１において例示される。この出願の図７は、実施例１１に記載さ
れるように、Ｔ細胞によるガンマインターフェロン（γ−ＩＦＮ）の分泌を阻害
するためのＰＮＡ配列を含む本発明の結合体を用いて得られた結果を示す。分か
り得るように、アンチセンスＰＮＡ結合体は、結合体が約１０μＭを超えるレベ
ルで存在する場合、γ−ＩＦＮ分泌をブロックするために有効であった。対照的
に、センスＰＮＡ結合体を用いたときも、非結合体化アンチセンスＰＮＡ単独で
用いたときも、阻害は見られなかった。
【０１５５】 上皮組織または内皮組織の１以上の層を横切って輸送され得る別のクラスの高
分子は、タンパク質（特に酵素）によって例示される。治療タンパク質としては
、置換酵素が挙げられるがこれらに限定されない。治療酵素としては、リソソー
ム（ｌｙｓｏｚｏｍａｌ）グルコセレブロシダーゼ欠損（ゴシェ病）を処置する
際に使用するためのアルグルセラーゼ（ａｌｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ムコ多糖症
Ｉを処置する際に使用するためのα−Ｌ−イズロニダーゼ（ｉｄｕｒｏｎｉｄａ
ｓｅ）、サンフィリポＢ症候群を処置する際に使用するためにα−Ｎ−アセチル
グルコサミダーゼ、膵臓不全を処置する際に使用するためのリパーゼ、重症複合
免疫不全症候群を処置する際に使用するためのアデノシンデアミナーゼ、および
トリオースリン酸イソメラーゼ不全に関連した神経筋機能不全を処置する際に使
用するためのトリオースリン酸イソメラーゼが挙げられるがこれらに限定されな
い。
【０１５６】 さらに、そして本発明の重要な局面に従って、タンパク質抗原が、抗原提示細
胞（ＡＰＣ）の細胞質ゾル区画へと送達され得、ここで、これらはペプチドへと
分解される。次いで、ペプチドは、小胞体へと輸送され、ここで、これらは、新
生のＨＬＡクラスＩ分子と会合し、そして細胞表面に提示される。このような「
活性化された」ＡＰＣは、クラスＩ拘束抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴ
Ｌ）のインデューサーとして役立ち得、次いでこれは、特定の抗原を提示する細
胞の認識および破壊へと進行する。このプロセスを実施し得るＡＰＣとしては、
特定のマクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞が挙げられるがこれらに限定され
ない。１つの実施形態では、タンパク質抗原は、腫瘍細胞に対する免疫応答を惹
起または促進するための腫瘍抗原である。ＣＴＬのその後の活性化を伴う、ＡＰ
Ｃの細胞質ゾルへの単離されたかまたは可溶性のタンパク質の輸送は、指数関数
的である。なぜなら、いくつかの例外はあるが、単離されたかまたは可溶性のタ
ンパク質の注射は、ＡＰＣの活性化もＣＴＬの誘導も、いずれももたらさないか
らである。従って、本発明の輸送増強組成物に結合体化された抗原は、インビト
ロまたはインビボで細胞性免疫応答を刺激するために役立ち得る。
【０１５７】 別の実施形態では、本発明は、免疫特異的抗体または抗体フラグメントを細胞
質へと送達して、微生物感染のような有害な生物学的プロセスを妨害するために
有用である。近年の実験は、細胞内抗体が、植物細胞および哺乳動物細胞におい
て効果的な抗ウイルス薬剤であり得ることを示した（例えば、Ｔａｖｌａｄｏｒ
ａｋｉら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４６９；およびＳｈａｈｅｅｎら
（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：３３９２）。これらの方法は代表的に、抗
体の重鎖および軽鎖が単一ポリペプチドとして合成されている単鎖可変領域フラ
グメント（ｓｃＦｖ）を用いた。この可変の重鎖および軽鎖は通常、可撓性リン
カーペプチド（例えば、１５アミノ酸の可撓性リンカーペプチド）によって隔て
られて、高親和性リガンド結合部位を保持する２８ｋＤａの分子を生じる。この
技術の広範な適用への主な障害は、感染細胞への取り込みの効率であった。しか
し、輸送ポリマーをｓｃＦｖフラグメントへと結合させることによって、細胞取
り込みの程度が増大し得、免疫特異的フラグメントが重要な微生物成分（例えば
、ＨＩＶ Ｒｅｖ、ＨＩＶ逆転写酵素およびインテグラーゼタンパク質）に結合
し、そしてこれを不能にするのを可能にする。
【０１５８】 （Ｄ．ペプチド） 本明細書中に記載される増強された輸送方法によって送達されるペプチドとし
ては、エフェクターポリペプチド、レセプターフラグメントなどが挙げられるが
これらに限定されるべきでない。例としては、細胞内シグナルを媒介するタンパ
ク質によって使用されるリン酸化部位を有するペプチドが挙げられる。このよう
なタンパク質の例としては、プロテインキナーゼＣ、ＲＡＦ−１、ｐ２１Ｒａｓ
、ＮＦ−κＢ、Ｃ−ＪＵＮおよび膜レセプター（例えば、ＩＬ−４レセプター）
、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｖ７、ならびにＭＨＣクラスＩ抗原およびＭＨＣク
ラスＩＩ抗原の細胞質テールが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５９】 送達増強輸送体もまたペプチドである場合、合成は、自動化ペプチド合成機を
用いてか、または上記のように、融合ペプチドをコードするポリヌクレオチドが
産生される組換え方法によってかのいずれかによって達成され得る。
【０１６０】 （実施例） 以下の実施例は、本発明の例示のために提供されるが、本発明を限定しない。
【０１６１】 （実施例１） （Ｄ−アルギニンのビオチン化ポリマーのヌードマウスの皮膚への浸透） この実施例は、ポリアルギニンヘプタマーが、結合体化ビオチンを、皮膚層内
かつ皮膚層を横切って、小胞に（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｌｙ）および小胞間に野
両方で、そして真皮内に送達し得ることを実証する。
【０１６２】 （方法） ビオチン化ペプチドを、固相技術ならびに市販のＦｍｏｃアミノ酸、樹脂、お
よび試薬（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ， ａ
ｎｄ Ｂａｃｈｅｍ Ｔｏｒｒｅｎｃｅ，ＣＡ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３３ペプチド合成機で合成した。Ｆａｓｔｍｏｃサイ
クルを、カップリング試薬としてのＨＢＴＵ／ＨＯＢｔの代わりのＯ−（７−ア
ザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート（ｈｅｘｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（ＨＡ
ＴＵ）と共に用いた。ペプチドのアミノ末端へのビオチンの付加の前に、アミノ
カプロン酸（ａｃａ）を結合体化し、そしてスペーサーとして作用させた。これ
らのペプチドを９６％のトリフルオロ酢酸、２％のトリイソプロピルシラン、お
よび２％のフェノールを１時間と１２時間との間使用して、樹脂から切断した。
より長い反応時間が、アルギニンのポリマーからＰｂｆ保護基を完全に除去する
ために必要であった。続いて、これらのペプチドを樹脂から濾過し、ジエチルエ
ーテルを使用して沈殿させ、ＨＰＬＣ逆相カラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｌｔｉｍ
ａ， Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ．）を使用して精製し、そしてエレクトロスプレー
質量分光法またはマトリックス支援レーザー脱離質量分光法（Ｐｅｒｃｅｐｔｉ
ｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のいずれかを使用して特徴
付けした。
【０１６３】 種々の濃度（１ｍＭ〜１０μＭ）の、ビオチンがアミノカプロン酸スペーサー
を使用してアミノ末端に共有結合されているＤ−アルギニンのヘプタマー（ｂｉ
ｏ ｒ７）（リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解されている）を、麻酔し
たヌードマウスの背部に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤を含まな
い液体として塗布し、ＶａｓｅｌｉｎｅTMバリアにより分散を防止して、そして
１５分間浸透させた。この期間の最後にこの動物を殺し、皮膚の関連切片を切除
し、封入剤（ＯＣＴ）に包埋させ、そして凍結した。凍結した切片（５ミクロン
）を、低温槽を使用してカットし、スライド上に集め、そして蛍光性標識化スト
レプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａ
ｍｅ，ＣＡ）で染色した。これらのスライドをアセトン中で４℃にて１０分間固
定し、風乾し、ＰＢＳに５分間浸し、正常ヤギ血清を用いて５分間ブロックし（
ｂｌｏｃｋｅｄ）、そしてＰＢＳで５分間洗浄した。この切片を、蛍光性標識化
ストレプトアビジンと共に３０μｇ／ｍｌで３０分間インキュベーションするこ
とによって染色し、ＰＢＳで洗浄し、ヨウ化プロピジウム（１μｇ／ｍｌ）で２
分間対比染色し、そしてこの切片をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄTM封入剤で封入した
。スライドを蛍光顕微鏡検査により分析した。フルオレセイン−ストレプトアビ
ジンではなくストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを使用して並行
研究を行った。ビオチン化ペプチドを、これらの切片の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ基質ジアミノベンザジンでの処置、および光学顕微鏡での視覚化により視覚
化した。
【０１６４】 （結果） ビオチン化アルギニンヘプタマーは、表皮中におよび表皮を横切って、そして
真皮中にわたっていた。この領域の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は蛍光性で
あり、切片中のヌードマウスの皮膚の実質的に全ての細胞中に浸透したことを示
していた。染色パターンは、小胞および小胞間の両方への予期しない輸送と一致
した。さらに、陽性の細胞は、乳頭および網状真皮において明らかであった。対
照的に、ビオチン単独、またはリン酸緩衝化生理食塩水単独で処置されたマウス
において染色は明らかではなかった。
【０１６５】 （実施例２） （Ｄ−アルギニンのビオチン化ポリマーの正常Ｂａｌｂ／Ｃマウスの皮膚への
浸透） 種々の濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、ビオチンがアミノカプロン酸スペーサ
ーを使用してアミノ末端に共有結合されているＤ−アルギニンのヘプタマー（ｂ
ｉｏ ｒ７）（ＰＢＳに溶解されている）を、麻酔したＢａｌｂ／Ｃマウスの鼡
径部の皮膚に塗布した。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤中の液体として塗布
し、ＶａｓｅｌｉｎｅTMバリアにより分散を防止して、そして３０分間浸透させ
た。この期間の最後にこの動物を殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣ
Ｔ）に包埋させ、そして凍結した。凍結した切片を、低温槽を使用してカットし
、スライド上に集め、そして蛍光性標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で実施例１に記載
のように染色した。スライドを蛍光顕微鏡検査で分析した。
【０１６６】 （結果） ヌードマウス由来の皮膚と同様に、ビオチン化アルギニンヘプタマーは、表皮
中へと、および表皮を横切って、そして真皮中にわたっていた。この領域の全て
の細胞の細胞質ゾルおよび核は蛍光性であり、切片中のヌードマウスの皮膚の実
質的に全ての細胞中に浸透したことを示していた。染色パターンは、小胞および
小胞間の両方への予期しない輸送と一致した。さらに、陽性の細胞は、乳頭およ
び網状真皮において明らかであった。対照的に、ビオチン単独、またはリン酸緩
衝化生理食塩水単独で処置されたマウスにおいて染色は明らかではなかった。
【０１６７】 （実施例３） （ヌードマウス上に移植された正常ヒト皮膚へのＤ−アルギニンのビオチン化
ポリマーの浸透） 種々の濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、ビオチンがアミノカプロン酸スペーサ
ーを使用してアミノ末端に共有結合されているＤ−アルギニンのヘプタマー（ｂ
ｉｏ ｒ７）（ＰＢＳに溶解されている）を、ＳＣＩＤマウスの背部上のヒト包
皮移植片に塗布した（例えば、Ｄｅｎｇら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏｌ．１５：１３８８−１３９１；Ｋｈａｖａｒｉら（１９９７）Ａｄ
ｖ．Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．１５：２７−３５；ＣｈｏａｔｅおよびＫｈａｖａｒｉ
（１９９７）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：８９５−９０１を参
照のこと）。サンプル（１００μｌ）を、賦形剤中の液体として塗布し、Ｖａｓ
ｅｌｉｎｅTMバリアにより分散を防止して、そして１５分間浸透させた。この期
間の最後にこの動物を殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）に包埋
させ、そして凍結した。凍結した切片を、低温槽を使用してカットし、スライド
上に集め、そして蛍光性標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で実施例１に記載のように染色
した。スライドを蛍光顕微鏡で分析した。
【０１６８】 （結果） ヌードマウスおよび正常マウス由来の皮膚と同様に、ビオチン化アルギニンヘ
プタマーは、ヒト皮膚の表皮中に、および表皮を横切って、そして真皮中にわた
っていた。この領域の全ての細胞の細胞質ゾルおよび核は蛍光性であり、上皮お
よび真皮の中に、ならびに上皮および真皮全体に浸透したことを示していた。強
い染色が、２０倍および４０倍の倍率で見られた。染色パターンは、小胞および
小胞間の両方への予期しない輸送と一致した。さらに、陽性の細胞は、乳頭およ
び網状真皮において明らかであった。対照的に、ビオチン単独、またはリン酸緩
衝化生理食塩水単独で処置されたマウスにおいて染色は明らかでなく、そしてビ
オチン化アルギニンペンタマー結合体では、低倍率または高倍率のいずれでもほ
とんど染色が観察されなかった。
【０１６９】 （実施例４） （プラスチックラップまたはローション賦形剤を使用する、Ｄ−アルギニンの
ビオチン化ポリマーのヌードマウスの皮膚への増加した浸透） 種々の濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、ビオチンがアミノカプロン酸スペーサ
ーを使用してアミノ末端に共有結合されているＤ−アルギニンのヘプタマー（ｂ
ｉｏ ｒ７）をＰＢＳに溶解し、そして等容積のＬｕｂｒｉｄｅｒｍTMと混合し
た。ローション剤混合物を、ヌードマウスの背部に塗布し、そして３０分間、６
０分間、および１２０分間浸透させた。あるいは、サンプル（１００μｌ）を、
賦形剤を含まない液体として塗布し、そしてＶａｓｅｌｉｎｅTMで密封されたサ
ンプル上にプラスチックラップを巻くことにより蒸発を防止した。これらのサン
プルを３０分間、６０分間および１２０分間浸透させた。この期間の最後にこの
動物を殺し、皮膚の関連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）に包埋し、そして凍結
した。凍結した切片を、低温槽を使用してカットし、スライド上に集め、そして
蛍光性標識化ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，
Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）で実施例１に記載のように染色した。スライド
を蛍光顕微鏡検査で分析した。
【０１７０】 （結果） ローション剤およびプラスチックラップの両方は、賦形剤のない染色と比較し
て増加した取り込みをもたらした。ローション剤は、結合体の取り込みの増強に
おいてプラスチックラップよりも効果的であった。ビオチン化アルギニンペンタ
マーは、いくつかの皮膚層中に、およびいくつかの皮膚層を横切り、そして表皮
細胞層の細胞質ゾルおよび核に、小胞にかつ小胞間に到達した。さらに、陽性の
細胞は、乳頭および網状真皮において明らかであった。
【０１７１】 （実施例５） （Ｄ−アルギニンのビオチン化ペンタマー、ヘプタマーおよびノナマーに結合
体化したシクロスポリンの、ヌードマウスの皮膚への浸透) （方法） Ａ．シクロスポリンの送達増強輸送体への連結 １．α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製 α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体を、図１に示されるように調製し
た。シクロスポリンＡ（１５２．７ｍｇ、１２７μｍｏｌ）および無水クロロ酢
酸（２２１．７ｍｇ；１３００μｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下で乾燥フラスコ中に
入れた。ピリジン（１．０ｍＬ）を添加し、そしてこの溶液を５０℃（油浴）に
加熱した。１６時間後、反応系を室温まで冷却して、そして水（４．０ｍＬ）で
クエンチした。生じた懸濁液をジエチルエーテル（Σ１５ｍＬ）で抽出した。合
わせた有機層を、ＭｇＳＯ4で乾燥した。濾過し、そして溶媒を減圧下でエバポ
レーションして黄色油状物とし、これをシリカゲルのフラッシュクロマトグラフ
ィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：４０％〜８０％）で精製し、１３６ｍｇ
（１０６．４μｍｏｌ、８３％）の所望の生成物を得た。 ２．輸送体分子へのカップリング システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体へのカ
ップリングのための一般的手順を、図２に示す。
【０１７２】 ａ．標識化ペプチド シクロスポリンＡ誘導体および標識化ペプチド（１当量）を、ＤＭＦ（約１０
ｍｍｏｌのシクロスポリンＡ誘導体／ＤＭＦ１ｍＬ）にＮ2雰囲気下で溶解した
。ジイソプロピルエチルアミン（１０当量）を、添加し、そして室温での攪拌を
全ての出発物質が消費されるまで（通常１６時間後）続けた（図３）。溶媒を減
圧下で除去し、そして粗製反応生成物を、水に溶解し、そして逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）（溶離液：水／ＭｅＣＮ*ＴＦＡ）で精製し
た。生成物を、以下の収率で得た： Ｂ−ａｃａ−ｒ５−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｏ−アシル−シクロスポリン
Ａ：４７％ Ｂ−ａｃａ−ｒ７−Ｃｙｓ−Ｏ−アシル−シクロスポリンＡ：４３％ Ｂ−ａｃａ−ｒ９−Ｃｙｓ−Ｏ−アシル−シクロスポリンＡ：３４％ Ｂ−ａｃａ−Ｃｙｓ−Ｏ−アシル−シクロスポリンＡ：５５％ ｂ．非標識化ペプチド ペプチド（３４．７ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）およびシクロスポリンＡ誘導体
（１９．６ｍｇ、１５．３μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）にＮ2雰囲気下
で溶解した（図４）。ジイソプロピルエチルアミン（１９．７ｍｇ、１５３μｍ
ｏｌ）を、添加し、そして室温での攪拌を続けた。１２時間後、溶媒を減圧下で
除去した。粗製物を水に溶解し、そしてＲＰ−ＨＰＬＣ（溶離液：水／ＭｅＣＮ * ＴＦＡ）で精製して純粋な生成物（２４．１ｍｇ、６．８ｍｍｏｌ、４４％）
を得た。
【０１７３】 Ｂ．皮膚を横切る輸送の分析 種々の濃度（１ｍＭ〜１００μＭ）の、Ｄ−アルギニンのビオチン化ペンタマ
ー、ヘプタマー、またはノナマー（ｂｉｏ ｒ５、ｂｉｏ ｒ７、またはｂｉｏ
ｒ９）のいずれかに結合体化したシクロスポリン（ＰＢＳに溶解）を、ヌード
マウスの背部に塗布した。サンプル（１００μｌ）を賦形剤中の液体として塗布
し、そしてＶａｓｅｌｉｎｅTMバリアにより分散を防止し、そして３０分間、６
０分間および１２０分間浸透させた。この期間の最後に、動物を殺し、皮膚の関
連切片を切除し、封入剤（ＯＣＴ）中に包埋しそして凍結した。凍結した切片を
、低温槽を使用してカットし、スライド上に集め、そして蛍光性標識化ストレプ
トアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｂｕｒｌｉｎｇａｍ
ｅ，ＣＡ）で実施例１に記載のように染色した。スライドを蛍光顕微鏡検査で分
析した。
【０１７４】 （結果） シクロスポリンの、Ｄ−アルギニンのビオチン化ヘプタマーおよびノナマーと
の結合体は、効果的に、ヌードマウスの皮膚の表皮内に、および表皮を横切って
、そして真皮内に進入した。対照的に、ペンタマーとアルギニンおよびシクロス
ポリンとの間の結合体を使用して、ほとんど取り込みは見られず、そしてＰＢＳ
コントロールでは染色が全く見られなかった。この領域における全ての細胞の細
胞質ゾルおよび核は、蛍光性であり、表皮および真皮内への、ならびに表皮およ
び真皮を通る浸透を示した。染色パターンは、小胞および小胞間の両方の予期し
なかった輸送と一致していた。さらに、陽性細胞は、乳頭および網状真皮におい
て明らかであった。これらの結果は、十分なグアニジニル基が送達増強輸送体に
含まれる場合にのみ顕著な取り込みを示す。
【０１７５】 （実施例６） （Ｄ−アルギニンヘプタマーがヒト皮膚に浸透し得ることの実証） ヒトの皮膚とマウスの皮膚とは、多くの点で有意に異なり、ヒト表皮の方が、
かなり厚い。Ｄ−アルギニンヘプタマー／シクロスポリンＡ（ｒ７ ＣｓＡ）結
合体もまたヒト皮膚に浸透し得るか否かを決定するために、ビオチンｒ７ Ｃｓ
Ａを、ＳＣＩＤマウスの背部上に移植された全層ヒト皮膚に塗布した。マウスの
皮膚のように、結合体化シクロスポリンＡは、ヒト表皮および真皮に浸透した。
ビオチン化ペプチド単独に曝露した組織における細胞の細胞質ゾルおよび核の両
方において蛍光が観察されたが、ビオチンｒ７ ＣｓＡで染色された切片におい
て、蛍光の大部分は、細胞質ゾルであり、ｒ７ ＣｓＡがシクロスポリンＡの公
知の細胞質標的に結合することと一致した。
【０１７６】 （実施例７） （シクロスポリンＡ−輸送体結合体が真皮におけるＴ細胞に進入することの実
証） （方法） 放出可能なＲ７−ＣｓＡ結合体によるＩＬ−２分泌の阻害。ジャーカット細胞
（５×１０4）を、種々の濃度の非放出性または放出可能なＲ７−ＣｓＡ結合体
またはＣｓＡと共に一晩３７℃でインキュベートして、ＰＭＡおよびイオノマイ
シン（ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ）で刺激する前にＣｓＡの活性形態の放出を可能にし
た。続いて、１０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）
および１μＭのイオノマイシン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，
ＣＡ）の添加により、Ｔ細胞を刺激してＩＬ−２を産生させる。培養物を一晩３
７℃でインキュベートし、そして上清を集め、そしてＩＬ−２を蛍光性ＥＬＩＳ
Ａを使用して測定した。手短には、プレートを４μｇ／ｍｌの抗ヒトＩＬ−２抗
体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）でコーティング
し、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１時間室温でブロックし、洗浄し、そして上清
を添加し、そして１時間インキュベートした。培地を除去し、そしてビオチン化
抗ヒトＩＬ−２（１．６μｇ／ｍｌ）を１時間添加した。このプレートを洗浄し
、次いでユーロピウム標識化ストレプトアビジン（０．０４ｎｇ／ｍｌ）を１時
間添加した。さらなる洗浄の後、増強溶液を添加し、そして生じた蛍光をＷａｌ
ｌａｃプレートリーダー（Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を使用
して測定した。
【０１７７】 （結果） ビオチン化Ｄ−アルギニンヘプタマー−シクロスポリン（ｒ７ ＣｓＡ）結合
体が、炎症性皮膚内の浸潤性Ｔ細胞にインビボで到達するか否かを決定するため
に、ビオチンｒ７ ＣｓＡを、実験的に誘導された接触皮膚炎を有するマウスの
背部上の炎症部位に塗布した。炎症性皮膚を、ローダミン標識化ヤギ抗マウスＣ
Ｄ３で染色して、Ｔ細胞を局在化し、そしてフルオレセイン標識化ストレプトア
ビジンで染色してビオチンｒ７ ＣｓＡを局在化した。ビオチンｒ７ ＣｓＡは
、他の炎症性細胞および内在する線維芽細胞をおそらく表す種々の他の細胞に加
えて、この組織内の全てのＣＤ３［＋］Ｔ細胞において見出された。これらのデ
ータは、ビオチンｒ７ ＣｓＡが、炎症性皮膚に浸透して、鍵となる標的Ｔリン
パ球に到達するということを示す。
【０１７８】 （実施例８） （アルギニンおよびＣｓＡの短いオリゴマーの放出可能結合体の合成、インビ
トロ活性およびインビボ活性） シクロスポリンＡの２級アルコールの改変は、生物学的活性の有意な損失をも
たらす。例えば、Ｒ．Ｅ．Ｈａｎｄｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２６，５４４−７（１９８４）を参照のこと。結果として、遊離のシクロスポ
リンＡのその結合体からの細胞への輸送後の放出を確実にするために、シクロス
ポリンＡをオリゴ−アルギニン輸送体に、ｐＨ感受性リンカーを介して、図１０
に示されるように結合体化した。得られた結合体は、酸性ｐＨで安定であるが、
７より大きいｐＨでは、シクロスポリンＡに隣接するカルボニルへの遊離アミン
の付加を含む分子内環化を受け（図６）、これは、非改変シクロスポリンＡの放
出をもたらす。
【０１７９】 放出可能な結合体の設計における別の改変は、輸送体におけるＤ−アルギニン
（ｒ）ではなくＬ−アルギニン（Ｒ）の使用であった。オリゴ−Ｄ−アルギニン
輸送体を組織学的実験に使用して、結合体の最大の安定性および従って蛍光によ
るその位置の決定の精度を確実にしたが、Ｌ−アルギニンのオリゴマーを、その
生物学的半減期を最小にするために放出可能な結合体の設計に組み込んだ。その
設計と一致して、生じた放出可能な結合体が、酸性ｐＨで安定であるが、血清の
非存在下での生理学的ｐＨで不安定であることを示した。この放出可能なシクロ
スポリンＡ結合体のｐＨ７．４のＰＢＳ中の半減期は９０分であった。
【０１８０】 （結果） インビトロでＰＭＡおよびイオノマイシンで刺激されたヒトＴ細胞株（ジャー
カット）によるＩＬ−２分泌を阻害することにより、シクロスポリンＡの放出可
能なグアニジノ−ヘプタマー結合体が生物学的に活性であることが示された。Ｒ
．Ｗｉｓｋｏｃｉｌら，ＪＩｍｍｕｎｏｌ １３４，１５９９−６０３（１９８
５）を参照のこと。この結合体をＰＭＡ／イオノマイシン添加の１２時間前に添
加し、そして用量依存阻害が放出可能Ｒ７ ＣｓＡ結合体により観察された。ｔ
−Ｂｏｃ保護基の保持が放出可能結合体と異なる非放出性アナログ（図６）を用
いると、この阻害は観察されなかった。このｔ−Ｂｏｃ保護基は、環化および結
果としての活性薬物の放出を防止する。放出可能Ｒ７シクロスポリン結合体のＥ
Ｃ50は、アルコール中に溶解されて放出可能結合体と同時に添加されたＣｓＡよ
りも約２倍高かった。
【０１８１】 放出可能Ｒ７ ＣｓＡ結合体を、接触皮膚炎のマウスモデルを使用して機能的
活性についてインビボでアッセイした。１％の放出可能Ｒ７ ＣＳＡ結合体での
処置は、耳の炎症における７３．９％±４．０の減少をもたらした（図７）。処
置していない耳では炎症の減少が見られず、このことは、処置された耳において
見られた効果が全身的でなく局部的であることを示す。０．１％および０．０１
％のＲ７−ＣｓＡで処置されたマウスの耳においてより少ない阻害（それぞれ６
４．６％±４．０および４０．９％±３．３）が観察されたことは、この効果が
適定可能であることを示す。フッ素化コルチコステロイド陽性コントロールによ
る処置は、耳腫脹の減少（３４．１％±６．３）をもたらしたが、これは、０．
１％の放出可能Ｒ７ ＣｓＡについて観測された減少より有意に少なかった（図
７）。改変されていないシクロスポリンＡ、ビヒクルのみ、Ｒ７、または非放出
性Ｒ７ ＣｓＡで処置されたマウスのいずれにおいても、炎症の減少は観察され
なかった。
【０１８２】 （実施例９） （銅およびガドリニウム−ＤＴＰＡ−ｒ７錯体のヌードマウスの皮膚への浸透
） （方法） １．金属錯体の調製 工程１−銅−ジエチレントリアミン五酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製 炭酸銅（１０ｍｍｏｌ）およびジエチレントリアミン五酢酸（１０ｍｍｏｌ）
を水（１５０ｍＬ）に溶解した（図８）。１８時間後、この溶液を遠心分離して
固体を除いた。青色溶液をデカンテーションし、そして凍結乾燥して青色粉末を
得た（収率＞９０％）。
【０１８３】 （工程２−ＤＴＰＡ輸送体の調製） Ｃｕ−ＤＴＰＡを、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｅｐｔ
ｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（ＡＢＩ ４３３Ａ）を用いて、アミノカプロ
ン酸スペーサーを介して、輸送体に連結した（図９）。この物質を、トリフルオ
ロ酢酸（ＴＦＡ）（４０ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（１００μＬ）および
フェノール（１００μＬ）で１８時間処理して、樹脂から切断した。この樹脂を
ろ過して、このペプチドをジエチルエーテル（８０ｍＬ）を添加することによっ
て沈殿させた。溶液を遠心分離して、そして、溶媒を取り去った。粗固体を、逆
相ＨＰＬＣによって水／アセトニトリル勾配を用いて精製した。ＴＦＡでの処理
は、再挿入されることが必要なＣｕ2+イオンの喪失を生じた。
【０１８４】 ＤＴＰＡ−ａｃａ−Ｒ７−ＣＯ２Ｈ（１０ｍｇ、０．００６３ｍｍｏｌ）およ
び硫酸銅（１．６ｍｇ、０．００６３ｍｍｏｌ）を、水（１ｍＬ）に溶解した。
１８時間穏やかにかき混ぜて、そして、凍結乾燥し、白色粉末（１０ｍｇ）とし
て生成物を得た。
【０１８５】 （２．皮膚を横断する輸送の分析） 金属ジエチレントリアミン５酢酸（ＤＴＰＡ）複合体を、１８時間水中で、等
モル量の金属塩を、ＤＴＰＡと混合することによって形成した。この時間の最後
に、溶液を遠心分離し、凍結し、そして、凍結乾燥した。乾燥粉末を、質量分光
測定によって特徴付け、そして、固相ペプチド合成において使用した。この金属
ＤＴＰＡ複合体を、ペプチド合成において使用される固相樹脂にまだ付着されて
いる、Ｄ−アルギニンまたはＬ−アルギニンのポリマーに付着させた。この金属
−ＤＴＰＡ複合体を、アミノカプロン酸スペーサーを用いて付着させた。固相ペ
プチド合成技術をトリフルオロ酢酸におけるペプチド−ＤＴＰＡ−金属複合体の
切断が、金属を放出したことを除いて、実施例１に記載した。この金属を、ＨＰ
ＬＣ精製およびペプチド−ＤＴＰＡ複合体の凍結乾燥の後に置換した。この金属
の置換は、等モル量の金属塩と、ペプチド−アミノカプロン酸−ＤＴＰＡ複合体
とのインキュベーション、および後に続く凍結乾燥を含んだ。
【０１８６】 様々な濃度（１μＭ〜１ｍＭ）のＣｕ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体を、１
５、３０および４５分間、ヌードマウスの腹腔領域に適用した。コントロールと
して、Ｃｕ−ＤＴＰＡ複合体の等モル量を、腹腔領域上にスポットした。インキ
ュベーション期間の終わりに、サンプルを簡単に拭き取り、そして、濃青色は、
Ｃｕ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体がスポットされた皮膚で明らかであったが
、Ｃｕ−ＤＴＰＡのみがスポットされた皮膚では明らかではなかった。１ｍＭの
適用の場合では、可視青色色素が、３日間見出され、時間と共に減少したが、全
期間中明らかであった。
【０１８７】 様々な濃度（１μＭ〜１ｍＭ）のＧｄ−ＤＴＰＡ−ａｃａ−ｒ７複合体を、１
００μｌ中のＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に注射した。Ｇｄの分布を、磁気共鳴
画像化を用いてリアルタイムで観察した。染色の分布は、肝臓、膵臓、腎臓、お
よび心臓に入る血流全体で明らかであった。ウサギの頸動脈に注射される場合、
色素は、血液脳関門にわたり見出される。
【０１８８】 （実施例１０） （Ｄ−アルギニンのビオチン化５量体、７量体、および９量体に結合体化した
ヒドロコルチゾンのヌードマウスの皮膚への浸透） （方法） （Ａ．送達増強輸送体へのヒドロコルスチンの連結） （工程１−クロロ酢酸無水物を使用するヒドロコルチゾンのアシル化） ピリジン（５ｍＬ）中におけるヒドロコルチゾン（２００ｍｇ、０．５５ｍｍ
ｏｌ）およびクロロ酢酸無水物（１１３ｍｇ、０．６６ｍｍｏｌ）の溶液を、室
温で２時間撹拌した（図１０）。溶媒を蒸発させ、そして、粗生成物を、５０％
酢酸ヘキサン／酢酸エチルを溶出として使用して、シリカ上でクロマトグラフィ
ーにかけた。単離された生成物は、白色固体（１３９ｍｇ、５８％）であった。
【０１８９】 （工程２−輸送体への連結） ヒドロコルスチン（０．０１３７ｍｍｏｌ）のクロロ酢酸エステルの溶液、ジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）（１ｍＬ）中にシステイン残基（０．０１３７）
およびジイソプロピルエリレンアミン（ＤＩＥＡ）（０．０２７４ｍｍｏｌ）を
含む輸送体を、１８時間室温で撹拌した（図１１）。この物質を水／アセトニト
リル勾配を用いて、逆相ＨＰＬＣを通して精製し、凍結乾燥して白色粉末を得た
。
【０１９０】 ｒ５結合体−１２ｍｇ獲得（２９％単離収率） ｒ７結合体−２２ｍｇ獲得（５５％単離収率） Ｒ７結合体−１３ｍｇ獲得（３３％単離収率） （Ｂ．皮膚を横断する輸送の分析） ＰＢＳ中で溶解されたＤ−アルギニン（ｂｉｏ ｒ５、ｒ７、またはｒ９）ビ
オチン化５量体、７量体、または９量体のいずれかに結合体化した様々な濃度（
１ｍＭ〜１００μＭ）のヒドロコルチゾンを、ヌードマウスの背中に適用した。
サンプル（１００μｌ）を、賦形剤内の液体として適用し、そして、Ｖａｓｅｌ
ｉｎｅTM障壁によって分散することを妨げ、３０、６０、および１２０分間浸透
することを可能にした。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を
切除し、マウント培地（ＯＣＴ）で包埋し、凍結させた。凍結切片を、クリオス
タットを用いて解離し、スライド上に収集し、そして、実施例１に記載されるよ
うに、蛍光標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡によ
って分析した。
【０１９１】 （結果） Ｄ−アルギニンのビオチン化７量体とヒドロコルチゾンとの結合体は、ヌード
マウスの皮膚の表皮の中へおよび表皮を横切って、そして、皮膚の真皮の中へ効
率良く入った。対照的に、アルギニンの５量体とヒドロコルジゾンとの間での結
合体では、ほとんど取り込みが見られず、そして、ＰＢＳコントロールでは、全
く染色が見られなかった。視野における全ての細胞の細胞質および核は蛍光性で
あり、表皮および真皮中に浸透し、そして、表皮および真皮を通ることを示した
。この染色パターンは、濾胞性および内部濾胞性の両方であった未予知の輸送と
一致していた。さらに、陽性細胞は、乳頭状および網状真皮において明らかであ
った。これらの結果は、十分なグアニジル基が、送達増強輸送体に含まれる場合
のみ、目立った取り込みを示した。
【０１９２】 （実施例１１） （Ｄ−アルギニンのビオチン化５量体、７量体、および９量体に結合体化した
タキソールのヌードマウスの皮膚への浸透） （方法） （１．Ｃ−２’活性化タキソール誘導体のビオチン標識ペプチドへの結合体化
） （Ｃ−２’誘導体の合成） タキソール（４８．７ｍｇ、５７．１μｍｏｌ）を、Ｎ2大気下で、ＣＨ2Ｃｌ 2 （３．０ｍＬ）中に溶解した。溶液を０℃に冷却した。ベンジル−（ｐ−ヒド
ロキシ安息香酸）（２００ｍｍｏｌ（２．０ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2中）、ベンジル−
（ｐ−ヒドロキシ安息香酸）およびジホスゲンから新しく調製した）のクロロホ
ルムのストック溶液を、０℃で添加し、そして、その温度での撹拌を５時間続け
、その後、溶液を室温まで温めた（図１２）。撹拌をさらに１０時間続けた。溶
媒を減圧中で除去し、そして、粗物質を、シリカゲル上での迅速なクロマトグラ
フィーによって精製し（溶出：ＥｔＯＡｃ／ヘキサン３０％〜７０％）、所望の
タキソールＣ−２’炭酸塩を生成した（３６．３ｍｇ、３２．８μｍｏｌ、５７
．４％）。
【０１９３】 （ビオチン標識ペプチドへのカップリング） ビオチン化標識ペプチドへのカップリング手順を図１３に示す。タキソール誘
導体およびビオチン標識ペプチド（１．２等量）を、Ｎ2雰囲気下で、ＤＭＦ中
（約１０μｍｏｌ／ｍＬ ＤＭＦ）で溶解した。ジイソプロピルエチレンアミン
（ＤＭＦ中１．２等量）およびＤＭＡＰ（ＤＭＦ中０．３当量）のストック溶液
を添加し、そして、全開始物質が消費されるまで室温での撹拌を続けた。１６時
間後、溶媒を減圧下で除去した。粗反応物混合物を水中で溶解し、そして、ＲＰ
−ＨＰＬＣによって精製し（溶出：水／ＭｅＣＮ*ＴＦＡ）、示される収率の結
合体を生成した： Ｂ−ａｃａ−ｒ５−Ｋ−タキソール：３．６ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、２０％
。
【０１９４】 Ｂ−ａｃａ−ｒ７−Ｋ−タキソール：９．８ｍｇ、３．０１ｍｍｏｌ、４４％
。
【０１９５】 Ｂ−ａｃａ−ｒ９−Ｋ−タキソール：１９．４ｍｇ、５．１ｍｍｏｌ、６７％
。
【０１９６】 （未標識Ｃ−２’カルバメート：） タキソール誘導体（１２．４ｍｇ、１１．２μｍｏｌ）および未標識ペプチド
（２７．１ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下で、ＤＭＦ（１．５ｍＬ
）中で溶解した（図１４）。ジイソプロピルエチレンアミン（１．７ｍｇ、１３
．４μｍｏｌ）をＤＭＦ中にストック溶液として添加して、次いで、ＤＭＦ中に
ストック溶液としてＤＭＡＰ（０．６８ｍｇ、５．６μｍｏｌ）を添加した。室
温での撹拌を、全ての開始物質が消費されるまで続けた。１６時間後、溶媒を減
圧下で除去した。粗物質を水中で溶解し、そして、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製
し（溶出：水／ＭｅＣＮ*ＴＦＡ）、所望の生成物を生成した（１６．５ｍｇ、
５．９μｍｏｌ、５３％）。
【０１９７】 （他のＣ−２’結合体） タキソール誘導体（８．７ｍｇ、７．８５μｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（２．０ｍ
Ｌ）中で溶解した。Ｐｄ／Ｃ（１０％、４．０ｍｇ）を添加し、反応フラスコを
Ｈ2を５回使用してパージした（図１５Ａ）。水素雰囲気下で撹拌を７時間続け
た。Ｐｄ／Ｃをろ過し、そして、溶媒を減圧下で除去した。この方法で獲得され
た粗物質（６．７ｍｇ、６．５８μｍｏｌ、８４％）は、純粋であって、次の工
程でさらなる精製なしで使用され得た。
【０１９８】 遊離酸タキソール誘導体（１８．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（
２．０ｍＬ）中で溶解した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（４．３ｍｇ、２
１．３μｍｏｌ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（０．１ｍＬ）中にストック溶液として添加し
た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．０ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）をＤＭＦ
（０．１ｍＬ）にストック溶液として添加した（図１５Ｂ）。室温で撹拌するこ
とを１４時間続けた。この溶媒を減圧下で除去し、そして得られた粗物質をシリ
カゲルのフラッシュクロマトグラフィーによって精製し（溶出：ＲｔＯＡｃ／ヘ
キサン４０％〜８０％）、所望の生成物を得た（１３．６ｍｇ、１２．２μｍｏ
ｌ、６９％）。
【０１９９】 活性化タキソール誘導体（１４．０ｍｇ、１２．６μｍｏｌ）およびペプチド
（３０．６ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下で、ＤＭＦ（３．０ｍＬ
）中で溶解した（図１５Ｃ）。ストック溶液としてジイソプロピルエチレンアミ
ン（１．９４ｍｇ、１５．１μｍｏｌ）を、ＤＭＦ中（０．１ｍＬ）に添加して
、次いで、０．１ｍＬのＤＭＦ中にストック溶液としてＤＭＡＰ（０．７６ｍｇ
、６．３μｍｏｌ）を添加した。室温での撹拌を、全ての開始物質が消費される
まで続けた。２０時間後、溶媒を減圧下で除去した。粗物質を水中で溶解し、そ
して、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し（溶出：水／ＭｅＣＮ*ＴＦＡ）、１：６
の割合（それぞれ、炭酸対カルバミン酸）で２種類の示されるタキソール結合体
を生成した。
【０２００】 （２．皮膚を横断する輸送の分析） ＰＢＳ中で溶解されたＤ−アルギニン（ｂｉｏ ｒ５、ｒ７、またはｒ９）の
ビオチン化５量体、７量体、または９量体のいずれかに結合体化した様々な濃度
（１ｍＭ〜１００μＭ）のタキソールを、ヌードマウスの背中に適用した。サン
プル（１００μｌ）を、賦形剤内の液体として適用し、そして、Ｖａｓｅｌｉｎ
ｅTM障壁によって分散することを妨げ、３０分、６０分、および１２０分間浸透
することを可能にした。この期間の終わりに、動物を屠殺し、皮膚の関連切片を
切除し、マウント培地（ＯＣＴ）で包埋し、凍結させた。凍結切片を、クリオス
タットを用いて切り出し、スライド上に収集し、そして、実施例１に記載される
ように、蛍光標識したストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）で染色した。スライドを、蛍光顕微鏡に
よって分析した。
【０２０１】 （結果） Ｄ−アルギニンのビオチン化７量体および９量体とタキソールの結合体は、ヌ
ードマウスの皮膚の表皮の中へおよび表皮を横断して、そして、皮膚の真皮の中
へ効率的に入った。対照的に、アルギニンの５量体とタキソールとの間での結合
体では、ほとんど取り込みが見られず、そして、ＰＢＳコントロールでは、全く
染色が見られなかった。視野における全ての細胞の細胞質および核が蛍光性であ
り、表皮および真皮中に浸透し、そして、表皮および真皮を通ることを示す。こ
の染色パターンは、濾胞性および内部濾胞性の両方であった未知の輸送と一致し
ていた。さらに、陽性細胞は、乳頭状および網状真皮において明らかであった。
これらの結果は、十分なグアニジル基が、送達増強輸送体に含まれる場合のみ、
目立った取り込みを示す。
【０２０２】 （実施例１２） （タキソールおよび送達増強輸送体のｐＨ放出可能なリンカーとの結合体） この実施例は、生理学的ｐＨに曝される際、薬物を送達増強輸送体から放出す
るリンカーによって、薬物に連結した送達増強輸送体を有するプロドラッグを合
成するための一般的なストラテジーの使用を実証する。一般的には、薬物上の適
切な部位は、α−クロロアセチル残基を有するように誘導化される。次に、塩素
が保護されていないアミンを保有するシステイン残基のチオールと置換される。
このスキームを、図１６に示す。
【０２０３】 （方法） （タキソール−２’−クロロアセチルの合成） タキソール（８９．５ｍｇ、１０４．９μｍｏｌ）を、ＣＨ2Ｃｌ2（３．５ｍ
Ｌ）中で溶解した。Ｎ2雰囲気下で、溶液を０℃以下に冷却した。α−クロロ酢
酸無水物（１９．７ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を添加し、ＤＩＥＡ（１４．８
ｍｇ、１１５．４μｍｏｌ）を続いて添加した。溶液を室温に温めた。薄層クロ
マトグラフィー（ｔｌｃ）分析が、開始物質の完全な消費を示した後、溶媒を減
圧下で除去し、そして、粗物質をシリカゲルでフラッシュクロマトグラフィーに
よって精製し（溶出：ＥｔＯＡＣ／Ｈｅｘ２０％〜５０％）、所望の物質を得た
（９９．８ｍｇ、定量的）（図１７）。
【０２０４】
【化１６】 （タキソールの送達増強輸送体への連結） ペプチド（４７．６ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を、Ｎ2雰囲気下でＤＭＦ（１
．０ｍＬ）中で溶解した。ＤＩＥＡ（２．８ｍｇ、２２．４μｍｏｌ）を添加し
た。ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のタキソール−２’−クロロ酢酸（２０．８ｍｇ、
２２．４μｍｏｌ）の溶液を添加した。室温での撹拌を６時間続けた。０．１％
ＴＦＡ（１．０ｍＬ）を含む水を添加し、サンプルを凍結し、溶媒を凍結乾燥し
た。粗物質をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した（溶出：水／ＭｅＣＮ＊０．１％
ＴＦＡ：８５％〜１５％）。この反応のスキームを図１８に示す。
【０２０５】 （関連結合体の合成） 上記に概要を述べた結合体を用いて、示される３つのさらなる結合体を合成し
た。
【０２０６】 （細胞傷害性アッセイ） タキソール結合体を、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，
５−ジフェニル−テトラゾリウム−ブロミド（ＭＴＴ）染色還元における細胞傷
害性について試験した。結果（図２０に示す）は、易ｐＨ放出性のリンカーを有
するｒ７に結合したタキソール（ＣＧ １０６２；図１９に示される構造におい
てＲ＝Ａｃ）は、タキソール単独、または難ｐＨ放出性可能なリンカーを有する
ｒ７に結合されたタキソール（ＣＧ １０４０；図１９に示される構造において
Ｒ＝Ｈ）のいずれかよりも、有意により細胞障害性であることを示す。
【０２０７】 （実施例１３） （Ｔａｔ49〜57に由来する蛍光標識ペプチドの構造−機能関係） （方法） （概要）Ｒｉｎｋアミド樹脂およびＢｏｃ2ＯをＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍより
購入した。ジイソプロピルカルボジイミド、ブロモ酢酸、フルオレセインイソチ
オシアネート（ＦＩＴＣ−ＮＣＳ）、エチレンジアミン、１，３−ジアミノプロ
パン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ジアミノヘキサン、トランス−１，６
−ジアミノシクロヘキサン、およびピラゾール−１−カルボキシアミジンを全て
Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）より購入した。全ての溶媒および他の試薬を、販売
元より購入し、そして、さらなる精製なしで使用した。モノ−Ｂｏｃアミンを、
文献の手順（クロロホルム中で、１０当量のジアミンのおよび１当量のＢｏｃ2
Ｏ、次いで未反応のジアミンを除去するための水でのワークアップ）を用いて、
市販ジアミンより合成した（３４）。
【０２０８】 （Ｎ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−１，６−トランス−ジアミノシクロヘ
キサン）
【０２０９】
【化１７】 ；ＥＳ−ＭＳ（Ｍ＋１）計算値２１５．１７、実測値２１５．２２。
【０２１０】 （ペプチド合成のための一般的な手順）Ｔａｔ49〜57（ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）
（Ｔａｔ49〜57由来の短縮化およびアラニン置換ペプチド）、アンテナペディア 43〜58 （ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）、ならびにアルギニン（Ｒ５〜Ｒ
９）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ９）のホモポリマーを、ペプチドカップリ
ング試薬としてＨＡＴＵを用いる標準的な固相Ｆｍｏｃ化学（３５）を使用して
、自動ペプチド合成機（ＡＢＩ４３３）により調製した。フルオレセイン部分を
１２時間ＤＭＦ（１０ｍＬ）におけるフルオレセインイソチオシアネート（１．
０ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（５ｍｍｏｌ）を使用して樹脂結合ペプチド（１．
０ｍｍｏｌ）を処理することによって、アミノヘキサン酸スペーサーを介して付
着させた。樹脂からの切断を、９５：５ ＴＦＡ／トリイソプロピルシランを用
いて達成した。減圧下における溶媒の除去は、冷エーテルで粉砕した原油を与え
る。従って、得られた重油混合物を遠心分離し、デカンテーションによってエー
テルを除去し、そして、得られたオレンジ色の固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％
ＴＦＡ中、Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ）によって精製した。生成物を、凍結乾燥によって
単離し、そして、エレクトロスプレー質量分析によって特徴付けた。ペプチドの
純度は、分析用逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中、Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ）によって
決定される場合、９５％を超えた。
【０２１１】 合成された全てのペプチドおよびペプトイドは、アミノヘキサン酸スペーサー
のアミノ基に共有結合されるフルオレセイン部分（ＦＩ）を有するＮ末端アミノ
基に付着されたアミノヘキサン（ａｈｘ）酸部分を含む。全てのペプチドおよび
ペプトイドのカルボキシル末端は、カルボキシアミドである。
【０２１２】 （細胞の取り込みアッセイ）アルギニンホモポリマーおよびグアニジン置換ペ
プトイドをそれぞれ、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ ７．２）中で溶解し、そして、それ
らの濃度を４９０ｎｍ（ε＝６７，０００）におけるフルオレセインの吸収によ
って決定した。濃度を決定するためのこの方法の精度は、選択されたサンプルの
秤量およびＰＢＳ緩衝液の既知の量においてそれらを溶解することによって確立
される。ＵＶ分光法によって決定された濃度は、手動で秤量された量に相関する
。ジャーカット細胞（ヒトＴ細胞株）、マウスＢ細胞（ＣＨ２７）、またはヒト
ＰＢＬ細胞を、１０％胎仔ウシ血清およびＤＭＥＭ中で増殖し、そして、これら
のそれぞれを細胞の取り込み実験について使用した。様々な量のアルギニンおよ
びグアニジン置換ペプトイドのオリゴマーを、２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（組み合わせ
て総量２００μＬ）中の約３×１０6細胞に添加し、そして、マイクロタイター
プレート（９６ウェル）に配置し、そして、２３℃または４℃で、様々な時間で
インキュベートした。マイクロタイタープレートを遠心分離し、そして、細胞を
単離し、ＰＢＳ（３×２５０μＬ）で洗浄し、５分間３７℃で０．０５％トリプ
シン／０．５３ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートし、冷ＰＢＳで洗浄し、そして
、０．１％ヨウ化プロピジウムを含むＰＢＳ中で再懸濁した。この細胞を蛍光フ
ローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を
用いて分析し、そして、ヨウ化プロピジウムを使用して染色した細胞を、分析か
ら除外した。示されるデータは、収集された５０００細胞についての平均蛍光シ
グナルである。
【０２１３】 （アジ化ナトリウムを使用した細胞の取り込みの阻害）使用された細胞を、蛍
光性ペプチドの添加の前に２％ＦＣＳ／ＰＢＳ緩衝液中に０．５％アジ化ナトリ
ウムを使用して３０分間プレインキュベートし、そして、その細胞をＰＢＳ緩衝
液中の０．５％アジ化ナトリウムを使用して洗浄することを除き、以前に記載さ
れるようにアッセイを行なった。細胞の取り込みの全てのアッセイを、アジ化ナ
トリウムの存在下および非存在下で並行して行なった。
【０２１４】 （細胞の取り込み速度アッセイ）細胞を、マイクロタイタープレート（９６ウ
ェル）において２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５０μｌ）中で３連で、４℃で、０．５、
１、２、および４分間、インキュベートしたのを除き、アッセイを上記のように
行なった。２％ＦＣＳ／ＰＢＳ（５ｍＬ）中にサンプルを希釈することによって
、反応をクエンチした。次いで、このアッセイをワークアップし、そして、以前
に記載されたように、蛍光フローサイトメトリーによって分析した。
【０２１５】 （結果） 短いアルギニンリッチペプチドの細胞の取り込みのための構造的必要を決定す
るために、一連のＴａｔ49〜57の蛍光標識短縮アナログを、標準的な固相化学用
いて、合成した。例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ、Ｅ．ら、ＳＯＬＩＤ−ＰＨＡＳＥ
ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ（ＩＲＬ：Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌｅ．
１９８９）を参照のこと。フルオレセイン部分をアミノ末端のアミノヘキサン酸
スペーサーを介して付着した。次いで、これらの蛍光標識ペプチドがジャーカッ
ト細胞に入る能力を、蛍光活性化細胞仕分け（ＦＡＣＳ）を用いて分析した。試
験されたペプチド構築物は、Ｔａｔ49〜57（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ
）：Ｔａｔ49〜56（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ）、Ｔａｔ49〜55（Ｆｌ−
ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ）、Ｔａｔ50〜57（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ）
、およびＴａｔ51〜57（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ）であった。細胞表面結
合と内部移行との間の差異を、アジ化ナトリウムの存在下および非存在下におけ
る並行の組のアッセイを行なうことによって、完全に達成した。アジ化ナトリウ
ムは、エネルギー依存の細胞の取り込みを阻害するが、細胞表面結合は阻害しな
いので、２つのアッセイの間の蛍光の差異は、内部移行から生じる蛍光の量を提
供した。
【０２１６】 アミノ末端（Ｔａｔ50〜57）またはカルボシキル末端（Ｔａｔ49〜56）のいず
れか由来のアルギニン残基の欠失は、親配列（Ｔａｔ49〜57）と比較して、細胞
内蛍光の８０％の喪失を生じた。１アミノ酸短縮アナログに由来する、カルボキ
シル末端からのＲ−５６のさらなる欠失（Ｔａｔ49〜55）は、細胞内蛍光のさら
なる６０％の喪失を生じたが、アミノ末端由来のＫ−５０の欠失（Ｔａｔ51〜57 ）は、内部移行の量をさらに減少しなかった。これらの結果は、Ｔａｔ49〜57の
短縮アナログが、ジャーカット細胞へのフルオレセインの細胞外送達において有
意に効果が低く、アルギニン残基が、リジン残基よりも細胞の取り込みにより貢
献するようであることを示す。
【０２１７】 個々のアミノ酸残基の細胞の取り込みへの貢献を決定するために、Ｔａｔ49〜 57 のそれぞれの部分でのアラニン置換を含むアナログを合成し、そして、ＦＡＣ
Ｓ分析によって合成した（図２２）。以下の構築物を試験した：Ａ−４９（Ｆｌ
−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲ
Ｒ）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＡＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈ
ｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ）、Ａ−５３（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ）、
Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＡＲＲＲ）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−Ｒ
ＫＫＲＲＱＡＲＲ）、Ａ−５６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ）、および
Ａ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＡ）。Ｔａｔ49〜57の非荷電グルタ
ミン残基のアラニン（Ａ−５４）との置換は、細胞内部移動における緩やかな減
少を生じた。他方、陽イオン残基のそれぞれのアラニン置換は、細胞の取り込み
の７０〜９０％の喪失を個別に産生した。これらの場合では、アラニンと、リジ
ン（Ａ−５０、Ａ−５１）またはアルギニン（Ａ−４９、Ａ−５２、Ａ−５５、
Ａ−５６、Ａ−５７）の置換は、取り込みを減少させる際に類似の効果を有した
。
【０２１８】 輸送体ペプチドのキラリティーが重要であるか否かを決定するために、対応す
るｄ−（ｄ−Ｔａｔ49〜57）、レトロ−ｌ−（Ｔａｔ49〜57）およびレトロ−逆
異性体（ｄ−Ｔａｔ49〜57）を合成し、そして、ＦＡＣＳアッセイによって分析
した（図２３）。重要なことには、全ての３アナログは、ジャーカット細胞に入
る際、Ｔａｔ49〜57よりもより効果的であった。これらの結果は、ペプチド骨格
のキラリティーが細胞の取り込みが重要でないことを示した。興味深いことには
、Ｔａｔ49〜57において見出される１つのアルギニンおよび２つのリジンの代わ
りに、アミノ末端に位置する３つのアルギニン残基を有するレトロ−ｌアイソマ
ー（Ｔａｔ49〜57）は、取り込み増加したことを示した。従って、アミノ末端に
おける残基は重要であるようであり、そして、アルギニンは、内部移行について
、リジンよりもより効果的である。非天然のｄ−ペプチドの改善した細胞の取り
込みは、アッセイで使用された２％ＦＣＳ（胎仔ウシ血清）におけるタンパク質
分解に対するそれらの増加した安定性に起因するようである。血清が除去される
場合、ｄ−ペプチドおよびｌ−ペプチドは、予想されるように等価であった。
【０２１９】 これらの最初の結果は、アルギニン含有量が、Ｔａｔ49〜57の細胞の取り込み
について主な原因であることを示す。さらに、これらの結果は、アルギニンの短
いオリゴマーが、細胞に入る際、リジン、オルニチン、およびヒスチジンの対応
する短いオリゴマーよりもより効果的であることを実証した、本発明者らの以前
の結果と一貫していた。確立されていなかったことは、アルギニンホモオリゴマ
ーが、Ｔａｔ49〜57よりもより効果的であるか否であった。この点に関して、Ｔ
ａｔ49〜57を、ｌ−アルギニン（Ｒ５−Ｒ９）およびｄ−アルギニン（ｒ５−ｒ
９）オリゴマーと比較した。Ｔａｔ49〜57は、陽イオン性残基を含むが、その細
胞内部移行は、Ｒ６およびＲ７との間の内部移行であり（図２４）、このことは
６つのアルギニン残基の存在が、細胞の取り込みについて最も重要な因子である
ことを示す。重要なことに、７−９アルギニン残基を含む結合体は、Ｔａｔ49〜 57 よりもより優れた取り込みを示した。
【０２２０】 これらのアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ49〜57の細胞に入る能力を定量的
に比較するために、ミカエリス−メンテン速度分析を行なった。細胞の取り込み
の速度は、３０、６０、１２０および２４０秒間、ジャーカット細胞におけるペ
プチドのインキュベーション（３℃）後に決定した（表１）。結果のＫm値は、
ｒ９およびＲ９が、Ｔａｔ49〜57よりもそれぞれ、約１００倍および２０倍速い
速度で、細胞に入ることを明らかにした。比較のために、アンテナペンディア（
Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）43〜59をまた分析し、そして、Ｔａｔ49〜57より約
２倍速く細胞に入ることを示したが、ｒ９およびＲ９よりも有意に遅かった。
【０２２１】 （表１：ミカエリス−メンテン速度論：アンテナペンディア43〜59（Ｆｌ−ａ
ｈｘ−ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）。
【０２２２】
【表１】 （実施例１４） （Ｔａｔ49-57のペプチド模倣アナログの設計および合成） （方法） ペプトイドポリアミン合成の一般的手順。ペプトイドを、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ
ｎによって開発された文献の手順に従って、樹脂を混合するために、フリッティ
ングしたガラス装置および窒素の正圧を使用して、手動で合成した。例えば、Ｍ
ｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５
，１５１７−１５２２（１９９８）；Ｓｉｍｏｎ，Ｒ．Ｊら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９，９３６７−９３７１（１９９２）；Ｚｕ
ｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｒ．Ｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４，１０６４
６−１０６４７（１９９２）を参照のこと。Ｆｍｏｃ置換Ｒｉｎｋアミド樹脂（
０．２ｍｍｏｌ）の、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）での３０分間（２×
）の処理により、遊離樹脂結合アミンを得、これをＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄
した。この樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のブロモ酢酸（２．０ｍｍｏｌ）の溶液
で３０分間処理した。この手順を繰り返した。次いで、この樹脂を洗浄し（３×
５ｍＬ ＤＭＦ）、そしてＤＭＦ（５ｍＬ）中のモノ−Ｂｏｃジアミン（８．０
ｍｍｏｌ）の溶液で１２時間処理した。これら２つの工程を、所望の長さのオリ
ゴマーが得られるまで繰り返した（注記：ＤＭＦ中のモノ−Ｂｏｃジアミンの溶
液を、収率を明らかに低下させることなく再利用し得た）。次いで、この樹脂を
、ＤＭＦ中のＮ−Ｆｍｏｃ−アミノヘキサン酸（２．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＣ
（２．０ｍｍｏｌ）で１時間処理し、そしてこれを繰り返した。次いで、Ｆｍｏ
ｃを、２０％ピペリジン／ＤＭＦ（５ｍＬ）で３０分間処理することによって、
除去した。この工程を繰り返し、そしてこの樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）で洗浄
した。次いで、遊離アミン樹脂を、ＤＭＦ（５ｍＬ）中のフルオレセインイソチ
オシアネート（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２．０ｍｍｏｌ）で１２時間
処理した。次いで、この樹脂をＤＭＦ（３×５ｍＬ）およびジクロロメタン（５
×５ｍＬ）で洗浄した。この樹脂からの切断を、９５：５ ＴＦＡ／トリイソプ
ロピルシラン（８ｍＬ）を使用して達成した。減圧下での溶媒の除去により、粗
製油を得、これを冷エーテル（２０ｍＬ）で粉砕した。このように得た粗製混合
物を遠心分離し、エーテルをデカンテーションによって除去し、そして得られる
橙色固体を、逆相ＨＰＬＣ（０．１％ ＴＦＡ中Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ）により精製
した。この生成物を、凍結乾燥によって単離し、そして電子スプレー質量分析に
よって、そして選択され場合には1Ｈ ＮＭＲ分光法によって、特徴付けた。
【０２２３】 ペプトイドポリアミンの過グアニジニル化（Ｐｅｒｇｕａｎｉｄｉｎｙｌａｔ
ｉｏｎ）のための一般的手順。脱イオン水（５ｍＬ）に溶解したペプトイドアミ
ン（０．１ｍｍｏｌ）の溶液を、炭酸ナトリウム（１つのアミン残基あたり５当
量）およびピラゾール−１−カルボキサミジン（１つのアミン残基あたり５当量
）で処理し、そして２４〜４８時間５０℃に加熱した。次いで、この粗製混合物
を、ＴＦＡ（０．５ｍＬ）で酸性化し、そして逆相ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ中
Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ）で直接精製した。この生成物を、電子スプレー質量分析によ
って特徴付け、そして凍結乾燥によって単離し、そして逆相ＨＰＬＣによってさ
らに精製した。このグアニジン置換したペプトイドの純度は、分析逆相ＨＰＬＣ
（０．１％ ＴＦＡ中Ｈ2Ｏ／ＣＨ3ＣＮ）によって決定した場合に、９５％より
高かった。
【０２２４】 （結果） Ｔａｔ47-59の細胞取り込みについて決定した構造−機能関係を利用して、本
発明者らは、アルギニンオリゴマーの側鎖の１，４骨格間隔を保存するが、ステ
レオジェン中心が欠けているオリゴグリシン骨格を有するポリグアニジンペプト
イド誘導体のセットを設計した。アルギニン様側鎖をアミド窒素に組み込むこれ
らのペプトイドを、これらのタンパク分解に対する予測される抵抗性、ならびに
合成の潜在的な容易さおよび有意に低い費用に起因して、選択した。（Ｓｉｍｏ
ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−９３
７１（１９９２）；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１
１４：１０６４６−１０６４７（１９９２））さらに、ラセミ化（頻繁に、ペプ
チド合成において遭遇する）は、ペプトイド合成においては問題ではない；そし
て「亜モノマー（ｓｕｂ−ｍｏｎｏｍｅｒ）」ペプトイドアプローチは、側鎖ス
ペーサーの容易な改変を可能にする。Ｔａｔ49-57のオリゴウレア（ｏｌｉｇｕ
ｒｅａ）およびペプトイド−ペプチドハイブリッド（Ｈａｍｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３５４８−３５５３（１９９７））
誘導体の調製は、以前に報告されているが、これらの細胞取り込みは、明白には
研究されなかった。
【０２２５】 所望のペプトイドを、ペプトイドに対する「亜モノマー」アプローチ（Ｓｉｍ
ｏｎら；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら）を使用して調製し、続いてアミノヘキサン酸
スペーサーを介して、フルオレセイン部分をアミン末端に結合させた。固相樹脂
からの切断の後に、このように得られた蛍光標識したポリアミンペプトイドを過
剰のピラゾール−１−カルボキサミジン（Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚら、Ｊ．Ｏｒ
ｇ．Ｃｈｅｍ．５７：２４９７−２５０２（１９９２）および炭酸ナトリウムで
処理することによって、良好な収率（６０〜７０％）でポリグアニジンペプトイ
ドに転換した（図２５に示すように）。以前に報告された、単離されたＮ−Ａｒ
ｇユニットを含むペプトイドの合成は、ペプトイド合成の前のＮ−Ａｒｇモノマ
ーの合成（５〜７工程）および特殊化されかつ高価なグアニジン保護基（Ｐｍｃ
、Ｐｂｆ）の使用に依存した（Ｋｒｕｉｊｔｚｅｒら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．
４：１５７０−１５８０（１９９８）；Ｈｅｉｚｍａｎｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅ
Ｒｅｓ．７：３２８−３３２（１９９４））。本明細書で報告される化合物は、
過グアニジニル化工程を使用して調製される、ポリグアニジニル化ペプトイドの
最初の例を提示する。この方法は、対応するポリアミンからのポリグアニジニル
化化合物への容易なアクセスを提供し、そして過グアニジニル化ホモオリゴマー
の合成のために、特に有用である。さらに、この方法は、高価な保護基（Ｐｂｆ
、Ｐｍｃ）の使用を排除する。新規のトリフリル（ｔｒｉｆｌｙｌ）置換グアニ
ル化剤を使用する、ペプチド基質の過グアニジニル化のさらなる例が、最近報告
された（Ｆｅｉｃｈｔｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：８４３２−
８４３９（１９９８））。
【０２２６】 蛍光標識されたポリグアニジンＮ−ａｒｇ５ペプトイド、ポリグアニジンＮ−
ａｒｇ７ペプトイド、ポリグアニジンＮ−ａｒｇ９ペプトイドの細胞取り込みを
、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＦＡＣＳ分析を使用して、対応するｄ−アルギニンペ
プチドｒ５、ｒ７、ｒ９（類似のタンパク分解性特性）と比較した。Ｎ−ａｒｇ
５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒｇ９を含む細胞の内側で測定した蛍光の量は、ｒ５
、ｒ７、ｒ９に関して見出される量に類似して、グアニジン残基の数に比例した
：Ｎ−ａｒｇ９＞Ｎ−ａｒｇ７＞Ｎ−ａｒｇ５（図２６）。さらに、Ｎ−ａｒｇ
５ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ７ペプトイド、Ｎ−ａｒｇ９ペプトイドは、対応する
ペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９と比較して、わずかに低い量の細胞侵入のみを示した
。これらの結果は、Ｔａｔ49-57またはアルギニンオリゴマーのペプチド骨格に
沿った水素結合が、細胞取り込みのために必要とされる構造的エレメントではな
く、そしてオリゴマーのグアニジン置換ペプトイドが、アルギニンに富むペプチ
ドの代わりに、分子輸送体として利用され得ることを実証する。アジ化ナトリウ
ムの添加は、インターナリゼーションを阻害し、このことは、ペプトイドの細胞
取り込みもまたエネルギー依存性であることを示した。
【０２２７】 （実施例１５） （細胞取り込みに対する側鎖長の効果） Ｎ−ａｒｇペプトイドが効果的に細胞膜と交差することを確認した後に、細胞
取り込みに対する側鎖長（メチレンの数）の効果を調査した。所定の数のグアニ
ジン残基（５、７、９）については、細胞取り込みは、側鎖長に比例した。より
長い側鎖を有するペプトイドは、より効率的な細胞取り込みを示した。グアニジ
ンヘッド基と骨格との間に６つのメチレンスペーサーを有する９マーペプトイド
アナログ（Ｎ−ｈｘｇ９）は、対応するｄ−アルギニンオリゴマー（ｒ９）より
顕著により高い細胞取り込みを示した。取り込みの相対的順序は、Ｎ−ｈｘｇ９
（６メチレン）＞Ｎ−ｂｔｇ９（４メチレン）＞ｒ９（３メチレン）＞Ｎ−ａｒ
ｇ９（３メチレン）＞Ｎ−ｅｔｇ９（２メチレン）であった（図２７）。注記と
して、Ｎ−ｈｘｇペプトイドは、対応するｄ−アルギニンオリゴマーよりさらに
大きな、顕著に高い細胞取り込みを示した。対応するヘプタマーおよびペンタマ
ーの細胞取り込みもまた、同じ相対的傾向を示した。Ｎ−ｈｘｇペプトイドに含
まれる側鎖がより長いほど、インターナリゼーションの量がさらに１つ多いグア
ニジン残基を含む対応するｄ−アルギニンオリゴマーに匹敵するような程度まで
、細胞取り込みが改善された（図２８）。例えば、Ｎ−ｈｘｇ７ペプトイドは、
ｒ８に匹敵する細胞取り込みを示した。
【０２２８】 細胞取り込みの増加が、増加した長さの側鎖に起因したのか、またはそれらの
疎水性の性質に起因したのかを確認するために、シクロヘキシル側鎖を含むペプ
トイドのセットを合成した。これらを、Ｎ−ｃｈｇ５ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ７
ペプトイド、Ｎ−ｃｈｇ９ペプトイドと呼ぶ。これらは、Ｎ−ｈｘｇペプトイド
と同じ数の側鎖炭素を含むが、異なる自由度を有する。興味深いことに、Ｎ−ｃ
ｈｇペプトイドは、以前にアッセイされたペプトイド（Ｎ−ｅｔｇペプトイドを
含む）の全てよりも、ずっと低い細胞取り込み活性を示した（図２９）。従って
、直鎖アルキルスペーサー基（ｓｐａｃｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）の、コンホメーシ
ョンの可撓性および立体的に妨害されない性質が、効率的な細胞取り込みのため
に重要である。
【０２２９】 （考察） ノナペプチドＴａｔ49-57は、以前に、原形質膜を通して効率的に転座するこ
とが示された。この研究の目的は、この効果のための構造的基礎を決定すること
、およびこの情報を使用してより単純かつより効果的な分子輸送体を開発するこ
とであった。この目的のために、フルオレセイン標識に結合体化した、Ｔａｔ49 -57 の短縮型誘導体およびアラニン置換誘導体を調製した。これらの誘導体は、
Ｔａｔ49-57と比較して非常に減少した細胞取り込みを示し、このことは、Ｔａ
ｔ49-57のカチオン性残基の全てが、効率的な細胞取り込みのために必要とされ
ることを示す。カチオン性オリゴマーの短いオリゴマーに関する本発明者らの以
前の研究と比較した場合に、これらの知見は、アルギニンのオリゴマーが、Ｔａ
ｔ49-57より優れており、そして確かにより容易かつ費用効率的に調製され得る
ことを示唆した。短いアルギニンオリゴマーとＴａｔ49-57との比較は、前者の
メンバーが、実際に、より効率的に細胞に取り込まれることを示した。これは、
初めて、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎの速度論分析によって、さらに定量
され、この分析は、Ｒ９およびｒ９オリゴマーが、Ｔａｔ49-57に関して見出さ
れる値より３０倍および１００倍大きなＫｍ値を有することを示した。
【０２３０】 本発明者らのペプチドの研究において明らかとなった、グアニジノヘッド基の
重要性およびオリゴマーキラリティーの明らかな不感受性を考慮して、本発明者
らは、新規な一連のポリグアニジンペプトイドを設計し、そして合成した。アル
ギニン側鎖を組み込むペプトイドであるＮ−ａｒｇ５、Ｎ−ａｒｇ７、Ｎ−ａｒ
ｇ９は、対応するｄ−アルギニンペプチドｒ５、ｒ７、ｒ９に匹敵する細胞取り
込みを示した。このことは、ペプチド骨格に沿った水素結合および骨格キラリテ
ィーが、細胞取り込みのために必須ではないことを示す。この観察は、これらの
ペプトイド、アルギニンオリゴマー、およびＴａｔ49-57（これらは全て、深く
埋め込まれた骨格およびグアニジニウム優性表面を有する）の分子モデルと一致
する。分子モデルは、これらの構造的特性が、ペプトイド骨格とグアニジノヘッ
ド基との間に異なるアルキルスペーサーを有するオリゴマーにおいて、様々な程
度で保持されることを、さらに明らかにする。従って、骨格と側鎖との間に２−
（Ｎ−ｅｔｇ）、４−（Ｎ−ｂｔｇ）、および６−ａｔｏｍ（Ｎ−ｈｘｇ）のス
ペーサーを組み込む一連のペプトイドを調製し、そして細胞取り込みについて、
Ｎ−ａｒｇペプトイド（３原子スペーサー）およびｄ−アルギニンオリゴマーと
比較した。側鎖の長さは、細胞侵入に対して、劇的な影響を有した。細胞取り込
みの量は、Ｎ−ｈｘｇ＞Ｎ−ｂｔｇ＞Ｎａｒｇ＞Ｎ−ｅｔｇの順で、側鎖の長さ
に比例した。細胞取り込みは、グアニジンヘッド基と骨格との間のアルキルスペ
ーサーユニットの数が増加する場合に、改善された。重要なことに、Ｎ−ｈｘｇ
９は、ｒ９より優れており、後者は、Ｔａｔ49-57より１００倍良好であった。
この結果により、本発明者らは、グアニジノ基と骨格との間により長いオクチル
スペーサー（Ｎ−ｏｃｇ）を含むペプトイド誘導体を調製した。溶解度に関する
問題点に起因して、本発明者らは、これらの化合物を試験しなかった。
【０２３１】 過グアニジニル化ペプチドと過グアニジニル化ペプトイドとの両方が、効率的
に細胞に侵入するので、グアニジンヘッド基（骨格とは独立している）は、明ら
かに、細胞取り込みの重大な構造的決定因子である。しかし、いくつか（６より
大）のグアニジン部分が分子の足場に存在することは、細胞内への能動的な移送
のためには十分ではない。なぜなら、Ｎ−ｃｈｇペプトイドは、細胞内に効率的
に転座しなかったからである。従って、グアニジンヘッド基の重要性に加えて、
細胞取り込みのために重要な構造／コンホメーション要件が存在する。
【０２３２】 要約すると、この研究は、Ｔａｔ49-57が細胞に侵入する能力に影響を与える
、一連の構造的特徴（配列の長さ、アミノ酸組成、およびキラリティーを含む）
を同定した。これらの特徴は、一連の新規ペプトイドの設計のための設計図を提
供し、これらのうちの１７のメンバーが合成され、そして細胞取り込みに関して
アッセイされた。重要なことには、Ｎ−ｈｘｇ９輸送体は、細胞取り込みが、ｒ
９より優れており、これは、Ｎ−ｂｔｇ９に匹敵することが見出された。従って
、これらのペプトイド輸送体は、Ｔａｔ49-57より実質的に良好であることが示
された。この研究は、ペプチド骨格およびその骨格に沿った水素結合が、細胞取
り込みのために必要ではないこと、グアニジノヘッド基が、他のカチオン性サブ
ユニットより優れていること、ならびに最も重要なことには、骨格とヘッド基と
の間のアルキル鎖の伸長が、優れた輸送体を提供することを、確認した。より良
好な取り込み性能に加えて、これらの新規ペプトイドは、Ｔａｔ49-57より優れ
たいくつかの利点（費用効果、アナログの合成の容易さ、およびプロテアーゼ安
定性を含む）を与える。これらの特性は、それらの有意な水溶性（＞１００ｍｇ
／ｍＬ）とともに、これらの新規ペプトイドが、薬物、薬物候補および他の薬剤
の、細胞内への分子送達のための効果的な輸送体として働き得ることを示す。
【０２３３】 （実施例１６） （イトラコナゾール−輸送体結合体の合成） この実施例は、送達増強輸送体を、トリアゾール構造を含む化合物に結合させ
るための一般的なストラテジーの１つの適用を提供する。このスキーム（アルギ
ニン（ｒ７）送達増強輸送体へのイトラコナゾールの結合を例として使用する）
を、図３０に示す。このスキームにおいて、ＲはＨまたはアルキルであり、ｎは
１または２であり、そしてＸはハロゲンである。
【０２３４】 この反応は、ハロゲン（例えば、Ｂｒ、Ｆｌ、Ｉ）またはメチルエステルを有
するアシル基を結合するために、トリアゾール環の窒素の四量化の使用を含む。
化合物３を、ＨＰＬＣによって単離した。Ｄ2Ｏ中でのプロトンＮＭＲは、イト
ラコナゾールおよび輸送体のピークを明らかにした。
【０２３５】 メチルエステルは、７０％以上の収率を提供したが、Ｂｒ−プロピオン酸／エ
ステル対を使用して得られた収率は、４０〜５０％であった。次いで、このアシ
ル誘導体は、送達増強輸送体のアミンと反応して、結合体を形成する。あるいは
、ハロゲン化アシル基が、アミド結合を介して最初に輸送体分子に結合し得、そ
の後、薬物化合物との反応が実施される。
【０２３６】 （実施例１７） （ＦＫ５０６結合体の調製） この実施例は、ＦＫ５０６が送達増強輸送体に結合された、結合体の調製を記
載する。２つの異なるリンカーを使用し、これらの各々が、生理学的ｐＨ（ｐＨ
５．５〜７．５）でＦＫ５０６を放出するが、より酸性のｐＨにおいては、より
長い半減期を有した。これらのスキームを、図３１ＡおよびＢに図式化する。
【０２３７】 （リンカー１：６−マレイミドカプロンヒドラジドトリフルオロアセテート（
スキームＩおよびＩＩ）） ＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、６−マレイミドカプロ
ン（ｍａｌｅｉｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｉｃ）ヒドラジドトリフルオロアセテート
（２）（０．１２６ｇ、３７３．２μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、
１μＬ）の、無水メタノール（５ｍＬ）中の溶液を、室温で３６時間撹拌した。
この反応を、薄層クロマトグラフィーによってモニターし、これは、出発物質の
ほぼ完全な消失を示した［ＴＬＣ溶媒系−ジクロロメタン（９５）：メタノール
（５）、Ｒf＝０．３］。この反応混合物を濃縮乾固し、そして酢酸エチル（２
０ｍＬ）に溶解した。有機層を水および１０％重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、
次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残渣を、溶出液とし
てジクロロメタン（９６）：メタノール（４）を使用するカラムクロマトグラフ
ィーによって精製して、ヒドラゾン３（０．１１６ｇ、９２％）を得た。
【０２３８】 上記ヒドラゾン（３）（０．０２５ｇ、２４．７μｍｏｌ）、輸送体（１×、
Ｂａｃａｒ9ＣＣＯＮＨ2．９ＴＦＡ、Ｂａｃａｒ7ＣＣＯＮＨ2．７ＴＦＡ、Ｂａ
ｃａＣＣＯＮＨ2、ＮＨ2ｒ7ＣＣＯＮＨ2．８ＴＦＡ、ＮＨ2Ｒ7ＣＣＯＮＨ2．８
ＴＦＡ）およびジイソプロピルエチルアミン（１×）の、無水ジメチルホルムア
ミド（１ｍＬ）中の溶液を、窒素下室温で３６時間撹拌し、このとき、ＴＬＣは
、出発ヒドラゾンの完全な消失を示した。溶媒を、この反応混合物からエバポレ
ートし、そして残渣を、トリフルオロ酢酸で緩衝化した水およびアセトニトリル
を使用する逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０２３９】 種々の輸送体との結合体の収率： Ｂａｃａｒ9ＣＣＯＮＨ2．９ＴＦＡとの結合体（４）−７３％ Ｂａｃａｒ7ＣＣＯＮＨ2．７ＴＦＡ（５）−５０％ ＢａｃａＣＣＯＮＨ2（６）−５２．９％ ＮＨ2ｒ7ＣＣＯＮＨ2．８ＴＦＡ（７）−４３．８％ ＮＨ2Ｒ7ＣＣＯＮＨ2．８ＴＦＡ（８）−６２．８％ 全ての生成物の構造を、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルおよびＴＯＦ ＭＳ分析によ
って確認した。
【０２４０】 （リンカー２：２−（２−ピリジニルジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレ
ート（スキームＩＩＩおよびＩＶ）） ＦＫ５０６（１）（０．１ｇ、１２４．４μｍｏｌ）、２−（２−ピリジニル
ジチオ）エチルヒドラジンカルボキシレート（９）（０．０９１ｇ、３７３．２
μｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸（触媒、１μＬ）の、無水メタノール（５ｍ
Ｌ）中の溶液を、室温で１６時間撹拌した。この反応を、薄層クロマトグラフィ
ーによってモニターし、これは、出発物質のほぼ完全な消失を示した［ＴＬＣ溶
媒系−酢酸エチルＲf＝０．５］。この反応混合物を濃縮乾固し、そして酢酸エ
チル（２０ｍＬ）に溶解した。有機層を、水および１０％重炭酸ナトリウム溶液
で洗浄し、次いで硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、そして濃縮した。残渣を、
ジクロロメタン（９７）：メタノール（３）を溶出液として使用するカラムクロ
マトグラフィーによって精製して、ヒドラゾン１０（０．０９１ｇ、７１％）を
得た。
【０２４１】 本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみであり、そ
して本明細書を考慮しての種々の改変または変化は、当業者に提唱され、そして
本願および添付の特許請求の範囲の意図および範囲内に含まれるべきであること
が、理解される。本明細書中で引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は
、全ての目的において、本明細書中に参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、α−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導体の調製のための反応スキ
ームを示す。
【図２】 図２は、システイン含有ペプチドのα−クロロアセチルシクロスポリンＡ誘導
体とのカップリングのための一般的な手順を示す。
【図３】 図３は、シクロスポリンＡ誘導体のビオチン標識ペプチドとのカップリングの
ための反応スキームを示す。
【図４】 図４は、シクロスポリンＡ誘導体の標識していないペプチドとのカップリング
のための反応スキームを示す。
【図５】 図５Ａ〜Ｈは、送達増強輸送体を目的の生物学的に活性な薬剤または他の分子
に結合するために使用され得る、種々の型の切断可能なリンカーを示す。図５Ａ
は、ジスルフィド連結の例を示す。図５Ｂは、電磁放射への曝露の際に切断され
る、光切断可能なリンカーを示す。図５Ｃは、切断可能なリンカーとして使用さ
れる、修飾されたリジル残基を示す。図５Ｄは、送達増強輸送体Ｔが、抗癌剤パ
クリタキセルの２’−酸素に連結した結合体を示す。連結部分は、以下を含む：
（ｉ）送達増強輸送体に結合した窒素原子、（ｉｉ）窒素原子のパラ位に位置す
るリン酸モノエステル、および（ｉｉｉ）窒素原子のメタ位にあるカルボキシメ
チル基（これは、カルボキシレートエステル連結によって、パクリタキセルの２
’−酸素に結合する）。図５Ｅは、アミノアルキルカルボン酸による、生物学的
に活性な薬剤（例えば、パクリタキセル）への送達増強輸送体の連結を示す；リ
ンカーアミノ基は、アミド連結によって送達増強輸送体に結合し、そしてエステ
ル連結によってパクリタキセル部分に結合する。図５ＦおよびＧは、パクリタキ
セルおよび「ＴＡＸＯＴＥＲＥTM」（Ｒ’＝Ｈ、Ｒ”＝ＢＯＣ）の化学構造およ
び構成骨格原子の慣習的な番号付けを示す。図５Ｇは、トキソイド化合物の一般
的な化学構造および環原子の番号付けを示す。
【図６】 図６は、Ｌ−アルギニンのヘプタマーとシクロスポリンＡとの間の化学結合の
ための合成スキーム（パネルＡ）およびそのｐＨ依存性化学解離（パネルＢ）を
示す。α−クロロエステル（２）を、ヨウ化ナトリウムの存在下でベンジルアミ
ンで処理して置換を行い、第２級アミン（５）を得た。アミン（５）を無水物（
６）で処理して、得られた粗酸（７）をその対応するＮＨＳエステル（８）に変
換した。次いで、エステル（８）を、ヘプタ−Ｌ−アルギニンのアミノ末端とカ
ップリングして、Ｎ−Ｂｏｃ保護ＣｓＡ結合体（９）を得た。最後に、Ｂｏｃ保
護基をギ酸で除去し、ＨＰＬＣ生成後、結合体（１０）を、そのオクタトリフル
オロ酢酸塩として得た。
【図７】 図７は、マウス接触皮膚炎における、解離可能なＲ７ ＣｓＡによる炎症の阻
害を示す。Ｂａｌｂ／ｃ（６〜７週）マウスに、アセトンオリーブ油（９５：５
）中の０．７％ ＤＮＦＢ（１００μｌ）を腹部に塗った。３日後、動物の両耳
を、アセトン中の０．５％ ＤＮＦＢで再刺激した。再刺激の１時間後、５時間
後、および２０時間後に、ビヒクルのみ、１％ Ｒ７ペプチドのみ、１％ Ｃｓ
Ａ、１％ 解離不可能なＲ７ ＣｓＡ、０．０１％／０．１％／１．０％ 解離
可能なＲ７ ＣｓＡ、およびフッ化ステロイド陽性コントロール０．１％ トリ
アムシノロンアセトニドのいずれかでマウスを処置した。耳の炎症を、再刺激の
２４時間後に、バネを装着したキャリパーを用いて測定した。炎症の％減少を、
以下の式：（ｔ−ｎ）／（ｕ−ｎ）（ここで、ｔ＝処置した耳の厚さ、ｎ＝正常
な未処置の耳の厚さ、およびｕ＝いかなる処置もしていない炎症した耳の厚さで
ある）を用いて計算した。各群において、Ｎ＝２０動物である。
【図８】 図８は、銅−ジエチレントリアミンペンタ酢酸錯体（Ｃｕ−ＤＴＰＡ）の調製
のための手順を示す。
【図９】 図９は、Ｃｕ−ＤＴＰＡをアミノカプロン酸を介して輸送体に連結するための
手順を示す。
【図１０】 図１０は、ヒドロコルチゾンの無水クロロ酢酸でのアシル化のための反応を示
す。
【図１１】 図１１は、アシル化ヒドロコルチゾンを輸送体に連結するための反応を示す。
【図１２】 図１２は、タキソールのＣ−２’誘導体の調製のための反応を示す。
【図１３】 図１３は、タキソール誘導体をビオチン標識ペプチドにカップリングするため
の反応の概略を示す。
【図１４】 図１４は、標識していないペプチドをタキソールのＣ−２’誘導体にカップリ
ングするための反応を示す。
【図１５】 図１５Ａ〜Ｃは、他のＣ−２’タキソール−ペプチド結合体の形成のための反
応スキームを示す。
【図１６】 図１６は、薬物または他の生物学的薬剤がｐＨ−解離可能なリンカーによって
送達増強輸送体に連結される結合体の合成のための、一般的戦略を示す。
【図１７】 図１７は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体を合成するためのプロトコ
ルの概略図を示す。
【図１８】 図１８は、タキソール２’−クロロアセチル誘導体が、アルギニンヘプタマー
送達増強輸送体に連結される戦略を示す。
【図１９】 図１９は、図１８に図示される反応条件を用いて作製され得る、３つのさらな
るタキソール−ｒ７結合体を示す。
【図２０】 図２０は、タキソールおよび２つの異なるリンカーを用いる、３日間のＭＴＴ
細胞障害性アッセイの結果を示す。
【図２１】 図２１は、以下のものの短縮型アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示
す：Ｔａｔ49-57（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ｔａｔ49-56（Ｆｌ−
ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＲ）、Ｔａｔ49-55（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲ）
、Ｔａｔ50-57（Ｆｌ−ａｈｘ−ＫＫＲＲＱＲＲＲ）、およびＴａｔ51-57（Ｆｌ
−ａｈｘ−ＫＲＲＱＲＲＲ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭ
を示す）のペプチドとともに２３℃で１５分間インキュベートした。
【図２２】 図２２は、以下のもののアラニン置換アナログのＦＡＣＳ細胞取り込みアッセ
イを示す：Ｔａｔ49-57：Ａ−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−ＡＫＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ
−５０（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＡＫＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５１（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫ
ＡＲＲＱＲＲＲ）、Ａ−５２（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＡＲＱＲＲＲ）、Ａ−５３
（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＡＱＲＲＲ）、Ａ−５４（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲ
ＡＲＲＲ）、Ａ−５５（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＡＲＲ）、Ａ−５６（Ｆｌ
−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲＱＲＡＲ）、およびＡ−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＫＫＲＲ
ＱＲＲＡ）。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチ
ドとともに２３℃で１２分間インキュベートした。
【図２３】 図２３は、Ｔａｔ49-57のｄ−異性体およびｒｅｔｒｏ−異性体：ｄ−Ｔａｔ
４９−５７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｋｋｒｒｑｒｒｒ）、Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−
ａｈｘ−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ）、およびｄ−Ｔａｔ５７−４９（Ｆｌ−ａｈｘ−
ｒｒｒｑｒｒｋｋｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みアッセイを示す。Ｊｕｒｋａｔ細
胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）のペプチドとともに、２３℃で１５分
間インキュベートした。
【図２４】 図２４は、一連のアルギニンオリゴマーおよびＴａｔ49-57：Ｒ５（Ｆｌ−ａ
ｈｘ−ＲＲＲＲＲ）、Ｒ６（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ７（Ｆｌ−ａｈ
ｘ−ＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ８（Ｆｌ−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲ）、Ｒ９（Ｆｌ
−ａｈｘ−ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）、ｒ５（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒ）、ｒ６（
Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒ）、ｒ７（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ８
（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ）、ｒ９（Ｆｌ−ａｈｘ−ｒｒｒｒｒｒｒｒ
ｒ）のＦＡＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．
５μＭを示す）のペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２５】 図２５は、グアニジン置換ペプトイドの調製を示す。
【図２６】 図２６は、ポリグアニジンペプトイドおよびｄ−アルギニンオリゴマーのＦＡ
ＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示
す）のペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベートした。
【図２７】 図２７は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびポリグアニジンペプトイドのＦＡ
ＣＳ細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示
す）の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュ
ベートした。
【図２８】 図２８は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｈｘｇペプトイドのＦＡＣＳ
細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（６．３μＭを示す）の
蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベート
した。
【図２９】 図２９は、ｄ−アルギニンオリゴマーおよびＮ−ｃｈｇペプトイドのＦＡＣＳ
細胞取り込みを示す。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、種々の濃度（１２．５μＭを示す）
の蛍光標識したペプトイドおよびペプチドとともに２３℃で４分間インキュベー
トした。
【図３０】 図３０は、送達増強輸送体をトリアゾール環構造を含む薬物に結合するための
一般的な戦術を示す。
【図３１Ａ】 図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強輸送体に結合された結合体
を作製するための合成スキームを示す。
【図３１Ｂ】 図３１Ａおよび図３１Ｂは、ＦＫ５０６が送達増強輸送体に結合された結合体
を作製するための合成スキームを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 45/00 45/00 49/00 Ｃ 49/00 Ａ６１Ｐ 1/04 Ａ６１Ｐ 1/04 3/02 １０１ 3/02 １０１ 5/00 5/00 11/00 11/00 11/06 11/06 11/08 11/08 17/00 17/00 17/02 17/02 25/00 25/00 25/06 25/06 25/08 25/08 25/16 25/16 25/18 25/18 25/24 25/24 25/28 25/28 29/00 29/00 31/04 31/04 31/12 31/12 35/00 35/00 37/06 37/06 37/08 37/08 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウェンダー， ポール エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94025， メンロ パーク， シスキユー アベニ ュー 930 (72)発明者 マックグレイン， ピー．レオ アメリカ合衆国 カリフォルニア 94040， マウンテン ビュー， ビーコン スト リート 110 (72)発明者 シスタ， ラリサ ブイ． エス． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94087， サニーベイル， フロイド アベニュー 1333 (72)発明者 キルスクバーグ， トーステン エイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94041， マウンテン ビュー， チキータ アベ ニュー ナンバー11 360 Ｆターム(参考） 4C076 BB01 BB22 BB24 BB27 BB29 BB30 BB31 CC12 CC15 CC16 CC19 CC32 CC35 EE59A FF02 FF34 4C083 AD411 EE12 4C084 AA02 AA17 DA11 MA52 MA57 MA58 MA59 MA60 MA63 NA13 NA14 ZA021 ZA061 ZA081 ZA121 ZA151 ZA161 ZA181 ZA341 ZA591 ZA611 ZA661 ZA681 ZA891 ZB081 ZB111 ZB131 ZB261 ZB331 ZB351 4C085 HH07 KB07 KB45 LL20 4C086 AA01 AA02 BA02 DA10 MA05 NA13 NA14 ZA02 ZA06 ZA08 ZA12 ZA15 ZA16 ZA18 ZA34 ZA59 ZA61 ZA66 ZA68 ZA89 ZB08 ZB11 ZB13 ZB26 ZB33 ZB35

Claims (94)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 動物の上皮または内皮組織の１以上の層への、および該層を
    横切る化合物の送達を増強するための方法であって、該方法は、以下： 該上皮組織と、該化合物および送達増強輸送体を含む結合体とを接触させる工
    程、 を包含し、ここで、該送達増強輸送体は、該送達増強輸送体の非存在下での該化
    合物の送達と比較して、１以上のインタクトな上皮組織層または内皮組織層への
    、および該層を横切る該結合体の送達を増大させるに十分なグアニジノ部分また
    はアミジノ部分を含む、方法。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、非
    ペプチド骨格を含む、方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、５
    〜２５のグアニジノ部分またはアミジノ部分を含む、方法。
  4. 【請求項４】 請求項３に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、７
    と１５との間のグアニジノ部分を含む、方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、少
    なくとも６の連続するグアニジノおよび／またはアミジノ部分を含む、方法。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、５
    〜５０のアミノ酸から本質的になり、該アミノ酸のうちの少なくとも５０％が、
    アルギニンまたはそのアナログである、方法。
  7. 【請求項７】 請求項６に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、５
    〜２５のアルギニン残基またはそのアナログを含む、方法。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の方法であって、少なくとも１つのアルギニ
    ンがＤ−アルギニンである、方法。
  9. 【請求項９】 請求項６に記載の方法であって、前記送達増強輸送体を含む
    アミノ酸の少なくとも７０％が、アルギニンまたはアルギニンアナログである、
    方法。
  10. 【請求項１０】 請求項６に記載の方法であって、前記送達増強輸送体が、
    少なくとも５の連続するアルギニンまたはアルギニンアナログを含む、方法。
  11. 【請求項１１】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物がリンカーに
    より前記送達増強輸送体に結合される、方法。
  12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の方法であって、前記リンカーは、前記
    化合物が上皮または内皮組織の１以上の層へおよび該層を通過した後に、該化合
    物を前記送達増強輸送体から放出する、放出可能なリンカーである、方法。
  13. 【請求項１３】 請求項１２に記載の方法であって、前記化合物が、前記リ
    ンカーからの放出の際に、生物学的に活性である、方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、前記送達
    増強輸送体に結合体化されている場合に、実質的に不活性である、方法。
  15. 【請求項１５】 請求項１２に記載の方法であって、前記結合体の半減期が
    、前記上皮または内皮組織と接触する際に、５分と２４時間との間である、方法
    。
  16. 【請求項１６】 請求項１５に記載の方法であって、前記結合体の半減期が
    、前記上皮または内皮組織と接触する際に、３０分と２時間との間である、方法
    。
  17. 【請求項１７】 請求項１２に記載の方法であって、前記化合物が、溶媒媒
    介性切断により前記リンカーから放出される、方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１１に記載の方法であって、前記結合体が、酸性ｐ
    Ｈで実質的に安定であるが、生理学的ｐＨでは前記化合物が前記送達増強輸送体
    から実質的に放出される、方法。
  19. 【請求項１９】 請求項１１に記載の方法であって、前記結合体が、以下の
    構造３、４または５からなる群より選択される構造： 【化１】 ここで、 Ｒ1−Ｘは前記化合物を含み； Ｘは、前記リンカーが結合されている該化合物上の官能基であり； ＹはＮまたはＣであり； Ｒ2は、水素、アルキル、アリール、アシル、またはアリルであり； Ｒ3は、前記送達増強輸送体を含み； Ｒ4は置換または非置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ6であり； Ｒ6は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり； ｋおよびｍは、それぞれ独立して１および２から選択され；そして ｎは１〜１０である、 構造を有する、方法。
  20. 【請求項２０】 請求項１９に記載の方法であって、ＸはＮ、Ｏ、Ｓ、およ
    びＣＲ7Ｒ8からなる群より選択され、Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、Ｈお
    よびアルキルからなる群より選択される、方法。
  21. 【請求項２１】 請求項１９に記載の方法であって、前記結合体は構造３を
    含み、そしてＲ2は、５分と２４時間との間の結合体半減期を得るように選択さ
    れる、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法であって、Ｒ2は、５分と２４時
    間との間の結合体半減期を得るように選択される、方法。
  23. 【請求項２３】 請求項１９に記載の方法であって、前記結合体は構造３を
    含み、ＹはＮであり、そしてＲ2は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アリ
    ル、ベンジルまたはフェニルである、方法。
  24. 【請求項２４】 請求項２３に記載の方法であって、Ｒ2はベンジルであり
    ；ｋ、ｍ、およびｎはそれぞれ１であり、そしてＸはＯである、方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１９に記載の方法であって、前記結合体は構造４を
    含み；Ｒ4はＳであり；Ｒ5はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は、水素、メチル、アリ
    ル、ブチルまたはフェニルである、方法。
  26. 【請求項２６】 請求項１９に記載の方法であって、前記結合体は構造４を
    含み；Ｒ5はＮＨＲ6であり；Ｒ6は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェ
    ニルであり；そしてｋおよびｍはそれぞれ１である、方法。
  27. 【請求項２７】 請求項１８に記載の方法であって、前記結合体は以下の構
    造６： 【化２】 ここで、 Ｒ1−Ｘは前記化合物を含み； Ｘは、前記リンカーが結合されている該化合物上の官能基であり； Ａｒは、オルト位またはパラ位で配置された結合ラジカルを有するアリール基で
    あり、このアリール基は、置換または非置換であり得； Ｒ3は、前記送達増強輸送体を含み； Ｒ4は置換または非置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ6であり； Ｒ6は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；そして ｋおよびｍは、それぞれ独立して１および２から選択される、 構造を含む、方法。
  28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の方法であって、Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓおよ
    びＣＲ7Ｒ8からなる群より選択され、Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、Ｈお
    よびアルキルからなる群より選択される、方法。
  29. 【請求項２９】 請求項２７に記載の方法であって、Ｒ4はＳであり；Ｒ5は
    ＮＨＲ6であり；そしてＲ6は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルであ
    る、方法。
  30. 【請求項３０】 請求項１に記載の方法であって、前記結合体は、少なくと
    も２つの送達増強輸送体を含む、方法。
  31. 【請求項３１】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物の前記インタ
    クトな上皮または内皮組織層へのおよび該上皮または内皮組織層を横切る送達の
    速度が増加されている、方法。
  32. 【請求項３２】 請求項１に記載の方法であって、前記インタクトな上皮ま
    たは内皮組織層へおよび該上皮または内皮組織層を横切って送達された化合物の
    量が増加されている、方法。
  33. 【請求項３３】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物の前記インタ
    クトな上皮または内皮組織層へのおよび該上皮または内皮組織層を横切る送達が
    、残基４９〜５７からなる塩基性ＨＩＶ ｔａｔペプチドに結合体化された該化
    合物の送達より有意に大きい、方法。
  34. 【請求項３４】 請求項３３に記載の方法であって、前記化合物の前記イン
    タクトな上皮組織層へのおよび該上皮組織層を横切る送達が、残基４９〜５７か
    らなる塩基性ＨＩＶ ｔａｔペプチドに結合体化された該化合物の送達より少な
    くとも２倍大きい、方法。
  35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の方法であって、前記化合物の前記イン
    タクトな上皮組織層へのおよび該上皮組織層を横切る送達が、残基４９〜５７か
    らなる塩基性ＨＩＶ ｔａｔペプチドに結合体化された化合物の送達より少なく
    とも６倍大きい、方法。
  36. 【請求項３６】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が診断画像化
    剤または造影剤である、方法。
  37. 【請求項３７】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が表皮および
    真皮の両方に通過する間、およびこの両方に通過した後に、その生物学的効果を
    発揮する、方法。
  38. 【請求項３８】 請求項３７に記載の方法であって、前記化合物が、真皮に
    存在する免疫細胞に作用する、方法。
  39. 【請求項３９】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、皮膚障害
    のための治療剤または化粧品である、方法。
  40. 【請求項４０】 請求項１に記載の方法であって、前記上皮組織は、以下： 血管であって、前記化合物が該上皮組織から該血管へ入る血管； 血液脳関門； 筋膜； 胃腸上皮； 気管支上皮；または 皮膚、 である、方法。
  41. 【請求項４１】 請求項１、３９または４０のいずれかに記載の方法であっ
    て、前記化合物が抗菌剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗増殖剤、免疫抑制剤、ビ
    タミン、鎮痛薬、およびホルモンからなる群より選択される、方法。
  42. 【請求項４２】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が毛細管系
    に入った後に、その生物学的効果を発揮する、方法。
  43. 【請求項４３】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が全身的に
    活性な薬剤である、方法。
  44. 【請求項４４】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が抗炎症剤
    である、方法。
  45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の方法であって、前記化合物が、コルチ
    コステロイド、ＮＳＩＡＤ、クロモリン、およびネドクロミルからなる群より選
    択される、方法。
  46. 【請求項４６】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、抗真菌
    剤である、方法。
  47. 【請求項４７】 請求項４６に記載の方法であって、前記抗真菌剤が、アゾ
    ール化合物である、方法。
  48. 【請求項４８】 請求項４７に記載の方法であっって、前記アゾール化合物
    が、イトラコナゾール、ミコナゾールおよびフルコナゾールからなる群より選択
    される、方法。
  49. 【請求項４９】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が、カフェイ
    ン、プロリン、サリチル酸およびビタミンＥからなる群より選択される、方法。
  50. 【請求項５０】 請求項１に記載の方法であって、前記化合物が治療剤であ
    る、方法。
  51. 【請求項５１】 請求項５０に記載の方法であって、前記治療剤が、シクロ
    スポリン、インスリン、バソプレッシン、ロイシンエンケファリン、Ａｓｕ−ｅ
    ｅｌカルシトニン、５−フルオロウラシル、サリチルアミド、β−ラクトン、ア
    ンピシリン、ペニシリン、セファロスポリン、β−ラクタマーゼインヒビター、
    キノロン、テトラサイクリン、マクロライド、ゲンタマイシン、アシクロビル、
    ガンシクロビル、トリフルオロピリジン、およびペンタミジンからなる群より選
    択される、方法。
  52. 【請求項５２】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、インタ
    クトな皮膚に適用される、方法。
  53. 【請求項５３】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、角質層
    、顆粒層、淡明層および胚芽層のうちの１以上に、およびこれらのうちの１以上
    を横切って送達される、方法。
  54. 【請求項５４】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、皮膚前
    処置がない場合に角質層を通過する、方法。
  55. 【請求項５５】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、局所的
    に投与され、そして前記化合物が、濾胞表皮または濾胞内表皮を含む細胞により
    取り込まれる、方法。
  56. 【請求項５６】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、経皮パ
    ッチにより投与される、方法。
  57. 【請求項５７】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、局所的
    に投与され、そして前記化合物が、乳頭表皮および歯根表皮のうちの１つおよび
    両方に、およびこれらのうちの１つおよび両方を横切って通過する、方法。
  58. 【請求項５８】 請求項５７に記載の方法であって、前記化合物が、表皮に
    存在する細胞により取り込まれる、方法。
  59. 【請求項５９】 請求項５８に記載の方法であって、前記化合物が、線維芽
    細胞、上皮細胞および免疫細胞からなる群より選択される１以上の細胞により取
    り込まれる、方法。
  60. 【請求項６０】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、経口経
    路、経鼻経路、肺経路、口内経路、直腸経路、経皮経路、膣経路または眼の経路
    により投与される、方法。
  61. 【請求項６１】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、胃腸上
    皮で作用する、方法。
  62. 【請求項６２】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、クロー
    ン病、潰瘍性大腸炎、胃腸潰瘍、クローン病、消化性潰瘍疾患、および異常増殖
    疾患からなる群より選択される状態のための治療剤である、方法。
  63. 【請求項６３】 請求項６２に記載の方法であって、前記化合物が、潰瘍の
    ための治療剤であり、そしてＨ2ヒスタミンインヒビター、プロトン−カリウム
    ＡＴＰａｓｅのインヒビター、およびＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ
    に関する抗生物質からなる群より選択される、方法。
  64. 【請求項６４】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、嚢胞性
    線維症、喘息、アレルギー性鼻炎、および慢性閉塞性肺疾患からなる群より選択
    される気管支状態を処置するための治療剤である、方法。
  65. 【請求項６５】 請求項６４に記載の方法であって、前記状態が喘息であり
    、そして前記治療剤が、抗炎症剤、気管支拡張剤、および免疫抑制薬からなる群
    より選択される、方法。
  66. 【請求項６６】 請求項６４に記載の方法であって、前記治療剤が、コルチ
    コステロイド、クロモリン、およびネドクロミルからなる群より選択される抗炎
    症剤である、方法。
  67. 【請求項６７】 請求項４０に記載の方法であって、前記結合体が、吸入に
    より送達される、方法。
  68. 【請求項６８】 請求項４０に記載の方法であって、前記化合物が、虚血、
    パーキンソン病、精神分裂病、癌、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、中枢神
    経系の感染、癲癇、多発性硬化症、神経変性疾患、外傷、鬱病、アルツハイマー
    病、片頭痛、疼痛、および癲癇障害を処置するための治療剤である、方法。
  69. 【請求項６９】 以下を含む結合体： ａ）動物の上皮または内皮組織の１以上の層におよび該層を横切って送達され
    る化合物；およびｂ）５〜２５のアルギニン残基を含む送達増強輸送体；ならび
    にｃ）該結合体が該上皮または内皮組織の１以上の層へおよび該層を横切って通
    過した後に、該化合物を生物学的に活性な形態で該送達増強輸送体から放出する
    、放出可能なリンカー。
  70. 【請求項７０】 請求項６９に記載の結合体であって、前記送達増強輸送体
    が７〜１５のアルギニン残基またはアルギニンアナログを含む、結合体。
  71. 【請求項７１】 請求項６９に記載の結合体であって、前記送達増強輸送体
    が、５〜５０のアミノ酸から本質的になり、このアミノ酸のうちの少なくとも５
    ０％がアルギニンまたはアルギニンアナログである、結合体。
  72. 【請求項７２】 請求項６９に記載の結合体であって、前記送達増強輸送体
    が、少なくとも５つの連続するアルギニンまたはアルギニンアナログを含む、結
    合体。
  73. 【請求項７３】 請求項６９に記載の結合体であって、該結合体の半減期が
    、前記上皮または内皮組織と接触する際に、５分と２４時間との間である、結合
    体。
  74. 【請求項７４】 請求項６９に記載の結合体であって、前記化合物が、溶媒
    媒介性切断により前記リンカーから放出される、結合体。
  75. 【請求項７５】 請求項６９に記載の結合体であって、該結合体が、酸性ｐ
    Ｈで実質的に安定であるが、生理学的ｐＨでは前記化合物が前記送達増強輸送体
    から実質的に放出される、結合体。
  76. 【請求項７６】 請求項６９に記載の結合体であって、該結合体が、以下の
    構造３、４、または５： 【化３】 ここで、 Ｒ1−Ｘは前記化合物を含み； Ｘは、前記リンカーが結合されている該化合物上の官能基であり； ＹはＮまたはＣであり； Ｒ2は、水素、アルキル、アリール、アシル、またはアリルであり； Ｒ3は、前記送達増強輸送体を含み； Ｒ4は置換または非置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ6であり； Ｒ6は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり； ｋおよびｍは、それぞれ独立して１および２から選択され；そして ｎは１〜１０である、 構造からなる群より選択される、結合体。
  77. 【請求項７７】 請求項７６に記載の結合体であって、Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、
    およびＣＲ7Ｒ8からなる群より選択され、Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、
    Ｈおよびアルキルからなる群より選択される、結合体。
  78. 【請求項７８】 請求項７６に記載の結合体であって、該結合体は、構造３
    を含み、ＹはＮであり、そしてＲ2はメチル、エチル、プロピル、ブチル、アリ
    ル、ベンジルまたはフェニルである、結合体。
  79. 【請求項７９】 請求項７８に記載の結合体であって、Ｒ2はフェニルであ
    り；ｋ、ｍ、およびｎはそれぞれ１であり、そしてＸはＯである、結合体。
  80. 【請求項８０】 請求項７６に記載の結合体であって、該結合体が、構造４
    を含み；Ｒ4はＳであり；Ｒ5はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は水素、メチル、アリ
    ル、ブチルまたはフェニルである、結合体。
  81. 【請求項８１】 請求項７６に記載の結合体であって、該結合体は、構造４
    を含み；Ｒ5はＮＨＲ6であり；Ｒ6は、水素、メチル、アリル、ブチルまたはフ
    ェニルであり；そしてｋおよびｍはそれぞれ１である、結合体。
  82. 【請求項８２】 請求項７６に記載の結合体であって、該結合体は、以下： 【化４】 を含み、ここでＰｈはフェニルである、結合体。
  83. 【請求項８３】 請求項７４に記載の結合体であって、該結合体が以下の構
    造６： 【化５】 を含み；ここで、 Ｒ1−Ｘは前記化合物を含み； Ｘは、前記リンカーが結合されている該化合物上の官能基であり； Ａｒは、オルト位またはパラ位で配置された結合ラジカルを有するアリール基で
    あり、該アリール基は、置換または非置換であり得； Ｒ3は、前記送達増強輸送体を含み； Ｒ4は置換または非置換のＳ、Ｏ、ＮまたはＣであり； Ｒ5は、ＯＨ、ＳＨまたはＮＨＲ6であり； Ｒ6は水素、アルキル、アリール、アシルまたはアリルであり；そして ｋおよびｍは、それぞれ独立して１および２から選択される、 結合体。
  84. 【請求項８４】 請求項８３に記載の結合体であって、Ｘは、Ｎ、Ｏ、Ｓお
    よびＣＲ7Ｒ8からなる群より選択され、Ｒ7およびＲ8は、それぞれ独立して、Ｈ
    およびアルキルからなる群より選択される、結合体。
  85. 【請求項８５】 請求項８３に記載の結合体であって、Ｒ4はＳであり；Ｒ5 はＮＨＲ6であり；そしてＲ6は水素、メチル、アリル、ブチルまたはフェニルで
    ある、結合体。
  86. 【請求項８６】 請求項８３に記載の結合体であって、該結合体は、以下： 【化６】 を含む、結合体。
  87. 【請求項８７】 経皮的薬物処方物であって、 治療的に有効な量の治療剤； 非結合形態における生物学的に活性な薬剤の経上皮組織送達と比較して、動物
    の上皮組織の１以上の層を横切る結合体の送達を増大させるに十分なグアニジノ
    またはアミジノ側鎖部分を含む、送達増強ポリマー；および 経皮的薬物投与に適切なビヒクル、 を含む、経皮的薬物処方物。
  88. 【請求項８８】 請求項８７に記載の処方物であって、該処方物が局所的投
    薬形態である、処方物。
  89. 【請求項８９】 請求項８８に記載の処方物であって、前記局所的投薬形態
    が経皮パッチである、処方物。
  90. 【請求項９０】 皮膚炎症状態を処置するための方法であって、該方法は、
    炎症状態に罹患した皮膚と、ａ）グルココルチコイド、シクロスポリン、ＦＫ５
    ０６またはアスコマイシン、およびｂ）５〜２５のアルギニン残基を含む送達増
    強輸送体を含む結合体とを接触させる工程を包含する、方法。
  91. 【請求項９１】 請求項９０に記載の方法であって、前記炎症状態が、乾癬
    、湿疹および円形脱毛症からなる群より選択される、方法。
  92. 【請求項９２】 請求項９０に記載の方法であって、前記グルココルチコイ
    ドがヒドロコルチゾンである、方法。
  93. 【請求項９３】 請求項９０に記載の方法であって、前記結合体がＦＫ５０
    ６を含む、方法。
  94. 【請求項９４】 請求項９０に記載の方法であって、前記結合体がシクロス
    ポリンを含む、方法。
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