JP2006517790A - ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化 - Google Patents

ポリペプチド−核酸複合体の細胞の送達および活性化 Download PDF

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Abstract

本発明は一般的に核酸、ポリペプチドおよび／または蛍光団の細胞送達のため組成物、蛍光分子または部分、核酸およびポリペプチドを含む分子複合体、および、このような組成物の製造および使用の方法を提供する。複合体の光活性化分散は組成物または複合体からの核酸および／またはペプチド１つ以上の細胞内放出をもたらす。核酸、ポリペプチドおよび蛍光団の生物学的活性は複合体内において抑制され、そして、これらの活性は複合体からの放出により回復する。

Description

（関連出願の引用）
本願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下で、２００３年１月９日に出願された、米国仮出願番号６０／４３８，７７８（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に対して優先権を主張する。
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は分子生物学、生化学および医薬品の分野にある。一般的に本発明は核酸、ポリペプチドおよび／または蛍光団の細胞送達のための組成物、蛍光分子または部分、核酸およびポリペプチドを含む分子複合体、および、このような組成物の製造および使用の方法を提供する。複合体の光活性化分散は組成物または複合体からの核酸および／またはペプチド１つ以上の細胞内放出をもたらす。核酸、ポリペプチドおよび蛍光団の生物学的活性は複合体内において抑制され、そして、これらの活性は複合体からの放出により回復する。
（関連技術）
本発明の背景の以下に示す説明は本発明を理解するためのものであり、従来技術が発明であると記載や裁定するものではない。明細書中で言及した全ての特許および出版物は、その個々の特許および出版物が参照により特にそして個々に示されるような程度まで参照により組み込まれるものとする。
転位蛋白は生物学的膜を通過するその能力により定義される。転位を媒介するアミノ酸配列は蛋白導入ドメイン（ＰＴＤ）と称されている。転位蛋白およびＰＴＤ配列については、Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｊ．Ｊ．，ａｎｄ Ｚｈａｎｇ，Ｓ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２：１６２−１６７（２０００）；Ｓｈｗａｒｚｅ，ａｎｄ Ｓ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２９０−２９５（２０００）を参照できる。
ネイティブな転位蛋白またはＰＴＤを有する合成蛋白を培養哺乳類細胞に適用すると、蛋白は取り込まれ細胞の原形質または核に蓄積する。この転位はインビボで起こり、場合によっては、ＰＴＤを含む蛋白が血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるようにする。
記載されている転位蛋白およびペプチドは、例えば、単純疱疹ウィルス１型由来のＶＰ２２蛋白（Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｇ．，ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｐ．，Ｃｅｌｌ ８８：２２３−２３３（１９９７））およびＨＩＶ Ｔａｔ蛋白由来のペプチド、ショウジョウバエホメオドメイン蛋白アンテナペヂア（Ｄｅｒｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９６）またはカポジ塩基性ＦＧＦ受容体（Ｋ−ＦＧＦ）（Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｏｋｋａ，Ｓ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４：１７５９−６４（１９９７））である。さらにまた、合成ペプチドもまた天然のＰＴＤから得られた構造情報を用いて製造されている。
Ｎｏｒｍａｎｄ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１５０４２−１５０５０（２００１）によれば、ＶＰ２２誘導ペプチド（ネイティブのＶＰ２２蛋白のアミノ酸１５９〜３０１に相当）および蛍光標識オリゴヌクレオチドを混合すると、細胞により取り込まれることができ、そして少なくとも４８時間は原形質中で安定である球状の粒子が形成される。適切な波長の光を照射した後、オリゴヌクレオチドは複合体から放出され細胞全体に渡って分散する。この系を用いて、ヒトｒａｆキナーゼに対して指向されたアンチセンスオリゴヌクレオチドが光依存的態様で細胞内で活性化された。
本明細書に記載した本発明に関連する情報を含む他の文献は例えば以下の通りである。
米国特許６，３４２，２２９（「融合蛋白を含むヘルペスウィルス粒子およびその製造および使用」）、６，２５１，３９８（「細胞内輸送のための物質および方法およびその使用」）、６，１８４，０３８（「輸送蛋白およびその使用」）、６，０１７，７３５（「細胞内輸送のための物質および方法およびその使用」）および６，５２１，４５５；米国特許出願公開ＵＳ２００２／００６４５３４Ａ１（「ヘルペスウィルスの製造およびその使用」）、ＵＳ２００２／００３９７６５Ａ１（「輸送蛋白およびその使用」）、ＵＳ２００１／００４８９２８Ａ１（「融合蛋白を含むヘルペスウィルス粒子およびその製造および使用」）、ＵＳ２００３／０２１９８５９Ａ１、ＵＳ２００２／０１４２９６０ＡおよびＵＳ２００２／０１６３７８；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ０２／２００６０（「ＶＰ２２蛋白／核酸凝集物、その使用」）および関連の米国出願公開２００２／０１４２９６０Ａ１、ＷＯ００／５３７２２（「細胞への物質の送達」）、ＷＯ９８／３２８６６（「細胞内および細胞間の輸送のための融合蛋白およびその使用」）およびＷＯ９７／０５２６５（「輸送蛋白およびその使用」）、全てＯ’Ｈａｒｅ等。
米国特許６，３０６，９９３（「生物学的膜を通過する輸送を増強するための方法および組成物」）および関連の米国特許６，４９５，６６３；米国特許出願公開ＵＳ２００２／０００９４９１；（「生物学的膜および組織を通過する薬剤送達を増強するための組成物および方法」）；およびＰＣＴ出願公開ＷＯ０２／０６７９１７（「眼組織通過または進入の薬剤送達を増強するための組成物および方法」）；ＷＯ０１／６２２９７（「生物学的膜および組織を通過する薬剤送達を増強するための組成物および方法」）；ＷＯ０１／１３９５７（「オリゴアルギニン部分を使用する上皮組織通過または進入の薬剤送達の増強」）；関連のＷＯ０２／０６９９３０、米国特許６，５９３，２９２；および米国特許出願公開２００３／００８３２５６Ａ１、２００３／００２２８３１Ａ１および２００２／０１２７１９８Ａ１；およびＷＯ９８／５２６１４（「生物学的膜および組織を通過する輸送を増強するための組成物および方法」）、全てＲｏｔｈｂａｒｄ等。
ＰＣＴ出願公開ＷＯ００／５８４８８（「転位蛋白による機能的蛋白配列の送達」）、ＤａｌｂｙおよびＢｅｎｎｅｔｔ。
ＰＣＴ出願公開ＷＯ０２／０６５９８６および米国特許出願２００３／００３２５９３Ａ１（「スペースアルギニン部分を含むトランスポーター」）、Ｗｅｎｄｅｒ等。
ＰＣＴ出願公開ＷＯ０２／２０７３７（「細胞透過性ＤＮＡ部位特異的リコンビナーゼによるゲノム操作」）、ＲｕｌｅｙおよびＪｏ。
米国特許出願公開２００２／０１２０１００；およびＰＣＴ出願ＷＯ０２／３１１０９（共に表題は「生物学的エフェクターの細胞内送達」）、共にＢｏｎｎｙ等。
米国特許６，２４８，５５８および６，４３２，６８０；米国特許出願公開２００２／０１４３１４２；およびＰＣＴ出願ＷＯ９９／４９８７９（全て表題は「細胞膜転位活性を有する蛋白の遺伝子操作のための配列および方法」）、全てＬｉｎ等。
米国特許出願公開２００２／０１３２７８８（「インビボの胚後の動物細胞への低分子干渉ＲＮＡの送達による遺伝子発現の抑制」）、Ｌｅｗｉｓ等。
米国特許出願２００２／０１６２１２６（「ＲＮＡ干渉のための方法および組成物」）、Ｂｅａｃｈ等。
米国特許出願公開２００２／００８６３５６（「ＲＮＡ干渉のＲＮＡ配列特異的メディエーター」）、Ｔｕｓｃｈｌ等。
米国特許出願公開２００２／０１６０３９３（「２本鎖ＲＮＡ媒介遺伝子抑制」）、Ｓｙｍｏｎｄｓ等。
米国特許出願公開２００２／０１３７２１０（「生物の遺伝子的特性を修飾するための方法」）、Ｃｈｕｒｉｋｏｖ等。
米国特許出願公開２００２／１３２３４６（「系統特異的ＥＳおよび他の身分か細胞の作成および同時培養によるインビトロ分化細胞の製造のためのＲＮＡ干渉の使用」）、Ｃｈｉｂｅｌｌｉ等。
（発明の要旨）
本発明は核酸分子１つ以上（例えばオリゴヌクレオチド１つ以上）およびポリペプチド１つ以上を含む組成物および非共有結合複合体を提供する。本発明はまたそのような複合体を含む組成物を提供する。本発明の複合体中において同じかまたは異なっており、そして、１つ以上のポリペプチドおよび／または核酸分子に共有結合していてよい蛍光分子または部分の１つ以上である。或は、または加えてさらに、本発明の複合体は１つ以上の「遊離の」蛍光分子（即ちポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドに共有結合していないがなお複合体に会合していて良い蛍光分子１つ以上）を含んでよい。組成物または複合体の化合物の１つ以上は生物学的に活性な分子であることができる。
本発明の複合体またはその部分は複合体またはその部分の細胞内への転位を促進できる細胞送達分子を含むことができる。一部の実施形態においては、本発明において使用するためのポリペプチドは細胞送達分子１つ以上を含んでよい。
一部の実施形態においては、本発明の複合体は適切な刺激物質と接触すると解離してよい複合体を包含する。適当な刺激物質は例えば電磁気照射（例えば光）、特に約２００ｎｍ〜約８００ｎｍの波長範囲の波長を有する電磁気照射を包含する。細胞内の複合体の解離は、複合体の内部にある生物学的に活性な分子を、細胞中の機能に利用されるようにすることができる。
一部の実施形態においては、細胞、組織、臓器または生物を本発明の複合体に接触させて良い。好ましくは、複合体は細胞により、または、組織、臓器または生物の細胞１つ以上取り込まれる。次に複合体は適当な刺激物質と接触し、複合体を解離させる。例えば、本発明の複合体１つ以上を含有する細胞、組織、臓器または生物の１つ以上を細胞外刺激物質（例えば光）と接触させ、その結果、核酸、ポリペプチドおよび／または蛍光分子、またはこれらのいずれかの組み合わせの複合体からの解離が起こる。
一部の実施形態においては、複合体の成分の１つ以上の解離は、成分および／または複合体の活性水準の変化をもたらして良い。一部の実施形態においては、複合体から解離する成分は細胞内分子の１つ以上と相互作用し、これにより細胞内分子の活性をモジュレートし、そして、これにより生物学的活性を示す。
適切な刺激物質に対するこれらの複合体の感度は複合体の成分１つ以上の制御された解離を可能にする。解離は例えば所望の時間および／または所望の位置において（例えば細胞内）成分の１つ以上を放出するように制御してよい。核酸成分の放出は核酸に備わっている活性１つ以上、例えばアンチセンス作用またはリボザイム作用を刺激してよい。ポリペプチド成分の放出は部位特異的組み換えのような蛋白に備わった活性１つ以上を刺激して良い。複合体の成分１つ以上のいずれかは活性１つ以上を有してよい。例えば、ポリペプチド、核酸および／または蛍光分子は活性剤であってよい。或は、または、これに加えて、複合体はポリペプチド、核酸および／または蛍光分子以外の活性剤を含むことができ、そしてその薬剤は適切な刺激（例えば光）により放出されて活性化されることができる。
１つの実施形態においては、複合体の細胞送達分子は細胞送達ポリペプチドである。別の実施形態においては、活性剤は生物活性ポリペプチドである。活性剤および細胞送達分子の両方がポリペプチドである場合は、融合蛋白は細胞送達ポリペプチドおよび生物活性ポリペプチドの両方を含んで良い。この融合蛋白を含む複合体を形成することができ、生物活性ポリペプチドの活性を光依存的態様において刺激してよい。
本発明の別の例および非限定的な実施形態においては細胞送達ポリペプチドおよびオリゴヌクレオチドとの間に複合体を含む組成物を形成し、培養哺乳類細胞に適用できる。細胞送達ポリペプチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれか、または両方をＦＩＴＣのような蛍光分子で標識する。これらの複合外は細胞内のオリゴヌクレオチドおよびペプチド成分の光活性化分散が後続するような送達を可能にする。複合体はまた標識された、および、標識されない核酸および／またはペプチドの組み合わせを含んでよい。これらの複合体の光感受性は、例えば遺伝子含有オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子一次的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）等であることができるオリゴヌクレオチドに備わった活性の制御された放出を可能にする。一部の実施形態においては、オリゴヌクレオチドが好ましい。
本発明は細胞にポリペプチドを送達する方法であって、下記工程：
（ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該ポリペプチド、核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させること；および、
（ｂ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
を含む上記方法を包含する。
好ましくは工程ａは細胞送達分子および蛍光分子または部分を含む複合体が形成されるように実施する。
関連の実施形態において、投与方法はさらに該細胞または細胞を含有する組織または生物の照射を含む。照射は典型的には約２００ｎｍ〜約８００ｎｍの波長における電磁気の照射を包含する。治療はこれに加えて、または、代替として、エンドソームを崩壊させるクロロキンとの接触のような治療を含む。本明細書に記載したこの実施形態および他の実施形態において、ポリペプチド、核酸、蛍光分子および／または細胞送達分子を混合して複合体とした後に上記接触に付すこともできる。
一部の実施形態においては、細胞送達分子は細胞送達ポリペプチドである。細胞送達ポリペプチドはレトロウィルス、原核生物、バクテリオファージ、古細菌、古細菌ウィルス、または真核細胞によりコードされる蛋白のアミノ酸配列から誘導されたアミノ酸瀬配列を有することができる。別の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドはホメオボックス遺伝子産物、例えばＤｏｒｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ蛋白（Ａｎｔｐ）から誘導される。細胞送達ポリペプチドは合成ペプチドであることができる。合成ペプチドは非天然のアミノ酸、例えばオルニチン（Ｏｒｎ）１つ以上を含んでよい。本発明を実施するために使用できる非合成ペプチドの例は本明細書に記載するものである。特定の実施形態においては、細胞送達ペプチドはアミノ酸５つ以上がアルギニンであるアミノ酸９つ以上を有するポリペプチドであることができる。
別の特定の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドは蛍光団（蛍光部分）で、例えば、フルオレセインまたはフルオレセインの誘導体で共有結合的に標識される。ペプチドはそのＮ末端において、または、そのＣ末端において標識してよい。より特定の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドはリンカー基を介して蛍光団に共有結合的に標識される。リンカー基の長さおよびリンカー基の官能基は変動してよい。リンカーはカルボキシアミドリンカーまたはチオ尿素リンカーであってよい。リンカー基の長さは当該分野で知られるとおり、スペーサー基（例えば−（ＣＨ２）ｘ−基、ここでｘは整数、例えば１〜約１０の整数）またはエーテルまたは好ましくは１〜１０原子の長さのポリエーテルスペーサーの導入により調節できる。
細胞送達ポリペプチドは副次的ポリペプチドのような他の要素をさらに含む融合蛋白内に含まれてよい。副次的ポリペプチドは、例えば副次的エレメント（例えばアフィニティータグ、精製エレメント、エピトープ、プロテアーゼ切断部位または細胞内ターゲティングエレメント）；生物活性ポリペプチド（例えば酵素、検出可能なポリペプチド、ホルモン、成長因子、抗体または抗体誘導体等）であることができる。酵素はまたその反応体の１つまたはその生成物の１つ（例えばリコンビナーゼ、例えば部位特異的リコンビナーゼ）として核酸を有するものであって良い。このような実施形態において、核酸における部位特異的リコンビナーゼにより認識される部位を少なくとも１つ含むことが望ましい。
本発明は細胞にポリペプチドを送達する方法を提供し、ここで該細胞送達ポリペプチドは：
（ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍ％は約５０％〜１００％であるものを含み；
（ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは２〜約７５のいずれかの整数であるものを含み；そして、これに加えて、または、代替として、
（ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）によりコードされる蛋白のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列を有する；
ものである。
一般的にｍ％は約５０％〜１００％、約５５％〜約９５％、約６０％〜約９０％、約６５％〜約８５％、約７０％〜約８０％、約７５％、約６５％〜１００％、約７０％〜１００％、約７５％〜１００％、約８０％〜１００％、約８５％〜１００％、約９０％〜１００％、約９５％〜１００％、約９９％、１００％、約５５％〜約９０％、約５５％〜約８５％、約５５％〜約８０％、約５５％〜約７５％、約５５％〜約７０％、約５５％〜約６５％、または約５５％〜約６０％であることができる。
一部の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドは約１０．５〜１４のｐＩを有し、そして／または、ｎ連続塩基性アミノ酸の配列を有するオリゴペプチドは約１０．５〜１４のｐＩを有する。別の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドは約１２．０より大きいｐＩを有し、そして／または、ｎ連続塩基性アミノ酸の配列を有するオリゴペプチドは約１２．０以上のｐＩを有する。一般的に、細胞送達ポリペプチドおよびｎ連続塩基性アミノ酸の配列を有するオリゴペプチドに関するｐＩは約９．５、約１０、約１０．５、約１１、約１１．５、約１２、約１２．５、約１３または約１３．５のより低値から約１３．５．約１４、約１４．５、約１５、約１５．５、約１６、約１６．５、約１７または約１７．５のより高値、および、上記範囲内に含まれるいずれかの中間的範囲に変動できる（即ち「約１０．５〜約１４：の範囲は例えば「約１０．５〜約１０．６」、「約１１．２〜約１３．２」、「約１３．６〜約１３．９」等の中間的範囲を包含する）。
細胞送達分子または副次的ポリペプチドまたはエレメントは核酸結合蛋白であることができる。例えばこのような蛋白はヒストン、ヒストン様蛋白およびポリ−Ｌリジン、ポリ−アルギニンおよびこれらの組み合わせおよびそれらの誘導体を包含する。
別の実施形態においては、本発明は細胞にポリペプチドを送達する方法であって、下記工程：
（ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該ポリペプチド、核酸、蛍光分子、細胞送達分子およびトランスフェクション剤に接触させること；および、
（ｂ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
を含む上記方法を提供する。
別の実施形態においては、本発明は蛍光分子を少なくとも１つおよび細胞送達分子を少なくとも１つ含むキットを提供する。キットにおいて、細胞送達分子および蛍光分子の一方または両方がポリペプチドであってよく、そして、単一の融合蛋白内に含まれていて良い。
本発明のキットはさらにトランスフェクション剤を少なくとも１つ、細胞を少なくとも１つ、核酸を少なくとも１つ、取扱説明書のセットを少なくとも１つ、および、光照明装置を少なくとも１つ、および、場合によりこれらのための電源、または、電源にキットの要素の１つ以上を連結するための手段を含んでよい。電池およびソーラーパネルが代表的な電源である。
特定の実施形態においては、キットは細胞送達分子を少なくとも１つおよび細胞送達分子を蛍光標識するための成分を含有する。
他のキット成分は、例えば、別の核酸、例えばオリゴヌクレオチド、ｉＲＮＡ分子、プラスミド等；表４に記載したもののようなトランスフェクション剤１つ以上：例えば部位特異的リコンビナーゼのようなリコンビナーゼ１つ以上；組み換え蛋白１つ以上；および／または細胞１つ以上を包含する。一部の実施形態においては、細胞はトランスフェクションまたは形質転換に対してコンピテントであってよく、そしてダイサーを発現または過剰発現してよい。
別の実施形態においては、本発明は、細胞送達ポリペプチドおよび細胞により取り込まれることが望ましい薬剤を含む複合体を提供し、ここで細胞送達ポリペプチドは蛍光部分を含む。細胞により取り込まれることが望ましい該薬剤の活性は複合体内において抑制されるが、薬剤が複合体から解離すると活性化される活性であることができる。
本発明の複合体および他の実施形態の核酸は５塩基〜約２００キロ塩基を含むことができる。核酸のいずれかの型、例えばｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせを使用してよい。ｔｍＲＮＡについては、Ｍｕｔｏ Ａ，Ｕｓｈｉｄａ Ｃ， Ｈｉｍｅｎｏ Ｈ． Ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＲＮＡ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｂｏｔｈ ａ ｔＲＮＡ ａｎｄ ａｎ ｍＲＮＡ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．１９９８ Ｊａｎ；２３（１）：２５−９；およびＷｉｔｈｅｙ ＪＨ， Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＤＩ． Ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｏｌｅｓ ｏｆ ｔｒａｎｓ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００２ Ａｐｒ；５（２）：１５４−９）を参照できる。核酸は化学修飾１つ以上を含んでよい。
本発明の複合体はさらにトランスフェクション剤１つ以上、リコンビナーゼ１つ以上、そして、これに加えて、または、代替として、組み換え蛋白１つ以上を含んでよい。
別の実施形態においては、本発明は細胞にポリペプチドを送達する方法を提供し、方法は下記工程：
（ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させること；および、
（ｂ）該蛍光分子および該細胞送達分子の一方または両方からの該核酸の解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
を含む。
一部の実施形態においては、（ｂ）における治療は照射を含む。核酸は好ましくは治療後には、該細胞の原形質内に分散および／または生物学的活性となる。
本発明の方法および組成物において、蛍光分子は核酸に結合している必要はなく；これは、細胞送達分子、方法で使用する他の薬剤（例えばトランスフェクション剤）に結合していることもでき、あるいは、複合体の１つ以上の他の成分、またはそれ以外のものと非共有結合的に会合することができる。
細胞送達ポリペプチドは合成ペプチドであってよい。合成ペプチドはオルニチン（Ｏｒｎ）のような非天然アミノ酸１つ以上を含んでよい。本発明を実施するために使用できる合成ペプチドの例は、例えば本明細書に記載するものを包含する。
一部の実施形態においては、細胞送達ポリペプチドは：
（ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍ％は約５０％〜１００％であるものを含み；
（ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは２〜約７５のいずれかの整数であるものを含み；そして、これに加えて、または、代替として、
（ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）によりコードされる蛋白のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列を有する。
本発明で使用する核酸は、一部の実施形態においては、蛋白またはその部分をコードする配列を包含する。一部の実施形態においては、蛋白またはその部分をコードする細胞核酸は望ましくは遺伝子療法の１つの形態において該配列により置き換えられる。これに加えて、またはその代替として、蛋白は細胞内で発現される。蛋白は外因性または内因性であってよい。後者の場合は、トランスフェクトすべき細胞は該蛋白の非機能的形態を含んでよい。
別の実施形態において本発明は細胞にポリペプチドを送達する方法であって、下記工程：
（ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該核酸、蛍光分子、細胞送達分子およびトランスフェクション剤に接触させること；および、
（ｂ）該蛍光分子および該細胞送達分子の１つ以上からの該核酸の解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
を含む上記方法を提供する。
別の実施形態において、本発明は核酸１つ以上、蛍光団１つ以上、および、細胞送達ポリペプチド１つ以上を含む分子複合体であって、各細胞送達ポリペプチドが、
（ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍは約１０％〜１００％であるものであり；
（ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは約２〜５０のいずれかの整数であるものを含み；そして、
（ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）蛋白に由来しない、
ものである上記複合分子複合体を提供する。
関連の実施形態において、組成物は分子複合体を含み、そして場合により、トランスフェクション剤、トランスフェクション増強剤、および／または、エンドソーム崩壊剤をさらに含む。さらにまた、分子複合体を含む細胞およびそのような細胞を含む組成物が提供される。キットの実施形態を含む特定の実施形態においては、細胞は好ましくは組成物が凍結および／または乾燥されていても生存状態を維持する。従って、組成物はさらにグリセロールのような物質を含む。本発明の組成物は容器内に保持してよい。典型的には容器は密封され、そして不透明である材料よりなる。容器は例えばマイクロプレートのようなフォーマットにおいて開封できる。一般的に、マイクロプレートは不透明な材料よりなり、そしてアルミホイルのような不透明フィルムにより被覆される。
本発明の組成物は医薬組成物であることができる。特定の実施形態においては、１つ以上の核酸、ポリペプチドおよび／または蛍光団は例えば治療活性のような生物学的活性を有する。特に限定しないが、例えば生物学的に活性な核酸はｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される。
これに加えて、または、その代替として、複合体のポリペプチドが生物学的に活性である。生物学的に活性なポリペプチドは治療用蛋白であってよい。例示される生物活性蛋白は抗体または抗体フラグメント、ホルモン、酵素、転写因子、成長因子等を包含する。
本発明はさらに疾患または障害に罹患した個体を治療する、治療を要する個体に遺伝子療法を提供する方法を提供し、方法は個体またはその細胞を本発明の複合体、組成物および／または医薬組成物の１つ以上に接触させることを包含する。
本発明さらに、被験化合物への細胞の応答を測定する方法であって、下記工程：
（ａ）第１の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第１の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させること；
（ｂ）第２の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第２の核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子に接触させること；
（ｃ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
（ｄ）（ａ）の前；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の最中；（ａ）と（ｂ）との間；（ｂ）と（ｃ）との間；および、これに加えて、または、代替として、（ｃ）の後に該被験化合物に該細胞を接触させること；
（ｅ）該細胞からの細胞応答に相当するシグナルを検出すること；および、
（ｆ）該第１の細胞からのシグナルを該第２の細胞からのシグナルと比較すること；
を含む上記方法を提供する。
特定の実施形態においては、細胞１つ以上は、検出可能なシグナルを発生するか、検出可能なシグナルの生成を妨害するレポーター遺伝子１つ以上を含む。
本発明はさらに、予め選択された活性または作用を有する化合物を発見する方法であって、下記工程：
（ａ）第１の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第１の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させること；
（ｂ）第２の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第２の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させること；
（ｃ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす治療により該細胞を治療すること；
（ｄ）（ａ）の前；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の最中；（ａ）と（ｂ）との間；（ｂ）と（ｃ）との間；および、これに加えて、または、代替として、（ｃ）の後に該被験化合物に該細胞を接触させること；
（ｅ）該細胞からの細胞応答に相当するシグナルを検出すること；および、
（ｆ）該第１の細胞からのシグナルを該第２の細胞からのシグナルと比較すること；
を含み、
ここで該第２の細胞からのシグナルとの第１の細胞からのシグナルの相違が該予め選択された活性または作用に相当する上記方法を提供する。
本発明の他の特徴および利点は以下の詳細な説明および請求項から明らかにされる。
（発明の詳細な説明）
Ｉ．定義および略記法
以下の説明において、分子生物学および医学／薬学で使用される多くの用語は広範に利用される。このような用語に与えられる範囲を含む明細書および請求項の明確で一貫した理解のために、以下の定義を示す。これらの定義の下に、以下の用語は特段の記載が無い限り以下の通り定義されるものとする。
増幅（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：本明細書においては、増幅とはポリメラーゼ活性（例えば核酸ポリメラーゼ１つ以上、または、逆転写酵素１つ以上）を有するポリペプチド１つ以上を用いることによりヌクレオチド配列の多くのコピーを増大させるためのいずれかのインビトロの方法である。核酸増幅によりＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの取り込みが起こり、これにより鋳型に相補的な新しい核酸分子が形成される。形成された核酸分子およびその鋳型はさらに別の核酸分子を合成するための鋳型として使用できる。本明細書においては、増幅反応は核酸複製の多くの回よりなってよい。ＤＮＡ増幅反応は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を包含する。１つのＰＣＲ反応はＤＮＡ分子の変性および合成の５〜１００サイクルよりなってよい。
会合（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：永久的、一時的または一過性に起こってよい分子２つ以上の共有結合的または非共有結合的な結びつき。分子複合体は化合物２つ以上の安定または半安定な会合により形成される。
塩基対（Ｂａｓｅ Ｐａｉｒ（ｂｐ））：２本鎖ＤＮＡ分子におけるアデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）の相互関係。ＲＮＡにおいてはウラシル（Ｕ）がチミンの代替となる。塩基対はその成分塩基が、通常はＤＮＡまたはＲＮＡ分子が２本鎖立体配置を採用する場合に、「対」となる。
ブロッキング剤（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ａｇｅｎｔ）：本発明の核酸抑制剤に組み込まれるヌクレオチド（またはその誘導体）、修飾オリゴヌクレオチドおよび／または１つ以上の他の修飾であって、ヌクレアーゼ活性によるこのような核酸分子の分解または消化を防止または抑制するためのもの。１つまたは複数のブロッキング剤は、本発明の核酸抑制剤に、核酸抑制剤の内部、３’末端近傍および／または５’末端近傍において、組み込んでよい。好ましくは、このようなブロッキング剤は線状の抑制剤である核酸分子の場合は、このような分子の３’末端またはその近傍、および／または、５’末端またはその近傍、および／または、５’〜３’エキソヌクレアーゼの好ましい切断位置に位置する（Ｌｙａｍｉｃｈｅｖ，Ｖ．，Ｂｒｏｗ，Ｍ．Ａ．Ｄ．， ａｎｄ Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７７８−７８３（１９９３））。好ましくは、このようなブロッキング剤は、使用されるポリメラーゼまたは逆転写酵素に備わっているか、または、活性または合成反応に存在するエキソヌクアレーゼ活性による抑制剤核酸分子の分解または消化を防止または抑制する。例えば、本発明のためのブロッキング剤は、ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ）に備わっている３’エキソヌクレアーゼ活性および／または５’エキソヌクレアーゼによる抑制剤核酸分子の分解または消化を防止する。ブロッキング剤は例えばジデオキシヌクレオチドおよびその誘導体、例えばｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰ；ＡＺＴ；ホスホロチオエート骨格；ホスファミド骨格（例えばＰＮＡ）、３’−ｄＮＴＰ（例えばコンジセピン）またブロッキング基を好ましくはその３’位置に含有するいずれかのヌクレオチドを包含する。このようなブロッキング剤は好ましくはエキソヌクレアーゼ活性（例えば３’−エキソヌクレアーゼ活性）が本発明の抑制剤核酸を改変または消化することを抑制または防止本発明のオリゴヌクレオチドの５’末端を、それらが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対して耐性となるように修飾してよい。このような修飾の１つは５’−５’−連結におけるオリゴヌクレオチドの５’末端への付加的ヌクレオチドの付加であってよい（Ｋｏｓａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５６：３７５７参照）。
細胞送達（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）（本明細書においては「送達」と互換であり等価なものとする）：所望の化合物が究極的に標的細胞の内部、または、標的の細胞膜中または膜上に位置するように標的細胞に所望の化合物を移行させる過程。特定の用途においては、特定の標的細胞型への送達が好ましい。
細胞送達分子（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）：自らの細胞送達を媒介する分子、細胞送達分子を含む分子複合体、および／または、細胞送達分子を含む分子。好ましくは、細胞送達分子は以下の特性の１つ以上、即ち、インビボおよびインビトロの両方での分解への耐性；細胞への受容体非依存性の送達；および細胞膜の実質的にエネルギー不要である浸透を保有している。
細胞送達ポリペプチド（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）：それ自体が細胞送達分子自身として、または、分子複合体の部分として、および／または融合蛋白の部分として機能するポリペプチド。細胞送達ポリペプチドの例は蛋白導入ドメイン（ＰＴＤ）と称されるアミノ酸配列を有する転位蛋白を包含する。
コンピテント細胞：外因性核酸、例えばＤＮＡ分子の取り込みと樹立の能力を有する。
相補ヌクレオチド配列（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：他の１本鎖に対してそれに特異的に（非ランダムに）ハイブリダイズした結果として水素結合を生じるＤＮＡまたはＲＮＡの１本鎖分子におけるヌクレオチドの配列。
コンストラクト（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）：非ベクター配列１つ以上に連結しているベクター配列またはその部分。
解離（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）：相互に会合している分子２つ以上の分離および／または分子複合体からの分子１つ以上の遊離。
ＤＮＡ分子（ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）：ウィルス、原核および真核生物のＤＮＡを含むいずれかの原料から得られたいずれかの大きさのいずれかのＤＮＡ分子。ＤＮＡ分子は例えば直鎖または環状、および１本鎖または２本鎖を含むいずれかの形態であってよい。ＤＮＡ分子の例はプラスミド、ベクターおよび発現ベクターを包含する。
発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）：遺伝子がポリペプチドを生成する過程。これにはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への遺伝子の転写およびポリペプチドへのこのようなｍＲＮＡの転位が包含される。
融合蛋白：同じＯＲＦにより通常はコードされない蛋白、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそのフラグメントの２つの別個のものを含むポリペプチド。融合蛋白を作成するためには、遺伝子操作を用いて、２つ以上の別個の蛋白、ポリペプチド、ペプチドおよび／またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含むＯＲＦ（キメラＯＲＦ）を有する核酸を調製する。融合蛋白はキメラＯＲＦの翻訳により生じるアミノ酸の重合体である。融合蛋白はさらに融合蛋白の検出および／または精製のために機能する配列（例えば蛋白タグ）を含んでよい。融合蛋白はさらに、融合蛋白の選択的切断において機能する配列を含有してよい。
遺伝子（Ｇｅｎｅ）：ポリペプチドまたは蛋白の発現のために必要な情報を含有するＤＮＡ配列。これにはプロモーターおよび構造遺伝子、並びに蛋白の発現に関与する他の配列が包含される。「構造遺伝子」という用語は本明細書においては特定のポリペプチドのアミノ酸特性の配列にその後翻訳されるメッセンジャーＲＮＡに転写されるＤＮＡ配列を指す。
宿主（Ｈｏｓｔ）：いずれかの原核、真核細胞または古細菌の微生物または細胞であって、複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは本発明の抑制核酸分子を含むいずれかの核酸のレシピエントであるもの。核酸分子は例えば構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を含有してよい。「組み換え宿主」という用語は本明細書においては、発現ベクター、クローニングベクターまたはいずれかの他の核酸分子内に所望のクローニングされた遺伝子を含有する原核生物または真核生物の微生物を指す。「組み換え宿主」という用語は宿主の染色体上、または、宿主ゲノム内に、所望の遺伝子を含有するように遺伝子操作された宿主細胞を含むものとする。本明細書においては「宿主」は「宿主細胞」と互換であり等価に使用してよい。同様に、本明細書においては、「組み換え宿主」という用語は「組み換え宿主細胞」という用語と互換であり等価に使用してよい。
取り込み（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ）：ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子またはプライマーの部分となること。
インデューサー（Ｉｎｄｕｃｅｒ）：受容体のような調節蛋白に結合することにより遺伝子転写をトリガーする分子。
誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）：正または負の調節因子とのインデューサーの相互作用の結果として転写をスイッチオンすること。
インサート（Ｉｎｓｅｒｔ）：本発明の方法により操作してよい所望の核酸セグメントまたは核酸セグメントの集団。即ち、インサートという用語は特定の核酸（好ましくはＤＮＡ）セグメントまたはセグメントの集団を包含するものとする。このようなインサートは遺伝子１つ以上を含むことができる。
インサートドナー（Ｉｎｓｅｒｔ Ｄｏｎｏｒ）：インサートを担持する本発明の２つの親核酸分子（例えばＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つ。インサートドナー分子は組み換え部位の両側でフランキングされているインサートを包含する。インサートドナーは直鎖または環状であってよい。本発明の１つの実施形態においては、インサートドナーは環状ＤＮＡ分子であり、さらに組み換えシグナルの外部にクローニングベクター配列を含む。インサートの集団または核酸セグメントの集団を用いてインサートドナーを作成する場合は、インサートドナーの集団が得られ、そして本発明に従って使用してよい。
分子複合体（複合体）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｃｏｍｐｌｅｘ））：共有結合および／または非共有結合によりまとめられた分子２つ以上の凝集物。複合体の形成および維持はｐＨ，温度、濃度および複合体を含む組成物中の化合物１つ以上の性質等のような条件に依存している。「蛋白複合体」とは異なるポリペプチド２つ以上を含む分子複合体である。
転写の負の調節（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）：負の調節因子またはリプレッサーの作用により転写が防止されない限り遺伝子が転写される遺伝子発現の制御の機序。
ヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）：塩基−糖−ホスフェートの組み合わせ。ヌクレオチドは核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の単量体単位である。ヌクレオチドはまたこのようなヌクレオチドのモノ、ジおよびトリホスフェート型を包含してよい。ヌクレオチドという用語にはリボヌクレオシドトリホスフェートＡＴＰ、ＵＴＰ、ＩＴＰ、ＣＴＧ、ＧＴＰおよびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＩＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰおよびこれらの誘導体が包含される。このような誘導体は例えば［ａＳ］ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰおよび７−デアザ−ｄＡＴＰおよびそれらを含有する核酸分子上にヌクレアーゼ耐性を付与するヌクレオチド誘導体を包含する。本明細書においてはヌクレオチドという用語はまたジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄｄＮＴＰ）およびその誘導体も指す。ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの例は、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＩＴＰおよびｄｄＴＴＰを包含する。本発明によれば、「ヌクレオチド」は実標識であるか、または、よく知られた方法により検出可能に標識してよい。検出可能な標識は、例えば放射性同位体、蛍光標識、ケミルミネセント標識、バイオルミネセント標識および酵素標識を包含する。当該分野で知られている種々の標識方法を本発明の実施において用いることができる。
ヌクレオチド類縁体（Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇ）：Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵ塩基とは構造的に異なるが核酸分子における通常のヌクレオチドを代替するには十分同様性を有するプリンまたはピリミジンヌクレオチド。イノシン（Ｉ）は他のヌクレオチドＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵのいずれかと水素結合できるヌクレオチド類縁体である。さらに、メチル化塩基は核酸ハイブリダイゼーションに関与できることがわかっている。修飾オリゴヌクレオチドを製造して使用するための方法はＶｅｒｍａ Ｓ，Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ｓｙｎｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｕｓｅｒｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９８；６７：９９−１３４に記載されている。例えば、ヌクレオチド類縁体は２，６−ジアミノプリン、６−メチルアデニン、８−アザグアニン、５−ブロモウラシル、５−ヒロドキシメチルウラシル、５−メチルシトシン（５ＭＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、８−クロロアデノシン、グリコシルＨＭＣおよびゲントビオシルＨＭＣを包含する。蛍光ヌクレオチド類縁体、例えばＪａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｅｃｃｌｅｓｔｏｎ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９９７；２７８：３６３−９０）の記載したもの、および、環状ヌクレオチド類縁体、例えばＳｃｈｗｅｄｅ ｅｔ ａｌ．（Ｃｙｃｌｉｃ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｓ ａｓ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｏｏｌｓ ａｎｄ ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｄｒｕｇｓ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ ２０００ ８７（２−３）：１９９−２２６）の記載したものもまた本発明において使用してよい。
作動可能に連結（Ｏｐｅｒａｂｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ）：本明細書においては、「作動可能に連結」という表現は第１のヌクレオチド配列が、１つ以上の第２のヌクレオチド配列に対し、第２の配列の機能を改変することができるような態様で連結しているような連結部を指す。例えばプロモーター／オペレーターに「作動可能に連結した蛋白コーディング配列はこれらのプロモーター／オペレーターの影響または制御の下に蛋白コーディング配列の発現をもたらす。２つのヌクレオチド配列（例えば蛋白コード配列およびコード配列の５’末端に連結したプロモーター領域配列）はプロモーター機能の誘導が蛋白コード配列ｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および、２つのヌクレオチド配列の間の連結の性質が（１）フレームシフト突然変異の誘導および（２）調節配列がｍＲＮＡまたは蛋白の発現を検出するのを妨害すること、のいずれももたらさない場合に、作動可能に連結しているといえる。即ち、プロモーター領域は、プロモーターがヌクレオチド配列の転写を起こすことができる場合に、そのヌクレオチド配列に「作動可能に連結」しているといえる。当業者の知るとおり、２つの核酸配列（例えばプロモーター／オペレーター配列および蛋白コード配列）は必ずしも相互に物理的に隣接して位置することなく作動可能に連結していてよく；プロモーター／オペレーター配列および蛋白コード配列が蛋白コード配列の発現を検出することが可能である限り、２つの配列が同じ核酸分子上で相互に直ぐ隣に位置するかまたはそれらの間に位置する介在配列１つ以上をおきながら相互に隔たっているかどうかに関わらず、配列は作動可能に連結しているということができる。
オペレーター（Ｏｐｅｒａｔｏｒ）：本明細書においては、オペレーターとは転写調節配列の一例であり、そして典型的にはリプレッサー蛋白が結合することにより隣接するプロモーターにおいて転写が開始されることを防止するＤＮＡ上の部位である。
光照明装置（Ｐｈｏｔｏｉｌｌｕｍｉｎａｔｏｒ）：適切な波長（典型的には約２００ｎｍ〜約８００ｎｍの範囲に入る波長）および強度を有する電磁気エネルギー（例えば光）を、本発明の複合体の解離をもたらすのに十分な時間与えることにより、複合体の成分１つ以上を、本発明の複合体１つ以上に接触させてある細胞、組織、臓器または生物に分配することができるいずれかのエネルギーの発生源。
核酸（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）：本明細書においては、「核酸」およびその文法的に同等な表現は、１本鎖または２本鎖のヌクレオチドの重合体の完全な範囲を含む。核酸は典型的には２つ以上のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）またはその変異体、誘導体および／または類縁体の直鎖よりなるポリヌクレオチド分子を指す。厳密な大きさは多くの要因により変動し、その要因もまた当該分野でよく知られル通り使用の究極的な条件により変動する。本発明の核酸は例えばプライマー、プローブ、オリゴヌクレオチド、ベクター、コンストラクト、プラスミド、遺伝子、トランスジーン、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント等を包含する。
転写の正の調節（Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）：正の調節因子（「アクティベーター」）が転写の開始をそれぞれ刺激するか可能とすることがない限り、遺伝子の転写が乏しいか皆無となる遺伝子発現の制御の機序。
プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）：核酸分子（例えばＤＮＡ分子）の増幅または重合の間にヌクレオチド単量体の共有結合により伸長される１本鎖または２本鎖のオリゴヌクレオチド。好ましい特徴においては、プライマーは組み換え部位１つ以上またはこのような組み換え部位の部分を含む。組み換え部位の部分は該当する組み換え部位の少なくとも２塩基、少なくとも５塩基、少なくとも１０塩基または少なくとも２０塩基を含む。組み換え部位の部分を使用する場合は、組み換え部位の欠落した部分は新しく合成された核酸分子により与えられて良い。このような組み換え部位はプライマーの内部またはその一方または両方の末端に位置して良い。好ましくは、別の配列を組み換え部位に隣接してプライマーに付加することにより、組み換えの増強または向上および／または組み換え最中における組み換え部位の安定化を図ってよい。このような安定化配列はいずれかの長さのいずれかの配列（好ましくはＧ／Ｃリッチ配列）であって良い。好ましくは、このような配列は１〜約１０００塩基、１〜約５００塩基、および１〜約１００塩基、１〜約６０塩基、１〜約２５塩基、１〜約１０塩基、２〜約１０塩基および好ましくは約４塩基のサイズ範囲である。好ましくはこのような配列は１塩基長より大きく、そして好ましくは２塩基長より大きい。
プロモーター（Ｐｒｏｍｏｔｅｒ）：本明細書においては、プロモーターは転写調節配列の一例であり、そして、典型的には開始コドンに近位に位置する遺伝子の５’末端として一般的に説明されるＤＮＡ配列である。隣接するＤＮＡセグメントの転写はプロモーター領域において開始される。転写の抑制性のプロモーター速度は抑制性の薬剤に応答して低下する。転写の誘導性のプロモーター速度は誘導性の薬剤に応答して増大する。転写の構成性のプロモーター速度は、全体的な代謝条件の影響下において変動する場合があるが、特に調節されない。
組み換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）分子（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ（ｒＤＮＡ）Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）：本発明のＤＮＡ分子配列に遺伝子のような核酸配列を作動可能に連結することにより作成されるＤＮＡ分子。即ち、組み換えＤＮＡ分子は天然界に通常は共に存在することのない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ分子である。共通の生物学的起源を有さない（即ち進化的に個別である）異なるｒＤＮＡは「非相同性（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）」と称される。本明細書においては、「ｒＤＮＡ」がリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）のための鋳型として作用するＤＮＡを指さないことに留意しなければならない。
認識配列（Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：本明細書においては、認識配列は、蛋白、化学物質、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば制限エンドヌクレアーゼ、修飾メチラーゼまたはリコンビナーゼ）が認識して結合する特定の配列である。本発明においては、認識配列は典型的には、ただし必然的にではなく、組み換え部位を指す。例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼに対する認識配列は８塩基対のコア配列にフランキングする２つの１３塩基反転リピート（リコンビナーゼ結合部位として作用する）よりなる３４塩基対の配列であるｌｏｘＰである。Ｓａｕｅｒ，Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）の図１を参照できる。認識配列の他の例は、リコンビナーゼ酵素インテグラーゼにより認識されるａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列である。ａｔｔＢ部位は２つの９塩基コア型Ｉｎｔ結合部位および７塩基対のオーバーラップ領域を含有する約２５塩基対の配列である。ａｔｔＰ部位はコア型Ｉｎｔ結合部位およびアーム型Ｉｎｔ結合部位並びに副次的蛋白組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよびエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）に対する部位を含有する約２４０塩基対配列である。Ｌａｎｄｙ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３：６９９−７０７（１９９３）を参照できる。このような部位はまた本発明により、本発明の方法における生成物の終了を増大させるために操作してよい。このような操作部位が組み換え反応を不可逆とするためのＰ１またはＨ１ドメインを欠いている場合（例えばａｔｔＲまたはａｔｔＰ）、このような部位はａｔｔＲ’またはａｔｔＰ’と表記することによりこれらの部位のドメインがある程度修飾されていることを示してよい。
リコンビナーゼ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）：特定の組み換え部位においてＤＮＡセグメントの交換を触媒する酵素。
組み換えクローニング（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｌｏｎｉｎｇ）：核酸分子のセグメントまたはこのような分子の集団がインビトロまたはインビボで交換、挿入、置き換え、置換または修飾される方法。米国特許５，８８８，７３２；６，１４３，５５７；６，１７１，８６１；６，２７０，９６９；および６，２７７，６０８を参照でき、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
組み換え蛋白（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ）：本明細書においては、組み換え蛋白は、組み換え部位１つ以上が関与する組み換え反応に関与する切断型または組み込み型の蛋白、酵素、コファクターまたは関連蛋白（例えばＩＨＦおよび／または他のヒストン様蛋白）を包含する。組み換え蛋白は野生型の蛋白またはその突然変異体、誘導体、フラグメントまたは変異体であってよい。
組み換え部位（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ）：本明細書においては、組み換え部位は組み換え蛋白による組み込み／組み換え反応に関与する核酸分子上の認識配列である。組み換え配列の例は、本明細書に記載したａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ配列、およびその突然変異体、フラグメント、変異体および誘導体であり、これらは組み換え蛋白λＩｎｔにより、そして、副次的蛋白組み込み宿主因子（ＩＨＦ）、ＦＩＳおよびエキシジオナーゼ（Ｘｉｓ）を包含する。Ｌａｎｄｙ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：６９９−７０７（１９９３）を参照できる。
レポーター遺伝子（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ）：容易に試験できる蛋白をコードする核酸。試験は定性的、定量的、手作業、自動、半自動等であることができる。レポーター遺伝子は例えば、β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、ネオマイシン耐性、ＨＩＳ３、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）および蛍光ポリペプチド、例えばＧＦＰを包含する。当業者の知るとおり宿主細胞および目的の用途に適切なレポーター遺伝子を選択できる。ベクターおよびレポーター遺伝子についてはＢａｎｅｙｘ Ｆ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：４１１−４２１，１９９９； Ｖａｎ Ｃｒａｅｎｅｎｂｒｏｅｃｋ Ｋ，Ｖａｎｈｏｅｎａｃｋｅｒ Ｐ，Ｈａｅｇｅｍａｎ Ｇ．Ｅｐｉｓｏｍａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００ Ｓｅｐ；２６７（１８）：５６６５−７８；Ｓｏｌｌ ＤＲ， Ｓｒｉｋａｎｔｈａ Ｔ． Ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｕｎｇｉ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｔｏ ｍａｎ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９８ Ａｕｇｌ；１（４）：４００−５；Ｐｏｓｓｅｅ ＲＤ． Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １９９７ Ｏｃｔ；８（５）：５６９−７２；およびＭｏｕｎｔ ＲＣ， Ｊｏｒｄａｎ ＢＥ， Ｈａｄｆｉｅｌｄ Ｃ． Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｇｅｎｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｓｓａｙｉｎｇ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｙｅａｓｔ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９６；５３：２３９−４８を参照できる。
リプレッション（Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）：ＤＮＡ上の特定の部位へのリプレッサー蛋白の結合により起こる転写の抑制。
リプレッションンカセット（Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃａｓｅｔｔｅ）：サブクローニングベクター中に存在する選択可能なマーカーのリプレッサーを含有する核酸セグメント。
リプレッサー（Ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）：ＤＮＡ上の特定の部位へ結合することにより転写を防止する蛋白。
選択可能なマーカー（Ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ Ｍａｒｋｅｒ）：多くは特定の条件下においてそれを含有する分子または細胞であるか否かの選択を可能にするＤＮＡセグメント。これらのマーカーは活性、例えばＲＮＡ、ペプチドまたは蛋白の生成をコードすることができ、または、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白、無機および有機の化合物またはこれらの組み合わせなどに対する結合部位を提供できる。選択可能なマーカーの例は、（１）その他の場合には毒性である化合物（例えば抗生物質）に対する耐性を与える生成物をコードするＤＮＡセグメント；（２）レシピエント細胞においてその他の場合には欠如している生成物をコードするＤＮＡセグメント（例えばｔＲＮＡ遺伝子、栄養要求性マーカー）；（３）遺伝子産物の活性を抑制する生成物をコードするＤＮＡセグメント；（４）容易に発見できる生成物をコードするＤＮＡセグメント（例えば表現型マーカー、例えばβ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）および細胞表面蛋白）；（５）その他の場合は細胞の生存および／または機能に悪影響を及ぼす生成物に結合するＤＮＡセグメント；（６）その他の場合は上記１〜５に記載のＤＮＡセグメントのいずれかの活性を抑制するＤＮＡセグメント（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）；（７）基質を修飾する生成物に結合するＤＮＡセグメント（例えば制限エンドヌクレアーゼ）；（８）所望の分子を単離または発見するために使用できるＤＮＡセグメント（例えば特異的蛋白結合部位）；（９）その他の場合は非機能的であることができる特定のヌクレオチド配列をコードするＤＮＡセグメント（例えば分子のサブ集団のＰＣＲ増幅用）；（１０）非存在の場合には特定の化合物への耐性または感受性を直接または間接的に与えるＤＮＡセグメント；および／または（１１）レシピエント細胞において毒性である生成物をコードするＤＮＡセグメントである。
選択スキーム（Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅ）：１つ以上のＤＮＡインサートベクター、望ましくない代替のコンストラクトおよび試薬中間体および／またはコンストラクト発生に用いられる工程から生じる副生成物を含有する混合物からの所望のコンストラクトの選択、大量化または発見を可能にするいずれかの方法。１つの実施形態の選択スキームはクローニングの最中に連結または未連結のいずれかである成分を少なくとも２つ有する。１つの成分は選択可能なマーカーであり；もう一方の成分は選択可能なマーカーのインビトロまたはインビボの発現、または、選択可能なマーカーを担持するコンストラクトを保有する細胞の生存性を制御する。一般的に、この制御エレメントは選択可能なマーカーのリプレッサーまたはインデューサーであるが選択可能なマーカーの発現を制御する他の手段も使用できる。リプレッサーまたはアクティベーターのいずれを使用するかは、当業者が容易に知りえるとおり、マーカーが正の選択であるか負の選択であるかにより、そして、種々のＤＮＡセグメントの厳密な配置により変動する。好ましい要件は選択スキームが１つ以上の所望のコンストラクトのみに対して選択または大量化をもたらす点である。本明細書においては、ＤＮＡ分子の選択は（ａ）所望のＤＮＡ分子の存在が有るように選択または大量化すること、および（ｂ）所望のＤＮＡ分子ではないＤＮＡ分子の存在が無いように選択または大量化すること、を包含する。
部位特異的リコンビナーゼ（Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）：典型的には以下の４つの活性（またはその組み合わせ）、即ち：（１）１つまたは２つの特異的核酸配列の認識；（２）該配列の切断；（３）鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性；および（４）核酸の切断鎖を再封鎖するリガーゼ活性の少なくとも１つを有するリコンビナーゼの型。Ｓａｕｅｒ， Ｂ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：５２１−５２７（１９９４）を参照できる。保存的部位特異的組み換えは、相同組み換えおよびトランスポジションとは、両方のパートナーに対する高い水準の特異性により識別される。鎖交換機序はＤＮＡ合成非存在下における特定のＤＮＡ配列の切断と再結合を含む（Ｌａｎｄｙ， Ａ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：９１３−９４９（１９８９）参照）。
実質的に純粋（Ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）：本明細書においては、「実質的に純粋」とは所望の精製された分子、例えば蛋白または核酸の分子（本発明の抑制性核酸分子を含む）が所望の分子に典型的に備わっている夾雑物を本質的に含まないことを意味する。夾雑成分は例えば、本発明の抑制性または合成の反応を妨害する、および／または、本発明の抑制性核酸分子（例えばヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ）を分解または消化する、または、本発明の方法により生産される合成または増幅された核酸分子を分解または消化する場合がある化合物または分子を包含する。
標的細胞（Ｔａｒｇｅｔ Ｃｅｌｌ）：所望の化合物を送達する対象となるいずれかの細胞。本発明の送達方法を適用できる細胞はインビトロの細胞、エクスビボの細胞またはインビボの細胞を含むことができる。標的細胞は細胞培養物中、細胞培養物の上、固定化された状態のいずれかの形態にあるか、または液体、半固体または固体の倍地中に生育させることができる。標的細胞は単層の形態であって良い。標的を生物から回収および／またはいずれかの方法で培養してよい。標的細胞は細胞壁を有さない細胞およびいずれかの知られた処理（例えばプロトプラストの形成）により細胞壁を除去してある細胞であって、それより生存細胞を回収できるものを包含する。
転写調節配列（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：本明細書においては、転写調節配列はメッセンジャーＲＮＡ内への構造遺伝子１つ以上の転写を調節する作用を有するいずれかの立体配置または幾何的配置における核酸分子上に含まれるヌクレオチドの機能的ストレッチである。転写調節配列は例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー等が包含される。「転写調節配列」、「転写部位」および「転写シグナル」は互換的に使用してよい。
トランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）：標的細胞への発現可能な核酸の送達であって、これにより標的細胞は該核酸の発現が可能となるもの。「核酸」という用語には、分子量に関わらず、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方が包含されるものとし、そして、「発現」という用語は一過性の発現および安定な発現を含む細胞内における核酸の機能的存在のいずれかの顕在化を意味する。
トランスフェクション剤（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔ）：トランスフェクション剤を含まないトランスフェクション組成物を（２倍以上）超過してトランスフェクションの有意な増強をもたらすいずれかの物質。
ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）：本明細書においては、ベクターは核酸配列または目的の分子、例えばインサート、コーディング領域等に有用な生物学的または生化学的な特性を与える核酸分子である。例にはプラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、動原体およびインビトロまたは宿主細胞内で複製できるか、宿主細胞内の所望の位置に所望の核酸セグメントを運搬できる他の核酸が包含される。ベクターは種々の構造および／または機能配列、例えばベクター配列がベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく所定の様式で操作される、そして、例えばその複製および／またはクローニングを行うために核酸フラグメントを挿入することができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位１つ以上を含んでよい。ベクターはさらに、例えばＰＣＲ、転写および／または翻訳の開始のためのプライマー部位、および／または調節部位、組み換えシグナル、レプリコン、選択可能なマーカー、および、当業者の知る他の配列を定容してよい。核酸インサートを含むベクターはコンストラクトである。即ち、遺伝子療法コンストラクトは治療のための遺伝子がクローニングされている遺伝子療法ベクターである。同様にアンチセンス転写物を発現するコンストラクトは「アンチセンスコンストラクト」である。
クローニングベクター（Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）：プラスミド、コスミド、ウィルスまたはファージＤＮＡまたは複製およびクローニングを行うためにベクターの本質的な生物学的機能を失うことなくＤＮＡをスプライシングしてよい宿主細胞内で自律複製可能な他のＤＮＡ分子。クローニングベクターはさらにクローニングベクターを用いて形質転換された細胞の発見に使用するのに適するマーカーを含有してよい。マーカーは例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性であってよい。明らかに、相同組み換え、トランスポジションまたは制限酵素の使用を必要としない所望の核酸を挿入する方法（例えばＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許５，３３４，５７５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｔ：Ａクローニング等）もまた本発明に従って使用されるクローニングベクター内にフラグメントをクローニングするために適用することができる。クローニングベクターはさらにクローニングベクターを用いて形質転換された細胞の発見において使用するのに適する選択可能なマーカー１つ以上を含有できる。
サブクローニングベクター（Ｓｕｂｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ）：好ましくは適切なレプリコンを含む環状または直鎖の核酸分子を含むクローニングベクター。サブクローニングベクターはまた、最終生成物に組み込まれることによりクローニングされたＤＮＡインサートに対して、またはこれと共に作用することが望まれる機能および／または調節エレメントを含有できる。これに加えて、または、その代替として、サブクローニングベクターはまた選択可能なマーカー（好ましくはＤＮＡ）も含有できる。
発現ベクター（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒ）：クローニングベクターと同様であるが宿主への形質転換の後にそれにクローニングされている遺伝子の発現を増強することができるベクター。クローニングされた遺伝子は通常はプロモーター配列のような特定の転写調節配列の制御下に（即ち作動可能に連結されて）置かれる。作動可能に連結した核酸インサートを含む発現ベクターは「発現コンストラクト」と称する。
ベクター遺伝子（Ｖｅｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ）：通常はベクターの維持に必要な機能（例えばＤＮＡ複製に必要な遺伝子）を提供するために包含されるか、またその他の場合はベクターを含む細胞またはベクターから作成され多所望のコンストラクトを発見、識別または選択するためにベクター上に包含される、ベクター上に存在する遺伝子またはその部分。ベクター遺伝子の例は選択可能なマーカーである。
生物学的に活性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ）：本明細書においては、「生物学的に活性」という用語（「生物活性」と同義）は組成物または化合物そのものが生物学的作用を有すること、または、それが生物学的作用を修飾、誘発、促進、増強、ブロックまたは低減することか、または生物学的作用を有する第２の分子の生産または活性を制限するか、それと反応および／または結合するものを指す。第２の分子は必然ではないが内因性であることができる。「生物学的作用」は例えば免疫応答を刺激または誘発するもの；細胞、組織または生物において（例えば動物において）生物学的過程に影響するもの；病原体または寄生虫において生物学的過程に影響するもの；検出可能なシグナルを発生するか、発生されるように誘発するもの等であってよい。生物学的に活性な組成物、複合体または化合物は、調査用、治療用、予防用および診断用の方法および組成物において使用してよい。生物学的に活性な組成物、複合体または化合物は細胞、組織、臓器または生物（例えば動物）に対して所望の作用を誘発するか促進するように作用する。所望の作用の例は細胞、組織、臓器または生物における遺伝子発現をモジュレート、抑制または増強すること；疾患または状態に罹患した動物においてそれを予防、治療または治癒すること；病原体に感染した動物においてその生育を制限するか殺傷すること；動物の表現型または遺伝子型を強化すること；動物における予防的免疫反応応答を刺激すること；または動物における疾患または障害を診断することを包含する。
法医学および科学的研究への応用を含む本発明の調査用途の範囲において、「生物学的活性」という用語は、組成物、複合体または化合物が、それらと接触させてある材料、生物学的試料または生物における測定可能な出力の何らかの形態の変化を直接または間接的にもたらすことを示す。調査用途は被験資料における選択された標的化合物の量または濃度を測定するため、細胞または動物に対する生物活性化合物の作用を測定するため、または、選択された生物学的活性を改変、ブロックまたは増強する活性を有する化合物をスクリーニングするために使用してよい。
本発明の治療用途の範囲においては、「生物学的に活性」という用語は疾患または障害に罹患した動物に好都合に影響、および／または、病原体または寄生虫に対して不都合に影響する活性を有することを指す。即ち、生物学的に活性な組成物、複合体または化合物は病原体または寄生虫の；または癌細胞のように異常な生育および生化学的特性を有する動物の細胞、組織または臓器の、生育および／または維持に対して悪影響を及ぼす動物内部の生物学的または生化学的な活性を誘発または促進してよい。
本発明の予防的用途の範囲においては、「生物学的に活性」という用語は組成物または化合物が免疫応答を誘導または刺激することを指す。一部の好ましい実施形態においては、免疫応答は予防的であるため、即ち、病原体による感染を防止するために設計される。他の好ましい実施形態においては、免疫応答は、動物の免疫系が、癌細胞のように異常な生育および生化学的特性を有する動物の細胞に対して悪影響を与えるように反応するように設計される。本発明のこの用途においては、抗原を含む組成物、複合体または化合物をワクチンとして製剤する。
本発明の診断用途の範囲においては、「生物学的に活性」という用語は、組成物、複合体または化合物がインビボまたはエクスビボの診断方法のため、および診断用の組成物およびキットにおいて使用できることを指す。診断目的のためには、好ましい生物学的に活性な組成物または化合物は検出可能なポリペプチドを含むことにより典型的には（必須ではなく）検出することができるものである。組成物または化合物上に存在するエピトープに対する抗体もまたその検出のために使用してよい。
当業者の知るとおり、ある組成物、複合体または化合物は治療上、診断上および／または予防上の用途において生物学的に活性であってよい。「細胞内で生物学的に活性」と記載されている組成物、複合体または化合物はインビトロ（即ち細胞または組織の培養物中）またはインビトロ（即ち動物の細胞中）において生物学的に活性なものである。組成物または化合物の「生物学的に活性な成分」は組成物または化合物から遊離した後に生物学的に活性となるその部分である。このような成分は組成物または化合物の一部分または他の部分として生物学的に活性であってよい。
明細書および請求項において、「および／または」とは、加えて、または、その代替としての意味を有する。さらにまた単数表示の用語は複数表示を包含しているものとする。
組み換えＤＮＡ技術、分子および細胞生物学、および、医療／薬学の技術の分野で使用される他の用語は、本明細書においては、あるものに対してその技術において理解されている最も広範な用語を包含するものとし、そして当業者が一般的に理解するとおりである。
Figure 2006517790
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 ＩＩ．概論
一般的な用語において、本発明は、細胞、組織、臓器および全生物体への１つ以上の核酸（例えば１つ以上の核酸分子、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ベクター、遺伝子等）および／または１つ以上のペプチド（例えば１つ以上のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白または蛋白複合体）の送達のための組成物、複合体および方法を提供する。本発明の組成物および複合体は典型的には１つ以上の核酸および１つ以上の蛋白またはペプチド（これは細胞送達（望ましくは転位）ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白であることができ、例えばＷＩＰＯ／ＰＣＴ公開ＷＯ００／５８４８８に記載されるものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を含む。特定の実施形態においては、本発明の組成物および複合体は場合により、細胞、組織、臓器または生物への核酸１つ以上および／またはペプチド１つ以上の送達に適する複合対中に、光活性化化合物１つ以上、例えば蛍光団１つ以上を含む。
本発明の特定のこのような特徴において、核酸１つ以上および／またはペプチド１つ以上を含む複合体は、細胞、組織、臓器または生物に送達され、そして、次に細胞、組織、臓器または生物を適当な波長および強度の光で処理することにより光活性化化合物１つ以上の光活性化を起こす。この光活性化により、本発明の複合体からの核酸１つ以上および／またはペプチド１つ以上の遊離は、核酸および／またはペプチドが導入されている細胞、組織、臓器または生物に対して所望の生物学的活性を有するような態様で起こるのである。本発明はまた本発明の複合体および別の成分１つ以上を含む組成物を提供する。適当なこのような組成物は、例えば本発明の複合体１つ以上およびそのための薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤１つ以上を含む医薬組成物を包含する。本発明はまたそのような複合体および組成物を製造するための方法、および、例えば治療または予防の目的のために細胞、組織、臓器または生物に核酸分子１つ以上および／またはペプチド１つ以上を送達するためにこのような複合体および組成物を使用する方法を提供する。本発明はまた、本発明の複合体および組成物を含み、そして、場合により、複合体および組成物中またはこれと共に使用するため、および／または、本発明の方法を実施するために適している別の成分１つ以上をさらに含む、キットを提供する。
ＩＩＩ．ポリペプチド
上記したとおり、本発明の組成物および複合体はペプチド、ポリペプチドまたは蛋白１つ以上を含む。本発明の特定の特徴において、これらの複合体および組成物において使用されるペプチド、ポリペプチドまたは蛋白はいずれかの適当な生物学的、治療および／または予防の目的のために細胞、組織、臓器または生物に送達されるべきペプチド、ポリペプチドまたは蛋白である。本発明の特定の他の特徴において、本発明の複合体において使用されるペプチド、ポリペプチドまたは蛋白は、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ／ＰＣＴ公開ＷＯ００／５８４８８に記載されるもののような、細胞送達ペプチド、ポリペプチドまたは蛋白である。
本明細書においては、「ポリペプチド」という用語は限定を伴うことなくペプチド（オリゴペプチド）、蛋白およびポリペプチドを包含する。これらは全て、アミノ結合で連結されたアミノ酸２つ以上の重合体である。一般的にペプチドは２〜約ａ個のアミノ酸残基を含み、ここで「ａ」は５〜５０、好ましくは１０〜３０の整数であり、そして、天然の原料から単離してよく、或はより典型的にはインビボで合成される。本明細書においては、「オリゴペプチド」という用語は上記において定義した「ペプチド」という用語はと互換および等価に使用してよい。本明細書においては、「ポリペプチド」とは一般的には約ｂ個のアミノ酸残基を含み、ここで「ｂ」は２５〜５０，０００、好ましくは５０〜１０，０００、より好ましくは５０〜１，０００の整数である。「蛋白」という用語はポリペプチド並びに２個以上の共有結合または非共有結合したポリペプチドの複合体を包含する。ポリペプチドおよび蛋白はその天然の原料から精製および／または組み換えＤＮＡ技術により合成される。
本発明の複合体、組成物および方法における使用に適するペプチド、ポリペプチド、蛋白および蛋白複合体は、ペプチド、ポリペプチド、蛋白および蛋白複合体が送達される細胞、組織、臓器および生物に対して望ましい生物学的または生理学的作用を有するいずれかのペプチド、ポリペプチド、蛋白および蛋白複合体を包含する。このようなペプチド、ポリペプチド、蛋白および蛋白複合体の例を以下に示す。
−酵素、例えばキナーゼ；ペプチダーゼ／プロテイナーゼ；オキシドレダクターゼ；ヌクレアーゼ；リコンビナーゼ（例えばＣｒｅ、Ｉｎｔ、Ｆｌｐ、Ｔｎ５リゾルバーゼ等）；リガーゼ（例えばＤＮＡリガーゼ等）；リアーゼ；イソメラーゼ（例えばトポイソメラーゼ等）；ポリメラーゼ（例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素等）；トランスフェラーゼ（例えば末端トランスフェラーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ等）；ＡＴＰアーゼ；ＧＴＰアーゼ；等；
−サイトカイン、例えば成長因子（例えば表皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子アルファおよびベータ（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、神経栄養因子（ＮＴＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＴＦ）、グリア細胞誘導神経栄養因子（ＧＤＮＴＦ）、骨形態発生蛋白（ＢＭＰ）等およびその変異体）；インターロイキン（例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１８等およびその変異体）；インターフェロン（例えばＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等およびその変異体）；コロニー刺激因子（例えば顆粒球コロニー刺激因子’Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）；エリスロポエチン（Ｅｐｏ）；トロンボポエチン（Ｔｐｏ）；白血病抑制因子（ＬＩＦ／Ｓｔｅｅｌ因子）；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；等およびその変異体）；ペプチドホルモン（例えば抗利尿ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、インスリン、プロラクチン、ソマトメジン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、胎盤ラクトゲン等およびその変異体）；等；
−細胞内シグナリングペプチド；
−受容体（例えばサイトカイン受容体、ホルモン受容体、抗体受容体、インテグリン具リンおよび他の細胞外マトリックス受容体、神経伝達物質受容体、ウィルス受容体等およびその変異体）；
−抗体（例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体、そのフラグメント（例えばＦａｂおよびＦｃフラグメントおよびその部分）、および多重抗体複合体）；
−ワクチン組成物（例えばウイルス、細菌、カビ（コウボを含む）、寄生虫等のような病因性物質の蛋白またはペプチド；腫瘍細胞の蛋白またはペプチドまたは他の腫瘍関連の蛋白またはペプチド；および動物、特にヒトのような哺乳類における免疫応答を生じさせることが望ましい対象である他の蛋白またはペプチド）；
−構造および／または機能性の蛋白またはペプチド（例えばヘモグロビン、アルブミン、例えば血清アルブミン、細胞骨格蛋白、膜貫通チャンネル蛋白またはペプチド等およびそのフラグメントまたは変異体）；
−合成ペプチド（例えばヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）、ポリリジンおよびペプチド結合により共に連結されることによりペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドまたは蛋白を形成するアミノ酸２個以上の所望の配列を含有するいずれかの長さのその他の合成ペプチド、ここでこれらのいずれも、そして全てが当業者がよく知り、そして本明細書に記載されたよく知られた合成ペプチド合成法により製造できるもの）；
等である。当然ながら、本発明における使用（即ち、本発明の複合体、組成物および使用）に適する他の適当なペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドおよび蛋白は当業者の知るとおりであり、従って本発明の範囲に包含される。
Ａ．アミノ酸
「アミノ酸」という用語は本明細書においては一般的にアルファ炭素原子と称される同じ炭素原子に結合したカルボキシル（−ＣＯＯＨ）およびアミノ（−ＮＨ２）基の両方を有する分子を指す。アミノ酸は一般式Ｒ−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨで示すことができ、式中Ｒは天然に存在してもしなくてもよい側鎖または残基である。一般的にアミノ酸の側鎖（Ｒ）はｃ個の炭素原子、ｄ個の窒素原子、０、１または２個のイオウ原子、ｄ個の酸素、および／または、ｄ個のハロゲン原子を含有し、ここで「ｃ」は０〜約２０のいずれかの整数であり、そして「ｄ」は０〜約５のいずれかの整数である。
「天然のアミノ酸」および「天然に存在するアミノ酸」という用語はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒを指す。「非天然アミノ酸」（即ち天然に存在しないアミノ酸）は、例えばホモセリン、ホモアルギニン、シトルリン、フェニルグリシン、タウリン、ヨードチロシン、セレノシステイン、ノルロイシン（「Ｎｌｅ」）、ノルバリン（「Ｎｖａ」）、ベータ−アラニン、Ｌ−またはＤ−ナフタラニン、オルニチン（「Ｏｒｎ」）等を包含する。
アミノ酸はまた天然および非天然のアミノ酸のＤ型も包含する。「Ｄ−」とは「Ｄ」（右旋性）の立体配置を有するアミノ酸を指し、これは天然に存在する（「Ｌ−」）アミノ酸の立体配置とは逆である。特定の立体配置を示さない限り、当業者の知るとおりアミノ酸はＬアミノ酸とする。しかしながらアミノ酸はＤおよびＬ型の立体配置のラセミ混合物であることもできる。天然および非天然のアミノ酸は市販品（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）を購入するか、または当該分野で知られた方法で合成できる。アミノ酸の置換はその生物学的活性が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の同様性に基づいて行ってよい。
Ｂ．ペプチド合成
本発明に従って使用されるペプチドは当業者のよく知る種々の方法で製造してよい。ペプチド合成の検討および可能にする開示は、Ｍ． Ｂｏｄａｎｚｓｋｙ， ”Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” １ｓｔ ａｎｄ ２ｎｄ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．，１９８４ ａｎｄ １９９３； Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， ”Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，” ２ｎｄ ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌｌ．， １９８４； Ｆｏｘ ＪＥ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：２４９−２５８， １９９５； Ｋｉｓｏ Ｙ， Ｆｕｊｉｉ Ｎ， Ｙａｊｉｍａ Ｈ． Ｎｅｗ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｂｒａｚ Ｊ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ Ｒｅｓ． ２７：２７３３−２７４４， １９９４； Ｂｏｎｇｅｒｓ Ｊ， Ｈｅｉｍｅｒ ＥＰ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ． １５：１８３−１９３， １９９４； Ｗａｄｅ ＪＤ， Ｔｒｅｇｅａｒ ＧＷ． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ａｕｓｔｒａｌａｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３：３３２−３３６， １９９３； Ｆｉｅｌｄｓ ＧＢ， Ｎｏｂｌｅ ＲＬ． Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３５：１６１−２１４， １９９０； Ｎｅｗｔｏｎ Ｒ， Ｆｏｘ ＪＥ． Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｄｖ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． １０：１−２４， １９８８； Ｂａｒａｎｙ Ｇ， Ｋｎｅｉｂ−Ｃｏｒｄｏｎｉｅｒ Ｎ， Ｍｕｌｌｅｎ ＤＧ． Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： ａ ｓｉｌｖｅｒ ａｎｎｉｖｅｒｓａｒｙ ｒｅｐｏｒｔ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３０：７０５−７３９， １９８７； Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ Ｍ． Ｉｎ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｌａｓｔ ｔｈｒｅｅ ｄｅｃａｄｅｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ２５：４４９−４７４， １９８５； Ｃｈａｉｋｅｎ ＩＭ． Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１：２５５−３０１， １９８１； Ｆｒｉｄｋｉｎ Ｍ， Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ Ａ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４３：４１９−４４３， １９７４； Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ ＲＢ． Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｄｖ Ｅｎｚｙｍｏｌ Ｒｅｌａｔ Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ３２：２２１−２９６， １９６９；およびＮｅｉｍａｒｋ等への米国特許４，７４８，００２（半自動固相ペプチド多重シンセサイザーおよび多重シンセサイザーを使用することによる合成ペプチドの製造のための方法）を参照できる。
Ｃ．融合蛋白
特定の実施形態においては、本発明において使用されるペプチド、ポリペプチドまたは蛋白は融合蛋白の形態である。本明細書においては、「融合蛋白」という用語は別のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白の１つ以上に由来する連続アミノ酸のシリーズにペプチド結合を介して連結したペプチド、ポリペプチドまたは蛋白の１つに由来する連続アミノ酸のシリーズを含むペプチド、ポリペプチドまたは蛋白を指す。例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）ドメインを目的のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白に融合することにより、融合蛋白はグルタチオンアガロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，１９９５カタログ）上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製できるようになる。融合蛋白は融合蛋白の検出、精製または切断のために機能する副次的配列１つ以上を包含してよい。目的のペプチド、ポリペプチドまたは蛋白を連続するヒスチジン（例えば６ｘＨｉｓ）のシリーズに融合する場合は、融合蛋白は金属イオン含有キレート形成樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ）上のアフィニティークロマトグラフィーにより精製で着る。融合蛋白は抗体エピトープ（例えばＭｙｃから誘導されるもの）、チオレセントペプチドまたはポリＨｉｓタグのような蛋白タグとして機能する配列を含んでよい。タグおよび他のエレメントは融合蛋白の精製および／または検出において機能する。本発明のこの特徴に従って融合蛋白を製造する際には、活性、溶解度、安定性等に関してアミノ末端およびカルボキシ末端の融合を比較する必要があることが多い。
標的配列は融合蛋白内に含まれることができる副次的エレメントの別の型である。特定の細胞型に融合蛋白を指向させる細胞ターゲティングエレメントは細胞表面分子に志向された抗体フラグメント、細胞上に存在する受容体のためのリガンドのフラグメント、病原体から誘導された細胞特異的ターゲティング配列、細胞接着分子の誘導体等のようなものを包含する。細胞下の位置に融合蛋白を志向させる細胞内ターゲティングエレメント、例えば、核、細胞膜、クロロプラスト、ミトコンドリア、小胞体、原形質、および、上記したものの膜または膜間の空隙はよく知られており、そして市販されている（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐＳｈｏｏｔｅｒＴＭベクターのシリーズ）。種々のターゲティング配列が当該分野で知られており、そして当該分野で知られた方法を用いて融合蛋白内に容易に組み込むことができる。融合蛋白をコードするポリヌクレオチドは標準的な分子生物学の手法により構築してよい（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。
ＩＶ．細胞送達分子
本発明の組成物、複合体および方法における使用に適する細胞送達分子の例は転位ペプチドおよび蛋白、および生物学的な膜を通過する能力により定義されるペプチドおよび蛋白の類縁体（ペプトイド）、および、ＤＮＡ結合ペプチド、オリゴペプチドまたはポリペプチドを包含する。転位ペプチドおよび蛋白は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ／ＰＣＴ公開ＷＯ００／５８４８８に記載され、使用されているもの、およびそのペプトリド類縁体を包含する。
１．転位ペプチドおよび蛋白
培養哺乳類細胞の培地に転位ペプチドまたは蛋白を適用する場合、ペプチドまたは蛋白は細胞の原形質または核（または他のオルガネラ）内に取り込まれ、そして蓄積される。報告されている転位ペプチドおよび蛋白の例は、単純疱疹ウィルス１型に由来するＶＰ２２蛋白およびその機能的フラグメント（Ｅｌｌｉｏｔｔ， Ｇ．， ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，Ｐ．，Ｃｅｌｌ ８８．２２３−２３３（１９９７））、ＨＩＶＴａｔ蛋白由来のペプチド、ショウジョウバエホメオドメイン蛋白アンテナペヂア（Ｄｅｒｒｏｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，１９９６）およびそのフラグメント、または、およびカポジ塩基性ＦＧＦ受容体（Ｋ−ＦＧＦ）（Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｏｋｋａ，Ｓ．，Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４：１７５９−６４（１９９７））を包含する。細胞膜を貫通する能力を有するペプチドは「細胞貫通ペプチド」または「蛋白導入配列」と称されている。転位蛋白およびペプチドについては、Ｓｃｈｗａｒｔｓ．，Ｊ．Ｊ． ａｎｄ Ｚａｎｇ，Ｓ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２：１６２−１６７（２０００）；およびＳｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１０：２９０−２９５（２０００）； Ｓｃｈｗａｒｚｅ， Ｓ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．，ａｎｄ Ｄｏｗｅｙ，Ｓ．Ｆ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ．２１：４５−４８（２０００）；およびＬｉｎｄｇｒｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｉｃ．２１．９９−１１３（２０００）を参照できる。
Ｖ２２、Ｔａｔおよびアンテナペジア蛋白の生物学的機能は異なっている。ＶＰ２２はＨＳＶ−１の被包中に存在する構造蛋白であり、ウィルスの感染性のためには必須である（Ｅｌｌｉｏｔ， Ｇ．Ｄ． ａｎｄ Ｍｅｒｅｄｉｔｈ，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．７３：７２３−７２６（１９９２））。ＴａｔはＨＩＶ−１長末端リピートからの発現の活性化に必要である（Ｃｕｌｌｅｎ，Ｂ．Ｒ．，ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｗ．Ｃ．，Ｃｅｌｌ ５８：４２３−４２６（１９８９）において検討されている）。一方、アンテナペジアはホメオドメインを含有する転写活性化物質であり、ショウジョウバエの発生に必要である（Ｇｅｒｉｎｇ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：１２４５−１２５２（１９８７）において検討されている）。
同様に細胞の取り込みに関与するこれらの蛋白のアミノ酸配列も異なる。ＶＰ２２のアミノ酸１５９〜３０１は培養哺乳類細胞による取り込みのために十分であり、そしてＶ２２の取り込みはＣ末端の３４残基の欠失により消失する。Ｔａｔ（アミノ酸４６〜６０）、アンテナペジア（アミノ酸４２〜５８）、アンテナペジア’４３〜５８）、アンテナペジア（４１〜５０）およびＫＦＧＦ（アミノ酸１〜１２）の同様のフラグメントは哺乳類細胞による取り込みに十分である。Ｖ２２（１５９〜３０１）、Ｔａｔ（４８〜６０）、アンテナペジア（４３〜５８）およびｋＦＧＦ（１〜１２）との蛋白およびペプチドの融合の多くが報告されており、例えば第２のポリペプチド、即ち緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、ｐ５３、チミジンキナーゼ、ｐ２７ｋｉｐ１カスパーゼ−３、β−ガラクトシダーゼ、ｒａｂ小分子ＧＴＰアーゼファミリーのメンバー、Ｇｒｂ２ＳＨ２度主およびＣｒｅリコンビナーゼを含む融合蛋白があげられる。おのおのの場合において、第２のポリペプチドの生物学的活性が細胞内送達の後に明らかにされている（Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ，１９９７，Ｄｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９， Ｎａｇａｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｏｃｅｒｏ−Ａｋｂａｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｃｈｗａｒｚｅ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１５６９−１５７２（１９９９），Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｐｅｒｅｚ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．８：１２７−１２８７（１９９４），Ｒｏｊａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊｏ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：９２９−９３３（２００１））。
ＶＰ２２、アンテナペジアおよびＴａｔは概ね構造的同様性を有しており、例えば各蛋白は未変化の残基により分離されているリジンまたはアルギニン残基多くを含有する領域を有する。二次構造の予測によれば、これらの塩基性の領域はアルファへリックスを形成することができる。最近、多くのその他の膜転位ペプチドが発見されており（Ｍｉ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３３９−３４７ （２０００）； Ｓｕｚｕｋｉ， ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００２； ａｎｄ Ｗｅｎｄｅｒ， Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９７：１３００３−１３００８ （２０００））、そしてこれらのペプチドの間の唯一の同様性はその高いアルギニン含量である。長さが僅か６〜１１残基のポリアルギニンペプチドはＴａｔ（４８〜６０）と同様の転位活性を有すると考えられる（Ｗｅｎｄｅｒ， Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９７：１３００３−１３００８ （２０００）； Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１； Ｍａｓａｙｕｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１； ａｎｄ Ｈａｎ， Ｋ．， ｅｔ’ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌｓ １２：２６７−２７１ （２００１））。米国特許出願公開２００３００３２５９３（２００３年２月１３日）はスペースアルギニン部分を含む転位ペプチドを記載している。
ペプチドは基（ＺＹＺ）ｎＺ、（ＺＹ）ｎＺ、（ＺＹＹ）ｎＡおよび（ＺＹＹＹ）ｎＺ、ただし式中ＺはＬ−アルギニンまたはＤ−アルギニンであり、Ｙはアミジノまたはグアニジノ部分を含むもの以外のアミノ酸であり、そして、ｎは２〜１０の整数であるものから選択される構造を有するものとして記載されている。この出願公開は参照によりその全体、特に転位ペプチドの合成および適用の説明について本明細書に組み込まれる。
蛋白ターゲティングドメインは、それらが新規に設計されたもの、または、ＶＰ２２、ＴａｔおよびＡｎｔのような天然に存在する蛋白から誘導されたもののいずれについても、知られたものである。例えば、Ｄｏｋｋａ， Ｓ．， Ｐｈａｒｎｚ Ｒｅｓ １４：１７５９−６４ （１９９７）． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｉｍｐｏｒｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｒｒｉｅｒ． Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １４， １７５９−６４； Ｆｕｔａｋｉ， Ｓ．， Ｓｕｚｕｋｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：５８３６−５８４０ （２００１ａ）． Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ａｎ ａｂｕｎｄａｎｔ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｌｉｖｅｒｙ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６：５８３６−５８４０； Ｆｕｔａｋｉ Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． １２：１００５−１０１１ （２００１ｂ）． Ｓｔｅａｒｙｌａｔｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ａ ｎｅｗ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． １２：１００５−１０１１； Ｈｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：４７４−４７７ （２００１）． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎｓ： ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６２， ４７４−４７７； Ｍｉ， Ｚ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ ２：３３９−３４７ （２０００）， Ｍａｉ， ｅｔ ａｌ．， （２００２）． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａｂｌｅ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒａｐｙ ２， ３３９−３４７； Ｍｏｒｒｉｓ， Ｍ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−６ （２００１）． Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９， １１７３−６； Ｒｏｔｈｂａｒｄ， Ｊ．Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １５：３６１２−３６１８ （２００２）． Ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｓｐａｃｉｎｇ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １５， ３６１２−８； Ｗｅｎｄｅｒ， Ｐ． Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９７：１３００３−１３００８ （２０００））． Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ， ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｅｎａｂｌｅ ｏｒ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ： ｐｅｐｔｏｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９７， １３００３−１３００８； Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７：２４３７−２４４３ （２００２）． Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｍｏｎｇ ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７， ２４３７−２４４３； ａｎｄ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ＰＣＴ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ０２／０６５９８６， Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｓｐａｃｅｄ ａｒｇｉｎｉｎｅ ｍｏｉｅｔｉｅｓ， ｔｏ Ｗｅｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．を参照できる。
１Ａ．転位ペプチドのペプトイド類縁体
特定の転位ペプチドのペプトイド類縁体は細胞膜を通過する転位のために機能することがわかっている。例えばポリグアニジンペプトイド誘導体のシリーズ（Ｎ−ａｒｇＸ、ここでｘは５〜９）はＴａｔ４９〜５０のペプチドミメティック類縁体として設計され、そしてＲ５、Ｒ７およびＲ９よりも僅かに少ない量で細胞により取り込まれることがわかっている（Ｗｅｎｄｅｒ，Ｐ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７：１３００３−１３００８（２０００））。この参考文献は細胞への転位のために機能する下記構造：
Figure 2006517790
 ［式中、Ｘは（ＣＨ２）ｍであり、ｍは２、３、４、６または８であり、そしてＹ(-)はアニオン、例えばＣＦ３ＣＯ２である］を有するポリグアニジンペプトイドを開示している。Ｎが９であり、ｍが４〜８であるこの式のペプトイドは転位のために特に有用である。ペプトイドの合成のための方法も前出のＷｅｎｄｕ等２０００の文献において知られており、そこに記載されている参考文献は有用な合成方法を示している。
２．ＤＮＡ結合ペプチドおよび蛋白
種々のＤＮＡ結合蛋白、特に塩基性のもの、さらにとりわけリジンおよびアルギニン残基の比較的高比率を有するＤＮＡ結合蛋白（「Ａｒｇ−およびＬｙｓ−リッチ蛋白」）を本発明の実施に使用できる。ＤＮＡ結合蛋白は配列特異的、部分的配列特異的または非特異的であることができる。本発明における使用に適するＤＮＡ結合ペプチドおよび蛋白の例は以下のサブセクションに詳述するとおりである。
ａ．ポリリジンおよび他のカチオンホモポリペプチド
ポリリジン（「ポリ−Ｌｙｓ」）は核酸に複合体化して圧縮することが当該分野で知られている。核蛋白複合体形成のためのモデルとしてカチオン性のホモポリペプチドを使用したＯｌｉｎｓとｖｏｎ Ｈｉｐｐｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２４：１５７−１７６，１９６７）による研究によれば、カチオン性ポリペプチド（例えばポリリジンを含む）とのＤＮＡの複合体は溶液中の両方成分の「アニーリング」の後、即ち、２Ｍ〜０．０１０ＭのＮａＣｌ濃度からの段階漸減的な透析により、形成することが示唆されている。ポリ−Ｌｙｓによる核酸の圧縮の研究は現在進行中である（Ｌａｕｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｕｐｔａｋｅ ｂｙ ｒａｔ ｌｉｖｅｒ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｏｒ ｐｏｌｙ−Ｄ−ｌｙｓｉｎｅ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４４３：６１−６５． Ｍｏｌａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｎａｎｏｍｅｔｒｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓｍａｌｌｅｒ， ｍｏｒｅ ｓｔａｂｌｅ ｉｎ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｆｌｕｉｄｓ ａｎｄ ａｆｆｏｒｄ ｈｉｇｈｅｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｈａｎ ｔｈｅｉｒ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １５７２：３７−４４； ａｎｄ Ｓｃｈｗａｒｚｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｂａｓｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｖｅｃｔｏｒｓ： ａ ｈｉｇｈ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ａｎｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ３２１：１２９−１３６）。
ポリ−Ｌｙｓ自体に加えて、種々の化学的に修飾されたポリ−Ｌｙｓの誘導体が使用されている。これらには例えば以下のものが包含される。
−ラクトシル化されたポリ−Ｌｙｓ（Ｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９６． Ｐｕｔａｔｉｖｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ａ ｈｕｍａｎ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ ｂｙ ＤＮＡ／ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２２５：１８６−１９４； Ｋｏｌｌｅｎ ｅｔ． ａｌ．， １９９９． Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎｔｏ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０：１０８１−１０８６； ａｎｄ Ｋｌｉｎｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ／ｃＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ３：８３１−８４１）；
−ガラクトシル化されたポリ−Ｌｙｓ（Ｈａｎ Ｊ， １１ Ｙｅｏｍ Ｙ．， ２０００． Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ｉｎｔｏ ｈｅｐａｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ ２０２：１５１−１６０； ａｎｄ Ｈａｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ ｗｉｔｈ ｇａｌａｃｔｏｓｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５３：３０１−３１０）；
−ヒスチジル化されたポリ−Ｌｙｓ（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖｅｃｔｏｒ ｏｆ ｈｉｓｔｉｄｙｌａｔｅｄ ｏｌｉｇｏｌｙｓｉｎｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ ｔｕｍｏｒ−ｈｏｍｉｎｇ ＲＧＤ ｍｏｔｉｆ． Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ８：７８３−７８７； Ｍｉｄｏｕｘ Ｐ， Ｍｏｎｓｉｇｎｙ Ｍ．， １９９９． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｈｉｓｔｉｄｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ／ｐＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １０：４０６−４１１； ａｎｄ Ｂｅｌｌｏ ｅｔ ａｌ， ２００１． Ｈｉｓｔｉｄｙｌａｔｅｄ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ａｓ ＤＮＡ ｖｅｃｔｏｒ： ｅｌｅｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌｙｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｌｅｘｅｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １２：９２−９９）；
−例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および誘導化ＰＥＧ部分のような親水性重合体とコンジュゲートしたポリ−Ｌｙｓ（Ｔｏｎｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｎｏｖｅｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｆｏｒｍｅｄ ｂｙ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ） ｇｒａｆｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３８０：３５４−３６８； Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， ２００２． ＰＥＧ ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｗｉｔｈ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ： ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７９：２８３−２９１； Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ａｓ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ５４：３９−４８； Ｎａｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ａｒｔｅｒｙ ｗａｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）−ｇｒａｆｔｅｄ−ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ａｒｔｅｒｙ ｗａｌｌ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：２７３−２８４； ａｎｄ Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ， ｌａｃｔｏｓｅ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ−ｇｒａｆｔｅｄ ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２６５７−２６６５）；
−葉酸とコンジュゲートしたポリ−Ｌｙｓ（Ｇｉｎｏｂｂｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７． Ｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｃａｒｒｉｅｒ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃ−ｍｙｃ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ （Ｍ１４） ｃｅｌｌｓ． Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １７：２９−３５）；
−還元性の培地中で核酸の細胞内放出を可能にするジスルフィド含有カチオン性重合体にコンジュゲートしたポリ−Ｌｙｓ、例えばＰｏｌｙ［Ｌｙｓ−（ＡＥＤＴＰ）（Ｐｉｃｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｐｏｌｙ［Ｌｙｓ−（ＡＥＤＴＰ）］：ａ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｔｈａｔ ａｌｌｏｗｓ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＤＮＡ／ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ａ ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｏｌｙｆｅｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １３：７６−８２）；および、
−グルコノイル化ポリ−Ｌｙｓ（Ｅｒｂａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｔｈｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｈａｒｇｅｓ ｏｆ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ ｂｙ ｐａｒｔｉａｌ ｇｌｕｃｏｏｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ／ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３２４：２７−３６）。
参考になるものは、Ｂｅｕｇ等への米国特許５，３５４，８４４（蛋白−ポリカチオンコンジュゲート）；Ｆｅｒｋｏｌ，Ｊｒ．等への５，９７２，９００（細胞への核酸の送達）；全てＨａｎｓｏｎ等への５，１６６，３２０（哺乳類細胞への遺伝子の導入のための担体システムおよび方法）；および６，００８，３３６、５，８４４，１０７および５，８７７，３０２（圧縮核および細胞へのその送達）、６，０７７，８３５（細胞への圧縮核の送達）である。Ｆｉｌｐｕｌａ等への米国特許６，３３３，３９６号（核酸のターゲティング送達のための方法）はそのＣ末端、Ｎ末端または両方において、オリゴ−Ｌｙｓ、オリゴ−Ａｒｇおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される塩基性アミノ酸残基を含む単一鎖抗原結合ポリペプチドを記載している。Ｈａｎｓｏｎ等への米国特許６，２８１，００５（自動核酸圧縮装置）は圧縮されたＤＮＡ複合体を製造するために使用できる装置を記載している。
ｂ．非真核生物ヒストン様蛋白
本発明において使用できるＤＮＡ結合Ａｒｇ−およびＬｙｓ−リッチの蛋白の１つのクラスはいずれかの非真核生物ヒストン様蛋白である。例えば、これらにはＨＵ蛋白およびＩＨＦ（組み込み宿主因子）が包含される。ＨＵおよびＩＨＦ蛋白は種々の真正細菌目および古細菌、例えばアエロモナス・プロテリチカ、バチルス・カルドリチクス、バチルス・カルドテナックス、バチルス・セレウス、バチルス・グロビジ、バチルス・ステアロサーモフィルス、バチルス・サブチルス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ボレリア・バーグドルフェリ、カンピロバクター・ジェジュニ、エシェリシア・コリ、マイコプラズマ・ガリセプチカム、ネイセリア・ゴノレア、シュードモナス・アエルギノーサ、シュードモナス・ピチダ、ロドバクター・カプスラタス、サルモネラ・チフィムリウム、セラチア・マルセセンスおよびサーモトガ・マリチマから発見され、クローニングされている。
本発明にしたがって使用するのに適する非真核生物ヒストン様蛋白は例えば表３に記載するものである。
Figure 2006517790
Figure 2006517790
Figure 2006517790
Figure 2006517790
 ｃ．ヒストン
本発明の複合体および組成物において使用できるＤＮＡ結合、Ａｒｇ−およびＬｙｓ−リッチの蛋白の別のクラスはヒストンまたはヒストンの混合物である。いずれかのヒストン蛋白、例えばＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４を使用することができる。
トランスフェクションを媒介または増強するためのヒストン蛋白の使用は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる以下の参考文献、即ち、Ｂａｌｉｃｋｉ Ｄ， Ｂｅｕｔｌｅｒ Ｅ． １９９７． Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｍｅｄ． ３：７８２−７８７； Ｂａｌｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ． ２０００． Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｍｕｒｉｎｅ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１１５００−１１５０４； Ｂａｌｉｃｋｉ ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：７４６７−７４７１； Ｄｅｍｉｒｈａｎ ｅｔ ａｌ． １９９８． Ｈｉｓｔｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＨＩＶ−１ ｔａｔ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ Ｈｕｍ Ｖｉｒｏｌ． １：４３０−４４０； ａｎｄ Ｚａｉｔｓｅｖ ｅｔ ａｌ． ２００２． Ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ： ｒｏｌｅ ｏｆ ｃａｌｃｉｕｍ ｉｎ ｔｈｅ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｕｐｔａｋｅ ａｎｄ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆａｔｅ ｏｆ Ｈｌ−ＤＮＡ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ． Ａｃｔａ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ １０４：８５−９２．さらにまた、共にＷｏｌｆｆ等への米国特許６，１８０，７８４および５，７４４，３３５（共に表題は「両親媒性化合物およびＤＮＡ結合蛋白と混合したポリヌクレオチドにより細胞のトランスフェクトする方法」）；Ｈｅｒｗｅｉｊｅｒ等への米国特許６，４５８，３８２（「核酸転移複合体」）；ＨａｌｌｙｂｏｎｅのＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／１４４２４（ＤＮＡ転移方法）；および全てＣｈａｎｄｒａ等のＰＣＴ出願公開ＷＯ９９／１９５０２、ＥＰ０９６７２８８Ａ１およびＥＰ０９０８５２１Ａ１（全て表題は「細胞への核酸の転移のためのトランスフェクションシステム）も参照できる。
全てＢａｎｄｍａｎ等への米国特許５，８５１，７９９、５，９８１，２２１および５，９０８，８３１（全て表題は「ヒストン様蛋白」）に記載されているヒトヒストン様蛋白および全てＳｃｈｅｒｍａｎ等への米国特許５，９４５，４００および６，２００，９５６およびＰＣＴ出願公開ＷＯ９６／２５５０８（全て表題は「核酸含有組成物、その調製および使用」）に記載されている蛋白およびペプチド配列もまた本発明を実施するために使用できる。化学修飾されたヒストン蛋白、例えばガラクトシル化ヒストン（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ５：４２９−４３５，１９９４）は本発明に使用できる。ヒストン蛋白は当該分野で知られた手法を用いて蛍光団で標識できる。例えばＺａｉｔｓｅｖ等（２００２）はＦＩＴＣ標識ヒストンＨ１を記載している。さらにまた、ヒストンは脂質ＤＯＳＰＥＲのような他のトランスフェクション剤と組み合わせて使用できる（Ｋｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ａ ｎｅｗ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｎｅｏｎａｔａｌ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｈｉｓｔｏｎｅ Ｈ１ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＤＯＳＰＥＲ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ．Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．２４：２５７−２６１）。
Ｖ．核酸
上記した通り、本発明の複合体は、本発明の組成物、複合体および方法を用いて細胞、組織、臓器または生物に送達で切る目的の遺伝子１つ以上を含む場合が多い核酸または核酸分子１つ以上を含む。本明細書においては、「核酸」という用語（本明細書においては「核酸分子」という用語と互換的および等価に用いる）は天然の原料から単離した核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡおよびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子）を指し、これらは；インビトロでＰＣＲ増幅または化学合成のような手法を用いて調製されるもの；例えば組み換えＤＮＡ技術を用いてインビボで調製されるもの；またはいずれかの適切な方法により調製または得られるものである。本発明に従って使用される核酸はいずれかの形状（直鎖、環状等）または位相幾何学（１本鎖、２本鎖、直鎖、環状、スーパーコイル、捩れ型、切り込み型等）のものであってよい。「核酸」という用語はまた限定することなくペプチド核酸（ＰＮＡ）およびポリペプチド−核酸コンジュゲート；少なくとも１つの化学修飾された糖残基、骨格、核間連結、塩基、ヌクレオチド、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類縁体または誘導体を有する核酸；並びに化学修飾された５’または３’末端を有する核酸；およびこのような修飾２つ以上を有する核酸のような核酸誘導体も包含する。核酸内の全ての連結部が同一である必要はない。
核酸の例は例えばオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）において有用なオリゴヌクレオチド）、アプタマー、ポリヌクレオチド、人工染色体、クローニングベクターおよびコンストラクト、発現ベクターおよびコンストラクト、遺伝子療法ベクターおよびコンストラクト、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｔＲＮＡおよびｔｍＲＮＡ等を包含する。後者の型の核酸についてはＭｕｔｏ Ａ，Ｕｓｈｉｄａ Ｃ，Ｈｉｍｅｎｏ Ｈ．Ａ． ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＲＮＡ ｔｈａｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｓ ｂｏｔｈ ａ ｔＲＮＡ ａｎｄ ａｎ ｍＲＮＡ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２３：２５−２９，１９９８；およびＧｉｌｌｅｔ Ｒ，Ｆｅｌｄｅｎ Ｂ．Ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｖｉｅｗｓ ｏｎ ｔｍＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｇｇｉｎｇ ａｎｄ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｒｅｓｃｕｅ．Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４２：８７９−８８５，２００１を参照できる。
Ａ．オリゴヌクレオチド
本発明において使用する場合は、オリゴヌクレオチドは１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接するヌクレオチドのペントースの５’位の間のホスホジエステル結合により連結されたヌクレオチドの共有結合連結配列を含む合成または生物により生産された分子である。本明細書においては、「オリゴヌクレオチド」という用語は天然の核酸分子（即ちＤＮＡおよびＲＮＡ）並びに非天然または誘導された分子、例えばペプチド核酸、ホスホチオエート含有核酸、ホスホネート含有核酸等を包含する。さらに本発明のオリゴヌクレオチドは修飾された、または天然に存在しない糖残基（例えばアラビノース）および／または修飾された塩基残基を含有してよい。オリゴヌクレオチドという用語は種々の天然のヌクレオチド、誘導ヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたはこれらの組み合わせを含むヌクレオチド分子のような誘導ヌクレオチドを包含する。本発明のオリゴヌクレオチドはまた特定の蛋白、酵素または基質との分子の相互作用を防止するブロッキング基を含んでよい。
オリゴヌクレオチドは例えばＲＮＡ、ＤＮＡおよびハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ分子であって、ｅ個のヌクレオチドの最小長、ただしここで「ｅ」は約２〜約１５のいずれかの整数であるもの、およびｆ個のヌクレオチドの最大長、ただしここで「ｆ」は約２〜約２００のいずれかの整数であるもの、を有する配列を有するものを包含する。一般的に、約６ヌクレオチド、好ましくは約１０、より好ましくは約１２〜約１５ヌクレオチドの最小長が相補核酸鎖への特異的結合を起こすためには望ましい。
一般的に、オリゴヌクレオチドは１本鎖（ｓｓ）または２本鎖（ｄｓ）のＤＮＡまたはＲＮＡ、またはコンジュゲート（例えば５’および３’ＤＮＡ「クランプ」を有するＲＮＡ分子）または誘導体（例えばＲＮＡ：ＤＮＡという対になった分子）それから化学修飾された形態）であってよい。１本鎖ＤＮＡが好ましい場合が多く、その理由はＲＮＡよりＤＮＡのほうがヌクレアーゼ分解に対して感受性が低いためである。同様に、オリゴヌクレオチドの特異性または安定性を増強させる化学修飾が本発明の一部の適用においては好ましい。
オリゴヌクレオチドの特定の型、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、干渉ＲＮＡおよびアプタマーは本発明の組成物および複合体において特に有用である場合がある。
１．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明における使用のために適する核酸はアンチセンスオリゴヌクレオチドを包含する。一般的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは予め選択された核酸と特異的なハイブリダイゼーションを起こすのに十分な同一性および数を有するヌクレオチド配列を含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドは一般的に、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡに対し、または、それから選択されたＤＮＡ部分に対し直接結合し、これにより、それぞれ、ｍＲＮＡから翻訳される蛋白の量、または、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの量をモジュレートするように設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは研究用ツール、診断補助用、および治療薬として使用してよい。
本発明に従って使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的には標的ｍＲＮＡ配列に十分相補的となるように選択された配列を有志、これにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡと安定なハイブリッドを形成し、そして好ましくは生理学的条件下にｍＲＮＡ配列の翻訳を抑制する。必然ではないが、アンチセンスオリゴヌクレオチドは標的遺伝子配列の部分に対して１００％相補であることが好ましい。しかしながら、本発明はまた、標的遺伝子配列に対する異なる水準の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば標的遺伝子配列に対して少なくとも約５０％の相補性、少なくとも約５５％の相補性、少なくとも約６０％の相補性、少なくとも約６５％の相補性、少なくとも約７０％の相補性、少なくとも約７５％の相補性、少なくとも約８０％の相補性、少なくとも約８５％の相補性、少なくとも約９０％の相補性、少なくとも約９１％の相補性、少なくとも約９２％の相補性、少なくとも約９３％の相補性、少なくとも約９４％の相補性、少なくとも約９５％の相補性、少なくとも約９６％の相補性、少なくとも約９７％の相補性、少なくとも約９８％の相補性、または、少なくとも約９９％の相補性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドの製造および使用を包含する。特定の実施形態においては、アンチセンスオリゴヌクレオチドは以下の条件下において単離された標的ｍＲＮＡにハイブリダイズする。即ち、ブロットをまず予備ハイブリダイゼーション溶液中（５ｘＳＳＣ；２５ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ６．５；１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液；および１％ＳＤＳ）４２℃で少なくとも２時間インキュベートし、次に放射標識ｃＤＮＡプローブまたはオリゴヌクレオチドプローブ（１ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌのハイブリダイズ溶液）と、ハイブリダイゼーション緩衝液（５ｘＳＳＣ；２５ｍＭＮａＰＯ４、ｐＨ６．５；１ｘＤｅｎｈａｒｄｔ溶液；２５０ｕｇ／ｍｌ全ＲＮＡ；５０％脱イオンホルムアミド；１％ＳＤＳ；および１０％デキストランスルフェート）中でハイブリダイズする。１８時間３０〜４２℃におけるハイブリダイゼーションの後０．１〜６ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３回２５〜５５℃でフィルター洗浄する。ハイブリダイゼーション温度および洗浄のストリンジェンシーはＳａｍｂｒｏｏｋ等の記載したガイドライン （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）および例えばそこに記載されている表１１．２に従ってオリゴヌクレオチドのＧＣ含量の比率により決定される。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成、設計、選択および使用に関する代表的な教示は例えば、Ｂａｋｅｒ等への米国特許５，７８９，５７３、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチンおよびＣＭＶＩＥ１／ＩＥ２のアンチセンス抑制剤；Ｂｅｎｎｅｔｔ等への米国特許６，１９７，５８４、ＣＤ４０発現のアンチセンスモジュレーション；およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｕｎｉｔｓ，２．１１ ａｎｄ ２．１２が挙げられる。
２．リボザイム
本発明における使用に適する核酸分子はまたリボザイムを包含する。一般的に、リボザイムは核酸配列の切断、スプライシングまたはライゲーションに通常関わる酵素活性を有するＲＮＡ分子である。リボザイムの典型的な基質はＲＮＡ分子であるがリボザイムはＤＮＡ分子（またはむしろ蛋白）が基質として働く反応を触媒する場合がある。２種の異なる領域がリボザイム中にみとめられ、それは、特定の核酸配列（および恐らくは特定の蛋白）へのハイブリダイゼーションを介してその特異性をリボザイムに与える結合領域、および、切断、ライゲーションまたはスプライシングの活性をリボザイムに与える触媒領域である。細胞内で活性であるリボザイムはｉｎ ｃｉｓで作用して単回のターンオーバーのみを職場医師、そして通常は半の宇宙は事故修飾性である。しかしながら、リボザイムはｉｎ ｔｒａｎｓに、真に触媒的な態様で作用するように操作でき、１より大きいターンオーバーで自己修飾性を伴わない。リボザイムの酵素的な性質により、単一のリボザイム分子は標的ＲＮＡの多数の分子を切断し、従って、アンチセンス投与で必要とされるよりも比較的より低い濃度で治療活性が達成される（ＷＯ９６／２３５６９）。
リボザイムの合成、設計、選択および使用に関する代表的教示は、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＣｅｃｈ等への米国特許４，９８７，０７１、ＲＮＡリボザイムポリメラーゼ、デホスホリラーゼ、制限エンドリボヌクレアーゼおよび方法；およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等への米国特許５，８７７，０２１、Ｂ７−１、標的リボザイムを包含する。
３．ＲＮＡｉのための核酸（ＲＮＡｉ分子）
本発明における使用に適する核酸分子はまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に有用な核酸分子、特にオリゴヌクレオチドを包含する。一般的にＲＮＡｉは配列特異的態様で遺伝子機能を分析する１つの方法である。例えば、Ｔｕｓｃｈｌ， Ｔ．， Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ． ２：２３９−２４５ （２００１）， ａｎｄ Ｃｕｌｌｅｎ， Ｂ．Ｒ．， Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３：５９７−５９９ （２００２）を参照できる。ＲＮＡ媒介遺伝子特異的サイレンシングは種々のモデル生物において記載されており、例えば線虫（Ｐａｒｒｉｓｈ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ ６：１０７７−１０８７ （２０００）； Ｔａｂａｒａ， Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ９９：１２３−１３２ （１９９９））；植物、即ち「同時抑制」 （Ｎａｐｏｌｉ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９ （１９９０））および植物における転写後または相同遺伝子サイレンシング（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ａ．Ｊ． ａｎｄ Ｄ．Ｃ． Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６：９５０−９５２ （１９９９）； Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ ２１：４６７１−４６７９ （２００２）） （それぞれＰＴＧＳまたはＨＧＳ）；およびカビ、即ち「クエリング」（Ｒｏｍａｎｏ， Ｎ． ａｎｄ Ｇ． Ｍａｃｉｎｏ， Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６：３３４３−３３５３ （１９９２））が挙げられる。適当な干渉ＲＮＡの例はｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよびｓｔＲＮＡを包含する。しかしながら当業者の知るとおり、類似の干渉作用を有する他のＲＮＡ分子も本発明のこの特徴に従った使用のために適している。
ａ．低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
ＲＮＡｉはその「標的」ｍＲＮＡに対する配列特異的相同性を有する２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子により媒介される（Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９８：９７４２−９７４７（２００１））。ショウジョウバエの無細胞溶解物の生化学的試験によれば、ＲＮＡ依存性遺伝子サイレンシングのメディエーターは２１〜２５ヌクレオチドの「低分子干渉」ＲＮＡ二重らせん（ｓｉＲＮＡ）であることがわかる。従って、ｓｉＲＮＡ分子は本発明の組成物、複合体および方法において好都合に使用される。ｓｉＲＮＡはダイサーとして知られるＲＮａｓｅによるｄｓＲＮＡのプロセシングから誘導される（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６（２００１））。ｓｉＲＮＡ二重らせん産物は収集されてはＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と称される多重蛋白ｓｉＲＮＡ複合体となる。特定の理論に制約されないが、ＲＩＳＣはターゲティングＲＮＡによりガイドされ、そこでｓｉＲＮＡ二重らせんが配列特異的に相互作用して触媒的態様で切断を媒介すると考えられる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３６３−３６６（２００１）；Ｂｏｕｔｌａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ １１：１７７６−１７８０（２００１）；Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
ＲＮＡｉは哺乳類細胞において遺伝子の昨日を分析するため、および、必須な遺伝子を発見するために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ２６：１９９−２１３ （２００２）； Ｈａｒｂｏｒｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４：４５５７−４５６５ （２００１））， ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｙ ｗａｙ ｏｆ ｎｏｎ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｅｘａｍｐｌｅ ｎｅｕｒｏｎｓ （Ｋｒｉｃｈｅｖｓｋｙ， Ａ．Ｍ． ａｎｄ Ｋｏｓｉｋ， Ｋ．Ｓ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１１９２６−１１９２９ （２００２））。ＲＮＩｉはまた治療上の選択肢、例えば、ポリオウィルス（Ｇｉｔｌｉｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３７９−３８０（２００２））およびＨＩＶ（Ｃａｐｏｄｉｃｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ １６９：５１９６−５２０１（２００２））を含むウィルスの感染、複製および／または生育の抑制またはブロッキング、および、癌遺伝子（例えばｂｃｒ−ａｂｌ遺伝子；Ｓｃｈｅｒｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｐ ２６（ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）（２００２））の発現の低減に関しても評価されている。ＲＮＡｉは哺乳類（マウス）および両生類（ツメガエル）の胚（それぞれＣａｌｅｇａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：１４２３６−１４２４０（２００２）およびＺｈｏｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：１６６４−１６６９（２００２））において、そして、出世以後のマウス（Ｌｅｗｉｓ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｌ Ｇｅｎｅｔ ３２：１０７−１０８（２００２））において遺伝子発現をモジュレートするため、および、成熟トランスジェニックマウスにおいてトランスジーンの発現を低減するため（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ， ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３８−３９（２００２））に使用されている。
例えばｓｉＲＮＡを含むＲＮＡｉを媒介する分子は化学合成 （Ｈｏｈｊｏｈ，Ｈ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５２１：１９５−１９９（２００２））、ｄｓＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９９：９９４２−９９４７（２００２））により、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロの転写により（Ｄｏｎｚｅ，Ｏ． ａｎｄ Ｐｉｃａｒｄ，Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３０：ｅ４６（２００２）；Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９９：６０４７−６０５２（２００２））により、そして、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮａｓｅＩＩＩのようなヌクレアーゼを用いた２本鎖ＲＮＡの加水分解（Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＳＵＡ９９：９９４２−９９４７（２００２））により、インビトロで製造できる。ＲＮＡｉ分子はまた、例えばＵ６ＲＮＡプロモーターに対して作用するＲＮＡＰｏｌＩＩＩを用いて内因性ＲＮＡポリメラーゼにより細胞内部で発現させることができる（Ｙｕ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ９９：６０４７−６０５２（２００２）；Ｐａｕｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：５０５−５０８（２００２））。例えば市販のＧｅｎｅＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＴＭＳｙｓｔｅ（ＩＭＧＥＮＥＸ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）はＲＮＡｉ分子をインビボで発生させるためにＵ６プロモーターを含むベクターを使用している。ｓｉＲＮＡに対するウィルスベクター（Ｘｉａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：１００６−１０１０（２００２））、例えばレトロウィルス（Ｄｅｖｒｏｅ， Ｅ．ａｎｄ Ｓｉｌｖｅｒ，Ｐ．Ａ．ＢＭＣ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２：１５（２００２））もまた記載されている。細胞培養物およびインビボにおけるｓｉＲＮＡの薬効および特異性を測定するための方法が報告されている（Ｂｅｒｔｒａｎｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９６：１０００−１００４（２００２）；Ｌａｓｓｕｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ ＳＴＫＥ ２００２（１４７）：ＰＬ１３（２００２）；Ｌｅｉｒｄａｌ，Ｍ． ａｎｄ Ｓｉｏｕｄ，Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２９５：７４４−７４８（２００２））。
ダイサーＲＮａｓｅはｓｉＲＮＡ生成を促進するため、ダイサーを発現する細胞はｄｓＲＮＡ媒介ＲＮＡｉに対してより迅速および／またはより頑健な応答を示すこと、および、ダイサーを過剰発現する細胞はよりさらに迅速および／またはより頑健に応答することが期待される。ダイサーの過剰発現は選択された細胞内に入れられる発現ベクターまたはカセット内に、ダイサー蛋白に関する遺伝子（例えばショウジョウバエＤＣＲ−１遺伝子）またはそのオーソログまたはホモログをクローニングすることにより達成してよい。クローニングされたＤＣＲ遺伝子の例は、マウス （Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｒ．Ｈ．ａｎｄ Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ａ．Ｗ．，Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ１３：６７−７３（２００２））、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿１４８９４８；ヒト（Ｎａｇａｓｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ Ｒｅｓ．６：６３−７０（２９９９））、アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３０６２１；並びにショウジョウバエダイサー−２（ＤＣＲ−２）遺伝子（Ａｄａｍｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２１８５−２１９５（２０００））， アクセッションＮｏ．ＮＭ＿０７９５４に由来するＤＣＲのホモログおよびオーソログを包含する。
ｓｉＲＮＡについての参考文献
Figure 2006517790
Figure 2006517790
 ｂ．低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
Ｐａｄｄｉｓｏｎ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．１６：９４８−９５８（２００２）はＲＮＡｉを行うための手段としてヘアピンに折り込まれた低分子のＲＮＡ分子を使用している。従って、このような低分子のヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子もまた本発明の組成物、複合体および方法において好都合に使用される。機能的ｓｈＲＮＡの幹部およびループ部の長さは多様であり；サイレンシング活性に影響しない場合は、幹部の長さは約２５〜約３０ｎｔに渡り、そしてループのサイズは４〜約２５ｎｔに渡る。特定の理論に制約されないが、ｓｈＲＮＡはダイサーＲＮａｓｅのｄｓＲＮＡ産物に似ており、そしていずれにしても、特定の遺伝子の発現の抑制に関して同様の能力を有すると考えられている。
ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを例えば遺伝子療法および発生試験においてインビボで長期間発現させるために、これらのＲＮＡを発現するプラスミドが作成されている。安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞においてｓｉＲＮＡを継続的に発現する発現ベクターが開発されている。ポリ（Ａ）テールを欠いた底部ヌクレオシドヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現する他のプラスミドが検討されている。ｓｈＲＮＡの転写はポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌＩＩＩ）プロモーターにおいて開始され、そして４−５−チミジン転写終止部位の２位において終止すると考えられている。発現により、ｓｈＲＮＡは３’ＵＵオーバーハングを有する幹ループ構造に折り込まれると考えられる。その後、これらのｓｈＲＮＡの末端をプロセシングし、ｓｈＲＮＡを〜２１ｎｔのｓｉＲＮＡ様分子に変換する。ｓｉＲＮＡ様分子は、次に、例えば哺乳類またはヒトの細胞であって良いトランスフェクトされた細胞において遺伝子特異的なサイレンシングをもたらすことができる。
ｓｈＲＮＡについての参考文献
Figure 2006517790
 ｃ．低分子一時的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）
本発明の組成物、複合体および方法における使用に適する低分子ＲＮＡの別のグループは低分子一時的調節ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）である。一般的にｓｔＲＮＡは約２０〜約３０ｎｔを含む（Ｂａｎｅｒｇｅｅ ａｎｄ Ｓｌａｃｋ，Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｉｍｉｎｇ ｂｙ ｓｍａｌｌ ｔｅｍｐｏｒａｌ ＲＮＡｓ：Ａ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ ２４：１１９−１２，２００２）。ｓｉＲＮＡとは異なり、ｓｔＲＮＡはｍＲＮＡの分解を伴うことなく翻訳開始後の標的ｍＲＮＡの発現をダウンレギュレートする。
ｄ．ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、アンチセンスおよび他のオリゴヌクレオチドの設計および合成
本発明に従って好都合に使用される標的ｍＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等に結合するように設計されたｓｉＲＮＡおよび他の核酸の配列を設計するために歯以下のガイドラインの１つ以上を使用してよい。
標的ｍＲＮＡの配列において介しコドンから３’側約５０〜約１００ｎｔに位置する領域を選択する。この領域内において、以下の配列：ＡＡ（Ｎ１９）ＴＴ（配列番号１）またはＡＡ（Ｎ２１）（配列番号２）、ただしＮ＝いずれかのヌクレオチドであるものを検索する。選択された配列のＧＣ含量は約３０％〜約７０％、好ましくは約５０％で無ければならない。ＲＮＡｉの特異性を最大限にするためには、目的のゲノム内の関連する配列の検索において選択された配列を使用することが望ましく；他の遺伝子には存在しない配列が好ましい。標的ｍＲＮＡの二次構造を測定または予測し、そして二次構造が僅かまたは皆無であるｍＲＮＡの領域を選択することが好ましいが、二次構造はＲＮＡｉにはほとんど影響しないことに留意しなければならない。可能である場合は、転写および／または翻訳因子に結合する配列は、それらがｍＲＮＡへのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｔＲＮＡ（並びに他のアンチセンスオリゴヌクレオチド）の結合を競合的に阻害する場合があるため、回避すべきである。即ち、一般的に、開始コドンにオーバーラップしない領域をお洗濯し、そしてまたｍＲＮＡ転写物の５’および３’未翻訳領域（ＵＴＲ）を回避することが好ましい。
ＲＮＡｉを媒介する核酸は本明細書に記載するオリゴヌクレオチドおよび他の核酸を製造するための方法を用いてインビトロで合成してよい。さらに、ｄｓＲＮＡおよびｉＲＮＡを媒介する他の分子が市販の入手元、例えばＲｉｂｏｐｈａｒｍａ ＡＧ（Ｋｕｌｍａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）およびＳｅｑｕｉｔｕｒ（Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）より得られる。Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃは蛍光団（例えばＨＥＸ／ＴＥＴ；５’フルオレセイン、６−ＦＡＭ；３’フルオレセイン、６−ＦＡＭ；フルオレセインｄＴイインターナル；５’ＴＡＭＲＡ、ローダミン；３’ＴＡＭＲＡ、ローダミン）で標識されたｓｉＲＮＡ、そして本発明で使用できる蛍光ｄｓＲＮＡの例を提供している。
４．アプタマー
伝統的には、標的分子を検出して精製するための手法はこのような標的に特異的に結合する抗体のようなポリペプチドを使用していた。核酸は長年にわたり他の核酸（例えば相補配列を有するもの）に特異的に結合することが知られている。しかしながら、非核標的分子に結合する核酸が報告されており、一般的にはアプタマーと称されている。例えばＢｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１１０４−１１１０；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１１４９−１１５２；Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．，ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：５０５−５１０；Ｊｏｙｃｅ，Ｇ，Ｆ．，Ｇｅｎｅ（１９８９）８２：８３−８７を参照できる。従って、本発明における使用に適する核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）もアプタマーに包含される。
アプタマーに適用する場合、「結合」という用語は特にＤＮＡ二重らせんに伝統的に関わっていた「ワトソン−クリック」型の結合相互作用（即ちＡ：ＴおよびＧ：Ｃ塩基対形成）は除外するものとする。即ち「アプタマー」という用語は標的分子に特異的に結合する核酸または核酸誘導体を指し、ここで標的分子は（ｉ）核酸ではないか、または（ｉｉ）二重または三重らせん塩基対形成以外の機序を介してアプタマーにより結合される核酸またはその構造的エレメントのいずれかである。
一般的に、アプタマーを発見するための手法は、標的分子およびアプタマーの複合体の形成を可能にする条件下で潜在的アプタマーである種々の核酸の混合物（２〜５０メンバー）、プール（５０〜５，０００メンバー）またはライブラリ（５０以上のメンバー）とともに予め選択された非核酸標的分子をインキュベートすることを包含する。「種々の核酸」とは各々の潜在的アプタマーのヌクレオチド配列がいずれかの他のメンバーのものとは異なることを意味し、即ち、潜在的アプタマーの配列は相互にランダムである。ランダム性は種々の態様において、例えば、突然変異誘発物質に核酸保有細胞を曝露することによりインビボで、核酸の化学薬品処理によりインビトロで、または、複製過程の厳密性を低減する条件下に進行することを故意に許された生化学的複製（例えばＰＣＲ）によりインビトロで実施できる突然変異誘発；ランダム化された化学合成、即ち配列の少なくとも１つの位置に関してランダムである予め選択された配列を有する核酸の複数の合成により導入することができる。「予め選択された配列におけるある位置においてランダム」とは、可能な限り１００％Ａに近いように通常は合成される配列（例えば５’−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’）におけるある位置がその位置においてランダムに合成されてよいことを意味する（Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｎ−Ｇ−Ｔ、組成物および複合体でＮはランダム化位置を示す）。ランダム化位置において、例えば、合成反応はＡ、Ｔ、ＣおよびＧの各々２５％を含有し；または、ｘ％Ａ、ｗ％Ｔ、ｙ％Ｃおよびｚ％Ｇであり、ここでｘ＋ｗ＋ｙ＋ｚ＝１００である。その位置におけるランダム化は完全（即ちｘ＝ｙ＝ｗ＝ｚ＝２５％）であるか確率論的（即ちｘ、ｙ、ｗおよびｚの少なくとも１つが２５％ではない）であってよい。
工程の後の段階において、配列はランダム性が漸増的に低減し、コンセンサス配列が生じる場合があり；いずれの場合も、独特のヌクレオチド配列を有するアプタマーを究極的に得ることが好ましい。
アプタマーおよびアプタマーのプールはインビトロの合成、組み換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ増幅等を利用したものを包含するいずれかの適切な手法により製造、発見、特性化および／または精製する。その形成後、標的：アプタマー複合体は次に核酸混合物の未複合体化メンバーから分離され、そして複合体か製造することができる核酸が候補アプタマーとなる（手法の早期の段階においては、アプタマーは一般的に標的に対する特異性が多様な程度であるヌクレオチド配列の多重の集団である）。得られたアプタマー（混合物またはプール）を次に、工程のこのシリーズの反復遂行において原料アプタマー（ライブラリまたはプール）と置換される。十分な特異性を有する核酸の限定された数（例えばプールまたは混合物、好ましくは１０メンバー未満、最も好ましくは１つとの混合物）が得られた時点で、アプタマーを配列決定し、特性化する。所定のアプタマーの純粋な調製物はいずれかの適切な手法（例えばＰＣＲ増幅、インビトロ化学合成等）により生成する。
例えばＴｕｅｒｋとＧｏｌｄ（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２４９：５０５−５１０）は「指数的リッチ化によるリガンドの系統的進化」（ＳＥＬＥＸ）と称された操作法の使用を記載している。この方法においては、特定の位置においてランダム化された核酸分子のプールを核酸結合蛋白への結合を対象とした選択に付す（例えばＰＣＴ出願公開ＷＯ９１／１９８１３および米国特許５，２７０，１６３参照）。このようにして得られたオリゴヌクレオチドの配列決定を行い、その他の点についても特性化する。Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．等（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８９）１７：３６４５−３６５３）は同様の手法を用いてＤＮＡ結合ポリペプチドに特異的に結合する合成２本鎖ＤＮＡ分子を発見している。Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．等（Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４６：８１８−８２２）はランダム配列ＲＮＡ分子の多数の製造、および、Ｃｉｂａｃｒｏｎブルーのような特定の染料に特異的に結合するものの選択および同定を記載している。
非核標的分子に結合する核酸を発見するための別の手法は「ランダム化フラグメントの合成非ランダム化」（ＳＵＲＦ）として知られるＥｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．等（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１，１８５３（１９９３））の記載したオリゴヌクレオチドコンビナトリアル手法であり、これはオリゴヌクレオチド類縁体ライブラリ、プールおよび混合物の漸増的に単純化されるセットの反復的合成およびスクリーニングに基づいている（Ｔｕｅｒｋ，Ｃ．ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，５０５（１９９０）。出発ライブラリは各プールの１つの位置が既知の類縁体を含有し、残余の位置が全ての他の類縁体の等モル混合物を含有する所定の長さのオリゴヌクレオチド類縁体よりなる。旨適化された核酸リガンドあまの配列が発見されるまで、合成および選択の各回でオリゴマーの少なくとも１つの位置の名称が決定される。
特定の候補アプタマーがＳＵＲＦ、ＳＥＬＥＸまたは他の手法を介して発見された後、そのヌクレオチド配列は（当該分野で知られるとおり）測定でき、そして三次元の分子構造は核磁気共鳴（ＮＭＲ）により調べることができる。これらの手法はＰａｄｍａｎａｂｈａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４，１７６５１（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｋ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３２，１８９９（１９９３）；およびＭａｃａｙａ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，３７４５（１９９３）に記載されているトロンビンに結合する核酸リガンドの三次元構造の測定に関連して説明される。選択されたアプタマーを１つ以上の修飾された塩基、糖または骨格の結合を用いて再合成してよい。アプタマーは本質的に結合特異性を付与するために必要な核酸の最小配列よりなるが、５’末端、３’末端または両方において伸長してよく、または、その他の方法により誘導体化またはコンジュゲートして良い。
５．オリゴヌクレオチド合成
本発明に従って使用するオリゴヌクレオチドは固相合成のよく知られた手法により好都合に日常的に製造できる。このような合成のための装置は例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａ）を含む幾つかの供給元から販売されている。当該分野でよく知られたこのような合成のための他の方法もこれに加えて、または、その代替として、使用してよい。ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなオリゴヌクレオチドを調製するために同様の手法を使用することはよく知られている。例えば、Ｕｒｄｅａ等への米国特許４，５１７，３３８（ポリヌクレオチド合成のための多重反応器システムおよび方法）、および、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等への４，４５８，０６６号（ポリヌクレオチドの製造方法）、； Ｌｙｅｒ ＲＰ， Ｒｏｌａｎｄ Ａ， Ｚｈｏｕ Ｗ， Ｇｈｏｓｈ Ｋ． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ−−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． １：３４４−３５８， １９９９； Ｖｅｒｍａ Ｓ， Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ． Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｕｓｅｒｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７：９９−１３４， １９９８； Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ Ｗ， Ｍａｔｙｓｉａｋ Ｓ， Ｂｅｒｇｍａｎｎ Ｆ， Ｓｃｈｎｅｌｌ Ｒ． Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ａｃｔａ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｐｏｌ． ４３：３７−４４， １９９６； Ｗａｒｒｅｎ ＷＪ， Ｖｅｌｌａ Ｇ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｂｙ ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４：１７９−１９９， １９９５； Ｓｐｒｏａｔ ＢＳ． Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ． Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４１：２２１−２３８， １９９５； Ｄｅ Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ Ａ， Ａｌｔｍａｎｎ ＫＨ， Ｗａｌｄｎｅｒ Ａ， Ｗｅｎｄｅｂｏｒｎ Ｓ． Ｂａｃｋｂｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． ５：３４３−３５５， １９９５； Ｃｈａｒｕｂａｌａ Ｒ， Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ Ｗ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ２’，５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ａｎａｌｏｇｕｅｓ． Ｐｒｏｇ Ｍｏｌ Ｓｕｂｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４：１１４−１３８， １９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ Ｅ． Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２６：１−７１， １９９４； Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ Ｊ． Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ． １：１６５−１８７， １９９０； Ｔｈｕｏｎｇ ＮＴ， Ａｓｓｅｌｉｎｅ Ｕ． Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ． ６７：６７３−６８４， １９８５； Ｉｔａｋｕｒａ Ｋ， Ｒｏｓｓｉ ＪＪ， Ｗａｌｌａｃｅ ＲＢ． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３−３５６， １９８４； Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ＭＨ， Ｂｅａｕｃａｇｅ ＳＬ， Ｂｅｃｋｅｒ Ｃ， Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ ＪＷ， Ｆｉｓｈｅｒ ＥＦ， Ｇａｌｌｕｐｐｉ Ｇ， Ｇｏｌｄｍａｎ Ｒ， ｄｅＨａｓｅｔｈ Ｐ， Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ Ｍ， ＭｃＢｒｉｄｅ Ｌ， ｅｔ ａｌ． Ｄｅｏｘｙｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｖｉａ ｔｈｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆ Ａｎａｌ． ３：１−２６， １９８３； Ｏｈｔｓｕｋａ Ｅ， Ｉｋｅｈａｒａ Ｍ， Ｓｏｌｌ Ｄ． Ｒｅｃｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６５５３−６５６０， １９８２； ａｎｄ Ｋｏｓｓｅｌ Ｈ． Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ． Ｆｏｒｔｓｃｈｒ Ｃｈｅｍ Ｏｒｇ Ｎａｔｕｒｓｔ． ３２：２９７−５０８， １９７５．を参照できる。
副次的エレメントを有するオリゴヌクレオチドおよび他の核酸もまた本発明の組成物、複合体および方法における好都合な使用のために製造できる。このような副次的エレメントの一部は例えば以下に示す種々の目的のために他の分子に特異的に結合するか、その他、それらと相互作用をすることができる。
−細胞内輸送。例えばミトコンドリアに核酸を局在化させるヌクレオチド配列は米国特許５，５６９，７５４に記載されている。
−細胞ターゲティング。例えば細胞表面分子（例えば受容体、細胞接着蛋白、膜脂質等）に結合するアプタマーの配列はオリゴヌクレオチドまたは他の核酸を特定の型の細胞に指向させるために含有させることができる。
−ＤＮＡ結合蛋白の送達。例えば転写因子に特異的に結合するヌクレオチド配列を複合体の他の成分と同時に転写因子を送達するために含有させることができる。
−組み換え蛋白の送達。一例として、組み換え蛋白に特異的に結合する部位を含有させることができる。組み換え蛋白はリコンビナーゼそのもの（例えばラムダインテグラーゼおよび関連の部位特異的リコンビナーゼ）または組み換えを促進または増強する蛋白（例えばヒストン様蛋白、例えば組み込み宿主因子、ＩＨＦ）であることができる。１つの実施形態においては、ヒストン様蛋白（例えばＩＨＦ）および部位特異的リコンビナーゼ（例えばラムダインテグラーゼまたはＸｉｓ）を１つ以上の複合体に組み込み、そしてこれにより細胞をトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞内のＩＨＦの存在はインテグラーゼにより媒介される部位特異的組み換えの量を増大させ、これにより、細胞内の核酸上の特異的部位（例えばａｔｔＢ、ａｔｔＰ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ等）の間の組み換えを促進する（Ｃｒｉｓｔ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｌａｍｂｄａ ｉｎｔｅｇｒａｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｓｙｎａｐｔｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｅｐｉｓｏｍａｌ ＤＮＡ ｓｅｇｍｅｎｔｓ．Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３１９：３０５−３１４）。このような細胞は例えば、胚性細胞、例えば幹細胞を包含する（Ｃｈｒｉｓｔ Ｎ， Ｄｒｏｇｅ Ｐ，２００２．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｍｕｔａｎｔ ｌａｍｂｄａ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ． Ｇｅｎｅｓｉｓ ３２：２０３−２０８）。別の実施形態においては、ＩＨＦの非存在下で活性を有するラムダインテグラーゼの突然変異体を使用する（Ｌｏｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ ｉｎｔｅｇｒａｓｅ ｍｕｔａｎｔｓ． Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９６：１１７５−８１）。
６．核酸の化学修飾
特定の実施形態においては、本発明に従って使用するオリゴヌクレオチドは例えば塩基の修飾、糖の修飾および骨格の修飾を含む化学修飾１つ以上を含んでよい。さらに、種々の分子をオリゴヌクレオチドにコンジュゲートすることができ；例えば本明細書全体を通じて記載するオリゴヌクレオチドに対する蛍光団の化学的連結の説明を参照できる。他の適当な修飾は例えば塩基の修飾、糖の修飾および骨格の修飾等を包含する。
ａ．塩基の修飾
特定の実施形態においては、本発明は塩基の修飾１つ以上を含んでよい。例えばアプタマー中の塩基残基天然に存在する塩基（例えばＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ等）以外のものであってよい。プリンおよびピリミジンの誘導体は当該分野で知られており；例示できるものは、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン（およびその誘導体）、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン（５ＭＣ）、Ｎ６−メチルアデニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシルケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸および２，６−ジアミノプリンを包含する。このような塩基の誘導体１つ以上を組み込む核酸に加えて、プリンまたはピリミジン塩基を含まないヌクレオチド残基を有する核酸もまたオリゴヌクレオチドまたは他の核酸に含有させて良い。
ｂ．糖の修飾
本発明において使用するオリゴヌクレオチドはさらに加えて（または代替として）糖の修飾１つ以上を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸の糖残基は従来のリボースおよびデオキシリボース残基以外であってよい。例えばフラノース残基の２’位における置換によりヌクレアーゼの安定性が増強される。修飾された糖の例としては、２’置換糖、例えば２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｓ−アルキル、２’−Ｓ−アリル、２’−フルオロ−、２’−ハロまたは２’−アジド−リボース、炭素環糖類縁体、アルファ−アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類縁体および非塩基性ヌクレオシド類縁体、例えばメチルリボシド、エチルリボシドまたはプロピルリボシドが挙げられる。
ｃ．骨格の修飾
本発明において使用されるオリゴヌクレオチドはさらに加えて（または代替として）骨格の修飾１つ以上を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドおよび他の核酸の化学修飾された骨格の例はホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび他のアルキルホスホネート、例えば３’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホアミデート、例えば３’−アミノホスホアミデートおよびアミノアルキルホスホアミデート、チオノホスホアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、および、通常の３’５’連結を有するボラノホスフェート、その２’−５’連結類縁体、およびヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’または２’−５’から５’−２’２連結している反転極性を有するものを包含する。リン原子を含まない化学修飾された骨格は、短鎖アルキルまたはシクロアルキルのヌクレオシド間連結部、混合型のヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または、１つ以上の短鎖ヘテロ原子または複素環のヌクレオシド間連結、例えばモルホリノ連結により形成された骨格；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；およびアミド骨格を有する。
Ｂ．ベクターおよびコンストラクト
特定の実施形態においては、本発明の核酸分子はベクター、特にクローニングベクター、発現ベクターまたは遺伝子療法ベクターとして提供される。本発明のこの特徴によるベクターは２本鎖または１本鎖であることができ、これはＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子であってよく、いかなる立体配座、例えば直鎖、環状、コイル状、スーパーコイル状、捩れ型、切り込み型等であってよい。本発明のこれらのベクターは例えばプラスミドベクターおよびウィルスベクター、例えばバクテリオファージ、バキュロウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、セムリキフォレストウィルスおよびアデノ関連ウィルスのベクターを包含し、これらは全てよく知られており、市販品として購入できる（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ；Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）。
本発明によれば、いずれかのベクターを本発明のクローニングベクターおよび発現ベクターを構築するために使用してよい。特に当該分野で知られているベクターおよび市販品（およびその変異体または誘導体）を本発明に従って操作することにより本発明の方法において使用するための１つ以上の組み換え部位が含まれるようにしてよい。そのようなベクターは例えばＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｎｏｖａｇｅｎ、ＮＥＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＥｐｉＣｅｎｔｅｒ、ＯｒｉＧｅｎｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｅｎｅｔｉｃｓより入手してよい。特に有利なベクターの一般的クラスは、種々の宿主において使用するための原核細胞および／または真核細胞のクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、突然変異誘発ベクター、転写ベクター、大型のインサートを受け取るためのベクター等を包含する。有利な他のベクターはウィルス起源のベクター（Ｍ１３ベクター、細菌ファージλベクター、アデノウィルスベクターおよびレトロウィルスベクター）、高、低および可変のコピー数のベクター、単一の宿主において組み合わせて使用するための適合レプリコンを有するベクター（ｐＡＣＹＣ１８４およびｐＢＲ３２２）および真核細胞エピソーム複製ベクター（ｐＣＤＭ８）を包含する。
有利な特定のベクターは原核細胞発現ベクター、例えばｐＰｒｏＥｘ−ＨＴ、ｐｃＤＮＡ ＩＩ、ｐＳＬ３０１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＴｒｃＨｉｓＡ、Ｂ，およびＣ、ｐＲＳＥＴ Ａ、ＢおよびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ｐＧＥＭＥＸ−１およびｐＧＥＭＥＸ−２（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｉｎｃ．）、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｉｎｃ．）、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｔｈｅ ｐＧＥＸベクター、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ，およびｐＭＣ１８７１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐＫＫ２３３−２およびｐＫＫ３８８−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．）およびその変異体および誘導体を包含する。ベクターはまた原核細胞発現ベクター、例えばｐＹＥＳ２、ｐＡＣ３６０、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ Ａ、Ｂ、ａｎｄ Ｃ、ｐＶＬ１３９２、ｐＢｓｕｅＢａｃＩＩＩ、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１、ｐＺｅｏＳＶ、ｐｃＤＮＡ３ ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＨＴ、ｐＦａｓｔＢａｃ ＤＵＡＬ、ｐＳＦＶ、ａｎｄ ｐＴｅｔ−Ｓｐｌｉｃｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＵＫ−Ｃ１、ｐＰＵＲ、ｐＭＡＭ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１２１、ｐＤＲ２、ｐＣＭＶＥＢＮＡ、ａｎｄ ｐＹＡＣｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ａｎｄ ｐＫＫ２３２−８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｉｎｃ．）、ｐ３’ＳＳ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ａｎｄ ｐＯＧ４４（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｃ．）およびその変異体または誘導体から作成することもできる。
特に有利な他のベクターはｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ、ｐＳＰＯＲＴ、コスミド、ファージミド、ＹＡＣｓ（コウボ人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）、ＭＡＣｓ（哺乳類人工染色体）、ＨＡＣｓ（ヒト人工染色体）、Ｐ１（Ｅ．ｃｏｌｉファージ）、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢＳベクター、ＰｈａｇｅＳｃｒｉｐｔベクター、ＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｃＤＮＡ３、ｐＳＰＯＲＴ１、ｐＳＰＯＲＴ２、ｐＣＭＶＳＰＯＲＴ２．０およびｐＳＶ−ＳＰＯＲＴ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｓｆｕｓ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＥＴ−５、ｐＥＴ−９、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲ１Ｔ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびその変異体または誘導体を包含する。
有利な他のベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手できるｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＬＥＸ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、ｐＲＳＥＴ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐｃＤＮＡ３．ｌ／Ｈｉｓ、ｐｃＤＮＡ３．１（−）／ Ｍｙｃ−Ｈｉｓ、ｐＳｅｃＴａｇ、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＡＯ８１５、ｐＰＩＣＺ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ｐＳｉｎＨｉｓ、ｐＩＮＤ、ｐＩＮＤ（ＳＰ１）、ｐＶｇＲＸＲ、ｐｃＤＮＡ２．１． ｐＹＥＳ２、ｐＺＥｒＯ１．１、ｐＺＥｒＯ−２．１、ｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０、ｐＳＥ４２０、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＣＤＭ８、ｐｃＤＮＡ１．１、ｐｃＤＮＡ１．１／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｚｅｏ、ｐＳｅ，ＳＶ２、ｐＲｃ／ＣＭＶ２、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ｐＲＥＰ８、ｐＲＥＰ９、ｐＲＥＰ１０、ｐＣＥＰ４、ｐＥＢＶＨｉｓ、ｐＣＲ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＣＲ３．１−Ｕｎｉ、およびｐＣＲＢａｃ；Ｐｈａｒｍａｃｉａより入手できるλＥｘＣｅｌｌ、λｇｔｌ１、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＧＥＸ−１λＴ、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−２ＴＫ、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２、ｐＧＥＸ−４Ｔ−３、ｐＧＥＸ−３Ｘ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−１、ｐＧＥＸ−５Ｘ−２、ｐＧＥＸ−５Ｘ−３、ｐＥＺＺ１８、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＭＣ１８７１，ｐＳＶＫ３、ｐＳＶＬ、ｐＭＳＧ、ｐＣＨ１１０、ｐＫＫ２３２−８、ｐＳＬ１１８０、ｐＮＥＯ、およびｐＵＣ４Ｋ； Ｎｏｖａｇｅｎより入手できるｐＳＣＲＥＥＮ−ｌｂ（＋）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ（Ｒ）、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、ｐＣＩＴＥ−４ａｂｃ（＋）、ｐＯＣＵＳ−２、ｐＴＡｇ、ｐＥＴ−３２ ＬＩＣ、ｐＥＴ−３０ ＬＩＣ、ｐＢＡＣ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２ ＬＩＣ、ｐＴ７Ｂｌｕｅ−２、λＳＣＲＥＥＮ−１、λＢｌｕｅＳＴＡＲ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−７ａｂｃ、ｐＥＴ９ａｂｃｄ、ｐＥＴｌｌａｂｃｄ、ｐＥＴｌ２ａｂｃ、ｐＥＴ−１４ｂ、ｐＥＴ−１５ｂ、ｐＥＴ−１６ｂ、ｐＥＴ−１７ｂ− ｐＥＴ−１７ｘｂ、ｐＥＴ−１９ｂ、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２ｌａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−２３ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２４ａｂｃｄ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−２９ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３０ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３ｌｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａｂｃ（＋）、ｐＥＴ−３３ｂ（＋）、ｐＢＡＣ−１、ｐＢＡＣｇｕｓ−１、ｐＢＡＣ４ｘ−ｌ、ｐＢＡＣｇｕｓ４ｘ−１、ｐＢＡＣ−３ｃｐ、ｐＢＡＣｇｕｓ−２ｃｐ、ｐＢＡＣｓｕｒｆ−１、ｐｌｇ、Ｓｉｇｎａｌ ｐｌｇ、ｐＹＸ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ−Ｎｅｏ、Ｓｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ − Ｈｙｇ、およびＳｅｌｅｃｔａ Ｖｅｃｔａ − Ｇｐｔ； Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手できるｐＬｅｘＡ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＧＢＴ９、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤ ＧＬ、ｐＧＡＤ ＧＨ、ｐＧＡＤ１０、ｐＧｉｌｄａ、ｐＥＺＭ３、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＰ−１、ｐＥＧＦＰ−Ｎ、ｐＥＧＦＰ−Ｃ、ｐＥＢＦＰ、ｐＧＦＰｕｖ、ｐＧＦＰ、ｐ６ｘＨｉｓ−ＧＦＰ、ｐＳＥＡＰ２−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ２−Ｃｏｎｔｒａｌ、ｐＳＥＡＰ２−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｃｏｎｔｒｏｌ、ｐβｇａｌ−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐＣＭＶβ、ｐＴｅｔ−Ｏｆｆ、ｐＴｅｔ−Ｏｎ、ｐＴＫ−Ｈｙｇ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｆｆ、ｐＲｅｔｒｏ−Ｏｎ、ｐＩＲＥＳｌｎｅｏ、ｐＩＲＥＳｌｈｙｇ、ｐＬＸＳＮ、ｐＬＮＣＸ、ｐＬＡＰＳＮ、ｐＭＡＭｎｅｏ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＣＡＴ、ｐＭＡＭｎｅｏ−ＬＵＣ、ｐＰＵＲ、ｐＳＶ２ｎｅｏ、ｐＹＥＸ ４Ｔ−１／２／３、ｐＹＥＸ−Ｓ１、ｐＢａｃＰＡＫ−Ｈｉｓ、ｐＢａｃＰＡＫ８／９、ｐＡｃＵＷ３１、ＢａｃＰＡＫ６、ｐＴｒｉｐｌＥｘ、λｇｔｌ０、λｇｔｌｌ、ｐＷＥ１５、およびλＴｒｉｐｌＥｘ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手できるＬａｍｂｄａ ＺＡＰ ＩＩ、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐＢＫ−ＲＳＶ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ ＋／−、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ ＋／−、ｐＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ、ｐＳｕｒｆｓｃｒｉｐｔ、Ｌａｍｂｄａ ＦＩＸ ＩＩ、Ｌａｍｂｄａ ＤＡＳＨ、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ３、Ｌａｍｂｄａ ＥＭＢＬ４、ＳｕｐｅｒＣｏｓ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｇｔ Ａｍｐ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｃａｍ、ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ Ｄｉｒｅｃｔ、ｐＢＳ ＋／−、ｐＢＣ ＫＳ ＋／−、ｐＢＣ ＳＫ ＋ｌ−、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＣＡＬ−ｎ、ｐＣＡＬ−ｃ、ｐＣＡＬ−ｋｃ、ｐＥＴ−３ａｂｃｄ、ｐＥＴ−ｌｌａｂｃｄ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＣＭＶＬａｃＩ、ｐＯＰＲＳＶＩ／ＭＣＳ、ｐＯＰＩ３ ＣＡＴ、ｐＸＴ１、ｐＳＧ５、ｐＰｂａｃ、ｐＭｂａｃ、ｐＭＣｌｎｅｏ、ｐＭＣｌｎｅｏ Ｐｏｌｙ Ａ、ｐＯＧ４４、ｐＯＧ４５、ｐＦＲＴβＧＡＬ、ｐＮＥＯβＧＡＬ、ｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、ｐＲＳ４０６、ｐＲＳ４１３、ｐＲＳ４１４、ｐＲＳ４１５、およびｐＲＳ４１６を包含する。
特に遊離であるツーハイブリッドおよび逆ツーハイブリッドベクターはｐＰＣ８６、ｐＤＢＬｅｕ、ｐＤＢＴｒｐ、ｐＰＣ９７、ｐ２．５、ｐＧＡＤ１−３、ｐＧＡＤ１０、ｐＡＣｔ、ｐＡＣＴ２、ｐＧＡＤＧＬ、ｐＧＡＤＧＨ、ｐＡＳ２−１、ｐＧＡＤ４２４、ｐＧＢＴ８、ｐＧＢＴ９、ｐＧＡＤ−ＧＡＬ４、ｐＬｅｘＡ、ｐＢＤ−ＧＡＬ４、ｐＨＩＳｉ、ｐＨＩＳｉ−１、ｐｌａｃＺｉ、ｐＢ４２ＡＤ、ｐＤＧ２０２、ｐＪＫ２０２、ｐＪＧ４−５、ｐＮＬｅｘＡ、ｐＹＥＳＴｒｐおよびその変異体または誘導体を包含する。
他の適当なベクターは当業者の知るとおりである。
１．クローニングベクター
本発明のクローニングベクターは、プラスミド、コスミド、ウィルスまたはファージのＤＮＡ分子、または、ベクターの本質的な生物学的機能を消失することなく宿主細胞の遺伝子物質（染色体または染色体外）内にベクター担持の核酸のスプライシングを介して、宿主細胞内で自律複製できる他のＤＮＡ分子を包含する。クローニングベクターはさらにクローニングベクターを用いて形質転換された細胞の発見に使用するのに適するマーカーを含有してよい。マーカーは例えば抗生物質耐性遺伝子、例えばテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性であってよい。明らかに、相同組み換え、トランスポジションまたは制限酵素の使用を必要としない所望の核酸を挿入する方法（例えばＰＣＲフラグメントのＵＤＧクローニング（米国特許５，３３４，５７５、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｔ：Ａクローニング等）もまた本発明に従って使用されるクローニングベクター内にフラグメントをクローニングするために適用することができる。クローニングベクターはさらにクローニングベクターを用いて形質転換された細胞の発見において使用するのに適する選択可能なマーカー１つ以上を含有できる。
２．発現ベクター
本発明の発現ベクターは宿主へのベクターの形質転換によりベクター内に挿入またはクローニングされている遺伝子１つ以上の発現を増強することができるベクターを包含する。クローニングされた遺伝子は通常はプロモーター配列のような特定の転写調節配列の制御下に（即ち作動可能に連結されて）置かれる。この点に関する特定の好ましい実施形態においては、誘導性および／または細胞型特異性であってよい特定の発現のためのベクターが提供される。このようなベクターのうち特に好ましいものは、温度および栄養添加物のような操作が容易な環境因子により誘導できるものである。本発明において有用な発現ベクターは染色体、エピソームおよびウィルス誘導のベクター、例えば細菌プラスミドまたはバクテリオファージから誘導されたベクター、および、それらの組み合わせから誘導されたベクター、例えばコスミドおよびファージミドを包含する。
本発明のこの特徴による発現ベクターを作成するためには、１つ以上の遺伝子含有核酸分子またはオリゴヌクレオチドのインサートをベクター内の適切なプロモーター（ベクター自体により与えられるもの（即ち「相同プロモーター」）であるか、または、ベクターにとって外因性（即ち「非相同プロモーター」）、例えばファージラムダＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃ，ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター等）に作動可能に連結しなければならない。その他の適当なプロモーターは当業者の知るとおりである。遺伝子融合コンストラクトはさらに転写の開始、終止のための部位、および、転写された領域においては、翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。コンストラクトにより発現される成熟転写物のコーディング部分は好ましくは翻訳すべきポリヌクレオチドの先端に翻訳開始コドン、および、末端に適切に位置した終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。発現ベクターはまた好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを包含する。このようなマーカーはＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌の培養のためのテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を包含する。
ウィルス発現ベクターは細胞、特に対象の細胞内に導入されるべき鎖の一方または両方に共有結合したｄｓ組み換え核酸分子を発生させる目的のために本発明の方法を実施する場合に特に有用である。ウィルスベクターはそれらが比較的高い効率で宿主細胞に感染でき、そして、特定の細胞型に感染できるか、または、宿主中の特定の細胞に感染するように修飾できる点で好都合である。
ウィルスベクターは特定の宿主系において使用するために開発されており、例えば、細菌細胞に感染するバクテリオファージベクター（例えばファージラムダ）（例えばＢａｎｅｙｘ Ｆ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：４１１−４２１（１９９９）参照）、昆虫細胞に感染するバキュロウィルスベクター；レトロウィルスベクター、他のレンチウィルスベクター、例えば人免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）に基づくもの、アデノウィルスベクター、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター等の哺乳類に感染するもの（参照により本明細書に組み込まれるＭｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｒｏｓｍａｎ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：９８０−９９０，１９９２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３９２：２５−３０ Ｓｕｐｐｌ．，１９９８； Ｖｅｒｍａ ａｎｄ Ｓｏｍｉａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８９：２３９−２４２，１９９７；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３４：１１８５−１１８７（１９９６）を参照）を包含する。例えばＨＩＶに基づくウィルスベクターはＴ細胞の感染に使用でき、アデノウィルスに基づくウィルスベクターは例えば呼吸上皮細胞に感染するために使用でき、そして、ヘルペスウィルスに基づくウィルスベクターはニューロン細胞に感染するために使用できる。他のベクター、例えばＡＡＶベクターはより大きい宿主細胞範囲を有し、従って、種々の細胞型を感染させるために使用できるが、ウィルスまたは非ウィルスベクターもまた受容体媒介事象を解して標的特異性を改変するために特定の受容体またはリガンドを用いて修飾できる。
３．遺伝子療法のためのベクター、組成物および方法
別の実施形態において、本発明は治療または予防の目的のために細胞、組織、臓器または生物に核酸分子を送達する際に有用であってよい、ベクター（例えば上記した発現またはクローニングベクター）または本発明の複合体１つ以上を含む、遺伝子コンストラクト１つ以上を含む組成物を提供する。本発明はまた、上記した、そして、以下にさらに詳述する核酸送達および治療／予防目的のために有用である、ウィルス核酸の領域を有する核酸分子の調製方法、並びに、このような方法により製造された核酸分子、および、このような核酸分子を含む組成物を提供する。
１つの実施形態においては、本発明は本発明の核酸分子、複合体または組成物１つ以上を動物に導入することを含む身体障害に罹患した、または、その素因のある動物における身体障害を治療または防止するための方法を提供する。本発明によれば、動物、特に、身体障害に罹患した、または、その素因があるか罹患しやすい動物を、本発明の核酸分子、複合体または組成物１つ以上の有効量を、場合によりそのための薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わせて投与することにより治療してよい。本明細書においては、特定の身体障害に「罹患している」動物とは、当業者のよく知る確立された医療および獣医科の操作法およびプロトコルに準じた障害の診断または発見において典型的に使用される障害の身体的悪徴候１つ以上を示している動物として定義される。同様に、本明細書においては、身体障害の「素因のある」またはこれに「罹患しやすい」動物とは、障害の身体的悪徴候の複数を示さないが、適切な生理学的および環境条件下に障害を発症する危険性が、遺伝的に、生理学的に、または何らか別の態様で存在している動物として定義される。従って、特定の動物が特定の身体障害に「罹患している」、「素因がある」または「罹患しやすい」かどうかは、医療および獣医科の技術分野において日常的なものである方法を用いて動物の病歴を測定することにより当業者には明らかになるものである。
本発明の組成物および方法により治療可能または防止可能な身体障害は、身体障害に罹患した、またはその素因があるかそれに罹患しやすい動物において、免疫系機能、特に抗原提示細胞内における活性化および／またはアポトーシスをモジュレートすることにより、遅延、防止、治癒または何らか他の態様で治療されるいずれかの身体障害を包含する。本発明の組成物、複合体および方法を用いて治療可能または防止可能なこのような身体障害は、例えば、感染性疾患（特に細菌性疾患（例えば髄膜炎、肺炎、破傷風、コレラ、腸チフス、ブドウ球菌皮膚感染症、連鎖球菌咽頭炎、猩紅熱、百日咳、ジフテリア、結核、らい病、リケッチア症、菌血症、細菌性性病等）、ウィルス性疾患（例えば髄膜炎、ＡＩＤＳ、インフルエンザ、鼻炎、肝炎、ポリオ、肺炎、黄熱病、ラッサ熱、エボラ熱等）および／またはカビ性疾患（例えばクリプトコックス症、ブラストミセス症、ムコール菌症、ヒストプラスマ症、アスペルギルス症等）、寄生虫性疾患（例えばマラリア、リーシュマニア症、フィラリア、トリパノソーマ症、住血吸虫症等）、癌（例えば癌腫、黒色腫、肉腫、白血病等）、および、本発明の方法および組成物を用いて治療可能または防止可能な別の障害を包含する。同様に、本発明の方法および組成物を用いて治療可能または防止可能であってよい身体障害は、免疫系障害（例えば慢性関節リューマチ、多発性硬化症、全身エリテマトーデス、クローン病）、および同様の病因による他の障害を包含する。本発明の組成物および方法は疾患の進行の防止において、例えば、悪性疾患への前悪性疾患の進行の化学療法的防止において、そして、抗原提示細胞におけるアポトーシスの活性化または抑制／遅延／防止または誘導を行う組成物を用いた治療に応答する他の身体障害に罹患した、またはその素因のある動物を治療するために使用してよい。
本発明の第１のこのような特徴において、身体障害に罹患した、またはその素因のある動物は、本発明の核酸分子１つ以上を、場合によりベクターの形態で、およびさらに場合により本発明のポリペプチド核酸複合体（またはこのような複合体１つ以上を含む本発明の組成物）の形態で、動物に導入することにより治療してよい。「遺伝子療法」として全般的に知られているこの方法は、動物の細胞および／または組織中において核酸分子上および／または投与された複合体内に一般的に含有される所定の遺伝子の発現の濃度を上昇させることにより身体障害の進行および／または発症を抑制、遅延または防止するため、または、身体障害の１つ以上の悪徴候または過程の退行、緩解または軽減を誘導するために設計されている。類似の遺伝子療法の方法は種々の哺乳類の疾患、例えば嚢胞性線維症（Ｄｒｕｍｍ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６２：１２２７−１２３３（１９９０）；Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４７：３５８−３６３（１９９０）；Ｒｉｃｈ，Ｄ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４７：３５８−３６３（１９９０））、ゴーシェ病（Ｓｏｒｇｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：９０６−９０９（１９８７）；Ｆｉｎｋ， Ｊ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２３３４−２３３８（１９９０））、特定の形態の血友病（Ｂｏｎｔｅｍｐｏ，Ｆ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ６９：１７２１−１７２４（１９８７）；Ｐａｌｍｅｒ，Ｔ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ７３：４３８−４４５（１９８９）；Ａｘｅｌｒｏｄ，Ｊ．Ｈ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：５１７３−５１７７（１９９０）；Ａｒｍｅｎｔａｎｏ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６１４１−６１４５（１９９０））および筋ジストロフィー（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，Ｔ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３７：１７６−１７９（１９８９）；Ｌａｗ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ３３６：１１４−１１５（１９９０）；Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１１：２４３７−２４４９（１９９０））および特定の癌、例えば転移性の黒色腫（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：１３１８−１３２１（１９８６）；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１９：１６７６−１６８０（１９８８）； Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：５７０−５７８（１９９０））の治療において有効であることが確認または期待されている。
本発明のこのような遺伝子療法を実施する際には、種々のベクター、特にウィルスベクターが本発明の複合体および組成物の形成において有用である。例えばアデノウィルスは呼吸器上皮への、またはこれを介した遺伝子の送達のための特に好都合なベヒクルであり、そしてそのようなベクターの使用は本発明の範囲に包含される、アデノウィルスは本来、呼吸器上皮に感染し、そこで軽度の疾患を誘発する。アデノウィルス系送達システムのための他の標的は肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウィルスは非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９−５０３（１９９３）はアデノウィルス系の遺伝子療法の検討を行っている。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３−１０（１９９４）はアカゲザルの呼吸器上皮に遺伝子を移行させるためのアデノウィルスベクターの使用を明らかにしている。遺伝子療法におけるアデノウィルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５−２３４（１９９３）；ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１２６４９およびＷＯ９６／１７０５３；米国特許５，９９８，２０５；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５−７８３（１９９５）に記載されており、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）およびヘルペスウィルス、並びに、これらのウィルスから調製したベクターもまた遺伝子療法における使用のために提案されている（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９−３００；米国特許５，４３６，１４６；Ｗａｇｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：１５６６−７０（１９９８））。ヘルペスウィルスベクターは遺伝子発現が神経細胞において望まれる場合の用途のために特に有用である。
好ましいこのような方法において、本発明の核酸分子１つ以上または本発明のポリペプチド−核酸複合体１つ以上を身体障害に罹患しているか、その素因のある動物内に導入するかこれに投与する。このような核酸分子は治療すべき動物の細胞または組織に核酸分子を導入するのに適するベクターまたはビリオン内に組み込むことにより、トランスフェクションベクターを形成してよい。この目的のための適当なベクターまたはビリオンはレトロウィルス、アデノウィルス、アルファウィルス、ヘルペスウィルスおよびアデノ関連ウィルスから誘導したものを包含する。或は、本発明の核酸分子はウィルス（例えばアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルス）と、または、ウィルス成分（例えばウイルスカプシド蛋白）と共に複合体化して分子コンジュゲートとしてよく、これを場合によりさらにポリペプチド１つ以上と複合体化して本発明のポリペプチド−核酸複合体とすることができる。当業者の知るとおり、本発明の核酸分子および／または複合体はまた場合により薬学的に許容される賦形剤または希釈剤１つ以上と組み合わせることにより本発明のこれらの方法における使用に適する医薬組成物を形成してよい。
当該分野でよく知られた本発明の核酸分子を含むベクターまたはビリオンの形成のための手法は一般的に”Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｔｏｗａｒｄ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｃｈａｐｔｅｒ ２８， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，ｐｐ．５６７−５８１（１９９２）に記載されている。さらにまた、遺伝子療法ベクターの構築のための一般的方法および治療目的のための罹患動物へのその導入は上記した参考文献から得ることができ、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。このような一般的な方法の１つにおいて、本発明の核酸分子を含むベクターは好ましくは注射、吸入、摂取または溶液を介した粘膜への導入により、罹患動物の細胞または組織内に直接導入され；このような方法は一般的には「インビボ」遺伝子療法と称されている。或は、細胞、組織または臓器、特に病原体（例えば細菌、ウィルス、寄生虫、コウボ等）を含有する欠陥または非機能の遺伝子１つ以上を含有するか、または、癌細胞または腫瘍を含有するものを罹患動物から摘出し、当該分野でよく知られた方法に従って培養に付す。次に、典型的には治療用の遺伝子または核酸配列１つ以上を含有する本発明の核酸分子を含むベクターを細胞または組織へのオリゴヌクレオチドの導入のための一般的には上記した方法のいずれかによりこれらの細胞または組織に導入し、そして、オリゴヌクレオチドの取り込みを可能にする十分な時間の後、細胞または組織を罹患動物に再挿入してよい。治療用遺伝子または核酸配列の導入は罹患動物の身体の外部で行われるため、この方法は一般的には「エクスビボ」の治療と称される。
或は、インビボおよびエクスビボの遺伝子療法の両方について、本発明の核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）はプロモーターまたはエンハンサーであってよい調節ＤＮＡ配列、または、遺伝子療法に使用される核酸分子の原料として使用されているものとは異なる遺伝子、細胞または生物から誘導されたプロモーターまたはエンハンサーのような非相同の調節ＤＮＡ配列に作動可能に連結されて上記した遺伝子コンストラクトを形成してもよい。次にこのような遺伝子コンストラクトをベクターに挿入し、次にこれを直接インビボ遺伝子療法の手法において罹患動物内に、または、エクスビボ手法において罹患動物の細胞または組織内に導入する。別の実施形態においては、本発明の遺伝子コンストラクト尾ｗウィルス（例えばアデノウィルスまたはアデノ関連ウィルス）またはウィルス成分（例えばウィルスカプシド蛋白；ＷＯ９３／０７２８３参照）との分子コンジュゲートとしてインビボまたはエクスビボのいずれかで動物の細胞または組織に導入して良い。さらに別の実施形態においては、本発明の遺伝子コンストラクトは本発明のポリヌクレオチド−核酸複合体の形態で動物に導入してよい。或は、相同または非相同であってよいトランスフェクトされた宿主細胞を半透過性のバリア装置内に封入し、そして罹患動物内に移植することにより、動物の組織および循環系への本発明のコンジュゲートまたは複合体中の核酸分子によりコードされる治療用ポリペプチド１つ以上の継代を可能にするが、動物の免疫系とトランスフェクトされた細胞との間の接触は防止することができる（ＷＯ９３／０９２２２参照）。これらの方法により、（ａ）宿主細胞ゲノム内への治療用遺伝子（本発明の核酸分子上に含有される）のランダムな挿入；または（ｂ）染色体外の遺伝子エレメントとして存在してよい場合には細胞の核内への治療用遺伝子の取り込みを介して治療された動物による治療用ポリペプチド１つ以上の生産が増加する。このような遺伝子療法の方法および手順の一般的記載は、例えば米国特許５，５７８，４６１；ＷＯ９４／１２６５０；およびＷＯ９３／０９２２２に記載されており；その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
即ち本発明はウィルスベクター（例えばアデノウィルスベクター、アルファウィルスベクター、ヘルペスウィルスベクター、アデノ関連ウィルスベクター等）の機能的特性１つ以上を有する核酸分子の製造方法を包含する。特定の実施形態においては、本発明の方法は核酸セグメントを連結させることを包含し、ここで核酸セグメントの１つ以上はウィルスベクターとして機能する能力を核酸分子の生成時に与える領域を有する。（例えば特殊な宿主細胞内で複製する能力、ウィルス粒子内にパッケージされる能力等）
特定の実施形態において、本発明はアデノウィルス配列を含む核酸セグメントを少なくとも１つ（例えば１、２、３または４つ等）、他の核酸セグメント１つ以上に結合することによる、アデノウィルスベクターの製造方法を包含する。アデノウィルスベクターおよびアデノウィルスベクターを製造するために使用できる核酸の特定の例は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，９３２，２１０、６，１３６，５９４および６，３０３，３６２に記載されている。本発明の方法により製造されるアデノウィルスベクターは複製コンピテントまたは複製欠損であってよい。
アデノウィルスの１つの例はアデノウィルス核酸を含む核酸セグメントを別の核酸セグメント１つ以上に結合することにより製造してよい。例えば、複製欠損アデノウィルスベクターが望まれる場合は、アデノウィルス核酸は以下の領域、即ちＥ１ａ領域、Ｅ１ｂ領域および／またはＥ３領域の１つ以上の全体または部分の欠失を有して良い。これらの領域において欠失を含有するアデノウィルスベクターは例えば米国特許６，１３６，５９４号に記載されている。本発明はさらに、本発明の方法により製造されるアデノウィルスベクター、並びに、これらのベクターの使用およびこれらのベクターを含む組成物を包含する。本発明の方法により製造されたアデノウィルスベクターの使用の１つの例は、哺乳類（例えばヒト）の細胞への核酸セグメントの送達を包含する。即ち、本発明は遺伝子療法プロトコルにおける使用に適するベクターの製造方法を提供する。典型的には、このようなベクターは複製欠損である。
特定の実施形態において、本発明のアデノウィルスベクターは以下の領域、即ちＥ１ａ領域、Ｅ１ｂ領域および／またはＥ３領域の１つ以上の全体または部分の欠失を有することを除き、実質的に全アデノウィルスゲノムを含む。別の特定の実施形態においては、非アデノウィルス核酸はＥ１ａ領域、Ｅ１ｂ領域および／またはＥ３領域の１つ以上において存在してよい。
特定の実施形態において、本発明の方法により製造されたアデノウィルスはＥ．ｃｏｌｉのような原核細胞中のベクターの増殖を可能にする少なくとも１つの複製起点および／または選択マーカーを含有する。
アデノ関連ウィルスベクターおよびヘルペスウィルスベクターは上記したものと同様の本発明の方法により製造してよい。即ち、本発明はさらにこのようなベクターの製造方法、並びにこれらの方法により製造されたベクター、これらのベクターの使用、および、これらのベクターを含む組成物を提供する。
本発明はさらに、アルファウィルスベクター（例えばシンドビスウィルスベクター、セミリキ森ウィルスベクター、ロス川ウィルスベクター、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルスベクター、西部ウマ脳脊髄炎ウィルスベクター、東部ウマ脳脊髄炎ウィルスベクター等）の製造方法、並びにこのような方法で製造されたアルファウィルスベクター、これらのアルファウィルスベクターを用いる方法、および、これらのアルファウィルスベクターを含む組成物を提供する。特定のこのような実施形態において、本発明はアルファウィルス配列を含む核酸セグメントを少なくとも１つ、別の核酸セグメントに結合することにより、アルファウィルスベクターの製造方法を包含する。アルファウィルスベクターおよびアルファウィルスベクターを製造するために使用できる核酸の特定の例は、米国特許５，７３９，０２６および６，２２４，８７９、ＧｉｂｃｏＢＲＬ’のＩｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ Ｎｏ．１０１７９−０１８，”ＳＦＶ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ”およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｉｎｄｂｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍマニュアル、カタログ番号Ｎｏ．Ｋ７５０−０１（Ｅ版）に記載されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、アルファウィルスベクターを製造するために本発明の方法において使用されるアルファウィルスベクター配列は、１つ以上の以下の成分、即ち、１つ以上のパッケージングシグナル（アルファウィルス起源であってもなくても良い）、１つ以上のサブゲノムのプロモーター、および／または、１つ以上の非構造蛋白（例えばｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４等）をコードする核酸を含む。
本発明のアデノウィルスベクターはＤＮＡまたはＲＮＡ分子として細胞内に導入してよい。このようなベクターのＤＮＡ型を細胞に導入する場合は、次に発現制御配列（例えば誘導性、抑制性または構成性の発現制御配列）を使用して非構造蛋白１つ以上を翻訳する元となるＲＮＡ分子を発生させて良い。特定の実施形態においては、これらの非構造蛋白はアルファウィルスベクターのＤＮＡ形態から発生した転写物の全体または部分に相当するＲＮＡ分子を増幅するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。即ち、これらの非構造蛋白はＲＮＡ鋳型からＲＮＡ分子のコピーをさらに生産することを触媒し、これにより、ＲＮＡの増幅をもたらす。さらにまた、高水準の発現が望まれる核酸セグメントをサブゲノムのプロモーターに作動可能に連結してよく、これにより核酸セグメントに相当するＲＮＡの高水準の生産がもたらされる。
１つの例示される実施形態において、本発明の方法により製造したアルファウィルスベクターは、誘導性プロモーターがシンドビスウィルスのｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４、および、シンドビスウィルス起源ではない核酸セグメントに作動可能に連結したシンドビスサブゲノムのプロモーターをコードするＲＮＡ分子の転写を指向するＤＮＡを含む。本発明はまた本発明の方法により製造されたアルファウィルスベクター、このようなアルファウィルスベクターを使用する方法、および、このようなアルファウィルスベクターを含む組成物を提供する。
本発明はさらに核酸セグメント１つ以上がウィルスパッケージングシグナル１つ以上（例えば１、２、３、４つ等）（例えば上記したウィルスより誘導されたパッケージングシグナル１つ以上）を含有するような核酸セグメントを連結させるための方法を提供する。これらのパッケージングシグナルは本発明の方法により製造された核酸分子のパッケージングを指向するために使用できる。パッケージされた核酸分子の製造のための１つの方法はウィルス様粒子の製造に適する蛋白を発現するパッケージング細胞系統内への本発明の核酸分子の導入または発現によるものである。即ち本発明はさらに、本発明のパッケージされた核酸分子、本発明のパッケージされた核酸分子の製造方法、および、本発明のパッケージされた核酸分子を含む組成物を包含する。
ａ．ベクターの導入
本明細書に記載した細胞、組織、臓器または生物内に本発明の組成物、複合体、核酸分子および／またはベクターを導入するための方法は、当業者のよく知るものである。例えば、本発明の核酸分子および／またはベクターは、感染、憩室導入、トランスフェクションおよび形質転換のよく知られた手法を用いて細胞、組織、臓器または生物内に導入して良い。本発明の組成物、核酸分子および／またはベクターは単独で、または、別の組成物、核酸分子および／またはベクターと組み合わせて導入してよい。或は、本発明の組成物、核酸分子および／またはベクターは沈降物、例えばリン酸カルシウム沈降物として、または脂質との複合体として、細胞、組織、臓器または生物内に導入して良い。エレクトロポレーションもまた宿主に本発明の核酸分子および／またはベクターを導入するために使用してよい。同様に、このような分子はＥ．ｃｏｌｉのような薬品コンピテントな菌体に導入しても良い。ベクターがウィルスである場合は、これはインビトロでパッケージングするかパッケージング細胞内に導入してよく、そして、パッケージされたウィルスを細胞に導入してよい。従って、本発明のこの特徴に従って細胞内に本発明の核酸分子および／またはベクターを導入することに適する広範な種類の手法は当業者のよく知る日常的なものである。このような手法は例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６．３０−１６．５５（１９８９），Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐｐ．２１３−２３４（１９９２）およびＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．，Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ （１９８７）に詳述されており、これらはこのような手法を詳述する多くの実験操作法を説明しており、そしてその関連の開示については参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
種々の試薬、化合物および組成物が特にトランスフェクションにより細胞、組織、臓器または生物内に本発明の組成物、複合体、核酸分子および／またはベクターを導入するために有用である。このような適当な試薬、化合物および組成物は例えば、表４に示すものである。さらに、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションを使用できる（Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎは特にＣａＰＯ４を使用したトランスフェクションキットまたはシステムを提供している）。一般的な検討については、Ｈｏｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ， ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ， ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ ｄｒｕｇｓ （ｒｅｂｉｅｗ）．Ｍｏｌ． Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ １５：１−１４；およびＺａｂｎｅｒ Ｊ．１９９７．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ ２７：１７−２８を参照できる。列挙された薬剤は単独または他の薬剤と組み合わせて使用できる。複数の試薬の一例は表４に示す通りである。
Figure 2006517790
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 ｂ．細胞内核酸放出
細胞内に内在化（典型的にはエンドサイトーシスによる）した後は、トランスフェクトされた核酸は通常は脂質膜封入ベシクル内（例えばエンドソーム並びに小胞体（ＥＲ）および／またはゴルジ体の成分）に封鎖される。核酸がエンドソーム、ＥＲまたはゴルジからシトゾルに放出されるとトランスフェクションが増強される。エンドソーム崩壊剤を本発明の範囲において使用でき、そして本明細書においてはシトゾルへの核酸の放出を誘発または増強する薬剤として定義する。エンドソーム崩壊剤は、例えばエンドソームの膜、ＥＲ、ゴルジ体および／または他の膜を崩壊させること；リソソームへのエンドソームの融合をブロックまたは低減すること；および／またはエンドソームのｐＨを改変、好ましくは上昇させることにより作用することができる。エンドソームのｐＨは一般的には１〜２ｐＨ単位だけシトゾルのｐＨより低値である。このｐＨの勾配を利用しながら、ｐＨ６．５以下に維持された脂質２層を崩壊させる薬剤を用いて細胞送達を行う（Ａｓｏｋａｎ Ａ，Ｃｈｏ ＭＪ．２００２．Ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ． Ｊ．Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ９１：９０３−９１３）。
膜崩壊ｐＨ感受性合成重合体は報告されており、そして、例えばポリ（アミドアミン）（ＰＡＡ）（Ｐａｔｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｒｉｃｉｎ Ａ−ｃｈａｉｎ ａｎｄ ｇｅｌｏｎｉｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｒｅａｓｅ ７７：２２５−３２；米国特許６，４１３，９４１）；ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）（Ｋｙｒｉａｋｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００２．ｐＨ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｔｈａｔ ｅｎｈａｎｃｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｉｎ ｖｉｖｏ．Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ７８：２９５−３０３）；およびポリ（エチルアクリル酸）（ＰＥＡＡｃ）（Ｍｕｒｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９．Ｔｈｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｆｏｒ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ６１：１３７−４３）が包含される。
アデノウィルスがその進入機序の部分としてエンドソームを崩壊させる能力は種々の遺伝子送達系において利用されている。Ｚａｔｌｏｕｋａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｕｇｍｅｎｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ． Ｖｅｒｈ Ｄｔｓｃｈ Ｇｅｓ Ｐａｔｈｏｌ ７８：１７１−６；Ｍｉｃｈａｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｂｉｎｄｉｎｇ−ｉｎｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｂｙ ｔｈｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：６８６６−９；Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｍａｌｌ ａｎｄ ｌａｒｇｅ （４８ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｇｅｎｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：６０９４−８． Ｃｕｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９１． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：８８５０−４を参照できる。ヒトアデノウィルスに加えて、他のアデノウィルス、例えばニワトリアデノウィルスをエンドソーム崩壊剤として使用できる（Ｃｏｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３．Ｃｈｉｃｋｅｎ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ （ＣＥＬＯ ｖｉｒｕｓ） ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｕｇｍｅｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６７：３７７７−８５）。
ベクタミジンおよびＤＭＲＩＥ−Ｃのような抑制剤部のカチオン性脂質トランスフェクション試薬は固有のエンドソーム崩壊特性を有する。Ｅｌ Ｏｕａｈａｂｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７． Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｒｏｃｅｓｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ４１４：１８７−９２を参照できる。さらにまた、酸不安定性のカチオン性脂質も報告されている（Ｂｏｏｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２．Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ａｎ ａｃｉｄ−ｌｉａｂｌｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １９：１２９２−１３０１；Ｗｅｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１．Ｒｅｄｕｃｉｂｌｅ ｃａｔｉｏｎｉｃ ｌｉｐｉｄｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ． Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３５６：７４７−７５６）。
他のエンドソーム崩壊剤はウィルス融合誘導性のペプチド、例えばインフルエンザウィルスヘマグルチニン融合誘導性ペプチド（Ｂｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｔｏ ａ ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２：４６８１−４６８８）およびその合成誘導体（Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｅｎｄｏｓｏｍｅ−ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｓｉｎｇ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４を包含する。これらのペプチドは酸性ｐＨにおいてコンホーメーションを変化させ、エンドソーム膜を脱安定化させると考えられている。
エンドソームに浸透してシトゾルに至ることができるリシンＡ鎖を核酸または蛋白に結合することによりそのエンドソーム放出を起こすことができる（Ｂｅａｕｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３．ＡＴＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｉｃｉｎ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｆ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２３６６１−２３６６９）。
エンドソームのｐＨを改変する薬剤を本発明の実施に使用できる。リソソーム向性のアミンは一般的にエンドソームのｐＨを上昇させる作用を有すると考えられている。このような薬剤は例えばカプセル化アンモニウム、４−アミノキノン（例えばクロロキン、アモジアキン）、８−アミノキノリン（例えばプリマキンおよびＷＲ２４２５１１）、ピリメタミン、キナクリン、キニンおよびキニジンを包含する（Ｔｓｉａｎｇ Ｈ，Ｓｕｐｅｒｔｉ Ｆ．Ａｍｍｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ． Ｂｒｉｅｆ ｒｅｐｏｒｔ． Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ ８１：３７７−３８２；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７．Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｃｅｒｔａｉｎ ｑｕｉｎｏｌｉｎｅｓ ａｓ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ ｉｎ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ． Ｔｏｘｉｃｏｎ ３５：４３３−４４５）。
Ｃ．人工染色体
本発明の組成物、複合体および方法に使用する核酸分子は人工染色体（ＡＣ）の形態であってもよい。ＡＣは最低でも少なくとも１つのＤＮＡ複製起点（ｏｒｉ）、１つ以上のテロメアおよび動原体を含むＤＮＡ分子である。ｏｒｉの各々は好ましくは、ＡＣの複製が細胞ＤＮＡ複製と強調するようにゲノム染色体から誘導する。テロメアは複製および細胞分裂の如何なる回に対しても染色体の末端配列を温存するエレメントである。動原体は各細胞分裂を通してＡＣの適切な分離を媒介する（Ｗｉｌａｒｄ ＨＦ．Ｃｅｎｔｒｏｍｅｒｅｓ：ｔｈｅ ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ８：２１９−２２５，１９９８）。
理想的には、ＡＣは安定に維持され、そして、有糸分裂および減数分裂の最中には適切に分離される。一般的にＡＣはクローニングされたＤＮＡのセグメントを含み、そして通常は、クローニングされたＤＮＡ片が大きいほどより安定となる。機能を向上させたり付加させたりするためにＡＣを操作することが可能である（Ｇｒｉｍｅｓ Ｂ， Ｃｏｏｋｅ Ｈ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ ７：１６３５−１６４０， １９９８； Ｓａｆｆｅｒｙ Ｒ， Ｃｈｏｏ ＫＨ． Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ４：５−１３， ２００２）。
細菌およびコウボの人工染色体（それぞれＢＡＣおよびＹＡＣ）が報告されている。ＢＡＣおよびＹＡＣはＳｈｉｚｕｙａ Ｈ， Ｋｏｕｒｏｓ−Ｍｅｈｒ Ｈ． Ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ． Ｋｅｉｏ Ｊ Ｍｅｄ ５０：２６−３０， ２００１； ａｎｄ Ｆａｂｂ ＳＡ， Ｒａｇｏｕｓｓｉｓ Ｊ． Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｈｕｍ Ｄｉｓ Ｓｅｒ ５：１０４−１２４， １９９５； Ａｎａｎｄ Ｒ． Ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ （ＹＡＣｓ） ａｎｄ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅｓ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １０：３５−４０，１９９２において検討されている。
哺乳類人工染色体（ＭＡＣ）が製造されており、そして体細胞遺伝子療法のためのベクターとして使用してよい。Ｓｅｅ Ｂｒｏｗｎ ＷＲ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ２：４７９−４８６， １９９２； Ｈｕｘｌｅｙ Ｃ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １３：３４５−３４７， １９９７； Ａｓｃｅｎｚｉｏｎｉ Ｆ， Ｄｏｎｉｎｉ Ｐ， Ｌｉｐｐｓ ＨＪ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ−ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｓｏｍａｔｉｃ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ １１８：１３５−１４２， １９９７； Ｖｏｓ ＪＭ． Ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ８：３５１−３５９， １９９８； ａｎｄ Ｖｏｓ ＪＭ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｍａｍｍａｌｉａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｅｐｉｓｏｍａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １：２０４−２１５， １９９９を参照できる。
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）が報告されている（Ｈｅｎｎｉｎｇ ＫＡ， Ｎｏｖｏｔｎｙ ＥＡ， Ｃｏｍｐｔｏｎ ＳＴ， Ｇｕａｎ ＸＹ， Ｌｉｕ ＰＰ， Ａｓｈｌｏｃｋ ＭＡ． Ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｏｔｈ ｈｕｍａｎ ａｌｐｈａ ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９６：５９２−５９７， １９９９； Ｌａｒｉｎ Ｚ， Ｍｅｊｉａ ＪＥ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １８：３１３−３１９， ２００２）。ＨＡＣは例えばサテライトＤＮＡ系人口染色体（ＳＡＴＡＣ）を包含する。ＳＡＴＡＣはヒトテロメアＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび動原体活性を有する反復α−サテライトＤＮＡのアレイを混合することにより作成されている（Ｈａｄｌａｃｚｋｙ Ｇ． Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＤＮＡ−ｂａｓｅｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ３：１２５−１３２， ２００１）。
遺伝子療法に加えて、ＡＣは種々の細胞型におけるＤＮＡの大型片を安定にクローニングするために使用されている（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ Ｄ， Ｎａｇａｒａｊａ Ｒ． Ｉｍｐａｃｔ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ａｎｎ Ｍｅｄ ３０：１８６−１９１， １９９８； Ｍｏｎａｃｏ ＡＰ， Ｌａｒｉｎ Ｚ． ＹＡＣｓ， ＢＡＣｓ， ＰＡＣｓ ａｎｄ ＭＡＣｓ： ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：２８０−２８６， １９９４）。さらにまた、ＡＣは動物において大型のトランスジーン、特にヒト遺伝子疾患のマウスも出るに置けるヒトトランスジーンを導入するためのトランスジェニック動物手法において使用することができる。Ｇｉｒａｌｄｏ Ｐ， Ｍｏｎｔｏｌｉｕ Ｌ． Ｓｉｚｅ ｍａｔｔｅｒｓ： ｕｓｅ ｏｆ ＹＡＣｓ， ＢＡＣｓ ａｎｄ ＰＡＣｓ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ａｎｉｍａｌｓ． Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ １０：８３−１０３， ２００１； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ， Ｌａｍｂ ＢＴ， Ｐｅｔｅｒｓｏｎ ＫＲ． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｗｉｔｈ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３６：４３５−４５３， ２０００； Ｌａｍｂ ＢＴ， Ｇｅａｒｈａｒｔ ＪＤ． ＹＡＣ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｇｅｎｅｔ Ｄｅｖ ５：３４２−３４８， １９９５； Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ Ａ． ＹＡＣ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｈｕｍａｎｉｚｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ． Ｃｕｒｒ Ｂｉｏｌ ４：７６１−７６３， １９９４； Ｈｕｘｌｅｙ Ｃ． Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＹＡＣｓ ｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ． Ｇｅｎｅｔ Ｅｎｇ （Ｎ Ｙ） １６：６５−９１， １９９４； Ｈｕｘｌｅｙ Ｃ， Ｇｎｉｒｋｅ Ａ． Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｙｅａｓｔ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｙｅａｓｔ ｔｏ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ １３：５４５−５５０， １９９１； ａｎｄ Ｈｅｉｎｔｚ Ｎ． ＢＡＣ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｔｕｒｅ： ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂａｃ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２：８６１−８７０， ２００１を参照できる。
Ｄ．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
或は、本発明の組成物、複合体および方法において使用される核酸分子はペプチド核酸（ＰＮＡ）の形態であってよい。ＰＮＡは骨格が糖ではなく擬似ペプチドである核酸分子の類縁体である。ＤＮＡおよびＲＮＡと同様、ＰＮＡ分子は逆相補鎖を有する１本鎖核酸に結合するが；ＰＮＡの中性の骨格はより強力な結合およびより大きい特異性をもたらすことができる。検討の際には、Ｃｏｒｅｙ ＤＲ． Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ： ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｔｈｅ ｓｃｏｐｅ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：２２４−２２９， １９９７を参照できる。ＰＮＡの合成はＨｙｒｕｐ等により検討されている （Ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ （ＰＮＡ）： ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． ４：５−２３， １９９６）。ＰＮＡの作成および使用のために例示されるプロトコルについては、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ： Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｉｅｌｓｅｎ， Ｐ．Ｅ． ａｎｄ Ｅｇｈｏｌｍ， Ｍ．， ｅｄｓ． Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏｒｆｏｌｋ， Ｕ．Ｋ． １９９９を参照できる。ＰＮＡは当該分野で知られている方法に従って調製でき、または、市販品を例えばＭｏｎｏｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． （Ｎｅｗ Ｍａｒｋｅｔ， ＡＬ， Ｕ．Ｓ．） およびＤａｌｔｏｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ． （Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ， Ｃａｎａｄａ）から購入できる。ＰＮＡに蛍光部分を結合させるための方法が報告されている。例えばＭｕｒａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ＨＩＶ−１ ｂｙ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ： ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｎｄ ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｓｉｇｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ． Ｐａｔｈｏｌ １９４：１３０−１３５， ２００１を参照できる。
ＶＩ．蛍光分子および部分
特定の実施形態においては、本発明の組成物および複合体は蛍光団１つ以上に連結された、これと複合体化された、または、これを含む分子または部分１つ以上のような、マーカーまたは活性化分子または部分１つ以上を含む。本発明のこの特徴により意図されるものは、本発明の組成物の成分１つ以上に蛍光団１つ以上が連結（例えば共有結合またはイオン結合により）された組成物である（例えば蛍光タグを付された核酸分子、ヌクレオチド、蛋白、ペプチド等）。本発明のこの特徴によりさらに意図されるものは組成物内の他の成分１つ以上に必ずしも直接連結されていなくて良い蛍光団１つ以上が組成物内に個別に含有されている組成物である。
Ａ．蛍光団
本発明の目的のためには、蛍光団はそれ自体蛍光性である物質、または、特定の状況下（例えばＦＲＥＴの場合のように別の蛍光団に近接した場合）において蛍光性となる物質であることができる。「蛍光団」または「フルオロ」という用語は、別の分子に共有結合している蛍光分子、別の分子に非共有結合的に結合する蛍光分子並びに遊離の蛍光分子を包含する。ペプチドまたは核酸のような別の分子に結合した後にのみ蛍光性となる分子もまた本発明の範囲に包含される。
原則として、現在知られているか、今後発見されるいずれかの蛍光団を本発明の方法、組成物およびキットに従って使用できる。特定の実施形態においては、本発明における使用に適する蛍光団は約２００ｎｍ〜約８００ｎｍ、 約２５０ｎｍ〜約８００ｎｍ、約２５０ｎｍ〜約７５０ｎｍ、約３００ｎｍ〜約７００ｎｍ、約３５０ｎｍ〜約６５０ｎｍ、約４００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約６００ｎｍ、約４５０ｎｍ〜５８０約ｎｍ、約４５０ｎｍ〜５７５約ｎｍ、約４５０ｎｍ〜約５７０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約６００ｎｍ、約５００ｎｍ〜約５９０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約５８０ｎｍ、約５００ｎｍ〜約５７５ｎｍ、約５００ｎｍ〜約５７０ｎｍ等の波長範囲に属する波長において励起および／または蛍光発生するものを包含する。当業者が知る通り、上記した範囲内で励起最大および発光最大を有するいずれかの蛍光団が、その所定の蛍光団に関する実際の特定の励起および発光の最大が上記において特に示したものであるか否かに関わらず、本発明における使用に適している。
適切な化合物のアレイの入手容易性に鑑みて、励起および発光の最大に関する上記したガイドラインがあれば、本発明の実施に適切である反応性蛍光分子または分子のセットを選択することは当業者が容易に知りえるものである。多くの適切な蛍光団が例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｉｎｅ，ＯＲ）のような入手もとより市販されている。
これらの方法の多くは本発明の実施に必要な種々の化合物の製造における使用に極めて適切である。当業者の知るとおり、特に予定外の実験を行うことなく、所望の蛍光標識核酸、オリゴヌクレオチド等を製造するための適当な方法を選択できる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ Ｊｏｕｒｓｅｙ（１９９４）のＰｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｖｏｌ．２６を参照できる。さらにまた、特に核酸化学の領域における有機合成の技術がその範囲を拡大し続けるに従って、現在知られているものと等しく適している新しい方法が開発される。以下の考察は核酸を修飾するために使用できる化合物のアレイおよび手法の代表として示す。本発明とともに使用される方法はこの考察により限定されるわけではない。
本発明の実施に有用な蛍光部分および分子は例えばフルオレセイン、ローダミン、クマリン、ジメチルアミノナフタレンスルホン酸（ダンシル）、ピレン、アントラセン、ニトロベンゾキサジアゾール（ＮＢＤ）、アクリジンおよびフッ化ジピロメテンホウ素の誘導体を包含する。より典型的には、本発明を実施する際に有用である蛍光部分および分子の例は下記に列挙する通りである。
−カルボシアニン、ジカルボシアニン、メロシアニンおよび他のシアニン染料（例えばＣｙＤｙｅＴＭ蛍光団、例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５およびＣｙ７、Ｐｈａｒｍａｃｉａ製）。これらの染料は種々の波長、即ち緑色（５０６ｎｍおよび５２０ｎｍ）、緑黄色（５４０ｎｍ）、オレンジ（５７０ｎｍ）、朱色（５９６ｎｍ）、遠赤職（６７０ｎｍ）および近赤外（６９４ｎｍおよび７６７ｎｍ）において最大蛍光を有する。
−クマリンおよびその誘導体（例えば７−アミノ−４−メチルクマリン、アミノクマリンおよびヒドロキシクマリン）。
−ＢＯＤＩＰＹ染料（例えばＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ）。
−フルオレセインおよびその誘導体（例えばフルオレセインイソチオシアネート）。
−ローダミン染料（例えばローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ローダミン６ＧおよびＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ）。
−Ａｌｅｘａ染料（例えばＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−３５０、−４３０、−４８８、−５３２、−５４６、−５６８、−５９４、−６６３および−６６０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ製）。
−蛍光エネルギー転移染料（例えばチアゾールオレンジ−エチジウムヘテロ二量体、ＴＯＴＡＢ等）。
−ルミネセント特性を有する蛋白、例えば緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）およびその突然変異体および変異体、例えば改変された波長を有する蛍光蛋白（例えばＹＦＰ、ＲＦＰ等）。Ｃｈｉｅｓａ ｅｔ ａｌ．（２００１）．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｅｑｕｏｒｉｎ ａｎｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓ ｖａｌｕａｂｌｅ ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３５５：１−１２；Ｓａｃｃｈｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，（２０００）．Ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｕｔａｎｔｓ． Ｈｉｓｔｏｌ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．１５：１０１−１０７；Ｌａｒｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）．Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｕｎｔｒａｐｐｅｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １：８３−８６）。
−アエクオリンおよびその突然変異体および変異体。
−ＤｓＲｅｄ蛋白（Ｂａｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， ２０００． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ， ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤｓＲｅｄ， ａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｃｏｒａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１１９８４−９）およびその突然変異体および変異体（Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ ｅｔ ａｌ．， ２００１． Ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＤｓＲｅｄ ｆｏｒ ｄｏｕｂｌｅ ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｔｉｍｅｒ ｏｆ ｎｅｕｒａｌ ｆｉｂｅｒ ｂｕｎｄｌｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６：２９６２１−４； Ｂｅｖｉｓ ＢＪ， Ｇｌｉｃｋ ＢＳ．， ２００２． Ｒａｐｉｄｌｙ ｍａｔｕｒｉｎｇ ｖａｒｉａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＤｓＲｅｄ）． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０：８３−８７； Ｔｅｒｓｋｉｋｈ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤｓＲｅｄ Ｍｕｔａｎｔｓ． Ｓｐａｃｅ ａｒｏｕｎｄ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７：７６３３−６； Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ａ ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：７８７７−８２；およびＫｎｏｐ ｅｔ ａｌ．， ２００２． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ （ｄｒＦＰ５８３／ＤｓＲｅｄ／ＲＦＰ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３３：５９２， ５９４， ５９６−５９８を参照）。
−他の蛍光物質、例えば６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、Ｆ１２−ｄＵＴＰ、Ｌ５−ｄＣＴＰ、８−アニリノ−ｌ−ナフタレンスルホネート、ピレン、エタノアデノシン、臭化エチジウムピロラビンモノセミカルバジド、ｐ−ターフェニル、２，５−ジフェニル−１，３，４−オキサジアゾール、２，５−ジフェニルオキサゾール、ｐ−ビス［２−（５−フェニルオキサゾリル）］ベンゼン、１，４−ビス−２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）−ベンゼン、ランタニドキレート、パシフィックブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、オレゴングリーン、マリアナブルー、テキサスレッド、フィコエリスリン、エオシンおよびエリストシン。
−並びに、上記した分子および部分のいずれかの誘導体。蛍光団および核酸およびペプチドに蛍光団を結合させるためのキットは例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）およびＳｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）より販売されている。
Ｂ．蛍光オリゴヌクレオチドおよび他の核酸
本発明を実施する際に有用である蛍光部分は塩基セグメント上の部位および糖セグメント上の部位を含む核酸上のいずれかの位置に結合することができる。即ち蛍光団は３’末端、５’末端、内部の位置およびこれらの組み合わせよりなる群から選択される位置における核酸に共有結合させる。一般的には、Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１：１６５−１８７（１９９０）を参照できる。いずれかの適当な蛍光団をオリゴヌクレオチドと会合させることができるが、より一般的に使用されているもの一部はフルオレセイン、テトラメチルローダミン、テキサスレッドおよびＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢである。
ＤＮＡおよびＲＮＡの鎖の特定の構成成分を蛍光付加物に変換するための多くの手法が開発されている。例えばＬｅｏｎａｒｄ ａｎｄ Ｔｏｌｍａｎ，”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ”，Ａ．Ｂｌｏｃｈ，ｅｄ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２５５：４３−５８（１９７５）を参照できる。
特定の核酸塩基に蛍光を導入するためには化学的な方法が使用できる。例えばクロロアセトアルデヒドのアデノシンおよびシチジンとの反応により蛍光産物が得られる。反応は２つの塩基のうちいずれを誘導するかについて、反応混合物のｐＨを操作することにより制御でき；３７℃における反応はアデノシンについては４．５、そして、シチジンについては３．５の旨適ｐＨで急速に進行する（Ｂａｒｒｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．４６：５９７−６０４，１９７２）。この反応はまた、これらの塩基のデオキシリボシル誘導体を蛍光性とするためにも有用である（Ｋｏｃｈｅｔｋｏｖ ｅｔ ａ．，Ｄｏｋｌ．Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲＣ２１３：１３２７−１３３０，１９７３）。
ＤＮＡおよびＲＮＡはそのシチジン残基を重亜硫酸ナトリウムと反応させてスルホネート中間体を形成し、次にこれを反応性の窒素化合物、例えばヒドラジドまたはアミンと反応させることにより修飾できる（Ｖｉｓｃｉｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３：３１１，１９８６；およびＤｒａｐｅｒ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９：１７７４，１９８０）。ＲＮＡはまた選択的酸化により３’末端で標識することもできる。過ヨウ素酸塩によるＲＮＡの３’リボースの選択的酸化によりジアルデヒドが形成し、次にこれをアミンまたはヒドラジド試薬とカップリングさせることができる（Ｃｈｕｒｃｈｉｃｈ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ７５：２７４−２７６，１９６３；Ｈｉｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．５：４３６−４４４，１９９４）。
個々のヌクレオチドは塩基または糖の成分上の蛍光部分により誘導化できる。塩基に対する修飾は環外のアミンにおいて、または、環の炭素において行うことができる。例えばＬｅｖｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ．４：３１９−３２５（１９９３）を参照できる。糖部分の修飾はヒドロキシル基の酸素、または、リボース環の炭素原子において行うことができる。例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＡｕｇｕｓｔｙｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２４：２２４（１９９１）；Ｙａｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｇ Ｃｈｅｍ．７：７１５−７２０（１９９６）；Ｇｕｚａｅｖ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：５０１−５０３（１９９４）；およびＯｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．４：４９９−５０８（１９９３）およびそれに含まれる参考文献を参照できる。
修飾標識核酸はまた例えばアルキル化またはアシル化を介して３’ヒドロキシルにおいて修飾された２’−デオキシリボ核酸であることもできる。これらの標識核酸はＳａｎｇｅｒの方法で使用した場合にジデオキシ核酸のように機能し、合成を終止させる。
蛍光Ｇ誘導体は多様に置換されたマロンジアルデヒドとのその反応に基づいて天然の塩基から製造されている。Ｌｅｏｎａｒｄ ａｎｄ Ｔｏｌｍａｎ， ”Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｕｓｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｓ”，Ａ．Ｂｌｏｃｈ，ｅｄ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２５５：４３−５８（１９７５）を参照できる。
未損傷のオリゴヌクレオチドの塩基をその蛍光類縁体に変換するための種々の方法に加えて、蛍光物質を、その新規合成時にオリゴヌクレオチド内に導入するための多くの方法が存在する。
一般的には、合成オリゴヌクレオチドに蛍光タグ付加を行うために使用できる方法は少なくとも３つ存在する。これらの方法は蛍光タグ付加支持体、蛍光タグ付加５’修飾試薬および蛍光タグ付加単量体を利用する。
これらの方法の第１のものは固体支持体にオリゴヌクレオチド鎖を係留する蛍光タグ付加リンカーを利用する。オリゴヌクレオチド鎖が固体支持体から切断されると、蛍光係留部はオリゴヌクレオチドに結合したまま残存する。この方法はその３’末端で蛍光標識されているオリゴヌクレオチドを与える。この方法の変法においては、核酸の３’末端を、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの切断の後に反応性の蛍光団に連結することができるアミンまたはその他の反応性またはマスキングされた反応性の基を担持するリンカーで標識する。この方法は蛍光物質が切断または脱保護の条件に対して安定でない場合に特に有用である。
第２の方法はオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の選択的標識に依存している。多くの方法が５’末端の標識について知られているが、大部分の汎用的な方法は蛍光団で誘導化されているホスホアミダイト、または、蛍光団が切断および脱保護条件下で不安定である場合は保護された反応性官能基を使用している。反応性の官能基は、オリゴヌクレオチドの切断および脱保護および反応性の官能基の脱保護の後に蛍光団で標識する。５’誘導化アミダイトは、単一のヌクレオチドを組み込んだ前の工程と同様の態様において一般的には達成される最終合成サイクルとして成長中の核酸鎖にカップリングする。
これらの変換を行うための多くの試薬がＧｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）のような薬品メーカーから販売されている。他の薬剤は新規に製造でき、そして市販の薬剤を当該分野で知られた方法により修飾できる。
さらにまた、蛍光団または他の部分のコンジュゲートのために使用できる末端アミノ基を有するオリゴヌクレオチドを製造することも当該分野で知られている。例えばともにＳｍｉｔｈ等への米国特許５，１１８，８０２（５’末端ヌクレオシドの２’または５’第１アミノ基を介して連結したＤＮＡレポーターコンジュゲート）および５，１１８，８００（末端ヌクレオチド中の第１アミノ基を有するオリゴヌクレオチド）を参照できる。
Ｃ．蛍光ペプチド、ポリペプチドおよび蛋白
本発明を実施する際に有用である蛍光部分はＮ末端、Ｃ末端、側鎖、内部の位置およびこれらの組み合わせの部位を含むペプチドまたは蛋白のいずれかの位置に結合することができる。
非限定的な例として、高蛍光分子はネイティブのアミノ酸基に化学的に連結することができる。化学修飾がアミノ酸側鎖上で起こり、カルボキシルおよびアミノ官能基はポリペプチド結合形成に参加自由の状態で残存する。高蛍光ダンシルクロリドは、主にアミノ基の場合はスルホンアミドとして、または、スルフェート結合として、種々のアミノ酸、例えばリジン、アルギニン、チロシン、システイン、ヒスチジン等の親核側鎖に連結でき、これにより蛍光誘導体が得られる。このような誘導体化はペプチド結合を未損傷のまま形成する能力を温存し、蛋白へのダンシルリジンの取り込みを可能にする。
より典型的には、本発明を実施する際に有用である蛍光部分および分子の例はペプチドのＮ末端またはアミノ酸残基の側鎖基と反応できるアミン反応性蛍光団を包含する。これらには例えばスクシンイミジルエステルおよびそのカルボン酸；アルデヒド；スルホニルクロリド、例えばダンシル、ピレン、ＬｉｓｓａｍｎｅローダミンＢおよびテキサスレッド誘導体；およびアリル化試薬（例えばＮＢＤクロリド、ＮＢＤフロリドおよびジクロロトリアジン）と会合した蛍光団を包含する。
フルオレスカミンは本来は非蛍光性であるが、ペプチドおよび蛋白中にあるものを含む第２脂肪族アミンと急速に反応して青緑色蛍光誘導体を生成する。
芳香族ジアルデヒドｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）およびナフタレン−２，３−ジカルボキシアルデヒド（ＮＤＡ）は第１アミンと反応して蛍光イソインドールを形成するまでは本質的に非蛍光性である。
スルホニルクロリド、例えばダンシルクロリド、１−ピレンスルホニルクロリドおよびダポキシルスルホニルクロリドはアミンと反応して青または青緑色蛍光スルホンアミドを生成する。
ＦＩＴＣおよびベンゾフランイソチオシアネートを使用できる。ＦＩＴＣによるペプチドのＮ末端の特異的な誘導体化のための独特の方法が報告されている（”Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌ ｔｏ ｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｚｏｎｅ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．” Ｚｈａｏ ＪＹ，Ｗａｌｄｒｏｎ ＫＣ．Ｍｉｌｌｅｒ Ｊ．Ｚｈａｎｇ ＪＺ，Ｈａｒｋｅ Ｈ，Ｄｏｖｉｃｈｉ ＮＪ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ６０８，２３９−２４２，１９９２）。
無水Ｎ−メチルイサトイック酸およびＮ−メチルアントラニル酸のスクシンイミジルエステルを使用して低分子Ｎ−メチルアントラニル酸蛍光団のプロパンエステルまたはアミドを製造できる。この蛍光団は小さいため、標識が蛋白の機能を妨害する危険性を低減する。
蛍光団の型、ペプチドへのその結合部位、蛍光団を結合するために使用するリンカーの型、および、蛍光団へのペプチドの結合部位が細胞送達および／または複合体化らの成分の光誘導放出の効率に影響する場合がある。特にフルオレセインおよびフルオレセインの環構造を有するフルオレセイン誘導体の場合は、フルオレセイン蛍光団の５環位置におけるペプチドの結合が好ましい。
蛍光団はペプチドおよび蛍光団への共有結合を形成するスペーサー部分および基を含む連結基を介してペプチドに連結できる。フルオレセインおよびフルオレセインの環構造を有するフルオレセイン誘導体の場合はカルボキシアミンリンカーが好ましい。ペプチドへの蛍光団の連結のため、および、リンカー内にスペーサーを生成するための種々の試薬が市販されている。スペーサーは例えば炭化水素スペーサー（−ＣＨ２）ｘ）、またはポリエーテルスペーサーを包含する。
Ｄ．核酸および蛋白との蛍光団の非共有結合会合
１つの実施形態においては、蛍光団は複合体の転位ペプチドおよび／または核酸に非共有結合的に結合している。特定の理論に制約されないが、転位ペプチドと核酸の会合は非共有結合性であると考えられている。蛍光団がペプチド、核酸または両方に非共有結合的に結合している場合は、形成される複合体は完全非共有結合複合体と称される。
蛍光団に結合する核酸、例えばアプタマーを製造し、そして、核酸、蛋白および蛍光団の完全非共有結合複合体を製造するために使用できる。同様に蛍光団に結合する蛋白およびペプチド、例えば抗体およびその誘導体（例えば単一鎖抗体、ｃａｍｅｌｉｄ抗体、ＣＤＲ等）を製造できる。
非共有結合特異的結合対を用いて完全非共有結合複合体を製造できる。この実施形態において、特異的結合対の一方の構成員は核酸またはペプチドと会合し、そして他方の構成員は蛍光団と会合する。対の構成員の相互の特異的結合により結合対の構成員を含む核酸またはペプチドと蛍光団との間の非共有結合連結部が形成される。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンを用いて核酸または蛋白との蛍光団としての非共有結合会合をもたらすことができる。強力な非共有結合がビオチンおよびアビジン部分の間に形成される（解離定数は約１０１５である）。
１つの態様において、ビオチン部分は蛍光団に結合させ、そしてペプチドまたはオリゴヌクレオチドがストレプトアビジンまたはアビジン部分を含んでいて良い。Ｓａｎｏ Ｔ，Ｖａｊｄａ Ｓ，Ｃａｎｔｏｒ ＣＲ．Ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ａ ｖｅｒｓａｔｉｌｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｔａｇ．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ．７１５：８５−９１，１９８９を参照できる。例えば、ＶＰ２２転位蛋白およびストレプトアビジンを含む融合蛋白を生成し、ビオチニル化蛍光団と複合体化してよい。
ＶＩＩ．組成物および使用方法
即ち、本発明は自動および半自動の方法を含む本発明の方法および当該分野で知られた他の方法により製造された蛋白またはペプチド１つ以上、核酸分子１つ以上、および、場合により蛍光団１つ以上を含むコンジュゲートまたは複合体を提供する。例えば、核酸およびポリ−Ｌｙｓの複合体を形成するための自動化装置はＣａｓａｌ等への米国特許６，２８１，００５に記載されている。関連の特徴において、本発明はさらにこのようなコンジュゲートまたは複合体１つ以上を含む組成物を提供する。本発明のこの特徴による複合体は本発明の上記したコンジュゲートまたは複合体１つ以上（例えば１、２、３、４、５、１０等）を含む。特定のこのような特徴において、組成物は別の成分１つ以上、例えば緩衝塩１つ以上、カオトロピック剤１つ以上、洗剤１つ以上、蛋白１つ以上（例えば酵素１つ以上）、重合体１つ以上等を含んでよい。本発明のこの特徴の組成物はいずれかの形態、例えば固体（例えば乾燥粉末）または溶液（特に本発明のコンジュゲート１つ以上を含む生理学的に適合性のある緩衝塩溶液の形態）であってよい。
Ａ．医薬組成物
本発明の特定の組成物は予防、診断または治療の用途における使用のための医薬組成物としての使用のために特に製剤される。このような組成物は典型的には本発明のコンジュゲート、複合体または組成物１つ以上、および、薬学的に許容される担体または賦形剤１つ以上を含む。「薬学的に許容される担体または賦形剤」という用語は本明細書においては非毒性の固体、半固体または液体の充填剤、希釈剤、カプセル化剤、または、添加により悪影響を生じることなく医薬組成物を導入するヒトまたは他の哺乳類を含むレシピエント動物により耐容性が示されるいずれかの型の製剤補助剤を指す。
本発明の医薬組成物はいずれかの適当な投与様式を介して、例えば経口、直腸、非経腸、全身、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、口腔内に、経口または経鼻スプレーとして、または吸入により、レシピエントに投与してよい。「非経腸」という用語は本明細書においては、静脈内、筋肉内、腹腔内、クモ膜下槽内、皮下および関節内注射および注入の投与様式を指す。
非経腸注射のための本発明により提供される医薬組成物は、薬学的に許容される滅菌された水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳液、並びに使用直前に滅菌注射溶液または分散液に希釈再調製される滅菌粉末を含むことができる。適当な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはベヒクルの例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリ（エチレングリコール）等、カルボキシメチルセルロースおよびその適当な混合物、植物油（例えばオリーブ油）およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルを包含する。適切な流動性は例えばコーティング物質、例えばレシチンの使用により、分散液の場合は必要な粒径の維持により、そして、界面活性剤の使用により維持することができる。
本発明のこのような医薬組成物はまた補助剤、例えば保存料、水和剤、乳化剤および分散剤も含有してよい。微生物の作用の防止は種々の抗細菌剤および抗カビ剤、例えばパラベン、ベンジルアルコール、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等を含有させることにより確保してよい。浸透圧調節剤、例えば糖類、塩化ナトリウム等を含有することも望ましい場合がある。注射用の剤型の長時間の吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム、ヒドロゲルおよびゼラチンを含有させることにより達成してよい。
一部の場合においては、薬剤の作用を延長するために、皮下または筋肉内注射からの吸収を遅延させることが望ましい。このことは水性の体液中の溶解度が低い結晶性または不定形の物質の液体懸濁液の使用により達成してよい。その後の薬剤の吸収速度は溶解の速度に依存しており、そしてこれはその物理的形態に依存している。或は、非経腸投与された薬剤の遅延吸収は油ベヒクル中に薬剤を溶解または懸濁することにより達成される。
注射用デポ剤型はポリラクチド−ポリグリコリドのような生体分解性重合体中に薬剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作成される。薬剤の担体重合体に対する比および使用される特定の担体重合体の性質に応じて、薬剤放出速度を制御できる。他の生体分解性重合体の例は生体適合性のポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）である。デポ注射製剤はまた身体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に薬剤を捕獲させることにより製造される。
注射用製剤を例えば細菌保留フィルターによる濾過によるか、または使用前に滅菌水または他の滅菌注射用溶媒に溶解または分散できる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を配合することにより滅菌することができる。
経口投与用の固体剤型はカプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒を包含する。このような固体剤型においては、活性化合物は少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤または担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸２カルシウムおよび／またはａ）充填剤または膨張財、例えば澱粉、乳糖、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、ｂ）バインダー、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよびアカシアガム、ｃ）湿潤剤、例えばグリセロール、ｄ）錠剤崩壊剤、例えば観点、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカの澱粉、アルギン酸、特定のケイ酸塩および炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えばパラフィン、ｆ）吸収加速剤、例えば第４アンモニウム化合物、ｇ）水和剤、例えばセチルアルコールおよびグリセロールモノステアレート、ｈ）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘度、および、ｉ）潤滑剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリ（エチレングリコール）、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物と混合する。カプセル、錠剤および丸薬の場合は、剤型はまた緩衝剤を含んでよい。
同様の型の固体組成物もまた乳糖（ミルクシュガー）並びに高分子量ポリ（エチレングリコール）等のような賦形剤を用いてソフトおよびハード充填ゼラチンカプセル中の充填剤として使用してよい。
錠剤、ドラジェ剤、カプセル、丸薬および顆粒の固体剤型はコーティングおよびシェル剤、例えば腸溶性コーティングまたは時間調製のコーティングおよび医薬品製剤分野でよく知られたコーティングを用いて製造できる。それらは場合により不透明化剤を含有してよく、そして場合により遅延された態様で胃腸管の特定の部分においてのみ、或はそこで優先的に、活性成分を放出するような組成物であることができる。使用できる包埋組成物の例は重合体物質およびワックスである。活性化合物はまた適宜上記した賦形剤１つ以上と共にマイクロカプセル化された形態であることができる。
経口投与用の液体剤型は薬学的に許容される乳液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシルを包含する。活性化合物に加えて、液体剤型は当該分野で一般的に使用されている不活性の希釈剤、例えば水またはその他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリ（エチレングリコール）およびソルビタンの脂肪酸エステルおよびその混合物を含有してよい。
不活性希釈剤に加えて、経口用組成物はまた補助的物質、例えば水和剤、乳化および懸濁剤、甘味料、フレーバーおよび芳香剤を含むことができる。
懸濁液は活性化合物のほかに懸濁剤、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカントおよびこれらの混合物を含有してよい。
局所投与は皮膚または粘膜、例えば肺および眼の表面への投与を包含する。吸入用を含む局所投与用の組成物は加圧または非加圧であってよい乾燥粉末として製造してよい。非加圧粉末組成物の場合は、微細分割された形態の活性成分を、例えば直径１００マイクロメートル以下の粒径を有する粒子を含む大型の薬学的に許容される不活性担体との混合物として使用してよい。適当な不活性担体は乳糖およびスクロースのような糖類を包含する。望ましくは、活性成分の粒子の少なくとも９５重量％が０．０１〜１０マイクロメートルの範囲の有効粒径を有する。
或は、医薬組成物は加圧してよく、そして、窒素または液化高圧ガスのような圧縮ガスを含んでよい。液化高圧ガス媒体および実際には全体の組成物が好ましくは活性成分がその中にそれほど溶解しないようにする。加圧組成物はまた界面活性剤を含有してよい。界面活性剤は液体または固体の非イオン系の界面活性剤であるか、または、固体のアニオン系界面活性剤であってよい。ナトリウム塩の形態の固体のアニオン系界面活性剤を使用することが好ましい。
局所適用の別の形態は眼への適用である。この投与様式において、本発明のコンジュゲートまたは組成物は、活性化合物が結膜または角膜および眼球内部、例えば前眼房、後眼房、ガラス体、房水、ガラス体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜／網膜および強膜に浸透するのに十分な時間に渡り化合物が眼球表面と接触した状態で維持されるように薬学的に許容される眼科用ベヒクル中で送達する。薬学的に許容される眼科用ベヒクルは例えば軟膏、植物油またはカプセル化物質であってよい。
直腸および膣投与のための組成物は、好ましくは本発明のコンジュゲートまたは組成物を、室温では固体であるが体温では液体となることにより直腸または膣で溶融して薬剤を放出するような、適当な非刺激性の賦形剤または担体、例えばカカオ脂、ＰＥＧまたは座材用ワックスと混合することにより製造できる坐剤である。
本発明において使用される医薬組成物はまた、リポソームの形態で投与してよい。当該分野で知られる通り、リポソームはリン脂質または他の脂質物質から誘導される。リポソームは水性媒体中に分散された単層または多層の水和液晶により形成される。いずれかの非毒性の生理学的に許容され代謝可能な、リポソーム形成可能な脂質を使用できる。本発明のコンジュゲートまたは組成物１つ以上のほかに、リポソーム形態の本発明の医薬組成物は安定化剤、保存料、賦形剤等１つ以上を含有できる。好ましい脂質はリン脂質およびホスファチジルコリン（レシチン）であり、共に天然または合成であって良い。リポソームを形成するための方法は当該分野で知られている（例えばＺａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，等の米国特許５，３９５，６１９を参照できる）。最も一般的にはモノメトキシ−ＰＥＧにカップリングされたホスファチジルエタノールアミンであるポリ（エチレングリコール）（「ＰＥＧ」）にコンジュゲートされたリン脂質を含むリポソームは、好都合な特性、例えば哺乳類における血液循環における延長された寿命を有する（Ｆｉｓｈｅｒ Ｄ．，米国特許６，１３２，７６３）。
Ｂ．使用
本明細書に記載するとおり、本発明のコンジュゲートおよび組成物は好都合には、細胞、組織、臓器または生物にコンジュゲートおよび組成物の成分１つ以上（例えばペプチド１つ以上および／または核酸分子１つ以上および／または蛍光団１つ以上）を送達するための方法において使用される。特に本発明は、細胞、組織、臓器または生物への複合体または組成物の成分１つ以上の制御された送達を提供し、これにより細胞、組織、臓器または生物に対する活性のために放出される特定の成分の量を時間的または空間的に調節する能力をユーザーに提供する。
一般的に本発明のこのような方法は１つ以上の活性を包含する。例えば本発明の１つのこのような方法は、（ａ）本明細書に詳述した本発明の複合体または組成物１つ以上を製造すること；（ｂ）細部、組織、臓器または生物による本発明の複合体または組成物１つ以上の取り込みに好都合な条件下において複合体または組成物１つ以上に細胞、組織、臓器または生物１つ以上を接触させること；および（ｃ）細胞、組織、臓器または生物内にコンジュゲートまたは組成物の生物活性成分１つ以上を放出する治療により本発明の複合体または組成物１つ以上を含有する細胞、組織、臓器または生物を治療すること、を包含する。特定の実施形態においては、放出治療は複合体または組成物の放射線感受性成分１つ以上（例えば蛍光団１つ以上）を活性化させるのに十分な波長および強度よび持続時間において電磁気照射、特に光で細胞、組織、臓器または生物を照射することにより、細胞、組織、臓器または生物内に生物活性成分１つ以上（例えばペプチド１つ以上および／または核酸１つ以上）を放出することを含む。本発明の特定のこのような特徴において、治療は約２００ｎｍ〜約８００ｎｍの波長範囲に属する励起波長を有する光で細胞、組織、臓器または生物を照射することを包含する。本発明の方法に従って使用するのに適する他の波長は上記したとおりであり、当業者のよく知るものである。
本発明の複合体および／または組成物の生物活性成分が細胞、組織、臓器または生物内に放出された後は、成分はその意図する生物学的機能を遂行する。例えば、細胞、組織、臓器または生物内に放出されたペプチド成分は細胞、組織、臓器または生物内の受容体または他の化合物または成分への結合を進行し；細胞、組織、臓器または生物内の代謝反応に関与し；細胞、組織、臓器または生物内の酵素活性１つ以上を実行、アップレギュレートまたは活性化、またはダウンレギュレートまたは阻害し；細胞、組織、臓器または生物に欠如した構造成分を提供し；細胞、組織、臓器または生物に栄養要求性１つ以上を提供し；疾患または身体障害の過程または徴候１つ以上を抑制、治療、退行またはその他の態様で軽減する等してよい。他の例においては、細胞、組織、臓器または生物に放出された核酸成分は細胞、組織、臓器または生物内の受容体または他の化合物または成分への結合を進行し；染色体または染色体外、ゲノムその他のものであるいずれかにおける細胞、組織、臓器または生物内の遺伝子物質内に取り込まれ；細胞、組織、臓器または生物内の酵素活性１つ以上を実行、アップレギュレートまたは活性化、またはダウンレギュレートまたは阻害し；細胞、組織、臓器または生物に欠如した遺伝子成分を提供し；細胞、組織、臓器または生物内の遺伝子１つ以上のコピー数を増大または低減し；疾患または身体障害の過程または徴候１つ以上を抑制、治療、退行またはその他の態様で軽減する等してよい。関連する特徴において、本発明の複合体および組成物は、当該分野でよく知られ、当業者のよく知るような方法（例えば核転移クローニング）を用いて、マウス、ラット、イヌ、ウシ、ブタ、ウサギ、イヌ、サル等のような非ヒトトランスジェニック動物を含むトランスジェニックな細胞、組織、臓器または生物を作成するために使用できる（例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許５，３２２，７７５、５，３６６，８９４、５，４７６，９９５、５，６５９，５０３および５，８６１，２９９；ＷＩＰＯ／ＰＣＴ質眼公開ＷＯ９８／３７１８３およびＷＯ００／４２１７４；米国特許出願００１２６６０−Ａ１（２００２年１月３１日公開）；Ｄａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２０：２５１−２５５（２００２）；Ｂｅｔｔｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：１０５５−１０５９（２０００）；Ｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１１８８−１１９０（２０００）；およびＰｏｌｅｊａｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４０７：８６−９０（２０００）を参照できる）。
Ｃ．用量用法
本発明のコンジュゲート、複合体または組成物は、細胞、組織、臓器または生物に対し、それに生物活性成分１つ以上（即ちペプチドまたは核酸分子１つ以上）を送達するために、インビトロ、エクスビボまたはインビボで投与することができる。当業者の知るとおり、ある活性化合物、コンジュゲート、複合体または組成物の有効量は実験的に決定することができ、そして、純粋な形態で、或は、薬学的に許容される製剤またはプロドラッグの形態で存在する場合はそのような形態で使用してよい。本発明の化合物、コンジュゲート、複合体または組成物は薬学的に許容される賦形剤１つ以上と組み合わせた獣医科用または医薬組成物として、それを必要とする動物（哺乳類、例えばヒトを含む）の患者に対して投与してよい。ヒト患者に投与する場合は、本発明の化合物および組成物の総量としての一日当たり、一週当りまたは一月当りの使用量は調和の取れた医療上の判断の範囲内で担当医により決定される。いずれかの特定の患者に対する治療有効用量水準は種々の要因、例えば、達成すべき細胞応答の種類および程度；使用する特定の化合物、コンジュゲート、複合体または組成物の名称および／または活性；患者の年齢、体重または表面積、全身状態、性別および食餌；投与時間、投与経路および活性化合物の排出速度；治療期間；特定の化合物、コンジュゲート、複合体または組成物と組み合わせるか同時に使用されている他の薬剤、および医薬品および医療の当業者がよく知る同様の要因により変動する。例えば、当業者の知るとおり所望の治療効果を達成するために必要な量よりも少量で本発明の所定の化合物、コンジュゲート、複合体または組成物の用量で開始し、そして、所望の作用が達成されるまで徐々に漸増する。
用量用法は当該分野で許容され日常的である主要、例えばサイズエクスクルージョン、イオン交換または逆相のＨＰＬＣにより決定される、血中の所定の活性化合物の所定の濃度を与えるような患者特異的な態様で調製してよい。即ち、患者の用量用法は医療、薬学および／または薬理学の分野における当業者が日常的に使用するよく知られた方法に従って、ＨＰＬＣで測定される比較的一定の血中濃度を達成するように調節してよい。
Ｄ．診断および治療上の使用
本発明のコンジュゲートの診断上の使用は本発明の複合体または組成物を投与することにより動物、特にヒトの身体内の抗原性部分、例えば癌を位置決めするためのものであり、ここでは、複合体またはコンジュゲートは、標識されるか、または、例えば当該分野でよく知られた方法に従って光学的、放射線的、蛍光的または共鳴的な検出により検出を可能にする検出可能な標識１つ以上を含む。従って、本発明の別の特徴においては、本発明のコンジュゲートおよび組成物は診断または治療上の方法において、種々の身体障害を診断、治療または防止する際に例えば、このような障害の素因があるかこれに罹患した動物、特にヒトのような哺乳類において使用してよい。このような方法において、治療の目標は障害の発症を遅延または防止すること、および／または、障害の治癒または軽減を誘導すること、および／または、他の治療用法の副作用を低減または最小限化することである。従って、本発明の複合体および組成物は、感染症または疾患のような身体障害の保護、抑制または治療のために使用してよい。身体障害からの「保護」という用語は本明細書においては、「防止」、「抑制」および「治療」を包含する。「防止」とは疾患または身体障害の誘導よりも前の本発明の複合体または組成物の投与を包含し、「抑制」とは疾患の臨床顕在化よりも前の複合体または組成物の投与を包含し；従って、身体障害の「防止」および「抑制」は典型的には障害の素因があるかそれに罹患しやすいがまだ罹患していない動物において行われる。しかしながら身体障害の「治療」は疾患の顕在化の後の本発明の治療用複合体または組成物の投与を包含する。ヒトおよび家畜の医療においては、身体障害の「防止」と「抑制」の間を明らかにすることは常に可能ではない。多くの場合において、究極的な誘導性の事象は未知または潜在的であり、患者または医師のいずれも発症後十分経過するまで誘導性の事象を感知できない場合がある。従って、「予防」という用語は「治療」とは異なるものとして使用し、そして、本明細書に定義した「防止」および「抑制」の両方を包含することが一般的である。本発明の方法に従って使用する「保護」という用語は、従って、「予防」を包含する意味を有する。
本発明のこの特徴による方法は医師が上記した治療目的を達成できるような工程１つ以上を含んで良い。本発明の１つのこのような方法は、例えば下記工程：
（ａ）身体障害に罹患した、またはその素因のある動物（好ましくは哺乳類、例えばヒト）を発見すること；および、
（ｂ）本明細書に記載した本発明のコンジュゲート、複合体または組成物１つ以上、特にペプチド１つ以上、核酸１つ以上および蛍光団１つ以上を含む複合体１つ以上（またはそのようなコンジュゲートを含む医薬組成物１つ以上）の治療有効量を、コンジュゲート、複合体または組成物が動物における身体障害の発症を防止、遅延または診断するか、それを治癒するかその後退を誘導するように、動物に投与すること；
を含む。
本明細書においては、身体障害の「素因のある」動物とは、障害の身体的悪徴候の複数を示さないが、遺伝的に、生理学的に、または何らか別の態様で障害を発症する危険がある動物として定義される。本発明の方法においては、所定の身体障害の素因がある、その危険がある、またはそれに罹患している動物（例えば哺乳類、例えばヒト）の発見は、当業者のよく知る標準的方法、例えば放射線試験、生化学的試験（例えば動物から得られた試料中の特定のペプチド、蛋白、電解質等の相対的濃度の試験）、外科的方法、遺伝子スクリーニング、家族病歴、触診、病理学的または組織学的試験（例えば組織または体液またはスミアの顕微鏡検査、免疫学的試験等）、体液（例えば血液、血清、血漿、脳脊髄液、尿、唾液、精液等）の検査、画像化（例えば放射線、蛍光、光学的、共鳴（例えば核磁気共鳴（ＮＭＲ）または電子スピン共鳴（ＥＳＲ）の使用）等に従って達成してよい。これらの方法の１つ以上により動物が発見された後、動物を攻撃的および／または前向的に治療することにより、身体障害を防止、抑制、遅延または治癒させてよい。
本発明の複合体、組成物および方法を用いて防止、診断または治療できる身体障害は、防止、診断または治療において複合体または組成物のペプチドおよび／または核酸成分を使用してよいいずれかの身体障害を包含する。このような障害には例えば種々の癌（例えば乳がん、子宮がん、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、白血病、リンパ腫、肺癌、神経癌、皮膚癌、頭部頚部の癌、骨癌、結腸および他の胃腸管の癌、膵臓癌、膀胱癌、腎臓癌および他の癌腫、肉腫、腺癌および黒色腫）；感染性疾患（例えば細菌性疾患、カビ性疾患、ウィルス性疾患（例えば肝炎およびＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、寄生虫性疾患等）、遺伝的障害（例えば嚢胞性線維症、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ゴーシェ病、ポーンプ病、重度の複合的免疫不全障害等）、貧血、好中球減少症、血友病および他の血液障害；神経学的障害（例えば多発性硬化症およびアルツハイマー病）；酵素的障害（例えば痛風、尿毒症、高コレステロール血症等）；不確定または多重患部の病因の障害（例えば心臓血管疾患、高血圧等）；および当業者のよく知る医療上重要な他の障害が包含される。本発明の複合体、組成物および方法はまた前悪性の患部の悪性の患部への進行の化学療法的防止の場合のような、疾患の進行の防止において使用してよい。
即ち本発明の治療方法は、経口、直腸、非経腸（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、クモ膜下槽内、皮下および動脈内の注射および注入）、全身投与、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ドロップまたは経皮パッチとして）、口腔内または鼻スプレーまたは吸入を包含する種々の投与経路により、これを必要としている動物に投与してよい本発明のコンジュゲート、複合体または組成物１つ以上、または、本発明の医薬組成物１つ以上を使用する。本発明によればコンジュゲート、複合体または組成物の有効量を、特定の障害に罹患するかその素因のある細胞または動物にインビトロ、エクスビボまたはインビボで投与することにより動物における障害を防止、遅延、診断または治療することができる。本明細書においては、「コンジュゲート（または複合体または組成物）の有効量」とは、コンジュゲート／複合体／組成物の生物活性成分（即ちペプチドおよび／または核酸成分）の生物学的活性をコンジュゲート（または複合体または組成物）が実行することにより、本発明のコンジュゲート、複合体または組成物が投与されている動物における身体障害を防止、遅延、診断、治療または治癒することができるような量を指す。当業者の知るとおり本発明のコンジュゲート、複合体または組成物の有効量は薬学および医療の当業者のよく知る標準的な方法に従って実験的に決定でき、例えば参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＢｅｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ＆ Ｔｈｅｒａｐｙ， １７ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ；Ｈａｒｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，１０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅｌｍｓｆｏｒｄ，ＮＹ；Ｓｐｅｉｇｈｔ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．（１９９７）Ａｖｅｒｙ’ｓ Ｄｒｕｇ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， ４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｓｔｏｎ；Ｋａｔｚｕｎｇ，Ｂ．Ｇ．（２０００）Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ ａｎｄ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴを参照できる。
ヒト患者に投与する場合は、本発明のコンジュゲート、複合体および組成物の総量としての一日当たり、一週当りまたは一月当りの用量は調和の取れた医療上の判断の範囲内で担当医により決定される。例えば満足できる結果は、使用する特定の生物活性化合物に応じて、適切な用量における本発明のコンジュゲート、複合体または組成物の特定のものの投与によりえられるが、そのような用量は当業者が容易に知りえるものであるか、または、日常的な実験のみを用いて経験的に容易に決定される。本発明のこの特徴によれば、コンジュゲート、複合体または組成物は１回で投与するか、または、分割用量で、例えば一日当たり、または週当たりまたは月当り２回等、投与することができる。種々の投与様式（例えば非経腸、皮下、筋肉内、眼内、鼻内等）に対する適切な用量用法はまた、コンジュゲート、複合体または組成物の生物活性成分（即ちペプチドおよび／または核酸成分）の名称に応じて、日常的な実験のみを用いて経験的に容易に決定されるか、または、当業者が容易に知りえるものである。
別の用途においては、本発明のコンジュゲート、複合体および組成物はコンジュゲート、複合体または組成物の生物活性成分（即ちペプチドおよび／または核酸成分）に対する受容体を発現するか、この成分を結合、組み込みまたは何らかの別の態様での取り込みを行う細胞、組織、臓器または生物に対して診断または治療薬を特異的にターゲティングするために使用してよい。本発明のこの特徴による方法は、例えば、いずれかの機序（例えば受容体媒介エンドサイトーシス、ピノサイトーシス、ファゴサイトーシス、拡散等）により細胞、組織、臓器または生物によりコンジュゲート、複合体または組成物が取り込まれるように診断または治療薬１つ以上をさらに含む本発明のコンジュゲート、複合体または組成物１つ以上に細胞、組織、臓器または生物を接触させることにより、細胞、組織、臓器または生物に診断または治療薬を送達することを包含してよい。本発明のこの特徴により使用される診断または治療薬は例えば、核酸、有機化合物、蛋白またはペプチド、抗体、酵素、糖蛋白、リポ蛋白、エレメント、脂質、糖、アイソトープ、炭水化物、造影剤、検出可能なプローブまたはそのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１つの物質であり、これは本明細書に記載するとおり検出可能に標識されていて良い。本発明のこの特徴において使用される治療薬は、標的細胞（または組織、臓器または生物）に対して治療作用を有するものであり、作用は例えば、欠損遺伝子または蛋白の補正、薬剤作用、毒性作用、成長刺激作用、成長抑制作用、代謝作用、異化作用、同化作用、抗ウィルス作用、抗カビ作用、抗細菌作用、ホルモン作用、神経液性作用、細胞分化刺激作用、細胞分化抑制作用、神経調節作用、抗新生物作用、抗腫瘍作用、インスリン刺激または抑制作用、骨髄刺激作用、多能性幹細胞刺激作用、免疫系刺激作用および本発明のこの特徴による送達システムを介して細胞（または組織、臓器または生物）に送達される治療薬により与えられるいずれかの他の知られた治療作用から選択される。
このような追加の治療薬は例えば知られた、および、新しい化合物および組成物、例えば抗生物質、ステロイド、細胞毒製剤、血管活性剤、抗体または他の治療薬から選択してよい。このような薬剤の例は抗生物質および細菌性ショックの治療に用いられる他の薬剤、例えばゲンタマイシン、トブラマイシン、ナフシリン、非経腸セファロスポリン等を包含し；副腎皮質ステロイドおよびその類縁体、例えばデキサメタゾンは内毒素により誘発された細胞傷害を軽減し；血管活性剤、例えばアルファアドレナリン作用性受容体ブロッキング剤（例えばフェノキシベンズアミン）、ベータアドレナリン作用性受容体アゴニスト（例えばイソプロテレノール）およびドーパミンを包含する。
本発明のコンジュゲート、複合体および組成物はまた疾患の診断のため、および、治療応答をモニタリングするために使用してよい。特定のこのような方法において、本発明のコンジュゲート、複合体または組成物は検出可能な標識（例えば本明細書に記載したもの）１つ以上を含んでよい。特定のこのような方法において、これらの本発明の検出可能に標識されたコンジュゲート、複合体または組成物は、コンジュゲート、複合体または組成物の生物活性成分（即ちペプチドおよび／または核酸成分）に対する受容体を発現するか、または、そのような成分を別の態様で取り込むような細胞、組織、臓器または生物を検出するために使用してよい。このような方法の１つの例においては、細胞、組織、臓器または生物を、本発明のコンジュゲート、複合体または組成物１つ以上に、細胞、組織、臓器または生物によるコンジュゲートの取り込みに好都合な条件下で接触させ（例えばコンジュゲートを細胞表面受容体に結合させることによるか、または、細胞へのコンジュゲートのピノサイトーシスまたは拡散による）、そして次に、使用された標識に特異的な検出手段（例えば蛍光標識コンジュゲートの場合は蛍光検出；磁気的に標識されたコンジュゲートの場合は共鳴画像化；放射標識コンジュゲートの場合は放射線撮影等）を用いて細胞内に結合したまたは取り込まれたコンジュゲートを検出する。このような検出可能に標識されたコンジュゲートの別の使用は、例えば、本発明のコンジュゲート１つ以上の標識された形態の有効量を投与すること、および、細胞、組織、臓器または生物（または動物）に会合した検出可能な放射能を測定することにより、細胞、組織、臓器または生物または動物（ヒトを含む）の内部構造の画像化することを包含してよい。種々の型の標識の検出方法および診断および治療上の画像化におけるその使用は当該分野でよく知られており、本明細書に記載するとおりである。
別の特徴において、本発明のコンジュゲートおよび組成物は、コンジュゲートの生物活性成分に対する特異的な受容体を発現する細胞の表面上におけるそのような受容体の濃度または活性をモジュレートする方法において使用してよい。所定の受容体の活性を「モジュレートする」とは、コンジュゲートが、受容体への結合により、その受容体により媒介される生理学的活性（例えば細胞内シグナリングカスケード）を活性化または抑制することを意味する。本発明のコンジュゲートの調節活性に関する特定の機序に関する説明に制約されないが、そのようなコンジュゲートは、細胞受容体の生理学的活性に対して、コンジュゲートの生物活性成分を介した受容体への結合により、拮抗作用を示し、これにより天然のアゴニスト（例えば未コンジュゲートの生物活性成分）の結合をブロッキングし、そして、受容体そのものの生理学的活性の実質的な活性化を誘導することなく、天然のアゴニストによる受容体の活性化を防止することができる。本発明のこの特徴に夜方法は１つ以上の工程、例えば、細胞を本発明のコンジュゲート１つ以上に、コンジュゲート（即ちコンジュゲートの生物活性成分の部分）が細胞表面上の生物活性成分に対する受容体に結合するが受容体を実質的に活性化しないような条件下で接触させること（インビトロまたはインビボのいずれで実施してもよい）を包含してよい。このような方法は当業者の知るとおり、種々の診断および治療の用途において有用である。
ＶＩＩＩ．キット
本発明はまた本発明のコンジュゲートおよび／または組成物を含むキットを提供する。このようなキットは典型的にはバイアル、チューブ、アンプル、ボトル等のような容器１つ以上を緊密に格納して有するキャリー部、例えばボックス、カートン、チューブ等を含み、ここで、第１の容器は本発明のコンジュゲートおよび／または組成物１つ以上を含有する。本発明のこの特徴により包含されるキットはさらに、本発明のコンジュゲートおよびその特定の用途１つ以上を実施するために必要な別の成分（例えば試薬および化合物）１つ以上、例えば、特定の疾患または身体障害を診断、治療または防止のために有用な成分１つ以上（例えば別の治療化合物または組成物１つ以上、診断用試薬１つ以上、担体または賦形剤１つ以上等）、本発明の別のコンジュゲートまたは組成物１つ以上、取扱説明書のセット１つ以上等を含んでよい。
当業者の知る通り、本明細書に記載した方法および用途に対して他の適当な変更や適合を本発明の範囲や実施形態から外れることなく実施できる。本発明は以上のように詳述したが、これは以下の実施例を参照することによりさらに明確に理解され、そしてそれは本発明の説明をのみ目的としており、本発明を制限するものではない。
実施例１
細胞送達ポリペプチド
実施例において使用したペプチドの一部を表５に示す。合成ポリペプチドは当該分野で知られた標準的な方法により製造した。標準的なクローニング手法を用いて融合蛋白を作成した。発現ベクターｐＣＲ（登録商標）Ｔ７／ＶＰ２２−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。
Figure 2006517790
Figure 2006517790
 （１）ｐＩはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ−ｒｅｆ．ｈｔｍｌ）の２００２年９月のバージョンによりオンラインで予測した。Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １４，１０２３−１０３１（１９９３）；Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １５，５２９−５３９（１９９４）；およびＷｉｌｋｉｎｓ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ＥｘＰＡＳｙ Ｓｅｒｖｅｒ ｉｎ ：２−Ｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｅｄｉｔｏｒ Ａ．Ｊ．Ｌｉｎｋ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（１９９８）参照。
（２）Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００１参照。
（３）Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０（１９９４）参照。
（４）Ｅｌｌｉｏｔ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｒｅ（１９９７）Ｃｅｌｌ ８８：２２３−３３；Ｄｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９） Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：１２−２１；およびＰｈｅｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４４０−３）参照。
（４）Ｓｉｇｍａ＃Ｐ−６４０３。
（５）Ｓｉｇｍａ＃Ｐ−４６６３。
実施例２
蛍光オリゴヌクレオチドの制御送達および再分布
２．１．材料および方法
ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体は以下の通り作成した。各ペプチドは１０μｌＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１μＭの濃度となるように希釈した。ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド（ＦＩＴＣ−５’−ＴＣＣＣＧＣＧＣＡＣＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴ＊）（配列番号１６）を使用した（Ｎｏｒｍａｎｄ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：１５０４２−１５０５０（２００１））。ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドは当該分野で知られた手法に従って合成した（一般的には、Ｈａｇｍａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１２４４：２５９−２６８，１９９５；Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ５’−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｔｈｉｏｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａ ３’−ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２８：８１８−８２５，２０００；およびＤｕｂｅｙ Ｉ．Ｐｒａｔｖｉｅｌ Ｇ，Ｍｅｕｎｉｅｒ Ｂ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏ ｏｆ ｔｈｅ ｔｈｉｏｕｒｅａ ｌｉｎｋａｇｅ ｏｆ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ−ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｏ ａ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｍｏｔｉｆ ｄｕｒｉｎｇ ａｍｍｏｎｉａ ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ９：６２７−６３２，１９９８を参照）。
オリゴヌクレオチドを１０μｌＰＢＳ中０．５μＭまで稀釈し、これを次に上記した１０ｕｌのペプチド溶液と合わせた。ペプチド−オリゴヌクレオチド混合物を室温で１０分間インキュベートした。
ＣＨＯ細胞を５ｘ１０４個／ウェルの密度で２４穴プレートに播種した。２４時間後、細胞の各ウェルの場位置を０．５ｍｌのＨＡＭ斜め１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。次にペプチド−オリゴヌクレオチド混合物を場位置に添加し、３７℃で１６時間細胞と共にインキュベートした。
次に、培地を新しい培地に交換し、細胞をＦＩＴＣフィルターおよび４０倍対物レンズ付のＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いて観察した。細胞は即座に写真撮影した（全図につきｔ＝０時点）。細胞を３０秒間観察し、次に蛍光光路を閉じて細胞を照明することなくさらに９０秒間インキュベートした。次に細胞を２回目の写真撮影に付した（全図につきｔ＝２時点）。
２．２ 結果：アルギニンリッチペプチド
ペプチド−オリゴヌクレオチド混合物と共に細胞を１６時間インキュベートした後、Ｒ９（ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ）（配列番号４）およびＰＴＤ３（ＹＡＲＫＡＲＲＱＡＲＲ）（配列番号１２）ペプチドを含有する複合体を蛍光顕微鏡で細胞中に検出されたが、ＰＴＤＡ（ＹＡＡＫＡＡＡＱＡＡＡ）（配列番号１３）は検出されなかった。３０秒間の照明およびさらに９０秒間の照明を伴わないインキュベーションの後、蛍光の再分布はＲ９またはＰＴＤ３ペプチドを用いた実験において検出された。即ち原形質蛍光粒子を含む細胞の照明では、ある程度均質な原形質染色とその後の核蓄積が起こった。
Ｒ９ペプチド／オリゴヌクレオチド複合体を用いて観察された蛍光の再分布の経時的変化（図１）は各ペプチドにおいて観察されたものの典型であった。３０秒の連続照明の後、再分布が一部の細胞で検出された。１分の連続照射の後、大部分の細胞で再分布が観察され、２分では再分布は完全であった。同様のパターンの再分布がＰＴＤ３において観察されたのに対し、ＰＴＤＡではＦＩＴＣオリゴヌクレオチドとの複合体の形成は観察されなかった。ポリ−Ｌｙｓおよびより長いポリ−Ａｒｇ（即ち、Ａｒｇｎ、ここでｎ＝〜３５−１００）ペプチドの場合は、取り込みは検出されたものの、再分布は観察されなかった。
２．３ 結果：Ａｎｔペプチド
１６時間のインキュベーションの後、Ａｎｔ（４２〜５８）およびＡｎｔＦＦ（４２〜５８）ペプチドを含有する複合体が蛍光顕微鏡観察により細胞内に検出された。３０秒間の照明およびさらに９０秒間の照明を伴わないインキュベーションの後、蛍光の再分布はＡｎｔ（４２〜５８）ペプチドおよび相当するＡｎｔＦＦペプチドを用いた場合には検出された。
ＡｎｔＦＦ（４２〜５８）は２つのトリプトファン残基がフェニルアラニンと置換されているＡｎｔ（４２〜５８）ペプチドの突然変異体である。ＡｎｔＦＦ（４２〜５８）と複合体化したＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチドの取り込みは本実験においては観察された。さらにまた、照明の後、蛍光シグナルの再分布が一部の細胞で観察された。
Ｄｅｒｏｓｓｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１０４４４−１０４５０（１９９４）によれば、アンテナペジアホメオドメインの第３のらせんから誘導された１６アミノ酸ペプチド、Ａｎｔ（４３〜５８）および２０アミノ酸ペプチドＡｎｔ（４１〜６０）は生物学的膜を介して吐露することが示されている。この領域に由来する２つの他のペプチドＡｎｔ（４６〜６０）およびＡｎｔ（４１〜５５）は細胞に内在化されないことが報告されている。ＡｎｔＦＦと命名された２つのトリプトファン残基がフェニルアラニンと置換されている突然変異体であるＡｎｔ（４２ｎ〜５８）は野生型のペプチドよりも内在化に対してはるかに低い効率を示すことが報告されている。
しかしながら本実験の所見によれば、ＡｎｔＦＦペプチド単独（オリゴヌクレオチドを伴わない）に備わった転位特性はペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の送達と放出のために保持される必要はないことを示唆している。
実施例３
アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達および活性化
Ｒ９ペプチド（配列番号４）を用いてヒトｒａｆキナーゼに対して指向されたＦＩＴＣアンチセンスオリゴヌクレオチドとの複合体を形成した。ＦＩＴＣ−抗−ｒａｆオリゴヌクレオチドおよびＶＰ２２を用いたその肺癌細胞系統Ａ−５４９への送達は報告されている（Ｎｏｒｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
ＦＩＴＣ−抗−ｒａｆオリゴヌクレオチドとＶＰ２２（１５９〜３０１）蛋白またはＲ９ペプチドのいずれかとの複合体を作成した。アンチセンス作用はＡ５４９細胞をアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびＶＰ２２（１５９〜３０１）蛋白またはＲ９ペプチドのいずれかを含む複合体に接触させることにより評価した。
細胞を２４穴プレート中に成育させ、プレートをオーバーヘッドプロジェクター（３Ｍの９１００型、３６０Ｗの電球付）上に５分間置くことにより照明するか、暗所に維持した。照明後６０時間に、細胞を１時間ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識した。標識および免疫細胞化学的検出は抗ＢｒｄＵおよびアルカリホスファターゼコンジュゲート二次抗体を用いて製造元の取扱説明書（Ｒｏｃｈｅ）に従って実施した。ＢｒｄＵ標識細胞の数量減少とＢｒｄＵ標識の強度の低下は、細胞周期に渡り進行する細胞がより少数となるようなｒａｆ依存性シグナリングに対する作用を示している。観察された作用はＶＰ２２またはＲ９を使用したオリゴヌクレオチドの送達において同様であるように観察された。この結果は、Ｒ９ペプチドをアンチセンスオリゴヌクレオチド送達のために使用できること、および、アンチセンス作用はペプチド−オリゴヌクレオチド複合体の分散に応答して細胞の照明時にのみ観察されることを示している（図２）。
実施例４
細胞送達ポリペプチドの評価
以下のペプチド、即ち、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１１、Ｋ７、Ｋ９、Ｋ１１、ＲＧ９（ＲＲＲＲＧＲＲＲＲ）（配列番号８）、ＲＰＧ（ＲＲＧＲＧＲＧＲＲ）（配列番号６）およびＲＲＱ（ＲＲＱＲＱＲＧＲＲ）（配列番号７）のＦＩＴＣ標識アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＦＩＴＣ−抗−ｒａｆオリゴヌクレオチド）の送達および光依存性放出について上記した通り試験した。これらのペプチドのアミノ酸配列、配列番号および予測ｐＩは表５において上記したとおりである。
ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体と一夜インキュベートした後、細胞を蛍光顕微鏡下に照明し、初期の蛍光分布がＲ９−オリゴヌクレオチド複合体で観察されたものと同様であるかどうかを確認した。ペプチドＲ１１およびＲＧ９を用いて作成したＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド複合体はペプチドＲ９を用いて作成した複合体と極めて同様の分布を示した。しかしながら、ペプチドＲ７、Ｋ７、Ｋ９、Ｋ１１、ＲＧ９、ＲＲＧおよびＲＲＱを用いた場合、極めて僅かの蛍光複合体が観察されるか大型の見かけ上の凝集物が検出されるのみであった。光媒介の再分布はペプチドＲ９、Ｒ１１およびＲＧ９では観察されたが、Ｒ７、Ｋ７、Ｋ９、Ｋ１１、ＲＧ９、ＲＲＧおよびＲＲＱでは観察されなかった。
これらの所見は一般的にアルギニンを含有するペプチドはリジン含有ペプチドよりも蛍光標識オリゴヌクレオチドとの複合体の形成能力が高いことを示している。特定の理論に制約されないが、同じ大きさのペプチドについては、アルギニン含量が重要であり、そしてアルギニン残基をグリシンで置き換えることは、恐らくはペプチドのｐＩを低下させることにより、ペプチド−オリゴヌクレオチド複合体形成を妨害すると考えられる。
実施例５
蛋白の送達および活性化
５．１ 材料および方法
ＶＰ２２およびＣｒｅリコンビナーゼを含む融合蛋白をベクターｐＣＲＴ７／ＶＰ２２−１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながら本質的に製品マニュアルに従って構築した。融合蛋白はＶＰ２２のアミノ酸１５９〜３０１およびＣｒｅリコンビナーゼのアミノ酸１〜３４３を含む。ＶＰ２２／Ｃｒｅリコンビナーゼ融合蛋白をＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、ＶｏｙａｇｅｒＴＭ蛋白製造キット１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。
融合蛋白はＣｒｅ依存性ｌａｃＺレポーター遺伝子で一過性のトランスフェクトした２９３細胞を用いて試験した（図３Ａ）。Ｃｒｅ非存在下においては、ｌａｃＺの発現は、ＣＭＶプロモーターとｌａｃＺＯＲＦとの間の転写終止カセット（Ｌａｓｋｏ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：６２３２−６２３６（１９９２））の挿入によりいずれの細胞でも検出されなかった。
ＶＰ２２−Ｃｒｅを１０μｌＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中１μＭの濃度まで希釈した。前記実施例において記載した５’−ＦＩＴＣ−標識オリゴヌクレオチド（ＦＩＴＣ−抗−ｒａｆ−オリゴヌクレオチド）を１０ｕｌＰＢＳ中０．５μＭまで希釈した。融合蛋白−オリゴヌクレオチド混合物を室温で１０分間インキュベートした。細胞の各ウェルの培地を０．５ｍｌＤＭＥＭ／１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換した。蛋白−オリゴヌクレオチド複合体を培地に添加し、混合し、３７℃で１６時間細胞と共にインキュベートした。
照明の前に、アルミホイルでウェルの半分を被覆することにより照明および未証明の細胞の間の境界線を設定した。次に、前述の通り培地を交換し、細胞をＦＩＴＣフィルターおよび４０倍対物レンズ付のＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いて観察した。ＶＰ２２−Ｃｒｅ融合蛋白はＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチドと複合体を形成し、そしてこれらの複合体はＲ９、Ａｎｔ（４２〜５８）およびＰＴＤ３−ＦＩＴＣオリゴヌクレオチド複合体と同様の特性を有するように観察された。
次にＶＰ２２−Ｃｒｅ／ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド複合体を、対物レンズを取り外し、光を直接細胞に到達させた（焦点合わせず）以外は前述と同様にして蛍光顕微鏡下に１０分間照明することにより処理した。次にウェルの照明された半部に渡る細胞において、ＶＰ２２−Ｃｒｅ／ＦＩＴＣ−オリゴヌクレオチド複合体の分散が観察された。
５．２ 結果
４０時間後、β−ガラクトシダーゼ活性に関して染色した。照明および未証明の細胞の間には顕著な境界が観察できた。β−ガラクトシダーゼを発現する細胞として測定された機能的Ｃｒｅリコンビナーゼ活性を有する細胞はウェルの照明された半分に限局していた（図３Ｂ）。この系においては、Ｃｒｅリコンビナーゼ活性、即ちｌａｃＺ発現は光依存性の態様で制御される。
これらの結果は、Ｃｒｅリコンビナーゼの活性が短いアルギニン含有タグをそれに添加することにより制御され、即ちＲ９−Ｃｒｅリコンビナーゼ融合蛋白の場合と同様であることを示している。Ｃｒｅリコンビナーゼ活性は細胞が照明されるまでは蛍光標識されたオリゴヌクレオチド（複合体形成に機能するいずれかのオリゴヌクレオチドまたは他の核酸）との複合体内で封鎖される。さらに、このようなタグの添加は、蛋白の活性を精密に制御するための一般的方法において使用できる。このことは蛋白の活性化が細胞刺激後の数分間に起こる場合には、細胞シグナリング事象に関与する蛋白の操作のために特に有用である。
実施例６
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達および活性化
６．１ 材料および方法
ルシフェラーゼ遺伝子を発現する安定な２９３細胞系と国際公開公報第Ｆｌｐ−Ｉｎシステムを用いて製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取扱説明書に従って構築した。Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓのルシフェラーゼ（ＧＬ２変異体）のヌクレオチド１５３〜１７３に対して指向された２１ｂｐのｓｉＲＮＡを使用した。このｓｉＲＮＡは配列５’−ＣＧＵＡＣＧＣＧＧＡＡＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’（配列番号１７）を有している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ．Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８（２００１））。ＧＦＰに対して指向された２１ｂｐのｓｉＲＮＡを用いて遺伝子発現（５’−ＣＡＣＵＵＧＵＣＡＣＵＡＣＵＵＵＣＵＣ−３’）（配列番号１８）に対するｓｉＲＮＡ送達の非特異的作用を制御した。各ｓｉＲＮＡはさらに３’ＴｄＴオーバーハングを有し、Ｘｅｒａｇｏｎ，Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ２０８７４）より入手した。
処理の前に、細胞はＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ中、６０〜８０％コンフルエントとなるまで２４穴プレート中（０．５ｍｌ培地／ウェル）で生育させた。細胞の各ウェルにつき、１００ｐｍｏｌのｓｉＲＮＡを１００μｌｏｐｔｉＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した。２μｌリポフェクタミン２０００を１００μｌｏｐｔｉＭＥＭ倍地中個別に希釈した。５分後、希釈したリポフェクタミン２０００およびｓｉＲＮＡを合わせ、室温で３０分間インキュベートした後に細胞に適用した。
各ｓｉＲＮＡ１００ｐｍｏｌを２００ｐｍｏｌのＦＩＴＣ−Ｒ９ペプチドとあわせた。本実験に使用したＦＩＴＣ−Ｒ９は５および６ＦＩＴＣのＮ末端標識のＲ９の混合物であった。細胞および照明への複合体の適用は、照明および非照明の半分を有するプレート１枚ではなく細胞の個別のプレート２枚を使用した以外は前述の実施例においてＶＰ２２−Ｃｒｅの送達および活性化に関して記載した通りに実施した。１枚のプレートは照明せずに３７℃のインキュベーター中に維持した。２枚目のプレートは上記した通り処理し、２４時間インキュベーターに戻した。次に細胞溶解物を調製し、ＥＧ＋Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄマイクロプレート照度計ＬＢ９６Ｖを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。
６．２ 結果
表６（下記）に示すとおり、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡを用いた場合にルシフェラーゼ発現の光依存性減少が観察された。ルシフェラーゼ活性は、ｓｉＲＮＡをリポフェクタミン２０００を用いて送達した場合に観察されたものと同様であった。
Figure 2006517790
 実施例７
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の送達および活性化−種々の蛍光標識ペプチドの比較
実験は製造元の取扱説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＦｌｐ−Ｉｎシステムを用いて構築したルシフェラーゼフェ遺伝子を発現する安定なＢＨＫ細胞系統を使用した以外は実施例６に記載したとおりに実施した。蛍光標識Ｒ９ペプチドはルシフェラーゼ活性の光依存性ノックダウンをもたらすルシフェラーゼレポーター遺伝子の対するｓｉＲＮＡを送達する能力に関して評価した。Ｒｐペプチドの特定の標識変法の作用を試験した。４種のＮ末端標識Ｒ９ペプチドを作成するために４種の蛍光標識試薬、即ち、下記構造：
Figure 2006517790
 を有する５−フルオレセインスクシンイミジルエステル（５−ＦＡＭ）、６−フルオレセインスクシンイミジルエステル（６−ＦＡＭ）、５−フルオレセインイソチオシアネート（５−ＦＩＴＣ）および６−フルオレセインイソチオシアネート（６−ＦＩＴＣ）を使用した。
蛍光標識されたＲ９ペプチドはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（慣用的な合成により製造）より入手した。しかしながら、Ｎ末端標識Ｒ９ペプチドは知られた方法および市販の試薬または標識キットを用いて調製することができる。
ＦＩＴＣ標識Ｒ９ペプチドにおいては、Ｒ９ペプチドをチオ尿素結合を介して連結し、ＦＡＭ標識Ｒ９ペプチドにおいては、Ｒ９ペプチドはカルボキシアミド結合：
Figure 2006517790
 を介して連結されている。
実施例６と同様、各ｓｉＲＮＡ１００ｐｍｏｌをフルオレセイン標識Ｐ９ペプチドの各々２００ｐｍｏｌと合わせた。細胞および照明への複合体の適用は、照明および非照明の半分を有するプレート１枚ではなく細胞の個別のプレート２枚を使用した以外は前述の実施例においてＶＰ２２−Ｃｒｅの送達および活性化に関して記載した通りに実施した。１枚のプレートは照明せずに３７℃のインキュベーター中に維持した。２枚目のプレートは上記した通り処理し、２４時間インキュベーターに戻した。次に細胞溶解物を調製し、ＥＧ＋Ｇ Ｂｅｒｔｈｏｌｄマイクロプレート照度計ＬＢ９６Ｖを用いてルシフェラーゼ活性を測定した。照明後の処理細胞における平均のルシフェラーゼレポーター活性を表７に示す。
Figure 2006517790
 これらの結果は、ペプチドおよび蛍光分子の間の結合が蛍光標識転位ペプチドを用いて細胞内に送達されたヌクレオチドの送達および／または放出の効率に影響することができることを示している。
実施例８
プラスミドＤＮＡの送達
ＦＩＴＣ−Ｒ９ペプチドとプラスミドＤＮＡとの間の複合体をＡ−５４９細胞に送達して光依存的に分散できるかどうかを調べるために、以下の実験をプラスミドｐＣＭＶ・ＳＰＯＲＴ−βｇａｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。本プラスミドはトランスフェクション効率をモニタリングするためのレポーターベクターとして使用できる。プラスミドはＥ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）遺伝子、哺乳類細胞におけるβ−ｇａｌの高発現のＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを真核細胞のｍＲＮＡの適切なプロセシングを指向したβ−ｇａｌ遺伝子の下流に含有する。
一定範囲のプラスミドの量、即ち０．５μｇ〜３．７５ｎｇをＦＩＴＣ−Ｒ９ペプチド５ｐｍｏｌと混合し、細胞に適用した。細胞内複合体は１２．５ｎｇおよび６．２５ｎｇのプラスミドを使用した場合にのみ観察された。照明の前に、細胞の５％が複合体を含んでいた。光照明の後には、ほぼ全ての複合体が再分布していた。
これらの結果はＦＩＴＣ−Ｒ９ペプチドとプラスミドの複合体が形成され、光照明の後に解離することを示している。
実施例９
オリゴヌクレオチドの化学媒介再分布
クロロキンを倍地中終濃度１００ｕＭで添加した以外は前述の実施例に記載した通りＣＨＯ細胞にＦＩＴＣ−Ｒ９ペプチドおよびｒａｆ対照オリゴヌクレオチドを含有する複合体を投与した。３７℃で１６時間インキュベートした後、細胞を蛍光顕微鏡で可視化した。細胞の約５０％において蛍光が細胞内に均一に分散して観察された。各細胞における分布は光照明の結果として再分布が観察された実験で観察されたものと同様に観察された。
実施例１０
トランスフェクション剤および低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
表４に記載した非限定的なトランスフェクション剤の例を前述の実施例に記載した細胞送達分子および複合体と組み合わせて使用できる。これらの薬剤はまたＲＮＡｉ分子を送達するためにそれ自体使用できる。例えばリポフェクタミンＴＭ２０００が哺乳類細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトするために使用されており（Ｇｉｔｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１８：３７９−３８０，２００２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：６０４７−６０５２，２００２）、そしてオリゴフェクタミンＴＭがＨｅｌａ細胞にｓｉＲＮＡをトランスフェクトするために使用されている（Ｅｌｂａｓｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４１１：４９４−４９８，２００１；Ｈａｒｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ１１４：４５５７−４５６５，２００１）。
細胞にｓｉＲＮＡを導入するためにこれらのトランスフェクション剤を使用する場合は一般的に以下のガイドラインを使用しなければならに。まず細胞は約３０〜約５０％コンフルエントとなった時点でトランスフェクトしなければならない。第２に抗生物質は細胞死を誘発する場合があるためトランスフェクションの最中には添加してはならない。第３に旨適結果を得るためには、トランスフェクション剤はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に希釈した後にｓｉＲＮＡとあわせなければならない。
実施例１１
マルチウェルフォーマット
本明細書に記載した化合物、組成物および方法を用いてマルチウェルフォーマット、例えば２４−、４８−、９６−または３８４−ウェルプレートで細胞をトランスフェクトすることができる。以下の操作法はリポフェクタミンＴＭ２０００またはオリゴフェクタミンＴＭを用いた細胞内へのｓｉＲＮＡのトランスフェクションを説明しており、そして、いずれかの他の核酸またはトランスフェクション剤またはそれらの組み合わせと共に使用する場合にも適合できる。
いずれの操作法においても、予め調製した以下の材料、即ち目的のｓｉＲＮＡ（２０ｐｍｏｌ／ｕｌ）；予め加温したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；および２４穴組織培養プレートおよび他の組織培養材を保有しなければならない。トランスフェクトすべき細胞は約３０〜約５０％コンフルエントとし、細胞集団はトランスフェクションの前に測定して少なくとも約９０％の生存細胞が含まれるようにする。
以下の操作法を用いて２４穴フォーマットにおいて哺乳類細胞をトランスフェクトする。他の組織培養フォーマットでトランスフェクトするには、それらのフォーマットに対する旨適条件は２４ウェルフォーマットに関する本明細書に記載したものとは異なる場合がある。
１０．１ リポフェクタミンＴＭ２０００
ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＣＨＯ−１またはＡ５４９細胞をトランスフェクトするためには、提案されるトランスフェクション条件に関する表８を参照する。典型的には、これらの条件を用いたＲＮＡｉ試験においては、安定に組み込まれたレポーター遺伝子または内因性遺伝子の発現の≧５０％、好ましくは≧７０％、より好ましくは≧８０％、最も好ましくは≧９０％の減少がトランスフェクション後約２４〜約４８時間までに観察される。
Figure 2006517790
 １．トランスフェクションの１日前に、抗生物質を含有しない生育培地０．５ｍｌ中に細胞をトランスフェクション時点で約３０〜約５０％コンフルエントとなるようにプレーティングする。
２．各トランスフェクション試料につき、以下に記載するとおりｓｉＲＮＡ：リポフェクタミンＴＭ２０００複合体を調製する。
（ａ）血清非含有のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（または他の血清非含有の培地）５０ｍｌ中にｓｉＲＮＡの適切な量を希釈する。穏やかに混合する。
（ｂ）使用前にリポフェクタミンＴＭ２０００を穏やかに混合し、次に適切な量をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ（または他の血清非含有の培地）５０ｕｌ中に希釈する。穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートする。注意：３０分以内に希釈ｓｉＲＮＡと希釈リポフェクタミンＴＭ２０００をあわせる。より長いインキュベーション時間は活性を低下させる場合がある。Ｄ−ＭＥＭをリポフェクタミンＴＭ２０００のための希釈剤として使用する場合は、５分以内に希釈ｓｉＲＮＡと混合する。
（ｃ）５分間のインキュベートの後、希釈ｓｉＲＮＡを希釈リポフェクタミンＴＭ２０００とあわせる（総容量は１００ｍｌ）。穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートする。
３．各ウェルにｓｉＲＮＡ／リポフェクタミンＴＭ２０００の混合物１００ｍｌを添加する。例えばプレートを前後に揺らすなどして穏やかに混合する。
４．細胞が遺伝子発現について試験できるようになるまで約２４〜約７２時間ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートする。複合体の除去や培地の交換は一般的に必要ではないが、生育培地はトランスフェクション活性を消失することなく約４〜約６時間の値に交換しても良い。
１０．２ オリゴフェクタミンＴＭ
典型的には、以下の条件を用いたＨｅＬａ細胞のＲＮＡｉ試験においては、安定に組み込まれたレポーター遺伝子または内因性遺伝子の発現の≧５０％、好ましくは≧７０％、より好ましくは≧８０％、最も好ましくは≧９０％の減少がトランスフェクション後約２４〜約４８時間までに観察される。
１．トランスフェクションの１日前に、抗生物質を含有しない生育培地０．５ｍｌ中に細胞をトランスフェクション時点で約５０％コンフルエントとなるようにプレーティングする。
２．各トランスフェクション試料につき、以下に記載するとおりｓｉＲＮＡ：オリゴフェクタミンＴＭ複合体を調製する。
（ａ）血清非含有のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ（または他の血清非含有の培地）５０ｕｌ中にｓｉＲＮＡの６０ｐｍｏｌを希釈する。穏やかに混合する。
（ｂ）使用前にオリゴフェクタミンＴＭを穏やかに混合し、次に，３ｕｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標） Ｍｅｄｉｕｍ（または他の血清非含有の培地）１２ｕｌ中に希釈する。穏やかに混合し、室温で５分間インキュベートする。
（ｃ）５分間のインキュベートの後、希釈ｓｉＲＮＡを希釈オリゴフェクタミンＴＭとあわせる（総容量は６８ｕｌ）。穏やかに混合し、室温で２０分間インキュベートする。
３．各ウェルにｓｉＲＮＡ／オリゴフェクタミンＴＭの混合物６８ｕｍｌを添加する。例えばプレートを前後に揺らすなどして穏やかに混合する。
４．細胞が遺伝子発現について試験できるようになるまで約２４〜約７２時間ＣＯ２インキュベーター中３７℃でインキュベートする。複合体の除去や培地の交換は一般的に必要ではないが、生育培地はトランスフェクション活性を消失することなく約４〜約６時間の値に交換しても良い。
当業者の知るとおり本発明は目的の遂行のためおよび記載した目標および利点を得るために、そして、それに固有のものを得るために十分適合させることができる。本明細書に記載した組成物および輸送可能な複合体および方法、操作法、治療、分子および特定の化合物は本発明の特定の特徴の現時点での代表であり、従って例示に過ぎず、そして本発明の範囲を限定する意図はない。代替、等価、変形例および他の使用は当業者の知るとおりであり、本発明の精神の範囲内にあり、添付する請求項の範囲により定義されるものである。当業者の知るとおり種々の置き換えおよび変更を本発明の範囲および精神から外れることなく本明細書に開示した本発明に対して行ってよい。
本明細書において説明的に記載した本発明は本明細書に特に開示しないいずれかの要素、条件の非存在下にも実施してよい。即ち、例えば本明細書における各々の例において、「含む」、「より本質的になる」および「よりなる」という用語は他の２者のいずれとも置き換えてよい、使用した用語および表現は説明の用語として使用しており、限定するものではなく、そして、そのような用語および表現の使用においては説明し、記載した特徴またはその部分の如何なる等価物も除外するような意図はなく、むしろ種々の変更が請求項に記載した本発明の範囲内で可能である。即ち、本発明を本明細書において特記したが、本明細書に開示した概念の任意の特徴、変更および変動は当業者により再分類され、そして、このような変更および変動は添付する請求項により定義される本発明の範囲内にある者とする。さらにまた、本発明の特性または特徴がＭａｒｋｕｓｈグループの用語において記載される場合は、当業者の知るとおり本発明はＭａｒｋｕｓｈグループのいずれかの個々のメンバーまたはメンバーの置換基グループの用語において記載できるものとみなす。
本発明を本明細書において広範にそして包括的に記載した。包括的な開示内に含まれるより狭い物質種および下位の分類もまた本発明の部分を構成する。これは抽出されたものが特に本明細書において説明されているかどうかに関わらず、属からいずれかの要件を除去する但し書きまたは負の制限を伴った本発明の包括的記載包含する。本発明の他の特徴は添付する請求項内に包含される。
本明細書において言及した全ての出版物、特許および特許出願は本発明が関与する技術分野の当業者の水準を示すものであり、ここの出版物、特許または特許出願が個々に参考文献として組み込まれるが如く同様の範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用した参考文献は少なくとも部分において本明細書に組み込まれるものであり、これにより、種々の手法の詳細（例えば合成方法および試験方法）および物質（例えば転位ペプチド、生物活性分子または他の複合体成分）の入手元を提示するものである。
図１はＣＨＯ細胞における［ＦＩＴＣ標識オリゴヌクレオチド：Ｒ９ペプチド］複合体の光胃活性化再分布の経時変化を示す。 図２はペプチドＲ９またはＶＰ２２を使用して送達された抗ｒａｆオリゴを用いて治療された細胞のＢｒｄＵ標識を示す。細胞核の染色は活性ＤＮＡ合成および細胞周期の振興によるＢｒｄＵの取り込みを示す。「＋」という符号は５分間細胞が照射されたことを示し、「−」は細胞が照射されなかったことを示す。 図３はＶＰ２２−Ｃｒｅ／ＦＩＴＣオリゴ複合体を用いたｌａｃＺレポーター遺伝子の光依存性活性化を示す。パネルＡは実験に使用したＤＮＡコンストラクトを示す。これらのコンストラクトにおいて、ｌａｃＺ ＯＲＦは転写ターミネーター（ｉｎｔ）を含有する介在配列によりＣＭＶプロモーターから隔離されている。パネルＢはｌａｃＺの発現の照射後のパターンを示す（パネルの上部の点描部）。照射および未照射の細胞の間の顕著な境界がｌａｃＺレポーター遺伝子で一過性にトランスフェクトされた細胞においてみとめられる。

Claims (117)

  1. 細胞にポリペプチドを送達する方法であって、以下：
    （ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該ポリペプチド、核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程
    を包含する、方法。
  2. 前記処理が照射を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチド、前記核酸、前記蛍光分子、および、前記細胞送達分子の２つ以上を前記接触の前に混合する、請求項１に記載の方法。
  4. 前記細胞送達分子が細胞送達ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  5. 前記細胞送達ポリペプチドが合成ペプチドである、請求項４に記載の方法。
  6. 前記ポリペプチドが、前記細胞送達ポリペプチドをさらに含む融合蛋白内に含まれる、請求項４に記載の方法。
  7. 前記融合蛋白がさらに副次的ポリペプチドを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記副次的ポリペプチドがその反応体の１つまたはその生成物の１つとして核酸を有する酵素である、請求項７に記載の方法。
  9. 前記副次的ポリペプチドがリコンビナーゼである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記リコンビナーゼが部位特異的リコンビナーゼである、請求項９に記載の方法。
  11. 前記核酸が前記部位特異的リコンビナーゼにより認識される少なくとも１つの部位を含む、請求項９に記載の方法。
  12. 前記細胞送達ポリペプチドが：
    （ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍ％は約５０％〜１００％であるものを含み；
    （ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは２〜約７５のいずれかの整数であるものを含み；そして、これに加えて、または、代替として、
    （ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）によりコードされる蛋白のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列を有する、
    請求項４に記載の方法。
  13. 前記ポリペプチドがリコンビナーゼである、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記リコンビナーゼが部位特異的リコンビナーゼである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記核酸が前記部位特異的リコンビナーゼにより認識される少なくとも１つの部位を含む、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記細胞送達ポリペプチドが約１０．５〜約１４のｐＩを有する、請求項４に記載の方法。
  17. 前記ｎ連続塩基性アミノ酸の配列を有するオリゴペプチドが約１０．５〜約１４のｐＩを有する、請求項１２に記載の方法。
  18. 前記蛍光分子が蛍光ポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
  19. 前記ポリペプチドが前記蛍光ポリペプチドをさらに含む融合蛋白内に含まれる、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記蛍光分子が蛍光ポリペプチドである、請求項４に記載の方法。
  21. 前記蛍光ポリペプチドが前記ポリペプチド、および、これに加えて、または、代替として、前記蛍光ポリペプチドをさらに含む融合蛋白内に含まれる、請求項２０に記載の方法。
  22. １つ以上の前記ポリペプチド、細胞送達ポリペプチドおよび前記蛍光ポリペプチドが副次的ポリペプチドをさらに含む融合蛋白内に含まれる、請求項２０に記載の方法。
  23. 前記副次的ポリペプチドがその反応体の１つまたはその生成物の１つとして核酸を有する酵素である、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記細胞送達分子が核酸結合蛋白である、請求項１に記載の方法。
  25. 前記核酸結合蛋白がヒストン、ヒストン様蛋白およびポリ−Ｌリジン、ならびに、これらの組み合わせおよびそれらの誘導体よりなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記ポリペプチド、前記核酸、前記蛍光分子、および、前記細胞送達ポリペプチドの２つ以上を前記接触の前に混合する、請求項４に記載の方法。
  27. 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
  28. 細胞にポリペプチドを送達する方法であって、以下：
    （ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該ポリペプチド、核酸、蛍光分子、細胞送達分子およびトランスフェクション剤に接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程、
    を包含する、方法。
  29. 前記ポリペプチド、前記核酸、前記蛍光分子、および、前記細胞送達分子の２つ以上を前記接触の前に混合する、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記蛍光分子および前記細胞送達分子の１つ以上がポリペプチドである、請求項２８に記載の方法。
  31. 少なくとも１つの蛍光分子および少なくとも１つの細胞送達分子を含むキット。
  32. 少なくとも１つのトランスフェクション剤、少なくとも１つの細胞、少なくとも１つの核酸、少なくとも１つの取扱説明書のセット、および、少なくとも１つの光照明装置、および、場合によりこれらのための電源よりなる群から選択される１つ以上の要素をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
  33. 前記細胞送達分子および前記蛍光分子の１つまたは両方がポリペプチドである、請求項３１に記載のキット。
  34. 前記細胞送達ポリペプチドおよび前記蛍光ポリペプチドが融合蛋白内に含まれる、請求項３３に記載のキット。
  35. 少なくとも１つのＲＮＡｉ分子をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
  36. １つ以上の細胞をさらに含む、請求項３１に記載のキット。
  37. 前記細胞がトランスフェクションまたは形質転換に対してコンピテントである、請求項３６に記載のキット。
  38. 前記細胞がダイサーを発現または過剰発現する、請求項３６に記載のキット。
  39. 少なくとも１つのトランスフェクション剤および少なくとも１つのＲＮＡｉ分子を含むキット。
  40. １つ以上の細胞、１つ以上のリコンビナーゼ、１つ以上の組み換え蛋白および１つ以上の取扱説明書のセットよりなる群から選択される１つ以上の要素をさらに含む、請求項３９に記載のキット。
  41. 細胞送達ポリペプチドおよび細胞により取り込まれる工程が望ましい薬剤を含み、該細胞送達ポリペプチドは蛍光部分を含む複合体。
  42. 細胞により取り込まれる工程が望ましい前記薬剤の活性が前記複合体内において抑制される、請求項４１に記載の複合体。
  43. 前記薬剤が一旦前記複合体から解離すると、前記薬剤が活性化される、請求項４２に記載の複合体。
  44. 前記複合体からの前記細胞送達ポリペプチドの解離が光活性化可能である、請求項４１に記載の複合体。
  45. 前記複合体からの細胞により取り込まれる工程が望ましい前記薬剤の解離が光活性化可能である、請求項４１に記載の複合体。
  46. 核酸をさらに含む、請求項４１に記載の複合体。
  47. 前記核酸が約５塩基〜約２００キロ塩基を含む、請求項４１に記載の複合体。
  48. 前記核酸がｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項４６に記載の複合体。
  49. 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項４６に記載の複合体。
  50. 前記核酸が１つ以上の化学修飾を含む、請求項４６に記載の複合体。
  51. 前記核酸が細胞により取り込まれる工程が望ましい薬剤である、請求項４６に記載の複合体。
  52. 前記細胞送達ポリペプチドが副次的ポリペプチドとの融合蛋白内に含まれる、請求項４６に記載の複合体。
  53. 前記副次的ポリペプチドが生物学的に活性である、請求項５２に記載の複合体。
  54. 前記副次的ポリペプチドが、アフィニティータグ、エピトープ、プロテアーゼ切断部位、検出可能なポリペプチド、酵素、ホルモン、受容体リガンド、受容体フラグメントおよび抗体または抗体誘導体よりなる群から選択される、請求項５３に記載の複合体。
  55. 前記蛍光部分が蛍光ポリペプチドである、請求項４１に記載の複合体。
  56. 前記蛍光ポリペプチドが第２のポリペプチドとの融合蛋白内に含まれる、請求項５５に記載の複合体。
  57. 前記副次的ポリペプチドが前記細胞送達ポリペプチドである、請求項５２に記載の複合体。
  58. １つ以上のトランスフェクション剤をさらに含む、請求項４１に記載の複合体。
  59. １つ以上のリコンビナーゼ、および、これに加えて、または、代替として、組み換え蛋白をさらに含む、請求項４１に記載の複合体。
  60. 請求項５９に記載の複合体を含むキット。
  61. 細胞に核酸を送達する方法であって、以下：
    （ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該蛍光分子および該細胞送達分子の一方または両方からの該核酸の解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程、
    を包含する、方法。
  62. 前記処理が照射を含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 前記核酸が前記処理の後に生物学的に活性である、請求項６１に記載の方法。
  64. 前記核酸が前記処理の後に前記細胞の原形質内に分散される、請求項６１に記載の方法。
  65. 前記核酸が約５塩基〜約２００キロ塩基を含む、請求項６１に記載の方法。
  66. 前記核酸がｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
  67. 前記核酸がオリゴヌクレオチドである、請求項６１に記載の方法。
  68. 前記核酸が１つ以上の化学修飾を含む、請求項６１に記載の方法。
  69. 前記蛍光分子が前記核酸に結合していない請求項６１に記載の方法。
  70. 前記蛍光分子が前記細胞送達分子に結合している、請求項６１に記載の方法。
  71. 前記細胞送達分子が細胞送達ポリペプチドである、請求項６１に記載の方法。
  72. 前記細胞送達ポリペプチドが合成ペプチドである、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記細胞送達ポリペプチドが：
    （ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍ％は約５０％〜１００％であるものを含み；
    （ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは２〜約７５のいずれかの整数であるものを含み；そして、これに加えて、または、代替として、
    （ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）によりコードされる蛋白のアミノ酸配列中に存在しないアミノ酸配列を有する、
    請求項７１に記載の方法。
  74. 前記細胞送達ポリペプチドが融合蛋白内に含まれる、請求項７１に記載の方法。
  75. 前記融合蛋白がさらに副次的ポリペプチドを含む、請求項７４に記載の方法。
  76. 前記副次的ポリペプチドがその反応体の１つまたはその生成物の１つとして核酸を有する酵素である、請求項７５に記載の方法。
  77. 前記副次的ポリペプチドがリコンビナーゼである、請求項７６に記載の方法。
  78. 前記リコンビナーゼが部位特異的リコンビナーゼである、請求項７７に記載の方法。
  79. 前記核酸が前記部位特異的リコンビナーゼにより認識される少なくとも１つの部位を含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 前記核酸が蛋白またはその一部をコードする配列を包含する、請求項６１に記載の方法。
  81. 前記配列が前記細胞の蛋白の一部のアミノ酸配列をコードし、該蛋白またはその一部をコードする細胞核酸が該配列により望ましく置き換えられる、請求項８０に記載の方法。
  82. 前記蛋白が前記細胞において発現される、請求項８０に記載の方法。
  83. 前記細胞送達ポリペプチドが約１０．５〜約１４のｐＩを有する、請求項７３に記載の方法。
  84. 前記ｎ連続塩基性アミノ酸の配列を有するオリゴペプチドが約１０．５〜約１４のｐＩを有する、請求項７３に記載の方法。
  85. 前記蛍光分子が蛍光ポリペプチドである、請求項６１に記載の方法。
  86. 前記蛍光分子が蛍光ポリペプチドである、請求項７１に記載の方法。
  87. 前記蛍光分子および前記蛍光送達分子が融合蛋白内に含まれるポリペプチドである、請求項８６に記載の方法。
  88. 細胞に核酸を送達する方法であって、以下：
    （ａ）該細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、該核酸、蛍光分子、細胞送達分子およびトランスフェクション剤に接触させる工程；ならびに
    （ｂ）該蛍光分子および該細胞送達分子の１つ以上からの該核酸の解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程
    を包含する、方法。
  89. 前記核酸、前記蛍光分子、および、前記細胞送達分子の２つ以上を前記接触の前に混合する、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記蛍光分子および前記細胞送達分子の１つ以上がポリペプチドである、請求項８８に記載の方法。
  91. １つ以上の核酸、１つ以上の蛍光団、および、１つ以上の細胞送達ポリペプチドを含む分子複合体であって、各細胞送達ポリペプチドが、
    （ａ）ｍ％塩基性アミノ酸、ただしここでｍ％は約１０％〜１００％であるものであり；
    （ｂ）ｎ連続塩基性アミノ酸の配列、ただしここでｎは２〜５０のいずれかの整数であるものを含み；そして、
    （ｃ）単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）蛋白に由来しない、
    複合分子複合体。
  92. 前記蛍光団が前記核酸または前記細胞送達ポリペプチドに共有結合している、請求項９１に記載の分子複合体。
  93. 請求項９１に記載の分子複合体を含む、組成物。
  94. トランスフェクション剤、トランスフェクション増強剤およびエンドソーム崩壊剤よりなる群から選択される１つ以上の薬剤をさらに含む、請求項９３に記載の組成物。
  95. 請求項９１に記載の分子複合体を含む、細胞。
  96. 請求項９５に記載の細胞を含む、組成物。
  97. 前記組成物を凍結した後に前記細胞が生存性を維持している、請求項９６に記載の組成物。
  98. 前記組成物がグリセロールを含む、請求項９７に記載の組成物。
  99. 請求項９１に記載の分子複合体を含む、容器。
  100. 請求項９１に記載の分子複合体および薬学的に許容される賦形剤または担体を含む、医薬組成物。
  101. １つ以上の前記核酸、前記ポリペプチドおよび前記蛍光団が生物学的に活性である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  102. 前記核酸が生物学的に活性である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  103. 前記生物学的に活性な核酸がｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１０２に記載の医薬組成物。
  104. 前記ポリペプチドが生物学的に活性である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  105. 疾患または障害に罹患した個体の治療方法であって、該方法が請求項９１に記載の複合体、請求項９３に記載の組成物、または、請求項１００に記載の医薬組成物に該個体を接触させる工程を包含する、方法。
  106. 電磁気照射に前記個体を曝露する工程をさらに含む、請求項１０５に記載の方法。
  107. 遺伝子療法を必要とする個体に、該療法を提供する方法であって、該個体またはその個体に由来する細胞を請求項９１に記載の複合体、請求項９３に記載の組成物、または、請求項１００に記載の医薬組成物に接触させる工程を包含する、方法。
  108. 試験化合物への細胞の応答を測定する方法であって、以下：
    （ａ）第１の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第１の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させる工程；
    （ｂ）第２の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第２の核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子に接触させる工程；
    （ｃ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程；
    （ｄ）（ａ）の前；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の最中；（ａ）と（ｂ）との間；（ｂ）と（ｃ）との間；および、これに加えて、または、代替として、（ｃ）の後に該試験化合物に該細胞を接触させる工程；
    （ｅ）該細胞からの細胞応答に相当するシグナルを検出する工程；ならびに
    （ｆ）該第１の細胞からのシグナルを該第２の細胞からのシグナルと比較する工程
    を包含する、方法。
  109. 前記細胞の１つ以上が１つ以上のレポーター遺伝子を含む、請求項１０８に記載の方法。
  110. １つ以上の前記核酸、前記細胞送達分子、および、前記蛍光団が生物学的に活性である、請求項１０８に記載の方法。
  111. 前記核酸が生物学的に活性である、請求項１０８に記載の方法。
  112. 前記生物学的に活性な核酸がｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１１１に記載の方法。
  113. 予め選択された活性または作用を有する化合物を発見する方法であって、以下：
    （ａ）第１の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第１の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させる工程；
    （ｂ）第２の細胞を、いずれかの順序または組み合わせにおいて、第２の核酸、蛍光分子、および、細胞送達分子に接触させる工程；
    （ｃ）該核酸、該蛍光分子、および、該細胞送達分子の１つ以上からの該ポリペプチドの解離をもたらす処理により該細胞を処理する工程；
    （ｄ）（ａ）の前；（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の最中；（ａ）と（ｂ）との間；（ｂ）と（ｃ）との間；および、これに加えて、または、代替として、（ｃ）の後に該試験化合物に該細胞を接触させる工程；
    （ｅ）該細胞からの細胞応答に相当するシグナルを検出する工程；ならびに
    （ｆ）該第１の細胞からのシグナルを該第２の細胞からのシグナルと比較する工程；
    を包含し、
    ここで該第２の細胞からのシグナルとの第１の細胞からのシグナルの相違が該予め選択された活性または作用に相当する、方法。
  114. 前記細胞の１つ以上が１つ以上のレポーター遺伝子を含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. １つ以上の前記核酸、前記細胞送達分子、および、前記蛍光団が生物学的に活性である、請求項１１３に記載の方法。
  116. 前記核酸が生物学的に活性である、請求項１１３に記載の方法。
  117. 前記生物学的に活性な核酸がｍＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＰＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド分子、プラスミド、人工染色体、遺伝子療法コンストラクト、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、制限フラグメント、リボザイム、アンチセンスコンストラクトおよびこれらの組み合わせよりなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
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