WO2013031833A1 - 細胞導入ペプチドと皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入システムおよび美白剤 - Google Patents

細胞導入ペプチドと皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入システムおよび美白剤 Download PDF

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peptide
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skin introduction
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松井　秀樹
宏之 道上
早苗 石川
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国立大学法人岡山大学
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    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin

Definitions

  • the present invention relates to a skin introduction system applicable to pharmaceuticals, quasi drugs, cosmetics, and the like.
  • the present invention also relates to a whitening agent using the system.
  • Patent Document 1 a chemical absorption promotion method in which a fat-soluble functional group is added to a target drug and a reagent such as an ester, a surfactant or an enzyme is used simultaneously
  • Patent Document 2 a method of using ultrasonics in combination with absorption accelerators such as nonionic surfactants, glycerin single-medium chain aliphatic esters and amide compounds
  • Patent Document 3 a method of absorbing into the stratum corneum by forming small pores with microneedles And the physical absorption promotion method.
  • the chemical absorption promotion method has not obtained a sufficient effect at present, and the physical absorption promotion method requires an apparatus for introduction, and further has the possibility of damaging the epidermis.
  • Patent Document 4 a peptide having an amino acid sequence composed of a plurality of consecutive arginines functions as a biological membrane passage signal sequence and has cell membrane permeability.
  • Patent Document 4 there has been no report on how much it is introduced into each cell of skin tissue when applied to the skin.
  • Tyrosinase is activated abnormally by a strong stimulus of ultraviolet rays such as excessive sunburn, the melanin synthesis function becomes very high, and an amount of melanin that cannot be metabolized remains from the skin base layer to the epidermis. Spots appear by repeating this for many years.
  • Hydroquinone (hereinafter also abbreviated as HQ) is the only ingredient recognized by the US Food and Drug Administration (FDA) as a whitening ingredient. A prescription is required. Therefore, the concentration of hydroquinone blended in generally available cosmetics is considerably lower than the effective concentration, and the effect cannot be expected.
  • FDA US Food and Drug Administration
  • An object of the present invention is to provide a skin introduction system capable of efficiently introducing a wide range of drugs into individual cells of each tissue of the skin. It is another object of the present invention to provide a whitening agent having a high whitening effect using this system.
  • the drug passes through the barrier of each layer of the skin and enters the skin. Although it can be introduced, the drug is present in the intercellular space between cells, so that it is difficult to introduce it into individual cells of the skin.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence consisting of 3 to 13 residues of arginine is added to a drug and used together with a skin introduction promoter such as 1-pyrenebutyric acid, The present invention has been completed by finding that it can be introduced and diffused into cells excellent in skin tissues, particularly epidermis and dermis, into subcutaneous tissues and muscle layers.
  • the present invention relates to a skin introduction system characterized by combining a peptide derivative obtained by adding a peptide consisting of an amino acid sequence having 3 to 13 residues of arginine to a drug with a skin introduction accelerator.
  • arginine is more preferably 9 to 13 residues, and most preferably 11 residues.
  • 1-pyrenebutyric acid is preferable as the skin introduction promoter used in the present invention.
  • the skin introduction system of the present invention can be applied to a wide range of drugs for which percutaneous absorption is desired, such as active ingredients such as pharmaceuticals, quasi drugs, and cosmetics.
  • the present invention also relates to a novel whitening agent characterized by combining a peptide derivative obtained by adding a peptide consisting of an amino acid sequence of 3 to 13 residues of arginine with hydroquinone in combination with a skin introduction accelerator.
  • the skin introduction system of the present invention can effectively introduce a drug by direct percutaneous action, it can induce a strong drug action locally only at the place where the drug is applied.
  • the whitening agent of the present invention has a low hydroquinone concentration, for example, can be suppressed to about 1/100 of the effective concentration of hydroquinone alone, thereby suppressing skin irritation and whitening, which are side effects of hydroquinone. it can. Since the whitening agent of the present invention is capable of direct percutaneous action, a strong whitening effect can be induced locally only when the drug is applied.
  • the whitening effect of the present invention is supported by comparing and examining not only the control that is a negative control and the hydroquinone that is a positive control, but also a group using random peptides. It can be used as a whitening agent in conformity with medical treatment based on evidence (EBM).
  • EBM medical treatment based on evidence
  • FIG. 2 is a fluorescence microscopic image showing the distribution of EGFP-11R in tissues of a 1-pyrenebutyric acid combination group and a 1-pyrenebutyric acid non-combination group by immunohistochemical staining.
  • FIG. 8B is a sketch of a nuclear-stained portion stained in blue in the fluorescence microscope image of FIG. 8A.
  • FIG. 8B is a sketch of an EGFP portion emitting fluorescence in green in the fluorescence microscope image of FIG. 8A. It is a fluorescence microscope image of the skin tissue showing the transdermal introduction effect of the EGFP-11R group combined with 1-pyrenebutyric acid. It is a graph which shows the measurement result of tyrosinase activity by MBTH method.
  • the skin introduction system of the present invention is characterized in that a skin introduction promoter is combined with a peptide derivative obtained by adding a peptide consisting of an amino acid sequence of 3 to 13 residues of arginine to a drug.
  • the number of consecutive arginine residues is preferably 9 to 13, and most preferably 11. If the arginine residue is 2 or less or 14 or more, the efficiency of drug introduction from the skin tends to deteriorate.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence consisting of 3 to 13 residues of arginine is a safe drug because it does not affect cell proliferation and does not show cytotoxicity.
  • the description of “added” generally means an amide bond between amino acids when the drug is a peptide or protein, but is not limited to the amide bond.
  • the peptide derivative can be produced not only by a normal artificial synthesis method but also by a genetic engineering technique. For example, a recombinant vector into which a DNA sequence encoding a sequence of several arginines and an amino acid sequence of a drug is inserted is introduced into an appropriate host cell, and then the host cell is cultured. Then, the peptide derivative can be obtained by recovering the culture. After the production, the obtained peptide derivative can be purified by a known method.
  • peptide derivatives are general techniques in this field and can be easily carried out by those skilled in the art.
  • the bond between the drug and a peptide consisting of an amino acid sequence consisting of 3 to 13 residues of arginine can be combined with other substances such as cysteine as long as it has an equivalent activity.
  • cysteine for example, 1 to 20, or 1 to 10, or 1 to 3 amino acid residues may be inserted.
  • cysteine for example, a reactive nitropyridine sulfenyl (NPYS) group or the like can be used to easily link various drugs via SS bonds.
  • NPYS reactive nitropyridine sulfenyl
  • the skin introduction system of the present invention can be applied to a wide range of drugs such as low molecular compounds, peptides, proteins, and is not particularly limited.
  • drugs such as low molecular compounds, peptides, proteins, and is not particularly limited.
  • proteins, physiologically active peptides, low molecular weight compounds and the like that are desired to be introduced from the epidermis, dermis, subcutaneous tissue to muscle layer.
  • the most preferable drugs include hydroquinone and its similar compounds, and very large proteins having a molecular weight of about 30 kDa such as EGFP. It can also be applied to low molecular weight preparations having a tyrosinase inhibitory effect other than HQ, such as when used in a whitening agent.
  • the peptide derivative of the drug of the present invention may contain a marker for confirming that it has been introduced into cells, such as when used in a skin research model.
  • the marker is not particularly limited, and for example, fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC), a fluorescent dye such as rhodamine, and a fluorescent protein such as GFP can be used.
  • the “skin introduction promoter” used in the present invention a negatively charged counteranion having high hydrophobicity can be used, and specific examples thereof include 1-pyrenebutyric acid, but are not limited thereto. It is not something.
  • the method for combining the skin introduction promoter with the peptide derivative of the drug is not particularly limited, but before application of the peptide derivative of the drug, preferably immediately before to 60 minutes, more preferably 1 to 30 minutes before, Most preferably, it can be pretreated with a skin introduction promoter 2 to 10 minutes before.
  • the use of the present invention can be applied to any drugs as long as they are intended for transdermal absorption, such as quasi-drugs, cosmetics, as well as pharmaceuticals.
  • the whitening agent of the present invention is characterized by combining a peptide derivative obtained by adding a peptide having an amino acid sequence in which 3 to 13 residues of arginine are continuous with hydroquinone with a skin introduction accelerator.
  • a hydroquinone concentration of about 4-10% is necessary to obtain a whitening effect, so the 0.2% hydroquinone HQ-11R used this time is compared with the hydroquinone alone.
  • the peptide derivative of hydroquinone which is an active ingredient, may contain a marker for confirming that it has been introduced into cells, such as when used in a model for melanin deposition inhibition research.
  • the marker is not particularly limited, and for example, fluorescein isothiocyanate (hereinafter abbreviated as FITC), a fluorescent dye such as rhodamine, and a fluorescent protein such as GFP can be used.
  • a peptide derivative of a drug which is an active ingredient is prepared by a general method such as a normal artificial synthesis method by producing a peptide moiety by a general artificial synthesis method or a commercially available artificial synthesizer. It can manufacture by adding. After the production, the obtained peptide derivative can be purified by a known method.
  • the production method and purification method of these peptide derivatives are general techniques in this field and can be easily carried out by those skilled in the art.
  • arginine is bonded one by one from the carboxyl terminal side by solid phase synthesis of the peptide, and after the desired number of residues are bonded, the reactive side such as a nitropyridine sulfenyl (NPYS) group
  • NTYS nitropyridine sulfenyl
  • One cysteine residue with a chain is introduced. Thereafter, after deprotection and purification by a conventional method, it is reacted with mercaptohydroquinone, hydroquinone is bound to a cysteine residue, and purification is performed to obtain the hydroquinone peptide derivative of the present invention (FIG. 1).
  • the dosage form of the peptide derivative of the drug and the skin introduction promoting agent, which are active ingredients of the skin introduction system of the present invention, can be appropriately set depending on the administration method. Specifically, liquid agents, such as aqueous solution and emulsion, ointment, etc. can be illustrated.
  • the skin introduction system of the present invention can be used as a skin introduction preparation in which a peptide derivative of a drug as an active ingredient and a skin introduction accelerator are combined.
  • the skin introduction system of the present invention can be in the form of a kit containing a peptide derivative of a drug as an active ingredient and a skin introduction promoter, according to the administration method.
  • the concentration of the peptide derivative of the drug that is an active ingredient of the skin introduction system of the present invention can be appropriately set according to the drug to be used, the dosage form, the substrate to be used, and the like.
  • the concentration of the peptide derivative of the drug is preferably 0.2 to 20 mg / g.
  • the skin introduction system of the present invention comprises suitable pharmaceutically acceptable excipients, carriers, solvents, gel formers, antioxidants, diluents, isotonicity Components commonly used in this technical field such as an agent and a pH stabilizer may be added. These additives are usually appropriately selected by those skilled in the art.
  • Any pharmaceutical, quasi-drug or cosmetic to which the peptide derivative of the drug of the present invention is added can be used and is not particularly limited. The effect can be exhibited.
  • the obtained crude product was separated and purified in a water-acetonitrile system containing 0.1% trifluoroacetic acid using an HPLC fractionator (LC-8A-1, manufactured by Shimadzu Corporation, column: ODS 30 ⁇ 250 mm).
  • HPLC fractionator LC-8A-1, manufactured by Shimadzu Corporation, column: ODS 30 ⁇ 250 mm.
  • a fraction of the desired peptide derivative was obtained, and acetonitrile was distilled off, followed by lyophilization to obtain 25 mg of the desired hydroquinone peptide derivative (abbreviated as HQ-11R).
  • HQ-11R hydroquinone peptide derivative
  • a product in which a peptide having the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was bound to hydroquinone (HQ-GLHFPHYVRD) was also produced in the same manner.
  • a lysis buffer containing 8M urea, 20 mM MEPES, and 100 mM NaCl was added and suspended, and then ultrasonic cell disruption was performed (Kubota, Sonata 201M). After crushing, the solution was centrifuged at 12,000 rpm for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The collected supernatant was reacted with lysine beads (Invitrogen, ProBond Resin) equilibrated with lysis buffer. Then, it was washed 3 times with a washing buffer containing 8M urea, 20 mM MEPES, 100 mM NaCl, and 20 mM imidazole. After washing, the product was eluted with an elution buffer containing 8M urea, 20 mM MEPES, 100 mM NaCl, and 200 mM imidazole, and collected.
  • the back of the hair-removed brown guinea pig was depilated with a hair clipper (ER509, Matsushita Electric Works) and a hair removal cream (epilat, Kracie).
  • a hair clipper ER509, Matsushita Electric Works
  • a hair removal cream epilat, Kracie
  • the irradiation area was set to 4 sections with 6 cm 2 per section, and the UV irradiation machine was measured while measuring the UV intensity with an ultraviolet UVB intensity measuring device (VLX-3, W, manufactured by ATTO Corporation).
  • VLX-3 ultraviolet UVB intensity measuring device
  • MODEL UVM-57, Funakoshi was irradiated with an ultraviolet dose of 0.015 Jls / cm 2 once a day for 5 days, rested for 2 days, and further irradiated for 5 days.
  • the administration schedule was 5 days continuous application (once a day)-2 days off-5 days again (once a day)-2 days off.
  • the number of melanin-containing cells in FIG. 4 was observed in 20 fields in each group, and statistically evaluated with other groups by Student T test. As a result, the HQ-11R group had a significant difference (p ⁇ 0.01). A decrease in melanin-containing cells was observed as compared to other groups (p ⁇ 0.01, FIG. 5).
  • Paraffin sections were prepared, and 100% ethanol, 95% ethanol, 90% ethanol, and 70% ethanol were sequentially added to xylene for 1 minute each for 1 minute. Washed with water, 10% Fontana ammonia silver dyeing solution was added dropwise, protected from light, and allowed to stand for 16 hours. After washing with water, a 0.25% aqueous sodium thiosulfate solution was added dropwise for 1 minute. After washing with water, the Cologne Echlot funnel was added dropwise for 5 minutes. After washing with water, 70% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol, and 100% ethanol were added dropwise for 1 minute each. Xylene was added dropwise for 5 minutes, sealed and observed.
  • Example 2 Inhibitory effect of HQ-11R on melanin content
  • B16 cells (Mouse B16 melanoma 4A5, ECACC) were used to evaluate the effect on intracellular melanin levels.
  • B16 cells are malignant melanoma cells that have developed in the skin of mice and have specific melanin producing ability. For this reason, it is widely used as a research material for regulating functions related to melanin synthesis and searching for melanin production inhibitors.
  • B16 cells are 10% (v / v) fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 100 units / ml penicillin (Gibco), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Gibco), and 0.2% L-glutamine ( The cells were cultured in plastic dishes (diameter 10 cm, Corning, Glendale, AZ, USA) using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco) containing Gibco at 37 ° C. and 5% CO 2 . 1 ⁇ 10 5 B16 cells were seeded per well in a 6-well plate, cultured at 37 ° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the results are shown in FIG. 6 as a ratio to the control.
  • the amount of melanin was significantly reduced in cells administered with HQ alone and HQ-11R.
  • an effect equivalent to that of HQ was not obtained, and the melanin amount was hardly changed up to 20 ⁇ M.
  • no decrease in melanin was observed in the group receiving only 11R.
  • HQ-11R was found to have a melanin reducing effect equivalent to or higher than HQ.
  • Example 3 Examination of a compound (EGFP-11R) in which EGFP (enhanced green fluorescence protein) is added to an amino acid sequence in which 11 residues of arginine are continuous
  • B16 cells (Mouse B16 melanoma 4A5, ECACC) were used to evaluate the cell membrane-passing action.
  • B16 cells are 10% (v / v) fetal bovine serum (Gibco, Carlsbad, CA, USA), 100 units / ml penicillin (Gibco), 100 ⁇ g / ml streptomycin (Gibco), and 0.2% L-glutamine ( The cells were cultured in plastic dishes (diameter 10 cm, Corning, Glendale, AZ, USA) using Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Gibco) containing Gibco at 37 ° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the glass bottom dish in which B16 cells were cultured was washed twice with PBS. Subsequently, 67 mM 1-pyrenebutyric acid diluted with PBS was added to the 1-pyrenebutyric acid treatment group so as to have a final concentration of 50 ⁇ M, followed by incubation at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 minutes, and then a final concentration of 5 ⁇ M. Then, EGFP-11R obtained in Production Example 2 diluted with PBS was added. To the other group, EGFP-11R diluted with PBS to a final concentration of 5 ⁇ M was added. Both were cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 2 minutes, then washed twice with PBS, replaced with culture medium, and observed with a confocal laser microscope every 0.5, 2, 4, and 8 hours.
  • the group treated with 67 ⁇ M 1-pyrenebutyric acid for 2 minutes and added with the same amount of EGFP-11R was introduced into the cells, and the diffusion of the green fluorescent substance in the cells was further enhanced (FIG. 5). 7).
  • Reference Example 1 Evaluation of cell viability 500 B16 cells were cultured per well at 37 ° C. and 5% CO 2 in five 96-well plates (IWAKI, AGC Techno Glass Co., Ltd.). After 16 hours, hydroquinone (Sigma-Aldrich) and HQ-11R diluted with PBS were added to 500 nM, 5 ⁇ M, and 50 ⁇ M, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. and 5% CO 2 . The plate was equilibrated to room temperature every 0, 24, 48, and 72 hours, and the adjusted Cell Titer-Glo reagent (Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega) was added to each well in an amount equivalent to the medium.
  • Cell Titer-Glo reagent Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay, Promega
  • Reference Example 2 Measurement of tyrosinase activity by MBTH 5000 B16 cells were seeded per well in a 96-well plate and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 12 hours. The culture solution was discarded and 1% Triton X-100 diluted with PBS, 0.1% L-DOPA (3,4-dihydroxy-L-phenylalanine) and 20.7 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thia Zolinone hydrazone hydrochloride monohydrate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added at 50 ⁇ L per well, and 5.0 ⁇ M, 500 nM or 50 nM HQ-11R was added at 50 ⁇ L per well, and 2 at 37 ° C.
  • SEQ ID NO: 1 peptide having an artificial random amino acid sequence

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Abstract

　広範な薬物を効率的に皮膚各組織の個々の細胞内へ導入することを可能とする皮膚導入システムを提供すること。また、このシステムを利用した、高い美白効果を奏する美白剤を提供する。アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体に、皮膚導入促進剤を組み合わせることを特徴とする皮膚導入システム。ハイドロキノンにアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したハイドロキノンのペプチド誘導体を含む美白剤であって、皮膚導入促進剤との組み合わせを特徴とする美白剤。

Description

細胞導入ペプチドと皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入システムおよび美白剤
　本発明は、医薬品、医薬部外品または化粧料等に応用可能な皮膚導入システムに関する。本発明はまた、該システムを利用した美白剤に関する。
　一般的に薬物を経皮的に吸収させる方法としては、標的薬剤に脂溶性官能基を付加し、エステルまたは界面活性剤、酵素などの試薬を同時に使用する化学的吸収促進法（特許文献１）や、非イオン系界面活性剤、グリセリン単中鎖脂肪族エステル、アミド化合物などの吸収促進剤と超音波を併用する方法（特許文献２）およびマイクロニードルによる小孔形成により角質層へ吸収させる方法といった物理的吸収促進法（特許文献３）などが挙げられる。
　しかしながら、化学的吸収促進法では、現在のところ充分な効果は得られておらず、また、物理的吸収促進法では、導入に関して装置を必要とし、さらに表皮を傷つける可能性が指摘されている。
　一方、アルギニンが複数個連続したアミノ酸配列を有するペプチドが生体膜通過シグナル配列として機能し、細胞膜透過性を有することが報告されている（特許文献４）。しかしながら、皮膚に対して適用した場合、どの程度皮膚組織の各細胞内に導入されるかなどについては、これまで全く報告されていない。
　特に、分子量５００Ｄａ以上の化合物や非脂溶性薬物などの皮膚導入については、これまでに有効な導入システムは報告されていない。
　また、メラニン産生およびメラニン輸送のメカニズムは、その基礎研究・応用研究に従事する者のみならず、広く一般の人々の間においても絶えず関心の尽きない話題である。過度の日焼けなどの紫外線の強い刺激によりチロシナーゼが異常に活性化し、メラニン合成機能が非常に高くなり、代謝しきれない量のメラニンが皮膚基底層から表皮にいたるまで残存する。これを長年繰り返すことにより、現れてくるのがシミである。
　ハイドロキノン（以下、ＨＱとも略称する）は美白成分としてアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）が認めている唯一の成分であるが、肌への刺激性が非常に強いため４％を超えるものに関しては医師の処方が必要とされる。したがって、一般に市販されている化粧品などでは配合されているハイドロキノン濃度は有効濃度よりかなり低く、その効果が期待できるものではない。
　また、美白効果のある濃度でハイドロキノンを使用した場合、「白抜き」と呼ばれる一部分が非常に白く色素が脱色されまだらになるような副作用を呈することも報告されている。これは、特に肌に敏感な女性への使用を考慮した場合、致命的な問題点となる。
　したがって、非脂溶性低分子化合物や、タンパク質などの高分子化合物など様々な有効成分をより効果的に皮膚に導入できる新たなシステムが切望されている。
国際公開第２００７／１１９４６７号 特開平１１－３３５２７１号公報 特開２００４－５０１７２５号公報 特開２００３－２５２８９８号公報
　本発明の目的は、広範な薬物を効率的に皮膚の各組織の個々の細胞内へ導入することを可能とする皮膚導入システムを提供することである。また、このシステムを利用した、高い美白効果を奏する美白剤を提供することも目的とする。
　本発明者が検討したところ、これまで知られているポリアルギニンやＴＡＴのタンパク質導入ドメインなどの細胞透過性シグナル配列を使用するだけでは、薬物を皮膚の各層のバリアを通過させて皮膚内へと導入することは可能でも、薬物が細胞と細胞の間の細胞間隙に存在してしまい皮膚の個々の細胞内への導入は困難であった。それにもかかわらず、驚くべきことに、アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加し、１－ピレン酪酸などの皮膚導入促進剤を併用した場合には、該薬物の優れた、皮膚組織、とりわけ表皮および真皮から皮下組織、筋層までのそれぞれの細胞への導入・拡散が可能となることを見出し、本発明が完成された。
　すなわち、本発明は、アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体を、皮膚導入促進剤と組み合わせることを特徴とする皮膚導入システムに関する。本発明において、アルギニンは９～１３残基がより好ましく、１１残基が最も好ましい。
　また、本発明に使用する皮膚導入促進剤としては、１－ピレン酪酸が好ましい。
　さらに、本発明の皮膚導入システムは、医薬品、医薬部外品または化粧料などの有効成分のように経皮吸収が望まれる広範な薬物に応用することができる。
　また、本発明は、ハイドロキノンにアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したペプチド誘導体を皮膚導入促進剤との組み合わせることを特徴とする新規美白剤に関する。
　本発明によれば、皮膚組織、とりわけ表皮および真皮から皮下組織までの細胞に広範な薬物を導入・拡散することが可能となる。また、本発明の皮膚導入システムは、経皮的な直接作用により効果的に薬物を導入できるため、薬剤を塗布したところにだけ局所的に強力な薬物作用を誘導することができる。
　本発明の美白剤は、ハイドロキノンの濃度を低く、たとえばハイドロキノン単独での有効濃度の約１００分の１程度に抑えることができ、それによりハイドロキノンの副作用である皮膚刺激や白抜きなどを抑えることができる。本発明の美白剤は、経皮的な直接作用が可能であるため、薬剤を塗布したところだけ局所的に強力な美白効果を誘導することができる。
　さらには、本発明の美白効果は、陰性対照であるコントロールおよび陽性対照であるハイドロキノンのみならず、ランダムなペプチドを使用した群とも比較検討して裏付けられたものであり、従来の他剤にはない、根拠に基づいた医療（ＥＢＭ）に即した美白剤として用いることが可能である。
本発明の美白剤の合成スキーム例である。 モルモットの皮膚に対する美白効果を評価する写真データである。（ａ）が治療前、（ｂ）が治療後の写真である。 ヘマトキシリン・エオジン染色を施した組織の顕微鏡像である。 フォンタナ・マッソン染色を施した組織の光学顕微鏡像である。 図４の組織におけるメラニン陽性細胞数を示すグラフである。 ＨＱおよびＨＱ－１１Ｒ投与による、Ｂ１６マウス悪性黒色腫瘍細胞におけるメラニン量の測定結果を示すグラフである。 Ｂ１６マウス悪性黒色腫瘍細胞におけるＥＧＦＰ導入を評価する蛍光顕微鏡像である。 モルモットの皮膚におけるＥＧＦＰ導入を評価する蛍光顕微鏡像である。 免疫組織染色による１－ピレン酪酸併用群および１－ピレン酪酸非併用群のＥＧＦＰ－１１Ｒの組織内分布を示す蛍光顕微鏡像である。 図８Ａの蛍光顕微鏡像の青色に染色された核染色部分のスケッチである。 図８Ａの蛍光顕微鏡像の緑色に蛍光を発しているＥＧＦＰ部分のスケッチである。 １－ピレン酪酸併用ＥＧＦＰ－１１Ｒ群の経皮導入効果を示す皮膚組織の蛍光顕微鏡像である。 ＭＢＴＨ法によるチロシナーゼ活性の測定結果を示すグラフである。
　本発明の皮膚導入システムは、アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体に皮膚導入促進剤を組み合わせることを特徴とする。
　連続するアルギニンの残基数としては９～１３が好ましく、１１が最も好ましい。アルギニン残基が２以下または１４以上であると、薬物の皮膚からの導入効率が悪くなる傾向がある。アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドは、細胞増殖に影響を及ぼすことなく、また細胞障害性も示さないため、安全な薬剤である。
　本明細書において、「付加した」との記載は、薬物がペプチドやタンパク質である場合には、アミノ酸同士のアミド結合を一般的には意味するが、そのアミド結合に限定されるものではない。そして薬物がペプチドやタンパク質である場合、このペプチド誘導体は、通常の人工合成法のみならず、遺伝子工学的手法を用いて製造することもできる。たとえば、数個のアルギニンが連続する配列および薬物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを挿入した組換えベクターを作製し、適当な宿主細胞に組換えベクターを導入後、その宿主細胞を培養する。ついで、培養物を回収することにより、ペプチド誘導体を得ることができる。製造後、得られたペプチド誘導体は公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド誘導体の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。また、薬物がアミノ酸、ペプチドおよびタンパク質以外の有機化合物である場合、薬物とアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドとの結合は、同等の活性を有する限り、たとえばシステインなどの他のアミノ酸や他の化学結合を介して行なうことができ、アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドと薬物との間には、たとえば１～２０個、または１～１０個、または１～３個のアミノ酸残基が挿入されていてもよい。システインを利用する場合には、たとえば反応性のニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などを用いて様々な薬物と容易にＳ－Ｓ結合により連結することができる。
　本発明の皮膚導入システムは、低分子化合物、ペプチド、タンパク質など広範な薬物に適用でき、特に限定されるものではない。たとえば表皮、真皮、皮下組織から筋層にかけて導入されることが望まれるようなタンパク質や生理活性ペプチド、低分子化合物などが挙げられる。最も好ましい薬物としては、ハイドロキノンやその類似化合物、ＥＧＦＰなどの分子量３０ｋＤａ程度の非常に大きなタンパク質などが挙げられる。美白剤に使用する場合など、ＨＱ以外のチロシナーゼ抑制効果を有する低分子製剤にも適用することができる。
　また、本発明の薬物のペプチド誘導体には、有効成分である薬物以外に、皮膚研究のモデルに使用する場合など、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
　もちろん現在使用されている、経皮用薬物にアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加し、皮膚導入促進剤と組み合わせることにより、飛躍的にその導入効果を増大することができる。
　本発明において使用される「皮膚導入促進剤」としては、高い疎水性を有する負に帯電したカウンターアニオンを使用することができ、具体的には１－ピレン酪酸が挙げられるが、これに限定されるものではない。皮膚導入促進剤を、薬物のペプチド誘導体と組み合わせる方法としては、特に限定されるものではないが、薬物のペプチド誘導体の塗布前、好ましくは直前～６０分前、より好ましくは１～３０分前、最も好ましくは２～１０分前に皮膚導入促進剤により前処理することができる。
　本発明の用途は、医薬品類はもとより、医薬部外品類、化粧品類等、経皮吸収を目的とするものであれば、どのような薬物にも適用可能である。
　また、本発明の美白剤は、ハイドロキノンにアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したペプチド誘導体を皮膚導入促進剤と組み合わせることを特徴とするものである。臨床の現場では、４～１０％程度のハイドロキノン濃度が、美白効果を得るために必要であると報告されているため、今回使用した０．２％ハイドロキノン量のＨＱ－１１Ｒは、ハイドロキノン単体と比較した場合、約２０～１００倍程度の強いチロシナーゼ抑制効果を示し、日焼け後の美白および日焼けの予防のいずれの用途にも使用することができる。つまり、ハイドロキノンの実質的な使用量を約２０分の１～約１００分の１程度に抑えることができる。
　さらに、本発明の美白剤において、有効成分であるハイドロキノンのペプチド誘導体は、メラニン沈着抑制研究のモデルに使用する場合など、細胞内に導入されたことを確認するためのマーカーを含有しても良い。マーカーは、特に限定されるものではなく、たとえば、フルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣと略称する）、ローダミンなどの蛍光色素、およびＧＦＰなどの蛍光タンパク質を使用することができる。
　本発明において、有効成分である薬物のペプチド誘導体は、通常の人工合成法によって、または一般に市販されている人工合成機によってペプチド部分を製造し、通常の人工合成法などの一般的な方法により薬物を付加することにより製造することができる。製造後、得られたペプチド誘導体は、公知の方法で精製することもできる。これらのペプチド誘導体の製造法および精製法は、本分野において一般的な手法であり、当業者により容易に実施されるものである。
　たとえば、薬物がハイドロキノンの場合、ペプチドの固相合成によりアルギニンを１残基ずつカルボキシル末端側から結合させ、所望の残基数結合した後、ニトロピリジンスルフェニル（ＮＰＹＳ）基などの反応性の側鎖を有するシステイン残基を１つ導入する。その後定法にて脱保護および精製したのち、メルカプトハイドロキノンと反応させ、システイン残基にハイドロキノンを結合させ、精製して本発明のハイドロキノンのペプチド誘導体を得ることができる（図１）。
　本発明の皮膚導入システムの有効成分である薬物のペプチド誘導体や皮膚導入促進剤の剤形は、投与方法によって適宜設定することができる。具体的には、水溶液や乳液などの液剤、および軟膏などを例示することができる。
　本発明の皮膚導入システムは、有効成分である薬物のペプチド誘導体と皮膚導入促進剤とを組み合わせた皮膚導入製剤として用いることができる。また、本発明の皮膚導入システムは、その投与方法に合わせて、有効成分である薬物のペプチド誘導体と皮膚導入促進剤とを含有するキットの態様にすることもできる。
　本発明の皮膚導入システムの有効成分である薬物のペプチド誘導体の濃度は、使用する薬物、剤形、使用する基材などにあわせて適宜設定することができる。たとえば、薬物としてハイドロキノンを用い、親水性軟膏とする場合、薬物のペプチド誘導体の濃度は０．２～２０ｍｇ／ｇであることが好ましい。
　本発明の皮膚導入システムは、有効成分である薬物のペプチド誘導体の他に、適当な薬学的に許容され得る賦形剤、担体、溶媒、ゲル形成剤、酸化防止剤、希釈剤、等張化剤、ｐＨ安定化剤など、本技術分野において通常用いられている成分を添加してもよい。これらの添加剤は、通常当業者により適宜選択される。
　本発明の薬物のペプチド誘導体を添加する医薬品、医薬部外品または化粧料としては、どのようなものでも使用することができ、特に限定されるものではないが、皮膚導入促進剤と組み合わせることによりその効果を発揮することができる。
　以下、実施例によって、本発明の皮膚導入システムをさらに詳細に説明するが、本発明はその趣旨と適用範囲から逸脱しない限りこれらに限定されるものではない。
製造例１
（Ａ）保護ペプチド樹脂の構築
　ペプチド自動合成機（４３３Ａ、アプライドバイオシステム（Applied Biosystems）社製）を用いて添付のソフトにしたがい、固相合成法により１個ずつアミノ酸をカルボキシル末端側から結合させＢｏｃ－Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）－［Ａｒｇ（Ｐｂｆ）］11－樹脂の合成を定法にて行なった。
（Ｂ）脱保護と樹脂からの切り出し
　精製後、脱保護を行い、樹脂から切り出し、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）－［Ａｒｇ］11－ＮＨ2を得た。
（Ｃ）ハイドロキノンへの付加
　（Ｂ）で得られた、Ｃｙｓ（Ｎｐｙｓ）－［Ａｒｇ］11－ＮＨ2（６０ｍｇ）を純水（１．２ｍｌ）に溶解し、２－メルカプトハイドロキノン（３．６ｍｇ、０．８当量）をアルゴン気流中で室温にて攪拌しながら添加した。一昼夜反応後、反応溶液を直接分取精製に供した。
　得られた粗精製物をＨＰＬＣ分取装置（ＬＣ－８Ａ－１、島津製作所製、カラム：ＯＤＳ３０×２５０ｍｍ）を用いて０．１％トリフルオロ酢酸を含む水－アセトニトリルの系で分取精製し、目的のペプチド誘導体の分画を得、アセトニトリルを留去した後、凍結乾燥粉末とし、目的物であるハイドロキノンのペプチド誘導体（ＨＱ－１１Ｒと略称する）２５ｍｇを得た。
　ハイドロキノンに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ－ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）も同様に製造した。
製造例２
　構築したpet21a ＥＧＦＰ－１１Ｒプラスミドを大腸菌ＢＬ２１株に形質転換した、その後、単一のコロニーをピックアップし、１００ｍＬのＬＢ－Ａｍｐ培地にて３７℃で一晩培養した。これを１ＬのＬＢ－Ａｍｐ培地に加えて、ＯＤ６００が０．６になるまで３７℃で培養した。その後、ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭになるように加え、ｐＥＴ２１ａ－ＥＧＦＰ－１１Ｒについては２５℃で一晩培養した。培養後、発現誘導した培養液を集菌した（８，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）。続いて、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌを含む溶菌バッファーを３０ｍＬ加えて懸濁させた後、超音波菌体破砕を行った（クボタ、Ｉｓｏｎａｔｅｒ２０１Ｍ）。破砕後、溶液を１２，０００ｒｐｍ、１５分、４℃で遠心し、上清を回収した。回収した上清を溶菌バッファーで平衡化したリジンビーズ（インビトロジェン、ＰｒｏＢｏｎｄ Ｒｅｓｉｎ）と反応させた。その後、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾールを含む洗浄バッファーで３回洗浄した。洗浄後、８Ｍ 尿素、２０ｍＭ ＭＥＰＥＳ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭ イミダゾールを含む溶出バッファーで溶出し、回収した。
　回収したタンパク質溶液中のイミダゾールを除去するために、Ｓｌｉｄｅ－Ａ－Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（Ｅｘｔｒａ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ）（テルモ　ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）により透析を行った。透析用のバッファーとして、１０００倍量のＰＢＳを使用した。透析は６時間を２回行なった。最終的に、目的の濃度になるように限外濾過法にてタンパク濃縮を行った。
実施例１：褐色モルモットを用いた美白効果の検討
　実験には、褐色モルモット（Weiser-Maples、８週齢、雌、各群ｎ＝５）を使用した。褐色モルモットは、表皮基底層に色素細胞を有しており、ヒトの皮膚と似ている。紫外線照射により、ヒトと同様の皮膚反応を示し、メラニン色素の沈着を形成する。そのため、美白効果のアッセイに用いることができる。
　脱毛した褐色モルモットの背中をバリカン（ＥＲ５０９、松下電工）および除毛クリーム（epilat, Kracie）により脱毛した。脱毛した褐色モルモットの背中に、照射面積を一区画６ｃｍ2で４区画設定し、紫外線ＵＶＢ強度測定装置（ＶＬＸ－３,Ｗ、アトー株式会社製）にてＵＶ強度を測定しつつ、ＵＶ照射機（ＭＯＤＥＬ　ＵＶＭ－５７、フナコシ）により、１日１回紫外線量０．０１５Ｊｌｓ／ｃｍ2を５日間照射し、２日間休んでさらに５日間照射した。日焼けモデルを作製後、プロピレングリコールにて調整した５００μＭの１－ピレン酪酸５０μＬを塗布し、５分後、プロピレングリコールにて調整した５００μＭのＨＱ－１１Ｒ、ＨＱ、ＨＱに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ－ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）およびＰＢＳ（陰性対照）を１回につき５０μＬずつ塗布した。
　投与スケジュールは、５日間連続塗布（１日１回）－２日休薬－再度５日間塗布（１日１回）－２日休薬、とした。
　結果、外観にてＨＱ－１１Ｒを用いた群の塗布部分のみが効果的な美白作用を示した（図２）。
　さらに、美白効果を顕微鏡下で詳細に検討するために、ヘマトキシリン・エオジン染色とフォンタナ・マッソン染色後、光学顕微鏡（×４０）にて観察し、組織障害およびリンパ球の浸潤、メラニン含有細胞について後述する手順で評価を行なった（図２、図３、図４）。ＨＱ－１１Ｒ群の塗布部分の組織においては、他の群と同様、アレルギー反応やリンパ球浸潤などの細胞・組織障害性は認められず、４群間において有意な差は認められなかった（図３）。フォンタナ・マッソン染色においてメラニン含有細胞数を確認したところ、明らかにＨＱ－１１Ｒ群の塗布部で有意に陽性細胞、すなわちメラニン含有細胞４が減少していた（図４）。図４のメラニン含有細胞数を各群２０視野にて観測し、スチューデントＴ検定にて、他の群と統計学的に評価したところ、ＨＱ－１１Ｒ群が有意差（ｐ＜０．０１）をもって他群よりもメラニン含有細胞の減少を認めた（ｐ＜０．０１、図５）。
（免疫染色）
　新鮮凍結切片を、４％ＰＦＡにて１０分間固定した。ＰＢＳにて３回洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＰＢＳで調整した５％ ＢＳＡおよび０．３％トリトン）にてブロッキングを行った。ＰＢＳにて１回洗浄した。濃度１ｕｇ／ｍｌとなるようＰＢＳ中１０％ＢＳＡにて調整した一次抗体を添加し、４℃、１６時間静置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。濃度１μｇ／ｍｌとなるようにＰＢＳ中１０％ＢＳＡにて調整した二次抗体を添加し、暗所、室温で２時間静置した。ＰＢＳにて３回洗浄した。ヘキストを添加し、暗所で１分間染色した。ＰＢＳにて３回洗浄し、共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
（フォンタナ・マッソン染色）
　パラフィン切片を作製し、キシレンに５分間、１００％エタノール、９５％エタノール、９０％エタノールおよび７０％エタノールを順に各１分間滴下した。水洗し、１０％フォンタナアンモニア銀染色液を滴下し、遮光して１６時間静置した。水洗し、０．２５％チオ硫酸ナトリウム水溶液を１分間滴下した。水洗し、ケルンエヒトロート液を５分間滴下した。水洗し、７０％エタノール、９０％エタノール、９５％エタノールおよび１００％エタノールを順に各１分間滴下した。キシレンを５分間滴下し、封入し観察した。
（フォンタナ・マッソン染色によるメラニン陽性細胞数の計測）
　フォンタナ・マッソン染色を行ったサンプルについて、各サンプルにつき顕微鏡にて基底層をランダムに１０箇所撮影し、各箇所でのメラニン陽性細胞の個数を計測した。
実施例２：メラニン含有量に対するＨＱ－１１Ｒの阻害効果
　マウス悪性メラノーマ細胞Ｂ１６細胞（Mouse B16 melanoma 4A5、ECACC）を用いて細胞内のメラニン量に対する効果を評価した。Ｂ１６細胞は、マウスの皮膚に発生した悪性黒色腫瘍細胞であり、特異的なメラニン産生能を有している。そのため、メラニン合成に関わる機能調節やメラニン産生抑制物質検索のための研究材料として汎用されている。Ｂ１６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ギブコ、カールスバッド、ＣＡ、米国）、１００単位／ｍｌペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ）、および０．２％Ｌ－グルタミン（ギブコ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ）を用いてプラスチックディッシュ（直径１０ｃｍ、コーニング、グレンデール、ＡＺ、米国）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。６ウェルプレートにＢ１６細胞を１ウェルあたり１×１０5個播種し、前述の培地を用いて３７℃、５％ＣＯ2下で培養後、最終濃度が５０μＭとなるように、ＰＢＳにて希釈した１－ピレン酪酸を添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した。その後、ＰＢＳにて希釈したＨＱ、ＨＱ－１１Ｒ、ＨＱに配列番号１記載のアミノ酸配列を有するペプチドを結合させたもの（ＨＱ－ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ）を最終濃度が各１０、２０および３０μＭになるように添加し（対照群は、ＰＢＳのみ添加）、２４時間培養した後、１Ｎ ＮａＯＨを０．５ｍｌ加えて８０℃で１時間メラニン可溶化処理を行い、吸光光度計にて４１５ｎｍの波長で測定した。
　結果を対照との比として図６に示す。ＨＱ単独およびＨＱ－１１Ｒ投与された細胞ではメラニン量が顕著に減少していた。また、ＨＱ－ＧＬＨＦＰＨＩＹＶＲＤ投与群では、ＨＱと同等の効果は得られず、２０μＭまでほとんどメラニン量に変化はみられなかった。さらに１１Ｒのみ投与している群では、メラニンの減少は全く認められなかった。これにより、細胞レベルにおいては、ＨＱ－１１ＲはＨＱと同等またはそれ以上のメラニン減少効果が認められた。
実施例３：アルギニン１１残基が連続したアミノ酸配列にＥＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質：enhanced green fluorescence protein）を付加した化合物（ＥＧＦＰ－１１Ｒ）についての検討
（Ａ）細胞膜通過作用の評価
　マウス悪性メラノーマ細胞Ｂ１６細胞（Mouse B16 melanoma 4A5、ECACC）を用いて、細胞膜通過作用に対する評価を行なった。Ｂ１６細胞は１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ギブコ、カールスバッド、ＣＡ、米国）、１００単位／ｍｌペニシリン（ギブコ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ギブコ）、および０．２％Ｌ－グルタミン（ギブコ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ）を用いてプラスチックディッシュ（直径１０ｃｍ、コーニング、グレンデール、ＡＺ、米国）中で、３７℃、５％ＣＯ2下で培養した。コンフルエント状態にまで培養した細胞を回収し、１０分の１量の細胞を３ｍｌの新しい培地を含む３５ｍｍガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業株式会社）に播き培養を続け、翌日のＥＧＦＰ導入観察に用いた。
　Ｂ１６細胞を培養したガラスボトムディッシュをＰＢＳにて２回洗浄した。ついで、１－ピレン酪酸処理群にはＰＢＳにて希釈した６７ｍＭ １－ピレン酪酸を最終濃度が５０μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した後、最終濃度５μＭとなるように、ＰＢＳで希釈した製造例２で得られたＥＧＦＰ－１１Ｒを添加した。もう一群には、最終濃度５μＭとなるように、ＰＢＳにて希釈したＥＧＦＰ－１１Ｒを添加した。どちらも３７℃、５％ＣＯ2下で２分間培養した後、ＰＢＳにて２回洗い、培養培地に置き換え、０．５、２、４、８時間ごとに共焦点レーザー顕微鏡にて観察した。
　１１個のアルギニンである１１Ｒを融合したタンパク質ＥＧＦＰ－１１Ｒ５は、細胞膜を通過して、細胞内に局在し、１１Ｒを付加していないＥＧＦＰは、細胞内へと導入されなかった。また、６７μＭの１－ピレン酪酸で２分間処理を行い、ＥＧＦＰ－１１Ｒを同量加えた群は、細胞内に導入され、より細胞内での緑色蛍光物質の拡散の増強が認められた（図７）。
（Ｂ）モルモット皮膚へのＥＧＦＰ－１１Ｒ導入
　実験には褐色モルモット（Weiser-Maples、８週例、雌、ｎ＝５）を用いた。モルモットの背中をバリカン（ＥＲ５０９、松下電工）および除毛クリーム（epilat, Kracie）により脱毛した。プロピレングリコールに溶解した５００μＭの１－ピレン酪酸を５０μＬずつモルモット皮膚６ｃｍ2あたり塗布した。５分後、同じ部位にプロピレングリコールに溶解したＥＧＦＰ－１１Ｒ（５０μＭ）およびＥＧＦＰ（８０μＭ）を５０μＬずつ塗布した。塗布後０．５時間、２時間、４時間、８時間、２４時間ごとにデルマパンチ（３ｍｍ、マルホ株式会社）を用いて皮膚サンプルを採取した。新鮮凍結切片（厚さ１０μｍ）を作成後、ローダミン　ファロイジン、ＤＡＰＩにより染色を行った。そして、共焦点レーザー顕微鏡により観察した。ＥＧＦＰ６のみでは、皮膚への導入は見られなかった。ＥＧＦＰ－１１Ｒのみの塗布群では、ＥＧＦＰ－１１Ｒ５は皮膚組織へと導入されたが、皮膚の細胞内へは導入されずに皮膚構成細胞間隙に局在し組織全体（表皮・真皮・皮下組織）への拡散は認められなかった（図８）。１－ピレン酪酸とＥＧＦＰ－１１Ｒとの組み合わせ群では皮膚塗布後０．５時間より、表皮・真皮・皮下組織全体へ拡散し、４～８時間でピークに達し、２４時間後でも皮膚内に残存していることを確認した（図９および図１０）。図１０中、白く光って観察される部分がＥＧＦＰ－１１Ｒが存在する部分である。
参考例１：細胞生存能の評価
　９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ、ＡＧＣテクノグラス株式会社）５枚にＢ１６細胞を３７℃、５％ＣＯ2下で１ウェルあたり５００個培養した。１６時間後、ＰＢＳにて希釈したハイドロキノン（シグマ－アルドリッチ）およびＨＱ－１１Ｒを５００ｎＭ、５μＭ、５０μＭとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ2下で静置した。０、２４、４８、７２時間ごとにプレートを室温に平衡化し、調整したCell Titer-Glo試薬（Cell Titer-Glo Luminescent Cell Viability Assay、プロメガ）を、各ウェルに培地と等量添加した。シェーカーで２分間攪拌し、室温で１０分間静置している間に、各ウェルをホワイトプレート（マイクロプレート９６－ウェル　Pswhite、Porvair advanced materials）に移した。ルミノメーター（MicroLumat Plus LB 96V, Berthold technologies）にて発光シグナルを測定した。
　従来のハイドロキノン投与群と比較し、毒性その他に関してはＨＱ－１１Ｒ投与群との間に有意な差は無く、１１Ｒを付加したことによる新たな有害事象は認めなかった。
参考例２：ＭＢＴＨによるチロシナーゼ活性の測定
　９６ウェルプレートにＢ１６細胞を１ウェルあたり５０００個播き、３７℃、５％ＣＯ2下で１２時間培養した。培養液を捨て、ＰＢＳにて希釈した１％トリトン　Ｘ－１００、０．１％　Ｌ－ＤＯＰＡ（３，４－ジヒドロキシ－Ｌ－フェニルアラニン）および２０．７ｍＭ ＭＢＴＨ（３－メチル－２－ベンゾ－チアゾリノンヒドラゾン塩酸塩一水和物、和光純薬工業株式会社）をそれぞれ１ウェルあたり５０μＬ添加し、５．０μＭ、５００ｎＭまたは５０ｎＭのＨＱ－１１Ｒを１ウェルあたり５０μＬ添加した後、３７℃で２時間培養した。マイクロプレートリーダー（ＭＴＰ－３００、コロナ電気株式会社）を用いてＯＤ４９２ｎｍ吸光度を測定した（参考文献：Winder AJ., et al., Eur J Biochem. 1991 Jun 1; 198(2):317-326）。
　結果を図１１に示す。ＨＱ－１１Ｒは濃度依存的にチロシナーゼ活性を阻害した。
　１　角質層
　２　表皮
　３　真皮
　４　メラニン含有細胞
　５　ＥＧＦＰ－１１Ｒ
　６　ＥＧＦＰ
配列番号１：人工的なランダムなアミノ酸配列を有するペプチド

Claims (9)

  1. アルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを薬物に付加したペプチド誘導体に、皮膚導入促進剤を組み合わせることを特徴とする皮膚導入システム。
  2. 皮膚導入促進剤が１－ピレン酪酸である請求項１記載の皮膚導入システム。
  3. アルギニンの残基数が９～１３である請求項１または２記載の皮膚導入システム。
  4. 前記薬物が、タンパク質、ペプチド、低分子化合物から選択される請求項１～３のいずれか１項に記載の皮膚導入システム。
  5. 前記タンパク質がＥＧＦＰである請求項４記載の皮膚導入システム。
  6. 前記低分子化合物がハイドロキノンである請求項４記載の皮膚導入システム。
  7. ハイドロキノンにアルギニン３～１３残基が連続したアミノ酸配列からなるペプチドを付加したハイドロキノンのペプチド誘導体を含む美白剤であって、皮膚導入促進剤との組み合わせを特徴とする美白剤。
  8. 皮膚導入促進剤が１－ピレン酪酸である請求項７記載の美白剤。
  9. 医薬品、医薬部外品または化粧料に添加して用いられる請求項７または８記載の美白剤。
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