KR20180095694A - 핵산 올리고머 및 이의 용도 - Google Patents

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드렉 리차드
케네스 오브린
로라 크로프트
샘 비어드
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퀸스랜드 유니버시티 오브 테크놀로지
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Abstract

폐암, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암 및 골암 세포를 포함하는 암세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하기 위한, 핵산 올리고머 화합물 및 그의 조성물의 용도 및 방법을 개시한다.

Description

핵산 올리고머 및 이의 용도
본 출원은 2015 년 12 월 23 일자로 출원 된 "핵산 올리고머 및 그 용도"라는 명칭의 호주 가출원 제 2015905380 호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용된다.
본 발명은 일반적으로 핵산 올리고머 화합물, 및 전립선, 폐, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암 및 골암 세포를 포함하는 암세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하기위한 조성물 및 방법에서 이들의 용도에 관한 것이다.
암은 세계적으로 단일한 가장 큰 건강 문제이다. 2030 년까지 전세계의 모든 사망자의 절반이 암으로 인한 것이며 우리의 평생 동안 암을 앓을 수 있는 수학적 기회는 현재 70 %에 달할 것으로 추산된다.
약물 개발은 많은 난제를 겪었다. 화학 요법 약물은 직접 또는 세포 분열의 억제를 통해 주로 게놈 안정성을 표적으로 한다. 모든 암은 게놈 불안정성을 나타내므로 이러한 약물은 세포를 세포 사멸 또는 괴사로 밀어 넣을 수 있다. 그러나 화학 요법 약물은 환자의 정상 세포에 독성을 나타내며 대다수의 환자는 이러한 약물에 내성을 갖는다. 암 치료가 특정 약제 학적 돌연변이가 있는 종양 단백에 의해 유도되는 환자의 아형에 대한 것이었다. 예로 유방암에서의 HER2 과발현, 폐암에서의 EGFR 돌연변이 및 ALK 재배열이 있다. 최근에는 고형 종양의 일부에 대해 효과가 있는 CTLA4 및 PD1 / PDL1 경로를 표적으로 하는 면역 검사 점 저해제가 개발되었지만 이러한 억제제의 대부분은 종양의 일부에 대해서만 효과적이며, 환자는 그들에게 불응해진다.
암의 치료 또는 예방에 대한 새로운 접근법에 대한 당 업계의 긴급한 요구가 남아있다.
본 발명은 특정한 주쇄(backbone, 백본) 화학 및 염기 조성을 갖는 특정 길이의 핵산 올리고머 화합물이 DNA 수리 및/또는 RNA 분자의 핵내 방출과 관련된 세포 단백질에 단백질 합성 기계에 결합 할 수 있다는 발견에 기초한다. 놀랍게도, 이들 화합물은 전립선, 폐, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암 또는 골암과 관련된 종양 세포를 포함하여 종양 세포의 증식을 현저하게 억제하거나 사멸을 자극 할 수 있음이 또한 밝혀졌다. 이러한 발견은 이후에 기술되는 바와 같이 신규한 화합물, 조성물 및 방법에서 실행하기 위해 감소되었다.
이에 따라, 일실시예에서, 본 발명은 종양 세포 (예를 들어, 인간 종양 세포와 같은 포유류 종양 세포)의 증식, 생존 또는 생존을 억제하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 종양 세포에 다음을 특징으로 하는 핵산 올리고머를 도입, 구성 또는 필수적으로 포함한다 :
a) 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합(phosphorothioate internucleoside linkages) 을 포함하는 백본(backbone)
b) (i) 적어도 약 50 %의 퓨린 함량, 또는 (ii) 적어도 약 50 %의 구아노신-시토신 (GC) 함량으로 적어도 약 45 %의 퓨린 함량; 및
c) 14 개 이상의 핵염기 및 29 개 이하의 핵염기의 길이,
상기 올리고머는 THO 복합 서브 유닛 4 (THOC4) 단백질 및 단일 가닥 DNA- 결합 단백질 1 (SSB1) 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 것을 특징으로 한다.
적어도 약 45 %의 대표적인 퓨린 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 6 개의 퓨린, 15- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 개의 퓨린, 16- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 개의 퓨린, 적어도 8 개의 퓨린 17- 핵 염기 올리고머에서, 18- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 개의 퓨린, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 개의 퓨린, 20- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 개의 퓨린, 21- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 개의 퓨린 , 22- 핵 염기 올리고머에서 10 개 이상의 퓨린, 23- 핵 염기 올리고머에서 10 개 이상의 퓨린, 24- 핵 염기 올리고머에서 11 개 이상의 퓨린, 25- 핵 염기 올리고머에서 11 개 이상의 퓨린, 26- 핵 염기 올리고머, 27- 핵 염기 올리고머에서 12 개 이상의 퓨린, 28- 핵 염기 올리고머에서 13 개 이상의 퓨린 및 29- 핵 염기 올리고머에서 13 개 이상의 퓨린을 포함한다.
적어도 약 50 %의 대표적인 퓨린 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 개의 퓨린, 15- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 개의 퓨린, 16- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 개의 퓨린, 적어도 9 개의 퓨린 17- 핵 염기 올리고머에서, 18- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 개의 퓨린, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 개의 퓨린, 20- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 개의 퓨린, 21- 핵 염기 올리고머에서 적어도 11 개의 퓨린 23-핵 염기 올리고머에서 12 개 이상의 퓨린, 24- 핵 염기 올리고머에서 12 개 이상의 퓨린, 25- 핵 염기 올리고머에서 13 개 이상의 퓨린, 13 개 이상의 퓨린, 26- 핵 염기 올리고머, 27- 핵 염기 올리고머에서 14 개 이상의 퓨린, 28- 핵 염기 올리고머에서 14 개 이상의 퓨린, 29- 핵 염기 올리고머에서 15 개 이상의 퓨린을 포함한다.
적어도 약 50 %의 대표적인 GC 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 7G / C 이상, 15- 핵 염기 올리고머에서 8G / C 이상, 16- 핵 염기 올리고머에서 8G / C 이상, 17- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9G / C, 18- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9G / C, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10G / C, 20- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10G /C, 21-핵 염기 올리고머에서 11 G / C 이상, 22-핵 염기 올리고머에서 11 G / C 이상, 23-핵 염기 올리고머에서 12 G / C 이상, 24- 핵 염기 올리고머에서 12 G/C 이상, 25- 핵 염기 올리고머에서 적어도 13G / C, 26- 핵 염기 올리고머에서 적어도 13G / C, 27- 핵 염기 올리고머에서 적어도 14G / C, 28- 핵 염기 올리고머에서 적어도 14 G/C, 29- 핵 염기 올리고머에서 적어도 15G / C를 나타낸다.
일부 실시 태양에서, 올리고머는 핵에서 종양 세포의 세포질(cytoplasm)로의 mRNA의 전이(translocation)를 차단한다는 것을 추가로 특징으로 한다.
일부 실시 양태에서, 올리고머는 비 - 종양 세포에 의한 그의 흡수와 비교하여 종양 세포에 의해 우선적으로 흡수되는 것을 특징으로 한다.
적절하게는, 올리고머는 종양 세포의 세포 사멸 또는 괴사를 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 올리고머는 비 - 종양 세포보다 종양 세포와 동일한 유형의 종양 세포를 더 많이 사멸시킨다.
특정 실시 양태에서, 올리고머는 THO4 및 SSB1 중 하나 또는 둘 모두와 적절하게는 본원에서 정의 된 조건 하에서 대조 올리고머보다 높은 친화성으로 결합한다는 것을 추가로 특징으로 한다.
올리고머의 종양 세포로의 도입은 생체 내 또는 시험 관내에서 발생할 수 있다.
적합하게는, 백본의 뉴클레오시드 간 결합의 적어도 약 70 %는 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합(phosphorothioate internucleoside linkages)을 포함한다. 특정 실시 태양에서, 백본의 모든 인터뉴클레오시드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함한다.
일부 구체 예에서, 올리고머는 적어도 약 45 ℃의 용융 온도 (Tm)를 갖는 것을 특징으로 한다.
일부 실시 양태에서, 올리고머의 주쇄는 본원에서 "2'-O- 알킬 뉴클레오시드"(예를 들어, 2'-O- 메틸 뉴클레오시드)로도 지칭되는 하나 이상의 2'-O- 알킬 변형 당 잔기(2’-O-alkyl modified sugar moiety)를 포함한다. 특정 예에서, 올리고머는 적어도 하나의 2'-O- 메틸 리보뉴클레오시드를 포함한다. 적합하게는, 올리고머의 뉴클레오시드의 적어도 약 50 %는 각각 2'-O- 알킬 뉴클레오시드 (예 : 2'-O- 메틸 뉴클레오시드)이다. 특정 실시 양태에서, 올리고머의 모든 뉴클레오시드는 각각 2'-O- 알킬 뉴클레오 시드(예컨대, 2'-O- 메틸 뉴클레오시드)이다.
일부 구체 예에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵산 염기 서열은 전사체에 대한 실질적인 상보성이 결여되어있다. 적절하게는 약 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % 올리고머의 핵 염기의 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %는 전사체와 염기쌍을 형성 할 수 있다. 이러한 타입의 예시적인 예에서, 전사체와 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵 염기의 95 % 이하를 갖는 14 내지 29 핵염기의 올리고머는 전사체의 기준 핵 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍을 형성 할 수 없는 적어도 하나의 비상 보적인 핵 염기를 갖는다. 다른 예시적인 예에서, 전사체와 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵염기의 90 % 이하인 14 내지 29 핵 염기의 올리고머는 예를 들어하기 표 1로부터 계산 된 바와 같이 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3 개의 비 - 상보 적 핵 염기를 가지며, 이들은 전 사체의 기준 핵 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍을 형성 할 수 없다.
일부 실시 양태에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 종양 세포가 적절하게 유래된 포유 동물의 게놈에 실질적인 상보성이 결여되어있다. 적절하게는 약 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % 올리고머의 핵 염기의 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %는 게놈과 염기쌍을 형성 할 수 있다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 게놈과 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵 염기가 95 % 이하인 14 내지 29 뉴 클레오 염기의 올리고머는 게놈의 기준 핵 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍이 형성되지 않는 적어도 하나의 비 상보적인 핵 염기를 갖는다. 다른 예시적인 예에서, 게놈과 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵 염기의 90 % 이하를 갖는 14 내지 29 핵 염기의 올리고머는 예를 들어 하기 표 1로부터 계산 된 바와 같이 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3 개의 비 - 상보 적 핵 염기를 가지며, 이는 게놈의 기준 핵산 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍을 형성 할 수 없다.
일부 실시 양태에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 종양 세포가 적절하게 유래된 포유류의 게놈에 대한 상동성이 결여되어있다. 적합하게는, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 게놈에서 기준 핵 염기 서열을 정의하는 임의의 동일한 길이의 인접한 핵 염기와 약 95 %, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 게놈의 기준 핵 염기 서열과 95 % 이하의 서열 동일성을 갖는 14 내지 29 뉴 클레오 염기의 올리고머는 기준 핵 염기 서열의 매칭 위치에서 핵 염기와 동일하지 않거나 동등하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력(nucleobase-pairing ability)을 갖지 않는 하나 이상의 핵 염기를 갖는다. 다른 예시적인 예에서, 게놈의 기준 핵 염기 서열과 90 % 이하의 서열 동일성을 갖는 14 내지 29 핵 염기의 올리고머는 예를 들어 하기 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3 핵 염기를 가지며, 이는 기준 핵 염기 서열의 매칭 위치에서 핵 염기와 동일하지 않거나, 또는 동일하거나 동등한 핵 염기 - 쌍 형성 능력을 갖지 않는다.
전사체에 대한 실질적인 상보성이 없거나 게놈에 대한 실질적인 상보성 또는 상동성이 결여된 올리고머 화합물은 본원에서 "비-표적화 올리고머"로 지칭된다. 일부 실시 태양에서, 본 발명의 비-표적화 올리고머는 하기 SEQ ID NO 의 하나로 선택된 핵염기 서열을 포함한다. SEQ ID NO : 1, 2, 3, 5, 7, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 91, 92, 93, 94, 98, 100, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 138, 143, 144, 145, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 191, 192, 196, 198, 203, 206, 207, 209, 210, 211, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 258, 259, 261, 263, 264, 265, 269, 270, 271, 272, 274, 277, 281, 282, 283, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 295, 296, 298, 300, 301 및 303.
다른 실시 양태에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 선택된 유전자의 안티센스 가닥에 실질적인 상보성을 갖는다. 이들 구체 예에서, 핵산 염기 서열은 고도의 엄격한 조건 하에서 선택된 유전자에 의해 코딩되는 전 mRNA 또는 mRNA 분자를 포함하여, 선택된 유전자 또는 그의 전사물의 표적 서열에 적절하게 상보적이며 하이브리드화 된다. 이 유형의 올리고머 화합물은 또한 본원에서 "안티센스 올리고머"로 지칭된다. 일부 실시 양태에서, 본 발명의 안티센스 올리고머는 SEQ ID NO 가운데 하나로 선택된 핵염기 서열을 포함한다. SEQ ID NO : 6, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28 29, 31, 32, 33, 34, 35, 101, 278, 279, 280, 284, 285, 288, 289, 297 및 299.
이들 올리고머는 종양 세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하는 중요한 활성을 갖는다. 그러나 이들 중 일부는 다른 것보다 더 높은 억제 활성을 가지며, 바람직한 구체예에서, 올리고머는 하기 SEQ ID NO 가운데 하나로 선택된 핵염기 서열을 갖는다. SEQ ID NO : 1, 2, 3, 5, 6, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 32, 31, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 44, 52, 56, 53, 54, 59, 61, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 91, 92, 93, 98, 100, 103, 104, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 135, 143, 144, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 180, 181, 182, 191, 192, 203, 224, 225, 226, 227, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 245, 247, 251, 252, 253, 258, 259, 261, 263, 264, 269, 271, 272, 274, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 및 303. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 올리고머는 하기 SEQ ID NO 가운데 하나로 선택된 핵염기 서열을 갖는다.
종양 세포는 악성이든 양성이든 간에 신생 세포 성장 및 증식을 갖는 임의의 세포 일 수 있다. 그것은 전-암 또는 암이 될 수 있다. 특정 실시 양태에서, 종양 세포는 전립선, 폐, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암 또는 골 종양 세포로부터 선택된다.
올리고머 화합물은 THOC4 및 hSSB1 중 하나 또는 둘 모두에 우선적으로 결합하거나 친화력을 갖는다. THOC4 및 SSB1 단백질은 바람직하게는 인간(즉, hTHOC4 및 hSSB1)이다. 특정 실시 양태에서, 올리고머 화합물은, 적합하게는 37 ℃에서 10 mM 트리스-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 함유하는 수용액에서, 약 50 nM 이하의 KD로 THOC4 (예, hTHOC4)에 우선적으로 결합하고 및/또는 약 3 nM 이하의 KD를 갖는 SSB1(예 : hSSB1)에 결합한다.
본 발명의 또 다른 양태는 상기 한 바와 같이 넓게 및 본 명세서의 다른 곳에서 올리고머를 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기에서 광범위하게 기술된 올리고머 및 본 명세서의 다른 부분을 포함하는 약학 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태는 대상(환자)에게 암을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 일반적으로 상기에서 광범위하게 기술된 바와 같은 유효량의 올리고머를 대상에게 투여하는 것으로 본질적으로 구성, 또는 구성되거나, 포함한다.
암은 피부, 조직, 기관, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 암을 포함하는 고형 종양 또는 혈액 매개 종양 일 수 있다. 암은 원발성 암 또는 전이성 암일 수 있습니다. 특정 실시 양태에서, 암은 전립선 암, 폐암, 췌장암, 유방암, 자궁 경부암 및 골암으로부터 선택된다.
일부 실시 양태에서, 상기 방법은 항 감염 제 (항생제, 항균제, 항 곰팡이 제, 항문 양제, 항 말라리아제, 항 결핵 제 및 항 바이러스제 등으로부터 선택됨), 화학 요법 제 (예를 들어, 항 증식 성 / 항신 생물성 약물, 세포 증식 억제제, 암 세포 침윤을 억제하는 제제, 성장 인자 기능의 억제제, 항 혈관 신생 제, 혈관 손상 제제 등으로부터 선택됨) 및 면역 요법 제 (예컨대, 사이토 카인, 사이토킨 - 발현 세포, 항체 등) 중에서 선택된 하나 이상의 보조제를 올리고머와 동시에 투여하는 단계를 포함한다.
도 1은 표시된 다양한 세포 라인의 밝은 필드 현미경 이미지를 나타낸 사진이다. 이미지는 컨트롤(대조군) 올리고머 또는 비-표적 올리고머 트랜스펙션 후 16-36 시간에 촬영했다. 비-표적화 올리고머 화합물("LSA")은 대조군 올리고뉴클레오타이드가 형질 전환 된 세포와 비교하여 순응도 상실 및 낮은 confluency에 의해 나타난 바와 같이 세포 생존 능력에 유의한 영향을 미쳤다.
도 2는 100 nM의 ctrl, In2E2LSA, In3E3LSA, E3E4LSA, ATGLSA 올리고머 화합물 및 모든 4 개의 LSA 서열 (오직 HeLa 세포)의 혼합으로 형질 감염된 HeLa 및 U2OS 세포의 웨스턴 블럿(Western blot)을 나타내는 사진이다. 트랜스펙션 24 시간 후 세포를 수확했다. 세포 손상의 지표로서의 PARP 절단은 γH2AX 유도가 DNA 손상의 표지자로서 LSA 형질 감염 세포에서 분명했다. hSSB1 단백질 수준은 LSA 형질 감염 후 다양한 범위로 감소했다. Actin은 loading control로 사용되었다.
도 3은 LSA 및 ASO로 형질 감염된 U2OS 세포에서 세포 사멸의 유도를 나타내는 사진이다. Western blot은 PARA 절단과 관련이 있는 H2AX의 인산화를 보여 주며, 독성 LSA / ASO로 형질 감염된 세포에서 DNA 손상 및 세포 사멸의 유도를 확인한다. hSSB1 단백질 수준은 또한 독성 LSA / ASO로 형질 감염시킨 후에 고갈된다. Actin은 loading control로 사용되었다.
도 4는 비 효과적인 올리고 뉴클레오타이드 (대조군)와 비교하여 가장 효과적인 LSA, ATGLSA 또는 In3LSA (약물)를 갖는 여러 암세포 라인을 이용한 치료를 나타내는 그래픽 표현이다. 세포 성장은 IncuCyte에 의해 72 시간 동안 측정되었다.
도 5는 THOC4 및 hSSB1 EMSA를 보여주는 사진 및 그래픽 표현이다. EMSAs는 THA4 (A)와 hSSB1 (B) 단백질의 증가하는 농도 대 10nmol의 FAM- 표지 LSA_In3E3 또는 음성 대조 (Neg_C)를 나타낸다. 낮은 밴드는 자유로운 결합되지 않은 올리고를 나타내고, 높은 밴드와 스미어는 단백질에 결합 된 올리고를 나타내고, 3 회 EMSA 실험의 (C) 정량화는 단백질에 결합 된 올리고의 백분율로 표현된다. 정제 된 hSSB1 또는 THOC4 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.01 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 100 ng / μL BSA.로 구성된 완충액에서 37 ℃에서 15 분 동안 10 nmol의 표지 올리고와 함께 배양하였다. TBE 완충액 중 10 % PAGE 겔에서 80 분간 4 ℃에서 60 분간 전기 영동으로 시료를 분리 하였다
도 6은 ASO 또는 LSAs (100nM)로 형질 감염된 HeLa-BCL2 세포에서의 GFP 발현 검정을 나타내는 그래프이다. 세포 사멸 (ATGLSA, In3LSA, In3LSACU 등) 및 낮은 GFP 형광을 유도하는 올리고머 화합물 간의 상관 관계가 관찰된다. CTRL, NEGC, NEGC GAP, NEGC 50 nM, In3LSA_CT5, OPEN_LSA1, CDCA3_LSA_IN2E2와 같은 비 죽음 유도 올리고 뉴클레오티드는 GFP 플라스미드 (GFP)로만 형질 감염된 세포에 비해 GFP 형광에 유의한 영향을 미치지 않는다. GFP 형광의 감소는 유전자 발현의 억제를 나타내며, mRNA 전좌의 억제와 일치한다.
도 7은 IN3LSA 올리고머 화합물이 핵으로부터 폴리 A mRNA의 방출을 억제한다는 것을 보여주는 사진이다. HeLa BCL2 세포를 FAM 표지 된 IN3LSA 올리고머 화합물 또는 NEGC 올리고 뉴클레오타이드로 형질 감염시키고 mRNA FISH를 트랜스펙션 후 24 시간에 수행 하였다. PolyA mRNA는 적색으로 염색되었으며 DAPI는 핵을 염색하기 위해 사용되었다.
도 8은 최적의 올리고머 화합물 길이를 결정하기 위한 스크린의 결과를 나타내는 그래픽 표현이다. 올리고머 화합물은 모 서열의 5 '또는 3'말단으로부터 시간에 1bp만큼 단계적으로 절단되었다. 데이터는 세포 사멸의 마커로서 응축 핵을 갖는 세포의 백분율이다 (데이터는 각 플레이트에 대한 최소 및 최대 점수로 0-1, 0 = 가장 낮은 사망률, 1 = 가장 높은 사망률로 정규화되었다).
도 9는 퓨린 함유량이 세포 사멸과 상관 관계가 있음을 나타내는 그래프이다. 도트는 세포 독성 마커 (핵 응축 및 PI 양성 염색)를 비교한다. 데이터는 HeLa 및 U2OS 세포 사이에서 평균화되고 각 플레이트에 대한 최소 및 최대 점수로 정규화되었다 (0 = 가장 낮은 PI 양성, 1 = 가장 높은 PI 양성).
도 10은 세포사 유도 효과가 있는 올리고머 화합물 IN3LSA (In3, 회색 삼각형) 및 ATGLSA (ATG, 흰색 다이아몬드) 대 비-효과적인 대조군 올리고 뉴클레오티드 (ctrl) 및 PBS (흑색 점)를 4 주에 걸쳐 투여(주 2 회 정맥 내 주사)로 처리 한 SCID 마우스의 종양 성장 지연을 나타내는 그래프이다. 그래프는 그룹당 최소 7 마리의 마우스 +/- SEM에 대한 종양 부피의 평균 변화를 나타낸다. 별은 통계적으로 유의하게 감소 된 종양 부피를 나타낸다.(ANOVA, α = 0.05, * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001, **** P <0.0001)
도 11은 올리고머 화합물 IN3LSA (In3, 회색 삼각형)와 ATGLSA (ATG, white diamonds) 대 비-효과적인 대조군 올리고 뉴클레오타이드 (ctrl)와 PBS (black dots)를 4 주간 (주 2 회 정맥 주사) 투여로 처리 된 SCID 마우스의 체중 변화를 나타내는 그래프이다. 그래프는 그룹당 최소 7 마리의 마우스에 대한 평균 체중 변화 +/- SEM을 나타낸다. 검은 색 화살표는 치료 시작을 나타낸다.
도 12는 IN3LSA (In3, 마우스 # 110H-1, 119J-2 및 84A-3, 좌측 패널) 및 ATGLSA (ATG)에 대해 가장 감소 된 종양을 갖는 3 마리 마우스에 대한 중량 변화를 나타내는 그래프이다. , 생쥐 # 114I-1, 120J-3, 91C-2, 우측 패널)에서 4 주 치료 후 대조군과 PBS를 비교하였다.
도 13은 Cy5.5 표지화 된 In3LSA 올리고머 화합물로부터의 시간 경과에 따른 종양 부위에서의 형광 신호를 나타내는 그래프이다. 정맥 내 (i.v.) 전달은 종양 부위에서 강력하고 지속적인 신호를 나타내는 반면, 신호 포스트 복강 내 (i.p.) 주입은 종양 부위에서 검출 불가능하다.
도 14는 IN3LSA가 투여 된 마우스의 전체 동물 영상을 보여주는 사진이다. 확립 된 종양 (체적 ~ 900mm3)을 가진 한 마리의 마우스에게 20mg / kg의 용량으로 IN5LSA로 표지 된 Cy5.5의 단일 정맥 주사를 투여 하였다. 이미지는 올리고머 화합물과 관련된 신호가 명확하게 관찰 될 수 있는 사후 주입과 동물 사후 주입을 보여준다. 주사 후 8 일째에 절제 된 종양이 또한 보여진다.
도 15는 포스 포로 티오 에이트 화학에서 네거티브 컨트롤 서열 (Neg_C) 또는 포스포로티오에이트 (PS) 또는 포스포디에스테르 (PD) 화학에서 hSSB1 단백질의 증가하는 농도 대 5nM의 FAM- 표지 된 LSA_In3E3 서열을 나타내는 hSSB1 EMSA의 그래픽 표현이다. 그래프는 단백질에 결합 된 올리고머 화합물의 분율로 표현되는 적어도 3 회의 실험의 정량을 나타낸다. 정제 된 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM KCl, 0.01 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 50 ng / μL BSA로 구성된 완충액에서 37 ℃에서 15 분 동안 5 nM의 표지 올리고머 화합물과 함께 배양 하였다. TBE 완충액 중 15 % PAGE 겔상에서 4 분 동안 80V에서 120 분 동안 전기 영동에 의해 샘플을 분리 하였다
도 16은 포스포로티오에이트 화학에서 hSSB2 단백질의 증가하는 농도 대 5nM의 FAM- 표지 된 LSA_In3E3 서열 또는 음성 대조군 서열 (Neg_C)을 보여주는 단일 EMSA의 그래픽 표현이다. 그래프는 단백질에 결합된 올리고의 분율을 나타낸다. 정제된 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM KCl, 0.01 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 50 ng / μL BSA로 구성된 완충액 중에서 37 ℃에서 15 분 동안 5 nM의 표지 올리고와 함께 배양하였다 . TBE 완충액 중 15 % PAGE 겔상에서 4 분 동안 80V에서 120 분 동안 전기 영동에 의해 샘플을 분리하였다.
도 17은 올리고머 화합물에 결합하는 hSSB1의 분자 시뮬레이션이 더 큰 hSSB1 결합 친화도를 갖는 서열을 스크리닝하는데 사용될 수 있음을 예시하는 개략도 및 그래픽 표현이다. A. 황색의 ATGLSA 올리고머 및 청색의 비 변형 RNA 서열. B. 핑크색의 NEGC 올리고머 및 청색의 비 변형 된 RNA 서열. C. 200 ~ 500 ps 사이의 안정한 입체 구조로부터 생성 된 평균 SSB- 올리고머 화합물 결합 에너지. D. 1 ns 시뮬레이션을 통해 변형되지 않은 RNA 염기 서열과 비교하여 각 올리고의 결합 에너지. E_binding = E (complex) - [E (수용체) + E (리간드)]로 계산 된 결합 에너지
도 18은 ATGLSA (ATG) 올리고머 화합물이 폐암 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다. H460 폐암 피하 종양을 가진 수컷 SCID 마우스를 정맥 내 꼬리 정맥 / 역 궤도 주사를 통해 매주 2 회 4 주 동안 80mg / kg의 비히클 대조군 PBS (개방 도트, n = 7) 또는 ATGLSA 올리고머 (어두운 삼각형, n = 8)로 처리 하였다. 그래프는 치료 과정 중 종양 부피의 평균 변화율 (+/- sem)을 보여준다. **** : 양방향 ANOVA에서 P 값 <0.0001.
도 19는 대조 PBS 또는 ATGLSA (ATG) 올리고머 화합물로 처리 한 부모 폐 H460 이종 이식의 생물 발광 이미징을 보여주는 사진이다. 암세포 루시퍼 라제 활성의 마우스 종양 생물 발광 신호는 시작 전과 치료 후 16 일에 측정되었다. SCID 수컷은 IVIS 시스템으로 신호 획득 15 분 전에 D- 루시페린 200 μL 복강 내 주사를 받았다. 3 개의 대표적인 마우스가 PBS 처리 그룹 (A, B 및 C) 및 ATGLSA (ATG) 처리 그룹 (D, E 및 F)에 대해 (상부 패널) 처리 16 일 (하부 패널)에 도시된다. 열 신호는 발광 규모를 나타낸다.
도 20은 대조군 PBS 대 ATGLSA (ATG) 처리 된 마우스 (부모 H460 종양 모델)의 체중 모니터링을 나타내는 그래프이다. 각 동물은 연구 과정 동안 매주 두 번 무게를 달았다. 그래프는 PBS로 처리 한 코호트 (열린 점) 및 ATGLSA (ATG)로 처리 한 코호트 (검은 삼각형)의 치료 첫 날과 비교 한 체중 변화 (+/- sem)의 평균 백분율을 나타낸다.
도 21은 ATGLSA 올리고머 화합물로 처리 한 후의 부모 및 시스플라틴 내성 폐 H460 암 세포 증식을 나타내는 그래프이다. H460 부모 (H460 P, 도트) 세포 및 시스플라틴 내성 (H460 R, 사각형) 세포를 대조 PBS (개방 기호) 대 100 nM ATGLSA (어두운 기호)로 처리 하였다. 증식율은 24 시간 및 48 시간에 세포의 confluency가 초기 세포 confluency (+/- sem)로 보고된 것에 의해 계산된다.
도 22는 ATGLSA (ATG) 올리고머 화합물이 시스플라틴 내성 폐암 이종 이식 모델에서 종양 성장을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다. 피하 H460 시스플라틴 내성 종양을 갖는 수컷 SCID 마우스를 정맥 내 꼬리 정맥 / 역 궤도 주사를 통해 매주 2 회 4 주 동안 80 mg / kg에서 비히클 대조군 PBS (개방 도트, n = 6) 또는 ATGLSA 올리고머 (ATG, 검정 삼각형, n = 6)로 처리 하였다. 그래프는 치료 과정 중 종양 부피의 평균 변화율 (+/- sem)을 보여준다. ** : 양방향 ANOVA에서 P 값 <0.01.
도 23은 대조군 PBS 또는 ATGLSA (ATG) 올리고머 화합물로 처리 된 시스플라틴 내성 폐 H460 이종 이식의 생물 발광 이미징을 보여주는 사진 사진이다. 암세포 루시퍼 라제 활성으로부터의 마우스 종양 생물 발광 신호를 치료 18 일전 및 18 일째에 측정 하였다. SCID 수컷은 IVIS 시스템으로 신호 획득 15 분 전에 D- 루시페린 200 μL 복강 내 주사를 받았다. 3 개의 대표적인 마우스가 PBS 처리 그룹 (A, B 및 C) 및 ATGLSA (ATG) 처리 그룹 (D, E 및 F)에 대해 (상부 패널) 처리 16 일 (하부 패널)에 도시된다. 열 신호는 발광 규모를 나타낸다.
도 24는 시스플라틴 내성 H460 종양 모델의 대조군 PBS 대 ATGLSA (ATG) 처리 마우스의 체중 모니터링을 나타내는 그래프이다. 각 동물은 연구 과정 동안 매주 두 번 무게를 달았다. 그래프는 PBS로 처리 한 코호트 (열린 점) 및 ATGLSA (ATG)로 처리 한 코호트 (검은 삼각형)의 치료 첫 날과 비교 한 체중 변화 (+/- sem)의 평균 백분율을 나타낸다.
도 25는 시스플라틴 - 민감성 H460 폐 이종 이식에 대한 ATGLSA (ATG) 치료 효과의 장기 평가를 보여주는 카플란 - 마이어 (Kaplan-Meier) 그래프이다. 수컷 SCID 마우스는 ATGLSA (80mg / kg)로 종양이 최대 최종 부피 인 1000mm3에 도달 할 때까지 (캘리퍼스 측정에 의해 측정) 치료 시작부터 모니터되었다. ** 순위 - 로그 분석에서 P 값은 0.01 미만.
도 26은 시스플라틴 - 내성 H460 폐 이종 이식에 대한 ATGLSA (ATG) 치료 효과의 장기간 평가를 보여주는 카플란 - 마이어 (Kaplan-Meier) 그래프이다. 수컷 SCID 마우스를 ATGLSA (80mg / kg)로 종양이 최종 최대 부피 인 1000mm3에 도달 할 때까지 (캘리퍼스 측정에 의해 결정됨) 치료 시작부터 모니터링 하였다.
도 27은 ATGLSA (ATG) 올리고머 화합물이 폐 종양 이종 이식 모델에서 종양 성장을 감소시키는 것을 나타내는 그래프이다. 피하 종양을 지닌 수컷 SCID 마우스를 ATGLSA 올리고머 (ATG, 녹색 삼각형, n = 5), 시스플라틴 (검은 색 다이아몬드) 또는 ATGLSA + 시스플라틴 (적색 사각형)의 조합으로 3 주 동안 처리 하였다 (점선). 각 그룹에 대한 처리는 4 주째에 전환되었다 : 조합 동물을 대조군 PBS로 처리하고, ATGLSA 동물을 시스플라틴으로 처리하고, 시스플라틴 동물을 ATGLSA로 처리하였다. 그래프는 치료 과정 중 종양 부피의 평균 변화율 (+/- sem)을 보여준다. **** : 양방향 ANOVA에서 P 값 <0.0001.
도 28은 H460 종양 모델에서 대조군 PBS, ATGLSA (ATG), 시스플라틴 및 ATGLSA + 시스플라틴 (Combo) 처리 된 마우스의 중량 모니터링을 나타내는 그래프이다. 각 동물은 연구 과정 동안 매주 두 번 무게를 달다. 그래프는 PBS 치료 코호트 (열린 파란색 점), ATGLSA (ATG), Cisplatin 치료 코호트 (녹색 삼각형), Cisplatin, ATGLSA 치료 코호트 치료 첫날과 비교 한 체중 변화 (+/- sem)의 평균 백분율을 나타낸다. (검정색 다이아몬드)와 ATGLSA + Cisplatin (Combo)을 합친 다음 PBS로 처리 한 코호트 (적색 사각형)를 사용했다.
1. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 발명의 목적을 위해, 하기 용어가 아래에 정의된다.
물품 "a"및 "an"은 본 명세서에서 물품의 문법적 목적물 중 하나 또는 둘 이상 (즉, 적어도 하나)을 언급하는데 사용된다. 예로서, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
본 명세서에서 사용 된 "및 / 또는"은 관련 목록에 나열된 항목 중 하나 이상의 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대체 (또는)로 해석 될 때 조합의 부족을 가리키며 포함한다.
또한, 양, 투여 량, 시간, 온도, 활동, 수위, 수, 빈도, 백분율, 크기, 크기, 양, 체중, 위치와 같은 측정 가능한 값을 언급 할 때 본원에서 사용 된 용어 "약" 용량, 시간, 온도, 활성도 등의 ± 15 %, ± 10 %, ± 5 %, ± 1 %, ± 0.5 % 또는 ± 0.1 %의 편차를 포함하는 것을 의미한다. 레벨, 수, 빈도, 백분율, 치수, 크기, 양, 중량, 위치, 길이 등을 포함 할 수 있다.
값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한과 다른 명시된 또는 상한 사이에서 문맥 상 명확하게 달리 지시되지 않는 한, 각각의 개재 된 값, 하한 단위의 1/10까지 이해되는 것으로 이해된다. 그 명시된 범위에서 개재 된 값은 본 발명에 포함된다. 이들 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 작은 범위에 포함될 수 있으며, 또한 명시된 범위에서 임의로 특별히 배제 된 한계에 따라 본 발명에 포함된다. 언급 된 범위가 한도 또는 두 제한을 포함하는 경우, 포함 된 한도를 제외한 범위도 본 발명에 포함된다.
약제가 세포막을 통한 수동 확산 이외의 메카니즘에 의해 세포 내로 진입 할 수 있는 경우, 약제는 "포유 동물 세포에 적극적으로 흡수된다". 예를 들어, ATP- 의존성 수송 메카니즘에 의한 포유 동물 세포 막을 가로 지르는 물질의 수송을 의미하는 "능동 수송 (active transport)"에 의해, 또는 "촉진 된 수송"에 의해 수송 될 수 있다. 세포막은 수송 단백질에 대한 제제의 결합을 필요로 하는 수송 메카니즘에 의해 결합되어 막을 가로 지른 결합제의 통과를 용이하게 한다. 능동적 또는 촉진 된 전달을 위해, 본 발명의 올리고머는 알몸이거나, 엔도사이토틱 메카니즘에 의해 세포 내로 도입 될 수 있는 양이온성 지질 또는 리포좀과 복합체 화 된 음이온 백본을 갖는 제제와 같은 복합체 형태로 제제화 될 수 있다. 올리고머는 또한 기재된 바와 같이 표적 숙주 세포 내로의 운반을 용이하게 하기 위해 예를 들어 그의 5 '또는 3' 말단에 아르기닌이 풍부한 펩티드, 예를 들어 HIV TAT 단백질의 일부 또는 폴리 알기닌과 접합될 수있다 (Moulton Bioconjug Chem, 2004, 15 (2) : 290-299, Nelson et al., Bioconjug Chem, 2005, 16 (4) : 959-966). 상기 화합물은 또한 안티센스 활성 및/또는 세포 흡수를 증진시키기 위해 하나 이상의 양이온 성 결합을 가질 수 있다.
"동시 투여"또는 "병용 투여"또는 "공동 투여"등과 같은 용어는 2 종 이상의 활성제를 함유하는 단일 조성물의 투여 또는 별도의 조성물로서 각각의 활성제의 투여 및 / 또는 전달 된 것을 지칭한다. 유효 결과가 모든 활성제가 단일 조성물로서 투여되는 경우에 수득되는 것과 동등한 짧은 시간 내에 동시 적으로 또는 동시에 또는 순차적으로 분리 된 경로에 의해 투여 될 수 있다. "동시에(simultaneously)"는 활성제가 실질적으로 동일한 시간에, 바람직하게는 함께 동일한 제형으로 함께 투여되는 것을 의미한다. "동시에(contemporaneously)"란 활성제가 제 시간에 밀접하게 투여되는 것을 의미하며, 예를 들어 한 약제는 약 1 분 내지 약 하루 전후로 약 1 일 이내에 투여된다. 동시대의 시간이 유용하다. 그러나, 동시에 투여되지 않을 때, 약제는 약 1 내지 약 8 시간 이내 및 적절하게는 약 1 내지 약 4 시간 미만 내에 투여되는 경우가 종종있다. 동시 투여 될 때, 약제는 피험자의 동일한 부위에서 적절하게 투여된다. "동일한 부위"라는 용어는 정확한 위치를 포함하지만, 약 0.5 내지 약 15 센티미터, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 5 센티미터 내에 있을 수있다. 본원에 사용 된 용어 "개별적으로"는 약제가 일정 간격, 예를 들어 약 1 일 내지 수주 또는 수개월 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 활성제는 어느 순서로 투여 될 수있다. 본원에서 사용 된 용어 "순차적"은 약제가 순차적으로, 예를 들어, 분 또는 시간, 수 일 또는 수주의 간격 또는 간격으로 투여되는 것을 의미한다. 적절한 경우, 활성 작용제는 규칙적인 반복 사이클로 투여 될 수 있다.
본원에 사용 된 용어 "친화성(affinity)"은 두 분자의 비 - 무작위 상호 작용을 나타낸다. 친화력 또는 상호 작용의 강도는 해리 상수(KD)로 정량적으로 표현 될 수 있다. 결합 친화성은 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명의 올리고머는 대조군 올리고머보다 표적 분자 (예 : THOC4 또는 SSB1)에 대해 더 높은 친화성을 가지며, 따라서 대조군 올리고머에 비해 표적 분자에 우선적으로 결합한다. 예를 들어, 본 발명의 올리고머 화합물은 약 50 nM 이하의 KD로 THOC4 (예 : hTHOC4)와 결합하고 및/또는 37 ℃에서 10nM 트리스 -HCl (pH8.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 수용액에서 약 3nM 이하의 KD로 SSB1 (예 : hSSB1)와 결합한다.
본원에 사용 된 용어 "알킬"은 24 개 이하의 탄소 원자를 함유하는 포화 된 직쇄 또는 분지 쇄 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 알킬기의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소 프로필, n- 헥실, 옥틸, 데실 및 도데 실 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 알킬기는 전형적으로 1 내지 약 6 개의 탄소 원자, 보다 전형적으로는 1 내지 약 3 개의 탄소 원자를 포함하고, 1 내지 약 2 개의 탄소 원자가보다 바람직하다. 본원에서 사용 된 알킬기는 임의로 하나 이상의 추가의 치환기를 포함 할 수 있다.
용어 "부수적 인 작용제"는 목적하는 약리학 적 및 / 또는 생리 학적 효과를 유도하는 화합물을 포함한다. 이 용어는 또한 염, 에스테르, 아미드, 프로 드러그, 활성 대사 물, 유사체 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 본원에서 구체적으로 언급 된 화합물의 약학 적으로 허용 가능한 및 약리학 적 활성 성분을 포함한다. 상기 용어가 사용되는 경우, 이는 활성 약제 그 자체뿐만 아니라 약학 적으로 허용 가능한 약리학 적 활성 염, 에스테르, 아미드, 프로 드러그, 대사 산물, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해해야 한다. "보조제"라는 용어는 좁은 것으로 해석되지는 않지만 소분자, 펩타이드, 폴리 펩타이드 및 단백질과 같은 단백질 성 분자뿐만 아니라 이들을 포함하는 조성물 및 RNA, DNA 및 모방 체 및 이들의 화학적 유사체 및 세포 작용제와 같은 유전 분자에까지 확장된다. "보조제"라는 용어는 폴리 펩타이드를 생산 및 분비 할 수있는 세포뿐만 아니라 그 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리 뉴클레오타이드를 포함한다. 예를 들어, 세포는 B7.1 또는 4-1BBL과 같은 면역 자극 분자를 발현하는 구조물이 도입 된 종양 세포 일 수있다. 따라서, 용어 "부수적 인 작용제"는 바이러스 또는 비 - 바이러스 벡터, 발현 벡터 및 세포 범위에서의 발현 및 분비를위한 플라스미드와 같은 벡터를 포함하는 핵산 구조물로 확장된다.
용어 "안티센스"는 뉴클레오타이드 잔기의 서열이 핵산 (예를 들어, DNA 또는 RNA) 이중 가닥의 센스 가닥에서 데옥시뉴클레오타이드 잔기의 서열에 대해 5 '에서 3'방향으로 역방향 인 뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. DNA duplex의 "sense strand"는 자연 상태의 세포가 "sense mRNA"로 전사하는 DNA duplex의 strand를 의미한다. 따라서 "antisense"서열은 전형적으로 DNA 이중 가닥의 비 암호화 사슬과 상동성이 있다.
용어 "안티센스 올리고머"및 "안티센스 화합물"은 안티센스 올리고머가 표적 핵산 서열에 하이브리드화되게 하는 핵 염기 및 서브 유닛 대 서브 유닛 주쇄의 표적화 서열을 갖는 화합물을 지칭하기 위해 상호 교환 적으로 사용되고, 타겟 핵산 서열 내에 RNA : 올리고머 또는 DNA : 올리고머 헤테로 이중체를 형성하기 위해 왓슨 - 크릭 (Watson-Crick) 염기쌍을 포함하는 염기쌍 화에 의해 수행 될 수 있다. 안티센스 올리고머는 전형적으로 표적 핵산 서열에서 상응하는 연속 염기에 수소 결합하는데 효과적인 백본에 의해 지지되는 퓨린 및 피리 미딘 복 소환 염기 서열을 포함한다. 백본은 전형적으로 그러한 수소 결합을 허용하는 위치에서 퓨린 및 피리 미딘 복 소환 염기를 지지하는 서브 유니트 백본 모이어티로 구성된다. 이러한 골격 부분은 길이가 5 내지 7 원자인 환형 잔기이며, 인-함유 결합에 의해 1 내지 3 개의 원자가 연결된다. 안티센스 올리고머는 전형적으로 mRNA 및 miRNA 및 폴리 펩타이드와 같은 핵산 발현 산물을 포함하는 유전자 발현 산물의 합성을 방해한다. 일반적으로, 안티센스 올리고머의 표적화 서열은 표적 유전자의 "센스"가닥에 상응하는 표적 서열 (예를 들어, DNA, mRNA (프리 -mRNA 포함) 분자와 같은 폴리 뉴클레오티드) 분자에 결합한다. 안티센스 올리고머는 예를 들어 인트론, 엑손, 5 '또는 3' 비번역 영역을 포함하는 표적 유전자 또는 핵산 발현 산물의 임의의 영역에 결합 할 수 있다. 예를 들어, 입체 차단제로 작용하는 안티센스 올리고머는 스플라이스 접합, 5 '비번역 영역 또는 핵산 표적 분자의 시작 영역 내에 우선적으로 결합한다. RNase H를 활성화시킴으로써 작동하는 안티센스 올리고머는 바람직하게는 표적 핵산의 인트론, 엑손, 5 '비번역 영역 또는 3' 비번역 영역 내에서 결합한다.
본원에 사용 된 용어 "캡 구조"또는 "말단 캡 부분"은 올리고머 화합물의 말단 중 하나 또는 둘 모두에 부착 될 수 있는 화학적 변형을 지칭한다.
본 명세서에서, 올리고머 화합물 (예를 들면, 결합 된 뉴 클레오 시드, 올리고 뉴클레오타이드 또는 핵산)에 대한 "상보적인"및 "상보성"은 핵산 염기 상보성을 통해 기준 핵산 서열에 하이브리드 화하는 그러한 올리고머 화합물 또는 그 영역의 능력을 의미한다. 본원에서 사용 된 핵산 염기를 언급 할 때 "핵산 염기 상보성"또는 "상보성"은 전형적으로 왓슨 - 크릭 염기쌍에 의해 다른 핵 염기와 염기쌍이 가능한 핵 염기를 의미한다. 예를 들면, 올리고머 화합물의 특정 위치의 핵 염기가 표적 핵산의 특정 위치에서 핵 염기와 수소 결합 할 수 있는 경우, 올리고머 화합물과 표적 핵산 사이의 수소 결합의 위치는 핵산 염 쌍에서 상보적인 것으로 간주된다. 따라서, 개질된 핵 염기는 상대 핵 염기와 쌍을 이루는 능력을 유지할 수 있으며, 따라서 여전히 핵 염기 쌍 또는 핵 염기 상보성이 가능하다. 대조적으로, "비 상보적인"또는 "불일치" 핵 염기는 서로 수소 결합을 형성하지 않거나 그렇지 않으면 "염기쌍을 형성 할 수 없다"는 핵 염기 쌍을 지칭한다. 용어 "상보 적" 또는 "상보성"은 또한 염기 및 염기 조건하에 핵산이 염기쌍에 의해 자연적으로 결합하는 것을 의미한다. 2 개의 단일 가닥 분자 (본원에서 "핵산 염 중합체"라고도 함) 사이의 상보성은 핵산 염기 쌍 중 일부만이 염기쌍으로 "부분적"일 수 있거나, 분자의 전장을 따라 또는 단일 가닥 분자의 부분 또는 영역을 따라 단일 가닥 분자간에 전체 상보성이 존재할 때 "완전"할 수 있다. 핵산 가닥 사이의 상보성의 정도는 핵산 가닥 사이의 하이브리드 화의 효율 및 강도에 상당한 영향을 미친다. 용어 "상보적인"은 그 범위 내에 "완전히 상보 적", "실질적으로 상보적인"또는 "부분적으로 상보적인" 핵산 서열을 포함한다. 본원에서 사용 된 용어 "완전히 상보 적"은 특정 핵 염기 올리고머 또는 폴리머에서 핵 염기의 100 %가 또 다른 핵 염기 올리고머 또는 폴리머와 염기쌍을 형성 할 수 있음을 나타낸다. 본원에서 사용 된 용어 "실질적으로 보완적인"또는 그 문법적 등가물은 특정 핵 염기 올리고머 또는 중합체에서 핵 염기의 95 %, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과가 또 다른 핵 염기 올리고머 또는 중합체와 염기쌍을 형성 할 수 있음을 나타낸다. 이 용어는 또한 예를 들어 본원에서 정의 된 바와 같이 2 개의 핵산 서열이 고 엄격 조건 하에서 하이브리드 화 될 수 있음을 의미 할 수도 있다. 본원에서 사용 된 용어 "부분적으로 보완적인"또는 그 문법적 등가물은 특정 핵 염기 올리고머 또는 중합체에서 핵 염기의 약 95 %, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하가 다른 핵 염기 올리고머 또는 중합체와 염기쌍을 형성 할 수 없음을 나타낸다. 또한, 이 용어는 예를 들어 본원에서 정의 된 바와 같이, 2 개의 핵산 서열이 고 엄격 조건 하에서 혼성화 할 수 없지만, 본 명세서에서 예로서 정의 된 바와 같이 중쇄 또는 중쇄 조건 하에서 혼성화 할 수 있음을 의미 할 수 있다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥 상 달리 요구되지 않는 한, "포함하다", "포함한다"및 "포함하는"이라는 단어는 언급 된 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 군을 포함하지만, 기타 단계 또는 요소 또는 단계 또는 요소 그룹을 배제하지는 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해 될 것이다. 따라서, "포함하는"등의 용어의 사용은 열거 된 요소가 요구되거나 필수적임을 나타내지만, 다른 요소는 선택적이고 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있음을 나타낸다. "구성된"은 "구성된"이라는 문구 다음에 오는 것을 포함하되 이에 국한되는 것을 의미한다. 따라서, "구성된"이라는 문구는 나열된 요소가 필수적이거나 필수적이며 다른 요소가 존재할 수 없음을 나타낸다. "본질적으로 이루어진 (consisting essentially of)"이란 문구 뒤에 나열된 모든 요소를 포함하며 나열된 요소에 대한 공개에서 명시된 활동이나 조치를 방해하거나 기여하지 않는 다른 요소로 제한된다. 따라서, "본질적으로 이루어진"이라는 문구는 나열된 요소가 필수적이거나 필수적임을 나타내지만, 다른 요소는 선택 사항이며 나열된 요소의 활동 또는 동작에 영향을 미치는지 여부에 따라 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다.
본원에 사용 된 바와 같이, 핵산 서열의 문맥에서 용어 "인접"은 서열이 임의의 개재 서열 또는 서열에 의해 방해받지 않는 단일 서열임을 의미한다.
"상응하는" 또는 "이에 상응하는"은 기준 핵산 서열과 실질적인 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 의미한다. (예를 들어, 적어도 약 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80,81,82,83,84,85,86,97,88,89,90,71,92,93,94,95,96, 97, 98, 99 % 또는 심지어 100 %까지의 서열 동일성을 지칭함).
"유효량"이란, 질병의 치료 또는 예방과 관련하여, 질병의 치료 또는 예방과 관련하여, 단일 투여 량 또는 일련의 일부로서, 그러한 치료 또는 예방을 필요로하는 개체에게 투여 량의 약제 또는 조성물을 투여하는 것을 의미하며, 그러한 증상의 예방 및/또는 기존 증상의 치료에 효과적이다. 유효량은 치료받는 개인의 건강 및 신체 상태, 치료 대상의 분류 학적 그룹, 조성물의 조성, 의학적 상황의 평가 및 기타 관련 요인에 따라 달라질 것이다. 그 양은 일상적인 시험을 통해 결정될 수 있는 상대적으로 넓은 범위에 해당 할 것으로 예상된다.
용어 "발현(expression )"은 유전자 산물의 생합성을 의미한다. 예를 들어, 코딩 서열의 경우, 발현은 코딩 서열의 mRNA 내로의 전사 및 mRNA의 하나 이상의 폴리펩티드로의 번역을 포함한다. 반대로, 비-코딩 서열의 발현은 비-코딩 서열의 전사물(transcript)에만의 전사(transcription)를 포함한다.
본원에 사용 된 용어 "갭머 (gapmer)"는 중앙 영역 ( "갭") 및 중앙 영역의 양측상의 영역 ( "날개")을 포함하는 키메라 올리고머 화합물을 지칭하며, 상기 갭은 각각의 윙의 변형과는 다른 적어도 하나의 변형을 포함한다. 그러한 변형은 핵 염기, 단량체 결합 및 당 변형뿐만 아니라 변형의 부재 (비 변형)를 포함한다. 따라서, 특정 실시 양태에서, 날개의 각각의 뉴클레오시드 결합은 갭의 뉴클레오시드 결합과 상이하다. 특정 구체 예에서, 갭 내의 뉴클레오티드는 변형되지 않고 윙의 뉴클레오티드가 변형된다. 특정 실시 양태에서, 각 날개의 변형 (들)은 동일하다. 특정 구체 예에서, 하나의 윙에서의 변형 (들)은 다른 윙에서의 변형 (들)과 상이하다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "유전자"는 mRNA, 안티센스 RNA, siRNA, shRNA, miRNA 등을 생산하는데 사용될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 기능성 단백질 생산에 사용될 수 있거나 없을 수 있다. 유전자는 암호화 영역 및 비 암호화 영역 (예 : 인트론, 프로모터, 인핸서, 종결 서열 및 5 '및 3'비 번역 영역을 포함하는 조절 요소)을 포함 할 수 있다. 유전자는 천연 상태의 핵산 분자와 관련하여 통상적으로 발견되는 성분이 실질적으로 또는 본질적으로 없는 핵산 분자를 의미함으로써 "단리 될(isolated)"수 있다. 이러한 성분은 다른 세포 물질, 재조합 생산물로부터의 배양 배지 및 / 또는 핵산 분자를 화학적으로 합성하는데 사용되는 다양한 화학 물질을 포함한다. "유전자"에 대한 언급은 또한 본원에서 정의 된 바와 같이 인접한 핵산 실체를 정의하는 연속적인 서열을 갖는 유전자, 또는 본원에서 정의 된 바와 같은 비 연속적인 핵산 실체를 정의하는 비 연속적인 서열을 그 범위 내에 포함한다. 특정 실시 양태에서, 용어 "유전자"는 특정 폴리 펩타이드, 인트론 및 발현 조절에 관여하는 인접한 5 '및 3' 비 암호화 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 오픈 리딩 프레임을 그 범위 내에 포함한다. 이와 관련하여, 유전자는 프로모터, 인핸서 (enhancer), 종결 및/또는 주어진 유전자와 자연적으로 결합 된 폴리아데닐화 신호 또는 이종의 제어 서열과 같은 제어 서열을 추가로 포함 할 수 있다. 유전자 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA 또는 그의 단편 일 수 있다. 유전자는 염색체 유지 또는 숙주로의 도입을 위한 적절한 벡터로 도입 될 수 있다.
본 명세서에 사용 된 "게놈"은 DNA의 유전자 및 비 - 코딩 서열, 염색체 또는 비 - 염색체 유전 요소, 예를 들어 선형 폴리 뉴클레오티드, 예로서 유전자(들) 조립 및 / 또는 재조합을 포함한다. 따라서, 용어 "게놈"은 핵산 DNA 성분, 염색체 또는 염색체 외 DNA뿐만 아니라 세포질 도메인 (예 : 미토콘드리아 DNA)을 포함하는 유기체의 전체 DNA 보완물을 포함하도록 의도된다.
본원에서 사용 된 바와 같이, "헤테로 사이클릭 염기 모이어티"라는 용어는 본 발명에 포함되는 뉴클레오시드를 형성하는데 사용되는 핵 염기 및 변형된 또는 치환된 핵 염기를 의미한다. "헤테로 사이클릭 염기 모이어티"라는 용어는 천연 퓨린 염기인 아데닌(A) 및 구아닌(G) 및 피리미딘 염기 티민(T), 시토신(C) 및 우라실(U)과 같은 변형되지 않은 핵 염기를 포함한다. 상기 용어는 합성 및 천연 핵산 염기를 포함 하나 이에 한정되지 않는 모든 변형 또는 치환 된 핵 염기를 포함하는 것으로 의도된다. 상기 핵산 염기의 예로서 5- 메틸 시토신 (5-me-C), 5- 하이드 록시 메 틸레 닐 시토신, 2- 아미노 및 2- 플루오로 아데닌, 아데닌 및 구아닌의 2- 프로필 및 기타 알킬 유도체, 우라실, 티민, 3- 데 아자 구아닌 및 아데닌, 4- 티오 우라실, 5- 우라실 (슈도 우라실), 5- 프로피 닐 (≡C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리 미딘 염기의 다른 알키 닐 유도체 , 5- 할로, 특히 5- 브로 모, 5- 트리 플루오로 메틸 및 다른 5- 치환 된 우라실 및 시토신, 6- 메틸 및 기타 알킬 유도체의 아데닌 및 구아닌, 6- 아조 우라실, 시토신 및 티민, 7- 메틸 아데닌 및 구아닌, 8- 아미노, 8- 아자, 8- 티오, 8- 티오 알킬, 8- 하이드 록실 및 다른 8- 치환 된 아데닌 및 구아닌, universal bases, hydrophobic bases, promiscuous bases, size-expanded bases, 및 본원에 정의된 바와 같은 fluorinated bases를 포함한다. 추가의 변형 된 핵 염기는 페녹사진아민 시티딘(1H-pyrimido[5,4-b][1,4]benzoxazin-2(3H)-one) 및 페노티아진 시티딘(1H-pyrimido[5,4-b][1,4]benzothiazin-2(3H)-one)과 같은 삼환 식 피리 미딘을 포함한다.
본원에서 사용 된 바와 같이, 용어 "동족체", "상동체"또는 "상동성"은 2 이상의 핵산 서열 사이의 유사성의 수준을 서열 동일성의 백분율로 나타낸다. 일반적으로, 동족체, 동종 서열 또는 상동성을 갖는 서열은 서로 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 초과의 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 지칭한다. 대안으로, 또는 부가적으로 상동체, 상동성 서열 또는 상동성을 갖는 서열은 예를 들어 본원에서 정의 된 바와 같이 서로 엄격하게 높은 엄격 조건 하에서 하이브리드화하는 핵산 서열을 지칭한다. 대조적으로, "비 상동", "비 상동 서열"또는 "상 동성이없는 서열"등과 같은 용어는 서로 95 %, 90%, 85%, 80%, 75% 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35% 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하의 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 지칭한다. 대안 적으로, 또는 부가 적으로, "상동성이 없는", "비 상동성 서열"또는 "상동성이 없는 서열"등은 본 명세서에서 예로서 정의된 바와 같이 고 엄격 조건 하에서 서로 혼성화하지 않는 핵산 서열을 지칭하고, 중성 또는 저 엄격 성 조건에서 서로 혼성화 할 수 있거나 또는 혼성화 할 수 없다.
"혼성화(Hybridization, 하이브리드화)"는 DNA-DNA 하이브리드 또는 DNA-RNA 하이브리드를 생성하기 위해 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 쌍을 나타 내기 위해 본원에서 사용된다. 상보적인 핵 염기 서열은 염기쌍 형성 규칙에 의해 관련된 서열이다. DNA에서 A는 T와 C가 G와 쌍을 이룬다. RNA에서는 U와 A, C가 G와 쌍을 이룬다. 이와 관련하여, 본원에서 사용 된 "일치"및 "불일치"라는 용어는 상보적인 핵산 스트랜드에서 한 쌍의 뉴클레오타이드의 하이브리드화 잠재성을 지칭한다. 일치하는 뉴클레오티드는 위에서 언급 한 고전적 A-T 및 G-C 염기쌍과 같이 효율적으로 하이브리드화 된다. 불일치는 효율적으로 혼성화하지 않는 뉴클레오타이드의 다른 조합이다. 본 발명에서, 바람직한 쌍이 되는 메카니즘은 올리고머 화합물의 가닥의 상보적인 뉴클레오시드 또는 핵 염기 사이의 왓슨 크릭 (Watson-Crick), 후그 스틴 (Hoogsteen) 또는 역전된 후그 스틴 수소 결합 일 수 있는 수소 결합을 포함한다. 예를 들어, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통해 쌍을 이루는 상보 핵 염기이다. 하이브리드 화는 당업자에게 공지된 다양한 상황 하에서 발생할 수 있다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "시험관 내"는 생물체 내에서보다는 인공 환경, 예를 들어 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양, 페트리 접시 (petri dish) 등에서 발생하는 사건을 지칭한다 (예 : 동물, 식물 또는 미생물).
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "생체 내"는 유기체 (예를 들어, 동물, 식물 또는 미생물 또는 그의 세포 또는 조직) 내에서 발생하는 사건을 지칭한다.
본원에서 사용 된 "뉴클레오시드 간 결합"은 인접한 뉴클레오시드 간의 공유 결합을 나타낸다. 인터 뉴클레오티드 결합은 본 발명의 올리고머를 포함하는 핵산 분자의 주쇄를 구성한다.
포유 동물 세포, 포유 동물 부분, 포유 동물 기관 또는 전체 포유 동물을 포함하는 숙주 세포의 맥락에서 "도입"은 포유 동물 세포, 포유류 부분, 또는 포유 동물 세포와 핵산 분자 (예를 들어, 본원에 기재된 올리고 뉴클레오타이드) 핵산 분자가 포유 동물 세포, 포유류 부분, 포유 동물 기관 또는 전체 포유 동물의 내부에 접근 할 수 있는 방식으로 포유류 세포, 포유 동물 기관 또는 전체 포유 동물에 투여 될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "변형된 당(modified sugar)"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 말하며, 본 발명의 뉴 클레오시드 및 올리고머 화합물에 사용되는 천연 리보퓨라노오스 및 데옥시리보퓨라노 오당의 변형을 포함한다. 변형 된 당은 헤테로 사이 클릭 염기 부분 또는 변형 된 헤테로 사이 클릭 염기 부분이 통상적으로 적절한 표적 핵산과의 하이브리드화를 위해 유지되는 뉴 클레오시드를 포함한다. 이러한 "변형된 당"은 올리고머 화합물에 부여 할 수 있는 유리한 특성, 예를 들어, 향상된 세포 섭취, 핵산 표적에 대한 증가 된 친 화성 및 증가 된 핵산 분해 효소 안정성과 같은 이유로 자연 발생 형태보다 종종 바람직하다. 용어 "변형된 당"은 고리 원자에 대한 변형 및 / 또는 치환기의 첨가를 포함하는 당 업계에 공지 된 모든 변형 방법을 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "핵 염기"는 뉴 클레오시드의 염기 부분을 의미한다. 핵 염기는 전형적으로 헤테로시클릭 잔기이고 다른 핵산의 염기에 수소 결합 할 수 있는 임의의 원자 또는 원자 그룹을 포함 할 수 있다. 용어 "핵 염기"는 천연 핵산 염기 및 변형 된 핵 염기를 포함한다. 핵 염기 (또는 염기) 변형 또는 치환은 자연 발생 핵산 또는 합성 비 개질 핵 염기와 구조적으로 구별 가능하지만 기능적으로 상호 교환 가능하다. 천연 및 변형 핵 염기는 모두 수소 결합에 참여할 수 있다. 이러한 핵 염기 변형은 핵산 분해 효소 안정성, 결합 친 화성 또는 몇몇 다른 유리한 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여 할 수 있다. 변형 된 핵 염기는 예를 들어 5- 메틸 시토신 (5-me-C)과 같은 합성 및 천연 핵 염기를 포함한다. 5- 메틸 시토신 치환을 포함하는 특정 핵 염기 치환은 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친 화성을 증가 시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 5- 메틸 시토신 치환은 0.6-1.2 degree. C. 만큼 핵산 이중 가닥의 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다. (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. 및 Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp.276-278). 추가의 변형되지 않은 핵 염기는 5- 하이드록시 메틸 시토신, 크산틴, 하이포크 산틴, 2- 아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6- 메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2- 프로필 및 다른 알킬 유도체, 2- 티오 우라실, 2- 티오 티민 및 2 (-C = C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 다른 알키닐 유도체, 6- 아조 우라실, 시토신 및 티민, 5- 우라실 (슈도 우라실), 4- 티오 우라실, 4- 티오 시아 노, 5- 할로 우라실 및 시토신, , 8- 할로, 8- 아미노, 8- 티올, 8- 티오 알킬, 8- 하이드 록실 및 기타 8- 치환 된 아데닌 및 구아닌, 5- 할로, 특히 5- 브로모, 5- 트리 플루오로메틸 및 다른 5- 치환된 우라실 및 시토신; 1- 메틸 아데닌 및 7- 메틸 아데닌, 2-F- 아데닌, 2- 아미노 - 아데닌, 8- 아자 구아닌 및 8- 아자아데닌, 7- 데 아자구아닌 및 7- 데자나디닌 및 3- 데자구아닌 및 3- 데자나아데닌. 헤테로 사이클릭 염기 부분은 또한 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로 사이클, 예를 들어 7- 데아자 - 아데닌, 7- 데자아 구아노 신, 2- 아미노 피리딘 및 2- 피리돈으로 대체 된 것들을 포함 할 수 있다. 안티센스 화합물의 결합 친화성을 증가시키는 데 특히 유용한 핵 염기는 2- 아미노 프로필 아데닌, 5- 프로피 닐 우라실 및 5- 프로피 닐 시토신을 포함하는 5- 치환된 피리미딘, 6- 아자 피이미딘 및 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다.
본원에 사용 된 용어 "뉴클레오시드(nucleoside, 또는 뉴클레오사이드)"는 염기 - 당의 조합을 의미한다. 뉴클레오사이드의 염기 부분은 일반적으로 헤테로 사이 클릭 염기 부분이다. 이러한 복소환 핵 염기의 두 가지 가장 공통적인 부류는 퓨린 및 피리미딘이다. "뉴클레오타이드(또는 뉴클레오티드)"는 뉴클레오사이드의 당 부분에 공유 결합된 인산기를 추가로 포함하는 뉴 클레오시드이다. 펜토프라노실당을 포함하는 뉴클레오시드의 경우, 인산기는 당의 2 ', 3'또는 5 ' 히드록실 잔기에 연결될 수 있다. 올리고 뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트기는 일반적으로 올리고 뉴클레오타이드의 뉴클레오시드 결합을 형성하는 것으로 또는 올리고 뉴클레오타이드의 주쇄인 설탕 고리와 함께 형성된다. 올리고뉴클레오티드를 형성함에 있어서, 인산염 그룹은 인접한 뉴클레오시드를 서로 공유 결합시켜 선형 고분자 화합물을 형성한다. RNA와 DNA의 정상적인 인터뉴클레오사이드 연결은 3 '에서 5' 포스포디에스테르 결합이다. 본 발명과 관련하여, 용어 "올리고 뉴클레오사이드"는 인 원자를 갖지 않는 뉴클레오시드 간 결합에 의해 결합된 뉴클레오시드 서열을 지칭한다.
"OB- 폴드 단백질"이란 용어는 (Murzin, 1993, Embo J12 : 861-86) 및 (Arcus, 2002, Curr Opin Struct Biol 12 : 794-801)에 기술 된 바와 같이, OB- 배양 토폴로지를 포함하는 도메인을 포함하거나 이로부터 구성된 임의의 폴리펩티드를 말하고, ssDNA와의 결합을 용이하게 한다. 이 토폴로지는 5 가닥(five-stranded)(β- 배럴이 양친 매성 α- 나선에 의해 한쪽 끝을 덮는다)을 포함하는 구조에 해당한다. CATH 단백질 구조 분류 (Pearl et al., 2003, Nucleic Acids Res 31 : 452-455)를 참조하면, OB 배형 토폴로지는 2.40.50 배군 (CATH 데이터베이스 버전 3.0.0 : 2006 년 5 월 출시)에 해당한다. 이러한 OB- 폴드 단백질은 천연 단백질 (즉, 천연 단백질과 동일한 서열을 갖는 단리 된, 정제 된 또는 재조합 단백질) 또는 인공 단백질(예를 들어, 천연 단백질의 단편, 또는 제 1 단백질의 OB- 폴드 도메인 및 또 다른 단백질의 또 다른 부분을 포함하는 융합 단백질을 포함 할 수 있다) 일 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수있는 OB 접힘 단백질의 비 제한적인 예는 단순 SSB를 포함하는 단일 가닥 DNA 결합 단백질 (SSB)을 포함하고, 이는 폴리펩티드 당 하나의 OB 배 및 다수의 OB- 폴드를 포함하는 고차 SSB(다른 폴리 펩타이드에있을 수 있음)를 포함한다. 대표적인 단순 SSB는 단일 가닥 DNA 결합 단백질 1 및 2 (예 : hSSB1 및 2) 및 미토콘드리아 SSB (mtSSB)를 포함하는 반면, 고차 SSB는 헤테로 삼량 복제 단백질 A (RPA)로 나타낸다. 또한, 다른 단백질들도 그들의 폴리 펩타이드 내에 ssDNA- 결합 -OB- 폴드 구조를 채택하였으며, SSB 계열의 구성원으로 간주 될 수 있다. 예를 들어 텔로미어 1 (POT1) 유방암 2, 조기 개시 (BRCA2) 및 중추 신경계 복합체 (CST)의 TPP1- 보호는 세린 / 트레오닌 키나아제 수용체 관련 단백질 (Strap) 고차원 SSB를 상기시키는 복합체를 형성한다. 다수의 OB- 폴드 단백질이 당업계에 공지되어 있으며, 그의 예시는 애쉬톤(Ashton) 등의 문헌 [ (2013, BMC Molecular Biology 14 : 9) 및 플린 (Flynn) 등 (2010, Crit Rev Biochem Mol Biol., 45 (4) : 266-275)이 있다.
본 명세서에서 사용 된 용어 "올리고 뉴클레오타이드"는 자연 발생 핵염기, 당 및 포스포디 에스테르 뉴클레오시드 간 결합으로 구성된 리보핵산(RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 중합체에 대한 중합체를 지칭한다.
"올리고머", "올리고머 화합물"및 "올리고머 화합물"이라는 용어는 본 명세서에서 상호 교환 적으로 사용되어, 특정 순서로 함께 결합된 다수의 자연 발생 및/또는 비 - 자연 발생 뉴클레오사이드를 지칭하고, 중합체성 구조를 형성한다. 용어 "올리고머" 및 "올리고머 화합물"에는 올리고 뉴클레오타이드, 올리고 뉴클레오티드 유사체, 올리고 뉴클레오타이드 모방 체, 올리고 뉴클레오사이드 및 이들의 키메라 조합이 포함되며, 따라서 모든 방식의 변형을 갖는 모든 올리고머를 포함하여 용어 "올리고 뉴클레오타이드" 이에 한정되는 것은 아니지만 당 업계에 공지된 것들을 포함한다. 올리고머 화합물은 전형적으로 천연 발생 또는 합성 야생형 올리고 뉴클레오티드와 구조적으로 구별 가능하지만 기능적으로 교환 가능하다. 따라서, 올리고머 화합물은 예를 들어 표적에 혼성화함으로써, 원하는 RNA 또는 DNA 가닥의 구조 및/또는 기능을 모방하기 위해 효과적으로 기능하는 모든 구조를 포함한다. 이러한 비 자연적으로 발생하는 올리고 뉴클레오타이드는 종종 증강 된 세포질 섭취, 핵산 표적에 대한 증가 된 친 화성 및 뉴클레아제 존재 하에서의 증가된 안정성과 같은 증진 된 특성을 종종 가지기 때문에 자연 발생 형태보다 종종 바람직하다.
본원에서 상호 교환적으로 사용되는 용어 "환자", "대상", "숙주" 또는 "개체"는 치료 또는 예방이 요구되는 임의의 대상, 특히 척추 동물 대상, 더욱 특히 포유류 대상을 지칭한다. 본 발명의 범위에 속하는 적합한 척추 동물은 영장류 예를 들어, 인간, 원숭이 및 유인원을 포함하며, Macaca 속의 원숭이의 종 (예를 들어, Macaca fascicularis 및 / 또는 Rhesus monkeys (Macaca mulatta)와 같은 cynomologus 원숭이를 포함하는 Chordata의 임의의 구성원 및 이하 예시를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 비비 (Papio ursinus), marmosets (Callithrix 속의 종), Squirrel 원숭이 (Saimiri 속의 종), tamarins 침팬지 (Pan troglodytes)), 설치류 (예 : 생쥐, 기니피그), 우성 형 (예 : 토끼, 토끼), 소 (예 : 소), 양 (예 : 사지) 돼지 등), 말 (예 : 말), 개 (예 : 개), 고양이 (예 : 고양이), 조류 (예 : 닭, 칠면조, 오리, 거위 등) 카나리아, budgerigars 등 동반자 새), 해양 포유 동물 (예, 돌고래, 고래), 파충류 (뱀, fr ogs, 도마뱀 등), 그리고 물고기. 특정 실시 양태에서, 개체는 사람과 같은 영장류이다. 그러나, 상기 용어는 증상이 존재함을 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다.
백분율은 특정 특징 또는 특징을 갖는 올리고머의 길이에 대한 핵 염기 또는 인터뉴클레오티드 결합의 근사 비율을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 이러한 특징 또는 특성을 갖는 핵 염기의 수는 올리고머 내의 핵 염기의 수에 기초하여 이들 백분율로부터 쉽게 계산 될 수 있다. 아래의 표 1에 나열된 값이 가장 가까운 정수로 반올림되거나 반올림 된 대표적인 계산이 제공된다.
[표 1]
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"약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물학적으로 또는 다른 방식으로 바람직하지 않은 물질로 구성된 약학적 비히클을 의미한다. 즉, 상기 물질은 임의의 또는 실질적으로 부작용을 일으키지 않으면서 선택된 활성제와 함께 대상에게 투여 될 수 있다. 일반적으로, 약학적으로 허용 가능한 담체는 피험자에서 실질적으로 비독성이고 비-염증성이다. 담체는 부형제 및 희석제, 세제, 착색제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보존제, 형질 감염 제 등과 같은 다른 첨가제를 포함 할 수 있다. 일부 구체 예에서, 약학 적으로 허용 가능한 담체는 활성제를 현탁 및/또는 용해시킬 수 있는 비히클이다. 담체는 항균제, 항산화 제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕 해제, 염료 (색소), 피부 연화제, 유화제, 충전제 (희석제), 필름 형성 제 또는 코팅제, 향료, 향료, 유동 촉진제 (윤활제) 보존제, 인쇄 잉크, 흡착제, 현탁 제 또는 분산제, 감미료 및 수화 된 물을 포함 할 수 있다. 예시적인 담체는 부틸화 히드록시 톨루엔 (BHT), 탄산 칼슘, 인산 칼슘 (이염기성), 스테아르 산 칼슘, 크로스 카멜 로스, 가교 폴리 비닐 피 롤리 돈, 시트르산, 크로스 포비돈, 시스테인, 에틸 셀룰로오스, 젤라틴, 히드 록시 프로필 셀룰로오스, 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스 , 락토스, 스테아린산 마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸 셀룰로오스, 메틸 파라벤, 미정 질 셀룰로오스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 비닐 피 롤리 돈, 포비돈, 예비 젤라틴 화 전분, 프로필 파라벤, 레티 닐 팔미 테이트, 셸락, 이산화 규소, 나트륨 카르복시 메틸 셀룰로오스, 소르비톨, 전분 (옥수수), 스테아르 산, 수 크로스, 탈크, 이산화 티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 자일리톨이 포함된다.
용어 "폴리 뉴클레오타이드", "유전 물질", "유전체 형태", "핵산"및 "뉴클레오타이드 서열"은 RNA, cDNA, 게놈 DNA, 합성 형태 및 혼합 중합체, 단일 가닥, 이중 가닥, 및 안티센스 가닥을 포함하며, 화학적으로 또는 생화학 적으로 변형 될 수 있거나, 당업자가 쉽게 알 수 있는 바와 같이, 비 천연 또는 유도체 핵 염기를 함유 할 수 있다.
종양 세포에 의한 올리고머의 흡수와 관련하여 "우선적으로"라는 용어는 올리고머가 동일한 조건 하에서 종양 세포 또는 정상 세포보다 높은 수준으로 종양 세포에 의해 흡수된다는 것을 의미하며, 생체 내 또는 시험관 내에 있을 수 있다. 다르게는, 올리고머가 표적 분자에 결합하는 맥락에서 "우선적으로"라는 용어는 비특이적이거나 비 표적 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친 화성으로 표적 분자에 결합하거나 또는 표적 분자가 올리고머는 대조군 올리고머보다 더 큰 친 화성을 갖는 것이고, 이는 동일한 조건 하에서, 생체 내 또는 시험 관내에 있을 수 있다. 올리고머 흡수는 비 종양 세포 또는 정상 세포보다 종양 세포에서 적어도 1 배 이상, 적어도 2 배 이상, 적어도 3 배 이상, 적어도 4 배 이상, 적어도 5 배 이상, 적어도 6 배 이상, 적어도 7 배 이상 될 수있다. 적어도 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 30 배 이상, 40 배 이상, 50 배 이상, 종양 세포에 의한 것보다 적어도 60 배 이상, 적어도 70 배 이상, 적어도 80 배 이상, 적어도 90 배 이상, 적어도 100 배 이상, 또는 적어도 1000배 더 클 수 있다. 마찬가지로, 올리고머 친화도는 비관련 또는 비-표적 분자에 대한 올리고머의 친화도보다 표적 분자에 대해 적어도 1 배 이상, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 30 배 이상, 40 배 이상, 50 배 이상 표적 분자에 비해 적어도 60 배 이상, 60 배 이상, 70 배 이상, 80 배 이상, 90 배 이상, 100 배 이상 또는 1000 배 이상 더 클 수 있다. 대안적으로, 표적 분자 친화성은 대조군 올리고머에 대한 표적 분자의 친화도보다 올리고머에 대해 적어도 1 배, 2 배 이상, 3 배 이상, 4 배 이상, 5 배 이상, 6 배 이상, 최소 7 배 이상, 8 배 이상, 9 배 이상, 10 배 이상, 20 배 이상, 30 배 이상, 40 배 이상, 50 배 이상, 올리고머에 비해 60 배 이상, 60 배 이상, 70 배 이상, 80 배 이상, 90 배 이상, 100 배 이상 또는 1000 배 이상 더 클 수 있다. 올리고머 흡수 또는 친화력을 측정하기 위한 일반적인 기술은 당업자에게 공지되어있다. 측정 된 흡수 또는 친 화성 및 기타 올리고머 - 결합 파라미터는 상이한 조건, 예를 들어 염 농도, pH 등으로 측정되는 경우 변할 수 있다. 따라서 흡수 또는 친 화성 및 다른 올리고머 - 결합 매개 변수(예로서 KD, IC50)의 측정은 바람직하게는 올리고머의 표준 용액 및 표적 세포 또는 분자, 및 표준화 된 완충액을 포함한다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "예방하다", "예방되는" 또는 "예방하는"은 질병 또는 상태를 발전시키는 환자의 저항성을 증가시키는 예방적 처치를 의미하며, 달리 말하면, 질병 또는 상태가 완전히 감소되거나 제거되거나 질병이 악화되는 것을 방지하기 위해 질병 또는 상태가 시작된 후 치료가 진행될 것이다. 이 용어는 또한 질병 또는 상태에 걸리기 쉽지만 아직 진단되지 않은 대상에서 질병 또는 상태가 발생하는 것을 방지하는 범위를 포함한다.
제 2 샘플에 비해 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 수준과 관련하여 사용될 때 "감소", "억제", "감소"및 문법적 등가물과 같은 용어는 물질의 양 및 / 또는 제 1 샘플에서의 현상은 임의의 당 업계에서 허용되는 통계 분석 방법을 사용하여 통계적으로 유의한 양만큼 제 2 샘플에서보다 낮다. 일 실시 예에서, 감소는 예를 들어 환자가 고통, 피로 등과 같은 질병 증상의 주관적 지각을 언급 할 때 주관적으로 결정될 수 있다. 다른 실시 예에서, 감소는 객관적으로 결정될 수 있는데, 예를 들어 환자의 샘플에서 종양 세포는 환자의 초기 샘플보다 낮다. 또 다른 실시 양태에서, 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 양은 제 2 샘플에서 동일한 물질 및 / 또는 현상의 양보다 적어도 10 % 더 낮다. 또 다른 실시 양태에서, 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 양은 제 2 샘플에서 동일한 물질 및 / 또는 현상의 양보다 25 % 이상 낮다. 또 다른 실시 양태에서, 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 양은 제 2 샘플에서 동일한 물질 및 / 또는 현상의 양보다 적어도 50 % 더 낮다. 추가의 실시 양태에서, 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 양은 제 2 샘플에서 동일한 물질 및 / 또는 현상의 양보다 75 % 이상 낮다. 또 다른 실시 양태에서, 제 1 샘플에서 물질 및 / 또는 현상의 양은 제 2 샘플에서 동일한 물질 및 / 또는 현상의 양보다 적어도 90 % 더 낮다. 또는 차이는 "n 배"차이로 표현 될 수 있다.
본원에서 사용 된 용어 "서열 동일성"은 서열이 동일하거나 또는 비교 윈도우에 비해 핵산 염기 단위로 핵산 염 - 짝짓기 능력을 갖는 정도를 지칭한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율"또는 "퍼센트 동일성"은 비교창에 걸쳐 2 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 동등한 염기쌍 형성 능력을 갖는 동일한 핵산 염기 또는 핵산 염기가 두 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정함으로써 계산되고, 매치 된 위치의 수를 산출하고, 매치 된 위치의 수를 비교 윈도우 (즉, 윈도우 사이즈) 내의 총 위치 수로 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출한다.
본 발명의 목적을 위해, "서열 동일성"은 적절한 방법에 의해 계산된 "일치 퍼센트"를 의미하는 것으로 이해 될 것이다. 예를 들어, 서열 확인 분석은 참고 매뉴얼에 사용된 표준 기본값을 사용하여 DNASIS 컴퓨터 프로그램 (윈도우 용 버전 2.5, 미국 캘리포니아 주 사우스 샌프란시스코 히타치 소프트웨어 엔지니어링 사에서 입수 가능)을 사용하여 수행 될 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고머 화합물 또는 그의 일부는 기준 서열에 대해 정의 된 퍼센트 동일성을 가질 수 있다. 본원에서 사용 된 바와 같이, 올리고머 핵 염기 서열은 동일한 핵산 염 쌍 형성 능력을 갖는 경우 기준 핵 염기 서열과 동일하다. 예를 들어, 참조 서열에서 티미딘 대신에 우라실을 함유하는 올리고머는 이들 모두가 아데닌과 쌍으로 동일하다고 간주 될 수 있다. 유사하게, 참조 서열에서 구아닌 대신에 6- 메틸 구아닌과 같은 변형 된 구아닌 핵 염기를 함유하는 올리고머는 이들 모두가 시토신과 쌍으로 동일하다고 간주 될 것이다. 동일성은 올리고머 화합물의 전체 길이 또는 올리고머 화합물의 일부분에 있을 수 있다 (예를 들어, 27-mer의 핵 염기 1-20은 20-mer와 비교되어 올리고머 화합물의 참조 서열에 대한 동일성 퍼센트를 결정할 수 있다). 임의의 동일하지 않은 염기는 서로 인접하거나, 올리고머를 통해 분산되거나, 또는 둘 모두 일 수 있다. 예를 들어, 20-mer의 뉴 클레오베이스 2-17과 동일한 서열을 갖는 16-mer는 20-mer와 80 % 동일하다. 또는, 20-mer와 동일하지 않은 4 개의 핵 염기를 함유하는 20-mer도 20-mer와 80 % 동일하다. 18-mer의 핵 염기 1-14와 같은 서열을 갖는 14-mer는 18-mer와 78 % 동일하다. 이러한 계산은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
2 개 이상의 폴리 뉴클레오티드 또는 폴리펩타이드 사이의 서열 관계를 기술하는데 사용되는 용어는 "참조 서열", "비교 윈도우", "서열 동일성", "서열 동일성의 백분율"및 "실질적 동일성"을 포함한다. "기준 서열"은 14 이상 29 이하 (예컨대, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29) 2 개의 핵산은 (1) 2 개의 핵산 사이에서 유사한 서열 및 (2) 2 개의 핵산 사이에서 발현되는 서열을 포함 할 수 있기 때문에, 2 개 (또는 그 이상)의 핵산 간의 서열 비교는 전형적으로 서열 비교의 국부적 인 영역을 확인하고 비교하기 위해 "비교 창 (comparison window)"을 통해 두 핵산의 서열을 비교한다. "비교 창"은 최소 14 개에서 최대 29 개까지의 개념적 세그먼트를 나타내고 (예 : 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 , 29) 인접 뉴 클레오 염기 위치를 포함하며, 여기서 서열은 두 개의 서열이 최적으로 정렬 된 후 동일한 연속 핵 염기 위치의 동일한 수의 기준 서열과 비교된다. 비교 윈도우는 2 개의 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열 (첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 약 20 % 이하의 첨가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함 할 수 있다. 비교 창의 정렬을 위한 서열의 최적 정렬은 컴퓨터화 된 알고리즘 (위스콘신 유전학 소프트웨어 패키지 릴리스 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, USA의 GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA) 또는 검사 및 최상의 정렬 (즉, 비교 윈도우에 비해 가장 높은 상 동성 비율을 나타냄)을 선택하는 방법을 제공한다. 또한, 예를 들어 Altschul 등, 1997, Nucl. Acids Res. 25 : 3389. 서열 분석에 대한 자세한 논의는 Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology,"John Wiley & Sons Inc, 1994-1998, Chapter 15의 Unit 19.3에서 찾을 수 있다.
본원에 사용 된 "엄격"은 혼성화 동안 온도 및 이온 강도 조건, 및 특정 유기 용매의 존재 또는 부재를 나타낸다. 엄격성이 높을수록, 서열 사이의 상보성 정도가 높아질 것이다. 본원에서 사용된 "엄격한 조건"은 높은 비율의 상보적인 핵 염기를 가지며, 바람직하게는 정확히 상보성을 갖는 폴리 뉴클레오타이드 만 하이브리드화하는 온도 및 이온 조건을 의미한다. 필요한 엄격성은 뉴클레오티드 서열 의존적이며, 하이브리드화 동안 존재하는 다양한 성분에 의존하며, 뉴클레오티드 유사체가 사용되는 경우 크게 변화된다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정 된 이온 강도 및 pH에서 특정 서열에 대한 열 융점보다 약 10 ℃ 내지 20 ℃ 낮은 것으로 선택된다. Tm은 표적 서열의 50 %가 상보적 프로브에 하이브리드화되는 온도 (규정 된 이온 세기 및 pH 하에서)이다. 폴리 뉴클레오타이드는 적어도 저 엄격 조건, 바람직하게는 중 중 엄격 조건, 보다 바람직하게는 고 엄격 조건 하에서 표적 서열에 혼성화 될 것으로 이해 될 것이다. 저 엄격 조건은 또한 65 ℃에서 하이브리드 화를 위해 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4 (pH 7.2), 7 % SDS 및 (i) 2xSSC, 0.1 % SDS; 또는 (ii) 실온에서 세척하기 위한 0.5 % BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4 (pH 7.2), 5 % SDS를 포함 할 수 있다. 중간 엄격도 조건은 42 ℃에서의 혼성화를 위해 적어도 약 16 % v / v 내지 적어도 약 30 % v / v 포름 아미드 및 적어도 약 0.5 M 내지 약 0.9 M 염, 및 42 ℃에서 세척하기 위한 적어도 약 0.5 M 내지 적어도 약 0.9 M 염을 함유하고 포함한다. 중간 엄격도 조건은 또한 65 ℃에서 하이브리드 화를 위해 1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4 (pH 7.2), 7 % SDS, 및 (i) 2 x SSC, 0.1 % SDS; 또는 (ii) 42 ℃에서 세척하기위한 0.5 % BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4 (pH 7.2), 5 % SDS 를 포함 할 수 있다. 고 엄격 조건은 42 ℃에서 적어도 약 31 % v / v 내지 적어도 약 50 % v / v 포름 아미드 및 적어도 약 0.01 M 내지 약 0.15 M 염, 및 42 ℃에서 세척하기 위한 적어도 약 0.01 M 내지 약 0.15 M 염을 함유하고 포함한다. 고 엄격 조건은 또한 65 ℃에서 하이브리드 화를 위해 1 % BSA, 1mM EDTA, 0.5M NaHPO4 (pH 7.2), 7 % SDS, 및 (i) 0.2 x SSC, 0.1 % SDS; 또는 (ii) 65 ℃를 초과하는 온도에서 세척하기위한 0.5 % BSA, 1mM EDTA, 40mM NaHPO4 (pH 7.2), 1 % SDS를 포함 할 수 있다. 고 엄격 조건의 일 실시 양태는 65 ℃에서 0.2xSSC, 0.1 % SDS에서 1 회 이상 세척 한 후 약 45 ℃에서 6xSSC에서 하이브리드 화하는 것을 포함한다. 매우 엄격한 조건의 일 실시 예는 하이브리드 화 65 ℃에서 0.5M 인산 나트륨, 7 % SDS, 65 ℃에서 0.2 × SSC, 1 % SDS에서 1 회 이상 세척 하였다. 다른 엄격한 조건은 당 업계에 잘 알려져 있다. 숙련 된 당업자는 하이브리드 화의 특이성을 최적화하기 위해 다양한 인자가 조작 될 수 있음을 인식 할 것이다. 최종 세척의 엄격성을 최적화하면 하이브리드화 정도를 높일 수 있다. 자세한 예제는 2.10.1 ~ 2.10.16 페이지의 분자 생물학 (MOLECULAR BIOLOGY) (이전) 및 분자 클로닝 (Molecular Cloning)을 참조할 수 있다. A LABORATORY MANUAL (Sambrook, et al., eds.) (Cold Spring Harbor Press 1989) 섹션 1.101 ~ 1.104.
본원에서 사용 된 용어 "치환체"및 "치환기"는 목적하는 성질을 향상 시키거나 목적하는 효과를 부여하기 위해 일반적으로 다른 기 또는 모 화합물에 첨가되는 기를 포함하는 것을 의미한다. 치환기 그룹은 보호 또는 보호 해제 될 수 있으며, 하나의 이용 가능한 사이트 또는 모 화합물의 많은 이용 가능한 사이트에 첨가 될 수 있다. 치환기는 또한 다른 치환기로 더 치환 될 수 있으며, 직접 또는 알킬 또는 하이드로 카르 빌기와 같은 연결기를 통해 모 화합물에 부착 될 수 있다. 상기 그룹은 할로겐, 하이드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아실 (-C (O) Ra), 카복실 (-C (O) O-Ra), 지방족, 지환족, 이미노 (-NRbRc), 이미노 (-C (O) NRbRc 또는 -N (Rb) C (O) Ra), 아지도 (-N3) C (O) NRbRc 또는 -N (Rb) C (O) ORa), 우레이도 (-N (Rb) C (O) NRbRc), 티오우레이도 (-N (Rb) C (= NRb) NRbRc), 아미디닐 (-C (= NRb) NRbRc 또는 -N (Rb) C (NRb) Ra) 술포닐 (-S (O) 2Rb) 및 설폰아미딜 (-S (O) 2NRbRc 또는 -N (b) S (O) 2Rb) Rb 및 Rc는 알킬, 알케닐, 알키닐, 지방족, 알콕시, 아실, 아릴, 아르알킬, 헤테로 아릴, 지환 족, 헤테로 사이클릭 및 헤테로 아릴 알킬을 포함하는 바람직한 목록을 갖는 추가의 치환기이다.
용어 "표적 핵산 서열" 및 "표적 서열"은 본 발명의 올리고머 화합물의 표적 서열이 표적화되는 표적 RNA 또는 표적 DNA 분자의 일부를 지칭하기 위해 본원에서 상호 교환 적으로 사용되며, 즉 올리고머 화합물이 상보적인 서열의 왓슨 - 크릭 (Watson-Crick) 염기쌍에 의해 하이브리드화 될 서열을 의미한다.
본원에서 사용 된 용어 "표적화 서열"은 표적 RNA 또는 표적 DNA 분자에서 표적 서열과 실질적으로 상보적인 본 발명의 안티센스 올리고머 화합물 내의 서열을 지칭한다. 올리고머 화합물의 전체 서열 또는 일부분 만이 표적 서열에 실질적으로 상보적일 수 있다. 예를 들어, 18 뉴 클레오 염기를 갖는 올리고머에서, 12-14만이 표적화 서열일 수 있다. 전형적으로, 표적화 서열은 적어도 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 올리고머 화합물의 염기를 포함 할 수 있지만, 예를 들어 올리고머의 대향 단부로부터 함께 놓일 때, 표적 서열에 걸친 서열을 구성하는 비 인접 서열로 형성 될 수 있다.
본원에 사용 된 바와 같이, 용어 "전사체 (transcriptome)"는 하나 또는 세포 집단에서 생산 된 모든 전령 RNA (mRNA) 분자 또는 "전사체"의 세트를 지칭한다. 이 용어는 주어진 유기체의 전 사체 세트 또는 특정 세포 유형에 존재하는 전사물의 특정 하위 세트에 적용될 수 있다. 주어진 세포주 (돌연변이 제외)에 대해 대략 고정되어있는 게놈과 달리, 전사체는 외부 환경 조건에 따라 달라질 수 있다. 세포 (전 mRNA 포함)에 모든 mRNA 전사체가 포함되어 있기 때문에 전사체는 전사 감쇠와 같은 mRNA 분해 현상을 제외하고는 주어진 시간에 활발하게 발현되는 유전자를 반영한다.
본원에서 사용된 "치료", "치료하는" 등의 용어는 원하는 약리학 적 및 / 또는 생리 학적 효과를 얻는 것을 의미한다. 이 효과는 질환 또는 상태 (예를 들어, 혈액 학적 악성 종양) 및 / 또는 질병 또는 상태에 기인하는 악영향에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 이 용어는 또한 포유류, 특히 사람에서의 질병 또는 상태의 치료를 포함하며, 다음을 포함한다 : (a) 질병 또는 상태를 억제, 즉 발달을 억제; 또는 (b) 질환 또는 상태를 완화시키는 것, 즉 질병 또는 상태의 퇴행을 야기하는 것.
본원에 사용 된 용어 "종양"은 악성 또는 양성 여부에 관계없이 임의의 종양 세포 성장 및 증식 및 모든 암세포 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다. 용어 "암"과 "암"은 포유 동물의 생리 조건을 나타내거나 설명하며, 일반적으로 부분적으로는 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 한다. 본원에서 사용된 용어 "암"은 초기 및 후기 암을 포함하는 비 전이성 및 전이성 암을 의미한다. "전암"이란 용어는 일반적으로 암에 선행하거나 암으로 진행되는 상태 또는 성장을 의미합니다. "비 전이성 (non-metastatic)"은 양성이거나 1 차 부위에 남아 있으며 림프계 또는 혈관 시스템 또는 1 차 부위 이외의 조직으로 침투하지 않은 암을 의미한다. 일반적으로 비 전이성 암은 Stage 0, I 또는 II 암 및 때때로 III 기 암 인 모든 암이다. "초기 암"은 침습성 또는 전이성이 아니거나 Stage 0, I 또는 II 암으로 분류되는 암을 의미한다. "말기 암"이란 일반적으로 3 기 또는 4 기 암을 의미하지만, 2 기 암 또는 2 기 암의 서브 스테이지를 지칭 할 수도 있다. 당업자는 초기 암 또는 후기 암 중 하나로 II 기 암을 분류하는 것이 암의 특정 유형에 의존한다는 것을 이해할 것이다. 암의 예시는 유방암, 전립선 암, 난소 암, 자궁 경부암, 췌장암, 결장 직장암, 폐암, 간세포 암, 위암, 간암, 방광암, 요로 암 갑상선암, 신장 암, 암종, 흑색 종, 뇌암, 비소 세포 폐암, 두경부 편평 세포 암, 자궁 내막 암, 다발성 골수종, 직장 암 및 식도암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 실시 양태에서, 암은 전립선 암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소 암 및 골암이다.
"종양 조절 성 (tumor-modulating)"이란 용어는 종양 세포의 기능을 억제 또는 방지하고 및 / 또는 종양 세포를 파괴시키는 물질을 의미한다. 종양 조절 활성은 세포 독성 또는 세포 증식 성일 수 있다. 세포 독성 물질은 종양 세포에 독성을 가지며 독성 효과는 종양 세포의 죽음 및 / 또는 용해를 초래할 수 있다. 특정 예에서, 독성 효과는 예를 들어 세포 성장을 늦추거나 억제하는 것과 같은 종양 세포에 대한 치사적인 파괴적인 효과 일 수 있다. 세포 증식 억제제는 종양 세포의 성장 및 / 또는 증식을 억제 또는 중지시킨다.
본원에 사용 된 바와 같이, 유전자의 이름을 강조하거나 이탤릭체로 표시하는 것은 그의 단백질 생성물과 대조적으로 유전자를 나타내야하는데, 이는 밑줄 또는 이탤릭체가 없는 유전자의 이름으로 표시된다. 예를 들어, "hSSB1"은 hSSB1 유전자를 의미하는 반면, "hSSB1"은 "hSSB1" 유전자의 전사 및 번역 및 선택적인 접합으로부터 생성 된 단백질 산물을 나타낸다.
본 명세서에서 설명 된 각 실시 예는 달리 명시되지 않는 한 각각의 모든 실시 예에 대해 준용되어 적용된다.
2. 약어
다음의 약어가 본 출원 전반에 걸쳐 사용된다
Da = Dalton (s)
kDa = kiloDalton (s)
분 = 분 (들)
hr = 시간
wk = 주 (들)
PD = 포스포디에스테르
PS = 포스포로티오에이트
LSA = PS 올리고머 화합물
ASO = 안티센스 올리고 뉴클레오타이드
GC = 구아노신 / 시토신
Tm = 용융 온도
SSB1 = NABP2, OBFC2B라고도 알려진 단일 가닥 DNA 결합 단백질 1
SSB2 = 단일 가닥 DNA 결합 단백질 2
hSSB1 = 인간 SSB1
hSSB2 = 인간 SSB2
mSSB1 = 마우스 SSB1
THOC4 = ALYREF, THO 복잡한 하위 단위 4
hTHOC4 = 인간 THOC4
3. 종양 세포를 표적화하기 위한 핵산 올리고머 화합물
본 발명은 부분적으로는 주로 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함하는 백본 및 적어도 약 절반의 퓨린 인 올리고머 핵 염기를 갖는 핵산 올리고머 화합물이 SSB1 및 THOC4 중 하나 또는 둘 모두에 결합하고, 이는 DNA 수리 및 세포의 단백질 합성 기계로의 RNA 분자의 핵 수출에 각각 관여하는 단백질이다. 예기치 않게, 이들 올리고머는 전사체와의 상보성이 있는지 또는 게놈과 상동성이 있는지에 관계없이 종양 세포의 증식을 현저하게 억제하거나 종양 세포의 죽음을 자극하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명자들은 단백질 결합 및 종양 세포 조절 활성의 기본 특징을 결정하기 위해 300 개 이상의 올리고머 서열을 시험함으로써 상기 발견을 추가로 조사 하였다. 이들 서열 중 195 개가 SSB1 및 THOC4 중 하나 또는 둘 모두와 결합하고 종양 세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 올리고머 화합물의 서열 및 화학 성을 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
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Figure pct00008
표 2에서, m은 2'OMe- 변형 된 뉴 클레오 사이드를 나타내고, *는 포스 포로 티오 에이트 (PS) 뉴 클레오 사이드 간 결합을 나타낸다.
이러한 발견에 기초하여, 본 발명은 광범위하게 다음과 같은 특징을 갖는 올리고머 화합물에 관한 것이다 :
a) 적어도 약 70 %의 포스포로티에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함하는 주쇄;
b) (i) 적어도 약 50 %의 퓨린 함량, 또는 (ii) 적어도 약 50 %의 구아노신 - 시토신 (GC) 함량으로 적어도 약 45 %의 퓨린 함량;
c) 적어도 14 핵 염기 내지 29 핵 염기 이하 길이;
d) 37 ℃에서 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 포함하는 수용액에서 THOC4 및 SSB1 중 하나 또는 둘 모두에 결합; 과
e) 생체 내 또는 시험 관내에서 종양 세포의 세포 사멸 또는 괴사를 일으킨다.
또한, SSB1 이외에도, 본 발명의 올리고머 화합물은 또한 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 포함하는 수용액에서 37 ℃에서 SSB2에 결합한다는 것이 판명되었다. 이 결정 및 SSB1 (hSSB1 및 mSSB1 포함) 및 SSB2가 각각 올리고 뉴클레오타이드 / 올리고사카라이드 결합 (OB) - 배향 단백질임을 관찰 한 결과, 본원에 기재된 올리고머 화합물은 일반적으로 OB 폴드 단백질을 결합시키는 것으로 제안되었다.
본 발명자들은 또한 이들 올리고머 화합물이 전형적으로 다음과 같은 특징을 갖는다는 것을 발견했다 :
f) 45 ℃ 내지 80 ℃ 범위의 용융 온도 (Tm);
g) 종양 세포에 의한 특이적 흡수;
h) 종양 세포의 핵에서 세포질로의 mRNA의 전좌(cytoplasm)를 억제한다.
3. 1 올리고머 화학 및 디자인
본 발명의 올리고머 화합물은 일반적으로 단일 가닥이고 바람직하게는 길이가 14 핵염기 이상 (예를 들어, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 그 이상)이고 길이가 29 핵염기 이하(예 : 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21 이하)이다. (즉, 29 개, 28 개, 27 개, 26 개, 25 개, 24 개, 23 개, 22 개, 21 개 이하 또는 그 이상의 연결된 뉴클레오시드 / 모노머 서브 유니트). 특정 실시 양태에서, 올리고머는 길이가 14 및 28, 14 및 27, 14 및 26, 14 및 25, 14 및 24, 14 및 23, 14 및 22, 14 및 21, 14 및 20, 15 및 29, 15 및 28, 15 및 27, 15 및 26, 25, 15 및 24, 15 및 23, 15 및 22, 15 및 21, 15 및 20, 16 및 29, 16 및 28, 16 및 27, 16 및 26, 16 및 25, 16 및 24, 16 및 23, 16 및 22, 16 및 21, 16 및 20, 17 및 29, 17 및 28, 17 및 27, 17 및 26, 17 및 25, 17 및 24, 17 및 23, 17 및 22, 17 및 21, 20, 18 및 29, 18 및 28, 18 및 27, 18 및 26, 18 및 25, 18 및 24, 18 및 23, 18 및 22, 18 및 21, 18 및 20, 19 및 29, 19 및 27, 19 및 26, 19 및 25, 19 및 24, 19 및 23, 19 및 22, 19 및 21, 또는 19 및 20 사이의 뉴클레오티드이다. 당업자는 본 발명이 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 또는 29 핵 염기 길이의 올리고머 화합물을 구현한다는 것을 이해할 것이다.
3.2 백본 화학
3.2.1 인터뉴클레오시드 결합
올리고머 주쇄는 적어도 약 70 %의 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함한다. 이와 관련하여, 모든 인터 뉴클레오시드 결합이 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함 할 필요는 없으므로 본 발명은 포스포디에스테르, 포스포로디티오에이트, 포스포네이트, 메틸포스포네이트, 알킬포스포네이트, 3'- 알킬렌과 같은 대안적인 인터뉴클레오시드 결합을 또한 포함하는 혼합 골격을 갖는 올리고머 화합물 포스 포로티오아미데이트, 포스포로티오아미데이트, 티오알킬포스포네이트, 포스포리에스테르, 티오노알킬포스포 네이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 티오알킬 포스포트리에스테르셀레노포스페이트 및/또는 보레노포스페이트 인터뉴클레오시드 결합을 포함 할 수 있다. 일부 구체 예에서, 올리고머 주쇄의 인터뉴 클레오 시드 간 결합의 적어도 약 70 %, 80 %, 90 % 또는 심지어 100 %는 포스 포로 티오 에이트 뉴 클레오시드 간 결합을 포함한다. 바람직한 실시 양태에서, 올리고머 주쇄의 모든 인터뉴클레오티드 결합은 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 간 결합을 포함한다.
적어도 약 70 %의 포스 포로 티오 에이트 뉴 클레오 시드 사이드 결합 (PIL)을 갖는 대표적인 올리고머 백본은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 개의 PIL, 15- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 10 또는 11 PIL, 16- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 11 PIL, 17- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 12 PIL, 18- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 12 또는 13 PIL, 적어도 13 핵산 올리고머에서 13 PIL, 20 핵 염기 올리고머에서 적어도 14 PIL, 21 핵 염기 올리고머에서 적어도 14 또는 15 PIL, 22 핵 염기 올리고머에서 적어도 15 PIL, 23 핵산 올리고머, 24 핵 염기 올리고머에서 최소 17 PIL, 25 핵산 올리고머에서 최소 17 또는 18 PIL, 26 핵 염기 올리고머에서 최소 18 PIL, 27 핵산 올리고머에서 최소 19 PIL , 28- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 19 또는 20 PIL 및 29- 뉴 클레오베이스 올리고머에서 최소 20 PIL 을 포함한다.
80 % 및 90 % PIL에 대한 올리고머 길이의 함수로서의 PIL의 대표 번호는 상기 표 1로부터 계산 될 수 있다.
임의의 다른 인터뉴클레오티드 연결기(즉, PIL 이외의 인터 뉴클레오티드 연결기)는 올리고머의 한쪽 또는 양쪽 말단에 있을 수 있고, 올리고머의 중앙 부분에 있을 수 있고, 서로 인접 할 수 있고, 또는 올리고머 전체에 걸쳐 분산 될 수 있다.
3.2.2 변형(수정)된 당 잔기 ( 모이어티 )
올리고머의 골격은 적절하게는 2'-O- 메틸, 2'-O- 메 톡시 에틸 및 2'-O-2- 메 톡시 에틸을 포함하는 하나 이상의 2'-O- 알킬 변형 된 당 잔기를 포함한다. (예 : 2'-O- 메틸 당 부분). 특정 예에서, 올리고머는 하나 이상의 2'-O- 메틸 리보스 잔기를 포함한다. 적합하게는, 올리고머의 당 잔기의 적어도 약 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 전부가 각각 2'-O- 알킬 변형 당 잔기이다. (예를 들어, 2'-O- 메틸 변형 당 잔기). 특정 실시 양태에서, 올리고머의 모든 당 잔기는 각각 2'-O- 알킬 변형 된 당 잔기이다. (예를 들어, 2'-O- 메틸 변형 당 잔기).
적어도 약 50 %의 대표적인 MSM 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7MSM 핵 염기, 15- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 또는 8 MSM 핵 염기, 16 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 MSM 핵 염기, 17- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 또는 9 MSM 핵 염기, 18 핵 염기 올리고머에서 최소 9 MSM 핵 염기, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 또는 10 MSM 핵 염기, 20 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 MSM 핵 염기, 21- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 또는 11 MSM 핵 염기, 22 핵 염기 올리고머에서 적어도 11 MSM 핵 염기, 23 핵 염기 올리고머에서 적어도 11 또는 12 MSM 핵 염기, 24 핵 염기 올리고머에서 적어도 12 MSM 핵 염기, 25- 핵 염기 올리고머에서 적어도 12 또는 13 MSM 핵 염기, 26 핵 염기 올리고머에서 최소 13 MSM 핵 염기, 27- 핵 염기 올리고머에서 적어도 13 또는 14 MSM 핵 염기, 28 핵 염기 올리고머에서 적어도 14 MSM 핵 염기 및 29 핵 염기 올리고머에서 적어도 14 또는 15 MSM 핵 염기를 포함한다.
60 %, 70 %, 80 % 또는 90 % MSM 함량에 대한 올리고머 길이의 함수로서의 MSM 핵 염기의 대표적인 수는 상기 표 1로부터 계산 될 수 있다.
3. 3 핵염기 서열
핵산 염기 서열은 하기에 기재되는 바와 같이, 퓨린 및 / 또는 GC 함량 및 / 또는 Tm을 달성하기 위한 임의의 적합한 기술을 사용하여 디자인 될 수 있다. 본 발명의 비 표적화 올리고머에 있어서, 핵 염기 서열은 랜덤 시퀀스 발생기 (예를 들어, 스위스 - 프로 웹 사이트 http://au.expasy.org/tools/randseq에 위치한 랜덤 시퀀스 발생기 툴)를 사용하여 생성 될 수 있다 (예, BLAST)에 의해 스크리닝하여 핵산 염기가 선택된 전사체 및 / 또는 게놈과 적절한 서열 동일성을 갖도록 한다. 대안적으로, 안티센스 올리고머에 대해, 적합한 퓨린 및 / 또는 GC 함량 및 / 또는 Tm을 갖는 표적 서열을 확인하기 위해 적절한 분석 수단 (예를 들어, 올리고 분석기, 프라이머 3, 프라이머 퀘스트 등)을 사용하여 목적 핵산 서열을 분석 할 수있다.
3. 3. 1 퓨린 함량
올리고머의 핵 염기 서열은 적절하게는 약 45 % 이상 내지 약 90 % 이하의 퓨린 함량, 예를 들어 약 45 %, 약 50 %, 약 55 %, 약 60 %, 약 65 %, 약 70 %, 약 75 %, 약 80 %, 약 85 % 또는 약 90 %의 퓨린 함량을 갖는다. 특정 실시 양태에서, 올리고머는 약 45-90 %, 약 45-85 %, 약 45-80 %, 약 45-75 %, 약 45-70 %, 약 45-65 %, 약 45-75 % 약 45-55 %, 약 45-50 %, 약 50-90 %, 약 50-85 %, 약 50-80 %, 약 50-75 %, 약 50-70 %, 약 50-65 % , 약 50-60 %, 약 50-55 %, 약 55-90 %, 약 55-85 %, 약 55-80 %, 약 55-75 %, 약 55-70 %, 약 55-65 % 또는 약 55-60 %의 퓨린 함량을 갖는다.
적어도 약 45 %의 대표적인 퓨린 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 6 개의 퓨린, 15 핵 염기 올리고머에서 적어도 6 개 또는 7 개의 퓨린, 16 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 개의 퓨린, 17- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 개 또는 8 개의 퓨린, 18 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 개의 퓨린, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 개 또는 9 개의 퓨린, 20 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 개의 퓨린, 21- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9-10 퓨린, 22 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 개의 퓨린, 23- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 개의 퓨린, 24- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 또는 11 개의 퓨린, 25- 핵 염기 올리고머에서 적어도 11 개의 퓨린, 26- 핵 염기 올리고머에서 적어도 11 또는 12 퓨린, 27- 핵 염기 올리고머에서 적어도 12 개의 퓨린, 28 핵 염기 올리고머에서 적어도 12 또는 13 퓨린 및 29 뉴 클레오베이스 올리고머에서 적어도 13 퓨린 을 포함한다.
50 %, 60 %, 70 %, 80 % 또는 90 % 퓨린 함량에 대한 올리고머 길이의 함수로서의 퓨린 핵 염기의 대표적인 수는 상기 표 1로부터 계산 될 수있다.
3.3. 2 GC 함량
올리고머의 핵 염기 서열은 적어도 약 50 % 내지 약 90 % 이하, 약 50 %, 약 55 %, 약 60 %, 약 65 %, 약 70 %, 약 75 %, 약 80 %, 약 85 % 또는 약 90 %의 GC 함량을 가질 수 있다. 특정 실시 양태에서, 올리고머는 50-90 %, 50-85 %, 50-80 %, 50-75 %, 50-70 %, 50-65 %, 50-60 %, 50-55 %, 55-90 %, 55-85 %, 55-80 % 55-75 %, 55-70 %, 55-65 % 또는 55-60 %의 GC 함량을 갖는다.
적어도 약 50 %의 대표적인 GC 함량은 14- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7G / C, 15- 핵 염기 올리고머에서 적어도 7 또는 8 G / C, 16 핵 염기 올리고머에서 적어도 8G / C, 17- 핵 염기 올리고머에서 적어도 8 또는 9 G / C, 18 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 G / C, 19- 핵 염기 올리고머에서 적어도 9 또는 10 G / C, 20 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 G / C, 21- 핵 염기 올리고머에서 적어도 10 또는 11 G / C, 22 핵 염기 올리고머에서 11 G / C 이상, 23- 핵 염기 올리고머에서 11 또는 12 G / C 이상, 24- 핵 염기 올리고머에서 12 G / C 이상, 25- 핵 염기 올리고머에서 적어도 12 또는 13 G / C, 26 핵 염기 올리고머에서 적어도 13G / C, 27- 핵 염기 올리고머에서 적어도 13 또는 14 G / C, 28 핵 염기 올리고머에서 14 G / C 이상 및 29 핵 염기 올리고머에서 14 G / C 이상을 포함한다.
60 %, 70 %, 80 % 또는 90 % GC 함량에 대한 올리고머 길이의 함수로서의 G / C 뉴 클레오 염기의 대표적인 수는 상기 표 1로부터 계산 될 수 있다.
3.3.3 퓨린과 GC 함량의 실시 예
특정 구현 예에서, 올리고머의 핵 염기 서열은 상기 기재된 바와 같이 적어도 약 45 % 및 최대 약 90 %의 퓨린 함량을 가지며, 적어도 약 50 % 내지 약 90 % %이다.
다른 구체 예에서, 올리고머의 핵산 염기 서열은 적어도 약 50 % 내지 약 90 %의 퓨린 함량 및 약 50 % 미만 및 10 % 초과의 GC 함량을 가지며, 예를 들어, 약 50 %, 약 45 %, 약 40 %, 약 35 %, 약 30 %, 약 25 %, 약 20 %, 약 15 % 또는 약 10 % 이러한 유형의 예시적인 예에서, 올리고머는 약 45 내지 90 %, 약 45 내지 85 %, 약 45 내지 80 %, 약 45 내지 75 %, 약 45 내지 70 %, 약 45 내지 65 % 약 45-60 %, 약 45-55 % 또는 약 45-50 %의 GC 함량 및 약 10-50 %, 약 15-50 %, 약 20-50 %, 약 25-50 %, 약 30-50 % 약 35 내지 50 %, 약 40 내지 50 %, 약 45 내지 50 %, 약 10 내지 45 %, 약 15 내지 45 %, 약 20 내지 45 %, 약 25 내지 45 %, 약 30 내지 45 % 약 35 내지 45 %, 약 40 내지 45 %, 약 10 내지 40 %, 약 15 내지 40 %, 약 20 내지 40 %, 약 25 내지 40 %, 약 30 내지 40 % 또는 약 35 내지 40 %이다.
3. 3. 4 용용 온도
올리고머는 적합하게는 적어도 약 45 ℃ 및 일반적으로 80 ℃ 이하의 용융 온도 (Tm)를 갖는다. (예를 들어, 약 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75 또는 80 ℃) 특정 실시 양태에서, 올리고머는 45 내지 80 ℃, 45-75 ℃, 45-70 ℃, 45-65 ℃, 45-60 ℃, 45-55 ℃, 45-50 ℃, 50-80 ℃, 50-75 ℃, 50-75 ℃, 70 ° C, 50-65 ° C, 50-60 ° C 또는 50-55 °의 Tm을 가진다.
3.3.5 비 표적 올리고머
표 2에 제시된 대부분의 올리고머는 증식을 현저하게 억제하거나 종양 세포의 죽음을 자극하지만, 전사체 및 / 또는 게놈과의 상동성이 실질적으로 상실된다.
본 발명의 올리고머 핵염기 서열은 표적 종양 세포의 전사체에 대한 완전한 상보성이 결핍될 수 있으며, 종종 표적 종양 세포가 적절하게 유래된 포유류의 게놈에 대한 완전한 상보성이 결여된다. 일부 구체 예에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵산 염기 서열은 전 사체에 대한 상보성이 실질적으로 결여되어있다. 적절하게는 약 95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % 올리고머의 핵 염기의 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 %는 트랜스크립톰과 염기쌍을 형성 할 수 있다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 전사체와 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵산 염기가 95 % 이하인 14에서 29 개의 핵염기로 이루어진 올리고머는 전사체의 기준 핵 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍을 형성 할 수 없는 적어도 하나의 비상보적인 핵 염기를 갖는다. 다른 예시적인 예에서, 올리고머는 전 사체와 염기쌍을 형성 할 수 있는 핵산 염기가 90 % 이하인 14 내지 29 뉴 클레오 염기의 올리고머가 전사체의 기준 핵 염기 서열의 핵 염기와 염기쌍을 형성 할 수 없는 2 개 이상의 비상 보적 핵 염기를 갖는다.
일부 실시 양태에서, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 종양 세포가 적절하게 유래 된 포유 동물의 게놈에 대한 상동성이 결여된다. 적합하게는, 올리고머의 길이에 걸친 핵 염기 서열은 게놈에서 기준 핵 염기 서열을 정의하는 임의의 동일한 길이의 인접한 핵 염기와 약 95 %, , 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 70 %, 65 %, 60 %, 55 %, 50 %, 45 %, 40 %, 35 % 30 %, 25 %, 20 %, 15 % , 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 이하의 서열 동일성을 갖는다. 이러한 유형의 예시적인 예에서, 게놈의 기준 핵 염기 서열과 95 % 이하의 서열 동일성을 갖는 14 내지 29 핵염기의 올리고머는 기준 핵 염기 서열의 매칭 위치에서 핵 염기와 동일하지 않거나 동등하거나 동등한 핵 염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 하나 이상의 핵 염기를 갖는다. 다른 예시적인 예에서, 게놈의 기준 핵 염기 서열과 90 % 이하의 서열 동일성을 갖는 14 내지 29 핵염기의 올리고머는 기준 핵 염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하거나 동등하거나 또는 동등한 핵 염기 쌍 형성 능력을 갖지 않는 2 개 이상의 핵 염기를 갖는다.
올리고머 길이 및 핵염기 쌍 형성에 관여 할 수 있거나 서열 동일성을 가질 수 있는 핵 염기의 백분율의 함수로서의 핵 염기의 대표 번호는 상기 표 1로부터 계산 될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 비 표적화 올리고머 핵 염기 서열은 하기 서열 번호(SEQ ID NO)로부터 선택된다 : 1, 2, 3, 5, 7, 36, 37, 38, 39, 40,41,44,45,51,52,53,54,55,56,59,61,62,63,64,6,6 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 91, 92, 93, 94, 98, 100, 103, 104, 105, 107, 108, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 138, 143, 144, 145, 152, 153, 155, 162, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 191, 192, 196, 198, 203, 206, 207, 209, 210, 211, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229,230,231,232,233,234,235,236,237, 238, 239, 240, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 258, 259, 261,263,264,265,269,270,271,272,274,277, 281, 282, 283, 286, 287, 290, 291, 292, 293, 295, 296, 298, 300, 301 및 303.
3.3.6 안티센스 올리고머
특정 표적 서열에 대한 특이성을 갖는 안티센스 올리고머가 올리고머 디자인에 상술한 골격 화학 및 염기 함량을 포함시킴으로써 SSB1 및 / 또는 THOC4에 결합 할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 올리고머는 또한 안티센스 올리고머가 표적화 된 유전자에 관계없이 생체 내 또는 시험 관내에서 종양 세포의 사멸 또는 괴사를 일으키는 것으로 밝혀졌다. 그렇지 않으면, 안티센스 올리고머의 표적 서열은 당 업계에 공지 된 표준 안티센스 디자인 프로그램 및 분석 도구를 사용하여 디자인 될 수 있다.
따라서, 본 발명의 안티센스 올리고머의 핵 염기 서열은 전형적으로 선택된 유전자의 안티센스 가닥에 실질적으로 상보성을 가질 것이다. 이러한 구체 예에서, 핵 염기 서열은 고도의 엄격한 조건하에 선택된 유전자에 의해 코딩 된 전 mRNA 또는 mRNA 분자를 포함하여, 선택된 유전자 또는 그의 전사물의 표적 서열에 적절하게 상보적이며 하이브리드화 될 수있다. 안티센스 올리고머는 당 업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 효능을 테스트 할 수 있다.
예를 들어, 안티센스 올리고머는 헤테로 이중 형성을 시험 할 수 있다. 표적 핵산 서열과 헤테로 이중체를 형성하는데 주어진 안티센스 올리고머의 효과는 당 업계에 공지된 스크리닝 방법에 의해 결정될 수 있다.
예를 들어, 올리고머는 종양 세포에서 우선적으로 발현 된 mRNA를 함유하는 세포 배양 물에서 배양 될 수 있으며, 표적 mRNA에 대한 영향은 (1) 당업자에게 공지 된 절차를 사용하여 표적 서열 및 비 - 표적 서열과의 헤테로 이중체 형성, (2) RT-PCR 또는 노던 블롯과 같은 표준 기술에 의해 결정된 종양 세포에 의해 발현 된 표적 mRNA의 양, (3) ELISA 또는 웨스턴 블 랏팅과 같은 표준 기술에 의해 결정된 표적 mRNA로부터 전사 된 단백질의 양의 존재 유무에 대한 모니터링에 의해 평가된다. 대안으로, 또는 부가 적으로, 안티센스 올리고머로 처리 된 종양 세포에서 표적 유전자의 발현을 측정함으로써 안티센스 올리고머의 유효성을 결정할 수있다.
특정 실시 양태에서, 안티센스 올리고머는 eIF-4E 또는 SSB1을 표적으로 한다. 예시적인 안티센스 올리고머 핵 염기 서열은 하기 서열 번호로부터 선택된다: 6, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 101, 278, 279, 280, 284, 285, 288, 289, 297 및 299.
3.4 올리고머 특성 변형
본 발명은 또한 본 발명의 올리고머 화합물의 특성을 향상시킬 수 있거나 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬 게이트의 부착을 포함하여 올리고머 화합물 또는 그의 대사 산물을 추적하는 데 사용될 수 있는 변형을 고려한다. 통상적으로 강화된 특성은 활성, 세포 분포 및 세포 흡수를 제한없이 포함한다. 일부 구체 예에서, 이러한 개질 된 올리고머 화합물은 히드록실 또는 아미노 작용기와 같은 올리고머 화합물 상에 이용 가능한 관능기에 공액 결합기를 공유 결합시킴으로써 제조된다. 본 발명의 컨쥬게이트 그룹은 올리고머의 약물 동력 학적 특성을 강화시키는 그룹 및 올리고머의 약동학적 성질을 강화시키는 그룹을 포함한다. 인터카 레이터, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리 아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리 에테르. 전형적인 컨쥬 게이트 그룹은 콜레스테롤, 지질, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난 트리 딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오 레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료를 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약력학적 성질을 향상시키는 그룹은 올리고머 흡수 및 / 또는 분해에 대한 올리고머 내성을 향상시키는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특성을 개선시키는 그룹을 포함한다. 본 발명의 맥락에서 약동학적 성질을 강화시키는 그룹은 올리고머 흡수, 분포, 대사 및 배설을 포함하지만 이에 한정되지 않는 특성을 개선시키는 그룹을 포함한다. 대표적인 접합체 그룹은 국제 특허 출원 PCT / US92 / 09196에 개시되어있다.
컨쥬 게이트 그룹은 예시로 든 지질 모이어티를 포함 하나 이에 한정되지 않는다 : 콜레스테롤 잔기 (Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556), 콜린 산 (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1994, 4, 1053-1060), 티오 에테르, 예를 들어 헥실 -S- 트리 틸 티올 (Manoharan et al., Ann. NY Acad. Sci., 1992, 660, 306-309, Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3, 2765-2770), 티오 콜레스테롤 (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533-538), 도데 칸디올 또는 운데 실 잔기와 같은 지방족 사슬 (Saison-Behmoaras et al., EMBO J., 1991, 10, 1111-1118; Kabanov 등, FEBS Lett., 1990, 259, 327-330, Svinarchuk et al. ., Biochimie, 1993, 75, 49-54), 예를 들어 디 - 헥사 데실 -rac- 글리세롤 또는 트리 에틸 암모늄 1,2- 디 -O- 헥사 데실 -rac- 글리세로 -3- -H- 포스 포 네이트 (문헌 [Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654 Shea 등, Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777-3783), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969-973), 또는 아다만탄 아세트산 (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651-3654), 팔미틸 부분 (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229-237), 또는 옥틸 데실 아민 또는 헥실 아미노 - 카르 보닐 - 옥시 콜레스테롤 잔기 (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923-937).
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 활성 약물 물질, 예를 들어 아스피린, 와파린, 페닐 부타 존, 이부프로펜, 수 프로 펜, 펜 부펜, 케토 프로 펜, (S) - (+) - 프라노 프로 펜, 카르 프로 펜, 포스 포 릭산, 벤조 티아 디아 지드, 클로로 티아 지드, 디아 제핀, 인도 메티 신, 바르 비 튜스 산염, 세 팔로 스포린, 설파제, 항 당뇨병제, 항균제 또는 항생제를 포함한다. 올리고 뉴클레오티드 - 약물 접합체 및 그의 제조는 미국 특허 출원 제 09 / 334,130 호에 개시되어 있으며, 이는 본원에 참조로서 통합된다.
본 발명의 올리고머 화합물은 또한 예를 들어 뉴클레아제 안정성과 같은 특성을 향상시키기 위해 올리고머 화합물의 하나 또는 두 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화기를 갖도록 변형 될 수 있다. 안정화 그룹에는 캡 구조가 포함된다. 이러한 말단 변형은 말단 핵산 잔기를 갖는 올리고머 화합물을 엑소 뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 세포 내 전달 및 / 또는 위치 파악을 도울 수있 다. 캡은 5'- 말단 (5'- 캡) 또는 3'- 말단 (3'- 캡)에 존재할 수 있거나 두 말단에 존재할 수 있다. 비 제한적인 예에서, 5'- 캡은 반전된 무치환 잔류 (잔기), 4 ', 5'- 메틸렌 뉴클레오티드; 1- (베타 -D- 에리트로 푸라 노실) 뉴클레오티드, 4'- 티오 뉴클레오티드, 카보 사이 클릭 뉴클레오티드; 1,5- 언 하이드로 헥 시톨 뉴클레오타이드; L- 뉴클레오타이드; 알파 - 뉴클레오타이드; 변형 된 염기 뉴클레오타이드; 포스 포 디티 오 에이트 결합; 트레오 - 펜토 푸라 노실 뉴클레오타이드; 비 사이 클릭 3 ', 4'- 세코 뉴클레오타이드; 비 사이 클릭 3,4- 디 하이드 록시 부틸 뉴클레오티드; 비 사이 클릭 3,5- 디 하이드 록시 펜틸 뉴클레오티드, 3'-3'- 역전 된 뉴클레오티드 잔기; 3'-3'- 역전 된 무 치환 잔기; 3'-2'- 역전 된 뉴클레오티드 잔기; 3'-2'- 역전 된 무 지방 잔기; 1,4- 부탄디올 포스페이트; 3'- 포스 포르 아미 데이트; 헥실 포스페이트; 아미노 헥실 포스페이트; 3'- 포스페이트; 3'- 포스 포로 티오 에이트; 포스 포디 티오 에이트; 또는 브리징 또는 비 - 브리징 메틸 포스 포 네이트 잔기이다. (보다 상세한 내용은 Wincott et al., 국제 PCT 공보 WO 97/26270 참조).
예시적인 3'- 캡 구조는 예를 들어 4 ', 5'- 메틸렌 뉴클레오타이드; 1- (베타 -D- 에리트로 푸라 노실) 뉴클레오타이드; 4'- 티오 뉴클레오티드, 카르 보시 클릭 뉴클레오티드; 5'- 아미노 - 알킬 포스페이트; 1,3- 디아 미노 -2- 프로필 포스페이트, 3- 아미노 프로필 포스페이트; 6- 아미노 헥실 포스페이트; 1,2- 아미노 도데 실 포스페이트; 히드 록시 프로필 포스페이트; 1,5- 언 하이드로 헥 시톨 뉴클레오타이드; L- 뉴클레오타이드; 알파 뉴클레오타이드; 변형 된 염기 뉴클레오타이드; 포스 포디 티오 에이트; 트레오 - 펜토 푸라 노실 뉴클레오타이드; 비 사이 클릭 3 ', 4'- 세코 뉴클레오타이드; 3,4- 디 하이드 록시 부틸 뉴클레오타이드; 3,5- 디 하이드 록시 펜틸 뉴클레오타이드, 5'-5'- 반전 뉴클레오타이드 잔기; 5'-5'- 비 반전 무산 잔기; 5'- 포스 포르 아미 데이트; 5'- 포스 포로 티오 에이트; 1,4- 부탄디올 포스페이트; 5'- 아미노; 포스 포로 티오 에이트 및 / 또는 포스 포로 디티 오 에이트, 브리징 또는 비 브리징 메틸 포스 포 네이트 및 5'- 메르 캅토 잔기를 포함한다 (보다 상세한 내용은 문헌 [Beaucage and Tyer, 1993, Tetrahedron 49, 1925 및 공개 된 미국 특허 출원 공보 번호 US 2005/0020525 2005 년 1 월 27 일 발행 참조).
본 발명의 올리고머는 DNA 유사 화합물 (문헌 [Oligonucleotides and Analogs, Protocols for Agrawal (1993), Humana Press)에 대한 문헌 절차] 및 / 또는 [참조 문헌]을 포함하는 당업자에게 공지 된 방법을 사용하여 제조 될 수 있다. RNA 유사 화합물 (Scaringe, Methods, 2001, 23, 206-217, Gait 등, RNA에서의 화학 합성 RNA의 응용 : 단백질 상호 작용, Ed. Smith (1998), 1-36, Gallo et al., Tetrahedron, 2001, 57, 5707-5713) 합성에 따라 적절하다.
다르게는, 본 발명의 올리고머 화합물은 예를 들어 Sigma-Aldrich Inc. (Castle Hill, NSW, Australia)와 같은 다양한 올리고 뉴클레오티드 합성 회사로부터 구입할 수 있다. 사용 된 특정 프로토콜과 관계없이, 본 올리고머 화합물은 고체상 합성의 잘 알려진 기술을 통해 편리하고 일상적으로 제조 될 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, Applied Biosystems (Foster City, Calif.)를 포함한 여러 벤더에 의해 판매된다. 당 업계에 공지 된 임의의 다른 합성 수단을 추가로 또는 대안 적으로 사용할 수 있다 (용액 상 합성 포함). 올리고머 화합물의 정제 및 분석 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 분석 방법에는 모세관 전기 영동 (CE) 및 전기 분무 - 질량 분광법이 포함된다. 본 발명의 방법은 올리고머 합성 또는 정제 방법에 의해 제한되지 않는다.
3.5 올리고머 특성
올리고머 화합물은 유리 (비 - 복합체) 형태로 투여 될 때 종양 세포막을 가로 지르는 촉진 또는 활성 수송에 의해 종양 세포에 의해, 또는 복합체 형태로 투여 될 때 엔도사이토틱 메카니즘에 의해 종양 세포에 의해 흡수 될 수 있다. 올리고머는 수송을 촉진 시키거나 또는 세포막을 가로 질러 올리고머를 능동적으로 수송 할 수 있는 막 운반체 시스템 (즉, 막 단백질 또는 단백질)에 대한 기질 일 수 있다. 이 특징은 다음과 같이 올리고머 상호 작용 또는 세포 섭취에 대한 다수의 시험 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
제 1 테스트는 올리고머 화합물이 세포 표면상의 선택된 하전 올리고머에 의해 치환되거나 치환 될 수 있는 능력을 조사함으로써 세포 표면 수용체에서의 결합을 평가한다. 세포는 전형적으로 형광으로 표지 된 시험 올리고머의 주어진 양으로 약 10-300nM 사이의 최종 올리고머 농도로 인큐베이션된다. 그 직후, 예를 들어, 10-30 분 (시험 올리고머의 현저한 내재화가 발생할 수 있기 전에), 치환 화합물이 점진적으로 증가하는 농도로 첨가된다. 시험 화합물이 세포 표면 수용체에 결합 할 수 있다면, 변위하는 화합물은 시험 화합물을 치환하는 것으로 관찰 될 것이다. 치환 화합물이 시험 화합물 농도의 10 배 이하의 농도에서 50 % 변위를 나타내는 것으로 나타나면, 시험 화합물은 치환 화합물과 같은 세포 수송 시스템의 동일한 인식 부위에서 결합하는 것으로 간주된다.
제 2 시험은 시험 화합물이 세포 내로 표지 된 리포터, 예를 들어 형광 리포터를 수송하는 능력을 검사함으로써 세포 수송을 측정한다. 상기 세포를 약 10 내지 300nM 사이의 최종 농도로 첨가 된 표지 된 시험 화합물의 존재 하에 항온 처리한다. 30-120 분 동안 인큐베이션 한 후, 세포 내 라벨에 대해, 예를 들어 현미경에 의해 세포를 검사한다. 유의 한 세포 내 표지의 존재는 시험 화합물이 촉진되거나 능동적 인 수송에 의해 운반된다는 증거이다.
올리고머 화합물은 또한 복합체 형태로 투여 될 수 있는데, 여기서 복합체 화제는 전형적으로 중합체, 예를 들어, 양이온성 지질, 폴리펩타이드 또는 비 - 생물학적 양이온 성 중합체이며, 올리고머상의 임의의 순 전하와 반대 전하를 갖는다. 음이온 올리고 뉴클레오타이드와 양이온 성 지질 또는 다른 중합체 성분 사이의 이중층 복합체를 포함하는 복합체를 형성하는 방법은 잘 알려져있다. 예를 들어, 양이온 성 지질 DOTMA (N- [1- (2,3- 디올 레일 옥실) 프로필 (D) -L- 글루코 피라 노실 -L- 아스 코르 빈산]을 함유하는 리포솜 조성물 LipofectinTM (Felgner 등, Proc Natl Acad Sci USA, 1987, 84 (21) : 7413-7417) N, N- 트리메틸 암모늄 클로라이드) 및 중성 인지질 DOPE (디올 레일 포스파티딜 에탄올 아민)가 널리 사용된다. 투여 후, 복합체는 엔도 좀 체내에서 입자 캡슐화를 포함하는 엔도사이 틱 (endocytotic) 기작을 통해 세포에 흡수된다.
올리고머 화합물은 또한 올리고머의 5 '또는 3'말단에 공유 결합 된 아르기닌이 풍부한 펩티드와 접합 된 형태로 투여 될 수있다. 펩타이드는 전형적으로 8-16 개의 아미노산이며, 아르기닌과 페닐알라닌 및 시스테인을 포함하는 다른 아미노산의 혼합물로 구성된다. 아르기닌이 풍부한 펩티드 -PMO 접합체의 사용은 올리고머의 세포 흡수를 증진 시키는데 사용될 수 있다 (Moulton et al., Bioconjug Chem, 2004, 15 (2) : 290-299; Nelson et al., Bioconjug Chem, 2005, 16 (4) : 959-966).
일부 예에서, 리포솜은 올리고머의 세포 내로의 흡수를 촉진시키기 위해 사용될 수있다 (Williams, SA, Leukemia 10 (12) : 1980-1989, 1996, Lappalainen 등, Antiviral Res., 1994 , 23 : 119, Uhlmann 등, Chemical Reviews, 1990, 90 (4) : 544-584). 하이드로 겔은 또한 예를 들어 WO 93/01286에 기재된 바와 같이 올리고머 투여 용 비히클로서 사용될 수있다. 대안 적으로, 올리고머는 미세 구 또는 미세 입자로 투여 될 수있다 (Wu, G.Y. 및 Wu, C.H., J.Biol.Chem.1987, 262 : 4429-4432 참조). 대안 적으로, 미국 특허 제 6,245,747 호에 기술된 바와 같이 안티센스 올리고머와 복합체를 형성 한 기체 - 충진 미세 기포의 사용은 표적 조직으로의 전달을 향상시킬 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 올리고머의 필수 흡수 특성은 동물 (예 : 포유류)에 표지 화합물을 투여하는 간단한 생체 내 시험 및 체액 샘플 올리고머가 투여 된 후 수 시간 후에 동물로부터 취하여, 전체 또는 일부의 동물을 동물의 종양 세포에서 올리고머의 존재를 위해 이미징한다.
특정 실시 양태에서, 대상 올리고머 화합물은 비 종양 또는 정상 세포에 의한 것보다 포유 동물의 종양 세포에 의해 우선적으로 흡수된다.
본 발명의 올리고머 화합물은 THOC4 및 / 또는 SSB1과 적절하게 결합한다. 후보 올리고머는 친 화성 분석을 포함하는 임의의 적합한 분석을 사용하여 단백질 중 하나 또는 둘 모두에 대한 결합을 시험 할 수 있다. 분석은 THOC4 및 / 또는 SSB1에 대한 올리고머 화합물의 해리 속도 상수 (kd) 또는 결합 속도 상수 (ka) 또는 평형 결합 상수 (KD) 중 하나 이상을 측정 할 수 있다. 이들 상수는 일부 실시 양태에서 방사성 표지 또는 형광 표지 올리고머 결합 분석에 의해 측정된다. 이 분석은 THOC4 또는 SSB1의 적정 시리즈를 최소 농도의 표지 올리고머로 평형화한다. 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동은 THOC4 또는 SSB1에 결합하는 정도를 결정하는 데 사용된다.
친화력 측정은 핵산 : 단백질 상호 작용에 대한 표준 방법론에 의해 결정될 수 있다. 예로서, (SPR) (Rich and Myszka Curr. Opin. Biotechnol, 2000, 11 : 54, Englebienne Analyst. 1998, 123 : 1599), 당 업계에 공지된 등온 적정 열량계 (ITC) 또는 기타 역동적 상호 작용 분석. 특정 실시 양태에서, 상수는 표면 플라스 몬 공명 분석을 사용하여 측정되며, 예로서 고정 된 THOC4 또는 SSB1 또는 그의 영역을 갖는 BIAcore 표면 플라스 몬 공명 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 사용하여 수행 될 수 있다. 예시적인 SPR 방법은 U.S. 제 7,229,619 호에 기술되어 있다.
특정 실시 양태에서, THOC4는 동일한 조건 하에서 음성 대조군 올리고머 인 Neg_C에 대해 KD보다 적어도 2 배 낮은 KD로 종양 조절 올리고머와 결합한다. (예를 들어, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 함유하는 수성 조건 하에 37 ℃에서). 예시적인 조건은 실시 예 3에 기재되어있다. 대표적인 예에서, 올리고머는 kTH ≤ 약 60 nM, 약 50 nM, 약 약 40 nM, 약 약 30 nM, 약 약 20 nM 또는 약 약 10 nM의 hTHOC4를 포함하는 THOC4에 결합한다.
일부 실시 양태에서, OB 접힘 단백질은 동일한 조건 하에서 음성 대조군 올리고머 인 Neg_C의 KD보다 적어도 2 배 낮은 KD로 종양 조절 올리고머에 결합한다.(예를 들어, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 함유하는 수성 조건하에 37 ℃에서). 예시적인 조건은 실시 예 3 및 7에 기재되어있다. 대표적인 예에서, 올리고머는 OB- 폴드 단백질에 결합하며, 이는 KD ≤ 약 10 nM, ≤ 약 5 nM, ≤ 약 4 nM, ≤ 약 3 nM 또는 ≤ 약 2 nM 인 SSB1 및 SSB2를 포함한다. 상기 유형의 예시 적 실시 예에서, SSB1은 동일 조건하에 음성 대조군 올리고머 인 Neg_C에 대해 KD보다 적어도 2 배 낮은 KD로 종양 조절 올리고머에 결합한다. (예를 들어, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 함유하는 수성 조건하에 37 ℃에서). 예시적인 조건은 실시 예 3에 기재되어있다. 대표적인 예에서, 올리고머는 SSB1에 결합하며, 이는 hSSB1 및 mSSB1을 포함하고 KD ≤ 약 10 nM, 약 ≤ 약 5 nM, ≤ 약 4 nM, ≤ 약 3 nM 또는 ≤ 약 2 nM이다. 다른 예시적인 예에서, SSB2는 동일한 조건 하에서 음성 대조군 올리고머 인 Neg_C에 대한 KD보다 적어도 2 배 낮은 KD로 종양 조절 올리고머에 결합한다. (예를 들어, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 100 mM NaCl을 함유하는 수성 조건하에 37 ℃에서). 예시적인 조건은 실시 예 7에 기재되어있다. 대표적인 예에서, 올리고머는 SSB2에 결합하고, KD ≤ 약 10 nM, ≤ 약 5 nM, ≤ 약 4 nM, ≤ 약 3 nM 또는 ≤ 약 2 nM의 hSSB2를 포함한다. 대안 적으로, 또는 부가적으로, silico에서의 모델링 사용하여 본 발명의 올리고머 화합물을 설계 및 / 또는 규명할 수 있다. 예를 들어, OB- 폴드 단백질의 3 차원 2 차, 3 차 및 / 또는 4 차 아미노산 잔기 구조의 표현을 제공하는 구조 모델이 사용될 수있다. 구조 모델은 X 선 결정 구조, NMR 구조, 이론적 인 단백질 구조, 상 동성 모델링으로 생성 된 구조, 단백질 단층 촬영 모델 및 전자 현미경으로 제작 된 원자 모델을 포함한다. 특정 실시 양태에서, 후보 올리고머를 갖는 OB 배 단백질 복합체의 원자 분자 역학 (MD) 시뮬레이션은 본원에 개시된 바와 같이 OB 폴드 단백질 및 항 종양 활성에 대한 유망한 친 화성을 갖는 화합물을 규명하는데 사용될 수있다. 많은 MD 시뮬레이션 기술이 당 업계에 공지되어 있으며, 그 대표적인 예는 예를 들어 Allison JR (2016, Curr Opin Struct Biol. 43 : 79-87), Ganesan et al. (2016, Drug Discov Today S1359-6446 (16) 30414-7) 및 Karplus et al. (2002, Nature Structural Biology 9 : 646-652)가 있다.
본 발명의 올리고머는 RNA, 전형적으로 핵에서 종양 세포의 세포질로의 전위를 차단할 수 있다. 핵으로의 RNA의 전위는, 예를 들어 둘 이상의 형광 - 표지 된 종의 방출이 동시에 검출되는 핵 전좌 검정 (nuclear translocation assays)에 의해 측정 될 수 있다. 예를 들어, 세포핵은 Hoechst 33342와 같은 DNA에 특이적인 공지된 형광 단으로 표지 될 수 있다. RNA는 직접적으로 또는 간접적으로 표지 될 수 있으며, 예를 들어 RNA에 특이적인 형광 표지 항체가 될 수 있다. 핵으로 또는 핵으로부터 전위 된 RNA의 양은 제 1의 형광 - 표지 된 종의 양을 결정함으로써 결정될 수 있고, 즉, 핵은 제 2의 형광 - 표지 된 종에 대해 상관 또는 반 - 상관 된 방식으로 분포되며, 즉, 미국 특허 제 5,251,302 호에 기재된 RNA. 미국 특허 제 6,400,487 호에 기재되어 있으며, 그 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.
본 발명의 올리고머 화합물은 종양 세포의 증식을 억제 할 수 있고 종종 종양 세포의 세포 사멸 또는 괴사를 유발할 수 있다. 세포 증식은 증식하는 세포 핵 항원 (PCNA)에 결합하는 플루오레세인 표지된 항 -PCNA 항체 (예 : PC-10, Santa Cruz Biotechnology)에 세포를 노출시킴으로써 분석 될 수 있다. 선택된 올리고머는 세포주에서의 증식에 대한 영향을 시험 할 수 있다. 2 x 105에서 2 x 108 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 넣을 수 있다. 각 올리고머 1 μM ~ 10 μM을 함유하는 배지를 3 중으로 웰에 첨가 할 수 있다. 최소한, 음성 (리간드 없음) 및 양성 대조가 또한 수행된다. 2 시간 후, FITC 항 -PCNA를 웰에 첨가하고, 15 분 동안 세포와 함께 배양하고, 3 회 세척 단계 후에, 형광 수준을 플레이트 판독기를 사용하여 측정 할 수 있다. PCNA 분석은 이미 세포와 조직에서 사용되어왔다 (Kulldorff et al., J. Clin Epidemiology, 2000, 53 : 875). 증식을 억제하는 올리고머 화합물은 유방암이나 전립선 암 환자를 포함한 암 환자의 새로운 종양 생검에서 검사 할 수 있다. 종양 생검의 작은 조각을 96 웰 플레이트의 웰에 도말 할 수 있고, 상기와 동일한 분석을 각 샘플마다 반복하여 반복 할 수 있다. 형광을 읽은 후 형광 현미경으로 샘플을 평가하여 실제로 증식이 영향을 받는 세포가 암세포임을 확인할 수 있다.
아폽토시스는 세포막 포스파티딜 세린 결합 염료 (FITC 아넥신 V; Cy5.5와 같은 대안적인 염료가 또한 사용될 수 있음)를 사용하여 분석 될 수 있다. 본 발명의 올리고머 화합물은 다양한 세포주에서 세포 사멸에 대한 효과를 시험 할 수 있다. 2 x 105에서 2 x 108 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 도말할(plated) 수 있으며, 각 올리고머 1 μM 내지 10 μM을 함유하는 배지를 3 중으로 웰에 첨가한다. 최소한, 음성 (올리고머 없음) 및 양성 (bcl2 반응성 리간드) 대조군도 수행된다. 1.5 시간 후, FITC 아넥신을 웰에 첨가하고, 세포와 함께 15 분 동안 항온 배양하고, 3 회 세척 단계 후, 플레이트 판독기를 사용하여 형광 수준을 결정 하였다. 이 분석법은 bcl-2 발현 세포 및 bcl-2 트랜스 제닉 마우스 (Charles River)의 조직을 사용하여 세포에서 조직으로 전달 가능함을 입증 할 수 있다. 세포 사멸을 유도하는 리간드는 유방암 환자로부터의 새로운 종양 생검에서 시험 될 수 있다. 1 차 조직 생검을 사용하는 한가지 장점은 조직 수집 2 시간 이내에, 즉 조직이 허혈과 관련된 변화를 보이기 전에 수행 될 수 있다는 것이다. 종양 생검의 작은 조각을 96 웰 플레이트의 웰에 도말하고 상기와 동일한 분석을 각 샘플에 대해 반복하여 반복한다. 형광을 읽은 후, 샘플을 DAPI 염색 (Molecular Probes, Eugene Oreg.)으로 염색하고, 핵 모폴로지를 확인을 위해 핵 응축 및 단편화를 위해 형광 현미경으로 평가할 수 있다. 또는 DNA strand break를 표지하기 위한 전통적인 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated biotinylated deoxyuridine triphosphate nick end labeling) 방법을 사용할 수 있다.
괴사를 검출하는 기술은 요오드화 프로피듐 (propidium iodide) 또는 TOTO-3와 같은 DNA 결합 염료의 전형적인 기술을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 또는 미토콘드리아 효소 방출을위한 비색계 메틸 티아 졸 테트라졸륨 (MTT) 분석을 사용하여 세포 생존력을 결정할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 세포 생존력은 DNA 결합 염료 인 프로피듐 아이오다이드 및 TOTO-3을 사용하여 결정된다. 세포주에서 이들 분석을 수행하면 구별되는 올리고머가 광범위하게 세포 독성 인 올리고머로부터 특정 효과를 갖는 것을 촉진하는 괴사 및 세포 사멸을 구별 할 수 있게된다. 이러한 구분은 괴사 및 세포 사멸 분석을 병행하여 수행함으로써 촉진 될 수 있다. 선택된 올리고머는 세포주의 괴사에 대한 효과를 시험 할 수있다. 2 x 105에서 2 x 108 세포를 96 웰 플레이트의 각 웰에 도말 할 수 있으며, 각 올리고머 1 μM 내지 10 μM을 함유하는 배지를 3 중으로 웰에 첨가한다. 최소한, 음성 (올리고머 없음) 및 양성 대조가 또한 수행된다. 8 시간 후 요오드화 프로피듐(propidium iodide) 또는 TOTO 3을 웰에 첨가하고 15 분간 세포와 함께 항온 처리 한 다음 3 회 세척 단계 후 형광 플레이트 판독기를 사용하여 형광 수준을 결정한다. 괴사는 일반적으로 적어도 8 시간 후에 분석되기 때문에 조직 생검으로 옮기기가 어려운 분석 일 수 있으며 이러한 배경 시간을 제공 한 후 조직 생검에서 허혈로 인한 괴사가 많이 발생하기 때문에 괴사가 발생할 수 있다. 이 문제를 극복하기 위해, 인간 생검 조직을 누드 마우스에 이식하여 8 시간의 분석 기간 동안 허혈 유발 유도 괴사를 예방할 수 있다. 누드 마우스의 성장이 종양을 변화시키지 않도록 하기 위해 누드 마우스에서 1 개월 동안 성장한 종양을 외과적으로 접종하여 단기간의 세포 사멸 및 증식을 테스트 할 수 있다. 또한 종양을 조직학적으로 관찰하고 새로운 종양 체외 이식편과 비교하여 차이를 평가할 수 있다. 동일한 표적에 결합하고 경우의 50 %에서 괴사를 유도하는 리간드는 동물의 종양 내로 주사되고 8 시간 후에 수집되고 요오드화 프로피디엄으로 염색 될 수 있다. 조직 검사 결과 종양 세포가 괴사를 겪고있는 반면 생검의 다른 세포는 그렇지 않은 것으로 나타났다.
4. 올리고머의 조성 및 용도
본 발명의 올리고머 화합물은 암세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하거나 암을 치료 또는 예방하기 위한 활성제로서 유용하다. 종양 세포는 생체 내 또는 시험 관내에서 처리 될 수 있다. 따라서, 대상 올리고머는 암을 치료 또는 예방하기 위해, 약학 조성물에서 적합하게 유용하다. 이와 같이, 본 발명은 유효량의 본 발명의 올리고머 및 약학 적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 암의 증상을 치료, 예방 및 / 또는 완화하기 위한 약학 조성물을 고려한다.
본 발명의 올리고머 화합물은 상기 에스테르의 임의의 약학 적으로 허용 가능한 염, 에스테르, 또는 염 또는 임의의 다른 화합물을 포함하며, 동물, 전형적으로 인간을 포함하는 포유류에 투여시 생물학적으로 활성 인 대사 물 또는 잔기를 (직접 또는 간접적으로) 제공 할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 발명은 또한 본 발명의 올리고머 화합물, 이의 전구 약물의 제약 상 허용되는 염 및 다른 생물학적 동등 물의 전구 약물 및 약학 적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 핵산 올리고머의 경우, 약학적으로 허용되는 염의 예 및 그의 용도는 미국 특허 제 5,002,302 호 및 제 5,002,322 호 미국 특허 제 6,287,860 호에 개시되어 있다.
본 발명의 조성물은 또한 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 혼합되거나, 캡슐화되거나, 흡수 및 분포 및 / 또는 흡수를 보조하기 위해 예를 들어, 리포솜, 수용체 - 표적화 된 분자, 구강, 직장, 국소 또는 다른 제제로 사용될 수 있다. 이러한 흡수, 분포 및 / 또는 흡수 - 보조 제제의 제조를 교시하는 대표적인 특허 문헌은 미국 특허 제 5,002,131 호, 미국 특허 제 5,108,921 호; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,158; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575; 및 제 5,595,756 호 (이들 각각은 본원에 참고로 인용 됨)에 기재되어있다.
본 발명의 약제 학적 조성물은 국소 치료 또는 전신 치료가 바람직한 지의 여부 및 치료할 영역에 따라 여러 가지 방법으로 투여 될 수 있다. 투여는 국소 (안과 및 질 및 직장 전달을 포함하는 점막을 포함 함), 분무기에 의한 것을 포함하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 흡입에 의한 폐; 경 막내, 비강 내, 표피 및 경피), 구강 또는 비경 구일 수 있다. 비경 구 투여는 정맥 내, 동맥 내, 피하, 복강 내 또는 근육 내 주사 또는 주입; 또는 두개 내 (intracranial), 예를 들어, 뇌척수 내 또는 뇌 실내 투여. 하나 이상의 2'-O- 메 톡시 에틸 변형을 갖는 올리고머는 경구 투여에 특히 유용한 것으로 여겨진다. 국소 투여 용 제약 조성물 및 제형은 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적 제, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말을 포함 할 수 있다. 통상적 인 약제 학적 담체, 수성, 분말 또는 유성 염기, 증점제 등이 필요하거나 바람직 할 수 있다. 코팅 된 콘돔, 장갑 및 이와 유사한 것도 유용 할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 용액, 유제, 발포체 및 리포좀 - 함유 제제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제 학적 조성물은 하나 이상의 침투 증강제, 담체, 부형제 또는 다른 활성 성분 또는 불활성 성분을 포함 할 수 있다.
당업자는 약학 조성물이 의도 된 용도, 즉 투여 경로에 따라 일상적으로 설계된다는 것을 인식 할 것이다.
예를 들어, 국소 투여를 위한 바람직한 제제는 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드가 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트 제 및 계면 활성제와 같은 국소 전달제와 혼합 된 것들을 포함한다. 바람직한 지질 및 리포좀은 중성(예를 들어, 디올 레오 일 포스파티딜 DOPE 에탄올 아민, 디메틸 올 포스 포스파티딜 콜린 DMPC, 디스 테아로 일 포스파티딜 콜린) 음성(예를 들어, 디 미리 스토로 포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온(예를 들어, 디 올레 일 테트라 메틸 아미노 프로필 DOTAP 및 디 올레 오일 포스파티딜 에탄올 아민 DOTMA)을 포함한다. 침투 증진제 및 그 용도는 본원에 그 전체가 합체 된 미국 특허 제 6,287,860 호에 추가로 기재되어있다. 계면 활성제 및 그의 용도는 본원에 그 전체가 합체 된 미국 특허 제 6,287,860 호에 더 기술되어있다.
경구 투여용 조성물은 물 또는 비수성 매질 중의 분말 또는 과립, 미립자, 나노 입자, 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 사 세제, 정제 또는 소형 정제를 포함한다. 증점제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직 할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고 뉴클레오타이드가 하나 이상의 침투 증강제 계면 활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것이다. 바람직한 계면 활성제는 지방산 및 / 또는 그의 에스테르 또는 염, 담즙산 및 / 또는 이의 염을 포함한다. 바람직한 담즙산 / 염 및 지방산 및 이들의 용도는 미국 특허 제 6,287,860 호에 상세히 기재되어 있으며, 이의 전체는 본 명세서에 포함된다. 담즙산 / 염과 조합 된 지방산 / 염과 같은 침투 증진제의 조합이 또한 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라 우르 산, 카 프르 산 및 UDCA의 나트륨 염이다. 추가의 침투 증진제는 폴리 옥시 에틸렌 -9- 라 우릴 에테르, 폴리 옥시 에틸렌 -20- 세틸 에테르를 포함한다. 본 발명의 올리고머 화합물은 분무 건조 된 입자를 포함하는 과립 형태로 경구로 전달되거나 마이크로 또는 나노 입자를 형성하도록 복합체화 될 수 있다. 핵산 올리고머 복합체 형성 제 및 이의 용도는 그 전체가 본원에 인용 된 미국 특허 제 6,287,860 호에 추가로 기재되어있다. 핵산 올리고머 및 그의 제조를위한 경구 제형은 미국 특허 출원 제 09 / 108,673 호 (1998 년 7 월 1 일 출원), 제 09 / 315,298 호 (1999 년 5 월 20 일 출원) 및 2002 년 2 월 8 일자로 출원 된 제 10 / 071,822 호 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용되어있다.
또 다른 관련 실시 양태에서, 치료 학적으로 효과적인 병용 요법은 다중 조성물이 단일 또는 다중 핵산 표적을 표적으로 하는 본 발명의 2 종 이상의 조성물의 용도를 포함 할 수 있다. 안티센스 올리고머 화합물의 많은 예가 당 업계에 공지되어있다. 둘 이상의 복합 화합물을 함께 또는 순차적으로 사용할 수 있다.
임의의 올리고머 화합물이 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있으나, 단 화합물이 약학 적으로 활성 인 것이 조건이다. "약학 적으로 활성 인" 올리고머는 (i) 형성; (ii) 확산; (iii) 생존; (iv) 생존력; 또는 (v) 종양 세포의 유지, 및 / 또는 암의 치료 및 / 또는 예방에서, 감소, 손상, 폐기 또는 예방을 초래하는 형태이고, 증후의 예방, 그러한 증상을 확인하거나 암과 관련된 현존 증상의 치료를 포함하여, 암을 필요로하는 개인에게 투여하는 경우를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 투여 방식, 투여 된 올리고머의 양 및 올리고머 제제는 일상적이고 당업자의 기술 범위 내에 있다. 암이 치료되었는지 여부는 적절한 통제와 비교하여 질병 경과를 나타내는 하나 이상의 진단 매개 변수를 측정함으로써 결정된다. 동물 실험의 경우, "적절한 대조군"은 올리고머 화합물로 처리되지 않은 동물이거나 올리고머 화합물 없이 약학 조성물로 처리 된 동물이다. 인간 대상의 경우, "적절한 대조군"은 치료 전의 개체 일 수도 있고, 또는 위약으로 치료 된 인간 (예를 들어, 연령 - 일치 또는 유사한 대조군) 일 수도 있다. 본 발명에 따라, 암의 치료는 제한없이 다음을 포함하며 포함한다 : (1) (i) 형성; (ii) 확산; (iii) 생존; (iv) 생존력; 또는 (v) 환자에서 종양 세포의 유지;의 발달을 저해, 폐지, 감소, 예방 또는 체포; (2) 대상체에서 암 (예 : 원발성 또는 전이성 암)을 치료하는 것; (3) 암에 걸리기 쉽지만 아직 암으로 진단되지 않은 대상에서 암 (예 : 원발성 또는 전이성 암)을 예방하고, 따라서, 치료는 암의 예방 적 처치를 구성 또는 (iii) 암 (예컨대, 원발성 또는 전이성 암)의 퇴행을 야기하는 것.
따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은 암으로 진단 된 개체를 치료하는데 적합하며, 암에 걸린 것으로 의심되고, 감수성이 좋으며 암 발병 가능성이 있다고 생각되는 사람, 또는 이전에 치료 한 암의 재발을 일으킬 것으로 생각되는 사람에 적합하다. 암은 호르몬 수용체 양성이거나 호르몬 수용체 음성 일 수 있습니다. 일부 실시 양태에서, 암은 호르몬 수용체 음성이고 따라서 호르몬 또는 내분비 치료에 내성이다. 암이 유방암 인 일부 실시 양태에서 유방암 (예를 들어, 비 유방 CMC 종양 세포)은 호르몬 수용체 음성 (예를 들어, 에스트로겐 수용체 (ER) 음성 및 / 또는 프로게스테론 수용체 (PR) 음성)이다.
본 발명은 또한 종양 세포의 증식, 생존 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 암 치료법과 동시에 올리고머 화합물을 투여하는 것을 고려한다. 올리고머는 암 치료 후에 치료 적으로 사용될 수 있거나 또는 치료가 투여되기 전에 또는 치료와 함께 사용될 수있 다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 올리고머 및 방사선 요법, 수술, 화학 요법, 호르몬 제거 요법, 프로 - 세포 자멸사 요법 및 면역 요법을 포함하는 비 제한적인 예인 암 요법의 동시 투여를 사용하는 병용 요법을 고려한다.
4.1 방사선 요법
방사선 요법은 예를 들어 χ- 방사선, X- 선, 자외선, 마이크로파, 전자 방출, 방사성 동위 원소 등을 비롯한 DNA 손상을 유도하는 방사선 및 파를 포함한다. 치료는 국소화 된 종양 부위에 상술 한 형태의 방사선을 조사함으로써 달성 될 수 있다. 이 모든 요소는 DNA의 전처리 과정, DNA의 복제 및 수리, 염색체의 조립 및 유지에 광범위하게 영향을 미친다.
X- 선의 투약 범위는 장시간 (3 내지 4 주) 50 내지 200 회 / 분의 일일 투여 량으로부터 2000 내지 6000 회 분량의 단일 투여 량 범위이다. 방사성 동위 원소의 투약량 범위는 광범위하며, 동위 원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 신생 세포의 섭취량에 따라 다르다.
방사선 요법의 비 제한적인 예는 단일 샷 또는 분획 화, 고 선량률 근접 치료, 영구적 간질 근접 치료, 전신 라디오 동위 원소 등의 컨 포멀 외부 빔 방사선 요법 (4 내지 8 주 이상의 분획으로 주어진 50 내지 100 그레이)을 포함한다. (예 : 스트론튬 89). 방사선 민감 제제의 예시는 efaproxiral, etanidazole, fluosol, misonidazole, nimorazole, temoporfin 및 tirapazamine 을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
4. 2 화학 요법
화학 요법 제는 다음 범주 중 임의의 하나 이상으로부터 선택 될 수있다 :
(i) 의학 종양학에서 사용되는 항 증식 성 / 항신 생물성 약물 및 이들의 조합 물, 알킬화제(예 : 시스플라틴, 카보 플 라틴, 시클로 포스 파 미드, 질소 겨자, 멜 팔란, 클로 람 부실, 부술 판 및 니트로 소 우레아); 항 대사 물질(예를 들어 5- 플루오로 우라실 및 테가 푸르, 랄 티트 렉스, 메토트렉세이트, 시토신 아라 비노 시드 및 히드 록시 우레아와 같은 플루오로 피리딘과 같은 항응고제); 항 종양 항생제(예를 들어 아드리아 마이신, 블레오 마이신, 독소루비신, 다우 노 마이신, 에피 루비 신, 이데루 비신, 마이 토마 이신 -C, 닥 티노 마이신 및 미트라 마이신과 같은 안트라 사이클린); 항 분열 제(예를 들어, 빈 크리스틴, 빈 블라 스틴, 빈 데신 및 비노 렐빈과 같은 빈카 알칼로이드 및 파클리탁셀 및 도세탁셀과 같은 탁 소이 드); 및 토포 아이소 머라 제 억제제(예 : 에토 포사이드 및 테니 포 시드와 같은 에피 포도 필로 톡신, 암사 크린, 토포 테칸 및 캄 프토 테 신);
(ii) 항 에스트로겐과 같은 세포 증식 억제제(예 : 타목시펜, 토레미 펜, 랄록시펜,로 록시 옥 펜 및 요오도 에펜) 에스트로겐 수용체 다운 레귤레이터 (예 : fulvestrant), 항 안드로겐 (예 : 비칼 루타 마이드, 플루 타 미드, 닐 루타 미드 및 시스 프로 테론 아세테이트) UH 길항제 또는 LHRH 작용제 (예 : goserelin, leuprorelin 및 buserelin), 프로제스테론 (예 : 메 게스트 롤 아세테이트), 아로마 타제 억제제 (예 : anastrozole, letrozole, vorazole 및 exemestane) 및 finasteride와 같은 5α- 환원 효소의 억제제;
(iii) 암세포 침윤을 억제하는 제제(예를 들어, 마리 마스타 트와 같은 메탈로 프로 티아 제 억제제 및 유로 키나아제 플라스 미노 겐 활성제 수용체 기능의 억제제); (iv) 성장 인자 기능의 억제제, 예를 들어 상기 억제제는 성장 인자 항체, 성장 인자 수용체 항체(예 : anti-erbb2 항체 trastuzumab [Herceptin ™] 및 항 erbb1 항체 cetuximab [C225]), 파네 실 트랜스퍼 라제 저해제, MEK 저해제, 티로신 키나제 억제제 및 세린 / 트레오닌 키나제 억제제, 예를 들어 표피 성장 인자 패밀리의 다른 억제제 (예를 들어, N- (3- 클로로 -4- 플루오로 페닐) -7- 메 톡시 -6- (3- 모르 폴리 노 프로 폭시) 퀴나 졸린 -4- 아민 (게 피티 닙, AZD1839), N- -6- (2- 메 톡시에 톡시) 퀴나 졸린 -4- 아민 (에를 로티 닙, OSI-774) 및 6- 아크릴 아미도 -N- (3- 클로로 -4- 플루오로 페닐) -7- (3- 모르 폴리 노 프로 폭시) 퀴나 졸린 -4- 아민 (CI 1033)), 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자 패밀리의 억제제 및 예를 들어 간세포 성장 인자 패밀리의 억제제;
(v) 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 것과 같은 항 - 혈관 형성 제, (예를 들어, 항 혈관 내피 세포 성장 인자 항체 인 베바 시주 맙 [AvastinTM], 국제 특허 출원 WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 및 WO 98/13354에 개시된 화합물) 다른 메커니즘들에 의해 작용하는 화합물들(예 : 리노 미드, 인테그린 αvβ3 억제제 및 안지오스타틴);
(vi) 혈관 손상 제, 예를 들어 콤 브레 타 스타틴 A4 및 화합물은 국제 특허 출원 WO 99/02166, WO 00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 및 WO 02/08213에 개시되어있다;
(vii) 안티센스 치료제, 예를 들어 ISIS 2503, 항 -ras 안티센스와 같은 상기 표적에 관한 것들; 과
(viii) 예를 들어, 이상 p53 또는 이상 GDEPT (유전자 - 지시 효소 프로 - 약물 치료)와 같은 이상 유전자를 대체하는 접근법을 포함하는 유전자 치료 접근법, 시토신 디아 미나 제, 티미 딘 키나아제 또는 세균성 니트로 리덕 타제 효소를 사용하는 접근법 및 화학 요법 또는 다중 약물 내성 유전자 치료와 같은 방사선 요법에 대한 환자 내성을 증가시키는 접근법.
4.3 면역 요법
면역 요법은 인터루킨 2, 인터루킨 4 또는 과립구 - 대 식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토 카인으로의 형질 감염과 같은 환자 종양 세포의 면역 원성을 증가시키는 생체 외 및 생체 외 접근법, T- 세포 아네 르기 감소 방법, 사이토 카인 - 트랜 스펙 션 된 수지상 세포와 같은 형질 감염된 면역 세포를 사용하는 접근법, 항 - 이디 오 타입 항체를 사용하는 접근법 등을 포함한다. 이러한 접근법은 일반적으로 면역 세포와 분자를 사용하여 암 세포를 표적화하고 파괴하는 것에 의존한다. 면역 효과기는 예를 들어, 악성 세포의 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체 일 수 있다. 항체는 단독으로 치료의 효과기 역할을 하거나 실제로 세포 살상을 촉진하기 위해 다른 세포를 모집 할 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소 (화학 치료제, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 결합 될 수 있으며 단지 표적 화제로서 작용할 수 있다. 대안 적으로, 작동 체는 악성 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호 작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구 일 수 있다. 다양한 이펙터 세포에는 세포 독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.
4. 4. 다른 치료법
다른 암 요법의 예는 광선 요법, 냉동 요법, 독소 요법 또는 프로 - 세포 자멸사 요법을 포함한다. 당업자는 이 목록이 암 및 다른 증식 성 병변에 이용 가능한 치료 양식의 유형을 전부 포함하지 않는다는 것을 알 것이다.
화학 요법 및 방사선 요법이 급속하게 분열하는 세포를 표적으로하고 및 / 또는 세포주기 또는 세포 분열을 파괴하는 것이 잘 알려져 있다. 이 치료법은 치매 치료를 통해 질병의 진행을 늦추거나 역전시키는 것을 목표로 여러 형태의 암 치료의 일부로 제공된다. 그러나, 이러한 암 치료법은 면역 저하 상태 및 계속되는 병원성 감염을 유도 할 수 있으며, 따라서 본 발명은 본 발명의 올리고머 화합물, 암 치료 및 암 치료로 인한 면역 저하 상태에서 발생하거나 발병 위험이 증가하는 감염에 효과적인 항 감염 제제 둘 다를 사용하는 병용 요법으로 확장된다. 항 감염 제는 미생물의 성장을 억제 또는 억제하는 화합물을 제한없이 포함하는 항균제로부터 적합하게 선택된다 ; 이는 바이러스, 박테리아, 효모, 균류, 원생 동물 등과 같은 항생제, 항균제, 항 곰팡이 제, 항원제, 항 말라리아제, 항 결핵 제 및 항 바이러스제를 포함한다. 항 감염 제는 또한 그들의 범위 내에서 구충제 및 선충제를 포함한다. 예시적인 항생제는 퀴놀론 (예 amifloxacin, cinoxacin, 시프로플록사신, 에녹 사신, fleroxacin, flumequine, lomefloxacin, 날 리딕 산, 노르 플록 사신, 오 플록 사신, 레보플록사신, lomefloxacin,, 옥솔 린산 (Oxolinic acid), pefloxacin, rosoxacin, temafloxacin, tosufloxacin, sparfloxacin, clinafloxacin, 가티 플록 사신, 목시 플록 사신, gemifloxacin 및 garenoxacin), 테트라 사이클린, 글리 시클린 및 옥사 졸리 디논 (예를 들어, 클로르 테트라 사이클린, 데 메크로 사이클린, 독시사이클린, 라임 사이클린, 메타 사이 클린, 미노사이클린, 옥시 테트라 사이클린, 테트라 사이클린, 티그 제형, 라인 졸리 드, 에페로 솔리드), 글리코 펩티드, 아미노 글리코 시드 (예를 들어, 아미 카신, 아르 베 카신, 부티로 신, 다이 베 카신, 포티 미신, 겐타 마이신, 카나마이신, 마이오 마이신, 네틸 실린, 리보 스타 마이신, 시소 미신, 스펙 티노 마이신, 스트렙토 마이신, 토 브라 마이신), -락탐 (예 : imipenem, meropenem, biapenem, cefaclor, cefadroxil, cefamandole, cefatrizine, cefazedone, cefazolin, cefixime, cefmenoxime, cefodizime, cefonicid, cefoperazone, ceforanide, cefotaxime, cefotiam, cefpimizole, cefpiramide, cefpodoxime, cefsulodin, ceftazidime, cefteram, ceftezole, ceftibuten, ceftizoxime, ceftriaxone, cefuroxime, cefuzonam, cephaacetrile, cephalexin, cephaloglycin, cephaloridine, cephalothin, cephapirin, cephradine, cefinetazole, cefoxitin, cefotetan, azthreonam, carumonam, flomoxef, moxalactam, amidinocillin, amoxicillin, ampicillin, azlocillin, carbenicillin, benzylpenicillin, carfecillin, cloxacillin, dicloxacillin, methicillin, mezlocillin, nafcillin, oxacillin, penicillin G, piperacillin, sulbenicillin, temocillin, ticarcillin, cefditoren, SC004, KY-020, cefdinir, ceftibuten, FK-312, S-1090, CP-0467, BK-218, FK-037, DQ-2556, FK-518, cefozopran, ME1228, KP-736, CP-6232, Ro 09-1227, OPC-20000, LY206763), 리파 마이신, 매크로 라이드 (예 : 아지트로 마이신, 클라리 트로 마이신, 에리스로 마이신, 올 레온 드 마이신, 로타 마이신, 로사 라미 닌, 로시 스로 마이신, 트로 렌도 마이신), 케 토리 사이드(예 : telithromycin, cethromycin), 메르 마이신, 린코 사 미드 (예 : clindamycin, lincomycin) 및 클로람페니콜을 포함한다.
항 바이러스제는 abacavir sulfate, acyclovir sodium, amantadine hydrochloride, amprenavir, cidofovir, delavirdine mesylate, didanosine, efavirenz, famciclovir, fomivirsen sodium, foscarnet sodium, ganciclovir, indinavir sulfate, lamivudine, lamivudine/zidovudine, nelfinavir mesylate, nevirapine, oseltamivir phosphate, ribavirin, rimantadine hydrochloride, ritonavir, saquinavir, saquinavir mesylate, stavudine, valacyclovir hydrochloride, zalcitabine, zanamivir, 및 zidovudine이 포함된다.
amebicides 또는 antiprotozoals 의 비 제한적인 예는, atovaquone, chloroquine hydrochloride, chloroquine phosphate, metronidazole, metronidazole hydrochloride, 및 pentamidine isethionate. 를 포함한다. Anthelmintics는 mebendazole, pyrantel pamoate, albendazole, ivermectin 및 thiabendazole에서 선택되는 적어도 하나 일 수 있다. 예시적인 항진균제는 amphotericin B, amphotericin B cholesteryl sulfate complex, amphotericin B lipid complex, amphotericin B liposomal, fluconazole, flucytosine, griseofulvin microsize, griseofulvin ultramicrosize, itraconazole, ketoconazole, nystatin, 및 terbinafine hydrochloride로부터 선택 될 수 있다. 항 말라리아제의 비 제한적 예로는 chloroquine hydrochloride, chloroquine phosphate, doxycycline, hydroxychloroquine sulfate, mefloquine hydrochloride, primaquine phosphate, pyrimethamine, 및 pyrimethamine with sulfadoxine이 있다. 항 결핵제로는 clofazimine, cycloserine, dapsone, ethambutol hydrochloride, isoniazid, pyrazinamide, rifabutin, rifampin, rifapentine, 및 streptomycin sulfate가 포함 되나 이에 국한되지 않는다.
상기 한 바와 같이, 본 발명은 추가의 작용제와 함께 올리고머 화합물의 공동 투여를 포함한다. 다른 제제와 함께 올리고머를 투여하는 것을 포함하는 실시 양태에서, 조합 물 중의 활성제의 투여 량은 그 자체로 유효량을 포함 할 수 있고 추가의 제제는 환자에게 치료 학적 또는 예방 적 이점을 추가로 증가시킬 수 있음이 이해 될 것이다. 다르게는, 올리고머 및 추가의 약물(들)은 함께 암을 예방 또는 치료하기 위한 유효량을 포함 할 수 있다. 유효량은 예를 들어, 투여의 시기 및 횟수, 투여 방식, 제형 등을 포함하는 특정 치료 요법과 관련하여 정의 될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구체 예에서, 올리고머 화합물 및 선택적으로 암 치료법은 일상적인 일정에 따라 관리된다. 대안으로, 암 치료법은 증상이 나타날 때 투여 될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "일상 스케줄"은 미리 정해진 지정된 시간을 가리킨다. 일상적인 일정은 일정이 미리 결정되는 한 동일하거나 일정 길이의 기간을 포함 할 수 있다. 예를 들어 일상 스케줄은 매일, 2 일마다, 3 일마다, 4 일마다, 5 일마다, 6 일마다, 매주 단위로, 월 단위로 또는 임의의 정해진 일수에 올리고머를 투여하는 것을 포함 할 수 있다. 또는 2 주마다, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 12 개월 등이 될 수 있다. 올리고머 화합물과 암 치료의 병행 투여를 첫 주 동안 매일, 그리고 몇 달 동안 매달, 그리고 그 후에 매 3 개월마다 실시한다. 특정 일정에 적절한 관리 일정이 포함되는 것으로 미리 결정되는 한, 특정 조합은 일상 일정에 포함된다.
본 발명의 치료 방법에 사용 된 임의의 화합물에 대해, 치료 유효량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정 될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양에서 결정된 IC50을 포함하는 순환 농도 범위를 달성하기 위한 투여 량을 동물 모델에 공식화 할 수 있다. (예를 들어, 종양 세포의 증식을 최대로 억제하는 반감기를 달성하는 활성제의 농도). 이러한 정보는 인간에서 유용한 선량을보다 정확하게 결정하는데 사용될 수 있다.
투약은 치료되는 질병 상태의 중증도 및 반응성에 의존하며, 치료 과정은 수일에서 수개월까지 지속되거나, 치료가 이루어 지거나 질병 상태가 감소 될 때까지 영향을 받는다. 최적의 투약 일정은 환자 몸의 약물 축적 측정으로부터 계산할 수 있다. 일반 기술자는 최적의 투약량, 투약 방법 및 반복률을 쉽게 결정할 수 있다. 최적의 투여 량은 개별 올리고머 화합물의 상대 효능에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로 시험 관내 및 생체 내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 기초하여 추정 될 수 있다. 일반적으로 복용량은 체중 kg 당 0.01 μg ~ 100 g이며 일일, 주간, 월간 또는 매년 1 회 이상 제공 될 수 있다. 당업자는 측정 된 체류 시간 및 체액 또는 조직에서의 약물 농도에 기초하여 투약 반복 횟수를 용이하게 추정 할 수 있다. 성공적 치료 후, 질병 상태의 재발을 막기 위해 환자에게 유지 요법을 시행하게 하는 것이 바람직 할 수 있으며, 이때 올리고 뉴클레오타이드는 체중 1 kg 당 0.01 μg 내지 100 g의 유지 용량으로 1 일 1 회 이상 매일, 매주, 매월 또는 매년 투여된다. 이중 가닥 화합물의 경우, 두 번째 가닥의 증가 된 핵산 부하를 고려하여 용량을 계산해야 한다. (두 개의 분리 된 가닥을 포함하는 화합물과 같이) 또는 추가의 핵산 길이를 갖는다 (이중 가닥 영역을 갖는 자기 상보성 단일 가닥과 같이).
일부 실시 양태에서, 의도 된 투여 방식에 따라, 올리고머 - 함유 조성물은 일반적으로 약 0.000001 % 내지 90 %, 약 0.0001 % 내지 50 %, 또는 약 0.01 % 내지 약 25 %의 올리고머이고, 나머지는 적합한 제약 담체 또는 희석제 등이다. 올리고머의 투여 량은 투여 방식, 영향 을받는 대상의 종, 연령, 성별, 체중 및 일반적인 건강 상태와 같은 다양한 인자에 좌우 될 수 있고, 표준 프로토콜을 사용하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다. 투여 량은 또한 그의 표적 분자 (예, THOC4 또는 SSB1)에 대한 올리고머의 결합 친화도, 그의 생체 이용률 및 그의 생체 내 및 약동학적 특성을 고려할 것이다. 이와 관련하여, 투여용 약제의 정확한 양은 의사의 판단에 달려있다. 암의 치료 또는 예방에서 투여될 약물의 유효량을 결정할 때, 의사 또는 수의사는 시간이 경과함에 따라 질병 또는 상태의 진행을 평가할 수 있다. 임의의 경우, 당업자는 과도한 실험없이 올리고머 화합물의 적절한 투여 량을 용이하게 결정할 수 있다. 환자에게 투여되는 활성제의 투여 량은 종양 세포의 형성, 증식, 생존, 생존, 유지 또는 유지 및 / 또는 치료에서의 손상, 폐기 또는 예방과 같은 환자의 시간 경과에 따른 유익한 반응을 일으키기에 충분해야 하고 및 / 또는 암 예방에 유용해야 한다. 투여량은 적절한 간격으로 투여하여 암의 증상을 완화시킬 수 있다. 이러한 간격은 당업자에게 공지 된 일상적인 절차를 사용하여 확인 될 수 있으며, 사용되는 활성 작용제의 유형 및 그의 제제에 따라 변할 수 있다. 예를 들어, 간격은 매일, 격일, 주간, 격주, 월별, 격월, 분기 별, 반년 또는 연간 일 수 있다.
투여 량 및 투여 간격은 개별적으로 조정되어 올리고머 효과를 유지하기에 충분한 활성제의 혈장 수준을 제공 할 수 있다. 전신 투여를 위한 통상적 인 환자 투여 량은 1-2000 mg / 일, 일반적으로 1-250 mg / 일, 전형적으로는 10-150 mg / 일이다. 환자의 체중을 기준으로 볼 때, 일반적인 투여 량은 0.02-25 mg / kg / day이며, 일반적으로 0.02-3 mg / kg / day, 일반적으로 0.2-1.5 mg / kg / day이다. 환자의 신체 표면적으로 표현하면, 통상적 인 투여 량은 0.5-1200 mg / m2 / day이며, 일반적으로 0.5-150 mg / m2 / day, 일반적으로 5-100 mg / m2 / day이다.
올리고머 약물의 독성 및 치료 효능은 LD50 (개체군의 50 %에 치사되는 투여 량) 및 ED50 (개체군의 50 %에서 치료 학적으로 유효한 투여 량)을 결정하기 위해 세포 배양 또는 실험 동물에서의 표준 약학 적 절차에 의해 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 간의 투여 비율은 치료 지수이며 LD50 / ED50 비율로 표현할 수 있다. 큰 치료 지표를 나타내는 화합물이 바람직하다. 이러한 세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 인간에서 사용하기 위한 투여 량의 범위를 정하는 데 사용될 수 있다. 상기 화합물의 투여 량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전혀 없는 ED50을 포함하는 순환 농도의 범위 내에 있다. 투여 량은 사용 된 투여 형태 및 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변할 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여 량은 환자의 상태를 고려하여 개개인의 의사에 의해 선택 될 수 있다. (Fingl 등, 1975, "The Pharmacological Basis of Therapeutics"1 장 1면 참조).
대안 적으로, 올리고머 화합물을 전신적 방식보다는 국부적 방식으로 투여 할 수 있으며, 바람직하게는 피하 조직 또는 망막 조직 인 조직 내로, 종종 저장소 또는 서방 형 제형으로 화합물을 직접 주입함으로써 투여 될 수 있다.
또한, 표적 약물 전달 시스템, 예를 들어, 조직 특이적 항체로 코팅 된 리포솜에서 올리고머 화합물을 투여 할 수 있다. 리포솜은 표적화 될 것이고 조직에 의해 선택적으로 흡수 될 것이다.
국소 투여 또는 선택적 흡수의 경우, 올리고머 화합물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련되지 않을 수 있다.
본 발명이 용이하게 이해 될 수 있고 실제적인 효과를 나타내기 위해, 이하의 비 제한적인 실시 예에 의해 특정 바람직한 실시 양태를 설명 할 것이다.
실시예
실시예1
비 표적화 올리고머 화합물의 종양 - 조절 효과
종양 세포의 전사체를 표적으로 하는 것으로 간주되지 않는 변형된 RNA 올리고머 화합물을 설계 하였다. 상기 변형은 표 3에 나타낸 바와 같이 포스포로티오에이트 백본 (*) 및 2-O'- 메틸 변형 (m)을 포함하며 접두어 'LSA'로 표시된다. 모든 서열은 Sigma-Aldrich (캐슬 힐, 뉴 사우스 웨일즈 주, 호주)에서 주문했다.
올리고머 화합물을 Lipofectamine 2000을 사용하여 최종 농도 100 nM 또는 50 nM에서 암 세포주 HeLa, U2OS, LNCAP, MCF7, A549 및 H460으로 트랜스펙션 하였다. 이 처리로 대부분의 세포가 20-36 시간까지 사망 하였고, 이는 대조 화합물로 처리된 세포와 비교하여 LSA 화합물로 처리 된 세포의 낮은 세포 합류 및 부착으로 나타난다 (그림 1 참조).
면역 블롯 분석은 PARS1 절단 및 증가 된 H2AX 인산화뿐만 아니라 처리 된 세포의 hSSB1 폴리 펩타이드 생산의 40-50 % 감소를 나타내었다 (도 2). PARP1은 세포 사멸 동안 절단되고 yH2AX는 게놈 내의 DNA 절단을 특이적으로 표시하여 비 표적화 올리고머로 처리 된 세포에서 각각 세포 사멸 및 DNA 손상의 존재를 확인한다.
[표 3]
Figure pct00009
서열 명칭은 다음과 같다 : m = 2'OMe- 변형 뉴 클레오 사이드, * = 포스포로티오에이트 (PS) 인터뉴클레오시드 결합.
실시 예 1에 기술 된 실험을 위한 올리고머 명칭(OLIGO NAME)이 표 8에 열거 된 상응하는 통합 OLIGO ID 및 SEQ ID NO와 함께 도시된다.
실시예 2
종양 세포에 대한 독성에 대한 비 표적화 OLIGOMER 화합물 및 항응고제 화합물의 비교
실시 예 1에 기재된 비 표적 올리고머를 종양 세포 독성에 대한 안티센스 올리고머와 비교 하였다. 안티센스 올리고머는 비 표적화 올리고머와 동일한 주쇄 화학 및 hSSB1 서열을 표적화하는 특이성으로 디자인되었다. 이 연구에 사용 된 올리고머의 서열은 비 표적 화합물이 접두사 'LSA'로 지정되고 안티센스 화합물이 접두사 'ASO'로 지정되는 표 4에 제시된다. 모든 서열은 Sigma-Aldrich (캐슬 힐, 뉴 사우스 웨일즈 주, 호주)에서 주문했다.
PARP 절단 및 H2AX 유도에 의해 나타내지는 바와 같이, 비 표적 올리고머 (LSA) 및 안티센스 올리고머 (ASO) 모두 세포 독성을 유도 하였다 (도 3). 특히, 비 표적 올리고머 및 안티센스 올리고머로 형질 감염된 세포에서 hSSB1 단백질 수준이 감소되었다.
추가의 비 표적화 올리고머 및 안티센스 올리고머 화합물을 설계하여 IncuCyte 동역 생 세포 영상 시스템을 사용하여 암 세포주 패널에서 독성을 스크리닝 하였다. 이들 올리고머를 표 5에 나타내었다.
간략하게, 세포를 마이크로 웰 플레이트에 파종하고 24 시간 후 LSA 또는 ASO 올리고 (100nM)로 형질 감염시키고 즉시 IncuCyte ZOOM 시스템에 로딩 하였다. 이미지는 72 시간 동안 위상차 현미경을 통해 1-2 시간마다 수집되었다. IncuCyte ZOOM 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석했다. 세포 증식은 도 4의 대표적인 올리고 뉴클레오타이드에 대해 나타낸 바와 같이, 시간 경과에 따른 세포 합류율을 모니터링 함으로써 측정 하였다. 표 5에 열거 된 41 종의 올리고머 화합물은 3 = 매우 독성, 2 = 중간 독성, 1 = 약간 독성 및 0 = 무독성이며 LSA 또는 ASO 방향에 의존하지 않는 것으로 보인다.
[표 4]
Figure pct00010
서열 명칭은 다음과 같다 : m = 2'OMe- 변형 뉴 클레오 사이드, * = 포스포로티오에이트 (PS) 인터뉴클레오시드 결합.
실시 예 2에서 기술 된 실험을위한 올리고머 명칭 (OLIGO NAME)이 표 8에 열거 된 상응하는 통합 된 OLIGO ID 및 SEQ ID NO와 함께 도시된다.
[표 5]
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
서열 명칭은 다음과 같다 : m = 2'OMe- 변형 뉴클레오시드, * = 포스포로티오에이트 (PS) 인터뉴클레오시드 결합.
구아노신 - 시토신 (GC) 함량, 용융 온도 (Tm) 및 퓨린 함량 (AG)의 백분율뿐만 아니라, 각각의 올리고머 (예컨대, LSA 또는 ASO)의 유형이 기재되어있다. 탐지 가능한 모든 라벨 또는 리포터 그룹 (예 : 바이오틴 FAM)은 OLIGO NAME으로 표시된다.
실시 예 2에서 기술 된 실험을 위한 올리고머 명칭 (OLIGO NAME)이 표 8에 열거 된 상응하는 통합 된 OLIGO ID 및 SEQ ID NO와 함께 도시된다.
실시예 3
SSB1과 THOC4에 결합하는 올리고머 화합물
비오티닐화 비 표적 화합물, LSA-IN3E3 및 음성 대조 올리고머 화합물인 NEGC를 세포 용해물과 함께 배양하였다. 상호 작용 단백질은 biotinylated 화합물에 바인딩 streptavidin 구슬을 사용하여 추출되었다. 비드를 세척하고 상호 작용하는 단백질을 SDS-PAGE로 분리하고, 쿠마시 R250으로 염색하고, 밴드를 트립신 분해된 단편의 질량 분광법 확인을 위해 제거 하였다. 질량 분석에서 확인 된 단백질 중에는 단일 가닥 DNA 복구 단백질인 hSSB1과 mRNA 수송 단백질 THOC4가 있다. THOC4는 TREX 복합체의 32 kDa 단백질 성분으로, mRNA 전사, 가공 및 핵산을 결합시키는 복합체이다. THOC4는 본 명세서에 기술 된 올리고머 화합물에 대한 결합을 잠재적으로 중재 할 수 있는 단일 가닥 RNA 결합 도메인인 RNA 인식 모티프 (RRM)를 포함한다.
이 상호 작용을 확인하기 위해, 세포 사멸을 일으키는 데 효과적인 올리고머 화합물 (LSA_In3E3, Open_A_1, cdca3_L_ATG-3 및 ASO_E3E4) 및 세포에서 비교적 무독성 인 올리고머 화합물 (Neg_C, LSA_In3E3_CT5 = In3LSA의 변형 된 버전, Open_L_1 및 cdca3_A_ATG-3)을 사용하여 전기 이동성 시약(EMSA)을 수행하였다. 올리고머 화합물을 FAM 또는 Cy5로 표지하고, 다양한 양의 hSSB1 또는 THOC4와 함께 배양하고, 결합 및 유리 올리고머를 천연 겔 전기 영동으로 분리 하였다. 특히, hSSB1과 THOC4는 무독성 올리고머보다 유의하게 높은 친화성을 갖는 종양 조절 올리고머의 이동을 지연시킴으로써 이 두 단백질이 관찰된 표현형에 관여 할 수 있음을 시사한다 (도 5 참조). THOC4에 대한 해리 상수 (KD)는 표 6에 나타내었고, hSSB1에 대한 해리 상수 (KD)는 표 7에 나타내었다 (GraphPad Prism에서 비선형 회귀를 사용하여 결정된 KD 값). 정제된 hSSB1 또는 THOC4 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.01 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 100 ng/ μL BSA 으로 구성된 완충액에서 37 ℃에서 15 분 동안 10 nmol의 표지 올리고와 함께 배양 하였다. TBE 완충액 중 10 % PAGE 겔상에서 80 ℃에서 4 분 동안 60 분 동안 전기 영동에 의해 샘플을 분리 하였다.
[표 6]
Figure pct00014
표 6은 THOC4 및 8 개의 상이한 올리고머 화합물을 사용하여 수행 된 3 회의 EMSA 실험의 결과를 요약한다. 개별 THOC4 : 올리고머 상호 작용에 대한 해리 상수가 표시된다(KD, 올리고 뉴클레오타이드의 50 %가 평형 상태에서 단백질에 결합되는 단백질의 농도). 알 수 있는 바와 같이, THOC4는 약 50 내지 80 nM의 KD 및 150 nM의 KD를 갖는 음성 대조군 올리고머에 결합하는 종양 조절 올리고머에 결합한다. KD 값은 전기 이동성 이동도 분석 (EMSA)에 의해 결정되었다. 정제 된 THOC4 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH8.0), 100 mM NaCl, 0.0 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 100 ng / μL BSA 로 구성된 완충액에서 37 ℃에서 15 분 동안 10 nmol의 표지 올리고머와 함께 배양 하였다. 샘플을 TBE 완충액 중 10 % PAGE 겔상에서 80 ℃, 4 ℃에서 60 분 동안 분리 하였다. KD 값은 GraphPad Prism에서 비선형 회귀를 사용하여 단백질 농도에 대한 유리 미 결합 올리고의 양을 플로팅함으로써 결정 하였다.
별도의 실험에서, 개선 된 용해도를 갖는 GST-THOC4 유도체가 동일한 조건 하에서 약 11nM의 KD를 갖는 종양 조절 올리고머를 THOC4에 결합시키는 것으로 밝혀졌다.
[표 7]
Figure pct00015
표 7은 hSSB1 및 2 가지 상이한 올리고머 화합물로 수행 된 3 회의 EMSA 실험의 결과를 요약한다. 개별 THOC4 : 올리고머 상호 작용에 대한 해리 상수가 표시된다 (KD, 올리고 뉴클레오타이드의 50 %가 평형 상태에서 단백질에 결합되는 단백질의 농도). 알 수 있는 바와 같이, hSSB1은 약 3 nM의 KD를 갖는 종양 조절 올리고머 및 9 nM의 KD를 갖는 음성 대조군 올리고머에 결합한다. KD 값은 전기 이동성 이동도 분석 (EMSA)에 의해 결정되었다. 정제 된 hSSB1 단백질을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.0 % IGEPAL, 1 mM EDTA 및 100 ng / μL BSA로 구성된 완충액에서 37 ℃에서 15 분 동안 10 nmol의 표지 올리고머와 함께 배양 하였다 . 샘플을 TBE 완충액 중 10 % PAGE 겔상에서 80 ℃, 4 ℃에서 60 분 동안 분리 하였다. KD 값은 GraphPad Prism에서 비선형 회귀를 사용하여 단백질 농도에 대한 프리 언바운드 올리고의 양을 플로팅함으로써 결정 하였다.
실시예 4
세포 유전자 발현 및 mRNA 전환을 억제하는 올리고머 화합물
전사 및 mRNA 방출에 THOC4의 관련성을 토대로, Lipofectamine 3000(생명 공학)을 사용하여 100 nM ASO / LSA로 아폽토시 내성 HeLa-BCL2 세포를 (아폽토시스의 편향을 피하기 위해) 형질 감염시킨 GFP 리포터 발현 분석을 수행 하였다. 5 시간 후, 세포를 Fugene 9 (Roche)를 사용하여 GFP 리포터 플라스미드로 형질 감염시키고, 20 시간 후의 GFP 트랜 스펙 션을 형광 시그널을 고 처리량 Cytell 세포 이미징 시스템을 사용하여 분석 하였다. GFP 플라스미드만 형질 감염된 세포를 비교 (GFP)로 사용 하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 세포 사멸을 유도하는 것으로 알려진 비 표적화 올리고머 (LSA) 및 안티센스 올리고머 (ASO)는 또한 극적으로 감소 된 GFP 형광을 나타내었지만 비 독성 ASO / LSA는 GFP 발현에 영향을 미치지 않았다. 이 결과는 세포 사멸을 유도하는 ASOs / LSAs가 TREX 복합체의 구성 요소를 고갈시킴으로써 전체 전사와의 간섭으로 이끄는 것을 암시한다. 이것은 차례로 DNA 손상과 세포사를 유발한다.
mRNA의 형광 in situ 하이브리드 화 (FISH) 실험에 의해 IN3LSA 또는 NEGC로 형질 감염된 세포에서 글로벌 mRNA 수출을 조사 하였다. 그 결과는 polyA mRNA (빨간색으로 염색 됨)의 핵 수출이 In3LSA로 형질 감염된 세포에서 억제되었지만 NEGC에서는 형질 감염되지 않았음을 보여준다 (도 7 참조). 이것은 TREX 복합체가 In3LSA 올리고머에 의해 저해된다는 것을 확인한다.
실시예 5
필수적인 기능을 확인하기위한 후보 올리고머의 고 함량 스크린
고 함량 스크린을 수행하여 본 발명의 종양 조절 올리고머 서열의 효능 및 THOC4 및 / 또는 hSSB1에 대한 결합에 필요한 최소 길이, 화학, 피리 미딘 / 퓨린 함량을 확인 하였다. 형광 염색 Hoescht 33342 (세포 투과성, 생균 및 사멸 세포 얼룩) 및 Propidium Iodide (PI, 세포 불 투과성, 후기 세포 자멸사 및 죽은 세포 얼룩)를 결합한 Live-Dead 프로토콜을 사용하여 HeLa 및 U2OS 세포에서 Incell 2200 플랫폼을 사용하여 총 305 개의 올리고머를 스크리닝했다. 세포를 분석한 결과 : 총 세포 수, apoptotic(분열된) 핵 및 propidium iodide (PI) 염색법으로 분석하였으며, 결과는 올리고머 화합물로 처리 한 후 24 시간에 측정 한 apoptotic 핵 및 PI 양성 세포(후기 세포 사멸)의 백분율로 보고되었다. THOC4 또는 hSSB1에 대한 올리고머의 결합은 정제 된 재조합 THOC4 또는 hSSB1 단백질이 SPR 칩의 표면에 결합 된 표면 플라스 몬 공명 (surface plasmon resonance; SPR)을 사용하여 수행되었고 올리고머는 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl 및 0.01 % IGEPAL로 구성된 완충액에서 2 nM 내지 16 μM로 희석 하였다.
이 고 함량 스크린으로부터의 결과가 표 8에 요약되어있다.
[표 8] : 올리고머 서열 및 화학, 길이, 용융 온도™, 퓨린 및 GC 함량, 고 함량 스크린(HCS)에 기초한 사망률 및 SPR 결합 분석 결과 인 올리고머 - Thoc4 및 - hSSB1 결과를 포함하는 305 올리고머 스크린으로부터의 요약 데이터.
세포 고사 (apoptotic) 및 죽은 세포의 비율을 측정하여 각 올리고머에 사망 점수를 부여하는 고 - 내용 스크린 (high-content screen, HCS)을 수행 하였다. 할당 된 사망 점수는 0 = 무독성, 1 = 약간 독성, 2 = 중간 독성, 3 = 독성. SPR은 올리고와 THOC4 또는 hSSB1 단백질 사이의 결합을 측정하는 데 사용되었다. 점수는 양성 및 음성 대조 올리고 LSA_In3E3 및 Neg_C에 대한 Rmax에 대한 각 oligo의 Rmax (최대 결합 반응)를 정규화하여 계산했다. 서열 명칭은 다음과 같다 : m = 2'OMe- 변형 뉴클레오tl드, * = 포스포로티오에이트 (PS) 인터뉴클레오시드 결합. Tm = 용융 온도.
[표 8]
Figure pct00016
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올리고머 길이
잠재적 인 종양 - 조절 올리고머 (예를 들어, open_A 및 ATG_LSA)의 크기를 20 핵 염기에서 30 핵 염기로 증가시키는 것은 종양 - 조절 성 표현형을 감소 시키거나 완전하게 폐지시켰다. 크기를 15 또는 10 핵 염기로 감소시키는 것은 또한 표현형을 감소 시키거나 폐기시켰다. 크기가 점진적으로 감소 할 때, 5 '또는 3' 말단으로부터 하나의 핵염기를 제거함으로써, 어느 한쪽 말단으로부터 제거 된 처음 4 내지 5 핵 염기에 대한 효능이 유지되고, 이어서 핵 염기의 제거를 위한 효능이 점진적으로 감소되었다 (표 8 참조). 유사하게, 하나의 핵 염기가 각 말단으로부터 동시에 제거 될 때, 효소는 6 개의 핵 염기를 제거한 후에 손실되었다. 이 연구 결과는 LSA 올리고머 화합물의 지속 효능에 필요한 최소 크기는 14-16 핵 염기이고 최대 크기는 28-29 핵 염기임을 제안한다.
화학
올리고머 화합물은 올리고머의 말단에서 또는 말단 근처에 2 개의 내부 ZEN (TM) 변형을 갖는 완전 2'-O- 메틸 변형 된 당 핵산 주형을 포함하는 ZEN 화학 (IDT 소유)을 사용하여 합성 하였다. 2'-O- 메틸 잔기는 엔도 뉴클레아제 분해에 대한 내성을 부여하고 RNA 표적에 대한 결합 친화력을 증가 시키지만, ZEN 변형은 엑소 뉴클레아제 분해를 차단하고 결합 친화력을 더 증가시킨다. 이들 화합물은 본원에서 ZEN 올리고머로 지칭된다. 세포 사멸을 유도하는 LSA 올리고머 서열에 해당하는 모든 ZEN 올리고머는 세포 사멸의 힘을 완전히 잃어 버렸다. 또한 핵염기의 다른 변형이없는 포스포디에스테르 (PD) 백본, 또는 완전한 2'-O- 메틸 변형 된 설탕 핵 염기를 갖는 PD 백본은 킬링 효과를 완전히 없앴다. 올리고머의 중간 부분에서 변형되지 않은 DNA를 가진 갭머 (gapmer)와 마찬가지로 전체 2'-O- 메틸 변형을 유지하면서 올리고머의 양 말단에 3 개의 포스포로티오에이트 (PS) 잔기 만이 킬링 효과를 약화시켰다. 바람직하게는 완전한 PS 골격 및 선택적으로 다른 변형을 갖지 않는 올리고머 화합물은 THOC4 및 hSSB1 중 하나 또는 둘 모두에 대한 결합뿐만 아니라 올리고머의 유지 및 증가 된 킬링 효과에 대해 요구되는 바람직한 화학적 성질이 있다고 결론 지었다. (표 8 참조)
피리미딘 / 퓨린 함량
스크린으로부터의 결과는 올리고머 화합물이 종양 조절 활성에 대해 50 %의 최소 퓨린 함량, 또는 종양 조절 활성에 대해 50 %의 최소 GC 함량을 가지면서 45 %의 최소 퓨린 함량을 필요로 하고, 종양 조절 활성과 증가된 퓨린 함량간에 양의 상관 관계가 있다. 그러나 퓨린 함량이 많은 일부 올리고머 화합물은 효과가 없으므로 퓨린 함량만으로는 활동을 예측하기에 충분하지 않다. 퓨린 (A 및 G) 또는 피리미딘 (C 및 U)만을 함유하도록 고안된 올리고머는 또한 효과가 없었고, 핵 염기의 혼합물이 활성에 필요하다는 것을 암시 하였다 (표 8 참조). 종양 조절 활성에 대한 퓨린 함량의 영향을 조사한 결과는 도 9에 요약되어있다.
암(BCL2 Oblimersen, SMN2-N1, dystrophin, clusterin, survivin, EIF4EASO4, Hsp27, Stat3)을 비롯한 다양한 조건에 대한 현재 임상 시험 중 일부 인 문헌으로부터의 다수의 안티센스 올리고머 화합물을 본원에 기재된 올리고머 화학과 일치하도록 변형시키고 활성을 스크리닝 하였다. 구체적으로, 이들 변형 된 문헌 올리고머는 완전한 PS 골격 및 2'-O- 메틸 변형 된 뉴 클레오 염기를 갖도록 설계되었으며, 이들 올리고머는 시험 된 가장 강력한 LSA 올리고머, IN3LSA, ATG_LSA 또는 Open_A와 비교되었다. 시험 된 변형 된 올리고머 화합물 중에서, 본원에 개시된 올리고머 IN3_LSA, ATG_LSA 또는 Open_A와 비교하여, 오직 하나의 올리고머, 디스트로핀 및 하나의 대조군 올리고머 HSP27mm이 3의 가장 높은 사망 스코어를 얻었으며, 대부분의 변형 된 문헌은 IN3_LSA, ATG_LSA 또는 Open_A에 비해 캐패시티(2 또는 1 스코어)를 포함하는 세포 독성이 약한 세포를 나타내는 것으로 나타났다.(표 8 참조)
실시예 6
생체 내에서 종양 세포 성장을 억제하는 올리고머 화합물
생체 내 연구
비 표적화 올리고머를 전립선 이종 이식 모델에서 생체 내에서 시험 하였다. 구체적으로, 6 주된 SCID 수컷에게 C42B 전립선 암 세포를 피하 주사 하였다. 일단 종양이 50 mm3의 부피에 도달하면, 마우스는 종양 조절 비 표적 올리고머 인 In3LSA 및 ATGLSA 중 2 개를 비 효과적인 제어 서열 및 PBS와 함께 처리 하였다. 올리고머 약물은 매주 80mg / kg의 용량으로 4 주간 정맥 주사로 투여되었다. 종양 성장은 치료 시간 동안 캘리퍼스 측정에 의해 모니터링되었다. 대조군 (ctrl) 및 PBS 처리 마우스 (도 11)와 비교하여, IN3LSA (In3) 및 ATGLSA (ATG) 처리 된 마우스에 대해 통계적으로 유의한 종양 성장 지연이 관찰되었다 (도 10 참조). 표적 올리고머는 처리 된 마우스에 유의한 독성을 나타내지 않았다.
처리 시간 동안, 마우스 무게를 모니터링 하였지만, 대조군 (ctrl) 및 PBS 처리 마우스와 비교하여 IN3LSA (In3) 및 ATGLSA (ATG) 처리 된 마우스 사이에 중량 손실의 유의 한 차이는 관찰되지 않았다. 특히, IN3LSA 및 ATGLSA 처리 군 (도 12)에 대해 가장 감소 된 종양을 갖는 쥐에 대한 체중 감소는 관찰되지 않았으며, 도 11에서 관찰 된 체중 감소가 종양 부하로 인한 것임을 보여 주었다.
실시예 7
생체 내에서 종양 세포에 의해 흡수된 올리고머 화합물
종양 부위에서 올리고머 화합물의 흡수는 형광으로 표지 된 IN3LSA 올리고머를 주입하고 마우스를 7 일 동안 모니터링함으로써 복강 내 및 정맥 내 전달 후 조사 하였다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 형광 신호는 i.p. 주사. 그러나 i.v. 주사는 종양 부위에서 더 큰 로그 스케일이었고 중요한 것은 신호가 주사 후 7 일 동안 지속되어 LSA 올리고머가 선택적으로 종양 부위에 축적된다는 것을 의미한다. 이러한 결과는 도 14에 표시된 전체 마우스 영상 분석과 일치한다.
실시예 8
OLIGOMUCEROTIDE / OLIGOSACCHARIDE-BINDING (OB) 폴드 함유 단백질을 통한 올리고머 화합물
FAM 표식 된 비 표적 PS 화합물, LSA_In3E3, PD 화합물, DNA_In3E3 및 RNA_In3E3 및 음성 대조 올리고머 화합물 인 NEGC를 정제된 마우스 SSB1 (mSSB1), hSSB1 및 인간 SSB2 (hSSB2) 단백질과 별도로 배양 하였다. 바운드 및 프리 올리고머는 천연 겔 전기 영동에 의해 분리되었으며,도 15 및 16 및 표 9-10에 나타낸 바와 같이, OB- 폴드 단백질 인 mSSB1, hSSB1 및 hSSB2는 종양 조절 올리고머(LSA_In3E3)의 이동을 비 독성 올리고머(DNA_In3E3, RNA_In3E3 and NEGC)보다 훨씬 더 지연시켰고, 이는 종양 조절 올리고머가 비 독성 올리고머보다 OB 배 단백질에 대해 훨씬 더 높은 친 화성을 갖는다는 것을 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00037
표 9는 mSSB1 및 3 개의 상이한 올리고머 화합물을 사용하여 수행 된 3 회의 EMSA 실험의 결과를 요약 한 것이다. 개별 mSSB1에 대한 해리 상수 : 올리고머 상호 작용이 제시된다. (KD, 올리고 뉴클레오타이드의 50 %가 평형에서 단백질에 결합되는 단백질의 농도)
표 9에 사용된 올리고머 화합물 :
a) LSA_IN3E3 =
mC*mC*mA*mG*mU*mG*mA*mG*mC*mC*mG*mG*mA*mC*mU*mU*mG*mC*mC*Mu [SEQ ID NO: 5]
m은 2'- Omethyl 변형 된 염기를 나타내고 *는 PS 인터뉴클레오시드 결합을 나타내고;
b) DNA_In3E3 =
dCdCdAdGdUdGdAdGdCdCdGdGdAdCdUdUdGdCdCdU [SEQ ID NO: 306],
d는 데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고, 상기 올리고머는 PD 인터뉴클레오티드 결합을 포함하고;
c) NEGC = mC*mU*mC*mA*mU*mU*mC*mC*mU*mA*mC*mC*mG*mA*mC*mA*mC*mC*mC*mC [SEQ ID NO: 4],
wherein m represents a 2’-Omethyl modified base, and * represents a PS internucleoside linkage.
m은 2'- Omethyl 변형 된 염기를 나타내고, *는 PS 인터뉴클레오시드 결합을 나타낸다.
[표 10]
Figure pct00038
표 10은 하기에 나타낸 바와 같이 hSSB1 및 4 개의 상이한 올리고머 화합물을 사용하여 수행된 3 회의 EMSA 실험의 결과를 요약한다. 개별 mSSB1에 대한 해리 상수 : 올리고머 상호 작용 이 제시된다. (KD, 올리고 뉴클레오타이드의 50 %가 평형에서 단백질에 결합되는 단백질의 농도)
표 10에서 사용된 올리고머 화합물
a) LSA_In3E3 = mC*mC*mA*mG*mU*mG*mA*mG*mC*mC*mG*mG*mA*mC*mU*mU*mG*mC*mC*Mu [SEQ ID NO: 5],
m은 2'- Omethyl 변형 된 염기를 나타내고 *는 PS 인터뉴클레오시드 결합을 나타내고;
b) DNA_In3E3 =
dCdCdAdGdUdGdAdGdCdCdGdGdAdCdUdUdGdCdCdU [SEQ ID NO: 306],
d는 데옥시리보뉴클레오티드를 나타내고, 상기 올리고머는 PD 인터뉴클레오티드 결합을 포함하고;
c) RNA_In3E3 =
rCrCrArGrUrGrArGrCrCrGrGrArCrUrUrGrCrCrU [SEQ ID NO: 307],
r은 리보 뉴클레오시드를 나타내고, 올리고머는 PD 인터뉴클레오시드 결합을 포함하며;
d) NEGC = mC*mU*mC*mA*mU*mU*mC*mC*mU*mA*mC*mC*mG*mA*mC*mA*mC*mC*mC*mC [SEQ ID NO: 4],
m은 2'- Omethyl 변형 된 염기를 나타내고, *는 PS 인터뉴클레오시드 사이드 결합을 나타낸다.
실시예 9
HSSB1 결합 친화성(AFFINITY)이 높은 올리고머의 분자 시뮬레이션
hSSB1에 대해보다 큰 결합 친화력을 갖는 올리고머 화합물은 Symbios에 의한 OpenMM과 같은 소프트웨어로 Atomistic Molecular Dynamics (AMD) 시뮬레이션을 사용하여 결정될 수 있다. 수백 개의 쿼리 시퀀스 시뮬레이션을 수행 할 수 있으며 바인딩에 대한 자유 에너지가 각각 결정된다. 도 17은 ATGLSA (사멸 서열)가 hSSB1에 NegC (비 살상 서열)보다 낮은 결합 자유 에너지로 hSSB1을 결합시킴으로써 서열 간의 치사의 차이에 대한 통찰력을 제공하고 추가 약물 개발을위한 AMD 시뮬레이션의 적용을 입증한다. 이러한 시뮬레이션 소프트웨어는 결합 자유 에너지가 낮고 hSSB1에 대한 결합 친화력이 더 큰 올리고머 화합물을 스크리닝하여 증가 된 치사율 및 감소 된 표적 효과를 가질 수있는 개선 된 약물 서열의 후보 목록을 제공하는 데 사용될 수 있다.
도 17A 및 B는 인간 hSSB1이 뉴클레오타이드 자체보다 NEGC 올리고머의 포스포로티오에이트 골격에 대해 더 큰 친화력을 나타냄을 보여 주며, 이는 염기 용매를 노출 된 채로 둔다. hSSB1은 ATGLSA와 더 유리한 상호 작용을 하며, 이는 노출 된 뉴클레오타이드 용매를 적게 남긴다. 용매에 노출되면 이 뉴클레오타이드는 물과 상호 작용할 것이고, 이는 결합 그루브를 용매에 개방된 상태로 남겨서 올리고머와의 상호 작용을 약화시킬 것이다. 도 17C 및 D는 ATGLSA가 SSB1의 결합 홈과의 상호 작용을 유지하는 데 필요한 에너지가 적어서 NEGC보다 낮은 결합 에너지 521KJ / mol을 나타냄을 보여준다. 이러한 바인딩 에너지가 시뮬레이션을 통해 어떻게 변화하는지는 NEGC가 변형되지 않은 서열과 거의 일치하는 결합 에너지를 가지는 반면, ATGLSA가 뉴클레오타이드 서열보다 일관되게 더 낮은 결합 에너지를 나타내는도 17D에서 볼 수있다.
실시예 10
폐암의 XENOGRAFT 모델에서 생체 내 종양 세포 성장을 억제하는 올리고머 화합물
비 표적화 올리고머를 H460 폐암 세포주를 사용하여 폐암 이종 이식 모델에서 생체 내에서 시험 하였다. 구체적으로, 6 주된 SCID 수컷 마우스 (동물 자원 센터, ARC, Canning Vale, WA)를 2 백만 루시페라 제를 발현하는 H460 폐암 세포의 옆구리에 피하 주사 하였다. 이어서, 마우스를 IVIS 스캐닝 시스템을 사용하여 촉진, 캘리퍼스 측정 및 종양 생물 발광 신호 측정에 의해 종양 성장을 모니터 하였다. 종양 체적이 평균 50 mm3에 도달하면, 마우스를 PBS (비히클 대조군) 또는 종양 조절 비 표적 올리고머 ATGLSA 그룹 (n = 8 마우스 / 치료 그룹) 중 임의의 것으로 혼입시켰다. 올리고머 ATGLSA를 PBS (Life Technologies)로 희석하고 매주 2 회 정맥 내 (i.v.) 주사를 통해 80 mg / kg의 용량으로 4 주간 (총 8 회 주사) 투여 하였다. 치료 과정에서 마우스는 캘리퍼스 측정 (A = 길이> B = 폭 (mm)으로 공식 V = A / 2 x B2에서 계산 된 부피) 및 생물 발광 신호에 대한 IVIS 스캔으로 체중과 종양 성장을 모니터링했다. 이들 비 표적 올리고머가 폐암 이종 이식 모델에서 염증 효과를 갖는 것으로 입증 된 PBS 처리 된 마우스와 비교하여, ATGLSA (ATG) 처리 된 마우스에 대해 통계적으로 유의한 종양 성장 지연이 관찰되었다 (도 18 참조).
종양 부피의 이러한 차이는 종양의 루시퍼 라제 활성에 의해 확인되었다. 치료 14 일째의 IVIS 스캔은 대조 PBS 그룹 (도 19)과 비교하여 ATGLSA 처리 그룹에 대한 낮은 생물 발광 신호를 나타낸다.
치료 과정 동안, 마우스의 체중을 매주 2 회 모니터링 하였다. PBS 또는 ATGLSA로 처리 한 동물에서 유의 한 체중 감소 또는 상태의 상실은 관찰되지 않았으며, 이들 비 표적 올리고머는 처리 된 마우스에서 유의 한 독성을 나타내지 않음을 입증 하였다 (도 20 참조).
실시예 11
시험관 내 CISPLATIN- 내성 폐암에서 종양 세포 성장을 억제하는 올리고머 화합물
시스플라틴 - 민감성 H460 폐암 세포주를 3 개월에 걸쳐 증가하는 시스플라틴에 노출시켜 시스플라틴 내성 세포주를 생성시켰다. 시험관에서 시험 할 때, Incucyte 확대 시스템을 사용하여 비 표적화 올리고머 ATGLSA (100nM)를 첨가 한 후 48 시간 동안 세포 증식을 측정함으로써, ATGLSA는 모체 H460 세포주보다 시스플라틴 내성 H460 세포주를 죽이는 데 더 효과적이었다 (도 21).
실시예 12
시험관 내 CISPLATIN- 내성 폐암에서 종양 세포 성장을 억제하는 올리고머 화합물
비 표적화 올리고머를 시스플라틴 내성 H460 폐암 세포주를 사용하여 폐암 이종 이식 모델에서 생체 내에서 시험 하였다. 구체적으로, 6 주된 SCID 수컷 마우스 (동물 자원 센터 - ARC, Canning Vale, WA)를 2 백만 루시 페라 제를 발현하는 시스플라틴 내성 H460 폐암 세포의 옆구리 아래에 주입 하였다. 이어서, 마우스를 스캐닝 시스템을 사용하여 촉진, 캘리퍼스 측정 및 종양 생물 발광 신호 측정에 의해 종양 성장을 모니터 하였다. 종양 체적이 평균 50 mm3에 도달하면, 마우스를 PBS (비히클 대조군) 또는 종양 조절 비 표적 올리고머 ATGLSA 그룹 (n = 8 마우스 / 치료 그룹) 중 임의의 것으로 혼입시켰다. Oligonucleotide ATGLSA를 PBS (Life Technologies)로 희석하고 매주 2 회 정맥 내 (i.v.) 주사를 통해 80 mg / kg의 용량으로 4 주간 (총 8 회 주사) 투여 하였다. 치료 과정에서 마우스는 캘리퍼스 측정 (A = 길이> B = 폭 (mm)으로 공식 V = A / 2 x B2에서 계산 된 부피) 및 생물 발광 신호에 대한 IVIS 스캔으로 체중과 종양 성장을 모니터링했다. 이들 비 표적 올리고머가 시스플라틴 내성 폐암 xenograft 모델에서 chemostatic 효과를 갖는다는 것을 입증하는 PBS 처리 된 마우스와 비교하여, ATGLSA (ATG) 처리 된 마우스에 대해 통계적으로 유의한 종양 성장 지연이 관찰되었다 (도 22 참조).
종양 부피 차이는 또한 IVIS 스캔 (도 23)을 갖는 각 종양에 대한 생물 발광 신호에 의해 측정 된 종양 세포의 루시퍼라제 활성에 의해 유효화되었다.
본 발명자들은 치료 시간 동안 ATGLSA 처리 된 코호트에서 어떠한 체중 감소도 관찰하지 않았으며, PBS 또는 ATGLSA로 처리 된 동물 사이의 행동 또는 상태의 차이를 식별하지 않았다. 이 결과는 부모 H460 이종 이식 실험과 일치한다 (도 24).
실시예 13
CISPLATIN-SENSITIVE 및 CISPLATIN-RESISTANT 폐암 모델에서 ATGLSA의 장기 복용 효과
ATGLSA 치료의 장기 효과를 평가하기 위해, 종양 성장 및 마우스 무게를 종양이 최종 부피 인 1000 mm3에 도달 할 때까지 4 주 치료 후 중단 관찰하고 Kaplan-Meier 그래프를 생성 하였다. 시스플라틴 감수성 H460 모델에서, 4 주간의 ATGLSA 처리는 대조군과 비교하여 ATGLSA 처리 군에서 생쥐 중간 생존율이 통계적으로 유의하게 41 % (14 일) 증가 하였다 (도 25 및 표 11).
[표 11]
대조 PBS 대 ATGLSA로 치료된 CISPLATIN-RESISTANT 폐 H460 종양 및 CISPLATIN-SENSITIVE H460을 갖는 SCID MALES의 중성 생존자
Figure pct00039
시스플라틴 내성 H460 모델에서, ATGLSA 처리 된 코호트에서 37.5 % (18 일) 증가 중앙 생존율이 관찰되었으나(도 26), ATGLSA와 PBS 대조군 간의 차이는 Rank-Log 검사에서 통계적으로 유의하지 않았다 (표 11).
실시예 14
생체 내 폐암 XenOGRAFT 모델에서 CISPLATIN 치료와 ATGLSA 병용
비 표적 올리고머를 시스플라틴 감수성 H460 폐암 세포주를 사용하여 폐암 이종 이식 모델에서 생체 내에서 시험 하였다. 구체적으로, 6 주된 SCID 수컷 마우스 (동물 자원 센터 - ARC, Canning Vale, WA)를 2 백만 루시 페라 제를 발현하는 시스플라틴 내성 H460 폐암 세포의 옆구리 아래에 주입 하였다. 이어서, 마우스를 IVIS 스캐닝 시스템을 사용하여 촉진, 캘리퍼스 측정 및 종양 생물 발광 신호 측정에 의해 종양 성장을 모니터 하였다. 종양의 부피가 평균 50 mm3 (종양 섭취량 92 %)에 도달하면 마우스를 PBS 대조군, ATGLSA 군, 시스플라틴 군 또는 ATGLSA + 시스플라틴 병용 군으로 무작위로 혼입시켰다. Oligonucleotide ATGLSA를 PBS (Life Technologies)로 희석하고 매주 2 회 정맥 내 (i.v.) 주사를 통해 80mg / kg의 용량으로 투여 하였다. 시스플라틴 (1 mg / kg의 염수 현탁액에서 Hospira)을 복강 내 주사 (4 mg / kg)로 일주일에 1 회 주사 하였다. 병용 치료군에는 주 당 2 x ATGLSA (80 mg / kg) i.v 주사 및 1 회 시스플라틴 (4 mg / kg) i.p 주사제를 투여 받았다. 치료 3 주 후, 본 발명자들은 그룹 간 치료를 전환했다(그림 28, 점선) : ATGLSA 처리 마우스를 시스플라틴 (4 mg / kg, 일주일에 1 회, i.p)으로 전환시키고, 시스플라틴 처리 된 마우스를 ATGLSA (80 mg / kg, i.v, 주 2 회)로 전환시키고, 조합 ATGLSA + Cisplatin 마우스 (콤보)는 대조 PBS 그룹 (150 μL PBS, i.v, 일주일에 두 번)이되었다. 우리는 'Cisplatin first / ATGLSA second'처리 마우스에서 종양 성장 지연이 유의하게 관찰되었으며, 치료 첫 날에는 종양 성장이 없었다.
각 동물의 체중을 모니터하여 치료가 생체 내에서 급성 독성을 유도 할 수 있는지를 확인하였다. ATGLSA (ATG) 화합물은 PBS와 비교하여 치료 3 주에서 마우스 체중 감소에 유의 한 영향을 미치지 않는 반면, 시스플라틴 처리 마우스에서는 유의한 중량 감소가 관찰되었다. 이것은 ATGLSA가 시스플라틴과 동일한 비율로 종양 성장을 둔화 시키지만 동물에게 명백한 유해한 독성을 일으키지 않았음을 시사한다. 더욱이, 시스플라틴 치료를 ATGLSA로 전환 할 때, 마우스 무게의 통계적으로 유의한 증가가 스위치 직후에 관찰되었다. 이 증가는 나머지 치료 기간 동안 안정적이었다. 전체적으로이 자료는 ATGLSA가 폐암 종양 및 cisplatin에 대한 내성을 가진 폐암 종양에 대해 화학적 효과가 있음을 보여준다. 이 데이터는 또한 ATGLSA 투여 후 cisplatin을 사용한 순차적 치료가 동시에 투여 된 두 가지 약물보다 효율적임을 보여준다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보의 개시는 그 전체가 본원에 참고 문헌으로 포함된다.
본원의 임의의 참조 문헌의 인용은 그러한 참조 문헌이 본 출원의 "선행 기술"로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서 전반에 걸쳐, 본 발명의 목적은 임의의 하나의 실시 예 또는 특정 특징들의 집합에 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하는 것이었다. 따라서, 당업자는 본 개시의 견지에서, 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 예시 된 특정 실시 예에서 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 모든 수정 및 변경은 첨부 된 청구항의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (331)

  1. 종양 세포(tumor cell)의 증식, 생존 또는 생존능력을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 종양 세포에 이하를 특징으로 하는 핵산 올리고머를 도입하는 단계를 포함하고,
    a) 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 결합(phosphorothioate internucleoside linkages) 을 포함하는 백본(backbone)
    b) (i) 적어도 약 50 %의 퓨린 함량, 또는 (ii) 적어도 약 50 %의 구아노신-시토신 (GC) 함량으로 적어도 약 45 %의 퓨린 함량; 및
    c) 14 개 이상의 핵염기 및 29 개 이하의 핵염기의 길이,
    상기 올리고머는 THO 복합 서브 유닛 4 (THOC4) 단백질 및 단일 가닥 DNA- 결합 단백질 1 (SSB1) 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  2. 종양 세포(tumor cell)의 증식, 생존 또는 생존능력을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 본질적으로 종양 세포에 이하를 특징으로 하는 핵산 올리고머를 도입하는 단계로 구성되고,
    a) 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드(phosphorothioate internucleoside) 결합을 포함하는 백본(backbone)
    b) (i) 적어도 약 50 %의 퓨린 함량, 또는 (ii) 적어도 약 50 %의 구아노신-시토신 (GC) 함량으로 적어도 약 45 %의 퓨린 함량; 및
    c) 14 개 이상의 핵염기 및 29 개 이하의 핵염기의 길이,
    상기 올리고머는 THO 복합 서브 유닛 4 (THOC4) 단백질 및 단일 가닥 DNA- 결합 단백질 1 (SSB1) 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  3. 종양 세포(tumor cell)의 증식, 생존 또는 생존능력을 억제하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 종양 세포에 이하를 특징으로 하는 핵산 올리고머를 도입하는 단계로 구성되고,
    a) 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드(phosphorothioate internucleoside) 결합을 포함하는 백본(backbone)
    b) (i) 적어도 약 50 %의 퓨린 함량, 또는 (ii) 적어도 약 50 %의 구아노신-시토신 (GC) 함량으로 적어도 약 45 %의 퓨린 함량; 및
    c) 14 개 이상의 핵염기 및 29 개 이하의 핵염기의 길이,
    상기 올리고머는 THO 복합 서브 유닛 4 (THOC4) 단백질 및 단일 가닥 DNA- 결합 단백질 1 (SSB1) 중 하나 또는 둘 모두에 결합하는 것을 특징으로 하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 14 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 7 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 6 퓨린 및 7 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 8 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제4항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 15 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 8 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 7 퓨린 및 8 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제13항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 16 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 8 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 7 퓨린 및 8 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제22항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 17 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 8 퓨린 및 9 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제32항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 18 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 8 퓨린 및 9 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제42항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 19 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린 및 10 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제53항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 20 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린 및 10 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제64항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 21 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 9 퓨린 및 11 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제76항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 22 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린 및 11 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제88항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 23 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 10 퓨린 및 12 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  108. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  109. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  110. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  111. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  112. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  113. 제101항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  114. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 24 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  116. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린 및 12 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  117. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  118. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  119. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  120. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  121. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  122. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  123. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  124. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  125. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  126. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  127. 제114항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  128. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 25 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  129. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  130. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 11 퓨린 및 13 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  131. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  132. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  133. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  134. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  135. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  136. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  137. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  138. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  139. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  140. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  141. 제128항에 있어서, 상기 올리고머는 24 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  142. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 26 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  143. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  144. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린 및 13 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  145. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  146. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  147. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  148. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  149. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  150. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  151. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  152. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  153. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  154. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  155. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 24 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  156. 제142항에 있어서, 상기 올리고머는 25 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  157. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 27 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  158. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  159. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 12 퓨린 및 14 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  160. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  161. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  162. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  163. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  164. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  165. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  166. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  167. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  168. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  169. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 24 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  170. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 25 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  171. 제157항에 있어서, 상기 올리고머는 26 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  172. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 28 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  173. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 14 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  174. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린 및 14 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  175. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  176. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  177. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  178. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  179. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  180. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  181. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  182. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  183. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  184. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 24 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  185. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 25 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  186. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 26 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  187. 제172항에 있어서, 상기 올리고머는 27 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  188. 제1항 내지 제3항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머는 29 핵염기의 길이를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  189. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 15 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  190. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 13 퓨린 및 15 G/C로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  191. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 16 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  192. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 17 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  193. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 18 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  194. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 19 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  195. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 20 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  196. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 21 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  197. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 22 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  198. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 23 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  199. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 24 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  200. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 25 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  201. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 26 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  202. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 27 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  203. 제188항에 있어서, 상기 올리고머는 28 퓨린으로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  204. 제1항 내지 제203항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 백본의 인터뉴클레오시드 결합의 적어도 70%가 포스포로티오에이트 (PS) 인터뉴클레오시드 결합(phosphorothioate internucleoside linkages)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  205. 제204항에 있어서,
    임의의 비-PS 인터뉴클레오시드 결합(non-PS internucleoside linkages)은 상기 올리고머의 한쪽 또는 양쪽 말단에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  206. 제204항 또는 제205항에 있어서,
    임의의 비-PS 인터뉴클레오시드 결합은 상기 올리고머의 중앙 부분에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  207. 제204항에 있어서,
    임의의 비-PS 인터뉴클레오시드 결합은 상기 올리고머 전체에 분산되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  208. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    9개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  209. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    8개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  210. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    7개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  211. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    6개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  212. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    5개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  213. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    4개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  214. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    3개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  215. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    2개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  216. 제204항 내지 제207항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    1개 이하의 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  217. 제204항에 있어서,
    모든 인터뉴클레오시드 결합이 비-PS 인터뉴클레오시드 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  218. 제1항 내지 제217항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는 핵에서 종양 세포의 세포질(cytoplasm)로의 mRNA의 전이(translocation)를 차단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  219. 제1항 내지 제218항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는
    비-종양 세포에 의해 흡수되는 것에 비하여, 종양 세포에 의해 우선적으로 흡수되는 것을 특징으로 하는 방법.
  220. 제1항 내지 제219항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는
    종양 세포에 세포 사멸 또는 괴사를 일으키는 것을 특징으로 하는 방법.
  221. 제220항에 있어서,
    상기 올리고머는 비-종양 세포보다 종양 세포와 동일한 유형의 종양 세포를 더 많이 사멸시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  222. 제1항 내지 제221항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는 대조 올리고머(control oligomer) 보다 THOC4 및 THOC4 중 하나 또는 둘 모두에 높은 친화성으로 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  223. 제1항 내지 제222항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는 생체 내에서 종양 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  224. 제1항 내지 제223항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는 시험관 내에서 종양 세포에 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
  225. 제1항 내지 제224항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머는 적어도 약 45 ℃의 용융 온도(Tm)를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  226. 제1항 내지 제225항 가운데 어느 한 항에 있어서,
    상기 올리고머의 백본은 2’-알킬 변형 당 잔기(2’-O-alkyl modified sugar moiety)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  227. 제226항에 있어서,
    상기 올리고머의 뉴클레오시드의 적어도 약 50%가 각각 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)인 것을 특징으로 하는 방법.
  228. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 14 핵염기로 구성되고 7 내지 14 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  229. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 15 핵염기로 구성되고 8 내지 15 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  230. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 16 핵염기로 구성되고 8 내지 16 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  231. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 17 핵염기로 구성되고 9 내지 17 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  232. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 18 핵염기로 구성되고 9 내지 18 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  233. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 19 핵염기로 구성되고 10 내지 19 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  234. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 20 핵염기로 구성되고 10 내지 20 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  235. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 21 핵염기로 구성되고 11 내지 21 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  236. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 22 핵염기로 구성되고 11 내지 22 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  237. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 23 핵염기로 구성되고 12 내지 23 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  238. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 24 핵염기로 구성되고 12 내지 24 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  239. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 25 핵염기로 구성되고 13 내지 25 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  240. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 26 핵염기로 구성되고 13 내지 26 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  241. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 27 핵염기로 구성되고 14 내지 27 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  242. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 28 핵염기로 구성되고 14 내지 28 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  243. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 29 핵염기로 구성되고 15 내지 29 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  244. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 구성된다.
  245. 제226항 또는 제227항에 있어서, 상기 올리고머가 15 핵염기로 구성되고 7 내지 15 2’-O-알킬-뉴클레오시드(2’-O-alkyl nucleoside)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  246. 제226항 내지 제245항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 2’-O-알킬 뉴클레오시드는 2’-O-메틸 뉴클레오시드인 것을 특징으로 하는 방법.
  247. 제1항 내지 제246항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머의 길이에 걸친 핵염기 서열은 전사체(transcriptome)에 대한 상보성(complementarity)이 실질적으로 결여되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  248. 제247항에 있어서, 상기 올리고머의 핵염기의 약 95% 이하가 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  249. 제248항에 있어서, 상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기-쌍이 형성되지 않는 적어도 하나의 비-상보적 핵염기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  250. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 90% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  251. 제250항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  252. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 85% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  253. 제252항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 2, 3 또는 4개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  254. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 80% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  255. 제254항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  256. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 75% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  257. 제256항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  258. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 70% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  259. 제258항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  260. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 65% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  261. 제260항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  262. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 60% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  263. 제262항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  264. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 55% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  265. 제264항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  266. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 50% 이하는 상기 전사체와 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  267. 제266항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 전사체의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  268. 제1항 내지 제267항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 종양 세포가 적절하게 유도된 포유류의 게놈(genome)에 실질적인 상보성이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  269. 제268항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 95% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  270. 제269항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기-쌍을 형성할 수 없는 적어도 하나의 비-상보적 핵염기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  271. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 90% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  272. 제271항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  273. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 85% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  274. 제273항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 2, 3 또는 4개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  275. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 80% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  276. 제275항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  277. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 75% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  278. 제277항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  279. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 70% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  280. 제279항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  281. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 65% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  282. 제281항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  283. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 60% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  284. 제283항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  285. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 55% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  286. 제285항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  287. 제247항에 있어서,
    상기 올리고머의 핵염기의 약 50% 이하가 상기 게놈에 염기-쌍을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  288. 제287항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 비-상보적 핵염기를 가지며, 상기 게놈의 기준 핵염기 서열의 핵염기와 염기쌍을 형성할 수 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  289. 제1항 내지 제288항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 종양 세포가 적절하게 유도된 포유류의 게놈(genome)에 상동성(homology)이 결여된 것을 특징으로 하는 방법.
  290. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 95% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  291. 제290항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 기준 핵염기 서열의 매칭 위치(matching position)에서 핵염기와 동일하지 않거나 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력(nucleobase-pairing ability)을 갖지 않는 적어도 하나의 핵염기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  292. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 90% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  293. 제292항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 1, 2 또는 3개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  294. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 85% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  295. 제294항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 2, 3 또는 4개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  296. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 80% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  297. 제296항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5 또는 6개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  298. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 75% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  299. 제298항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  300. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 70% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  301. 제300항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  302. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 65% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  303. 제302항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  304. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 60% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  305. 제304항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  306. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 55% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  307. 제306항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  308. 제289항에 있어서,
    상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열이 게놈에서 기준 핵염기 서열을 한정하는 임의의 동일한 길이의 인접 핵염기와 약 50% 이하의 서열 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  309. 제308항에 있어서,
    상기 올리고머는 14 내지 29 핵염기로 이루어지고, 표 1로부터 계산된 올리고머의 길이에 따라 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 14개의 핵염기를 가지며, 이는 기준 핵염기 서열의 매칭 위치에서 핵염기와 동일하지 않거나, 또는 그와 동일하거나 동등한 핵염기-쌍 형성 능력을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  310. 제1항 내지 제246항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고머 길이에 걸친 핵염기 서열은 선택된 유전자의 안티센스 가닥(antisense strand)에 실질적인 상보성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  311. 제310항에 있어서, 상기 핵염기 서열은 고 엄격 조건(high stringency conditions) 하에서 선택된 유전자 또는 이의 전사물의 표적 서열에 상보적이고 하이브리드화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  312. 제1항 내지 제311항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 혁염기 서열이 다음 SEQ ID NO의 어느 하나로부터 선택된 것인 방법.
    SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 27, 28, 29, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 44, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 59, 61, 62, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 91, 92, 93, 94, 98, 100, 101, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, 111, 113, 114, 115, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 135, 137, 138, 143, 144, 145, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 177, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 191, 192, 196, 198, 203, 206, 207, 209, 210, 211, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 244, 245, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 256, 258, 259, 261, 263, 264, 265, 269, 270, 271, 272, 274, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 및 303.
  313. 제1항 내지 제311항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 혁염기 서열이 다음 SEQ ID NO의 어느 하나로부터 선택된 것인 방법.
    SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 6, 10, 12, 14, 15, 16, 17, 21, 22, 23, 24, 25, 28, 32, 31, 34, 35, 36, 38, 39, 41, 44, 52, 56, 53, 54, 59, 61, 63, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 91, 92, 93, 98, 100, 103, 104, 107, 109, 110, 111, 113, 114, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 131, 132, 133, 134, 135, 143, 144, 145, 153, 155, 156, 158, 159, 160, 161, 162, 164, 165, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 180, 181, 182, 191, 192, 203, 224, 225, 226, 227, 229, 230, 233, 234, 235, 236, 238, 239, 240, 245, 247, 251, 252, 253, 258, 259, 261, 263, 264, 269, 271, 272, 274, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 및 303.
  314. 제1항 내지 제311항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 혁염기 서열이 다음 SEQ ID NO의 어느 하나로부터 선택된 것인 방법.
    SEQ ID NO: 1, 2, 3, 5, 14, 16, 17, 31, 34, 35, 36, 38, 39, 52, 56, 67, 68, 69, 70, 71, 79, 80, 81, 82, 83, 91, 92, 93, 100, 103, 109, 110, 111, 114, 119, 131, 133, 134, 135, 143, 153, 155, 158, 159, 161, 164, 168, 169, 171, 181, 182, 203, 253, 272, 300, 301 및 303.
  315. 제1항 내지 제314항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포가 유방, 전립선, 난소, 자궁 경부, 췌장, 결장, 직장, 폐, 간세포, 위, 간, 방광, 요로, 갑상선, 암, 흑색 종, 뇌, 비소 세포 폐, 머리와 목의 편평 세포, 자궁 내막 암, 다발성 골수종, 직장 및 식도 종양 세포로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  316. 제1항 내지 제314항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포는 전립선, 폐 췌장, 유방, 난소 또는 뼈 종양 세포로부터 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  317. 제1항 내지 제316항 가운데 어느 한 항에 있어서, 올리고머 화합물은 THOC4 및 hSSB1 중 하나 또는 둘 모두에 우선적으로 결합하거나 또는 친화력을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  318. 제318항에 있어서, 상기 THOC4 및 hSSB1 단백질은 인간(human)인 것을 특징으로 하는 방법.
  319. 제318항 또는 제319항에 있어서, 상기 올리고머 화합물은 37 ℃에서 10nM Tris-HCl (pH8.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 수용액에서 약 50nM 이하의 KD로 THOC4와 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  320. 제318항 또는 제319항에 있어서, 상기 올리고머 화합물은 37 ℃에서 10nM Tris-HCl (pH8.0) 및 100mM NaCl을 함유하는 수용액에서 약 3nM 이하의 KD로 SSB1(예 : hSSB1)과 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  321. 제1항 내지 제314항 가운데 어느 한 항으로 정의되는 올리고머.
  322. 제1항 내지 제314항 가운데 어느 한 항으로 정의된 올리고머 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물.
  323. 제1항 내지 제314항 가운데 어느 한 항에서 정의된 올리고머의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게 암을 치료 또는 예방하는 방법.
  324. 제323항에 있어서, 상기 암은 고형 종양 또는 혈액 매개 종양인 방법.
  325. 제323항 또는 제324항에 있어서, 상기 암은 피부, 조직, 기관, 뼈, 연골, 혈액 및 혈관의 암으로부터 선택된 방법
  326. 제323항 내지 제325항 가운데 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 유방암, 전립선 암, 난소 암, 자궁 경부암, 췌장암, 결장 직장암, 폐암, 간세포 암, 위암, 간암, 방광 암, 요로 암, 갑상선암, 신장 암, 암종, 흑색 종, 뇌암, 비소 세포 폐암, 두경부 편평 세포 암, 자궁 내막 암, 다발성 골수종, 직장 암 및 식도암으로부터 선택된 암인 방법.
  327. 제323항 내지 제326항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 전립선 암, 폐암, 췌장암, 유방암, 난소 암 및 골암으로부터 선택된 것인 방법.
  328. 제323항 내지 제327항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 원발성 암인 방법.
  329. 제323항 내지 제327항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암이 전이성 암인 방법.
  330. 제323항 내지 제329항 중 어느 한 항에 있어서, 암을 치료 또는 예방하기 위한 하나 이상의 보조제를 상기 올리고머와 동시에 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  331. 제330항에있어서, 보조제가 항 감염 제, 화학 요법 제 및 면역 요법 제 중에서 선택되는 방법.
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