CN117683769A - 核酸寡聚体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及核酸寡聚体及其用途。公开了核酸寡聚体化合物及其在用于抑制癌细胞的增殖、存活或存活力的组合物和方法中的用途，所述癌细胞包括前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌和骨癌细胞。

Description

核酸寡聚体及其用途
本申请是申请日为2016年12月23日，申请号为201680082471.9，发明名称为“核酸寡聚体及其用途”的申请的分案申请。
发明领域
本申请要求于2015年12月23日提交的题为“Nucleic acid oligomers and usestherefor”的澳大利亚临时申请号2015905380的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
本发明通常涉及核酸寡聚体化合物及其在用于抑制癌细胞的增殖、存活或存活力的组合物和方法中的用途，所述癌细胞包括前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌和骨癌细胞。
发明背景
癌症为全球唯一最大的健康问题。估计到2030年，全球所有死亡人数的一半将来自癌症，并且我们一生中我们患癌症的数学机会现在已接近70％。
药物开发已经遇到了一些障碍。化学治疗药物主要直接或通过抑制细胞分裂靶向基因组稳定性。由于所有癌症都显示基因组不稳定性，这些药物可以推进这些细胞凋亡或坏死。然而，化学治疗药物对患者的正常细胞表现出毒性，并且大多数患者对这些药物发展耐受性。还已经开发了针对其癌症由具有特定可药用突变的癌蛋白驱动的患者亚型的癌症疗法。实例包括乳腺癌中的HER2过表达，以及肺癌中的EGFR突变和ALK重排。最近已经开发了靶向CTLA4和PD1/PDL1途径的免疫检查点抑制剂，它们对一定比例的实体瘤有效，但大多数这些抑制剂仅对肿瘤子集有效，并且在许多情况下，患者对它们变得为难治性的。
本领域对治疗或预防癌症的新方法仍然存在迫切需求。
发明概述
本发明基于这样的发现，即具有特定骨架化学组成(chemistry)和碱基组成的指定长度的核酸寡聚体化合物可以与参与DNA修复和/或RNA分子细胞核输出到细胞的蛋白合成机器的细胞蛋白结合。出乎意料地，还已经发现这些化合物能够显著抑制肿瘤细胞的增殖或刺激肿瘤细胞的死亡，所述肿瘤细胞包括与前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌或骨癌相关的肿瘤细胞。如下文描述的，这些发现已经被还原至新型化合物、组合物和方法中的实践。
因此，在一个方面，本发明提供了用于抑制肿瘤细胞(例如，哺乳动物肿瘤细胞，诸如人类肿瘤细胞)的增殖、存活或存活力的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：将核酸寡聚体引入到肿瘤细胞中，其特征在于：
a)骨架，所述骨架包含硫代磷酸酯核苷间连键；
b)(i)至少约50％的嘌呤含量，或(ii)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；以及
c)至少14个核碱基和不多于29个核碱基的长度，
其中所述寡聚体与THO复合物亚基4(THOC4)蛋白和单链DNA结合蛋白1(SSB1)中的一种或两种结合。
至少约45％的代表性嘌呤含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少6个嘌呤、15个核碱基寡聚体中的至少7个嘌呤、16个核碱基寡聚体中的至少7个嘌呤、17个核碱基寡聚体中的至少8个嘌呤、18个核碱基寡聚体中的至少8个嘌呤、19个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、20个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、21个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、22个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、23个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、24个核碱基寡聚体中的至少11个嘌呤、25个核碱基寡聚体中的至少11个嘌呤、26个核碱基寡聚体中的至少12个嘌呤、27个核碱基寡聚体中的至少12个嘌呤、28个核碱基寡聚体中的至少13个嘌呤和29个核碱基寡聚体中的至少13个嘌呤。
至少约50％的代表性嘌呤含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少7个嘌呤、15个核碱基寡聚体中的至少8个嘌呤、16个核碱基寡聚体中的至少8个嘌呤、17个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、18个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、19个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、20个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、21个核碱基寡聚体中的至少11个嘌呤、22个核碱基寡聚体中的至少11个嘌呤、23个核碱基寡聚体中的至少12个嘌呤、24个核碱基寡聚体中的至少12个嘌呤、25个核碱基寡聚体中的至少13个嘌呤、26个核碱基寡聚体中的至少13个嘌呤、27个核碱基寡聚体中的至少14个嘌呤、28个核碱基寡聚体中的至少14个嘌呤和29个核碱基寡聚体中的至少15个嘌呤。
至少约50％的代表性GC含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少7个G/C、15个核碱基寡聚体中的至少8个G/C、16个核碱基寡聚体中的至少8个G/C、17个核碱基寡聚体中的至少9个G/C、18个核碱基寡聚体中的至少9个G/C、19个核碱基寡聚体中的至少10个G/C、20个核碱基寡聚体中的至少10个G/C、21个核碱基寡聚体中的至少11个G/C、22个核碱基寡聚体中的至少11个G/C、23个核碱基寡聚体中的至少12个G/C、24个核碱基寡聚体中的至少12个G/C、25个核碱基寡聚体中的至少13个G/C、26个核碱基寡聚体中的至少13个G/C、27个核碱基寡聚体中的至少14个G/C、28个核碱基寡聚体中的至少14个G/C和29个核碱基寡聚体中的至少15个G/C。
在一些实施方案中，寡聚体的特征还在于寡聚体阻断mRNA从肿瘤细胞的细胞核至细胞质的易位。
在一些实施方案中，寡聚体的特征还在于，与其被非肿瘤细胞摄取相比，所述寡聚体优先被肿瘤细胞摄取。
合适地，寡聚体的特征还在于所述寡聚体引起肿瘤细胞的凋亡或坏死。在这种类型的说明性实例中，与非肿瘤细胞相比，寡聚体引起与肿瘤细胞相同类型的肿瘤细胞更多的死亡。
在具体的实施方案中，寡聚体的特征还在于所述寡聚体合适地在如本文定义的条件下以比对照寡聚体更高的亲和力与THOC4和SSB1中的一种或两种结合。
寡聚体引入到肿瘤细胞可以在体内或体外发生。
合适地，骨架的至少约70％的核苷间连键包含硫代磷酸酯核苷间连键。在具体的实施方案中，骨架的所有核苷间连键包含硫代磷酸酯核苷间连键。
在一些实施方案中，寡聚体的特征还在于具有至少约45℃的解链温度(Tm)。
在一些实施方案中，寡聚体的骨架包含至少一个2'-O-烷基修饰的糖部分，其在本文中也被称为“2'-O-烷基核苷”(例如，2'-O-甲基核苷)。在具体实例中，寡聚体包含至少一个2'-O-甲基核糖核苷。合适地，寡聚体的至少约50％的核苷各自为2'-O-烷基核苷(例如，2'-O-甲基核苷)。在具体的实施方案中，寡聚体的所有核苷各自为2'-O-烷基核苷(例如，2'-O-甲基核苷)。
在一些实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与转录物组缺乏实质上的互补性。合适地，寡聚体的不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的核碱基能够与转录物组进行碱基配对。在这种类型的说明性实例中，其中不多于95％的寡聚体核碱基能够与转录物组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体具有至少一个非互补核碱基，所述至少一个非互补核碱基不能与该转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。在其他说明性实例中，如例如由以下表1计算的，其中不多于90％的寡聚体核碱基能够与转录物组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体取决于寡聚体的长度具有至少1个、2个或3个非互补核碱基，所述至少1个、2个或3个非互补核碱基不能与该转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
在一些实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物的基因组缺乏实质上的互补性。合适地，寡聚体的不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的核碱基能够与基因组进行碱基配对。在这种类型的说明性实例中，其中不多于95％的寡聚体核碱基能够与基因组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体具有至少一个非互补核碱基，所述至少一个非互补核碱基不能与该基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。在其他说明性实例中，如例如由以下表1计算的，其中不多于90％的寡聚体核碱基能够与基因组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体取决于寡聚体的长度具有至少1个、2个或3个非互补核碱基，所述至少1个、2个或3个非互补核碱基不能与该基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
在一些实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物的基因组缺乏同源性。合适地，在寡聚体长度内的核碱基序列与任何相同长度的定义基因组中参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的序列同一性。在这种类型的说明性实例中，与基因组中的参考核碱基序列具有不多于95％序列同一性的14个至29个核碱基的寡聚体具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少一个核碱基。在其他说明性实例中，如例如由如下表1计算的，与基因组中的参考核碱基序列具有不多于90％序列同一性的14个至29个核碱基的寡聚体取决于寡聚体的长度具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少1个、2个或3个核碱基。
与转录物组缺乏实质上的互补性或者与基因组缺乏实质上的互补性或同源性的寡聚体化合物在本文中被称为“非靶向寡聚体”。在一些实施方案中，本发明的非靶向寡聚体包含选自以下的任一项的核苷碱基序列：SEQ ID NO:1、2、3、5、7、36、37、38、39、40、41、44、45、51、52、53、54、55、56、59、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、79、80、81、82、83、84、85、91、92、93、94、98、100、103、104、105、107、108、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、131、132、133、134、135、137、138、143、144、145、152、153、155、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、180、181、182、183、184、185、191、192、196、198、203、206、207、209、210、211、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、244、245、247、248、249、250、251、252、253、256、258、259、261、263、264、265、269、270、271、272、274、277、281、282、283、286、287、290、291、292、293、295、296、298、300、301和303。
在其他实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与选择的基因的反义链具有实质上的互补性。在这些实施方案中，核碱基序列在高严格条件下与所选择的基因或其转录物(包括由所选择的基因编码的前体mRNA或mRNA分子)的靶序列合适地互补并杂交。这种类型的寡聚体化合物在本文中也被称为“反义寡聚体”。在一些实施方案中，本发明的反义寡聚体包含选自以下的任一项的核苷碱基序列：SEQ ID NO:6、10、12、14、15、16、17、21、22、23、24、25、27、28、29、31、32、33、34、35、101、278、279、280、284、285、288、289、297和299。
这些寡聚体对抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力具有显著的活性。然而，这些寡聚体中一些具有比其他寡聚体高的抑制活性，并且在优选的实施方案中，寡聚体具有选自以下的任一项的核碱基序列：SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、12、14、15、16、17、21、22、23、24、25、28、32、31、34、35、36、38、39、41、44、52、56、53、54、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、79、80、81、82、83、84、91、92、93、98、100、103、104、107、109、110、111、113、114、117、118、119、120、121、122、131、132、133、134、135、143、144、145、153、155、156、158、159、160、161、162、164、165、167、168、169、170、171、172、180、181、182、191、192、203、224、225、226、227、229、230、233、234、235、236、238、239、240、245、247、251、252、253、258、259、261、263、264、269、271、272、274、285、286、287、288、289、290、291、292、293、295、296、297、298、299、300、301和303。在更优选的实施方案中，寡聚体具有选自以下的任一项的核苷碱基序列：SEQ ID NO:1、2、3、5、14、16、17、31、34、35、36、38、39、52、56、67、68、69、70、71、79、80、81、82、83、91、92、93、100、103、109、110、111、114、119、131、133、134、135、143、153、155、158、159、161、164、168、169、171、181、182、203、253、272、300、301和303。
肿瘤细胞可以是具有赘生性细胞生长和增殖的任何细胞，无论是恶性的还是良性的。它可能是癌前或癌性的。在具体的实施方案中，肿瘤细胞选自前列腺肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤或骨肿瘤细胞。
寡聚体化合物与THOC4和hSSB1中的一种或两种优先结合或具有对THOC4和hSSB1中的一种或两种的亲和力。THOC4和SSB1蛋白优选地为人类(即，hTHOC4和hSSB1)。在具体的实施方案中，寡聚体化合物在37℃合适地在包含10nM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中以约50nM或更少的KD与THOC4(例如，hTHOC4)优先结合和/或以约3nM或更少的KD与SSB1(例如hSSB1)结合。
本发明的另一个方面提供了如以上以及本文别处广泛描述的寡聚体。
又在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如以上以及本文别处广泛描述的寡聚体和药学上可接受的载体。
本发明的仍另一个方面提供了用于治疗或预防受试者中的癌症的方法。这些方法通常包括以下、由以下组成或基本上由以下组成：将有效量的如以上以及本文别处广泛描述的寡聚体施用至受试者。
癌症可以是实体瘤或血源肿瘤，包括皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的癌症。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。在具体的实施方案中，癌症选自前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌和骨癌。
在一些实施方案中，该方法包括与寡聚体同时施用至少一种辅助剂，所述辅助剂选自抗感染剂(例如，选自抗生素、抗阿米巴药(amebicides)、抗真菌药、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药等)、化学治疗剂(例如，选自抗增殖药物/抗肿瘤药物、细胞生长抑制剂、抑制癌细胞侵袭的剂、生长因子功能抑制剂、抗血管生成剂，血管损伤剂等)和免疫治疗剂(例如，细胞因子、细胞因子-表达细胞、抗体等)。
本申请提供了以下内容：
1.一种用于抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力的方法，所述方法包括将核酸寡聚体引入到所述肿瘤细胞中，所述核酸寡聚体特征在于：
a)骨架，所述骨架包含硫代磷酸酯核苷间连键；
b)(i)至少约50％的嘌呤含量，或(ii)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；以及
c)至少14个核碱基和不多于29个核碱基的长度，
其中所述寡聚体与THO复合物亚基4(THOC4)蛋白和单链DNA结合蛋白1(SSB1)中的一种或两种结合。
2.一种用于抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力的方法，所述方法基本上由将核酸寡聚体引入到所述肿瘤细胞中组成，所述核酸寡聚体特征在于：
a)骨架，所述骨架包含硫代磷酸酯核苷间连键；
b)(i)至少约50％的嘌呤含量，或(ii)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；以及
c)至少14个核碱基和不多于29个核碱基的长度，
其中所述寡聚体与THO复合物亚基4(THOC4)蛋白和单链DNA结合蛋白1(SSB1)中的一种或两种结合。
3.一种用于抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力的方法，所述方法由将核酸寡聚体引入到所述肿瘤细胞中组成，所述核酸寡聚体特征在于：
a)骨架，所述骨架包含硫代磷酸酯核苷间连键；
b)(i)至少约50％的嘌呤含量，或(ii)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；以及
c)至少14个核碱基和不多于29个核碱基的长度，
其中所述寡聚体与THO复合物亚基4(THOC4)蛋白和单链DNA结合蛋白1(SSB1)中的一种或两种结合。
4.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有14个核碱基的长度。
5.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由7个嘌呤组成。
6.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由6个嘌呤和7个G/C组成。
7.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由8个嘌呤组成。
8.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤组成。
9.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
10.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
11.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
12.根据项目4所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
13.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有15个核碱基的长度。
14.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由8个嘌呤组成。
15.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由7个嘌呤和8个G/C组成。
16.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤组成。
17.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
18.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
19.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
20.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
21.根据项目13所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
22.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有16个核碱基的长度。
23.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由8个嘌呤组成。
24.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由7个嘌呤和8个G/C组成。
25.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤组成。
26.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
27.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
28.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
29.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
30.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
31.根据项目22所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
32.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有17个核碱基的长度。
33.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤组成。
34.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由8个嘌呤和9个G/C组成。
35.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
36.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
37.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
38.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
39.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
40.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
41.根据项目32所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
42.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有18个核碱基的长度。
43.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤组成。
44.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由8个嘌呤和9个G/C组成。
45.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
46.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
47.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
48.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
49.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
50.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
51.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
52.根据项目42所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
53.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有19个核碱基的长度。
54.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
55.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤和10个G/C组成。
56.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
57.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
58.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
59.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
60.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
61.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
62.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
63.根据项目53所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
64.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有20个核碱基的长度。
65.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤组成。
66.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤和10个G/C组成。
67.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
68.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
69.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
70.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
71.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
72.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
73.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
74.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
75.根据项目64所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
76.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有21个核碱基的长度。
77.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
78.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由9个嘌呤和11个G/C组成。
79.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
80.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
81.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
82.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
83.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
84.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
85.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
86.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
87.根据项目76所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
88.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有22个核碱基的长度。
89.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤组成。
90.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤和11个G/C组成。
91.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
92.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
93.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
94.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
95.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
96.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
97.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
98.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
99.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
100.根据项目88所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
101.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有23个核碱基的长度。
102.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
103.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由10个嘌呤和12个G/C组成。
104.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
105.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
106.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
107.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
108.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
109.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
110.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
111.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
112.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
113.根据项目101所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
114.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有24个核碱基的长度。
115.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤组成。
116.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤和12个G/C组成。
117.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
118.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
119.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
120.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
121.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
122.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
123.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
124.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
125.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
126.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
127.根据项目114所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
128.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有25个核碱基的长度。
129.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
130.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由11个嘌呤和13个G/C组成。
131.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
132.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
133.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
134.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
135.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
136.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
137.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
138.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
139.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
140.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
141.根据项目128所述的方法，其中所述寡聚体由24个嘌呤组成。
142.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有26个核碱基的长度。
143.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤组成。
144.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤和13个G/C组成。
145.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
146.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
147.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
148.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
149.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
150.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
151.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
152.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
153.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
154.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
155.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由24个嘌呤组成。
156.根据项目142所述的方法，其中所述寡聚体由25个嘌呤组成。
157.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有27个核碱基的长度。
158.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
159.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由12个嘌呤和14个G/C组成。
160.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
161.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
162.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
163.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
164.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
165.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
166.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
167.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
168.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
169.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由24个嘌呤组成。
170.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由25个嘌呤组成。
171.根据项目157所述的方法，其中所述寡聚体由26个嘌呤组成。
172.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有28个核碱基的长度。
173.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由14个嘌呤组成。
174.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤和14个G/C组成。
175.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
176.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
177.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
178.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
179.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
180.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
181.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
182.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
183.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
184.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由24个嘌呤组成。
185.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由25个嘌呤组成。
186.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由26个嘌呤组成。
187.根据项目172所述的方法，其中所述寡聚体由27个嘌呤组成。
188.根据项目1至3中任一项所述的方法，其中所述寡聚体具有29个核碱基的长度。
189.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由15个嘌呤组成。
190.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由13个嘌呤和15个G/C组成。
191.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由16个嘌呤组成。
192.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由17个嘌呤组成。
193.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由18个嘌呤组成。
194.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由19个嘌呤组成。
195.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由20个嘌呤组成。
196.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由21个嘌呤组成。
197.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由22个嘌呤组成。
198.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由23个嘌呤组成。
199.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由24个嘌呤组成。
200.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由25个嘌呤组成。
201.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由26个嘌呤组成。
202.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由27个嘌呤组成。
203.根据项目188所述的方法，其中所述寡聚体由28个嘌呤组成。
204.根据项目1至203中任一项所述的方法，其中所述骨架的至少约70％的核苷间连键包含硫代磷酸酯(PS)核苷间连键。
205.根据项目204所述的方法，其中任何非-PS核苷间连键位于所述寡聚体的一个末端或两个末端处。
206.根据项目204或项目205所述的方法，其中任何非-PS核苷间连键位于所述寡聚体的中心部分。
207.根据项目204所述的方法，其中任何非-PS核苷间连键分散于整个所述寡聚体中。
208.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达9个核苷间连键为非PS核苷间连键。
209.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达8个核苷间连键为非PS核苷间连键。
210.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达7个核苷间连键为非PS核苷间连键。
211.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达6个核苷间连键为非PS核苷间连键。
212.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达5个核苷间连键为非PS核苷间连键。
213.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达4个核苷间连键为非PS核苷间连键。
214.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达3个核苷间连键为非PS核苷间连键。
215.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达2个核苷间连键为非PS核苷间连键。
216.根据项目204至207中任一项所述的方法，其中多达1个核苷间连键为非PS核苷间连键。
217.根据项目204所述的方法，其中所有核苷间键均为PS核苷间键。
218.根据项目1至217中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的特征还在于所述寡聚体阻断mRNA从所述肿瘤细胞的细胞核至细胞质的易位。
219.根据项目1至218中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的特征还在于，与其被非肿瘤细胞摄取相比，所述寡聚体优先被肿瘤细胞摄取。
220.根据项目1至219中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的特征还在于所述寡聚体引起所述肿瘤细胞的凋亡或坏死。
221.根据项目220所述的方法，其中与非肿瘤细胞相比，所述寡聚体引起与所述肿瘤细胞相同类型的肿瘤细胞更多的死亡。
222.根据项目1至221中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的特征还在于，所述寡聚体以比对照寡聚体高的亲和力与THOC4和SSB1中的一种或两种结合。
223.根据项目1至222中任一项所述的方法，其中所述寡聚体被体内引入到所述肿瘤细胞中。
224.根据项目1至222中任一项所述的方法，其中所述寡聚体被体外引入到所述肿瘤细胞中。
225.根据项目1至224中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的特征还在于具有至少约45℃的解链温度(Tm)。
226.根据项目1至225中任一项所述的方法，其中所述寡聚体的骨架包含至少一个2'-O-烷基修饰的糖部分。
227.根据项目226所述的方法，其中所述寡聚体的至少约50％的核苷各自为2'-O-烷基核苷。
228.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由14个核碱基组成，并且包含从7个至14个2'-O-烷基核苷。
229.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由15个核碱基组成，并且包含从8个至15个2'-O-烷基核苷。
230.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由16个核碱基组成，并且包含从8个至16个2'-O-烷基核苷。
231.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由17个核碱基组成，并且包含从9个至17个2'-O-烷基核苷。
232.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由18个核碱基组成，并且包含从9个至18个2'-O-烷基核苷。
233.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由19个核碱基组成，并且包含从10个至19个2'-O-烷基核苷。
234.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由20个核碱基组成，并且包含从10个至20个2'-O-烷基核苷。
235.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由21个核碱基组成，并且包含从11个至21个2'-O-烷基核苷。
236.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由22个核碱基组成，并且包含从11个至22个2'-O-烷基核苷。
237.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由23个核碱基组成，并且包含从12个至23个2'-O-烷基核苷。
238.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由24个核碱基组成，并且包含从12个至24个2'-O-烷基核苷。
239.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由25个核碱基组成，并且包含从13个至25个2'-O-烷基核苷。
240.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由26个核碱基组成，并且包含从13个至26个2'-O-烷基核苷。
241.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由27个核碱基组成，并且包含从14个至27个2'-O-烷基核苷。
242.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由28个核碱基组成，并且包含从14个至28个2'-O-烷基核苷。
243.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由29个核碱基组成，并且包含从15个至29个2'-O-烷基核苷。
244.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由...组成。
245.根据项目226至227中任一项所述的方法，其中所述寡聚体由15个核碱基组成，并且包含从7个至15个2'-O-烷基核苷。
246.根据项目226至245中任一项所述的方法，其中2'-O-烷基核苷为2'-O-甲基核苷。
247.根据项目1至246中任一项所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的核碱基序列与转录物组实质上缺乏互补性。
248.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约95％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
249.根据项目248所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且具有至少一个非互补核碱基，所述至少一个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
250.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约90％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
251.根据项目250所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少1个、2个或3个非互补核碱基，所述至少1个、2个或3个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
252.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约85％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
253.根据项目252所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少2个、3个或4个非互补核碱基，所述至少2个、3个或4个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
254.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约80％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
255.根据项目254所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少3个、4个、5个或6个非互补核碱基，所述至少3个、4个、5个或6个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
256.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约75％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
257.根据项目256所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少3个、4个、5个、6个或7个非互补核碱基，所述至少3个、4个、5个、6个或7个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
258.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约70％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
259.根据项目258所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少4个、5个、6个、7个、8个或9个非互补核碱基，所述至少4个、5个、6个、7个、8个或9个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
260.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约65％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
261.根据项目260所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少5个、6个、7个、8个、9个或10个非互补核碱基，所述至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
262.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约60％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
263.根据项目262所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
264.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约55％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
265.根据项目264所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
266.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约50％的核碱基能够与所述转录物组进行碱基配对。
267.根据项目266所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个非互补核碱基不能与所述转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
268.根据项目1至267中任一项所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的核碱基序列与所述肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物的基因组缺乏实质上的互补性。
269.根据项目268所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约95％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
270.根据项目269所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且具有至少一个非互补核碱基，所述至少一个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
271.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约90％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
272.根据项目271所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少1个、2个或3个非互补核碱基，所述至少1个、2个或3个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
273.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约85％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
274.根据项目273所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少2个、3个或4个非互补核碱基，所述至少2个、3个或4个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
275.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约80％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
276.根据项目275所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少3个、4个、5个或6个非互补核碱基，所述至少3个、4个、5个或6个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
277.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约75％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
278.根据项目277所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少3个、4个、5个、6个或7个非互补核碱基，所述至少3个、4个、5个、6个或7个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
279.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约70％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
280.根据项目279所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少4个、5个、6个、7个、8个或9个非互补核碱基，所述至少4个、5个、6个、7个、8个或9个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
281.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约65％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
282.根据项目281所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少5个、6个、7个、8个、9个或10个非互补核碱基，所述至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
283.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约60％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
284.根据项目283所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
285.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约55％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
286.根据项目285所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
287.根据项目247所述的方法，其中所述寡聚体的不多于约50％的核碱基能够与所述基因组进行碱基配对。
288.根据项目287所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成，并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个非互补核碱基，所述至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14非互补核碱基不能与所述基因组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
289.根据项目1至288中任一项所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的核碱基序列与所述肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物的基因组缺乏同源性。
290.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约95％的序列同一性。
291.根据项目290所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少一个核碱基。
292.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约90％的序列同一性。
293.根据项目292所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少1个、2个或3个核碱基。
294.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约85％的序列同一性。
295.根据项目294所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少2个、3个或4个核碱基。
296.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约80％的序列同一性。
297.根据项目296所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少3个、4个、5个或6个核碱基。
298.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约75％的序列同一性。
299.根据项目298所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少3个、4个、5个、6个或7个核碱基。
300.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约70％的序列同一性。
301.根据项目300所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少4个、5个、6个、7个、8个或9个核碱基。
302.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约65％的序列同一性。
303.根据项目302所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少5个、6个、7个、8个、9个或10个核碱基。
304.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约60％的序列同一性。
305.根据项目304所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个核碱基。
306.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约55％的序列同一性。
307.根据项目306所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个核碱基。
308.根据项目289所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的所述核碱基序列与任何相等长度的定义所述基因组中的参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约50％的序列同一性。
309.根据项目308所述的方法，其中所述寡聚体由14个至29个核碱基组成并且如由以下表1计算的，取决于所述寡聚体的长度具有与所述参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个或14个核碱基。
310.根据项目1至246中任一项所述的方法，其中在所述寡聚体长度内的核碱基序列与选择的基因的反义链具有实质上的互补性。
311.根据项目310所述的方法，其中所述核碱基序列在高严格条件下与所选择的基因或其转录物的靶序列互补并杂交。
312.根据项目1至311中任一项所述的方法，其中所述核碱基序列选自以下的任一项：SEQ ID NO:1、2、3、5、6、7、10、12、14、15、16、17、21、22、23、24、25、27、28、29、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、44、45、51、52、53、54、55、56、59、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、79、80、81、82、83、84、85、91、92、93、94、98、100、101、103、104、105、107、108、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、131、132、133、134、135、137、138、143、144、145、152、153、155、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、180、181、182、183、184、185、191、192、196、198、203、206、207、209、210、211、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、244、245、247、248、249、250、251、252、253、256、258、259、261、263、264、265、269、270、271、272、274、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、295、296、297、298、299、300、301和303。
313.根据项目1至311中任一项所述的方法，其中所述核碱基序列选自以下的任一项：SEQ ID NO:1、2、3、5、6、10、12、14、15、16、17、21、22、23、24、25、28、32、31、34、35、36、38、39、41、44、52、56、53、54、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、79、80、81、82、83、84、91、92、93、98、100、103、104、107、109、110、111、113、114、117、118、119、120、121、122、131、132、133、134、135、143、144、145、153、155、156、158、159、160、161、162、164、165、167、168、169、170、171、172、180、181、182、191、192、203、224、225、226、227、229、230、233、234、235、236、238、239、240、245、247、251、252、253、258、259、261、263、264、269、271、272、274、285、286、287、288、289、290、291、292、293、295、296、297、298、299、300、301和303。
314.根据项目1至311中任一项所述的方法，其中所述核碱基序列选自以下的任一项：SEQ ID NO:1、2、3、5、14、16、17、31、34、35、36、38、39、52、56、67、68、69、70、71、79、80、81、82、83、91、92、93、100、103、109、110、111、114、119、131、133、134、135、143、153、155、158、159、161、164、168、169、171、181、182、203、253、272、300、301和303。
315.根据项目1至314中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自乳腺肿瘤、前列腺肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、胰腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、肺肿瘤、肝细胞肿瘤、胃肿瘤、肝肿瘤、膀胱肿瘤、尿道肿瘤、甲状腺肿瘤、肾肿瘤、上皮细胞恶性肿瘤、黑素瘤、脑肿瘤、非小细胞肺肿瘤、头颈部鳞状细胞肿瘤、子宫内膜肿瘤、多发性骨髓瘤、直肠肿瘤和食管肿瘤细胞。
316.根据项目1至314中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自前列腺肿瘤、肺肿瘤、胰腺肿瘤、乳腺肿瘤、卵巢肿瘤或骨肿瘤细胞。
317.根据项目1至316中任一项所述的方法，其中寡聚体化合物与THOC4和hSSB1中的一种或两种优先结合或具有对THOC4和hSSB1中的一种或两种的亲和力。
318.根据项目318所述的方法，其中所述THOC4和SSB1蛋白为人类蛋白。
319.根据项目318或项目319所述的方法，其中所述寡聚体化合物在37℃在包含10nM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中以约50nM或更少的KD与THOC4结合。
320.根据项目318或项目319所述的方法，其中所述寡聚体化合物在37℃在包含10nM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中以约3nM或更少的KD与SSB1(例如，hSSB1)结合。
321.一种如项目1至314中任一项中定义的寡聚体。
322.一种药物组合物，所述药物组合物包含如项目1至314中任一项中定义的寡聚体和药学上可接受的载体。
323.一种用于治疗或预防受试者中的癌症的方法，所述方法包括将有效量的如项目1至314中任一项中定义的寡聚体施用至所述受试者。
324.根据项目323所述的方法，其中所述癌症为实体瘤或血源肿瘤。
325.根据项目323或项目324所述的方法，其中所述癌症选自皮肤、组织、器官、骨、软骨、血液和血管的癌症。
326.根据项目323至325中任一项所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、肾癌、上皮细胞恶性肿瘤、黑素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食管癌。
327.根据项目323至326中任一项所述的方法，其中所述癌症选自前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和骨癌。
328.根据项目323至327中任一项所述的方法，其中所述癌症为原发性癌症。
329.根据项目323至327中任一项所述的方法，其中所述癌症为转移性癌症。
330.根据项目323至329中任一项所述的方法，所述方法还包括与所述寡聚体一起同时施用至少一种用于治疗或预防所述癌症的辅助剂。
331.根据项目330所述的方法，其中所述辅助剂选自抗感染剂、化学治疗剂和免疫治疗剂。
附图简述
图1为显示如指示的多种细胞系的明视野显微图像的照片表示。在对照寡聚体或非靶向寡聚体转染后16-36小时拍摄图像。与对照寡核苷酸转染的细胞相比，非靶向寡聚体化合物(“LSA”)对细胞存活力具有显著影响，如通过粘附力损失和低汇合显示的。
图2为显示用100nM的ctrl、In2E2LSA、In3E3LSA、E3E4LSA、ATGLSA寡聚体化合物以及用所有四种LSA序列的混合物(仅HeLa细胞)转染的HeLa和U2OS细胞的蛋白印迹的照片表示。在转染后24小时收获细胞。作为凋亡的标志的PARP裂解在LSA转染的细胞中是明显的，γH2AX诱导作为DNA损伤的标志也是如此。在LSA转染之后hSSB1蛋白水平均下降至不同程度。肌动蛋白被用作装载对照。
图3为显示用LSA和ASO转染的U2OS细胞中凋亡诱导的照片表示。蛋白印迹显示H2AX的磷酸化与PARP裂解相关，确认在用有毒的LSA/ASO转染的细胞中诱导了DNA损伤和凋亡。在用有毒的LSA/ASO转染之后，hSSB1蛋白水平也被耗尽。肌动蛋白被用作装载对照。
图4为显示与非有效寡核苷酸(对照)相比用最有效的LSA、ATGLSA或In3LSA(药物)对几种癌细胞系的治疗的图形表示。通过IncuCyte在72小时内测量细胞生长。
图5为显示THOC4和hSSB1 EMSA的照片和图形表示。EMSA显示增加浓度的THOC4(A)和hSSB1(B)蛋白与10nmol FAM标记的LSA_In3E3或阴性对照(Neg_C)。较低的条带表示游离的未结合的寡聚体(oligo)，较高的条带和涂片表示与蛋白结合的寡聚体，(C)一式三份EMSA实验的定量被表示为与蛋白结合的寡聚体的百分比。将纯化的hSSB1或THOC4蛋白与10nmol标记的寡聚体在37℃在由10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、0.01％IGEPAL、1mMEDTA和100ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的10％PAGE凝胶上电泳60min将样品分离。
图6为显示用ASO或LSA(100nM)转染的HeLa-BCL2细胞中的GFP表达测定的图形表示。观察到诱导细胞死亡的寡聚体化合物(ATGLSA、In3LSA、In3LSACU等)和低GFP荧光之间的相关性。与仅用GFP质粒(GFP)转染的细胞相比，非死亡诱导寡核苷酸诸如CTRL,NEGC、NEGC GAP、NEGC 50nM、In3LSA_CT5、OPEN_LSA1、CDCA3_LSA_IN2E2未显著影响GFP荧光。GFP荧光的降低指示基因表达的抑制，与mRNA易位的抑制一致。
图7为显示IN3LSA寡聚体化合物抑制多聚A mRNA从细胞核输出的照片表示。将HeLa BCL2细胞用FAM标记的IN3LSA寡聚体化合物或NEGC寡核苷酸转染，并且在转染后24小时进行mRNA FISH。多聚AmRNA以红色染色，并且使用DAPI染色细胞核。
图8为显示确定最佳寡聚体化合物长度的筛选结果的图形表示。从亲本序列的5'或3'末端开始，在那时(at the time)将寡聚体化合物逐步截短1bp。显示的数据为具有浓缩细胞核作为凋亡标志的细胞的百分比(将每一个板的数据以0-1的标度归一化为最小和最大评分，0＝最低死亡评分，1＝最高死亡评分)。
图9为显示嘌呤含量与细胞死亡相关的图形表示。比较细胞毒性的标志(细胞核浓缩和PI阳性染色)的散点图。每一个板的数据在HeLa和U2OS细胞之间取平均值，并且归一化为最小和最大评分，0＝最低PI阳性，1＝最高PI阳性)。
图10为显示在4周内用细胞死亡诱导有效寡聚体化合物IN3LSA(In3，灰色三角形)和ATGLSA(ATG，白色菱形)与非有效对照寡核苷酸(ctrl)和PBS(黑点)治疗的SCID小鼠的肿瘤生长延迟的图形表示(每周2次静脉注射)。该图显示了每组至少7只小鼠的肿瘤体积的平均变化+/-SEM。星号表示统计学上显著降低的肿瘤体积(ANOVA,α＝0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.0001)。
图11为显示在4周内用寡聚体化合物IN3LSA(In3，灰色三角形)和ATGLSA(ATG，白色菱形)与非有效对照寡核苷酸(ctrl)和PBS(黑点)治疗的SCID小鼠的重量变化的图形表示(每周2次静脉注射)。该图形表示每组至少7只小鼠的平均重量变化+/-SEM。黑色箭头显示治疗的开始。
图12为显示在4周治疗之后与对照和PBS相比对于IN3LSA(In3，小鼠编号#110H-1、119J-2和84A-3，左图)和ATGLSA(ATG，小鼠编号#114I-1、120J-3、91C-2，右图)，具有最明显降低的肿瘤的3只小鼠的重量变化。
图13为显示来自Cy 5.5标记的In3LSA寡聚体化合物的肿瘤部位随时间推移的荧光信号的图形表示。静脉内(i.v.)递送在肿瘤部位显示强烈且持久的信号，而腹腔内(i.p.)注射后的信号在肿瘤部位处为检测不到的。
图14为显示施用IN3LSA的小鼠的整个动物成像的照片表示。将一只具有建立的肿瘤(体积～900mm3)的小鼠以20mg/kg的剂量单次静脉内注射Cy5.5标记的IN3LSA。该图像显示了注射前，以及注射后5天的动物，其中可以清楚地观察到与寡聚体化合物相关的信号。还显示了在注射后第8天切离的肿瘤。
图15为hSSB1 EMSA的图形表示，其显示在增加浓度的hSSB1蛋白与5nM FAM标记的硫代磷酸酯(PS)或磷酸二酯(PD)化学组成的LSA_In3E3序列或阴性对照序列(Neg_C)。图形表示至少一式三份实验的定量，表示为与蛋白结合的寡聚体化合物的分数。将纯化的蛋白与5nM标记的寡聚体化合物在37℃在由10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM KCl、0.01％IGEPAL、1mM EDTA和50ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的15％PAGE凝胶上电泳120min将样品分离。
图16为单个EMSA的图形表示，其显示增加浓度的hSSB2蛋白与5nM FAM标记的硫代磷酸酯化学组成的LSA_In3E3序列或阴性对照序列(Neg_C)。图形表示与蛋白结合的寡聚体的分数。将纯化的蛋白与5nM标记的寡聚体在37℃在由10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM KCl、0.01％IGEPAL、1mM EDTA和50ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的15％PAGE凝胶上电泳120min将样品分离。
图17为说明hSSB1与寡聚体化合物结合的分子模拟可以用于筛选具有更大hSSB1结合亲和力的序列的示意图和图形表示。A.黄色的ATGLSA寡聚体及其蓝色的未修饰的RNA序列。B.粉红色的NEGC寡聚体及其蓝色的未修饰的RNA序列。C.平均SSB-寡聚体化合物结合能由200ps至500ps之间的稳定构象产生。D.每一种寡聚体相对于其未修饰的RNA核苷酸序列的结合能在1ns模拟中。
结合能计算为，E_结合＝E(复合物)-[E(受体)+E(配体)]。
图18为显示ATGLSA(ATG)寡聚体化合物抑制肺癌异种移植物模型中肿瘤生长的图形表示。携带H460肺癌皮下肿瘤的雄性SCID小鼠用媒介物对照PBS(空心点，n＝7)或ATGLSA寡聚体(黑色三角形，n＝8)以80mg/kg经由静脉内尾静脉/眶后注射治疗，每周两次，持续四周。图形显示在治疗过程期间肿瘤体积的平均变化百分比(+/-sem)****：以双因素方差分析(Two-way ANOVA)的P值<0.0001。
图19为显示用对照PBS或ATGLSA(ATG)寡聚体化合物治疗的亲本肺H460异种移植物的生物发光成像的照片表示。在开始之前和治疗16天时测量小鼠的来自癌细胞萤光素酶活性的肿瘤生物发光信号。在用IVIS系统获取信号之前15min，SCID雄性接受200μL腹腔内注射的D-萤光素。显示了在治疗之前(上图)和治疗16天时(下图)PBS治疗组(A、B和C)和ATGLSA(ATG)治疗组(D、E和F)的三只代表性小鼠。热信号表示发光标度。
图20为显示对照PBS与ATGLSA(ATG)治疗的小鼠(亲本H460肿瘤模型)的重量监测的图形表示。在研究过程期间每一只动物每周称重两次。图形表示与PBS治疗的组群(空心点)和ATGLSA(ATG)治疗的组群(黑色三角形)的第一天治疗相比，平均的重量变化百分比(+/-sem)。
图21为显示在用ATGLSA寡聚体化合物处理之后的亲本和顺铂耐受肺H460癌细胞增殖的图形表示。用对照PBS(空心符号)与100nM ATGLSA(黑色符号)治疗H460亲本(H460P，点)细胞和顺铂耐受(H460 R，正方形)细胞。增殖比率通过在24h和48h报告的细胞汇合比初始细胞汇合来计算(+/-sem)。
图22为显示ATGLSA(ATG)寡聚体化合物抑制顺铂耐受肺癌异种移植物模型中肿瘤生长的图形表示。携带皮下H460顺铂耐受肿瘤的雄性SCID小鼠用媒介物对照PBS(空心点，n＝6)或用ATGLSA寡聚体(ATG，黑色三角形，n＝6)以80mg/kg经由静脉内尾静脉/眶后注射治疗，每周两次，持续四周。图形显示在治疗过程期间平均的肿瘤体积变化百分比(+/-sem)。**:以双因素方差分析的P值<0.01。
图23为显示用对照PBS或ATGLSA(ATG)寡聚体化合物治疗的顺铂耐受肺H460异种移植物的生物发光成像的照片表示。在治疗之前和治疗18天时测量小鼠的来自癌细胞萤光素酶活性的肿瘤生物发光信号。在用IVIS系统获取信号之前15min，SCID雄性小鼠接受200μL腹腔内注射的D-萤光素。显示了在治疗之前(上图)和治疗16天时(下图)PBS治疗组(A、B和C)和ATGLSA(ATG)治疗组(D、E和F)的三只代表性小鼠。热信号表示发光标度。
图24为显示对照PBS与ATGLSA(ATG)治疗的顺铂耐受H460肿瘤模型的小鼠的重量监测的图形表示。在研究过程期间每一只动物每周称重两次。图形表示与PBS治疗的组群(空心点)和ATGLSA(ATG)治疗的组群(黑色三角形)的第一天治疗相比，平均重量变化百分比(+/-sem)。
图25为显示ATGLSA(ATG)对顺铂敏感性H460肺异种移植物的治疗效果的长期评价的Kaplan-Meier图形。从用ATGLSA(80mg/kg)治疗开始监测雄性SCID小鼠，直至它们的肿瘤达到1000mm3的最大终体积(通过卡尺测量确定)。**以Rank-Log分析的P-值<0.01。
图26为显示ATGLSA(ATG)对顺铂耐受H460肺异种移植物的治疗效果的长期评价的Kaplan-Meier图形。从用ATGLSA(80mg/kg)治疗开始监测雄性SCID小鼠，直至它们的肿瘤达到1000mm3的最终最大体积(通过卡尺测量确定)。
图27为显示ATGLSA(ATG)寡聚体化合物降低肺肿瘤异种移植物模型中肿瘤生长的图形表示。携带皮下肿瘤的雄性SCID小鼠用ATGLSA寡聚体(ATG，绿色三角形，n＝5)、顺铂(黑色菱形)或ATGLSA+顺铂的组合(红色方块)治疗3周(虚线)。在第4周切换每一组的治疗：用对照媒介物PBS治疗组合动物，用顺铂治疗ATGLSA动物，并且用ATGLSA治疗顺铂动物。图形显示在治疗过程期间肿瘤体积的平均变化百分比(+/-sem)****：以双因素方差分析的P值<0.0001。
图28为显示对照PBS、ATGLSA(ATG)、顺铂和ATGLSA+顺铂的组合(Combo)治疗的H460肿瘤模型的小鼠的重量监测的图形表示。在研究过程期间每一只动物每周称重两次。图形表示与PBS治疗的组群(空心蓝色点)、ATGLSA(ATG)然后顺铂治疗的组群(绿色三角形)、顺铂然后ATGLSA治疗的组群(黑色菱形)和组合的ATGLSA+顺铂(Combo)然后PBS治疗的组群(红色正方形)的第一天治疗相比，平均的重量变化百分比(+/-sem)。
发明详述
1.定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可用于实践或测试本发明，但描述了优选的方法和材料。为了本发明的目的，在下文中定义了以下术语。
冠词“一(a)”和“一(an)”在本文中用于指一个或多于一个(即至少一个)的该冠词的语法对象。以举例的方式，“要素(an element)”意指一个要素或多于一个要素。
如本文使用的，“和/或(and/or)”指和涵盖一个或更多个相关的所列项目的任何和所有可能的组合，以及当以可选地解释(或)时缺少组合。
此外，当提及可测量值诸如量、剂量、时间、温度、活性、水平、数字、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量、位置、长度等时，如本文使用的术语“约”意指涵盖指定的量、剂量、时间、温度、活性、水平、数字、频率、百分比、维度、尺寸、量、重量、位置、长度等的±15％、±10％、±5％、±1％、±0.5％，或甚至±0.1％。
在提供值的范围的情况下，应当理解，除非上下文另有清楚地规定，该范围的上限和下限之间的每一个中间值，至下限的单位的十分之一，和在该陈述的范围内的任何其他陈述的或中间的值被涵盖在本发明内。这些较小的范围的上限和下限可以独立地被包括在较小的范围内，也被涵盖在本发明内，受制于陈述的范围中的任何特异性排除的限制。在规定的范围包含限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的两个的任一个的范围也被包括在本发明内。
当剂通过除了被动扩散跨越细胞膜以外的机制进入细胞时，剂“被哺乳动物细胞主动摄取”。例如，剂可以通过“主动转运”或通过“促进转运(facilitated transport)”转运，“主动转运”指剂通过例如ATP依赖性转运机制跨越哺乳动物细胞膜的转运，“促进转运”指反义剂通过需要将该剂与转运蛋白结合的转运机制(其然后促进结合的剂跨越膜的通过)的跨越细胞膜的转运。对于主动转运或促进转运，本发明的寡聚体可以是裸露的或可以被配制为复合形式，诸如具有与阳离子脂质或脂质体复合的阴离子骨架的剂，其可以通过胞吞机制进入细胞。寡聚体也可以例如在其5'或3'末端与富含精氨酸的肽(例如HIV TAT蛋白的一部分或多聚精氨酸)缀合，以促进到靶宿主细胞中的转运，如所描述的(Moulton等,Bioconjug Chem,2004,15(2):290-299；Nelson等，Bioconjug Chem,2005,16(4):959-966)。化合物还可以具有一个或更多个阳离子连键以增强反义活性和/或细胞摄取。
术语“同时施用(administration concurrently)”或“同时施用(administeringconcurrently)”或“共施用(co-administering)”等是指含有两种或更多种活性物质的单一组合物的施用，或各活性物质同期地(contemporaneously)或同时地(simultaneously)或在足够短的时间段内顺序地作为单独组合物和/或通过各自的途径递送而施用，有效结果等同于当所有此类活性物质作为单一组合物施用时获得的结果。“同时地(simultaneously)”意指，活性剂大体上同时被施用，并且期望地在同一制剂中一起被施用。“同期地(contemporaneously)”意指，活性剂在时间上相近地被施用，例如，一种剂在另一种之前或之后约1分钟内至约1天内被施用。任何同时期的时间均是有用的。然而，通常情况是，当不被同时地施用时，剂将在约1分钟内至约8小时内，并且合适地在少于约1至约4小时内被施用。当被同期地施用时，剂合适地被施用在受试者的相同部位。术语“相同部位(same site)”包括精确的位置，但可以在约0.5厘米至约15厘米内，优选地在约0.5厘米至约5厘米内。如本文使用的术语“分别地(separately)”意指，剂以间隔被施用，例如以约一天至数周或数月的间隔被施用。活性剂可以以任一顺序被施用。如本文使用的术语“顺序地(sequentially)”意指，剂按顺序被例如以数分钟、数小时、数天或数周的一个或更多个间隔施用。如果适当，活性剂可以有规律的重复周期被施用。
如本文使用的，术语“亲和力”指两个分子的非随机相互作用。亲和力或相互作用的强度可以被定量地表示为解离常数(KD)。可以使用标准技术确定结合亲和力。在特定的实施方案中，本发明的寡聚体对靶分子(例如，THOC4或SSB1)具有比对照寡聚体高的亲和力，并且因此相对于对照寡聚体优先结合靶分子。例如，本发明的寡聚体化合物在37℃在包含10nM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中以约50nM或更少的KD与THOC4(例如，hTHOC4)结合和/或以约3nM或更少的KD与SSB1(例如hSSB1)结合。
如本文使用的术语“烷基”指包含多达24个碳原子的饱和直链或支链烃基。烷基基团的实例包括，但不限于，甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、正己基、辛基、癸基、十二烷基等。烷基基团通常包括从1个至约6个碳原子，更通常从1个至约3个碳原子，其中从1个至约2个碳原子是更优选的。如本文使用的烷基基团可以任选地包括一个或更多个其他取代基基团。
术语“辅助剂(ancillary agent)”包括诱导期望的药理学和/或生理学作用的化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些化合物的药学上可接受的且药理上有活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用以上术语时，然后应当理解，这包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学上有活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物，类似物等。术语“辅助剂”不被狭义地解释，而是延伸至小分子、蛋白性分子诸如肽、多肽和蛋白以及包含它们的组合物和遗传分子诸如RNA、DNA和模拟物及其化学类似物以及细胞剂。术语“辅助剂”包括能够产生和分泌多肽的细胞以及包含编码该多肽的核苷酸序列的多核苷酸。例如，细胞可以是构建体已经被引入到其中的肿瘤细胞，所述构建体表达免疫刺激分子，诸如B7.1或4-1BBL。因此，术语“辅助剂”延伸至核酸构建体，包括载体诸如病毒载体或非病毒载体、用于在一系列细胞中表达和分泌的表达载体和质粒。
术语“反义”指这样的核苷酸序列：其核苷酸残基序列相对于核酸(例如DNA或RNA)双链体的有义链中的脱氧核苷酸残基的序列处于反向5'至3’取向。DNA双链体的“有义链”指DNA双链体中以其天然状态被细胞转录为“有义mRNA”的链。因此，“反义”序列通常与DNA双链体中的编码链实质上互补，并且与DNA双链体中的非编码链具有同源性。
术语“反义寡聚体”和“反义化合物”在本文中可互换使用，指具有核碱基的靶向序列和亚基至亚基骨架的化合物，所述亚基至亚基骨架允许反义寡聚体与靶核酸序列通过碱基配对(包括沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对)杂交，以在靶核酸序列内形成RNA:寡聚体或DNA:寡聚体异源双链体。反义寡聚体通常包括由骨架支撑的嘌呤和嘧啶杂环碱基序列，其与靶核酸序列中的对应的连续碱基有效地氢键键合。骨架通常包括亚基骨架部分，所述亚基骨架部分在允许此类氢键键合的位置处支撑嘌呤和嘧啶杂环碱基。这些骨架部分为5个至7个原子长度的环状部分，通过包含磷的连键将1个至3个原子长度连接在一起。反义寡聚体通常干扰基因表达产物(包括核酸表达产物，诸如mRNA和miRNA和多肽)的合成。通常，反义寡聚体的靶向序列与对应于靶基因(例如，多核苷酸，诸如DNA、mRNA(包括前mRNA))分子的“有义”链的靶序列结合。反义寡聚体可以与靶基因或核酸表达产物的任何区域，包括例如内含子、外显子、5'或3'非翻译区结合。例如，用作空间阻断物的反义寡聚体在核酸靶分子的剪接点、5'非翻译区或起始区内优先结合。通过激活RNA酶H起作用的反义寡聚体优选地在靶核酸的内含子、外显子、5'非翻译区或3'非翻译区内结合。
如本文使用的术语“帽结构”或“末端帽部分”指可以与寡聚化合物的一个或两个末端附接的化学修饰。
如本文使用的，提及寡聚化合物(例如，连接的核苷、寡核苷酸或核酸)的“互补”和“互补性”指此类寡聚化合物或其区域通过核碱基互补性与参考核酸序列杂交的能力。如本文使用的，当提及核碱基时，“核碱基互补性”或“互补性”意指能够与另一个核碱基通常通过沃森-克里克碱基配对进行碱基配对的核碱基。例如，如果在寡聚体化合物的某个位置处的核碱基能够与靶核酸的某个位置处的核碱基氢键键合，则寡聚体化合物与靶核酸之间的氢键键合的位置被认为是在该核碱基对处互补。因此，修饰的核碱基可以维持与对应物(counterpart)核碱基配对的能力，并且因此仍然能够核碱基配对或具有核碱基互补性。相比之下，“非互补”或“错配”核碱基指一对彼此不形成氢键，或者另外“不能碱基配对”的核碱基。术语“互补”或“互补性”也指核酸在允许的盐和温度条件下通过碱基配对的天然结合。两个单链分子(在本文中也被称为“核碱基聚合物”)之间的互补性可以是“部分的”，其中仅一些核碱基碱基配对，或者当单链分子之间沿着分子的全长或沿着单链分子的一部分或区域存在完全互补性时它可以是“完整的”。核酸链之间的互补性的程度对核酸链之间杂交的效率和强度具有显著影响。术语“互补”在其范围内包括“完全互补”、“实质上互补”或“部分地互补”的核酸序列。如本文使用的，术语“完全互补”指示特定核碱基寡聚体或聚合物中100％的核碱基能够与另一种核碱基寡聚体或聚合物进行碱基配对。如本文使用的，术语“实质上互补”或其语法等同物指示特定核碱基寡聚体或聚合物中大于95％、96％、97％、98％或99％的核碱基能够与另一种核碱基寡聚体或聚合物进行碱基配对。该术语还可以意指两个核酸序列可以在如例如本文中定义的高严格条件下杂交。如本文使用的，术语“部分地互补”或其语法等同物指示特定核碱基寡聚体或聚合物中不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的核碱基能够与另一种核碱基寡聚体或聚合物进行碱基配对。该术语还可以意指两个核酸序列不能在如例如本文中定义的高严格条件下杂交，但能够在如例如本文中定义的低或中等严格条件下杂交或不杂交。
遍及本说明书，除非上下文另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为暗示包含陈述的步骤或要素或步骤或要素的组，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组。因此，术语“包含”等的使用指示列出的要素是必需的或要求的，但其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在。“由以下组成(consisting of)”指包括并且限于“由以下组成”一词之后的任何事物。因此，短语“由以下组成”指列出的要素是必需的或要求的，并且不可以存在其他要素。“基本上由以下组成(consisting essentially of)”意味着包括在该短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于所列要素在本公开中指定的活动或作用的其他要素。因此，措辞“基本上由以下组成”指示列出的要素是必需的或要求的，但其他要素是可选的并且可以存在或可以不存在，这取决于它们是否影响列出的要素的活性或作用。
如本文使用的，在核酸序列的上下文中，术语“连续的”指该序列为单个序列，不受任何间插的一个或更多个序列(intervening sequence or sequences)干扰。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”意指与参考核酸序列显示实质上序列同一性的核酸序列(例如，与参考核酸序列的全部或一部分至少约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至多达100％的序列同一性)。
在治疗或预防状况的上下文中，“有效量”意指向需要此类治疗或预防的个体以单剂量或作为系列的一部分施用一定量的剂或组合物，该量有效预防引起该状况的症状、控制(holding in check)该状况的此类症状和/或治疗该状况的现有症状。有效量将根据待治疗个体的健康和身体状况、待治疗个体的分类群体、组合物的配制、医学情况的评价和其他相关因素而变化。据预计，该量将落入可以通过常规试验确定的相对较宽的范围内。
术语“表达”指基因产物的生物合成。例如，在编码序列的情况下，表达包括将编码序列转录为mRNA以及将mRNA翻译为一个或更多个多肽。相反地，非编码序列的表达包括仅将非编码序列转录为转录物。
如本文使用的，术语“gapmer”指包含中心区域(“间隙(gap)”)和中心区域两侧上的区域(“侧翼(wings)”)的嵌合寡聚化合物，其中间隙包含与每一个侧翼不同的至少一个修饰。此类修饰包括核碱基、单体连键和糖修饰以及不存在修饰(未修饰)。因此，在某些实施方案中，每一个侧翼中的核苷连键不同于间隙中的核苷连键。在某些实施方案中，间隙中的核苷酸未被修饰，并且侧翼中的核苷酸被修饰。在某些实施方案中，每一个侧翼中的修饰是相同的。在某些实施方案中，一个侧翼中的修饰与另一个侧翼中的修饰不同。
如本文使用的，术语“基因”指能够用于产生mRNA、反义RNA、siRNA、shRNA、miRNA等的核酸分子。基因可以能够或可以不能够用于产生功能性蛋白。基因可以包括编码区和非编码区(例如，内含子、调节元件，包括启动子、增强子、终止序列和5'和3'非翻译区)两者。基因可以是“分离的”，其意指实质上或基本上不含通常发现与其天然状态的核酸分子缔合的组分的核酸分子。此类组分包括其他细胞材料、来自重组生产的培养基，和/或用于化学合成核酸分子中的多种化学品。提及“基因”在其范围内还包括提及具有连续序列的基因，因此定义如本文定义的连续核酸实体；或非连续序列，因此定义如本文定义的非连续核酸实体。在某些实施方案中，术语“基因”在其范围内包含编码特定多肽的开放阅读框、内含子和参与表达调节的相邻5'和3'非编码核苷酸序列。在这方面，基因还可以包含与给定基因自然缔合的控制序列诸如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号；或异源控制序列。基因序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。基因可以被引入到适当的载体中用于染色体外维持或用于引入到宿主中。
如本文使用的，“基因组”指生物体的遗传信息的整体，由基因和DNA的非编码序列、染色体或非染色体遗传元件，诸如线性多核苷酸表示，例如包括待组装和/或重组的基因。因此，术语“基因组”意图包括生物体的完整DNA互补序列，包括核DNA组分、染色体或染色体外DNA，以及细胞质结构域(例如，线粒体DNA)。
如本文使用的，术语“杂环碱基部分”指用于形成本发明所涵盖的核苷的核碱基和修饰的或取代的核碱基。术语“杂环碱基部分”包括未修饰的核碱基，诸如天然嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)、和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。该术语还意图包括所有形式的修饰或取代的核碱基，包括但不限于，合成和天然核碱基，诸如黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基吡啶和2-吡啶酮、5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟基亚甲基胞嘧啶、2-氨基和2-氟腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫代胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、3-脱氮杂鸟嘌呤和腺嘌呤、4-硫尿嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、7-甲基腺嘌呤和鸟嘌呤、7-脱氮杂腺嘌呤和鸟嘌呤、8-卤素、8-氨基、8-氮杂、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸膨胀碱基和氟化物碱基，如本文所定义的。进一步修饰的核碱基包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噁嗪-2(3H)-酮)和吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并[5,4-b][1,4]苯并噻嗪-2(3H)-酮)。
如本文使用的，术语“同源物(homolog)”、“同源物(homolog)”或“同源的”等指两个或更多个核酸序列之间在序列同一性百分比方面的相似性水平。通常，同源物、同源序列或具有同源性的序列指彼此表现出大于95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的核酸序列。可选地或另外，同源物、同源序列或具有同源性的序列指在如例如本文中定义的高严格条件下彼此杂交的核酸序列。相比之下，术语“非同源的”，“非同源序列”或“缺乏同源性的序列”等指彼此表现出不多于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的序列同一性的核酸序列。可选地，或另外，“非同源的”、“非同源序列”或“缺乏同源性的序列”等指在如例如本文中定义的高严格条件下不彼此杂交，但在中等或低严格条件下能够彼此杂交或不杂交的核酸序列。
“杂交”在本文中用于表示互补核苷酸序列产生DNA-DNA杂交体或DNA-RNA杂交体的配对。互补核碱基序列为通过碱基配对规则相关的那些序列。在DNA中，A与T配对且C与G配对。在RNA中，U与A配对且C与G配对。在这方面，如本文使用的术语“匹配”和“错配”指配对的核苷酸在互补核酸链中的杂交潜力。匹配的核苷酸有效杂交，诸如以上提及的经典A-T和G-C碱基对。错配是不有效杂交的核苷酸的其他组合。在本发明中，优选的配对机制包括氢键键合，其可以是寡聚化合物链的互补核苷或核苷酸碱基(核碱基)之间的沃森-克里克、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶为互补的核碱基，其通过形成氢键配对。杂交可以在本领域技术人员已知的不同情况下发生。
如本文使用的，术语“体外”指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中，在培养皿中等，而不是在生物体(例如，动物、植物或微生物)内发生的事件。
如本文使用的，术语“体内”指在生物体(例如，动物、植物或微生物或其细胞或组织)内发生的事件。
如本文使用的，“核苷间连键”指相邻核苷之间的共价连键。核苷间连键构成核酸分子的骨架，所述核酸分子包括本发明的寡聚体。
在包括哺乳动物细胞、哺乳动物部分、哺乳动物器官或整个哺乳动物的宿主细胞的上下文中“引入”意指使核酸分子(例如，如本文描述的寡核苷酸)与哺乳动物细胞、哺乳动物部分、哺乳动物器官或者整个哺乳动物以使得核酸分子进入哺乳动物细胞、哺乳动物部分、哺乳动物器官或整个哺乳动物的内部的方式接触。
如本文使用的，术语“修饰的糖”指由天然糖的取代或变化，并且涵盖用于本发明的核苷和寡聚化合物中的天然呋喃核糖和脱氧呋喃核糖的修饰。修饰的糖包含核苷，该核苷中通常杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分被保持以与适当的靶核酸杂交。此类“修饰的糖”通常期望优于(over)天然存在的形式，因为它们可以赋予寡聚化合物有利的特性，诸如，例如，增强的细胞摄取、增强的核酸靶亲和力和增加的核酸酶降解稳定性。术语“修饰的糖”意图包括本领域已知的所有形式的修饰，包括但不限于对环原子的修饰和/或取代基基团的添加。
如本文使用的，术语“核碱基”指核苷的碱基部分。核碱基通常为杂环部分，并且可以包含能够与另一个核酸的碱基氢键键合的任何原子或原子团。术语“核碱基”涵盖天然核碱基和修饰的核碱基。核碱基(或碱基)修饰或取代在结构上可与天然存在的或合成的未修饰的核碱基区分开，但在功能上可互换。天然和修饰的核碱基两者均能够参与氢键键合。此类核碱基修饰可以赋予反义化合物核酸酶稳定性、结合亲和力或一些其他有益的生物学特性。修饰的核碱基包括合成和天然核碱基，诸如，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)。某些核碱基取代，包括5-甲基胞嘧啶取代，对于增加反义化合物对靶核酸的结合亲和力特别有用。例如，已经显示5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体稳定性增加了0.6-1.2.℃(degree.C.)(Sanghvi,Y.S.,Crooke,S.T.和Lebleu,B.,编著,Antisense Research andApplications,CRC Press,Boca Raton,1993,第276-278页)。另外的未修饰的核碱基包括5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C≡C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫尿嘧啶、8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤和3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。杂环碱基部分还可包括其中嘌呤或嘧啶碱基被其他杂环取代的那些，例如7-脱氮杂腺嘌呤、7-脱氮杂鸟苷、2-氨基吡啶和2-吡啶酮。对增加反义化合物的结合亲和力特别有用的核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。
如本文使用的，术语“核苷”指碱-糖组合。核苷的碱基部分通常为杂环碱基部分。此类杂环核碱基的两种最常见的类别为嘌呤和嘧啶。“核苷酸”为还包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含戊呋喃糖基糖的那些核苷，磷酸基团可以与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在寡核苷酸结构内，磷酸基团通常被称为形成寡核苷酸的核苷间连键，或与糖环(寡核苷酸的骨架)结合。在形成寡核苷酸时，磷酸基团将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合物化合物。RNA和DNA的正常核苷间连键为3'至5'磷酸二酯连键。在本发明的上下文中，术语“寡核苷(oligonucleoside)”指通过不具有磷原子的核苷间连键被连接的核苷序列。
术语“OB-折叠蛋白”指包含具有OB-折叠拓扑结构的结构域或由具有OB-折叠拓扑结构的结构域组成(如例如(Murzin,1993,Embo J 12:861-86)和(Arcus,2002,Curr OpinStruct Biol 12:794-801)描述的)并且促进与ssDNA结合的任何多肽。该拓扑结构对应于包含五链(在一个末端由两亲性α-螺旋加帽的β桶形结构)的结构。参考CATH蛋白结构分类(Pearl等,2003,Nucleic Acids Res 31:452-455)，OB-折叠拓扑结构对应于2.40.50折叠家族(fold family)(CATH database version 3.0.0:Released May 2006)。此类OB-折叠蛋白可以是天然蛋白(即，与天然蛋白具有相同序列的分离、纯化或重组蛋白)，或工程化蛋白(如，例如，天然蛋白的片段，或融合蛋白，所述融合蛋白包含来自第一蛋白的OB-折叠结构域和来自另一种蛋白的另一部分)。可以根据本发明使用的OB-折叠蛋白的非限制性实例涵盖单链DNA结合蛋白(SSB)，其包含简单的SSB，其包含每个多肽一个的OB-折叠，以及包含多于一个(multiple)OB-折叠的更高阶SSB(其可以在不同的多肽上)。代表性简单的SSB包括单链DNA结合蛋白1和2(例如，hSSB1和2)和线粒体SSB(mtSSB)，而高阶SSB由异源三聚体复制蛋白A(RPA)代表。另外，其他蛋白也在其多肽内采用ssDNA-结合-OB-折叠结构，并且可以被认为是SSB家族的成员。例如，丝氨酸/苏氨酸激酶受体相关蛋白(Strap)在结构上包含一个DNA结合OB折叠，与简单SSB一样，而TPP1-保护端粒1(POT1)乳腺癌2早发型(earlyonset)(BRCA2)和CST复合物形成让人联想到高阶SSB的复合物。许多OB-折叠蛋白是本领域已知的，其说明性实例被公开于Ashton等(2013,BMC Molecular Biology 14:9)和Flynn等(2010,Crit Rev Biochem Mol Biol.45(4):266-275)中。
如本文使用的术语“寡核苷酸”指包含天然存在的核碱基、糖和磷酸二酯核苷间连键的核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)的寡聚体或聚合物。
术语“寡聚体”、“寡聚体化合物(oligomer compound)”和“寡聚化合物(oligomeric compound)”在本文中可互换使用，指多于一个(a plurality of)天然存在的和/或非天然存在的核苷以特定顺序连接在一起形成聚合物结构。术语“寡聚体”和“寡聚化合物”中包括寡核苷酸、寡核苷酸类似物、寡核苷酸模拟物、寡聚核苷和这些的嵌合组合，并且因此意图比术语“寡核苷酸”更广泛，包括具有所有修饰方式的所有寡聚体，包括但不限于本领域已知的那些。寡聚化合物通常在结构上可与天然存在的或合成的野生型寡核苷酸区分开，但在功能上可互换。因此，寡聚化合物包括例如通过与靶杂交有效地起作用以模拟所期望RNA或DNA链的结构和/或功能的所有此类结构。此类非天然存在的寡核苷酸通常期望优于天然存在的形式，因为它们通常具有增强的特性，诸如例如增强的细胞摄取、增强的核酸靶亲和力和在核酸酶存在下增加的稳定性。
本文可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”指期望治疗或预防的任何受试者，特别地脊椎动物受试者，且甚至更特别地哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括，但不限于，脊索动物(Chordata)亚门的任何成员，包括灵长类动物(例如，人类、猴和猿，并且包括猴的物种诸如来自猕猴属(Macaca)(例如，食蟹猴猴(cynomologus monkeys)诸如食蟹猕猴(Macaca fascicularis)，和/或恒河猴(rhesusmonkeys)(普通猕猴(Macaca mulatta)))和狒狒(baboon)(豚尾狒狒(Papio ursinus))，以及狨猴(marmosets)(来自狨属(Callithrix)的物种)，松鼠猴(squirrel monkeys)(来自松鼠猴属(genus Saimiri)的物种)和绢毛猴(tamarins)(来自柽柳猴属(Saguinus)的物种)，以及猿的物种诸如黑猩猩(chimpanzees)(黑猩猩属(Pan troglodytes))),啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠)，兔类动物(例如，家兔、野兔)，牛科动物(例如，家牛)，绵羊类(ovines)(例如，绵羊)，如山羊类(caprines)(例如，山羊)，猪科动物(porcines)(例如，猪)，马科动物(equines)(例如，马)，犬科动物(例如，狗)，猫科动物(例如，猫)，鸟类(例如，鸡、火鸡、鸭、鹅、伴侣鸟类，诸如金丝雀、虎皮鹦鹉等)，海洋哺乳动物(例如，海豚、鲸)，爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)和鱼。在具体的实施方案中，受试者为灵长类动物诸如人类。然而，应当理解，以上提及的术语并不暗示存在症状。
本文使用的百分比指寡聚体长度内的具有某些表征(characteristic)或特征的核碱基或核苷间连键的大致比例。具有这些特征或表征的核碱基的数目可以基于寡聚体中的核碱基的数目从这些百分比容易地计算。代表性计算在下文的表1中提供，其中列出的值被四舍五入至最接近的整数。
表1
“药学上可接受的载体”意指一种药物媒介物，所述药物媒介物包含不是生物学上或以其他方式不合意的材料，即该材料可与选择的活性剂一起施用至受试者而不引起任何或实质的不良反应。通常，药学上可接受的载体在受试者中实质上是无毒的且非炎性的。载体可以包括赋形剂和其他添加剂，诸如稀释剂、去垢剂、着色剂、湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂、转染剂等。在一些实施方案中，药学上可接受的载体为能够悬浮和/或溶解活性剂的媒介物。载体可以包括，例如：抗粘附剂、抗氧化剂、粘合剂、包膜、压缩助剂(compression aids)、崩解剂、染料(颜色)、软化剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包膜、调味剂、芳香剂、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷油墨、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂和水合水。示例性载体包括，但不限于：丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸钙(二元酸)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E、维生素C和木糖醇。
术语“多核苷酸”、“遗传物质”、“遗传形式”、“核酸”和“核苷酸序列”包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物、单链、双链、有义链和反义链两者，并且如本领域技术人员容易理解的，可以是化学或生物化学修饰的，或者可以包含非天然或衍生的核碱基。
在寡聚体被肿瘤细胞摄取的上下文中，术语“优先”意指在相同条件下，寡聚体以比被非肿瘤细胞或正常细胞更高的水平被肿瘤细胞摄取，这可以是在体内或体外。可选地，在寡聚体与靶分子结合的上下文中，术语“优先”意指寡聚体以比其与不相关或非靶分子结合更大的亲和力与靶分子结合，或者靶分子可以在体内或体外的相同条件下以比对照寡聚体更大亲和力与寡聚体结合。寡聚体被肿瘤细胞的摄取可以比被非肿瘤细胞或正常细胞的摄取大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1000倍。同样，寡聚体对靶分子的亲和力可以比寡聚体对不相关分子或非靶分子的亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1000倍。可选地，靶分子对寡聚体的亲和力可以比靶分子对对照寡聚体的亲和力大至少1倍、大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍、或大至少1000倍。用于测量寡聚体摄取或亲和力的一般技术是本领域技术人员已知的。如果在不同条件，例如，盐浓度、pH等测量，测量的摄取或亲和力和其他寡聚体结合参数可以变化。因此，测量摄取或亲和力和其他寡聚体结合参数，例如，KD、IC50，优选用寡聚体和靶细胞或分子的标准化溶液和标准化缓冲液进行。
如本文使用的，术语“预防(prevent)”、“预防(prevented)”或“预防(preventing)”指预防性治疗，其增加受试者对发展疾病或状况的耐受性，或者换言之，减少受试者将发展疾病或状况的可能性以及在疾病或状况已经开始之后的治疗以降低或完全消除它或预防它变得更糟。这些术语在其范围内还包括在可能易患疾病或状况但尚未被诊断为患有疾病或状况的受试者中预防疾病或状况发生。
当提及第一样品中的物质和/或现象相对于第二样品中的水平使用时，术语“降低”、“抑制”、“减少”和语法等同物意指第一个样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的物质和/或现象的量低任何量，该任何量为使用任何本领域接受的统计学分析方法为统计学显著的。在一个实施方案中，可以主观地确定降低，例如当患者提及他们对疾病症状的主观感知，诸如疼痛、疲劳等时。在另一个实施方案中，可以客观地确定降低，例如当来自患者的样品中的肿瘤细胞的数目低于来自患者的早期样品中的肿瘤细胞的数目时。在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的相同物质和/或现象的量低至少10％。在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的相同物质和/或现象的量低至少25％。又在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的相同物质和/或现象的量低至少50％。在另外的实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的相同物质和/或现象的量低至少75％。又在另一个实施方案中，第一样品中的物质和/或现象的量比第二样品中的相同物质和/或现象的量低至少90％。可选地，差异可以被表示为“n倍”差异。
如本文使用的术语“序列同一性”指在比较窗口内在一个核碱基接着一个核碱基的基础上序列相同或具有相同的核碱基配对能力的程度。因此，“序列同一性百分比”或“同一性百分比”如下计算：通过在比较窗内比较两个最佳比对序列，确定两个序列中出现相同的核碱基或具有等同碱基配对能力的核碱基的位置的数目，以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目(即，窗尺寸)，并将结果乘以100以得到序列同一性的百分比。为了本发明的目的，“序列同一性”将被理解为意指通过适当方法计算的“匹配百分比”。例如，序列同一性分析可以使用如软件附带的参考手册中使用的标准缺省值，使用DNASIS计算机程序(windows版本2.5；可从Hitachi Software engineering Co.,Ltd.,South San Francisco,California,USA获得)来进行。因此，本发明的寡聚体化合物或其部分可以与参考序列具有定义的同一性百分比。如本文使用的，如果寡聚体核碱基序列具有相同的核碱基配对能力，其与参考核碱基序列相同。例如，在参考序列中包含尿嘧啶代替胸苷的寡聚体将被认为是相同的，因为它们均与腺嘌呤配对。相似地，在参考序列中包含修饰的鸟嘌呤核碱基诸如6-甲基鸟嘌呤代替鸟嘌呤的寡聚体将被认为是相同的，因为它们均与胞嘧啶配对。同一性可以在寡聚化合物的整个长度内，或在寡聚体化合物的一部分中(例如，可以将27-mer的核碱基1-20与20-mer进行比较，以确定寡聚化合物与参考序列的同一性百分比)。任何不相同的碱基可以彼此相邻，分散在整个寡聚体中，或两者。例如，具有与20-mer的核碱基2-17相同序列的16-mer与该20-mer 80％相同。可选地，包含与20-mer不相同的四个核碱基的20-mer也与该20-mer 80％相同。具有与18-mer的核碱基1-14相同序列的14-mer与该18-mer 78％相同。此类计算完全在本领域技术人员的能力范围内。
用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系的术语包括“参考序列(reference sequence)”、“比较窗口(comparison window)”、“序列同一性(sequenceidentity)”、“序列同一性百分比(percentage of sequence identity)”和“实质上同一性(substantial identity)”。“参考序列”为至少14个且多达29个(例如，14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个)核碱基。因为两个核酸可以各自包含(1)在两个核酸之间相似的序列，和(2)在两个核酸之间不同的序列，两个(或更多个)核酸之间的序列比较通常通过比较两个核酸在“比较窗口”上的序列，以鉴定和比较序列相似性的局部区域来进行。“比较窗口”指至少14个且多达29个(例如，14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个)连续核碱基位置的概念区段，其中在两个序列被最佳比对之后，将序列与具有相同数目的连续核碱基位置的参考序列进行比较。为了两个序列的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口可以包含约20％或更少的添加或缺失(即，空位)。用于对齐比较窗口的序列的最佳比对可以通过算法的计算机化实现(Wisconsin Genetics SoftwarePackageRelease7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group,575Science Drive Madison,WI,USA)或通过检查来进行并且选择多种方法的任一种产生的最佳比对(即，导致比较窗口上的最高同源性百分比)。还可以参考如例如由Altschul等，1997,Nucl.Acids Res.25:3389公开的BLAST程序家族。序列分析的详细讨论可以见于Ausubel等，“Current Protocols in Molecular Biology”,John Wiley&Sons Inc,1994-1998,Chapter 15的Unit19.3中。
如本文使用的“严格性”指在杂交期间温度和离子强度条件，以及某些有机溶剂的存在或不存在。严格性越高，将观察到序列之间的互补性程度越高。如本文使用的“严格条件”指在其下仅具有高比例互补核碱基的多核苷酸，优选地具有精确互补性的多核苷酸将杂交的温度和离子条件。所要求的严格性为核苷酸序列依赖性的，并且取决于杂交期间存在的各种组分，并且当使用核苷酸类似物时，严格性有很大变化。通常，选择比对于特定序列在定义的离子强度和pH的热解链温度(thermal melting point)低约10℃至20℃的严格条件。Tm为50％的靶序列与互补探针杂交时的温度(在定义的离子强度和pH下)。应当理解，多核苷酸将在至少低严格条件下、优选地在至少中度严格条件下且更优选地在高严格条件下与靶序列杂交。本文提及低严格条件包括和涵盖从至少约1％v/v至至少约15％v/v甲酰胺和从至少约1M至至少约2M盐用于在42℃杂交，以及至少约1M至至少约2M盐用于在42℃洗涤。低严格条件还可包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH7.2)、5％SDS用于在室温洗涤。中度严格条件包括和涵盖从至少约16％v/v至至少约30％v/v甲酰胺和从至少约0.5M至至少约0.9M盐用于在42℃杂交，以及至少约0.5M至至少约0.9M盐用于在42℃洗涤。中度严格条件还可以包括1％牛血清白蛋白(BSA)、1mM EDTA、0.5MNaHPO4(pH 7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mMEDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、5％SDS用于在42℃洗涤。高严格条件包括和涵盖从至少约31％v/v至至少约50％v/v甲酰胺和从至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃杂交，以及至少约0.01M至至少约0.15M盐用于在42℃洗涤。高严格条件还可以包括1％BSA、1mM EDTA、0.5M NaHPO4(pH7.2)、7％SDS用于在65℃杂交，以及(i)0.2×SSC、0.1％SDS；或(ii)0.5％BSA、1mM EDTA、40mM NaHPO4(pH 7.2)、1％SDS用于在超过65℃的温度洗涤。高严格条件的一个实施方案包括在6×SSC中在约45℃杂交，随后是在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃一次或更多次洗涤。非常高严格条件的一个实施方案包括在0.5M磷酸钠、7％SDS在65℃杂交，随后是在0.2×SSC、0.1％SDS在65℃一次或更多次洗涤。其他严格条件为本领域熟知的。熟练的处理人员(skilled addressee)将认识到，多种因素可以被操作，以优化杂交的特异性。最终洗涤的严格度的优化可以用于确保高杂交程度。对于详细的实例，参见CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(同上)，在2.10.1至2.10.16页以及MOLECULARCLONING.ALABORATORY MANUAL(Sambrook等，编著)(Cold Spring Harbor Press1989)在1.101至1.104节。
如本文使用的术语“取代基”和“取代基基团”意指包括通常被添加至其他基团或母体化合物中以增强期望特性或产生期望作用的基团。取代基基团可以是被保护的或不受保护的，并且可以被添加至母体化合物中的一个可用位点或许多可用位点。取代基基团也可以进一步被其他取代基基团取代，并且可以直接或经由连接基团诸如烷基或烃基基团附接至母体化合物。此类基团包括但不限于，卤素、羟基、烷基、烯基、炔基、酰基(-C(O)Ra)、羧基(-C(O)O-Ra)、脂肪族的、脂环族的、烷氧基、取代的氧代(-O-Ra)、芳基、芳烷基、杂环基、杂芳基、杂芳基烷基、氨基(-NRbRc)、亚氨基(＝NRb)、酰氨基(-C(O)NRbRc或-N(Rb)C(O)Ra)、叠氮基(-N3)、硝基(-NO2)、氰基(-CN)、氨基甲酰基(-OC(O)NRbRc或-N(Rb)C(O)ORa)、脲基(-N(Rb)C(O)NRbRc)、硫脲基(-N(Rb)C(S)NRbRc)、胍基(-N(Rb)C(＝NRb)NRbRc)、脒基(-C(＝NRb)NRbRc或-N(Rb)C(NRb)Ra)、巯基(-SRb)、亚磺酰基(-S(O)Rb)、磺酰基(-S(O)2Rb)和磺酰胺基(-S(O)2NRbRc或-N(b)S(O)2Rb)，其中每个Ra、Rb和Rc进一步被另一取代基基团，其中优选列表包括但不限于烷基、烯基、炔基、脂肪族的、烷氧基、酰基、芳基、芳烷基、杂芳基、脂环族的、杂环基和杂芳基烷基。
术语“靶核酸序列”和“靶序列”在本文中可互换使用，指本发明的寡聚体化合物的靶向序列所针对的靶RNA或靶DNA分子的一部分，即寡聚体化合物将通过互补序列的沃森-克里克碱基配对与之杂交的序列。
如本文使用的术语“靶向序列”指本发明的反义寡聚体化合物中与靶RNA或靶DNA分子中的靶序列实质上互补的序列。寡聚体化合物的整个序列或仅一部分可以与靶序列实质上互补。例如，在具有18个核碱基的寡聚体中，仅12-14个可以是靶向序列。通常，靶向序列由寡聚体化合物中至少10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或更多个连续碱基形成，但可以可选地由当放置在一起(例如从寡聚体的相对末端)时构成跨越靶序列的序列的非连续序列形成。
如本文使用的，术语“转录物组”指在一个或一群细胞中产生的所有信使RNA(mRNA)分子或“转录物”的集合。该术语可以应用于给定生物体中的总转录物的集合，或特定细胞类型中存在的转录物的特定子集。与对于给定细胞系(不包括突变)大致固定的基因组不同，转录物组可以随外部环境条件而变化。因为它包括细胞中的所有mRNA转录物(包括前体mRNA)，转录物组反映了在任何给定时间活跃表达的基因，除了mRNA降解现象诸如转录弱化以外。
如本文使用的，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等指获得期望的药理学和/或生理学效果。在部分或完全治愈疾病或状况(例如，血液系统恶性肿瘤)和/或可归因于该疾病或状况的不利影响方面该效果可以是治疗性的。这些术语还涵盖哺乳动物，特别地人类中的状况或疾病的任何治疗，并且包括：(a)抑制疾病或状况，即，阻止其发展；或(b)减轻疾病或状况，即，引起疾病或状况的消退。
如本文使用的术语“肿瘤”指任何赘生性细胞生长和增殖，不论恶性或良性，以及所有的癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”和“癌性的”指或描述哺乳动物中通常部分地以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。如本文使用的，术语“癌症”指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。术语“癌前”指通常在癌症之前或发展为癌症的状况或生长。“非转移性”意指为良性的或保持在原发部位并且尚未渗入到淋巴或血管系统或除原发部位以外的组织的癌症。通常，非转移性癌症为任何癌症，其为0期、I期或II期癌症，并且偶尔为III期癌症。“早期癌症”意指非侵袭性或非转移性或被分类为0期、I期或II期癌症的癌症。术语“晚期癌症”通常指III期或IV期癌症，但也可以指II期癌症或II期癌症的亚期(substage)。本领域技术人员将理解，将II期癌症分类为早期癌症或晚期癌症取决于特定类型的癌症。癌症的说明性实例包括，但不限于，乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、尿道癌、甲状腺癌、肾癌、上皮细胞恶性肿瘤(carcinoma)、黑素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、子宫内膜癌、多发性骨髓瘤、直肠癌和食管癌。在一个示例性实施方案中，癌症选自前列腺癌、肺癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌和骨癌。
术语“肿瘤调节”指抑制或阻止肿瘤细胞功能和/或引起肿瘤细胞破坏的物质。肿瘤调节活性可以是细胞毒性的或细胞抑制性的。细胞毒性剂对肿瘤细胞有毒，并且毒性作用可以导致肿瘤细胞的死亡和/或溶解。在某些情况下，毒性作用可能是对肿瘤细胞的亚致死破坏作用，例如减缓或阻止细胞生长。细胞抑制剂抑制或阻止肿瘤细胞的生长和/或增殖。
如本文使用的，强调或斜体化基因名称应该指示基因，与在没有任何强调或斜体的情况下的基因名称指示的蛋白产物形成对比。例如，“hSSB1”应该意指hSSB1基因，而“hSSB1”应该指示由“hSSB1”基因的转录和翻译以及可变剪接产生的蛋白产物(proteinproduct or products)。
除非另有特别说明，本文描述的每一个实施方案在必要修改后适用于每个实施方案。
2.缩写
贯穿本申请使用以下缩写：
nt＝核苷酸
nts＝核苷酸(nucleotides)
Da＝道尔顿
kDa＝千道尔顿
min＝分钟
hr＝小时
wk＝周
PD＝磷酸二酯
PS＝硫代磷酸酯
LSA＝PS寡聚体化合物
ASO＝反义寡核苷酸
GC＝鸟苷/胞嘧啶
Tm＝解链温度
SSB1＝单链DNA结合蛋白1，也被称为NABP2、
OBFC2B
SSB2＝单链DNA结合蛋白2
hSSB1＝人类SSB1
hSSB2＝人类SSB2
mSSB1＝小鼠SSB1
THOC4＝ALYREF，THO复合物亚基4
hTHOC4＝人类THOC4
3.用于靶向肿瘤细胞的核酸寡聚化合物
本发明部分地基于以下发现的鉴定：具有主要包含硫代磷酸酯核苷间连键的骨架，并且至少约一半寡聚体核碱基为嘌呤的核酸寡聚体化合物与SSB1和THOC4中的一个或两个结合，SSB1和THOC4为分别参与DNA修复基和RNA分子细胞核输出到细胞的蛋白合成机器的蛋白。出乎意料地，还已经发现无论这些寡聚体是否与转录物组具有实质上互补性，或者它们是否与基因组具有同源性，它们都显著抑制增殖或刺激肿瘤细胞的死亡。
本发明人已经通过测试超过300个寡聚体序列进一步探索了这一发现，以确定蛋白结合和肿瘤细胞调制活性的潜在特征。在这些序列中，发现195个与SSB1和THOC4中的一个或两个结合，并且抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力。这些寡聚体化合物的序列和化学组成示于表2中。
表2
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在表2中，m表示2'OMe-修饰的核苷，且*代表硫代磷酸酯(PS)核苷间连键。
基于这些发现，本发明广泛地涉及具有以下特征的寡聚体化合物：
a)骨架，所述骨架包含至少约70％硫代磷酸酯核苷间连键；
b)(i)至少约50％的嘌呤含量，或(ii)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；
c)至少14个核碱基和不多于29个核碱基的长度；
d)在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中与THOC4和SSB1中的一种或两种结合；
e)在体内或体外引起肿瘤细胞的凋亡或坏死。
还已经确定了，除了SSB1以外，本发明的寡聚体化合物在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH8.0)和100mM NaCl的水性溶液中还与SSB2结合。基于该确定以及SSB1(包括hSSB1和mSSB1)和SSB2各自为寡核苷酸/寡糖结合(OB)-折叠蛋白的观察，提出本文公开的寡聚体化合物通常结合OB-折叠蛋白。
本发明人还已经发现这些寡聚体化合物通常具有以下特征：
f)在45℃至80℃的范围内的解链温度(Tm)；
g)被肿瘤细胞的优先摄取；
h)抑制mRNA从肿瘤细胞的细胞核至细胞质的易位。
3.1寡聚体的化学组成和设计
本发明的寡聚化合物通常为单链的，并且优选地为至少14个(例如，14个、15个、16个、17个、18个、19个或更多个)核碱基的长度(即，至少14个、15个、16个、17个、18个、19个或更多个连接的核苷/单体亚基)和不多于29个(例如，29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个或更少)核碱基的长度(即，不多于29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个或更少或更多的连接的核苷/单体亚基)。在具体的实施方案中，寡聚体长度为14个与28个、14个与27个、14个与26个、14个与25个、14个与24个、14个与23个、14个与22个、14个与21个、14个与20个、15个与29个、15个与28个、15个与27个、15个与26个、15个与25个、15个与24个、15个与23个、15个与22个、15个与21个、15个与20个、16个与29个、16个与28个、16个与27个、16个与26个、16个与25个、16个与24个、16个与23个、16个与22个、16个与21个、16个与20个、17个与29个、17个与28个、17个与27个、17个与26个、17个与25个、17个与24个、17个与23个、17个与22个、17个与21个、17个与20个、18个与29个、18个与28个、18个与27个、18个与26个、18个与25个、18个与24个、18个与23个、18个与22个、18个与21个、18个与20个、19个与29个、19个与28个、19个与27个、19个与26个、19个与25个、19个与24个、19个与23个、19个与22个、19个与21个、或19个与20个之间核碱基的长度。本领域普通技术人员将理解，本发明因此体现了14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个或29个核碱基的长度的寡聚化合物。
3.2骨架化学组成
3.2.1核苷间连键
寡聚体骨架包含至少约70％硫代磷酸酯核苷间连键。在这方面，并非所有核苷间连键均需要包含硫代磷酸酯核苷间连键，并且因此本发明涵盖具有混合骨架的寡聚化合物，所述混合骨架还包含可选的核苷间连键，诸如磷酸二酯、二硫代磷酸酯、膦酸酯、甲基膦酸酯、烷基膦酸酯、3'-亚烃基膦酸酯(3'-alkylene phosphonate)、5'亚烃基膦酸酯、手性膦酸酯、膦酰乙酸酯(phosphonoacetate)、硫代膦酰基乙酸酯(thiophosphonoacetate)、次膦酸酯(phosphinate)、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、3'-氨基氨基磷酸酯(3'-aminophosphoramidate)、氨基烷基氨基磷酸酯(aminoalkylphosphoramidate)、硫代氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫代磷酰胺酯(phosphorothioamidate)、硫代烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonate)、磷酸三酯、硫代烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriester)、氨基烷基磷酸三酯、硫代烷基磷酸三酯、硒磷酸酯和/或硼烷磷酸酯核苷间连键。在一些实施方案中，寡聚体骨架的至少约70％、80％、90％或甚至100％的核苷间连键包含硫代磷酸酯核苷间连键。在优选的实施方案中，寡聚体骨架的所有核苷间连键包含硫代磷酸酯核苷间连键。
具有至少约70％硫代磷酸酯核苷间连键(PIL)的代表性寡聚体骨架涵盖14个核碱基寡聚体中的至少10个PIL、15个核碱基寡聚体中的至少10个或11个PIL、16个核碱基寡聚体中的至少11个PIL、17个核碱基寡聚体中的至少12个PIL、18个核碱基寡聚体中的至少12个或13个PIL、19个核碱基寡聚体中的至少13个PIL、20个核碱基寡聚体中的至少14个PIL、21个核碱基寡聚体中的至少14个或15个PIL、22个核碱基寡聚体中的至少15个PIL、23个核碱基寡聚体中的至少16个PIL、24个核碱基寡聚体中的至少17个PIL、25个核碱基寡聚体中的至少17个或18个PIL、26个核碱基寡聚体中的至少18个PIL、27个核碱基寡聚体中的至少19个PIL、28个核碱基寡聚体中的至少19个或20个PIL和29个核碱基寡聚体中的至少20个PIL。
对于80％和90％PIL，PIL的代表性数目作为寡聚体长度的函数可以由上表1计算。
任何可选的核苷间连键(即除了PIL以外的核苷间连键)可以处于寡聚体的一个末端或两个末端处，可以处于寡聚体的中心部分，可以彼此相邻，和/或可以分散在整个寡聚体中。
3.2.2修饰的糖部分
寡聚体的骨架合适地包含至少一个2'-O-烷基修饰的糖部分，其说明性实例包括2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基和2'-O-2-甲氧基乙基修饰的糖部分。(例如，2’-O-甲基糖部分)。在具体的实例中，寡聚体包含至少一个2'-O-甲基核糖部分。合适地，寡聚体的至少约50％、60％、70％、80％、90％或所有糖部分各自为2'-O-烷基修饰的糖部分(例如，2'-O-甲基修饰的糖部分)。在具体的实施方案中，寡聚体的所有糖部分各自为2'-O-烷基修饰的糖部分(例如，2'-O-甲基修饰的糖部分)。
至少约50％的代表性MSM含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少7个MSM核碱基、15个核碱基寡聚体中的至少7个或8个MSM核碱基、16个核碱基寡聚体中的至少8个MSM核碱基、17个核碱基寡聚体中的至少8个或9个MSM核碱基、18个核碱基寡聚体中的至少9个MSM核碱基、19个核碱基寡聚体中的至少9个或10个MSM核碱基、20个核碱基寡聚体中的至少10个MSM核碱基、21个核碱基寡聚体中的至少10个或11个MSM核碱基、22个核碱基寡聚体中的至少11个MSM核碱基、23个核碱基寡聚体中的至少11个或12个MSM核碱基、24个核碱基寡聚体中的至少12个MSM核碱基、25个核碱基寡聚体中的至少12个或13个MSM核碱基、26个核碱基寡聚体中的至少13个MSM核碱基、27个核碱基寡聚体中的至少13个或14个MSM核碱基、28个核碱基寡聚体中的至少14个MSM核碱基和29个核碱基寡聚体中的至少14个或15个MSM核碱基。
对于60％、70％、80％或90％的MSM含量，MSM核碱基的代表性数目作为寡聚体长度的函数可以由上表1计算。
3.3核苷酸序列
可以使用任何合适的技术设计核碱基序列以实现嘌呤和/或GC含量和/或Tm，如例如下文描述的。对于本发明的非靶向寡聚体，可以使用随机序列发生器产生核碱基序列(例如，位于Swiss-Prot网站：http://au.expasy.org/tools/randseq.html的随机序列发生器工具)或合理设计并通过合适的序列分析手段(means)(例如，BLAST)筛选，使得核碱基与选择的转录物组和/或基因组具有适当的序列同一性。可选地，对于反义寡聚体，可以使用合适的分析手段(例如，OligoAnalyzer、Primer3、PrimerQuest等)分析感兴趣的核酸序列，以鉴定具有适当的嘌呤和/或GC含量和/或Tm的靶序列。
3.3.1嘌呤含量
寡聚体的核碱基序列合适地具有至少约45％且不多于约90％的嘌呤含量，例如约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的嘌呤含量。在具体的实施方案中，寡聚体具有约45％-90％、约45％-85％、约45％-80％、约45％-75％、约45％-70％、约45％-65％、约45％-60％、约45％-55％、约45％-50％、约50％-90％、约50％-85％、约50％-80％、约50％-75％、约50％-70％、约50％-65％、约50％-60％、约50％-55％、约55％-90％、约55％-85％、约55％-80％、约55％-75％、约55％-70％、约55％-65％或约55％-60％的嘌呤含量。
至少约45％的代表性嘌呤含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少6个嘌呤、15个核碱基寡聚体中的至少6个或7个嘌呤、16个核碱基寡聚体中的至少7个嘌呤、17个核碱基寡聚体中的至少7个或8个嘌呤、18个核碱基寡聚体中的至少8个嘌呤、19个核碱基寡聚体中的至少8个或9个嘌呤、20个核碱基寡聚体中的至少9个嘌呤、21个核碱基寡聚体中的至少9个或10个嘌呤、22个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、23个核碱基寡聚体中的至少10个嘌呤、24个核碱基寡聚体中的至少10个或11个嘌呤、25个核碱基寡聚体中的至少11个嘌呤、26个核碱基寡聚体中的至少11个或12个嘌呤、27个核碱基寡聚体中的至少12个嘌呤、28个核碱基寡聚体中的至少12个或13个嘌呤和29个核碱基寡聚体中的至少13个嘌呤。
对于50％、60％、70％、80％或90％的嘌呤含量，嘌呤核碱基的代表性数目作为寡聚体长度的函数可以由上表1计算。
3.3.2GC含量
寡聚体的核碱基序列可以具有至少约50％且不多于约90％的GC含量，例如约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％或约90％的GC含量。在具体的实施方案中，寡聚体具有50％-90％、50％-85％、50％-80％、50％-75％、50％-70％、50％-65％、50％-60％、50％-55％、55％-90％、55％-85％、55％-80％、55％-75％、55％-70％、55％-65％或55％-60％的GC含量。
至少约50％的代表性GC含量涵盖14个核碱基寡聚体中的至少7个G/C、15个核碱基寡聚体中的至少7个或8个G/C、16个核碱基寡聚体中的至少8个G/C、17个核碱基寡聚体中的至少8个或9个G/C、18个核碱基寡聚体中的至少9个G/C、19个核碱基寡聚体中的至少9个或10个G/C、20个核碱基寡聚体中的至少10个G/C、21个核碱基寡聚体中的至少10个或11个G/C、22个核碱基寡聚体中的至少11个G/C、23个核碱基寡聚体中的至少11个或12个G/C、24个核碱基寡聚体中的至少12个G/C、25个核碱基寡聚体中的至少12个或13个G/C、26个核碱基寡聚体中的至少13个G/C、27个核碱基寡聚体中的至少13个或14个G/C、28个核碱基寡聚体中的至少14个G/C和29个核碱基寡聚体中的至少14个或15个G/C。
对于60％、70％、80％或90％的G/C含量，G/C核碱基的代表性数目作为寡聚体长度的函数可以由上表1计算。
3.3.3嘌呤和GC含量实施方案
在某些实施方案中，寡聚体的核碱基序列具有如以上描述的至少约45％且不多于约90％的嘌呤含量，和如以上描述的至少约50％且不多于约90％的GC含量。
在其他实施方案中，寡聚体的核碱基序列具有至少约50％且不多于约90％的嘌呤含量和少于约50％和多于10％，例如约50％、约45％、约40％、约35％、约30％、约25％、约20％、约15％或约10％的GC含量。在这种类型的说明性实例中，寡聚体具有约45％-90％、约45％-85％、约45％-80％、约45％-75％、约45％-70％、约45％-65％、约45％-60％、约45％-55％、或约45％-50％的嘌呤含量和约10％-50％、约15％-50％、约20％-50％、约25％-50％、约30％-50％、约35％-50％、约40％-50％、约45％-50％、约10％-45％、约15％-45％、约20％-45％、约25％-45％、约30％-45％、约35％-45％、约40％-45％、约10％-40％、约15％-40％、约20％-40％、约25％-40％、约30％-40％或约35％-40％的GC含量。
3.3.4解链温度
寡聚体合适地具有至少约45℃且通常不多于80℃的解链温度(Tm)。(例如，约45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、65℃、70℃、75℃或80℃)。在具体的实施方案中，寡聚体具有45℃-80℃、45℃-75℃、45℃-70℃、45℃-65℃、45℃-60℃、45℃-55℃、45℃-50℃、50℃-80℃、50℃-75℃、50℃-70℃、50℃-65℃、50℃-60℃或50℃-55℃的Tm。
3.3.5非靶向寡聚体
表2中呈现的大多数寡聚体显著抑制肿瘤细胞的增殖或刺激肿瘤细胞的死亡，但缺乏与转录物组的实质上的互补性和/或与基因组的同源性。
本发明的寡聚体核碱基序列可以缺乏与靶肿瘤细胞的转录物组的完全互补性，并且通常也缺乏与靶肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物基因组的完全互补性。在一些实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与转录物组实质上缺乏互补性。合适地，寡聚体的不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的核碱基能够与转录物组进行碱基配对。在这种类型的说明性实例中，不多于95％的寡聚体核碱基能够与转录物组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体具有至少一个非互补核碱基，所述至少一个非互补核碱基不能与该转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。在其他说明性实例中，不多于90％的寡聚体核碱基能够与转录物组进行碱基配对的14个至29个核碱基的寡聚体具有至少两个非互补核碱基，所述至少两个非互补核碱基不能与该转录物组的参考核碱基序列的核碱基碱基配对。
在一些实施方案中，在寡聚体长度内的核碱基序列与肿瘤细胞所合适地源自的哺乳动物的基因组缺乏同源性。合适地，在寡聚体长度内的核碱基序列与任何相同长度的定义基因组中参考核碱基序列的连续核碱基具有不多于约95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的序列同一性。在这种类型的说明性实例中，与基因组中的参考核碱基序列具有不多于95％序列同一性的14个至29个核碱基的寡聚体具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少一个核碱基。在其他说明性实例中，与基因组中的参考核碱基序列具有不多于90％序列同一性的14个至29个核碱基的寡聚体具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基不同的或者不具有与参考核碱基序列的匹配位置处的核碱基相同或等同的核碱基配对能力的至少两个核碱基。
作为寡聚体长度和能够参与碱基配对或具有序列同一性的核碱基的百分比的函数的核碱基的代表性数目可以由上表1中计算。
在具体的实施方案中，非靶向寡聚体核苷碱基序列选自以下的任一项：SEQ IDNO:1、2、3、5、7、36、37、38、39、40、41、44、45、51、52、53、54、55、56、59、61、62、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、79、80、81、82、83、84、85、91、92、93、94、98、100、103、104、105、107、108、109、110、111、113、114、115、117、118、119、120、121、122、131、132、133、134、135、137、138、143、144、145、152、153、155、156、158、159、160、161、162、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、177、180、181、182、183、184、185、191、192、196、198、203、206、207、209、210、211、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、244、245、247、248、249、250、251、252、253、256、258、259、261、263、264、265、269、270、271、272、274、277、281、282、283、286、287、290、291、292、293、295、296、298、300、301和303。
3.3.6反义寡聚体
还已经发现，通过在寡聚体设计中包括以上描述的骨架化学组成和碱基含量，可以使对特定靶序列具有特异性的反义寡聚体适合于结合SSB1和/或THOC4。还已经发现无论反义寡聚体靶向的基因如何，这些寡聚体在体内或体外引起肿瘤细胞的凋亡或坏死。另外，可以使用本领域已知的标准反义设计程序和分析工具设计反义寡聚体的靶向序列。
因此，主题反义寡聚体的核碱基序列通常将与选择的基因的反义链具有实质上的互补性。在这些实施方案中，核碱基序列在高严格条件下与所选择的基因或其转录物(包括由所选择的基因编码的前体mRNA或mRNA分子)的靶序列合适地互补并且能够杂交。可以使用本领域已知的多种技术测试反义寡聚体的效力。
例如，可以测试反义寡聚体的异源双链体形成。给定的反义寡聚体与靶核酸序列以形成异源双链体的有效性可以通过本领域已知的筛选方法确定。例如，可以将寡聚体在包含在肿瘤细胞中优先表达的mRNA的细胞培养物中孵育，并且对靶mRNA的作用通过监测以下的存在或不存在来评价：(1)与靶序列和非靶序列的异源双链体形成，其使用本领域技术人员已知的程序，(2)由肿瘤细胞表达的靶mRNA的量，如通过标准技术诸如RT-PCR或RNA印迹确定的，(3)由靶mRNA转录的蛋白的量，如通过标准技术诸如ELISA或蛋白印迹确定的。可选地或另外，反义寡聚体的有效性可通过测量用反义寡聚体处理的肿瘤细胞中靶基因的表达来确定。
在具体的实施方案中，反义寡聚体靶向eIF-4E或SSB1。说明性反义寡聚体核碱基序列合适地选自以下的任一个：SEQ ID NO:6、10、12、14、15、16、17、21、22、23、24、25、27、28、29、31、32、33、34、35、101、278、279、280、284、285、288、289、297和299。
3.4寡聚体特性修饰
本发明还考虑了可以增强本发明的寡聚化合物的特性或可以用于追踪寡聚化合物或其代谢物的修饰，该修饰包括一个或更多个部分或缀合物的附接。通常被增强的特性包括但不限于活性、细胞分布和细胞摄取。在一些实施方案中，此类修饰的寡聚化合物通过将缀合物基团共价附接至寡聚化合物上可用的官能基团(诸如羟基或氨基官能基团)来制备。本发明的缀合物基团包括嵌入剂、报告物分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚体的药效学特性的基团、和增强寡聚体的药代动力学特性的基团。典型的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本发明的上下文中，增强药效学特性的基团包括改进特性(包括但不限于寡聚体摄取)和/或增强寡聚体对降解的耐受性的基团。在本发明的上下文中，增强药效学特性的基团包括改进特性(包括但不限于寡聚体摄取、分布、代谢和排泄)的基团。代表性缀合物基团在国际专利申请PCT/US92/09196中公开。
缀合物基团包括但不限于脂质部分诸如胆固醇部分(Letsinger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553-6556)、胆酸(Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,1994,4,1053-1060)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇(hexyl-S-tritylthiol))(Manoharan等,Ann.N.Y.Acad.Sci.,1992,660,306-309；Manoharan等,Bioorg.Med.Chem.Let.,1993,3,2765-2770)、硫代胆固醇(Oberhauser等,Nucl.AcidsRes.,1992,20,533-538)、脂肪族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Saison-Behmoaras等,EMBO J.,1991,10,1111-1118；Kabanov等,FEBS Lett.,1990,259,327-330；Svinarchuk等,Biochimie,1993,75,49-54)、磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3H-膦酸酯(Manoharan等,Tetrahedron Lett.,1995,36,3651-3654；Shea等,Nucl.Acids Res.,1990,18,3777-3783)、多胺或聚乙二醇链(Manoharan等,Nucleosides&Nucleotides,1995,14,969-973)，或金刚烷乙酸(Manoharan等,TetrahedronLett.,1995,36,3651-3654)、棕榈基部分(Mishra等,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229-237)、或十八烷基胺或己基氨基-羰基-羟胆固醇部分(Crooke等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996,277,923-937)。
本发明的寡聚化合物还可以与活性药物物质缀合，活性药物物质例如阿司匹林、华法林(warfarin)、保泰松(phenylbutazone)、布洛芬(ibuprofen)、舒洛芬(suprofen)、苯布芬(fenbufen)、酮洛芬(ketoprofen)、(S)-(+)-普拉洛芬((S)-(+)-pranoprofen)、卡洛芬(carprofen)、丹磺酰肌氨酸、2,3,5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亚叶酸、苯并噻二嗪、氯噻嗪、二氮杂卓(diazepine)、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥酸盐、头孢菌素、磺胺类药、抗糖尿病药(antidiabetic)、抗细菌药或抗生素。寡核苷酸-药物缀合物及其制备描述于美国专利申请系列号09/334,130中，其通过引用以其整体并入本文。
本发明的寡聚化合物也可以被修饰为具有一个或更多个稳定基团，所述一个或更多个稳定基团通常被附接至寡聚化合物的一个或两个末端以增强特性，诸如例如核酸酶稳定性。稳定基团包括帽结构。这些末端修饰保护具有末端核酸部分的寡聚化合物免于外切核酸酶降解，并且可以有助于细胞内的递送和/或定位。帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)，或者可以存在于两个末端上。在非限制性实例中，5'-帽包括反向无碱基(abasic)残基(部分)、4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；1,5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)连键；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3',4'-seco核苷酸(acyclic 3',4'-seco nucleotide)；无环3,4-二羟丁基核苷酸；无环3,5-二羟基戊基核苷酸、3'-3'-反向核苷酸部分；3'-3'-反向无碱基部分；3'-2'-反向核苷酸部分；3'-2'-反向无碱基部分；磷酸1,4-丁二醇；3'-氨基磷酸酯；己基磷酸酯(hexylphosphate)；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-硫代磷酸酯；硫代磷酸酯；或者桥接或非桥接的甲基膦酸酯部分(更多细节参见Wincott等，国际PCT公布号WO 97/26270，通过引用并入本文)。
示例性3'-帽结构包括，例如，4',5'-亚甲基核苷酸；1-(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸；4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸；5'-氨基-烷基磷酸酯；1,3-二氨基-2-丙基磷酸酯、3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基磷酸酯；1,2-氨基十二烷基磷酸酯；羟丙基磷酸酯；1,5-脱水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α-核苷酸；修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-戊呋喃糖基核苷酸；无环3',4'-seco核苷酸；3,4-二羟丁基核苷酸；3,5-二羟基戊基核苷酸，5'-5'-反向核苷酸部分；5'-5'-反向无碱基部分；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；磷酸1,4-丁二醇；5'-氨基；桥接和/或非桥接5'-氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯、桥接或非桥接甲基膦酸酯和5'-巯基部分(更多细节参见Beaucage和Tyer，1993，Tetrahedron 49,1925和公布于2005年1月27日的公布的美国专利申请公布号US2005/0020525)。
可以使用本领域技术人员熟知的方法制备本发明的寡聚体，所述方法包括用于适当的DNA样化合物(Protocols for Oligonucleotides and Analogs,编著Agrawal(1993),Humana Press)和/或RNA样化合物(Scaringe,Methods,2001,23,206-217.Gait等,Applications of Chemically synthesized RNA in RNA:Protein Interactions,编著Smith(1998),1-36.Gallo等,Tetrahedron,2001,57,5707-5713)合成的文献程序。
可选地，本发明的寡聚化合物可以从多种寡核苷酸合成公司，诸如，例如，Sigma-Aldrich Inc.(Castle Hill,NSW,Australia)购买。不考虑使用的特定方案，主题寡聚化合物可以通过熟知的固相合成技术方便地且常规地制备。用于此类合成的设备由几个供应商，包括，例如，Applied Biosystems(Foster City,Calif.)出售。可以另外地或可选地采用本领域已知的任何其他用于此类合成的手段(包括溶液相合成)。寡聚化合物的纯化和分析方法是本领域技术人员已知的。分析方法包括毛细管电泳(CE)和电喷雾质谱。本发明的方法不受寡聚体合成或纯化方法的限制。
3.5寡聚体特性
寡聚体化合物可以如下被肿瘤细胞摄取：当以游离(非复合)形式施用时，通过促进或主动转运跨越肿瘤细胞膜，或者当以复合形式施用时，通过胞吞机制。寡聚体可以是用于膜转运体系统(即一种或更多种膜蛋白)的底物，能够促进转运或主动转运寡聚体跨越细胞膜。该特征可以通过用于寡聚体相互作用或细胞摄取的许多测试之一如下确定。
第一测试通过检查寡聚体化合物置换或被细胞表面上选择的带电荷寡聚体置换的能力来评价在细胞表面受体处的结合。将细胞与给定量的测试寡聚体以约10-300nM之间的最终寡聚体浓度一起孵育，所述测试寡聚体通常为荧光标记的。此后不久，例如10-30分钟(在测试寡聚体显著内化可以发生之前)，以递增地增加浓度添加置换化合物。如果测试化合物能够与细胞表面受体结合，将观察到置换化合物置换测试化合物。如果显示置换化合物以10×测试化合物浓度或更少的浓度产生50％置换，认为测试化合物与置换化合物在相同的细胞转运系统识别位点处结合。
第二测试通过检查测试化合物将标记的报告物分子(例如荧光报告物)转运到细胞中的能力来测量细胞转运。将细胞在标记的测试化合物存在下孵育，以约10-300nM之间的最终浓度添加。在孵育30-120分钟之后，例如通过显微术检查细胞的细胞内标记物。显著细胞内标记物的存在证明测试化合物通过促进或主动转运被转运。
寡聚体化合物也可以以复合形式施用，其中复合剂通常为具有与寡聚体上的任何净电荷相反的电荷的聚合物，例如阳离子脂质、多肽或非生物学阳离子聚合物。在阴离子寡核苷酸与阳离子脂质或其他聚合物组分之间形成复合物(包括双层复合物)的方法是熟知的。广泛使用，例如，包含阳离子脂质DOTMA(N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵)((N-[1-(2,3-dioleyloxyl)propyl]-N,N,N-trimethylammonium chloride))和中性磷脂DOPE(二油酰基磷脂酰乙醇胺(dioleyl phosphatidyl ethanolamine))的脂质体组合物LipofectinTM(Felgner等Proc Natl Acad Sci USA,1987,84(21):7413-7417)。在施用之后，复合物通过胞吞机制被细胞摄取，通常包括内体中的颗粒包封。
寡聚体化合物也可以与富含精氨酸的肽以缀合形式一起施用，所述富含精氨酸的肽与寡聚体的5'或3'末端共价连接。肽通常为8-16个氨基酸，并且由精氨酸和其他氨基酸(包括苯丙氨酸和半胱氨酸)的混合物组成。富含精氨酸的肽-PMO缀合物的使用可以用于增强寡聚体的细胞摄取(参见，例如，Moulton等，Bioconjug Chem,2004,15(2):290-299；Nelson等，Bioconjug Chem,2005,16(4):959-966)。
在一些情况下，可以采用脂质体来促进寡聚体摄取到细胞中(参见，例如，Williams,S.A.,Leukemia 10(12):1980-1989,1996；Lappalainen等,Antiviral Res.,1994,23:119；Uhlmann et al.,Chemical Reviews,1990,90(4):544-584)。水凝胶也可以用作寡聚体施用的媒介物，例如，如WO 93/01286中描述的。可选地，寡聚体可以以微球或微粒施用(参见，例如，Wu,G.Y.和Wu,C.H.,J.Biol.Chem.1987,262:4429-4432)。可选地，使用与反义寡聚体复合的充气微泡可以增强向靶组织的递送，如美国专利号6,245,747中描述的。
在其他实例中，本发明的寡聚体的必需摄取特性可以通过简单的体内试验来确认，其中将标记的化合物施用至动物(例如，哺乳动物)，并且测定在寡聚体被施用之后数小时内从该动物采取的体液样品或者针对寡聚体在该动物的肿瘤细胞中的存在将该动物整体或部分地成像。
在具体的实施方案中，与被非肿瘤或正常细胞摄取相比，主题寡聚体化合物优先被哺乳动物的肿瘤细胞摄取。
本发明的寡聚体化合物合适地结合THOC4和/或SSB1。可以使用任何合适的测定(包括亲和力测定法测试候选寡聚体与一种或两种蛋白的结合。测定可以测量寡聚体化合物对THOC4和/或SSB1的解离速率常数(kd)或结合速率常数(ka)或平衡结合常数(KD)中的任何一个或更多个。在一些实施方案中，这些常数通过放射性标记或荧光标记的寡聚体结合测定测量。该测定用最小浓度的标记寡聚体平衡滴定系列的THOC4或SSB1。使用聚丙烯酰胺凝胶电泳确定与THOC4或SSB1的结合程度。
亲和力测量可以通过用于核酸:蛋白相互作用的标准方法确定，所述标准方法例如，表面等离子体共振(SPR)(Rich和Myszka Curr.Opin.Biotechnol,2000,11:54；Englebienne Analyst.1998,123:1599)、等温滴定量热法(ITC)或本领域已知的其他动力学相互作用测定。在具体的实施方案中，常数通过使用表面等离子体共振测定，例如使用BIAcore表面等离子体共振(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)与固定的THOC4或SSB1或其区域进行测量。示例性SPR方法描述于美国专利号7,229,619中。
在具体的实施方案中，THOC4以在相同条件(例如，在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH 8.0)和100mM NaCl的水性条件下)下比对阴性对照寡聚体Neg_C的KD低至少2倍的KD结合肿瘤调节寡聚体。示例性条件在实施例3中描述。在代表性实例中，寡聚体以≤约60nM、≤约50nM、≤约40nM、≤约30nM、≤约20nM或≤约10nM的KD结合THOC4，包括hTHOC4。
在一些实施方案中，OB-折叠蛋白以在相同条件(例如，在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH 8.0)和100mM NaCl的水性条件下)下比对阴性对照寡聚体Neg_C的KD低至少2倍的KD结合肿瘤调节寡聚体。示例性条件在实施例3和7中描述。在代表性实例中，寡聚体以≤约10nM、≤约5nM、≤约4nM、≤约3nM或≤约2nM的KD结合OB-折叠蛋白，包括SSB1和SSB2。在这种类型的说明性实例中，SSB1以在相同条件(例如，在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH 8.0)和100mM NaCl的水性条件下)下比对阴性对照寡聚体Neg_C的KD低至少2倍的KD结合肿瘤调节寡聚体。示例性条件在实施例3中描述。在代表性实例中，寡聚体以≤约10nM、≤约5nM、≤约4nM、≤约3nM或≤约2nM的KD结合SSB1，包括hSSB1和mSSB1。在其他说明性实例中，SSB2以在相同条件(例如，在37℃在包含10mM Tris-HCl(pH 8.0)和100mM NaCl的水性条件下)下比对阴性对照寡聚体Neg_C的KD低至少2倍的KD结合肿瘤调节寡聚体。示例性条件在实施例7中描述。在代表性实例中，寡聚体以≤约10nM、≤约5nM、≤约4nM、≤约3nM或≤约2nM的KD结合SSB2，包括hSSB2。可选地，或另外，本发明的寡聚体化合物可以使用计算机(in silico)建模设计和/或鉴定。例如，可以使用结构模型，其提供OB-折叠蛋白的三维二级、三级和/或四级氨基酸残基结构的表示。结构模型涵盖X射线晶体结构、NMR结构、理论蛋白结构、由同源建模创建的结构、蛋白断层扫描模型和由电子显微镜研究构建的原子模型。在具体的实施方案中，OB-折叠蛋白复合物与候选寡聚体的原子分子动力学(MD)模拟可以用于鉴定如本文公开的对OB-折叠蛋白具有有希望的亲和力和抗肿瘤活性的化合物。许多MD模拟技术是本领域已知的，其代表性实例例如由以下公开的：Allison JR(2016,Curr Opin StructBiol.43:79-87)、Ganesan等(2016,Drug Discov Today S1359-6446(16)30414-7)和Karplus等(2002,Nature Structural Biology 9:646-652)。
本发明的寡聚体可以阻断RNA的易位，通常是mRNA从肿瘤细胞的细胞核至细胞质的易位。可以例如通过细胞核易位测定来测量RNA至细胞核的易位，在细胞核易位测定中同时检测两种或更多种荧光标记物质(species)的发射。例如，细胞的细胞核可以用对DNA特异性的已知荧光团，诸如Hoechst 33342标记。RNA可以直接或间接标记，例如对RNA特异性的荧光标记的抗体。易位至细胞核或从细胞核易位的RNA的量可以通过确定第一荧光标记的物质(即细胞核)的量来确定，所述第一荧光标记的物质以关于第二荧光标记的物质(RNA)相关或反相关方式分布，如美国专利号6,400,487中描述的，其内容在此通过引用并入。
本发明的寡聚化合物可以抑制肿瘤细胞的增殖，并且通常引起肿瘤细胞的凋亡或坏死。细胞增殖可以通过将细胞暴露于荧光素标记的抗PCNA抗体(例如，PC-10,Santa CruzBiotechnology)来测定，该抗PCNA抗体与增殖细胞的细胞核抗原(PCNA)结合。可以测试选择的寡聚体对细胞系增殖的影响。可以将从2×105个至2×108个细胞铺板于96孔板的每一个孔中。然后可以将包含1μM至10μM的每一种寡聚体的培养基以一式三份添加至孔中。最低限度地，还进行阴性(无配体)和阳性对照。在2小时之后，可以将FITC抗PCNA添加至孔中，与细胞一起孵育15分钟，并且在3次洗涤步骤之后，可以使用酶标仪(plate reader)确定荧光水平。PCNA测定已经用于细胞和组织中(Kulldorff等J.Clin Epidemiology,2000,53:875)。可以在来自癌症患者(包括乳腺癌或前列腺癌患者)的新鲜肿瘤活检组织中测试抑制增殖的寡聚化合物。可以将小块肿瘤活检组织铺板于96孔板的孔中，并且对每一个样品以一式两份重复与以上描述相同的测定。在读取荧光之后，可以在荧光显微镜下评价样品以确认其增殖确实受到影响的细胞为癌细胞。
可以使用细胞膜磷脂酰丝氨酸结合染料(FITC膜联蛋白V；也可以使用可选的染料诸如Cy5.5)测定凋亡。可以测试本发明的寡聚化合物对多种细胞系的凋亡的影响。可以将从2×105个至2×108个细胞铺板于96孔板的每一个孔中并且将包含1μM至10μM每一种寡聚体的培养基以一式三份添加至孔中。最低限度地，还进行阴性(无寡聚体)和阳性(bcl2反应性配体)对照。在1.5小时之后，将FITC膜联蛋白添加至孔中，与细胞一起孵育15分钟，并且在3次洗涤步骤之后，使用酶标仪确定荧光水平。通过使用来自bcl-2转基因小鼠(CharlesRiver)的表达bcl-2的细胞和组织，可以证明测定可以从细胞转移至组织。可以在来自乳腺癌患者的新鲜肿瘤活检中测试诱导凋亡的配体。使用初级组织活检的一个优点是可以在组织收集的两小时内，即在组织已经开始显示与局部缺血相关的变化之前进行测定。可以将小块肿瘤活检铺板于96孔板的孔中，并且对每一个样品以一式两份重复与以上描述相同的测定。之后，读取荧光，可以用DAPI染色(Molecular Probes,Eugene Oreg.)染色样品，并且可以在荧光显微镜下评价细胞核形态以用于确认细胞核浓缩和片段化。可选地，可以使用标记DNA链断裂的经典TUNEL(末端脱氧核苷酸基转移酶介导的生物素化的脱氧尿苷三磷酸缺口末端标记)方法。
检测坏死的技术包括但不限于DNA结合染料诸如碘化丙啶或TOTO-3的经典技术。可选地，用于线粒体酶释放的比色甲基噻唑四唑(MTT)测定也可以用于确定细胞存活力。在具体的实施方案中，使用DNA结合染料碘化丙啶和TOTO-3确定细胞存活力。在细胞系中进行这些测定可以允许人们区分坏死与凋亡，这将促进区分具有特异性作用的寡聚体与为广泛细胞毒性的寡聚体。通过并行进行坏死和凋亡测定也可以促进这种区分。可以测试选择的寡聚体对细胞系坏死的影响。可以将从2×105个至2×108个细胞铺板于96孔板的每一个孔中并且将包含1μM至10μM每一种寡聚体的培养基以一式三份添加至孔中。最低限度地，还进行阴性(无寡聚体)和阳性对照。在8小时之后，将碘化丙啶或TOTO 3添加至孔中，与细胞一起孵育15分钟，并且在3个洗涤步骤之后，使用荧光酶标仪确定荧光水平。坏死可能是转移至组织活检的困难测定，因为它通常在至少8小时之后进行测定，并且在这样的间隔之后由于组织活检中的局部缺血存在大量坏死，这提供了高背景。为了克服这个问题，可以将人类活检组织移植到裸小鼠中，从而在8小时测定时间段期间防止局部缺血诱导的坏死。为了确保裸小鼠中的生长不改变肿瘤，可以将在裸小鼠中生长1个月的肿瘤外植并测试短期凋亡和增殖。也可以将肿瘤进行组织学观察并且与新鲜肿瘤外植体进行比较以评价差异。在50％的案例中结合相同靶并诱导坏死的配体可以被注射到动物的肿瘤中，在8小时之后收集，并且用碘化丙啶染色。组织学检查可以揭示肿瘤细胞正在发生坏死，而活检中的其他细胞则没有。
4.寡聚体组合物和应用
本发明的寡聚体化合物可以用作用于抑制肿瘤细胞的增殖、存活或存活力，或用于治疗或预防癌症的活性物质。可以在体内或体外处理肿瘤细胞。因此，主题寡聚体合适地用于治疗或预防癌症药物组合物。因此，本发明考虑了用于治疗、预防和/或缓解癌症症状的药物组合物，其中所述组合物包含有效量的本发明的寡聚体和药学上可接受的载体。
本发明的寡聚化合物涵盖任何药学上可接受的盐、酯或此类酯的盐，或在施用至动物(通常哺乳动物包括人类)后能够(直接或间接)提供生物学活性代谢物或其残基的任何其他化合物。因此，例如，本公开内容还涉及本发明的寡聚化合物的前药和药学上可接受的盐、此类前药的药学上可接受的盐和其他生物等同物。对于核酸寡聚体，药学上可接受的盐及其用途的实例被进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以其整体并入本文。
本发明的组合物还可以与用于辅助摄取、分布和/或吸收的其他分子、分子结构或化合物(如例如，脂质体、受体靶向分子、口服、直肠、局部或其他制剂)的混合物混合、包封、缀合或以其他方式联合。教导制备此类摄取、分布和/或吸收辅助制剂的代表性专利文献包括，但不限于，美国专利号5,108,921；5,354,844；5,416,016；5,459,127；5,521,291；5,543,158；5,547,932；5,583,020；5,591,721；4,426,330；4,534,899；5,013,556；5,108,921；5,213,804；5,227,170；5,264,221；5,356,633；5,395,619；5,416,016；5,417,978；5,462,854；5,469,854；5,512,295；5,527,528；5,534,259；5,543,152；5,556,948；5,580,575；和5,595,756，其每一个通过引用并入本文。
本发明的药物组合物可以取决于所期望的是局部治疗还是全身治疗以及待治疗的区域而以多种方式施用。施用可以是局部的(包括眼部的和粘膜的，包括阴道和直肠递送)、肺部，例如通过吸入或吹入粉末或气雾剂，包括通过喷雾器；气管内、鼻内、表皮和经皮)、口服或肠胃外。肠胃外施用包括静脉内、动脉内、皮下、腹腔内或肌内注射或输注；或颅内例如鞘内或心室内施用。具有至少一个2'-O-甲氧基乙基修饰的寡聚体被认为对于口服施用特别有用。用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括经皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。常规的药物载体，水性粉末或油性基质、增稠剂等可以是必需的或期望的。涂覆的避孕套、手套等也可以是有用的。
本发明的药物组合物包括，但不限于，溶液、乳液、泡沫和包含脂质体的制剂。本发明的药物组合物可以包含一种或更多种渗透增强剂、载体、赋形剂或其他活性或非活性成分。
本领域技术人员将认识到，药物组合物根据其预期用途，即施用途径常规设计。
例如，用于局部施用的优选的制剂包括其中本发明的寡核苷酸与局部递送剂诸如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些制剂。优选的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱)阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和阳离子(例如，二油酰基四甲基氨基丙基DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA)。渗透增强剂及其用途被进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以其整体并入本文。表面活性剂及其用途被进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以其整体并入本文。
用于口服施用的组合物包括粉末或颗粒(granules)、微粒、纳米颗粒、水或非水性介质中的悬浮液或溶液、胶囊、凝胶胶囊、小袋剂(sachet)、片剂或微片剂。增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是期望的。优选的口服制剂为其中本发明的寡核苷酸与一种或更多种渗透增强剂表面活性剂和螯合剂结合施用的那些。优选的表面活性剂包括脂肪酸和/或其酯或盐、胆汁酸和/或其盐。优选的胆汁酸/盐和脂肪酸及其用途被进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以其整体并入本文。还优选渗透增强剂的组合，例如，脂肪酸/盐与胆汁酸/盐的组合。特别优选的组合为月桂酸、癸酸和UDCA的钠盐。另外的渗透增强剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-十六烷基醚。本发明的寡聚化合物可以以颗粒形式口服递送，所述颗粒形式包括喷雾干燥的颗粒，或复合形成微米颗粒或纳米颗粒。核酸寡聚体复合剂及其用途被进一步描述于美国专利号6,287,860中，其以其整体并入本文。用于核酸寡聚体的口服制剂及其制备被详细描述于美国专利申请系列号09/108,673(于1998年7月1日提交)、系列号09/315,298(1999年5月20日提交)和系列号10/071,822(2002年2月8日提交)，其每一个通过引用以其整体并入本文。
在另一个相关的实施方案中，治疗有效的组合疗法可以包括使用两种或更多种本发明的组合物，其中多于一种组合物靶向单个或多于一个核酸靶。反义寡聚化合物的许多实例是本领域已知的。两种或更多种组合的化合物可以一起使用或顺序使用。
任何寡聚化合物均可以用于本发明的组合物和方法中，条件是该化合物为药学活性的。“药学活性”寡聚体呈以下的形式：当施用至有相应需要的个体时，导致肿瘤细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)生存；(iv)存活力；或(v)维持的降低、减少、消除或预防；和/或治疗和/或预防癌症，包括预防引起症状，控制此类症状或治疗与癌症相关的现有症状。
用于在本发明方法中使用的施用方式、施用的寡聚体的量和寡聚体制剂为常规的并且在本领域从业者的技能范围内。与合适的对照相比，通过测量指示疾病过程的一个或更多个诊断参数来确定是否已经治疗癌症。在动物实验的情况下，“合适的对照”为未用寡聚体化合物治疗的动物、或用没有寡聚体化合物的药物组合物治疗的动物。在人类受试者的情况下，“合适的对照”可以是治疗之前的个体，或者可以是用安慰剂治疗的人类(例如，年龄匹配或类似的对照)。根据本发明，癌症的治疗包括并且涵盖，但不限于：(1)损害、消除、降低、预防或阻止患者中的肿瘤细胞的(i)形成；(ii)增殖；(iii)存活；(iv)存活力；或(v)维持的发展；(2)治疗受试者中的癌症(例如，原发性癌症或转移性癌症)；(3)预防具有癌症的倾向但尚未被诊断为患有癌症的受试者中的癌症(例如，原发性癌症或转移性癌症)并且因此，该治疗构成癌症的预防性治疗；或(iii)引起癌症消退(例如，原发性癌症或转移性癌症)。
因此，本发明的组合物和方法适用于治疗已经被诊断为患有癌症、疑似患有癌症、已知易感并且被认为可能发展癌症、或者被认为可能发展先前治疗过的癌症复发的个体。癌症可以是激素受体阳性的或激素受体阴性的。在一些实施方案中，癌症为激素受体阴性的，并且因此对激素或内分泌疗法耐受。在其中癌症为乳腺癌的一些实施方案中，乳腺癌(例如，非乳腺CMC肿瘤细胞)为激素受体阴性的(例如，雌激素受体(ER)阴性的和/或孕酮受体(PR)阴性的)。
本发明还考虑与抑制肿瘤细胞增殖、存活或存活力的至少一种癌症疗法同时施用寡聚体化合物。寡聚体可以在癌症疗法之后治疗性使用，或者可以在施用疗法之前或与疗法一起使用。因此，本发明考虑了组合疗法，其采用本发明的寡聚体和癌症疗法的同时施用，其非限制性实例包括放射疗法、外科手术、化学疗法、激素消融疗法、促凋亡疗法和免疫治疗。
4.1放射疗法
放射疗法包括诱导DNA损伤的辐射和波，例如，γ-辐照、X-射线、UV辐照、微波、电子发射、放射性同位素等。疗法可以通过用以上描述的辐射形式辐照局部肿瘤部位来实现。最有可能的是，所有这些因素对DNA、DNA的前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持产生广泛范围的损伤。
X-射线的剂量范围为范围从50-200伦琴的每天剂量持续延长的时间段(3-4周)，至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围变化很宽，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型，以及被赘生性细胞的摄取。
放射疗法的非限制性实例包括单次击发或分次击发的适形外部束放射疗法(50-100格雷作为在4-8周内的分次(fractions)提供)、高剂量率近距离放射疗法、永久性间质近距离放射疗法、全身放射性同位素(例如，锶89)。在一些实施方案中，放射疗法可以与放射增敏剂组合施用。放射增敏剂的说明性实例包括但不限于乙丙昔罗(efaproxiral)、依他硝唑(etanidazole)、氟路索(fluosol)、米索硝唑(misonidazole)、尼莫拉唑(nimorazole)、替莫泊芬(temoporfin)和替拉扎明(tirapazamine)。
4.2化学疗法
化学治疗剂可以选自以下类别的任何一种或更多种：
(i)抗增殖药/抗肿瘤药及其组合，如医学肿瘤学中使用的，诸如烷基化剂(例如顺铂、卡铂、环磷酰胺、氮芥、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)和亚硝基脲类)、抗代谢物(例如抗叶酸剂诸如氟嘧啶类(fluoropyridines)，如5-氟尿嘧啶和替加氟(tegafur)、雷替曲塞(raltitrexed)、氨甲蝶呤(methotrexate)、阿糖胞苷和羟基脲)；抗肿瘤抗生素类(例如蒽环霉素，如阿霉素、博来霉素、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、丝裂霉素-C、更生霉素(dactinomycin)和光辉霉素(mithramycin))；抗有丝分裂剂(例如长春花生物碱类，如长春花新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)和长春瑞滨(vinorelbine)和紫衫烷类如紫杉醇和多西他赛)以及拓扑异构酶抑制剂(例如表鬼臼毒素类如依托泊苷和替尼泊苷、安吖啶(amsacrine)、拓扑替康和喜树碱)；
(ii)细胞生长抑制剂诸如抗雌激素(例如他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)和艾多昔芬(iodoxyfene))、雌激素受体下调物(例如氟维司群(fulvestrant))、抗雄激素类(例如比卡鲁胺(bicalutamide)、氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和乙酸环丙孕酮)、UH拮抗剂或LHRH激动剂(例如戈舍瑞林(goserelin)、亮丙瑞林(leuprorelin)和布舍瑞林(buserelin))、孕激素(例如醋酸甲地孕酮)、芳香酶抑制剂(例如如阿那曲唑(anastrozole)、来曲唑(letrozole)、伏氯唑(vorozole)和依西美坦(exemestane))以及5α-还原酶抑制剂诸如非那雄胺；
(iii)抑制癌细胞侵袭的剂(例如金属蛋白酶抑制剂如马立马司他(marimastat)和尿激酶型纤溶酶原活化物受体功能的抑制剂)；
(iv)生长因子功能抑制剂，例如此类抑制剂包括生长因子抗体、生长因子受体抗体(例如抗-erbb2抗体曲妥珠单抗[HerceptinTM]和抗-erbb1抗体西妥昔单抗[C225])、法呢基转移酶抑制剂、MEK抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂和丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，例如表皮生长因子家族的其他抑制剂(例如其他EGFR家族酪氨酸激酶抑制剂诸如N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(吉非替尼(gefitinib)，AZD1839)、N-(3-乙炔基苯基)-6,7-双(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(厄洛替尼(erlotinib)，OSI-774)和6-丙烯酰胺基-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉-4-胺(CI 1033))，例如血小板来源的生长因子家族的抑制剂和例如肝细胞生长因子家族的抑制剂；
(v)抗血管生成剂，诸如抑制血管内皮生长因子作用的那些，(例如，抗-血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[AvastinTM]，化合物诸如在国际专利申请WO 97/22596、WO 97/30035、WO 97/32856和WO 98/13354中公开的那些化合物)和通过其他机制工作的化合物(例如，利诺安(linomide)、整联蛋白αvβ3功能的抑制剂、和血管抑素)；
(vi)血管损伤剂，诸如考布他汀A4和在国际专利申请WO 99/02166、WO00/40529、WO 00/41669、WO01/92224、WO02/04434和WO02/08213中公开的化合物；
(vii)反义疗法，例如针对以上列出的靶的那些，例如ISIS2503，一种抗-ras反义物；以及
(viii)基因治疗方法，包括例如替代异常基因诸如异常p53或异常GDEPT(基因导向的酶前药治疗)方法的方法，诸如使用胞嘧啶脱氨酶、胸苷激酶或细菌硝基还原酶的那些，以及增加患者对化学疗法或放射疗法的耐受性的方法，诸如多-药物耐受性基因疗法。
4.3免疫治疗
免疫治疗方法包括，例如，增加患者肿瘤细胞的免疫原性的离体和体内方法，诸如用细胞因子诸如白细胞介素2、白细胞介素4或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的转染；减少T细胞无反应性的方法，使用转染的免疫细胞诸如细胞因子转染的树突细胞的方法，使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法，和使用抗独特型抗体的方法。这些方法通常依赖于使用免疫效应物细胞和分子来靶向和破坏癌细胞。免疫效应物可以是例如对恶性细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。单独的抗体可以用作疗法的效应物，或者单独的抗体可以募集其他细胞以事实上促进细胞杀伤。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻毒蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合，并且仅用作靶向剂。可选地，效应物可以是携带与恶性细胞靶直接或间接相互作用的表面分子的淋巴细胞。各种效应物细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
4.4其他疗法
其他癌症疗法的实例包括光线疗法、冷冻疗法、毒素疗法或促凋亡疗法。本领域的技术人员将知道，该列表并非可用于癌症和其他增生性损伤的治疗方式的类型的穷举。
熟知，化疗治疗和辐射治疗快速靶向快速分裂细胞和/或破坏细胞周期或细胞分裂。这些治疗作为治疗几种形式的癌症的一部分被提供，旨在通过治愈性治疗来减缓其进展或逆转疾病的症状。然而，这些癌症治疗可能导致免疫受损状态和随后的致病性感染，并且因此本发明也延伸至组合疗法，所述组合疗法采用本发明的寡聚化合物、癌症疗法和针对发展或具有由于癌症疗法引起的免疫受损的状况发展的增加的风险的感染有效的抗感染剂两者。抗感染药物合适地选自抗微生物剂，所述抗微生物剂包括但不限于杀伤或抑制微生物诸如病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物等的生长的化合物，并且因此包括抗生素、抗阿米巴药、抗真菌剂、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。抗感染药物在其范围内也包括驱肠虫药(anthelmintics)和杀线虫剂。说明性抗生素包括喹诺酮类(quinolones)(例如，氨氟沙星(amifloxacin)、西诺沙星(cinoxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、氟罗沙星(fleroxacin)、氟甲喹(flumequine)、洛美沙星(lomefloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星、恶喹酸(oxolinic acid)、培氟沙星(pefloxacin)、罗索沙星(rosoxacin)、替马沙星(temafloxacin)、托氟沙星(tosufloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)；吉米沙星(gemifloxacin)；和加雷沙星(garenoxacin))、四环素类(tetracyclines)、甘氨环素类(glycylcyclines)和噁唑烷酮类(oxazolidinones)(例如，金霉素(chlortetracycline)、地美环素(demeclocycline)、多西环素(doxycycline)、赖甲环素(lymecycline)、美他环素(methacycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)、四环素(tetracycline)、替加环素(tigecycline)；利奈唑胺(linezolide)、依哌唑胺(eperezolid))、糖肽类(glycopeptides)、氨基糖苷类(aminoglycosides)(例如，阿米卡星(amikacin)、阿贝卡星(arbekacin)、丁苷菌素(butirosin)、地贝卡星(dibekacin)、福提霉素(fortimicins)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素、奈替米星(netilmicin)、核糖霉素(ribostamycin)、西索米星(sisomicin)、壮观霉素(spectinomycin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin))、β-内酰胺类(例如，亚胺培南(imipenem)、美罗培南(meropenem)、比阿培南(biapenem)、头孢克洛(cefaclor)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢羟唑(cefamandole)、头孢曲秦(cefatrizine)、头孢西酮(cefazedone)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢克肟(cefixime)、头孢甲肟(cefmenoxime)、头孢地秦(cefodizime)、头孢尼西(cefonicid)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢雷特(ceforanide)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢替安(cefotiam)、头孢咪唑(cefpimizole)、头孢匹胺(cefpiramide)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢磺啶(cefsulodin)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢特仑(cefteram)、头孢替唑(ceftezole)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢唑南(cefuzonam)、cephaacetrile、头孢氨苄(cephalexin)、头孢来星(cephaloglycin)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢噻吩(cephalothin)、头孢匹林(cephapirin)、头孢拉定(cephradine)、头孢美唑(cefinetazole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢替坦(cefotetan)、氨曲南(azthreonam)、卡芦莫南(carumonam)、氟氧头孢(flomoxef)、拉氧头孢(moxalactam)、美西林(amidinocillin)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄青霉素(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄青霉素(carbenicillin)、苄青霉素(benzylpenicillin)、卡非西林(carfecillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、甲氧西林(methicillin)、美洛西林(mezlocillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素G(penicillin G)、哌拉西林(piperacillin)、磺苄西林(sulbenicillin)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin)、头孢托仑(cefditoren)、SC004、KY-020、头孢地尼(cefdinir)、头孢布烯(ceftibuten)、FK-312、S-1090、CP-0467、BK-218、FK-037、DQ-2556、FK-518、头孢唑兰(cefozopran)、ME1228、KP-736、CP-6232、Ro 09-1227、OPC-20000、LY206763)、利福霉素(rifamycins)、大环内酯类(macrolides)(例如阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、红霉素(erythromycin)、竹桃霉素(oleandomycin)、罗他霉素(rokitamycin)、罗沙米星(rosaramicin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin))、酮内酯类抗生素(ketolides)(例如泰利霉素(telithromycin)、喹红霉素(cethromycin))、香豆霉素(coumermycins)、林可酰胺类抗生素(lincosamides)(例如，克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)和氯霉素(chloramphenicol)。
说明性抗病毒药包括硫酸阿巴卡韦(abacavir sulfate)、阿昔洛韦钠(acyclovirsodium)、盐酸金刚烷胺(amantadine hydrochloride)、安普那韦(amprenavir)、西多福韦(cidofovir)、甲磺酸地拉韦啶(delavirdine mesylate)、地达诺新(didanosine)、依非韦伦(efavirenz)、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生钠(fomivirsen sodium)、膦甲酸钠(foscarnet sodium)、更昔洛韦(ganciclovir)、硫酸茚地那韦(indinavir sulfate)、拉米夫定(lamivudine)、拉米夫定/齐多夫定(zidovudine)、甲磺酸奈非那韦(nelfinavirmesylate)、奈韦拉平(nevirapine)、磷酸奥司他韦(oseltamivir phosphate)、利巴韦林(ribavirin)、盐酸金刚乙胺(rimantadine hydrochloride)、利托那韦(ritonavir)、沙奎那韦(saquinavir)、甲磺酸沙奎那韦(saquinavir mesylate)、司他夫定(stavudine)、盐酸万乃洛韦(valacyclovir hydrochloride)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、和齐多夫定。
抗阿米巴药或抗原虫药的非限制性实例包括阿托伐醌(atovaquone)、盐酸氯喹(chloroquine hydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、甲硝唑(metronidazole)、盐酸甲硝唑(metronidazole hydrochloride)、和喷他脒羟乙磺酸盐(pentamidine isethionate)。驱肠虫药可以是选自以下的至少一种：甲苯达唑(mebendazole)、双羟萘酸噻嘧啶(pyrantel pamoate)、阿苯达唑(albendazole)、伊维菌素(ivermectin)和噻苯达唑(thiabendazole)。说明性抗真菌剂可以选自两性霉素B(amphotericin B)、两性霉素B胆固醇硫酸酯复合物(amphotericin B cholesterylsulfate complex)、两性霉素B脂质复合物(amphotericin B lipid complex)、两性霉素B脂质体(amphotericin B liposomal)、氟康唑(fluconazole)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素微粒(griseofulvin microsize)、超微粉化灰黄霉素(griseofulvinultramicrosize)、伊曲康唑(itraconazole)、酮康唑(ketoconazole)、制霉菌素(nystatin)、和盐酸特比萘芬(terbinafine hydrochloride)。抗疟药的非限制性实例包括盐酸氯喹(chloroquine hydrochloride)、磷酸氯喹(chloroquine phosphate)、多西环素、硫酸羟基氯喹(hydroxychloroquine sulfate)、盐酸甲氟喹(mefloquinehydrochloride)、磷酸伯氨喹(primaquine phosphate)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)、和乙胺嘧啶-磺胺多辛(pyrimethamine with sulfadoxine)。抗结核药物包括但不限于氯法齐明(clofazimine)、环丝氨酸(cycloserine)、氨苯砜(dapsone)、盐酸乙胺丁醇(ethambutolhydrochloride)、异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福布丁(rifabutin)、利福平(rifampin)、利福喷丁(rifapentine)、和硫酸链霉素(streptomycin sulfate)。
如以上指出的，本发明涵盖一起共施用寡聚体化合物与另外的剂。将理解，在包括施用寡聚体与其他剂的实施方案中，组合中活性物质的剂量可以自身包含有效量，并且另外的剂可以进一步增加对患者的治疗或预防益处。可选地，寡聚体和另外的剂可以一起包含用于预防或治疗癌症的有效量。还将理解，有效量可以在特定治疗方案的背景下定义，特定治疗方案包括，例如，施用的时间和次数、施用方式、制剂等。在一些实施方案中，寡聚化合物和任选地癌症疗法按常规时间表施用。可选地，可以在症状出现时施用癌症疗法。如本文使用的“常规时间表”指预定的指定时间段。常规时间表可以涵盖相同或不同的长度的时间段，只要时间表是预定的。例如，常规时间表可以包括每天、每两天、每三天、每四天、每五天、每六天、每周、每月或期间的任何设定天数或者周数、每两个月、三个月、四个月、五个月、六个月、七个月、八个月、九个月、十个月、十一个月、十二个月等施用寡聚体。可选地，预定的常规时间表可以包括第一周每天同时施用寡聚体化合物和癌症疗法，随后每月施用持续数月，并且然后在此之后每三个月施用。只要事先确定适当的时间表包括某一天的施用，任何特定的组合均将被常规时间表涵盖。
对于本发明的治疗方法中使用的任何化合物，治疗有效剂量可以最初从细胞培养测定估计。例如，可以在动物模型中配制剂量以达到循环浓度范围，所述循环浓度范围包括如在细胞培养中确定的IC50(例如，实现肿瘤细胞增殖的半数最大抑制的活性剂的浓度)。这些信息可用于更精确地确定人体中的有用剂量。
给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和响应性，疗程持续从若干天到若干月，或直至实现治愈或取得疾病状态的减少。最佳给药时间表可从患者体内药物累积的测量结果计算。普通技术人员可以容易地确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可以根据单独寡聚体化合物的相对效力而变化，并且可以通常基于发现在体外和体内动物模型中有效的EC50来评价。通常，剂量为从0.01μg至100g/kg体重，且可以每日一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次、每年一次或更多次地被提供。本领域普通技术人员可以基于测量的体液或组织中药物的停留时间和浓度容易地评价用于给药的重复频率。在成功治疗之后，让患者经历维持疗法以阻止疾病状态的复发可以是可期望的，在所述维持疗法中寡核苷酸以维持剂量施用，范围从0.01μg至100g/kg体重，每日一次或更多次、每周一次或更多次、每月一次或更多次、或每年一次或更多次。对于双链化合物，必须计算剂量以解释第二链的核酸载量增加(如同包含两条分开的链的化合物)或另外的核酸长度(如同具有双链区的自身互补单链))。
在一些实施方案中，并且取决于预期的施用方式，包含寡聚体的组合物将通常包含约0.000001％至90％、约0.0001％至50％、或约0.01％至约25％按重量计的寡聚体，剩余物(remainder)是合适的药物载体或稀释剂等。寡聚体的剂量可以取决于多种因素，诸如施用方式，受影响的受试者的物种、年龄、性别、体重和一般健康状况，并且可以由本领域技术人员使用标准方案容易地确定。剂量还将考虑寡聚体与其靶分子(例如，THOC4或SSB1)的结合亲和力，其生物利用度及其体内和药代动力学特性。在这方面，用于施用的剂的精确量还可以取决于从业者的判断。在确定在治疗或预防癌症时待施用的剂的有效量时，医师或兽医可以评价疾病或状况随时间的进展。在任何情况下，本领域技术人员可以容易地确定寡聚体的合适剂量而无需过度实验。施用至患者的活性物质的剂量应该足以在患者中随时间推移产生有益响应，诸如减少、消除或预防肿瘤细胞的形成、增殖、存活、存活力或维持，和/或治疗和/或预防癌症。剂量可以以合适的间隔施用以改善癌症的症状。此类间隔可以使用本领域技术人员已知的例行程序确定，并且可以根据所采用活性剂的类型及其制剂而变化。例如，间隔可以是每天、每隔一天、每周、每两周、每月、每两个月、每季度、每半年或每年。
剂量的量和间隔可以被单独调整以提供足以维持寡聚体作用的活性剂的血浆水平。用于全身施用的通常患者剂量范围为从1-2000mg/天，通常为从1-250mg/天，且通常为从10-150mg/天。按照患者体重来表示，通常剂量范围为从0.02-25mg/kg/天，通常为从0.02-3mg/kg/天，通常为从0.2-1.5mg/kg/天。按照患者身体表面面积来表示，通常剂量范围为从0.5-1200mg/m2/天，通常为从0.5-150mg/m2/天，通常为从5-100mg/m2/天。
寡聚体药物的毒性和治疗效力可以通过细胞培养物物或实验动物中的标准药物程序，例如，用于确定LD50(对50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)来确定。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数，并且其可以被表示为比率LD50/ED50。表现出大治疗指数的化合物为优选的。通过这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人体的剂量范围。优选地，此类化合物的剂量处于包括具有很少毒性或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。剂量可根据所使用的剂型和利用的施用路径而在该范围内变动。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医师鉴于患者的状况选择。(参见，例如，Fingi等,1975,于:The Pharmacological Basis of Therapeutics，第1章，第1页中)。
可选地，人们可以通常以长效制剂或持续释放制剂以局部而非全身方式例如，经由将化合物直接注射到组织中施用寡聚体化合物，所述组织优选地为皮下或网膜组织。
另外，人们可以以靶向药物递送系统，例如，以用组织特异性抗体涂覆的脂质体施用寡聚体化合物。脂质体将被靶向至组织并且被组织选择性地吸收。
在局部施用或选择性摄取的情况下，寡聚体化合物的有效局部浓度可以与血浆浓度不相关。
为了可以容易地理解并实践本发明，现在将通过以下非限制性实施例的方式来描述特定的优选实施方案。
实施例
实施例1
非靶向寡聚体化合物的肿瘤调节作用
设计了不被认为靶向肿瘤细胞的转录物组的修饰的RNA寡聚体化合物。修饰包括硫代磷酸酯骨架(*)和2-O'-甲基修饰(m)(如表3中指示的)，并且用前缀‘LSA’命名。所有序列均从Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,Australia)订购。
使用Lipofectamine 2000将寡聚体化合物以100nM或50nM最终浓度转染到癌细胞系HeLa、U2OS、LNCAP、MCF7、A549和H460中。与用对照化合物处理的细胞相比，这种处理导致到20-36小时大多数细胞死亡，如通过用LSA化合物处理的细胞的较低的细胞汇合和粘附示出的(参见图1)。
免疫印迹分析显示处理细胞的40％-50％的hSSB1多肽产生降低以及PARP1裂解和H2AX磷酸化增加(图2)。PARP1在凋亡期间被裂解，并且yH2AX特异性地标记基因组内的DNA断裂，分别确认在用非靶向寡聚体处理的细胞中凋亡和DNA损伤的存在。
实施例2
非靶向寡聚体化合物和反义化合物对肿瘤细胞毒性的比较
将实施例1中描述的非靶向寡聚体与反义寡聚体进行肿瘤细胞毒性比较。将反义寡聚体设计为具有与非靶向寡聚体相同的骨架化学组成，并且具有靶向hSSB1序列的特异性。用于该研究的寡聚体的序列示于表4中，其中非靶向化合物用前缀‘LSA’命名，且反义化合物用前缀‘ASO'命名。所有序列均从Sigma-Aldrich(Castle Hill,NSW,Australia)订购。
如通过PARP裂解和H2AX诱导显示的，非靶向寡聚体(LSA)和反义寡聚体(ASO)两者均诱导细胞毒性(图3)。值得注意的是，用非靶向寡聚体和反义寡聚体转染的细胞中hSSB1蛋白水平也被降低。
设计另外的非靶向寡聚体和反义寡聚体化合物，并且使用IncuCyte动力学活细胞成像系统在一组癌细胞系中筛选毒性。这些寡聚体示于表5中。
简言之，将细胞接种在微孔板中，并且在24小时后用LSA或ASO寡聚体(100nM)转染，并且立即装载到IncuCyte ZOOM系统中。经由相差显微术每1-2小时收集图像持续72小时的时间段。使用IncuCyte ZOOM软件分析数据。细胞增殖通过监测细胞汇合随时间推移的百分比来测量，如图4中的代表性寡核苷酸示出的。表5中列出的41种寡聚体化合物被评分为3＝高度有毒的、2＝中等有毒的、1＝轻微有毒的和0＝无毒的，并且这似乎不依赖于LSA或ASO取向。
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实施例3
寡聚体化合物与SSB1和THOC4结合
将生物素化的非靶向化合物LSA-IN3E3和阴性对照寡聚物化合物NEGC与细胞裂解物一起孵育。相互作用的蛋白使用链霉抗生物素蛋白珠提取，所述链霉抗生物素蛋白珠与生物素化的化合物结合。洗涤珠并且通过SDS-PAGE分离相互作用的蛋白，用考马斯R250染色并且将条带切离用于质谱鉴定胰蛋白酶消化的片段。其中，在质谱分析中鉴定的蛋白为单链DNA修复蛋白hSSB1和mRNA转运蛋白THOC4。THOC4为TREX复合物的32-kDa蛋白组分，该复合物偶联mRNA转录、加工和核输出。THOC4包含RNA识别基序(RRM)(一种单链RNA结合结构域)，其可能潜在地介导与本文描述的寡聚体化合物的结合。
为了确认这种相互作用，使用有效引起细胞死亡的寡聚体化合物(LSA_In3E3,Open_A_1,cdca3_L_ATG-3和ASO_E3E4)和在细胞中相对无毒的寡聚体化合物(Neg_C,LSA_In3E3_CT5＝突变形式的In3LSA,Open_L_1和cdca3_A_ATG-3)进行电迁移率测定(EMSA)。将寡聚化合物用FAM或Cy5标记，与不同量的hSSB1或THOC4一起孵育，并且结合的和游离的寡聚体通过天然凝胶电泳分离。值得注意的是，hSSB1和THOC4两者均延迟了具有比无毒寡聚体显著更高的亲和力的肿瘤调节寡聚体的迁移，表明这两种蛋白可能参与观察到的表型(参见图5)。THOC4的解离常数(KD)示于表6中，并且hSSB1的解离常数(KD)示于表7中(使用GraphPad Prism中的非线性回归确定的KD值)。将纯化的hSSB1或THOC4蛋白与10nmol标记的寡聚体在37℃在由10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、0.01％IGEPAL、1mM EDTA和100ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的10％PAGE凝胶上电泳60min将样品分离。
表6
寡聚体 标记物 细胞死亡 KD(nM)
LSA_In3E3 Fam 3 81
Neg_C Fam 0 150
LSA_In3E3_CT5 Fam 0 125
Open_A_1 Fam 3 52
Open_L_1 Fam 0 104
cdca3_A_ATG-3 Fam 0 134
cdca3_L_ATG-3 Cy5 3 58
ASO_E3E4 Cy5 2 70
表6总结了用THOC4和八种不同的寡聚体化合物进行的一式三份EMSA实验的结果。显示了单独THOC4：寡聚体相互作用的解离常数(KD，50％寡核苷酸与蛋白结合平衡时的蛋白浓度)。如可见的，THOC4以约50nM至80nM的KD与肿瘤调节寡聚体结合，且以150nM的KD与阴性对照寡聚体结合。KD值通过电泳迁移率变动测定(EMSA)确定。将纯化的THOC4蛋白与10nmol标记的寡聚体在37℃在由10mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl、0.01％IGEPAL、1mMEDTA和100ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的10％PAGE凝胶上电泳60min将样品分离。通过绘制游离未结合的寡聚体对蛋白浓度的量，使用GraphPad Prism中的非线性回归确定KD值。
在单独的实验中，发现具有改进的溶解度的GST-THOC4衍生物在相同条件下THOC4以约11nM的KD结合肿瘤调节寡聚体。
表7
寡聚体 标记物 细胞死亡 KD(nM)
LSA_In3E3 Fam 3 3
Neg_C Fam 0 9
表7总结了用hSSB1和两种不同的寡聚体化合物进行的一式三份EMSA实验的结果。显示了单独THOC4：寡聚体相互作用的解离常数(KD，50％寡核苷酸与蛋白结合平衡的蛋白浓度)。如可见的，hSSB1以约3nM的KD与肿瘤调节寡聚体结合，且以9nM的KD与阴性对照寡聚体结合。KD值通过电泳迁移率变动测定(EMSA)确定。将纯化的hSSB1蛋白与10nmol标记的寡聚体在37℃在由10mM Tris-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、0.01％IGEPAL、1mM EDTA和100ng/μL BSA组成的缓冲液中一起孵育15min。通过在4℃在80V在TBE缓冲液中的10％PAGE凝胶上电泳60min将样品分离。通过绘制游离未结合的寡聚体对蛋白浓度的量，使用GraphPadPrism中的非线性回归确定KD值。
实施例4
寡聚体化合物抑制细胞基因表达和MRNA易位
基于THOC4参与转录和mRNA输出，使用Lipofectamine 3000(Life Technologies)进行GFP报告物基因表达测定，其中用100nM ASO/LSA转染凋亡耐受HeLa-BCL2细胞(以避免凋亡的偏倚)。在5小时后，使用Fugene9(Roche)用GFP报告物质粒转染细胞，并且在GFP转染后20小时，使用高通量Cytell细胞成像系统分析荧光信号。使用仅GFP质粒转染的细胞作为比较(GFP)。如图6中示出的，已知诱导细胞死亡的非靶向寡聚体(LSA)和反义寡聚体(ASO)也显示出显著降低的GFP荧光，而无毒ASO/LSA不影响GFP表达。该结果表明诱导细胞死亡的ASO/LSA通过耗尽TREX复合物的组分导致干扰总体转录而这样做。这继而导致DNA损伤和细胞死亡。
通过mRNA荧光原位杂交(FISH)实验在用IN3LSA或NEGC转染的细胞中研究总体mRNA输出。结果显示多聚A mRNA(以红色染色)的细胞核输出在用In3LSA转染但不转染NEGC的细胞中被抑制(参见图7)。这确认了TREX复合物被In3LSA寡聚体抑制。
实施例5
用于鉴定基本特征的候选寡聚体的高含量筛选
进行高含量筛选以鉴定本发明的肿瘤调节寡聚体序列的效力和与THOC4和/或hSSB1结合所需的最小长度、化学组成、嘧啶/嘌呤含量。使用Live-Dead方案在HeLa和U2OS细胞中使用Incell 2200平台筛选总计305种不同的寡聚体，所述Live-Dead方案组合荧光染色Hoescht 33342(细胞渗透的，染色活细胞和死细胞)和碘化丙啶(PI，细胞不可渗透的，染色晚期凋亡和死亡细胞)。分析细胞的：总细胞计数、凋亡细胞核和碘化丙啶(PI)染色，且结果报告为在用寡聚体化合物处理之后24小时测量的凋亡(片段化)细胞核和PI阳性细胞(晚期凋亡或死亡)的百分比。
使用表面等离子体共振(SPR)进行寡聚体与THOC4或hSSB1的结合，其中将纯化的重组THOC4或hSSB1蛋白偶联至SPR芯片的表面，并且使寡聚体以在由20mM Tris-HCl(pH8.0)、100mM NaCl和0.01％IGEPAL组成的缓冲液中从2nM至16μM范围的浓度通过该表面。
来自该高含量筛选的结果总结于表8中。
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寡聚体长度
将有效的肿瘤调节寡聚体(例如，open_A和ATG_LSA)的尺寸从20个核碱基增加至30个核碱基，降低或完全消除肿瘤调节表型。将尺寸减小至15个或10个核碱基也降低或消除了表型。当尺寸递增地降低时，通过从5'或3’末端去除一个核碱基，对于从任一末端去除前4-5个核碱基，效力被维持，对于随后去除后续核碱基，效力逐渐减少(参见表8)。相似地，当从每一个末端同时去除一个核碱基时，在去除6个核碱基之后丧失效力。探索寡聚体长度对肿瘤调节活性的影响的结果总结于图8中。这些发现表明，维持LSA寡聚体化合物效力所需的最小尺寸为14个-16个核碱基，且最大尺寸为28个-29个核碱基。
化学组成
使用ZEN化学法(IDT专有)合成寡聚化合物，所述寡聚化合物包含完全2'-O-甲基修饰的糖核碱基骨架，在寡聚体末端处或其附近具有两个内部ZENTM修饰。2'-O-甲基残基赋予对内切核酸酶降解的耐受性并且增加对RNA靶的结合亲和力，而ZEN修饰阻断外切核酸酶降解并且进一步增加结合亲和力。这些化合物在本文中被称为ZEN寡聚体。对应于诱导细胞死亡的LSA寡聚体序列的所有ZEN寡聚体完全丧失诱导细胞死亡的效力。另外，不具有核碱基的其他修饰的磷酸二酯(PD)骨架，或具有完全2'-O-甲基修饰的糖核碱基的PD骨架完全消除了杀伤作用。维持完全2'-O-甲基修饰但在寡聚体的每一个末端上仅存在三个硫代磷酸酯(PS)残基削弱了杀伤作用，在寡聚体的中间部分中具有未修饰的DNA的gapmer也是如此。得出的结论是，优选地具有完全PS骨架且任选地无其他修饰的寡聚化合物是维持且甚至增加寡聚体杀伤作用以及与THOC4和hSSB1中的一种或两种结合所需的优选的化学组成(参见表8)。
嘧啶/嘌呤含量
来自筛选的结果显示，寡聚体化合物对于肿瘤调节活性需要50％的最小嘌呤含量、或者对于肿瘤调节活性需要45％的最小嘌呤含量，以及50％的最小GC含量，并且在肿瘤调指活性与增加的嘌呤含量之间存在正相关。然而，单独的嘌呤含量不足以预测活性，因为具有高嘌呤含量的一些寡聚体化合物是无效的。被设计为仅包含嘌呤(A和G)或嘧啶(C和U)的寡聚体也是无效的，表明活性需要核碱基的混合物(参见表8)。探索嘌呤含量对肿瘤调节活性的影响的结果总结于图9中。
来自文献的许多反义寡聚化合物(其中的一些当前正处于多种状况(包括癌症)的临床试验中(BCL2 Oblimersen、SMN2-N1、肌养蛋白、簇集素、存活蛋白、EIF4EASO4、Hsp27、Stat3))被修改以匹配本文描述的寡聚体化学组成并且筛选活性。具体地，这些修饰的文献寡聚体被设计为具有完全PS骨架和完全2'-O-甲基修饰的核碱基，并且将这些寡聚体与一些测试的最有效的LSA寡聚体IN3LSA、ATG_LSA或Open_A进行比较。在所测试的修饰的文献寡聚化合物中，与本文公开的寡聚体IN3_LSA、ATG_LSA或Open_A相比，仅一种寡聚体，肌养蛋白和一种对照寡聚体HSP27 mm被评为3的最高死亡评分，其中与IN3_LSA、ATG_LSA或Open_A相比，大多数修饰的文献寡聚体显示出较弱的诱导细胞死亡能力(评分为2或1)(参见表8)。
实施例6
寡聚体化合物抑制体内肿瘤细胞生长
体内研究
在前列腺异种移植模型中体内测试非靶向寡聚体。具体地，将6周龄的SCID雄性小鼠皮下注射C42B前列腺癌细胞。在肿瘤达到50mm3的体积后，用两种肿瘤调节非靶向寡聚体In3LSA和ATGLSA以及无效对照序列和PBS治疗小鼠。寡聚体药物通过每周两次以80mg/kg的剂量静脉内注射施用，持续四周。在治疗时间期间通过卡尺测量监测肿瘤生长。与对照(ctrl)和PBS治疗的小鼠(图11)相比，观察到IN3LSA(In3)和ATGLSA(ATG)治疗的小鼠的肿瘤生长的统计学显著的延迟(参见图10)，这证明这些非靶向寡聚体对治疗的小鼠不具有显著的毒性。
在治疗时间期间，监测小鼠重量，但与对照(ctrl)和PBS治疗的小鼠相比，在IN3LSA(In3)与ATGLSA(ATG)治疗的小鼠之间未观察到重量减轻的显著差异。值得注意的是，对于IN3LSA和ATGLSA治疗组的具有最明显降低的肿瘤的小鼠未观察到重量减轻(图12)，表明图11中观察到的重量减轻很可能是由于肿瘤负荷。
实施例7
寡聚体化合物在体内被肿瘤细胞摄取
在腹腔内和静脉内递送之后，通过注射荧光标记的IN3LSA寡聚体并且监测小鼠7天来研究肿瘤部位中寡聚体化合物的摄取。如图13中示出的，i.p.注射之后未检测到荧光信号。然而，在i.v.注射之后的信号在肿瘤部位处高了几个对数级，并且重要的是，注射后信号持续7天，表明LSA寡聚体选择性地在肿瘤部位处积累。这些结果与图14中示出的整个小鼠成像分析一致。
实施例8
寡聚体化合物通过包含寡核苷酸/寡糖结合(OB)折叠的蛋白家族起作用
将FAM标记的非靶向PS化合物，LSA_In3E3、PD化合物、DNA_In3E3和RNA_In3E3以及阴性对照寡聚体化合物NEGC分别与纯化的小鼠SSB1(mSSB1)、hSSB1和人类SSB2(hSSB2)蛋白一起孵育。结合的和游离的寡聚体通过天然凝胶电泳分离，并且如图15和图16以及表9-10中示出的，OB-折叠蛋白、mSSB1、hSSB1和hSSB2以比无毒寡聚体(DNA_In3E3、RNA_In3E3和NEGC)大得多的水平延迟肿瘤调节寡聚体(LSA_In3E3)迁移，表明肿瘤调节寡聚体对OB-折叠蛋白比无毒寡聚体具有显著更高的亲和力。
表9
表9总结了用mSSB1和三种不同的寡聚体化合物(如下文列出的)进行的一式三份EMSA实验的结果。显示了单独的mSSB1:寡聚体相互作用的解离常数(KD，50％寡核苷酸与蛋白结合平衡的蛋白浓度)。
用于表9的寡聚体化合物如下：
a)LSA_IN3E3＝mC*mC*mA*mG*mU*mG*mA*mG*mC*mC*mG*mG*mA*mC*mU*mU*mG*mC*mC*Mu[SEQ ID NO:5]
其中m表示2'-甲基修饰的碱基，且*表示PS核苷间连键；
b)DNA_In3E3＝dCdCdAdGdUdGdAdGdCdCdGdGdAdCdUdUdGdCdCdU[SEQ ID NO:306]，
其中d表示脱氧核糖核苷，并且寡聚体包含PD核苷间连键；以及
c)NEGC＝mC*mU*mC*mA*mU*mU*mC*mC*mU*mA*mC*mC*mG*mA*mC*mA*mC*mC*mC*mC[SEQ ID NO:4]，
其中m表示2'-O甲基修饰的碱基，且*表示PS核苷间连键。
表10
表10总结了用hSSB1和四种不同的寡聚体化合物(如下文列出的)进行的一式三份EMSA实验的结果。显示了单独的mSSB1:寡聚体相互作用的解离常数(KD，50％寡核苷酸与蛋白结合平衡时的蛋白浓度)。
用于表10的寡聚体化合物如下：
a)LSA_In3E3＝mC*mC*mA*mG*mU*mG*mA*mG*mC*mC*mG*mG*mA*mC*mU*mU*mG*mC*mC*Mu[SEQ ID NO:5]
其中m表示2'-甲基修饰的碱基，且*表示PS核苷间连键；
b)DNA_In3E3＝dCdCdAdGdUdGdAdGdCdCdGdGdAdCdUdUdGdCdCdU[SEQ ID NO:306]，
其中d表示脱氧核糖核苷，并且寡聚体包含PD核苷间连键；
c)RNA_In3E3＝rCrCrArGrUrGrArGrCrCrGrGrArCrUrUrGrCrCrU[SEQ ID NO:307]，其中r表示核糖核苷，并且寡聚体包含PD核苷间连键；
d)NEGC＝mC*mU*mC*mA*mU*mU*mC*mC*mU*mA*mC*mC*mG*mA*mC*mA*mC*mC*mC*mC[SEQ ID NO:4]，
其中m表示2'-O甲基修饰的碱基，且*表示PS核苷间连键。
实施例9
筛选具有更大HSSB1结合亲和力的寡聚体的分子模拟
对hSSB1具有更大结合亲和力的寡聚体化合物也可以使用原子分子动力学模拟(Atomistic Molecular Dynamics)(AMD)模拟利用软件诸如Symbios的OpenMM来确定。可以进行数百个查询序列的模拟，并且为每一个查询序列确定结合的自由能。图17证明ATGLSA(杀伤序列)以比NegC(非杀伤序列)低的结合自由能与hSSB1结合，提供了关于序列之间致死率差异的见解，并证明了AMD模拟用于进一步药物开发的应用。此类模拟软件可以用于筛选具有较低结合自由能，并且因此对hSSB1具有更大的结合亲和力的寡聚体化合物，提供了可以具有增加的致死率和降低的脱靶效应的改进的药物序列的候选列表。
图17的A和B显示比起对核苷酸本身人类hSSB1对NEGC寡聚体的硫代磷酸酯骨架表现出更大的亲和力，这使得碱溶剂暴露。hSSB1与ATGLSA具有更有利的相互作用，使得暴露的核苷酸溶剂更少。当暴露于溶剂时，这些核苷酸将与水相互作用，并且这使得结合沟对溶剂开放，这将削弱与寡聚体的相互作用。图17的C和D显示ATGLSA维持其与SSB1的结合沟的相互作用所需的能量较少，表明结合能比NEGC低521KJ/mol。在图17的D中可以观察到这种结合能如何随模拟而变化，这表明ATGLSA的结合能始终比其核苷酸序列的低，而NEGC具有几乎与其未修饰序列匹配的结合能。
实施例10
寡聚体化合物在肺癌异种移植物模型中体内抑制肿瘤细胞生长
使用H460肺癌细胞系在肺癌异种移植物模型中体内测试非靶向寡聚体。具体地，将6周龄SCID雄性小鼠(动物资源中心(Animal Resources Centre)-ARC,Canning Vale,WA)在侧腹皮下注射200万个表达萤光素酶的H460肺癌细胞。随后通过触诊、卡尺测量和用IVIS扫描系统测量肿瘤生物发光信号监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均50mm3时，将小鼠随机并入到PBS(媒介物对照)组或肿瘤调节非靶向寡聚体ATGLSA组(n＝8只小鼠/治疗组)。将寡聚体ATGLSA在PBS(Life Technologies)中稀释，并且每周两次以80mg/kg的剂量经由静脉内(i.v.)注射施用，持续四周(总计8次注射)。在治疗过程期间，通过卡尺测量监测小鼠的重量和肿瘤生长(由公式V＝A/2×B2计算的体积，其中A＝长度>B＝宽度，以mm计)和IVIS扫描生物发光信号。观察到与PBS治疗的小鼠相比，ATGLSA(ATG)治疗的小鼠的肿瘤生长的统计学显著的延迟(参见图18)，这证明这些非靶向寡聚体在肺癌异种移植模型中具有恒化作用(chemostatic effect)。
通过肿瘤的萤光素酶活性确认肿瘤体积的这种差异。在治疗第14天的IVIS扫描显示与对照PBS组相比，ATGLSA治疗组的生物发光信号较低(图19)。
在治疗过程期间，每周两次监测小鼠重量。在用PBS或ATGLSA治疗的动物中未观察到显著的重量减轻或状况丧失，证明这些非靶向寡聚体在治疗的小鼠中不具有显著的毒性(参见图20)。
实施例11
寡聚体化合物在顺铂耐受肺癌中体外抑制肿瘤细胞生长
将顺铂敏感的H460肺癌细胞系在3个月的时间段内暴露于递增剂量的顺铂以产生顺铂耐受细胞系。当在体外测试时，通过使用Incucyte zoom系统在添加非靶向寡聚体ATGLSA(100nM)后48小时内测量细胞增殖，比起亲本H460细胞系，ATGLSA更有效地杀伤顺铂耐受H460细胞系(图21)。
实施例12
寡聚体化合物在顺铂耐受肺癌中体内抑制肿瘤细胞生长
使用顺铂耐受H460肺癌细胞系在肺癌异种移植物模型中体内测试非靶向寡聚体。具体地，将6周龄SCID雄性小鼠(动物资源中心-ARC,Canning Vale,WA)在侧腹皮下注射200万个表达萤光素酶的顺铂耐受H460肺癌细胞。随后通过触诊、卡尺测量和用IVIS扫描系统测量肿瘤生物发光信号监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均50mm3时，将小鼠随机并入到PBS(媒介物对照)组或肿瘤调节非靶向寡聚体ATGLSA组(n＝8只小鼠/治疗组)。将寡核苷酸ATGLSA在PBS(Life Technologies)中稀释，并且每周两次以80mg/kg的剂量经由静脉内(i.v.)注射施用，持续四周(总计8次注射)。在治疗过程期间，通过卡尺测量监测小鼠的重量和肿瘤生长(由公式V＝A/2×B2计算的体积，其中A＝长度>B＝宽度，以mm计)和IVIS扫描生物发光信号。观察到与PBS治疗的小鼠相比，ATGLSA(ATG)治疗的小鼠的肿瘤生长的统计学显著的延迟(参见图22)，这证明这些非靶向寡聚体在顺铂耐受肺癌异种移植模型中具有恒化作用。
肿瘤体积差异也通过肿瘤细胞的萤光素酶活性验证，如通过IVIS扫描每一个肿瘤的生物发光信号测量的(图23)。
本发明人在治疗时间内未观察到ATGLSA治疗组群中的任何重量减轻，它们也未辨别出用PBS或ATGLSA治疗的动物之间的行为或状况的任何差异。这些结果与亲本H460异种移植物实验一致(图24)。
实施例13
ATGLSA在顺铂敏感和顺铂耐受肺癌模型中的体内长期作用
为了评价ATGLSA治疗的长期作用，在停止4周治疗后监测肿瘤生长和小鼠重量，直至肿瘤达到1000mm3的最终体积并且产生Kaplan-Meier图形。在顺铂敏感的H460模型中，与对照组相比，4周ATGLSA治疗导致ATGLSA治疗组中的小鼠中位存活的统计学显著的41％的增加(14天)(图25和表11)。
表11
用对照PBS与ATGLSA治疗的患有顺铂敏感H460和顺铂耐受肺H460肿瘤的SCID雄性小鼠的中位存活
在顺铂耐受H460模型中，观察到ATGLSA治疗组群中增加37.5％(18天)的中位存活(图26)，然而，ATGLSA与PBS对照组之间的差异在Rank-Log检验中无统计学意义(表11)。
实施例14
体内肺癌异种移植物模型中的ATGLSA与顺铂治疗的组合
使用顺铂敏感H460肺癌细胞系在肺癌异种移植物模型中体内测试非靶向寡聚体。具体地，将6周龄SCID雄性小鼠(动物资源中心-ARC,Canning Vale,WA)在侧腹皮下注射200万个表达萤光素酶的顺铂耐受H460肺癌细胞。随后通过触诊、卡尺测量和用IVIS扫描系统测量肿瘤生物发光信号监测小鼠的肿瘤生长。当肿瘤体积达到平均50mm3(92％肿瘤摄取)时，将小鼠随机并入到PBS对照组、ATGLSA组、顺铂组或组合ATGLSA+顺铂组。将寡核苷酸ATGLSA在PBS(Life Technologies)中稀释，并且每周两次以80mg/kg的剂量经由静脉内(i.v.)注射施用。通过腹腔内注射(4mg/kg)每周一次注射顺铂(在以1mg/kg的盐水悬浮液中，Hospira)。组合治疗组每周接受2×ATGLSA(80mg/kg)i.v注射和1次顺铂(4mg/kg)i.p注射。在治疗3周之后，与PBS相比，所有治疗组群均具有显著更低的肿瘤生长，然而，ATGLSA(ATG)、顺铂与组合ATGLSA+顺铂(Combo)治疗组群之间的肿瘤生长不存在显著差异(图27)。在治疗后3周时，本发明人在组之间切换治疗(图28，虚线)：将ATGLSA治疗的小鼠切换为顺铂(4mg/kg，一周一次，i.p)，将顺铂治疗的小鼠切换为ATGLSA(80mg/kg，i.v，一周两次)，并且组合ATGLSA+顺铂小鼠(Combo)变为对照PBS组(150μLPBS,i.v，一周两次)。我们在‘顺铂第一/ATGLSA第二'治疗的小鼠中观察到显著的肿瘤生长延迟，在治疗的第一天没有肿瘤生长。
还监测每一只动物的体重以检查该治疗是否可以在体内诱导任何急性毒性。观察到与PBS相比，ATGLSA(ATG)化合物在治疗3周时对小鼠重量减轻不具有显著影响，而在顺铂治疗的小鼠中观察到显著的重量减轻。这表明ATGLSA虽然以与顺铂相同的速率减缓肿瘤生长，但未对动物造成明显的不良毒性。此外，当将顺铂治疗切换为ATGLSA时，在切换之后直接观察到小鼠重量的统计学显著增加。这种增加在其余治疗中保持稳定。总之，数据显示ATGLSA对肺癌肿瘤和已经对顺铂发展耐受性的肺癌肿瘤具有恒化作用。数据还显示，顺铂后用ATGLSA的顺序治疗比同时施用的两种药物更有效。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用以其整体并入本文。
本文中任何参考文献的引用不应被理解承认该参考文献是本申请的“现有技术”。
在整个说明书中，目的是描述本发明的优选实施方案，而不是将本发明限制于任何一个实施方案或指定的特征集合。因此，本领域技术人员将理解，根据本公开内容，在不脱离本发明的范围的情况下，可以在所示例的特定实施方案中进行各种修改和改变。所有这样的修改和改变被意图包括于所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种核酸寡聚体，其特征在于：
a)骨架，其中所述骨架的所有核苷间连键是硫代磷酸酯核苷间连键；
b)至少约45％的嘌呤含量以及至少约50％的鸟苷-胞嘧啶(GC)含量；以及
c)不多于29个核碱基的长度，其中所述核酸寡聚体包含SEQ ID NO:1中列出的核碱基序列，
其中所述寡聚体与THO复合物亚基4(THOC4)蛋白和单链DNA结合蛋白1(SSB1)中的一种或两种结合。
2.根据权利要求1所述的核酸寡聚体，其中所述寡聚体的所述骨架包含至少1个2'-O-烷基修饰的糖部分。
3.根据权利要求2所述的核酸寡聚体，其中所述寡聚体的所有糖部分各自为2'-O-烷基修饰的糖部分。
4.根据权利要求2所述的核酸寡聚体，其中所述2'-O-烷基修饰的糖部分为2'-O-甲基核苷。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸寡聚体，其中所述核酸寡聚体的核碱基序列在SEQ ID NO:1中列出。
6.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至5中任一项所述的核酸寡聚体以及药学上可接受的载体。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，还包含至少一种辅助剂，所述辅助剂选自抗感染剂、化学治疗剂和免疫治疗剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述抗感染剂选自抗生素、抗阿米巴药、抗真菌药、抗原虫药、抗疟药、抗结核药和抗病毒药。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述化学治疗剂选自抗增殖药物和/或抗肿瘤药物、细胞生长抑制剂、抑制癌细胞侵袭的剂、生长因子功能抑制剂、抗血管生成剂和血管损伤剂。
10.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述免疫治疗剂选自细胞因子、细胞因子-表达细胞和抗体。
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