KR20200028392A - 질환의 치료를 위한 sting-의존성 활성화제 - Google Patents

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Abstract

본 개시는, 일반적으로, STING (인터페론 유전자의 자극제) 활성을 자극하고 면역 세포의 활성을 증가시키는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 개시된 STING 활성화제 (STAV)는 암 및 다른 면역 매개 병태의 치료에 유용하다.

Description

질환의 치료를 위한 STING-의존성 활성화제
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2017년 6월 12일자 출원된 미국 가출원 제62/518,292호를 우선권 주장하며, 상기 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
전자제출된 자료의 참조로서의 인용
본 출원은, 본 개시의 별도의 부분으로서, 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록 (파일명: 50648A_Seqlisting.txt; 크기: 4,094 바이트; 작성일: 2018년 6월 11일)을 포함하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로서 인용된다.
기술분야
본 개시는, 일반적으로, STING (인터페론 유전자의 자극제(STimulator of INterferon Gene)) 활성을 자극하고 면역 세포의 활성을 증가시키는 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다. 개시된 STING 활성화제 (STAV)는 암 및 다른 면역 매개 병태의 치료에 유용하다.
병원체 침입에 대한 세포의 숙주 방어 반응은 주로 병원체 관련 분자 패턴 (PAMP), 예컨대 항병원체 유전자를 유도하는 지질다당류 또는 편모 단백질을 포함하는 바이러스 핵산 또는 박테리아 세포벽 성분의 검출을 수반한다. 예를 들어, 바이러스 RNA는 막 결합된 톨 유사(Toll-like) 수용체 (TLR) (예를 들어, TLR 3 및 7/8), 또는 레티노산 유도성 유전자 1 (RIG-I) 또는 흑색종 분화 관련 항원 5 (MDA5, 또한 IFIH1 및 헬리카드(helicard)로서 지칭됨)로 지칭되는 TLR-비의존성 세포내 DExD/H 박스 RNA 헬리카아제에 의해 검출될 수 있다. 이러한 사건(event)은 다운스트림 신호전달 사건의 활성화에서 정점에 이르고, 이들 중 다수는 공지되어 있지 않은 채로 남아있으며, 제1형 IFN을 비롯한 NF-κB 및 IRF3/7-의존성 유전자의 전사를 유도한다.
종양 세포 상에 제시된 특정 항원을 인식하는 T 세포의 생성은, 암의 발달을 제거하기 위해 진화된 중요한 숙주 방어 반응을 구성한다 (1). 항원 제시 세포 (APC)의 자극 및 종양 특이적 T 세포의 프라이밍을 강조하는 메카니즘은 해명되야 할 것으로 남아있지만, 면역자극성 제1형 인터페론 (IFN) 및 포식된 세포로부터의 DNA에 의해 촉발된 다른 사이토카인의 생성을 수반하는 것으로 여겨진다 (2-6). 이러한 사건을 통제하는 선천적 면역 경로는 CD8+ 수지상 세포와 같은 식세포 내에서의 STING (인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 수반한다 (7-10). STING은 세포내 박테리아에 의해 분비된 c-디-GMP 또는 c-디-AMP, 또는 시토졸 dsDNA 종과의 회합 후 세포 신타아제 시클릭 GMP-AMP 신타아제 (cGAS)에 의해 생성된 시클릭-GMP-AMP (cGAMP)를 비롯한 시클릭 디뉴클레오티드를 인식한다 (11, 12). 일반적으로, 아폽토시스(apoptosis)를 거치는 비(非)종양형성 세포는 만성 사이토카인 생성으로 인한 치명적인 자가염증성 질환을 야기할 수 있는 사건인 APC의 활성화를 회피하고 (13-15), 아마도 유사한 과정을 채택함으로써, 종양 세포 또한 APC의 활성 및 그에 따른 후속되는 T-세포의 자발적 생성을 회피할 수 있다. 대조적으로, 미생물 감염된 세포는 포식 후 APC를 강하게 활성화시킬 수 있고, 항병원체 T-세포를 강력하게 생성할 수 있다 (16, 17). 포식된 세포로부터의 DNA는 APC를 자극하는데 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있지만 (18), 식세포가 아폽토시스성/종양형성 세포와 감염된 세포 (둘 모두 상당량의 세포 DNA를 보유하고 있음)를 어떻게 구별하는지에 대해서는, 완전히 결정되어야 할 것으로 남아있다.
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본 개시는 면역 반응을 자극하는데 충분한 구조를 갖는 dsDNA가 STING (인터페론 유전자의 자극제)을 활성화시키는데 유용하고, 생체내 면역 반응을 자극하는데 효과가 있다는 것을 입증함으로써, STING 활성화제가 자가면역 질환, 감염 및 암의 치료에 유용할 것임을 시사한다.
본 개시는 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING (인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 제공한다.
다양한 구현예에서, dsDNA는 대략 30개 뉴클레오티드 길이이다. 다양한 구현예에서, dsDNA는 대략 70개 뉴클레오티드 길이이다. STING 활성화제 dsDNA가 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90개 뉴클레오티드 길이일 수 있다고 고려된다.
다양한 구현예에서, dsDNA는 AT 풍부하거나 GC 풍부하다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제 서열은 모두 A 잔기, 모두 T 잔기, 교대 A 및 T 잔기, 또는 A 및 T 잔기의 혼합물, 예를 들어 뉴클레오티드의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상이 A 잔기 또는 T 잔기이고, 나머지 잔기가 상보적 뉴클레오티드인 것으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 활성화제 서열이 모두 G 잔기, 모두 C 잔기, 교대 G 및 C 잔기, 또는 G 및 C 잔기의 혼합물, 예를 들어 뉴클레오티드의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상이 G 잔기 또는 C 잔기이고, 나머지 잔기가 상보적 뉴클레오티드인 것으로 이루어질 수 있다고 고려된다. 나아가, 상기 활성화제 폴리뉴클레오티드는 A, T, G 및 C 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다.
다양한 구현예에서, 상기 활성화제 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 및/또는 3' 말단이 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단은 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서의 처음 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제 뉴클레오티드는 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드마다 변형된다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제 뉴클레오티드는 3번째 염기마다 변형된다.
다양한 구현예에서, 상기 활성화제는 하기와 같은 서열을 갖는다: 센스 가닥: AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 1), 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형됨;
안티센스 가닥: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (서열번호 2), 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형됨.
또한, 본원에 기재된 바와 같은 STING 활성화제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물이 본 개시에 의해 고려된다. 다양한 구현예에서, 상기 조성물은 멸균 조성물이다.
나아가, 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING 신호전달을 유도하는 본원에 기재된 바와 같은 STING 활성화제를 포함하는 벡터가 본 개시에 의해 제공된다.
또한, 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING 신호전달을 유도하는 본원에 기재된 바와 같은 STING 활성화제를 포함하는 백신이 제공된다.
다양한 구현예에서, 뉴클레오티드는 벡터에 존재한다. 다양한 구현예에서, 벡터는 바이러스 또는 플라스미드 벡터이다. 하나의 구현예에서, 바이러스 벡터는 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 백시니아 바이러스 및 변형된 백시니아 앙카라 (MVA, modified vaccinia Ankara) 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 개시는 또한, 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, STING의 활성화를 필요로 하는 대상에서 STING을 활성화시키는 방법을 고려한다.
25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 자극시키는 방법이 본원에 제공된다.
다양한 구현예에서, 대상은 암 또는 미생물 감염을 앓고 있다. 본원에서 고려되는 예시적인 암 및 미생물 감염은 상세한 설명에 추가로 기재되어 있다.
본 개시는, 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 종양의 크기를 감소시키는 방법을 고려한다.
25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
다양한 구현예에서, 암은 난소암, 결장암, 흑색종, 유방암 또는 폐암이다.
다양한 구현예에서, 대상의 종양 크기는 약 25 내지 50%, 약 40 내지 70% 또는 약 50 내지 90% 이상 감소된다.
다양한 구현예에서, STING 활성화제는 종양내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 비강내, 근육내, 피부내 또는 피하로 투여된다.
다양한 구현예에서, STING 활성화제는 면역 세포의 종양으로의 침윤을 유도한다. 다양한 구현예에서, 면역 세포는 대식세포 또는 다른 식세포이다.
다양한 구현예에서, STING 활성화제 올리고뉴클레오티드는 세포에서 시토졸로 유지된다. 다양한 구현예에서, STING 활성화제는 Cxcl10 및/또는 제1형 IFN 사이토카인 생성을 유도한다.
도 1a 내지 1j. 상이한 서열 및 폴리뉴클레오티드 길이를 갖는 다양한 STING 리간드. (도 1a 내지 1c): 상이한 서열, (도 1d 내지 1f): 상이한 길이의 AT 풍부 리간드, (도 1g 내지 1i): 상이한 길이의 GC 풍부 리간드. MEF (도 1a, 1d, 1g) 및 hTERT (도 1b, 1e, 1h)의 IFNb ELISA 검정. 3ug/ml의 STING 리간드로 처리된 1차 인간 대식세포에서의 IFNb ELISA 검정 (도 1c) 및 IFNb의 qPCR (도 1f 내지 1i). (도 1j) 3 ug의 STAV로 트랜스펙션된(transfected) B16 OVA 세포에서 DNA 양의 평가.
도 2a 내지 2l. 포식된 아폽토시스성 세포에서 외인성 시토졸 DNA (STAV)에 의한 대식세포의 활성화. (도 2a) FAM 표지된 STAV (녹색)로 트랜스펙션된 B16 OVA 세포 (B16)의 공초점 분석 및 유세포 분석법 분석. 대조 염색으로서 DAPI (청색) 및 항칼레티쿨린(anti-Calreticulin) (적색). (도 2b) STAV로 트랜스펙션된 B16 세포의 유전자 어레이 분석. 최고 가변성 염증 관련 유전자가 제시된다. (도 2c) (도 2b)에서와 동일한 B16 OVA 세포에서 Ifnβ, Cxcl10 및 Ifit3의 qPCR 분석. (도 2d) 다음 시점에서 STAV로 트랜스펙션된 B16 세포에서 STING, p65 및 IRF3의 웨스턴 블롯(Western blot) 분석. (도 2e) STAV의 트랜스펙션 3 시간 후 B16 세포에서 항-STING 및 항-p65를 사용한 면역형광 분석. (도 2f) 대식세포에 의한 B16 세포의 식균 작용의 개략도. B16 세포를 3 시간 동안 STAV로 트랜스펙션시키고, UV (120mJ/cm)를 조사하였다. UV 조사 24 시간 후 조사된 B16 세포를 대식세포 (MØ)에게 공급하였다. FAM 표지된 STAV로 트랜스펙션된 B16 세포의 세포 포식 후 대식세포에서의, (도 2g) 공초점 분석 및 (도 2h) 유세포 분석법 분석. STAV 포함 또는 미포함 B16 세포의 포식 후 야생형 (WT) 및 스팅 녹아웃(sting knock out (SKO)) 대식세포 (WT MØ 및 SKO MØ)에서의 Cxcl10 (도 2i) 및 IFNβ (도 2j)의 qPCR 분석. B16 세포의 식균 작용 후 대식세포 상에서의 CD86 (도 2k) 및 H2Kb (도 2l)에 대한 유세포 분석법. 데이터는 적어도 3번의 독립적인 실험을 나타낸다. 오차 막대(error bar)는 표준편차(s.d.)를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정(Student's t-test).
도 3a 내지 3d. B16 OVA 세포의 대식세포에의 공급. B16 OVA 세포를 3 ug/ml의 ISD-FITC로 24 시간 및 48 시간 동안 트랜스펙션시켰다. (도 3a) 프로피듐 요오다이드 및 아넥신 V로 염색된 B16 OVA 세포의 유세포 분석법 분석. (도 3b) UV 조사 후 B16 OVA 세포에서의 잔류 FITC-표지된 DNA에 대한 유세포 분석법 분석. (도 3c) UV 조사 후 B16 OVA 세포에서의 항-OVA를 사용한 웨스턴 블롯 분석. 베타 액틴을 대조군으로 사용하였다. (도 3d) CFSE 표지된 B16 OVA 세포의 세포 포식 후 대식세포에서의 유세포 분석법 분석.
도 4a 내지 4d. 대식세포에서의 외인성 STING 신호전달 의존성 유전자 발현. (도 4a) FAM 표지된 STAV로 트랜스펙션된 HEK293 세포 (293)의 세포 포식 후 대식세포에서의 유세포 분석법 분석. (도 4b) STAV 포함 또는 미포함의 조사된 293 세포의 포식 후 WT 및 SKO 대식세포의 유전자 어레이 분석. 최고 가변성 염증 관련 유전자가 제시된다. (도 4a)에서와 동일한 세포에서 Cxcl10 (도 4c) 및 IFNβ (도 4d)의 qPCR 분석. 데이터는 적어도 3번의 독립적인 실험을 나타낸다. 오차 막대는 표준편차를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 5a 내지5h. 시토졸 DNA에 의한 트랜스에서의 대식세포 자극. (도 5a) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)에서 STING 및 cGAS의 웨스턴 블롯 분석. (도 5b) STAV로 트랜스펙션된 WT, SKO 및 cGAS 녹아웃 (cGAS KO)에서의 IFNβ의 ELISA. (도 5c) 대식세포에 의한 MEF의 식균 작용의 개략도. STAV를 포함한 UV 조사된 WT, SKO 및 cGAS KO MEF의 포식 후 WT 및 SKO 대식세포에서의 Cxcl10 (도 5d) 및 IFNβ (도 5e)의 qPCR 분석. (도 5f) STAV로 트랜스펙션된 293T 및 hTERT 세포에서의 IFNβ의 ELISA. STAV 포함 또는 미포함의 UV 조사된 293T 세포의 포식 후 WT 및 SKO 대식세포에서의 Cxcl10 (도 5g) 및 IFNβ (도 5h)의 qPCR 분석. 데이터는 적어도 3번의 독립적인 실험을 나타낸다. 오차 막대는 표준편차를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 6a 내지 6f. 대식세포에서의 cGAS/STING 축의 외인성 활성화. (도 6a) STAV 처리된 B16 세포의 포식 후 WT, SKO, cGAS KO 및 TLR9 KO 대식세포에서의 Cxcl10 및 IFNβ의 qPCR 분석. (도 6b) 웨스턴 블롯에 의한 cGAS 발현 및 하이브리드 질량 분광계에 의한 cGAMP 양. (도 6c) STAV를 함유하는 293T 세포의 포식 후 WT, SKO 및 cGAS KO 대식세포에서의 Cxcl10의 qPCR 분석. 293T 세포를 대조군 벡터로서 pcGAS 또는 pCMV를 이용하여 재구성하였다. (도 6d) (도 6c)에서와 동일한 293T 세포에서 하이브리드 질량 분광계에 의한 cGAMP 수준의 측정. (도 6e) STAV를 함유하는 HT116 세포의 포식 후 WT, SKO 및 cGAS KO 대식세포에서의 Cxcl10의 qPCR 분석. HT116 세포를 대조군 벡터로서 pcGAS 또는 pCMV를 이용하여 재구성하였다. (도 6f) HSVγ34.5로 감염된 B16 세포의 포식 후 WT, SKO, cGAS KO 및 Trex1 KO 대식세포에서의 IFNβ의 qPCR 분석. HT116 세포를 대조군 벡터로서 pcGAS 또는 pCMV를 이용하여 재구성하였다. 오차 막대는 표준편차를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 7a 내지 7c. STAV에 의한 항원 제시 세포의 활성화. WT, SKO, cGAS KO 대식세포를 24 시간 동안의 3 ug/ml의 (도 7a) AT90ES 또는 (도 7b) cGAMP 및 (도 7c) Ifnb 처리로 트랜스펙션시킨 후, SIINFEKL 유무 하에서 펄싱하였다. 항원 제시는 제1형 MHC의 H-2Kb에 결합된 OVA 펩티드 SIINFEKL과 반응하는 항체를 사용하여 유세포 분석법 분석에 의해 평가하였다.
도 8a 내지 8d. STAV를 함유하는 아폽토시스성 세포는 DNase II에 의한 분해를 회피함. (도 8a) DNase I, DNase II 또는 Trex1 녹아웃 대식세포에 의한 B16 세포의 식균 작용의 개략도. B16 세포를 3 시간 동안 STAV로 트랜스펙션시키고, UV (120mJ/cm)를 조사하였다. UV 조사 24 시간 후, 조사된 B16 세포를 3가지 상이한 유전자형의 대식세포 (MØ)에 공급하였다. STAV를 함유하는 B16 세포의 포식 6 시간 후, (도 8b) DNase I KO, (도 8c) DNase II KO 및 (도 8d) Trex1 KO 대식세포에서의 Cxcl10의 qPCR 분석. 오차 막대는 표준편차를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 9a 내지 9d. B16 OVA 흑색종에서 STAV의 항종양 활성. (도 9a) B16 OVA 흑색종에서 STAV의 종양내 주사의 개략도. 마우스의 옆구리에 B16-OVA 세포를 피하 주사하였다. 10ug의 STAV를 3 일마다 종양내 (i.t.) 주사하였다. (도 9b) WT (n=7/군) 및 (도 9c) SKO 마우스 (n=7/군)로부터의 종양 부피를 지시된 날에 측정하였다. (도 9d) 대조군으로서 STAV 또는 PBS를 주사한 WT (n=4/군) 및 SKO (n=4/군) 마우스의 비장에서의 OVA 특이적 CD8+ T 세포의 빈도. 오차 막대는 표준편차를 나타냄. *; p<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 10a 내지 10h. B16 OVA에 의한 폐 전이의 보호는 STING을 필요로함. (도 10a) 죽은 세포 면역화의 개략도. B16 OVA 세포를 STAV로 3 시간 동안 트랜스펙션시키고, UV (120mJ/cm)를 조사하였다. 24 시간 후, WT, SKO, TLR9 KO 및 cGAS KO 마우스에게 STAV 포함 또는 미포함의 조사된 B16 세포를 주 2회 복강내 주사하였다. (도 10b) 2차 면역화 후 7일차에, WT, SKO, TLR9 KO 및 cGAS KO 마우스의 비장세포에서의 IFNγ 측정. (도 10c) B16 OVA 매개 폐 전이에 대한 백신접종 후의 개략도. WT, TLR9KO, SKO 및 cGAS KO 마우스에게 B16 OVA 세포를 정맥내 주사하였다. 1, 3, 7 및 14일차에, 마우스에게 STAV를 포함한 UV 조사된 B16 OVA 세포 (마우스 당 1 x 105개의 세포)를 복강내 주사하였다. (도 10d) WT (p=0.0429, n=7/군), (도 10e) SKO (p=0.2616, n=7/군), (도 10f) cGAS KO (p=0.4075, n=7/군) 및 (도 10g) TLR9KO (p=0.0012 n=7/군) 마우스로부터의 생존율을 모니터링하였다. P 값은 Logrank 시험을 기반으로 하며, P<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
도 11. STAV로 트랜스펙션된 B16 세포에서 유전자 어레이 분석의 배수 변화(fold change). STAV로 트랜스펙션된 B16 세포의 ILLUMINA 어레이의 유전자 발현 배수 변화. 배수 변화 분석을 2개의 군 사이에서 수행하였고, 트랜스펙션되지 않은 세포와 STAV 트랜스펙션된 B16 세포 간 비교로부터 배수 변화 3 이상의 임계값을 기준으로 차등적으로 발현된 유전자를 선택하였다.
도 12. B16 공급 대식세포에서 유전자 어레이 분석의 배수 변화. ILLUMINA 어레이의 유전자 발현 배수 변화.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 업계의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 당업자에게 본 발명에 사용된 다수의 용어의 일반적 정의를 제공한다: [Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY (2d ed. 1994)]; [THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY (Walker ed., 1988)]; [THE GLOSSARY OF GENETICS, 5TH ED., R. Rieger, et al. (eds.), Springer Verlag (1991)]; 및 [Hale and Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY (1991)].
본원에 인용된 각각의 공보, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은, 본 개시와 상충되지 않는 범위까지 그 전문이 본원에 참조로서 인용된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바, 단수 형태의 표현은, 문맥에서 달리 명백하게 지시되지 않는 한, 복수의 언급 대상을 포함한다는 점에 유의한다.
본원에 사용된 바와 같은 하기 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 그에 속하는 의미를 갖는다.
정의
본원에 사용된 바, 용어 "면역 반응을 유도하거나 증강시킨다"는, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질이 투여되지 않은 대조군 샘플에 비해, 면역 반응에 있어서 통계적으로 측정 가능한 유도 또는 증가를 야기하는 것을 나타낸다. 바람직하게는, 면역 반응의 유도 또는 증강은 대상에서 예방적 또는 치료적 반응의 결과를 가져온다. 면역 반응의 예는 제1형 IFN의 생성 증가, 바이러스 및 대체 병원체에 의한 다른 유형의 감염에 대한 내성 증가이다. 종양에 대한 면역 반응 (항종양 반응)의 증강, 또는 종양을 예방하거나 기존 종양을 제거하기 위한 백신의 개발.
본원에 사용된 바, 용어 "STING"에는, 비제한적으로, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 가닥, 상보적 서열, 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 상동성 및/또는 이종성 STING 분자, 동형체, 전구체, 돌연변이체, 변이체, 유도체, 스플라이스 변이체, 대립유전자, 상이한 종 및 이들의 활성 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바, "STING 활성화제" 또는 "STAV"는, 세포에 도입되거나 세포에 의해 생성될 때, STING 단백질을 통해 신호전달을 유도할 수 있는 뉴클레오티드를 나타낸다. 사실상, 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN)는 STING의 천연 활성화제이지만, 종종 종양 세포에서 유도되지 않거나, 종양 세포 사멸을 회피하기 위해 종양 세포에 의해 사용된다. STAV는, 세포의 시토졸에 도입될 때 STING 신호전달을 활성화시키는 이중 가닥 DNA 분자인 것으로 본원에서 고려된다. STAV dsDNA는 변형된 5' 말단을 가질 수 있고/있거나, 뉴클레오티드 서열 전반에 걸쳐 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드마다 변형된 염기를 가질 수 있다. 다양한 구현예에서, STAV는 약 20 내지 90, 25 내지 90, 또는 30 내지 70개 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90개 뉴클레오티드 길이이다.
본원에 사용된 바, "DNA 백신" 또는 "DNA 벡터"는, 표적 세포에서 전사될 수 있고 선형 핵산을 포함할 수 있는 합성 DNA 구조, 예컨대 정제된 DNA, 플라스미드 벡터에 혼입된 DNA, 또는 DNA를 숙주 세포에 도입하는데 적합한 임의의 다른 벡터에 혼입된 DNA를 나타낸다. 다양한 구현예에서, DNA 백신은 네이키드(naked) DNA일 수 있다. 네이키드 DNA 백신, 플라스미드 DNA 백신 또는 바이러스 벡터 백신이 본원에 제공된다. 백신은 생 바이러스 백신, 약독화된 생 바이러스 백신, 또는 불활성화 또는 사멸된 바이러스 백신인 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 백신은 바이러스 유사 입자 (VLP)를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바, "수포성 구내염 바이러스" 또는 "VSV"는, VSV의 임의의 균주 또는 VSV의 돌연변이 형태, 예컨대 WO 01/19380 또는 US20140088177에 기재된 것들을 나타낸다. 본원의 VSV 구성은, 비제한적으로, 게놈 RNA, mRNA, cDNA, 뉴클레오캡시드 코어에 캡슐화된 VSV RNA의 일부 또는 전부, PEG와 같은 화합물과 복합체화된 VSV 및 비(非)바이러스 단백질에 컨쥬게이션된 VSV를 포함하는 여러 형태 중 임의의 것일 수 있다. 본원에 유용한 VSV 벡터에는 복제-유능 및 복제-결함 VSV 벡터, 예컨대 G 당단백질이 결여된 VSV 벡터가 포함된다.
본원에 사용된 바, 용어 "벡터"는, 하나 이상의 세포 유형의 형질도입/트랜스펙션을 위해 설계된 폴리뉴클레오티드 구성체를 나타낸다. VSV 벡터는, 예를 들어 삽입된 뉴클레오티드의 단리, 증식 및 복제를 위해 설계된 "클로닝 벡터", 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 발현을 위해 설계된 "발현 벡터", 또는 재조합 바이러스 또는 바이러스 유사 입자의 생성을 유도하기 위해 설계된 "바이러스 벡터", 또는 하나 초과 유형의 벡터의 속성을 포함하는 "셔틀(shuttle) 벡터"일 수 있다. 본 발명은 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 백시니아 바이러스, 또는 지카(Zika) 바이러스 단백질, 예컨대 Env 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함하는 변형된 백시니아 앙카라 (MVA) 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 벡터는 지카 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드뿐 아니라, 벡터의 효능을 개선시킬 수 있는 또 다른 단백질, 예컨대, 비제한적으로, 본원에 기재된 사이토카인을 포함하는 사이토카인; 예를 들어 Mip와 같은 케모카인; 예를 들어 B7-1 및 B7-2와 같은 동시 자극성 단백질; 안지오스타틴; 엔도스타틴; 및 예를 들어 gp96과 같은 열 충격 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다고 고려된다.
본원에서 상호 교환 가능하게 사용된 바, 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 나타낸다. 이러한 용어에는, 단일-, 이중- 또는 삼중-가닥 DNA, 게놈 DNA, cDNA, 게놈 RNA, mRNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기, 또는 다른 천연의, 화학적, 생화학적으로 변형된 비(非)천연의, 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 포함하는 중합체가 포함된다. 폴리뉴클레오티드의 백본은 당 및 포스페이트기 (RNA 또는 DNA에서 전형적으로 발견될 수 있는 바와 같음), 또는 변형되거나 치환된 당 또는 포스페이트기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드의 백본은 포스포르아미데이트와 같은 합성 서브유닛의 중합체를 포함할 수 있으며, 따라서 올리고데옥시뉴클레오시드 포스포르아미데이트 (P-NH2) 또는 포스포르아미데이트-포스포디에스테르 혼합 올리고머일 수 있다. [Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-8]; [Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318-23]; [Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-73]. 포스포디에스테르 연결 대신 포스포로티오에이트 연결이 사용될 수 있다. [Braun et al. (1988) J. Immunol. 141: 2084-9]; [Latimer et al. (1995) Molec. Immunol. 32: 1057-1064]. 또한, 이중-가닥 폴리뉴클레오티드는 상보적 가닥을 합성하고, 상기 가닥을 적절한 조건 하에서 어닐링하거나, 또는 적절한 프라이머를 갖는 DNA 폴리머라아제를 사용하여 새로 상보적 가닥을 합성하는 것에 의한 화학적 합성의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 생성물로부터 수득될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 언급 (예컨대, 서열번호에 대한 언급)은 또한 보체 서열을 포함한다.
하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, 게놈 RNA, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체와 같은 변형된 뉴클레오티드, 우라실, 플루오로리보오스 및 티오에이트와 같은 다른 당 및 연결기, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에는 비(非)뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 예컨대 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 중합 후 추가로 변형될 수 있다. 본 정의에 포함되는 다른 유형의 변형은 캡(cap), 하나 이상의 천연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 다른 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다.
"인코딩"은, 뉴클레오티드의 한정된 서열 (즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 아미노산의 한정된 서열, 및 이로부터 유도된 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오티드 내 뉴클레오티드의 특정 서열의 고유한 특성을 나타낸다. 따라서, 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생성하는 경우, 유전자는 단백질을 인코딩한다. 뉴클레오티드 서열이 mRNA 서열과 동일하고 통상적으로 서열 목록에 제공되는 코딩 가닥, 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로서 사용되는 비(非)코딩 가닥은 모두, 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 인코딩하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열"은, 서로 변성 버전이고, 동일한 아미노산 서열을 인코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
"전사 제어 하에서"는, 당업계에서 널리 이해되는 용어이며, 폴리뉴클레오티드 서열의 전사가 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진시키는 요소에 작동 가능하게 (작동적으로) 연결된 것에 의존한다는 것을 나타낸다. "작동 가능하게 연결된"은, 요소들이 기능할 수 있도록 배열되어 있는 병렬(juxtaposition)을 나타낸다.
바이러스 벡터의 맥락에서 본원에 사용된 바, "이종성 폴리뉴클레오티드" 또는 "이종성 유전자" 또는 "전이유전자(transgene)"는, 야생형 바이러스 벡터에 존재하지 않는 임의의 폴리뉴클레오티드 또는 유전자이다.
벡터의 맥락에서 본원에 사용된 바, "이종성" 프로모터는 벡터 자체에서 유도되거나 벡터와 회합되지 않은 것이다.
"숙주 세포"는 본원에 기재된 벡터(들)의 수용체일 수 있거나 수용체였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자손은 자연적, 우발적 또는 의도적 돌연변이 및/또는 변화로 인해 본래의 모 세포와 (형태학적으로 또는 전체 DNA 보체에서) 반드시 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주 세포는 생체내 또는 시험관내에서 본원의 벡터로 트랜스펙션된, 형질전환된 또는 감염된 세포를 포함한다.
"벡터" (때때로, 유전자 전달 또는 유전자 이동 "비히클"로 지칭됨)는, 시험관내 또는 생체내에서, 숙주 세포에 전달하고자 하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분자의 복합체 또는 거대분자를 나타낸다. 전달하고자 하는 폴리뉴클레오티드는 유전자 요법에서 관심있는 코딩 서열을 포함할 수 있다. 벡터에는, 예를 들어 바이러스 벡터 (예컨대, 아데노바이러스 ("Ad"), 아데노 연관 바이러스 (AAV) 및 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 및 레트로바이러스), 리포솜 및 다른 지질 함유 복합체, 및 숙주 세포로의 폴리뉴클레오티드의 전달을 매개할 수 있는 다른 거대분자 복합체가 포함된다. 벡터는 또한 유전자 전달 및/또는 유전자 발현을 추가로 조절하거나, 다르게는 표적화된 세포에 유익한 특성을 제공하는, 다른 성분 또는 기능을 포함할 수 있다. 하기에 보다 상세하게 기재 및 예시된 바와 같이, 이러한 다른 성분에는, 예를 들어 세포에 대한 결합 또는 표적화에 영향을 미치는 성분 (세포 유형 또는 조직 특이적 결합을 매개하는 성분을 포함); 세포에 의한 벡터 핵산의 흡수에 영향을 미치는 성분; 흡수 후 세포 내 폴리뉴클레오티드의 국부화에 영향을 미치는 성분 (예컨대, 핵 국부화를 매개하는 작용제); 및 폴리뉴클레오티드의 발현에 영향을 미치는 성분이 포함된다. 이러한 성분은 또한 벡터에 의해 전달된 핵산을 흡수하고 발현하는 세포를 검출 또는 선택하는데 사용될 수 있는, 검출 가능한 및/또는 선택 가능한 마커와 같은 마커를 포함할 수 있다. 이러한 성분은 벡터의 자연적 특징 (예컨대, 결합 및 흡수를 매개하는 성분 또는 기능을 갖는 특정 바이러스 벡터의 용도)으로서 제공될 수 있거나, 이러한 기능을 제공하기 위해 벡터가 변형될 수 있다. 다른 벡터에는, [Chen et al; BioTechniques, 34: 167-171 (2003)]에 기재된 것들이 포함된다. 매우 다양한 이러한 벡터가 당업계에 공지되어 있으며, 일반적으로 입수 가능하다.
본원에 사용된 바, 용어 "발현 벡터"는, 전사될 수 있는 유전자 생성물의 적어도 일부를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 벡터를 나타낸다. 일부 경우에, RNA 분자는 이후에 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드로 번역된다. 다른 경우에, 이러한 서열은, 예를 들어 안티센스 분자, siRNA, 리보자임 등의 생성에서 번역되지 않는다. 발현 벡터는 특정한 숙주 유기체에서 작동적으로 연결된 코딩 서열의 전사 및 가능하게는 번역에 필수적인 핵산 서열을 나타내는, 다양한 제어 서열을 함유할 수 있다. 전사 및 번역을 통제하는 제어 서열 이외에, 벡터 및 발현 벡터는 다른 기능을 수행하는 핵산 서열을 또한 함유할 수 있다.
본원에 사용된 바, "백신"은, 증강된 면역 반응이 나타나는 암 또는 다른 병태의 치료에 유용한, 본원에 기재된 바와 같은 STING 활성화제를 포함하는 벡터를 포함하는 조성물을 나타낸다. 백신은 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 아쥬반트(adjuvant)를 포함하는 것으로 고려된다. 백신은 예방적 또는 치료적인 것으로 고려된다. "예방적" 치료는, 병리의 발병 위험을 감소시키기 위한 목적으로, 질환의 징후를 나타내지 않거나 초기 징후만을 나타내는 대상에게 투여되는 치료이다. 본 발명의 화합물은 병리의 발병 가능성을 감소시키거나, 발병된 경우 병리의 중증도를 최소화하기 위한 예방적 치료로서 제공될 수 있다. "치료적" 치료는, 징후 또는 증상을 감소시키거나 제거하기 위한 목적으로, 병리의 징후 또는 증상을 나타내는 대상에게 투여되는 치료이다. 징후 또는 증상은 생화학적, 세포적, 조직학적, 기능적, 주관적 또는 객관적일 수 있다.
"항원 제시 세포" (APC)는 T 세포를 활성화시킬 수 있는 세포이며, 비제한적으로, 단핵구/대식세포, B 세포 및 수지상 세포 (DC)를 포함한다. 용어 "수지상 세포" 또는 "DC"는, 림프 또는 비(非)림프 조직에서 발견되는 형태학적으로 유사한 세포 유형의 다양한 집단의 임의의 구성원을 나타낸다. 이러한 세포는 독특한 형태, 높은 수준의 표면 제2형 MHC 발현을 특징으로 한다. DC는 다수의 조직 공급원으로부터 단리될 수 있다. DC는 MHC-제한 T 세포를 감작시킬 수 있는 높은 용량을 가지며, 제자리에서 T 세포에 항원을 제시하는데 매우 효과적이다. 항원은 T 세포 발달 및 관용 동안 발현되는 자가 항원, 및 정상적인 면역 과정 동안 존재하는 외래 항원일 수 있다.
"암의 치료"는, 하기 효과 중 하나 이상을 나타낸다: (1) (i) 종양 성장의 둔화 및 (ii) 완전한 성장 정지를 포함하는, 어느 정도까지의 억제; (2) 종양 세포 수의 감소; (3) 종양 크기의 유지; (4) 종양 크기의 감소; (5) 말초 기관으로의 종양 세포 침윤의 (i) 감소, (ii) 둔화 또는 (iii) 완전한 예방을 포함하는 억제; (6) 전이의 (i) 감소, (ii) 둔화 또는 (iii) 완전한 예방을 포함하는 억제; (7) (i) 종양 크기의 유지, (ii) 종양 크기의 감소, (iii) 종양 성장의 둔화, (iv) 침입의 감소, 둔화 또는 예방을 유도할 수 있는 항종양 면역 반응의 증강, 및/또는 (8) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 수 또는 중증도의, 어느 정도까지의 완화.
본원에 사용된 바, "단리된"은, 이의 고유 환경에서 제거된 폴리뉴클레오티드, 바이러스 또는 항원성 조성물을 나타낸다. 따라서, 단리된 생물학적 물질에는 일부 또는 모든 세포 성분, 즉, 고유 물질이 자연적으로 발생하는 세포의 성분 (예를 들어, 세포질 또는 막 성분)이 없다. 하나의 양태에서, 폴리뉴클레오티드, 바이러스 또는 항원성 조성물은, 세포 추출물 또는 상청액에 존재하는 경우, 단리된 것으로 간주된다. 핵산 분자의 경우, 단리된 핵산에는 PCR 생성물, 단리된 mRNA, cDNA 또는 제한 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바, "정제된"은, 관련없는 물질, 즉, 조성물이 수득되는 내인성 물질을 포함하는 오염물의 존재를 감소 또는 제거하는 조건 하에서 단리된 바이러스 또는 면역원성 조성물을 나타낸다. 예로서, 및 비제한적으로, 정제된 비리온에는 비특이적 병원체 및 조직 배양물 또는 세포 단백질을 포함하는 숙주 세포 또는 배양물 성분이 실질적으로 없다. 다양한 구현예에서, 오염물이 실질적으로 없는 정제된 물질은, 적어도 50%의 순도를 가지며; 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 심지어 적어도 99%의 순도를 갖는다. 순도는 크로마토그래피, 겔 전기영동, 면역검정, 조성물 분석, 생물학적 검정, 및 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바, "약학적 조성물"은, 인간 및 포유동물을 포함하는 대상 동물에게 투여하는데 적합한 조성물을 나타낸다. 약학적 조성물은 약리학적 유효량의 본 발명의 바이러스 또는 항원성 조성물을 포함하고, 또한 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 약학적 조성물은 활성 성분(들), 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 구성하는 불활성 성분(들)뿐 아니라, 임의의 둘 이상의 성분의 조합, 복합체화 또는 응집으로부터, 직접적으로 또는 간접적으로, 유도된 임의의 생성물을 포함하는 조성물을 포함한다. 따라서, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 화합물 또는 컨쥬게이트와 약학적으로 허용 가능한 담체를 혼합하여 제조된 임의의 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바, "약학적으로 허용 가능한 담체"에는, 임의의 및 모든 임상적으로 유용한 용매, 분산 매질, 코팅, 항균 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 작용제, 완충제 및 부형제, 예컨대 포스페이트 완충 식염수 용액, 덱스트로오스 또는 만니톨의 5% 수용액, 및 오일/물 또는 물/오일 에멀젼과 같은 에멀젼, 및 다양한 유형의 습윤제 및/또는 아쥬반트가 포함된다. 적합한 약학적 담체 및 제형은 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co., Easton, 1995)]에 기재되어 있다. 상기 조성물에 유용한 약학적 담체는 의도된 활성제의 투여 방식에 따라 달라진다. 전형적인 투여 방식에는, 비제한적으로, 장내 (예를 들어, 경구) 또는 비경구 (예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 주사; 또는 국소, 경피 또는 경점막 투여)가 포함된다. "약학적으로 허용 가능한 염"은, 예를 들어 금속 염 (나트륨, 칼륨, 마그네슘, 칼슘 등), 및 암모니아 또는 유기 아민의 염을 포함하는, 약학적 사용을 위한 화합물 또는 컨쥬게이트로 제형화될 수 있는 염이다.
본원에 사용된 바, "약학적으로 허용 가능한" 또는 "약리학적으로 허용 가능한"은, 생물학적으로 또는 달리 비(非)바람직하지 않은 물질, 즉, 하기 기재되는 바와 같이, 당업계에 널리 공지된 경로를 사용하여 투여될 때, 바람직하지 않은 생물학적 효과를 야기하거나 함유된 조성물의 임의의 성분과 유해한 방식으로 상호작용하지 않고 개체에게 투여될 수 있는 물질을 나타낸다.
본원에 사용된 바, "표적"과 관련된 "병태" 또는 "장애"는, 본원에 기재된 이의 표적 활성의 변형이 유익하며, 또한 높은 수준의 표적이 장애의 악화에 기여하는 인자 또는 장애의 병태생리학에 원인이 되는 것으로 보이거나 의심되는 다른 장애뿐 아니라, 표적의 조절이 임상 징후 또는 증상의 변화와 관련이 있는 질환 및 다른 장애를 포함한다. 이러한 장애는, 예를 들어 분비된 및/또는 세포 표면 상의 표적 수준의 증가, 및/또는 장애로 고통받는 대상의 영향을 받은 세포 또는 조직에서의 변형된 표적 신호전달에 의해 입증될 수 있다. STING 활성화제로 치료될 수 있는 예시적인 질환, 병태 또는 장애는 상세한 설명에 보다 상세하게 기재되어 있다.
STING (인터페론 유전자의 자극제)
선천적 면역 반응에서 핵심 역할을 하는 분자인 STING (인터페론 유전자의 자극제)은, 5개의 추정 막횡단 (TM) 영역을 포함하고, 주로 소포체 (ER)에 존재하며, NF-κB 및 IRF3 전사 경로 둘 모두를 활성화시켜, 제1형 IFN을 유도하고, 발현 후 강력한 항-바이러스 상태를 발휘할 수 있다. 인간 STING은 Genbank 수탁번호 NP_938023로 제시된 아미노산 서열 및 Genbank 수탁번호 NM_198282로 제시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 379 아미노산 단백질이지만, 대체 단백질 동형체 (Genbank 수탁번호 NP_001288667.1, XP_011535942.1, XP_011535941.1)가 존재할 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 공보 20130039933 및 PCT/US2009/052767 (이들의 전문은 본원에 참조로서 인용됨)를 참조한다. 인간 STING (379개 아미노산)의 아미노산 서열은 하기 제시되는 바와 같다 (서열번호 3): M P H S S L H P S I P C P R G H G A Q K A A L V L L S A C L V T L W G L G E P P E H T L R Y L V L H L A S L Q L G L L L N G V C S L A E E L R H I H S R Y R G S Y W R T V R A C L G C P L R R G A L L L L S I Y F Y Y S L P N A V G P P F T W M L A L L G L S Q A L N I L L G L K G L A P A E I S A V C E K G N F N V A H G L A W S Y Y I G Y L R L I L P E L Q A R I R T Y N Q H Y N N L L R G A V S Q R L Y I L L P L D C G V P D N L S M A D P N I R F L D K L P Q Q T G D H A G I K D R V Y S N S I Y E L L E N G Q R A G T C V L E Y A T P L Q T L F A M S Q Y S Q A G F S R E D R L E Q A K L F C R T L E D I L A D A P E S Q N N C R L I A Y Q E P A D D S S F S L S Q E V L R H L R Q E E K E E V T V G S L K T S A V P S T S T M S Q E P E L L I S G M E K P L P L R T D F S.
STING의 소실은 제1형 IFN를 활성화시키는 polyI:C의 능력을 감소시켰으며, 수포성 구내염 바이러스 (VSV) 감염에 취약한 표적화된 상동성 재조합에 의해 생성된 STING이 결여된 쥣과 배아 섬유아세포 (-/- MEF)가 되게 하였다. STING의 부재 하에서, DNA 매개 제1형 IFN 반응은 억제되었으며, 이는 STING이 바이러스, 박테리아 및 세포를 감염시킬 수 있는 다른 병원체로부터의 DNA를 인식하는데 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다. 효모-2종 하이브리드 및 공동 면역침전 연구는, STING이 번역 후 ER 막을 통한 단백질 전위에 필요한 트랜스로콘(translocon) 관련 단백질 (TRAP) 복합체의 구성원인 Ssr2/TRAPβ 및 RIG-I와 상호작용함을 나타냈다. TRAPβ의 RNAi 제거는 STING 기능을 억제하였고, polyIC에 대한 반응에서 제1형 IFN의 생성을 저해하였다.
추가 실험은, STING 자체가 병원체 및 아폽토시스성 DNA와 같은 단일- 및 이중-가닥 DNA를 포함하는 핵산에 결합하며, DNA 매개 관절염 및 암과 같은 염증성 병태에서 전염증성 유전자 발현을 조절하는데 중심적인 역할을 한다는 것을 보여주었다. STING의 특정 억제제 및 활성화제는 국제 특허 공보 제WO 2013/166000호에 논의되어 있다.
STING 활성화제
사실상, 시클릭 디뉴클레오티드 (CDN)는 STING의 천연 활성화제이지만, 종종 종양 세포에서 유도되지 않거나, 종양 세포 사멸을 회피하기 위해 종양 세포에 의해 사용된다. CDN은 전형적으로 핵에 머무르며, 시토졸로 누출되지 않는데, 이는 종양이 면역 세포를 회피하는데 도움이 된다. 암에서 STING의 이점을 사용하기 위해, 본 발명자들은 세포의 아폽토시스 상황과 유사하게, 시토졸에 머무르고, 유리 dsDNA에 대한 반응에서 STING 활성화를 유도할 수 있는 뉴클레오티드를 개발하였다.
STAV는 세포의 시토졸로 유도될 때 STING 신호전달을 활성화시키는 이중 가닥 DNA 분자인 것으로 본원에서 고려된다.
다양한 구현예에서, STAV는 약 20 내지 90, 25 내지 90, 또는 30 내지 70개 뉴클레오티드 길이이거나, 또는 약 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90개 뉴클레오티드 길이이다.
다양한 구현예에서, 본원의 활성화제 올리고뉴클레오티드는 AT (아데닌-티민) 풍부하거나 GC (구아닌-시토신) 풍부하다. 예를 들어, 상기 활성화제 서열은 모두 A 잔기, 모두 T 잔기, 교대 A 및 T 잔기, 또는 A 및 T 잔기의 혼합물, 예를 들어 뉴클레오티드의 대략 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상이 A 잔기 또는 T 잔기이고, 나머지 잔기가 상보적 뉴클레오티드인 것으로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 활성화제 서열이 모두 G 잔기, 모두 C 잔기, 교대 G 및 C 잔기, 또는 G 및 C 잔기의 혼합물, 예를 들어 뉴클레오티드의 대략 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상이 G 잔기 또는 C 잔기이고, 나머지 잔기가 상보적 뉴클레오티드인 것으로 이루어질 수 있다고 고려된다. 나아가, 상기 활성화제 폴리뉴클레오티드는 A, T, G 및 C 뉴클레오티드의 혼합물일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제는 하기와 같은 서열을 갖는다: 센스 가닥: AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 1), 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형됨;
안티센스 가닥: TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (서열번호 2), 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형됨.
STAV dsDNA는 변형된 5' 말단을 가질 수 있고/있거나, 뉴클레오티드 서열 전반에 걸쳐 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드마다 변형된 염기를 가질 수 있다. 5' 말단 및/또는 3' 말단이 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' 말단은 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단은 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서의 처음 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 일부 구현예에서, 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제 뉴클레오티드는 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드마다 변형된다. 다양한 구현예에서, 상기 활성화제 뉴클레오티드는 3번째 염기마다 변형된다.
하나의 구현예에서, STAV 올리고뉴클레오티드는 하기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드간 연결 및 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결의 조합을 포함할 수 있다: 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복실메틸 에스테르 및/또는 이들의 조합.
또 다른 구현예에서, STAV 올리고뉴클레오티드는 선택적으로 펩티드 핵산, 잠금 핵산 (LNA) 분자, 유사체, 유도체 및/또는 이들의 조합을 포함하는 적어도 하나의 변형된 핵염기를 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 또한, 부가적으로 또는 대안적으로, 핵염기 (종종 당업계에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바, "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기에는, 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)이 포함된다. 변형된 핵염기에는, 천연 핵산에서 드물게 또는 일시적으로만 발견되는 핵염기, 예를 들어 하이포잔틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (또한 5-메틸-2' 데옥시시토신으로 지칭되며, 종종 당업계에서 5-Me-C로 지칭됨), 5-히드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토비오실 HMC뿐 아니라, 합성 핵염기, 예를 들어 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸릴알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 이종치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N.sub.6 (6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. ([Kornberg, A., DNA Replication, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp 75-77]; [Gebeyehu, G., et al. Nucl. Acids Res. 1987, 15:4513]). 당업계에 공지된 "범용(universal)" 염기, 예를 들어, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 핵산 이중체 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 만큼 증가시키는 것으로 나타났으며 ([Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이는 현재 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포 흡수를 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 컨쥬게이트를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결시키는 것을 수반한다. 이러한 모이어티에는, 비제한적으로, 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티 ([Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 6553]), 콜산 ([Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1994, 4, 1053]), 티오에테르, 예를 들어 헥실-5-트리틸티올 ([Manoharan et al. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1992, 660, 306]; [Manoharan et al. Bioorg. Med. Chem. Let. 1993, 3, 2765]), 티오콜레스테롤 ([Oberhauser et al., Nucl. Acids Res. 1992, 20, 533]), 지방족 사슬, 예를 들어 도데칸디올 또는 운데실 잔기 ([Saison-Behmoaras et al. EMBO J. 1991, 10, 111]; [Kabanov et al. FEBS Lett. 1990, 259, 327]; [Svinarchuk et al. Biochimie 1993, 75, 49]), 인지질, 예를 들어 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트 ([Manoharan et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651]; [Shea et al. Nucl. Acids Res. 1990, 18, 3777]), 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬 ([Manoharan et al. Nucleosides & Nucleotides 1995, 14, 969]), 또는 아다만탄 아세트산 ([Manoharan et al. Tetrahedron Lett. 1995, 36, 3651])과 같은 지질 모이어티가 포함된다. 친유성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 및 이러한 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다: 예를 들어, 미국 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호.
주어진 올리고뉴클레오티드에서 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없으며, 사실 상기 언급된 변형 중 하나 초과는 단일 올리고뉴클레오티드에 또는 심지어 올리고뉴클레오티드 내의 단일 뉴클레오시드 내에 혼입될 수 있다. 본 발명은 또한 상기 정의된 바와 같은 키메라 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명의 핵산 분자는, 비제한적으로, 비(非)염기성 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 다중탄화수소 화합물을 포함하는 또 다른 모이어티와 컨쥬게이션된다. 당업자는, 이러한 분자가 당, 염기 또는 포스페이트기 상의 여러 위치에서 핵산 분자를 포함하는 임의의 뉴클레오티드 중 하나 이상에 연결될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 개시에 따르면, 효능, 특이성 및 작용의 지속기간을 증강시키고, MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성된 올리고뉴클레오티드의 투여 경로를 넓히기 위한, LNA 단량체의 사용과 같은 변형의 사용이 제공된다 (참고: [Recent advances in the medical chemistry of antisense oligonucleotide, Uhlman, Current Opinions in Drug Discovery & Development 2000 Vol 3 No 2]). 이는 현재 올리고뉴클레오티드에서 단량체의 일부를 LNA 단량체로 치환함으로써 달성될 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 모 화합물과 유사한 크기를 가질 수 있거나, 보다 크거나 바람직하게는 보다 작을 수 있다. 이러한 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드가 LNA 단량체를 약 70% 미만, 더욱 바람직하게는 약 60% 미만, 가장 바람직하게는 약 50% 미만으로 함유하고, 이의 크기가 약 5 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 약 12 내지 20개 뉴클레오티드인 것이 바람직하다.
바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은, 비제한적으로, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 3' 알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트 및 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트 및 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 및 인접한 뉴클레오시드 단위의 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결되는 역전된 극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다.
인 원자를 포함하지 않는 바람직한 변형된 올리고뉴클레오티드 백본은, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 뉴클레오시드간 연결, 헤테로원자와 알킬 또는 시클로알킬 혼합 뉴클레오시드간 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로시클릭 뉴클레오시드간 연결에 의해 형성된 백본을 갖는다. 이는, 모르폴리노 연결 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 백본; 술파이드, 술폭시드 및 술폰 백본; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본; 아미드 백본을 갖는 것들; 및 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 다른 것들을 포함한다.
다른 바람직한 올리고뉴클레오티드 모방체에서, 뉴클레오티드 단위의 당 및 뉴클레오시드간 연결, 즉, 백본은 모두 신규한 기로 대체된다. 염기 단위는 적절한 핵산 표적 화합물과의 하이브리드화를 위해 유지된다. 탁월한 하이브리드화 특성을 갖는 것으로 밝혀진 올리고뉴클레오티드 모방체인 이러한 올리고머 화합물 중 하나는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당 백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 대체된다. 핵염기는 보유되며, 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직접적으로 또는 간접적으로 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에서, 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드, 및 헤테로원자 백본, 특히 -CH2--NH--O--CH2--, 메틸렌 (메틸이미노) 또는 MMI 백본으로 공지된 --CH2--N(CH3)--O--CH2-, --CH2--O--N(CH3)--CH2--, --CH2N(CH3)--N(CH3)CH2- 및 -O--N(CH3)--CH2--- CH2--을 갖는 올리고뉴클레오시드가 바람직하며, 여기서 천연 포스포디에스테르 백본은 상기 참조된 미국 특허 제5,489,677호의 --O--P--O--CH2--, 및 상기 참조된 미국 특허 제5,602,240호의 아미드 백본으로 표시된다. 또한, 상기 언급된 미국 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬 (여기서, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 미치환된 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐일 수 있음). O(CH2),On,CH3, O(CH2)n,OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 및 O(CH2nON(CH2)nCH3)2이 특히 바람직하며, 여기서 n 및 m은 1 내지 약 10일 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에서 하기 중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터기, 인터칼레이터(intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약동학적 특성을 개선시키는 기 또는 올리고뉴클레오티드의 약력학적 특성을 개선시키는 기, 및 유사한 특성을 갖는 다른 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O--CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨) ([Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995,78, 486-504]), 즉, 알콕시알콕시기를 포함한다. 추가로 바람직한 변형은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 즉, O(CH2)2ON(CH3)2 기 (또한 본원의 이하 실시예에 기재된 바와 같이 2'-DMAOE로 공지됨), 및 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당업계에서 또한 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE로 공지됨), 즉, 2'-O--CH2--O--CH2--N(CH2)2를 포함한다.
다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시 (2'-OCH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오로 (2'-F)를 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 상의 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서 당의 3' 위치, 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 이루어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신 시클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 가질 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (종종 당업계에서 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바 "변형되지 않은" 또는 "천연" 핵염기는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 핵염기는 다른 합성 및 천연 핵염기, 예컨대 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (유사-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다.
나아가, 핵염기는 ['The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990]에 기재된 것들, ['Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, page 613, Englisch et al.]에 개시된 것들, 및 ['Antisense Research and Applications', Chapter 15, pages 289-302, Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993]에 개시된 것들을 포함한다. 이러한 핵염기 중 일부는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘, 및 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 N-2, N-6 및 0-6 치환된 퓨린을 포함한다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중체 안정성을 0.6 내지 1.2℃ 만큼 증가시키는 것으로 나타났으며 ([Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]), 이는 현재, 보다 더욱 특히 2'-O-메톡시에틸 당 변형과 조합될 때, 바람직한 염기 치환이다.
사용 방법
다양한 구현예에서, 본 개시는 STING 신호전달을 유도하는 본원에 기재된 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, STING의 활성화를 필요로 하는 대상에서 STING을 활성화시키는 방법을 제공한다.
나아가, 본원에 기재된 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 자극시키는 방법이 고려된다. 다양한 구현예에서, 면역 반응은 암, 미생물 감염 또는 자가면역 질환에서 진행 중인 면역 반응이다. 다양한 구현예에서, STING 활성화제는 면역 반응이 관해 상태에 있는 질환 또는 장애, 예를 들어 암 또는 자가면역 질환에 예방적으로 투여될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 개시는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 종양 또는 암을 앓는 대상에서 종양의 크기를 감소시키는 방법을 제공한다. 또한, 치료적 유효량의 STAV, 또는 STAV를 포함하는 약학적 조성물, 또는 본원에 기재된 바와 같은 STAV를 포함하는 벡터 또는 백신을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하거나 암의 재발을 예방하는 방법이 제공된다.
STAV로 치료될 수 있는 예시적인 병태 또는 장애에는, 식도암, 췌장암, 전이성 췌장암, 전이성 췌장 선암종, 방광암, 위암, 섬유성 암, 신경교종, 악성 신경교종, 미만성 내인성 뇌교 신경교종, 재발성 아동기 뇌 신생물 신장 세포 암종, 투명 세포 전이성 신장 세포 암종, 신장암, 전립선암, 전이성 거세 저항성 전립선암, IV기 전립선암, 전이성 흑색종, 흑색종, 악성 흑색종, 재발성 피부 흑색종, 흑색종 뇌 전이, IIIA기 피부 흑색종; IIIB기 피부 흑색종, IIIC기 피부 흑색종; IV기 피부 흑색종, 악성 두경부 흑색종, 폐암, 비(非)소세포 폐암 (NSCLC), 편평세포 비소세포 폐암, 유방암, 재발성 전이성 유방암, 간세포 암종, 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma), 여포성 림프종, 비(非)호지킨 림프종, 진행성 B-세포 NHL, HL 포함 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 다발성 골수종, 만성 골수성 백혈병, 차도가 있는 성인 급성 골수성 백혈병; Inv(16)(p13.1q22); CBFB-MYH11을 갖는 성인 급성 골수성 백혈병; t(16;16)(p13.1;q22); CBFB-MYH11을 갖는 성인 급성 골수성 백혈병; t(8;21)(q22;q22); RUNX1-RUNX1T1을 갖는 성인 급성 골수성 백혈병; t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL을 갖는 성인 급성 골수성 백혈병; t(15;17)(q22;q12);PML-RARA를 갖는 성인 급성 전골수성 백혈병; 알킬화제-관련 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 리히터 증후군(Richter's syndrome); 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 성인 교모세포종; 성인 신경교육종, 재발성 교모세포종, 재발성 아동기 횡문근육종, 재발성 유잉 육종(Ewing sarcoma)/ 말초 원시신경 외배엽성 종양, 재발성 신경모세포종; 재발성 골육종, 결장직장암, MSI 양성 결장직장암; MSI 음성 결장직장암, 비인두 비각질화 암종; 재발성 비인두 미분화 암종, 자궁경부 선암종; 자궁경부 선편평세포 암종; 자궁경부 편평세포 암종; 재발성 자궁경부 암종; IVA기 자궁경부암; IVB기 자궁경부암, 항문관 편평세포 암종; 전이성 항문관 암종; 재발성 항문관 암종, 재발성 두경부암; 두경부의 편평세포 암종, 두경부 편평세포 암종 (HNSCC), 난소 암종, 결장암, 위암, 진행성 GI 암, 위 선암종; 위식도 접합부 선암종, 골 신생물, 연조직 육종; 골 육종, 흉선 암종, 요로 암종, 재발성 메르켈(Merkel) 세포 암종; III기 메르켈 세포 암종; IV기 메르켈 세포 암종, 골수이형성 증후군 및 재발성 균상 식육종 및 세자리 증후군(Sezary syndrome)과 같은 암이 포함된다.
일부 구현예에서, 본 발명으로 치료될 수 있는 암에는, 난소암, 결장암, 흑색종, 유방암 또는 폐암이 포함된다.
본원의 방법은 대상에서 종양 크기 또는 종양 부담을 감소시키고/시키거나, 대상에서 전이를 감소시키는 것으로 고려된다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 종양 크기를 10%, 20%, 30% 이상 감소시킨다. 다양한 구현예에서, 상기 방법은 종양 크기를 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 감소시킨다.
본원의 방법은 종양 부담을 감소시키고, 또한 일단 암이 완화되면, 종양의 재발을 감소 또는 예방하는 것으로 고려된다.
다양한 구현예에서, 본원에 기재된 STAV 또는 STAV 조성물은 종양에서 면역 세포를 조절한다. 일부 구현예에서, STAV 또는 STAV 조성물은 종양에서 대식세포 또는 다른 식세포 또는 항원 제시 세포의 수를 증가시키고/시키거나 종양의 영역에서 세포의 식세포 활성을 증가시킨다.
본원에 기재된 바와 같은 STAV를 이용한 치료를 위해 고려되는 다른 병태 또는 장애에는, 면역 반응의 증가가 바람직할 수 있는 감염성 질환 또는 자가면역 질환이 포함된다. 예시적인 병태에는, 비제한적으로, 염증성 장질환 (예를 들어, 궤양성 대장염 또는 크론병(Crohn's disease)), 말초 혈관 질환, 대뇌혈관 사고 (뇌졸중), 염증성 세포 침윤을 갖는 병변을 특징으로 하는 장애, 아밀로이드 플라크가 뇌에 존재하는 장애 (예를 들어, 알츠하이머병(Alzheimer's disease)), 아이카디-구티에레스 증후군(Aicardi-Goutieres syndrome), 청소년 관절염, 골다공증, 근위축성 측삭 경화증 또는 다발성 경화증이 포함된다.
고려되는 예시적인 미생물 감염에는, 바이러스, 박테리아 또는 진균 감염이 포함된다.
투여 방법
비제한적으로, 종양내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 비강내, 근육내, 피부내, 피하, 경구 또는 연속 주입을 포함하는 다수의 방법이, dsDNA STAV, 또는 dsDNA를 포함하는 벡터, 백신 또는 바이러스 입자를 개체 (즉, 대상 또는 환자 포함)에게 투여 또는 도입하는데 사용될 수 있다. 벡터 또는 바이러스 입자가 투여되는 개체는 유인원, 또는 다른 예에서, 포유동물, 또는 다른 예에서, 인간이지만, 또한, 비제한적으로, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 고양이, 개, 햄스터, 마우스 및 래트를 포함하는 비(非)인간 포유동물일 수 있다. 벡터, 백신 또는 바이러스 입자의 사용에서, 개체는 벡터 또는 바이러스가 dsDNA를 도입할 수 있고, STING의 활성화를 유도하는 임의의 동물일 수 있다.
본 발명은 dsDNA, 벡터, 백신 또는 바이러스 입자를 포함하는 조성물을 포함하며, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 투여되는 벡터(들)의 양은 투여 경로, 개체의 상태, 악성종양 침입력의 정도 및 이용되는 특정한 벡터와 같은 여러 인자에 따라 달라질 것이다. 또한, 벡터는 다른 치료 방식과 함께 사용될 수 있다.
바이러스 벡터(들), 백신 또는 바이러스 입자로서 투여되는 경우, 약 102 내지 약 107 이하의 p.f.u., 다른 예에서, 약 103 내지 약 106 이하의 p.f.u., 및 다른 예에서, 약 104 내지 약 105 이하의 p.f.u.로 투여된다. 폴리뉴클레오티드 구성체 (즉, 바이러스로서 패키징되지 않음)로서 투여되는 경우, 본 발명의 바이러스 구성체는 약 0.01 μg 내지 약 100 μg 투여될 수 있으며, 다른 예에서, 0.1 μg 내지 약 500 μg, 및 다른 예에서, 약 0.5 μg 내지 약 200 μg 투여될 수 있다. 하나 초과의 벡터는 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 투여는 전형적으로 임의의 반응을 모니터링하면서, 주기적으로 제공된다. 투여는, 예를 들어 근육내, 정맥내, 종양내 또는 복강내로 제공될 수 있다.
dsDNA, 벡터(들), 백신 또는 바이러스 입자의 유효량이 투여되는 것으로 고려된다. "유효량"은, 충분한 체액성 또는 세포성 면역을 유도하는 것과 같은 목적하는 생물학적 효과를 달성하는데 충분한 양이다. 이는 백신의 유형, 수용체의 연령, 성별, 건강 및 체중에 따라 달라질 수 있다. 목적하는 생물학적 효과의 예에는, 비제한적으로, 면역 반응의 증가, STING 자극의 증가, 종양 크기 또는 종양 부담의 감소, 치료하고자 하는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 감소 또는 증상의 없음이 포함된다.
본 발명의 백신 또는 조성물은, 이의 존재가 종양 또는 다른 표적화된 세포 또는 미생물에 대한 적어도 하나의 1차 또는 2차 체액성 또는 세포성 면역 반응을 증강시키는 수용체 환자의 생리학에서 검출 가능한 변화를 유도하는 경우, 생리학적으로 유의하다. 예를 들어, 특정 구현예에서, STING 활성화제는 면역 세포의 종양 또는 감염 부위로의 침윤을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 면역 세포는 대식세포, 수지상 세포 또는 다른 식세포이다.
상기 조성물은, 목적하는 경우, 또한 소량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 상기 조성물은 액체 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제, 캡슐, 서방형 제형 또는 분말일 수 있다. 경구 제형은 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로오스, 탄산마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다.
일반적으로, 상기 성분들은, 예를 들어 활성제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐(sachet)와 같은 밀폐밀봉된 용기에 무수 농축물 또는 동결건조된 분말과 같은 단위 투여량 형태로, 별도로 또는 함께 혼합되어 공급된다. 상기 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 투여 전 성분들이 혼합될 수 있도록 멸균 희석제의 앰풀이 제공될 수 있다.
활성 성분으로서 본원에 기재된 억제제를 함유하는 본 개시의 약학적 조성물은, 투여 경로에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 함유할 수 있다. 이러한 담체 또는 첨가제의 예에는, 물, 약학적 허용 가능한 유기 용매, 콜라겐, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐 중합체, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 폴리아크릴 나트륨, 나트륨 알기네이트, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸 전분 나트륨, 펙틴, 메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 잔탄 검, 아라비아 검, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴 알코올, 스테아르산, 인간 혈청 알부민 (HSA), 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 약학적으로 허용 가능한 계면활성제 등이 포함된다. 사용되는 첨가제는, 적절한 경우, 본 개시의 투여량 형태에 따라, 비제한적으로, 상기 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
약학적 조성물의 제형은 선택된 투여 경로에 따라 달라질 것이다 (예를 들어, 용액, 에멀젼). 투여하고자 하는 억제제, 예를 들어 항체를 포함하는 적절한 조성물은 생리학적으로 허용 가능한 비히클 또는 담체에 제조될 수 있다. 용액 또는 에멀젼의 경우, 적합한 담체에는, 예를 들어 식염수 및 완충된 매질을 비롯한, 수성 또는 알코올성/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액이 포함된다. 비경구 비히클은 염화나트륨 용액, 덱스트로오스 링거액, 덱스트로오스 및 염화나트륨, 젖산화 링거액 또는 불휘발성 오일을 포함할 수 있다. 정맥 비히클은 다양한 첨가제, 보존제, 또는 유체, 영양소 또는 전해질 보충제를 포함할 수 있다.
다양한 수성 담체, 예를 들어 멸균 포스페이트 완충 식염수 용액, 정균수, 물, 완충수, 0.4% 식염수, 0.3% 글리신 등, 및 온건한 화학적 변형 등에 적용되는 증강된 안정성을 위한 다른 단백질, 예컨대 알부민, 지질단백질, 글로불린 등을 포함할 수 있다.
억제제의 치료적 제형은, 목적하는 순도를 갖는 억제제를 선택적인 생리학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 ([Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)])와 혼합하여, 저장을 위해 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조된다. 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 이용되는 투여량 및 농도에서 수용체에게 비독성이며, 이에는, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코오스, 만니톨 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로오스, 만니톨, 트레할로오스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대 이온; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 TWEEN™, PLURONICS™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면활성제가 포함된다.
본원의 제형은 또한 치료하고자 하는 특정 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합으로 존재한다.
상기 활성 성분은 또한, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미소구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 거대에멀젼에서, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 멸균되어야 한다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
제형에 이용되는 벡터, 백신 또는 바이러스 입자의 용량은 또한 투여 경로 및 환자의 성질에 따라 달라질 것이며, 표준 임상 기법에 따라 각 환자의 상황 및 의사의 판단에 따라 결정되어야 한다. 주어진 제제에 이용되는 벡터 또는 바이러스의 정확한 양은, 면역 활성을 생성하는데 필요한 최소량의 바이러스가 제공되는 한, 중요하지 않다. 밀리그램 이상의 양으로 약 10 mg 정도의 투여량 범위가 고려된다.
본 발명의 벡터 또는 바이러스 입자의 유효 용량은 또한 동물 모델 시험 시스템에서 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
하나의 구현예에서, 투여는 치료를 필요로 하는 영향을 받은 조직 또는 암의 부위에서, 제형을 내부로 전달할 수 있는 지속 전달 또는 지속 방출 메커니즘을 통해, 또는 상기 부위로의 직접 주사에 의해 수행된다. 예를 들어, 조성물 (예를 들어, 가용성 폴리펩티드, 항체 또는 소분자)의 지속 전달을 가능하게 하는 생분해성 미소구체 또는 캡슐 또는 생분해성 중합체 구성이 암의 부위 또는 근처에 이식된 본 개시의 제형에 포함될 수 있다.
치료적 조성물은 또한 다수의 부위에서 환자에게 전달될 수 있다. 다중 투여는 동시에 이루어지거나, 일정 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 특정한 경우, 치료적 조성물의 지속적인 흐름을 제공하는 것이 유리하다. 부가적인 요법은 기간별로, 예를 들어 매시간, 매일, 격일로, 주2회, 주3회, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월 또는 보다 긴 간격으로 투여될 수 있다.
병용 요법
본 개시의 STAV 또는 이의 조성물은 STAV 요법이 사용되는 병태 또는 장애, 예를 들어 암, 감염 또는 자가면역 질환을 치료하는데 유용한 제2 작용제와 함께 투여되는 것으로 고려된다.
2가지 치료제의 동시 투여는, 작용제들이 이의 치료 효과를 발휘하는 기간이 중복되는 한, 작용제들이 동시에 또는 동일한 경로로 투여될 필요는 없다. 상이한 날 또는 주에 투여되는 것과 같이, 동시 또는 순차적 투여가 고려된다.
제2 작용제는 암 또는 면역학적 장애를 치료하는데 유용한 다른 치료제, 예컨대 사이토카인, 성장 인자, 다른 억제제 및 표적 항원에 대한 항체, 예를 들어 이필리무맙(ipilimumab) (YERVOY®, Bristol-Myers Squibb Company), CTLA-4에 대한 항체; 베바시주맙(bevacizumab) (AVASTIN®, Genentech), VEGF-A에 대한 항체; 엘로티닙(erlotinib) (TARCEVA®, Genentech and OSI Pharmaceuticals), EGFR 상에 작용하는 티로신 키나아제 억제제, 다사티닙(dasatinib) (SPRYCEL®, Bristol-Myers Squibb Company), 경구 Bcr-Abl 티로손 키나아제 억제제; IL-21; 페길화된 IFN-α2b; 악시티닙(axitinib) (INLYTA®, Pfizer, Inc.), 티로신 키나아제 억제제; 및 트라메티닙(trametinib) (MEKINIST®, GlaxoSmithKline), MEK 억제제 ([Philips and Atkins, Int Immunol., 27(1):39-46 (2015)], 이는 본원에 참조로서 인용됨)일 수 있다.
본 개시의 STAV 및 제2 작용제는 동일한 제형으로 동시에 제공될 수 있다고 고려된다. 나아가, STAV 및 제2 작용제는 별개의 제형으로 투여되고, 동시에 투여되는 것으로 고려되며, 여기서 동시에는 작용제들이 서로 30분 이내에 제공되는 것을 나타낸다. 나아가, 제3 작용제가 상기 억제제와 동시에 제공될 수 있다고 고려된다.
또 다른 양태에서, STAV는 제2 작용제의 투여 전에 투여된다. 투여 전은, 제2 작용제로의 치료 1주 전에서 제2 작용제의 투여 30분 전까지의 범위 내에서의 STAV의 투여를 나타낸다. 나아가, STAV는 제2 작용제의 투여 후에 투여되는 것으로 고려된다. 후속 투여는 STAV 치료 후 30분에서 STAV 투여 후 1주 까지의 투여를 설명하는 것을 의미한다.
나아가, 적절한 경우, 다른 보조 요법이 투여될 수 있다고 고려된다. 예를 들어, 적절한 경우 환자에게 또한 외과적 요법, 화학요법, 세포독성제, 광역학적 요법 또는 방사선 요법이 투여될 수 있다.
나아가, 본원의 STAV가, 예를 들어 사이토카인 또는 성장 인자 또는 화학요법제와 같은 제2 작용제와 조합으로 투여될 때, 투여는 또한 방사선 요법제 또는 방사선 요법의 사용을 포함하는 것으로 고려된다. 항체 조성물과 조합으로 투여되는 방사선 요법은 암의 치료를 받는 환자에게 전형적으로 제공되는 용량으로 치료의에 결정된 바와 같이 투여된다.
세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포의 유발하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I131, I125, Y90 및 Re186), 화학요법제, 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 합성 독소와 같은 독소, 또는 이의 단편을 포함하는 것으로 의도된다. 비(非)세포독성제는 세포의 기능을 억제 또는 방지하지 않고/않거나 세포의 파괴를 유발하지 않는 물질을 나타낸다. 비세포독성제는 세포독성으로 활성화될 수 있는 작용제를 포함할 수 있다. 비세포독성제는 비드, 리포솜, 매트릭스 또는 입자를 포함할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공보 2003/0028071 및 2003/0032995 참조, 상기 문헌들은 그 전문이 본원에 참조로서 인용됨). 이러한 작용제는 본 개시에 따른 항체와 컨쥬게이션, 커플링, 연결 또는 회합될 수 있다.
본 개시의 항체와 함께 사용되는 것으로 고려되는 화학요법제에는, 비제한적으로, 표 I에 열거된 것들이 포함된다:
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
키트
추가의 양태로서, 본 개시는 본 개시의 방법을 실시하기 위해 이들의 사용을 용이하게 하는 방식으로 패키징된 하나 이상의 화합물 또는 조성물을 포함하는 키트를 포함한다. 하나의 구현예에서, 이러한 키트는 방법을 실시하는데 있어서의 화합물 또는 조성물의 사용을 설명하는 패키지에 포함된 또는 용기에 부착된 라벨과 함께, 밀봉된 병 또는 통과 같은 용기에 패키징된 본원에 기재된 화합물 또는 조성물 (예를 들어, 단독으로, 또는 또 다른 항체 또는 제3 작용제와 조합으로 표적-특이적 항체를 포함하는 조성물)을 포함한다. 바람직하게는, 상기 화합물 또는 조성물은 단위 투여량 형태로 패키징된다. 키트는 특정 투여 경로에 따라 조성물을 투여하거나 스크리닝 검정을 실시하는데 적합한 장치를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트는 억제제 조성물의 사용을 설명하는 라벨을 함유한다.
본 개시의 추가의 양태 및 세부사항은, 제한이 아닌 예시적인 것으로 의도되는 하기 실시예로부터 명백해질 것이다.
실시예 1
적응성 면역 반응을 촉진시키는데 있어서 STING의 중요성을 추가로 조사하기 위해, 다양한 DNA-의존성 핵산을 생성하고, STING 신호전달을 활성화시키는 이의 능력을 조사하였다.
방법
마우스. STING 녹아웃 마우스 (SKO)를 이전에 기재된 바와 같이 ([Ishikawa and Barber, Nature 455:674-8, 2008]) 생성하고, C57BL/6J와 역교배하였다. 야생형 C57BL/6J 마우스 (WT)는 잭슨 실험실(Jackson Laboratory)로부터 제공받았다. cGAS 녹아웃 마우스 (cGAS KO)는 Herbert W. Virgin IV 박사 (워싱턴 의과 대학)로부터 제공받았다. TLR9 녹아웃 마우스 (TLR9KO)는 잭슨 실험실에서 구입하였다. 마우스 관리 및 연구는 마이애미 대학의 실험동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Miami)의 승인 하에 수행하였다. 상업적 공급업체 (Transnetyx)에 의해 각각의 유전자에 대하여 설계된 특정 프로브와 함께 실시간 PCR을 사용하여, 꼬리 생검으로부터 마우스 유전자형을 결정하였다.
세포. B16-OVA 세포 (B16)는 Eli Gilboa 박사 (마이애미 대학교)로부터 제공받아, 10% 열 불활성화 소 태아 혈청 (FCS, Invitrogen)을 포함하는 완전한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 293, 293T 세포 및 hTERT 세포는 ATCC에서 구입하였다. 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)는 표준 절차에 따라 e13.5 배아로부터 수득하였다. 대식세포 유래 골수 (BMDM; MΦ)는 8 내지 10 주령의 WT, SKO, cGASKO, TLR9KO, DNase IKO, DNase II KO 또는 DNase III (Trex1) KO 마우스의 뒷다리 대퇴골에서 단리하였다. 간략하게, 골수 세포를 26 게이지 바늘을 이용하여 완전한 DMEM을 포함한 뼈로부터 플러싱하였다. 상기 세포를 10 ng/ml의 마우스 재조합 콜로니 자극 인자(M-CSF, R&D Systems)를 포함하는 완전한 DMEM (Invitrogen)에서 10 내지 14일 동안 배양하였다.
STING-의존성, TLR9-비의존성 아쥬반트 (STAV). 말단에서 포스포로티오에이트 (S-올리고)로 변형된 ssDNA 센스 가닥 (polyA90mer)을 안티센스 가닥 (polyT90mer); STAV와 동일한 변형을 갖는 ssDNA 안티센스 가닥에 어닐링하였다. 각각의 올리고는 TriLink Biotechnologies에서 합성 및 변형하였다.
시험관내 식균 작용. MΦ를 상기 기재된 바와 같이 배양하고, 12 웰 플레이트 (웰 당 2 x 105개의 세포)상에 씨딩하였다. B16-OVA 세포를 3 ug/ml의 STAV로 3 시간 동안 트랜스펙션시키고, 120 mJ/cm2의 UVC500 UV 가교제를 조사한 후, 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 처리된 B16-OVA 세포를 대식세포에 6 시간 동안 첨가하였다. 포식되지 않은 B16-OVA 세포를 제거하기 위해 격렬하게 세척한 후, 대식세포를 qPCR 및 유전자 어레이 분석을 위한 RNA 추출을 위해 수확하였다. 식균 작용 효율을 확인하기 위해, 대식세포를 식균 작용 4 시간 후에 수집하고, APC-항-마우스 CD11b 항체 (eBiosciences)를 사용하여 염색하였다. 포식된 세포의 백분율은 LSRII 기기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 유세포 분석법에 의해 평가하였다.
유전자 어레이 분석. RNeasy 미니 키트 (Qiagen)를 이용하여 세포 또는 조직으로부터 전체 RNA를 단리하였다. RNA 품질은 Bionalyzer RNA 6000 Nano (Agilent Technologies)로 분석하였다. 유전자 어레이 분석은 마이애미 대학의 인간 게놈을 위한 Hussman 기관(Hussman Institute for Human Genomics University of Miami)에서 Affymetrix 마우스 유전자 어레이 (2.0 ST 어레이)로 조사하였다. 유전자 발현 프로파일을 처리하고, 마이애미 대학의 공중 보건 대학(Public health science, University of Miami)에서 통계 분석을 수행하였다.
정량적 실시간 PCR (qPCR). 전체 RNA를 트리졸법(Trizol method)을 사용하여 세포로부터 추출하고, M-MLV 역전사효소 (Promega)로 역전사시켰다. 실시간 PCR은 TaqMan 유전자 발현 검정 (Ifn-β: Mm010439546, Cxcl10 : Mm00445235 ; Applied Biosystems)으로 수행하였다.
세포 사멸 유도 및 분석. B16-OVA 세포를 3μg/mL STAV로 3 시간 동안 트랜스펙션시킨 후, UV 광 (120 mJ/cm2)으로 처리하였다. 37℃, 5% CO2에서 24 시간 후, 세포를 수집하고, 골수 유래 대식세포에 6 시간 동안 공급하였다. B16-OVA 세포 생존율은 1 μg/mL 프로피듐 요오다이드 (eBiosciences) 및 APC-표지된 아넥신 V (eBiosciences)로 염색 후, FACSCantoII (Becton Dickinson, USA)을 이용하여 유세포 분석법 분석으로 평가하였다.
트랜스펙션 효율. B16-OVA 또는 293T 세포로의 STAV 트랜스펙션 효율은 유세포 분석법 분석으로 평가하였다. 상기 세포를 3 μg/ml의 FAM-표지된 STAV로 트랜스펙션시켰다. 24 시간 후, 세포를 수집하고, LSRII 기기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다.
항원 제시 검정. 골수 유래 대식세포를 3 μg/ml의 STAV로 24 시간 동안 트랜스펙션시킨 후, SIINFEKL (3 μM) 유무 하에서 펄싱하였다. 2 시간 후, 세포를 APC-표지된 항-H-2Kb-SIINFEKL (클론 25-D1.16) (Biologend) 및 FITC-표지된 항-마우스 CD11b (eBiosciences)로 염색하였다. H-2Kb 상에의 SIINFEKL의 제시는 LSRII 기기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 유세포 분석법으로 평가하였다.
면역형광 염색. 세포를 DMEM 중4% 파라포름알데히드로 37℃에서 15 분 동안 고정시키고, 0.2% Triton X-100으로 투과 가능하도록 만들었다. 고정되고 투과 가능해진 세포를 PBS 중 10% BSA로 차단하고, PBS 중 2% BSA 중에서 1차 항체와 함께 인큐베이션한 후, 형광단-컨쥬게이션된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다 (Dapi 대조염색 포함). 염색 후, 세포를 항페이드 (anti-fade) 고정 용액 (Invitrogen)에 고정시키고, Leica SP5 스펙트럼 공초점 도립 현미경 하에서 조사하였다.
질량 분광법 분석. 세포를 3 μg/ml의 STAV로 3 시간 동안, 또는 1 μg/ml의 pCMV 또는 pcGAS 플라스미드로 24 시간 동안 트랜스펙션시켰다. 적절한 처리 후, 1 x 107개의 세포를 펠릿화하고, 액체 질소 중에 급속 냉동시키고, 추가 처리 전 -80℃에서 저장하였다. cGAMP를 추출하기 위해, 동결된 세포를 얼음 위에서 해동시키고, 2% (vol/vol) 아세트산 (HAc)을 포함하는 냉각된 80% (vol/vol) 메탄올 중에 용해시켰다. 시클릭-디-GMP를 내부 표준으로서 보충하였다. 세포 용해물을 4℃, 10,000 x g에서 10 분 동안 원심분리하여 제거하였다. 펠릿을 2% HAc를 포함하는 20% (vol/vol) 메탄올 중에서 추가로 2회 추출하고, 모든 추출물을 풀링하였다. 이어서, cGAMP를 2015년 Gao 등에 의해 기재된 바와 같이, HyperSep 아미노프로필 SPE 컬럼 (Thermo Scientific)을 사용하여 고체상 추출 (SPE)에 의해 농축시켰다. 간략하게, 컬럼을 100% 메탄올로 활성화시키고, 2% HAc로 2회 세척하고; 추출물을 통해 추출한 후, 컬럼을 2% HAc로 2회 및 80% 메탄올로 1회 세척하고, 최종적으로 80% 메탄올 중 2% (vol/vol) 수산화암모늄으로 용리하였다. 용리액을 회전-진공으로 건조시키고, 액체 크로마토그래피 (LC)/MS-등급 물 중에 재구성하고, LC/MS 분석에 적용하기 전 -20℃에서 저장하였다. Thermo Scientific Surveyor MS Pump Plus 펌프 및 Micro AS 자동샘플러를 사용하여 크로마토그래피를 수행하였다. 18:82 물:아세토니트릴, 6.3 mM 수산화암모늄 및 6.3 mM 탄산수소암모늄을 사용하여 200 ul/분으로 Water's XBridge 아미드 컬럼 (3.5 um, 2.1 x 100 mm) 상에서 등용매 분리하였다. 샘플을 선형 이온 트랩 및 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명 질량 분광계로 이루어진 하이브리드 질량 분광계인 Thermo Scientific LTQ-FT에 도입하였다. 표준 전기분무 공급원을 음이온 모드로 작동시키는데 사용하였다. cGAMP를 m/z 673의 탈양성자화된 모 이온의 충돌-유도 해리로부터 m/z 522 생성물 이온을 사용하여 정량화하였다. 8개의 표준물에서 유도된 외부 보정 곡선 [원하는 경우, 표준물 제조에 대하여 상술할 수 있음]을 정량화에 사용하고, 샘플의 분석 전후에 획득하였다. c-디-GMP 성분을 탈양성자화된 m/z 689 모 이온에서 유래된 m/z 344 생성물 이온으로부터 정량화하였다.
생체내 모델. 항종양 효과에 대하여, 마우스 우측 옆구리에 5 x 105개의 B16-OVA 세포를 피하 주사하였다. 1 주일 후, 종양의 부피가 50mm3이 되면, 10 μg의 STAV를 3 일마다 3회 종양내 (i.t.) 주사하였다. 종양 부피를 캘리퍼를 사용하여 측정하고, 하기 식을 이용하여 계산하였다: V=(길이 x 너비2)/2. 종양 보유 마우스에서 백신접종 후, 마우스에게 B16 OVA 세포 (마우스 당 1 x 105개의 세포)를 정맥내 (i.v.) 주사하였다. 1, 3, 7 및 14 일차에, 마우스에게 UV 조사된 B16 OVA 세포 (마우스 당 1 x 106개의 세포)를 복강내 (i.p.) 주사하였다. 생존율을 110 일 동안 모니터링하였다. B16-OVA 세포를 3 μg/ml의 STAV로 3 시간 동안 트랜스펙션시키고, 120 mJ/cm2의 UVC500 UV 가교제로 조사한 후, 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
OVA 특이적 CD8+ T 세포 분석 및 IFNγ ELISA. 1~2 x 106 개의 비장세포를 H-2Kb/SIINFEKL Pro5® Pentamer (ProImmune, UK)로 22℃에서 10 분 동안 염색하였다. 이어서, 세포를 2회 세척한 후, FITC-표지된 항-마우스 CD8 (eBiosciences) 및 PECy5-표지된 항-마우스 CD19 (ProImmune, UK) 항체와 함께 얼음 위에서 20 분 동안 인큐베이션하고, 빛을 차단하였다. 2회 추가의 세척 후, 세포를 고정액에 재현탁시키고, LSRII 기기 (Becton Dickinson, USA)를 사용하여 유세포 분석법으로 분석하였다. IFNβ ELISA의 경우, 1 x 106개의 비장세포를 플레이팅하고, SIINFEKEL 펩티드 (10 μg/ml)로 자극하였다. 자극 2일 후, 상청액을 수확하고, BD 마우스 IFNβ 키트로 IFNβ 생성을 추정하였다.
통계 분석. 모든 통계 분석은 스튜던트 t-검정으로 수행하였다. 데이터는 P < 0.05인 경우, 유의하게 상이한 것으로 간주하였다.
결과
적응성 면역 반응을 촉진시키는데 있어서 STING의 중요성을 추가로 조사하기 위해, 다양한 DNA-의존성 핵산을 생성하고, STING 신호전달을 활성화시키는 이의 능력에 대하여 조사하였다. 엑소뉴클레아제 분해를 방지하는 것을 돕기 위해, 쥣과 세포 (MEF; 쥣과 배아 섬유아세포)에서 대략 30 bp 초과 또는 인간 세포 (hTERT 및 1차 인간 대식세포)에서 70 bp 초과로의 5'말단이 변형된 트랜스펙션된 시토졸 dsDNA가, STING의 효율적인 활성화에 필요했다는 점에 주목해야 한다 (도 1a 내지 1i). 트랜스펙션 후 효과는 서열 특이성에 대체로 독립적인 것으로 보였으며, AT 또는 GC 풍부 구조 둘 모두 STING 활성을 용이하게 촉발시킬 수 있었다. 이러한 노력의 결과로서, 변형된 5'-말단을 갖는 90 bp의 AT 풍부 STING 활성화 dsDNA 리간드 (STAV로서 지칭됨)를 추가 연구에 사용하였다. 쥣과 B16 세포를 비롯한 다양한 세포의 트랜스펙션 후, 대부분의 STAV가 아직 정의되지 않은 세포 구획에서 세포의 시토졸에 남아있음을 관찰하였다 (도 2a). 정량화 연구는, 정량화 분석에 의해 결정된 바와 같이, 시토졸 STAV가 총 세포 DNA 함량의 대략 1%를 구성하는 것으로 나타났다 (도 1j).
세포 포식 후 APC의 자극에서 STING 신호전달의 중요성을 평가하기 위해, B16 세포를 통상적으로 90% 초과의 트랜스펙션 효율을 수득하는 STAV로 트랜스펙션시키고 (도 2a), Cxcl10을 비롯한 사이토카인 생성의 증가를 관찰함에 의해 결정된 바와 같이, B16 세포가 시토졸 DNA-의존성 STING 신호전달을 나타냄을 확인하였다 (도 2b 내지 2e 및 도 11). 이는, 수많은 유형의 암 세포가 STING 신호전달에 결함이 있는 것으로 이전에 밝혀졌기 때문에, 아마도 내인성 STING 신호전달을 통해 발생할 수 있는 DNA-손상 매개 사이토카인 생성을 회피하기 위해 수행되었는데, 이는 아마도 손상된 세포 근처로 면역계에 경고를 보낼 가능성이 있다 ([Xia et al., Cell Rep 14:282-297, 2016]; [Xia et al., Cancer Res., 76:6747-6759, 2016]). 이어서, STAV 함유 세포를 UV 처리하여, 24 시간 내 90% 초과의 아폽토시스를 촉발시켰고, 세포를 시험관내에서 식세포 (쥣과 골수 유래 대식세포)에 공급하였고 (도 2f), STAV의 90%가 처리된 세포에 남아있었다 (도 3a 및 3b). 대식세포의 대략 50%가 형광 표지된 STAV로 트랜스펙션된 B16 세포를 사용하여 결정된 바와 같이 세포를 지속적으로 포식하였다 (도 2f 내지 2h, 도 3c). UV 처리된 B16 세포 단독 또는 Poly I:C 함유 B16 세포는, Cxcl10, 제1형 IFN, 대식세포 성숙 마커 (CD86) 및 제1형 MHI (H2kD)를 측정하여 확인된 바와 같이, 대식세포를 자극하는데 실패하였다 (도 2i 내지 2l, 도 3d). 하지만, STAV를 함유한 B16 세포는 대식세포 내 외인성 STING 신호전달에 의존적인 대식세포에서 사이토카인의 생성을 강하게 유도하였다 (도 2i 내지 2l). STAV를 함유하는 HEK293 세포의 식균 작용 후 유사한 효과가 관찰되었다 (도 4 및 도 12). 이러한 데이터는, 아폽토시스성 세포 단독이 아닌, 포식된 아폽토시스성 세포에 존재하는 외인성 시토졸 DNA 종이 트랜스에서 대식세포의 활성화를 강력하게 자극할 수 있음을 나타냈다.
가능하게는, 트랜스펙션된 시토졸 DNA는 처리된 세포 내 내인성 STING 신호전달을 자극하고, APC 활성화를 유발할 수 있는 면역조절 사이토카인의 생성을 촉진시킬 수 있다. 따라서, STING이 포식된 세포 자체 내에서 외인적으로 또는 내인적으로 작용하는지를 평가하기 위해, STING 또는 cGAS가 결여된 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 STAV로 처리하고, STING 및 cGAS 둘 모두 시토졸 DNA의 존재 하에서 제1형 IFN와 같은 사이토카인을 생성하는데 필요하다는 것을 확인하였다 (도 5a 및 5b). 이어서, UV 처리된 MEF를 대식세포와 함께 인큐베이션하여 대식세포의 활성화를 확인하였다 (도 5c). 결과는 다시, 시토졸 DNA를 함유하는 아폽토시스성 세포만 대식세포를 활성화시킬 수 있음을 나타냈다 (도 5d 및 5e). 사실, STAV로 트랜스펙션된 cGAS 또는 STING이 결여된 MEF는, APC를 활성화시키기 위해 남아있었는데, 이는 포식된 세포 내 STING-의존성 사이토카인 생성이 시험관내 대식세포 활성화에 완전히 필수적이 아님을 나타낸다 (도 5a, 5d 및 5e). 이러한 데이터는, 내인성 세포 DNA가 아닌, 외인성 시토졸 DNA가 대식세포를 비롯한 APC의 자극에 기여한다는 것을 시사한다. 이러한 연구를 보충하기 위해, STAV를 cGAS 및 STING 둘 모두가 결여된 인간 293T 세포에 트랜스펙션시켰다. 정상적인 인간 hTERT 세포와 달리, 293T 세포는 결과적으로 STAV에 대한 반응에서 제1형 IFN을 생성할 수 없었다 (도 5f). 이어서, STAV-처리된 293T 세포를 쥣과 대식세포와 함께 인큐베이션하고, STAV를 함유하는 293T 세포만 포식성 대식세포에서 사이토카인 생성을 자극할 수 있음을 관찰하였다 (도 5g 및 5h). 이러한 효과는 대식세포에서 STING 신호전달에 의존적이었다 (도 5g 및 5h). 293T 세포에는 cGAS도 STING도 존재하지 않기 때문에, 포식성 대식세포의 자극은 아마도 APC (즉, 대식세포)에서 STING 신호전달을 촉진시키는 시토졸 DNA (STAV)에 의해 트랜스에서 직접 발생할 수 있다.
핵 DNA, 및 아마도 미토콘드리아 DNA는 아폽토시스 과정 동안 분해되는 것으로 당업계에서 받아들여진다. 핵 내 해당 뉴클레아제는 CAD (카파아제 활성화된 DNAse)를 포함하며, 이는 뉴클레오좀 사이에서 게놈 DNA를 절단한다 (14, 19). 따라서, STING을 활성화시키는데 충분한 핵 DNA의 단편은 생성될 수도 없고, STING 신호전달을 활성화시키기 위해 시토졸로 빠져나갈 수도 없다.
이를 고려하여, 포식성 APC 내에서의 활성화를 위한 STING 신호전달의 중요성, 및 외인성 STING 신호전달의 중요성을 조사하였다. 이를 달성하기 위해, B16 세포를 STAV로 처리하고, STING 또는 cGAS가 결여된 쥣과 대식세포에 공급하였다. 이러한 분석은 놀랍게도 STING이 아닌, cGAS 또는 TLR9가 결여된 대식세포가, STAV를 함유하는 세포에 의해 용이하게 활성화될 수 있음을 나타냈다 (도 6a). 따라서, cGAS가 아닌, STING이 세포 포식 후 APC의 활성화에 필수적이다. 이러한 사건은 TLR9를 필요로 하지 않았다. 하지만, 이러한 과정에서 cGAS 자체 또한 필요하지 않았는데, 이는 UV 처리된 세포 내 STAV가 APC에서 대안적인 DNA 결합인, STING-활성화 분자에 결합할 수 있거나, 또는 반대로 CDN이 cGAS에 의해 B16 세포와 함께 생성되고, 이러한 리간드가 트랜스에서 APC 내에서 외인적으로 STING을 활성화시킬 수 있음을 시사한다. 이를 평가하기 위해, cGAS가 B16 세포에서 발현되었음을 확인하였고, 질량 분광법은 미처리된 것이 아닌, STAV 처리된 B16 세포가 CDN을 생성하고 (도 6b), 또한 마찬가지로 트랜스에서 작용할 수 있음을 보여주었다.
이를 추가로 확인하기 위해, cGAS 또는 STING이 결여된 293T 세포를 STAV로 트랜스펙션시켰다. B16 또는 MEF 세포와 달리, 이러한 세포는 CDN을 생성할 수 없다. STAV-함유 293T 세포가 STING이 결여된 대식세포가 아닌, 대조군 대식세포를 적당히 자극할 수 있었음을 확인하였다 (도 6c). 또한, STAV가 아마도 APC 내에서 cGAS-생성 CDN 생성을 활성화시켜 STING을 활성화시킬 수 없기 때문에, cGAS가 결여된 대식세포가 STAV를 함유하는 293T 세포에 의해 유사하게 활성화될 수 없음을 관찰하였다 (도 6c). 이를 추가로 탐구하기 위해, 293T 세포를 cGAS를 발현하는 플라스미드로 재구성하였다. 데이터는, 질량 분광법에 의해 결정된 바와 같이 cGAS를 발현하는 293T 세포가 CDN을 용이하게 생성할 수 있으며, 이러한 CDN 함유 세포가 시토졸 DNA (STAV) 단독과 비교하여, STING-의존적 방식으로 대식세포를 유의하게 활성화시킬 수 있음을 보여준다 (도 6c). 293T 생성 CDN이 거의 확실하게 STING에 직접적으로 작용할 수 있기 때문에, cGAS 재구성 293T 세포는 cGAS 자체가 결여된 대식세포를 활성화시킬 수 있었다 (도 6c 및 6d). 이러한 효과를 유사하게 cGAS가 결여된 인간 결장암 세포주 (HT116)를 사용하여 확인하였다 (도 6e). 또한, 상기 데이터는, DNA 바이러스 HSV1 (γ34.5)이 또한 B16 세포의 감염 후 STAV에 유사하게 기능하였음을 나타냈다. 즉, 감염되지 않은 세포가 아닌, 포식된 바이러스-감염된 세포만 대식세포를 활성화시킬 수 있었다. 나아가, 이러한 사건은 유사한 cGAS/STING-의존적 방식으로 발생하였다 (도 6f).
결과는, 세포에 트랜스펙션된 STAV가 대식세포에서 cGAS/STING 축을 외인적으로 활성화시킬 수 있음을 시사한다. 두 번째로, STAV는 세포 내 CDN을 생성할 수 있으며, 이는 또한 APC에서 외인성 STING 신호전달을 자극하기 위해 트랜스에서 작용할 수 있다. 나아가, 예를 들어 종양 세포 내에서의 cGAS의 재구성은 STING을 통해 대식세포의 활성화를 자극하기 위해 트랜스에서 유사하게 작용할 수 있는 CDN을 생성할 수 있다. 최종적으로, 숙주 대식세포는, 주로 STAV와 유사한 바이러스 세포질 DNA의 cGAS/STING 검출을 통해, 바이러스 감염된 세포와 감염되지 않은 죽어가는 세포를 구별할 수 있다.
세포 내에서 생성된 CDN이 트랜스에서 대식세포를 자극할 수 있는 상당한 능력을 나타낸다는 것을 고려하여, CDN을 B16 및 293T 세포로 직접 트랜스펙션시키고, 상기 세포를 대식세포에 공급하였다. 이러한 분석은, 외인적으로 첨가된 CDN을 함유하는 종양 세포가 대식세포에 의해 용이하게 포식되었지만, 대식세포 활성화 또는 트랜스에서의 STING 신호전달의 강력한 활성화제는 아니었음을 나타냈다 (도 5). 이는, cGAS가 종양 세포 내에서 트랜스펙션되어 내인성 CDN을 생성하였던 경우와 대조적이다. 대조적으로, APC로의 CDN 또는 사실상 STAV의 직접 트랜스펙션은, 이의 활성화를 용이하게 유도하고, STING 특이적 방식으로 항원의 교차 제시를 증강시킬 수 있었다 (도 7). 본 결과는, 외인적으로 첨가된 CDN이 암 세포 자체에 작용함으로써 이의 항종양 효과를 발휘하는 것으로 보이는 것이 아니라, 세포 포식 후 STING-의존성 사이토카인 유도 항원 교차 제시를 촉진시키기 위해 APC를 직접 자극함으로써 기능할 가능성이 더 높음을 나타낸다.
따라서, 본 데이터는, 시토졸 DNA (STAV) 또는 CDN이 APC를 직접 또는 간접적으로 활성화시키고, 항원 교차 제시를 촉진시킬 수 있음을 나타낸다. 세포 DNA가 아닌 시토졸 DNA (STAV)가 트랜스에서 APC를 자극할 수 있었던 이유는 아직 확실하지 않은 채로 남아있다. 핵 DNA, 및 아마도 미토콘드리아 DNA는 아폽토시스 과정 동안 분해된다. 뉴클레오좀 사이에서 게놈 DNA를 절단하는 핵 내 해당 뉴클레아제는 CAD (카파아제 활성화된 DNAse)를 포함한다 (14, 21). 따라서, STING 신호전달을 활성화시키는데 충분한 핵 DNA의 단편은 생성될 수도, 시토졸로 빠져나갈 수도 없다. 대식세포에 의한 포식 후, 나머지 DNA는 APC의 리소좀 구획 내 DNaseII와 같은 부가적인 DNase에 의해 분해된다 (13, 18). 따라서, 시토졸 DNA 종 (STAV/바이러스 DNA)이 아폽토시스성 세포 내에서 세포 분해를 회피하고, APC에서의 후속 포식이 리소좀 구획을 보다 용이하게 이용할 수 있으며, APC에서 외인성 cGAS-STING 신호전달을 자극한다는 것이 그럴듯하다. 이를 추가로 탐구하기 위해, DNase I (도 8b), II (도 8b) 또는 III (Trex1) (도 8d)이 결여된 마우스로부터 대식세포를 회수하고, STAV가 결여된 또는 이를 함유하는 B16 세포를 공급하였다. 데이터는 다시, 아폽토시스성 세포가 정상 대식세포를 불량하게 활성화시키는 것으로 나타냈는데, 이는 아마도 종양 세포가 일반적으로 비(非)면역원성인 이유를 설명한다. 하지만, DNase I 또는 DNase III이 아닌, DNase II가 결여된 APC가 미처리된 아폽토시스성 세포의 포식 후 사이토카인 생성의 증가를 나타냈다 (도 8). 이러한 사건은 STAV 함유 세포에서 크게 강화되었다 (도 8).
이러한 데이터는, CAD와 같은 DNase가 아폽토시스성 세포 내에서 자가-DNA를 효율적으로 분해하여 대식세포의 활성화를 방지하는 것을 돕는다는 것을 확인시켜준다. 또한, APC에서 DNaseII는 주로 분해를 회피하는 임의의 포식된 아폽토시스성 DNA가 리소좀 구획에서 비(非)STING 활성화 뉴클레오티드로 분해되는 것을 보장한다. 흥미롭게도, 시토졸 DNA (STAV) 또는 세포질 바이러스 DNA를 함유하는 세포는 죽어가는 세포에서 분해를 회피할 수 있으며, DNaseII에 의한 분해 전, 외인성 cGAS/STING 신호전달을 자극할 수 있다. 따라서, DAMP와 같은 CDN은 포식 후 분해를 보다 잘 회피할 수 있으며, 세포가 감염되거나 DNA 손상을 겪고 활성화되는 것을 식세포가 결정할 수 있게 한다.
본원의 데이터는, 세포가 STING에 의해 통제되는 것들과 같은 자가-DNA 활성화 내재적 면역 센서 경로의 치명적인 가능성을 제거하기 위한 효율적인 방법을 고안하였음을 시사한다 (18, 22). 마찬가지로, 종양 세포는 또한 이러한 과정을 이용하여 면역학적으로 무능한 상태로 남는다. STAV가 생체내에서 종양 세포를 면역원성으로 만들 수 있는지를 결정하기 위해, STAV를 함유하거나 STAV가 결여된 B16-OVA 흑색종 세포를 면역적격성 C57BL/6J 마우스에 종양내 접종하였다 (도 9a). STAV로 처리된 B16-OVA 세포가 미처리된 세포가 접종된 마우스와 비교하여 더 적은 성장을 나타냄을 관찰하였다 (도 9b). 또한, STAV 함유 세포는 수용체 마우스에서 STING의 부재 하에서 어떠한 항종양 활성도 발휘하지 못했다 (도 9c). 종양 성장을 억제하는 STAV의 능력은, 항-SIINFEKL 특이적 CD8 T 세포를 측정함으로써 결정된 바와 같이, 종양에 대한 항종양 CTL의 생성을 수반하였다 (도 9d). 이러한 데이터는, STAV를 함유하는 종양 세포가 항종양 면역의 강력한 자극제일 수 있음을 나타낼 수 있다.
STAV 함유 세포가 쥣과 모델에서 면역 반응을 생성할 수 있는지를 추가로 평가하기 위해, B16-OVA 세포에 STAV를 로딩하고, 방사선 조사하여, B6 마우스를 면역화하는데 사용하였다 (도 10a). 이러한 연구는, STAV 함유 세포가 CTL 생성의 지표인 제2형 IFN을 생성하는 능력이 있음을 나타냈다 (도 10b). STAV 의존성 제2형 IFN 생성은 TLR9가 아닌, STING 및 cGAS에 의존적이었다. 이러한 데이터는, STAV를 함유하는 종양 세포가 항종양 면역의 강력한 자극제일 수 있음을 나타낼 수 있다. 이를 조사하기 위해, C57BL/6 마우스에게 B16-OVA 흑색종 세포를 정맥내 접종하여 종양을 유도하고, 이어서 STAV가 로딩된 B16-OVA 세포로 후속 백신접종하였다 (도 10c). 결과는, B16 OVA 종양이 40 일 내에 대부분의 마우스를 사멸시킴을 보여주었다 (도 10d). 하지만, B16-OVA STAV로 처리된 마우스는 70일의 중간 반감기를 가졌으며, 100 일 후 마우스의 40%가 생존했다 (도 10d). 하지만, TLR9 (도 10g)가 아닌, STING (도 10e) 또는 cGAS (도 10f)가 결여된 마우스는 야생형 마우스와 유사한 치명적인 질환에 굴복하였으며, 이는 암 발달을 방지하는데 있어서 STING 신호전달의 중요성을 나타낸다. 따라서, STAV를 함유하는 세포는 암의 예방을 위한 효과적인 치료를 제공할 수 있다.
종합적으로, 결과는, 죽어가는 세포 내 존재하는 시토졸 dsDNA 종이, 아마도 CDN을 생성할 수 있는 cGAS와의 회합 후, 식세포에서 외인성 STING 신호전달을 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 시토졸 DNA 종은 게놈 DNA의 분해를 담당하는 핵 DNAse에 의해 분해되는 것을 회피할 가능성이 있다. 이러한 시토졸 종은, 아마도 아폽토시스성 세포 내에서 분해되는 것을 회피한 결과로서, 식세포에서 STING을 유의하게 더 많이 활성화시킬 수 있는 것으로 보인다. 따라서, DNAse 내성 시토졸 종은 트랜스에서 STING을 활성화시키는데 더 유능하였다. 또한, 감염 또는 손상된 세포로부터 생성된 CDN은 염증성 반응, 항원의 교차 제시 및 T 세포의 자발적 생성을 촉발시키기 위해, 트랜스에서 APC의 STING-의존성 신호전달을 직접 활성화시킬 수 있다. 죽어가는 세포 내에서 생성된 CDN은 민감한 세포 DNA와 달리 또한 대부분 포식된 식세포 내 DNAse의 활성에 대한 내성이 있으며, 이는 CDN을 외인성 STING 신호전달을 자극하는데 매우 효율적으로 만든다. 종양형성 세포는 아폽토시스를 거치는 정상 세포를 근접하게 모방하여, STING 신호전달의 촉발을 회피할 가능성이 있다. 따라서, 종양형성 세포는 주로 비면역원성이다. 대식세포 내 외인성 STING 신호전달 성분은 교차 제시 사건을 촉진시키는 제1형 인터페론과 같은 사이토카인의 생성에 있어서 중요하지만, 내인성 STING 신호전달은 죽어가는/감염된 세포 내에서 손상된 영역에 대하여 APC에게 경고를 보내는데 중요할 것으로 예상된다.
데이터는, 다수의 종양 세포가 결함이 있는 STING 신호전달을 나타냄을 나타낸다. 이는, 손상된 세포가 제거 및 항원 제시에 대하여 면역계에게 경고를 보내는 것을 못하게 할 수 있을 것이다. 하지만, 데이터는 또한, 병원체 또는 DNA 손상 유도된 CDN 생성을 억제함으로써, 포식된 세포가 또한 APC 자체의 활성화를 회피할 수 있음을 나타낸다. 이는, STING/cGAS 경로가 특정 암에서 그렇게 통상적으로 탈조절되는지를 설명하는데 도움이 될 수 있다. 결과는 나아가, CDN 및 STING 신호전달의 재구성이 손상된/감염된/종양 세포에 대하여 면역계에게 경고를 보낼 수 있을 뿐 아니라, 사이토카인 생성, 염증성 반응, 항원 교차 제시 및 자발적 T 세포 생성을 강력하게 촉발시킬 수 있음을 나타낸다. 암을 치료하기 위해 STAV를, 종양으로 직접 또는 종양 세포 내로 운반하여, 또는 백신 아쥬반트로서 사용하는 것은, 강력한 신규한 항종양 요법을 제공할 수 있다. 나아가, 종양 세포 내 CDN의 생성은 또한 항종양 T 세포 반응을 자극하기 위한 강력한 접근법을 제공할 수 있다. 최종적으로, 데이터는 DAMP를 CDN 형태로 함유하는 DNA 손상 또는 감염된 세포에 비해, 일반적으로 아폽토시스성 세포의 포식 후 식세포가 어떻게 활성화되는 것을 회피할 수 있는지에 대한 설명을 제공한다.
당업자는, 상기 예시적인 실시예에 제시된 바와 같은 본 발명의 다수의 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것을 예상한다. 결과적으로, 첨부된 청구범위에 나타난 바와 같은 제한만이 본 발명에 적용되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> University of Miami <120> STING-DEPENDENT ACTIVATORS FOR TREATMENT OF DISEASE <130> 32286/50648A PC <150> US 62/518,292 <151> 2017-06-12 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 1 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 60 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 90 <210> 2 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 2 tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt tttttttttt 60 tttttttttt tttttttttt tttttttttt 90 <210> 3 <211> 379 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Pro His Ser Ser Leu His Pro Ser Ile Pro Cys Pro Arg Gly His 1 5 10 15 Gly Ala Gln Lys Ala Ala Leu Val Leu Leu Ser Ala Cys Leu Val Thr 20 25 30 Leu Trp Gly Leu Gly Glu Pro Pro Glu His Thr Leu Arg Tyr Leu Val 35 40 45 Leu His Leu Ala Ser Leu Gln Leu Gly Leu Leu Leu Asn Gly Val Cys 50 55 60 Ser Leu Ala Glu Glu Leu Arg His Ile His Ser Arg Tyr Arg Gly Ser 65 70 75 80 Tyr Trp Arg Thr Val Arg Ala Cys Leu Gly Cys Pro Leu Arg Arg Gly 85 90 95 Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ile Tyr Phe Tyr Tyr Ser Leu Pro Asn Ala 100 105 110 Val Gly Pro Pro Phe Thr Trp Met Leu Ala Leu Leu Gly Leu Ser Gln 115 120 125 Ala Leu Asn Ile Leu Leu Gly Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Glu Ile 130 135 140 Ser Ala Val Cys Glu Lys Gly Asn Phe Asn Val Ala His Gly Leu Ala 145 150 155 160 Trp Ser Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Arg Leu Ile Leu Pro Glu Leu Gln 165 170 175 Ala Arg Ile Arg Thr Tyr Asn Gln His Tyr Asn Asn Leu Leu Arg Gly 180 185 190 Ala Val Ser Gln Arg Leu Tyr Ile Leu Leu Pro Leu Asp Cys Gly Val 195 200 205 Pro Asp Asn Leu Ser Met Ala Asp Pro Asn Ile Arg Phe Leu Asp Lys 210 215 220 Leu Pro Gln Gln Thr Gly Asp His Ala Gly Ile Lys Asp Arg Val Tyr 225 230 235 240 Ser Asn Ser Ile Tyr Glu Leu Leu Glu Asn Gly Gln Arg Ala Gly Thr 245 250 255 Cys Val Leu Glu Tyr Ala Thr Pro Leu Gln Thr Leu Phe Ala Met Ser 260 265 270 Gln Tyr Ser Gln Ala Gly Phe Ser Arg Glu Asp Arg Leu Glu Gln Ala 275 280 285 Lys Leu Phe Cys Arg Thr Leu Glu Asp Ile Leu Ala Asp Ala Pro Glu 290 295 300 Ser Gln Asn Asn Cys Arg Leu Ile Ala Tyr Gln Glu Pro Ala Asp Asp 305 310 315 320 Ser Ser Phe Ser Leu Ser Gln Glu Val Leu Arg His Leu Arg Gln Glu 325 330 335 Glu Lys Glu Glu Val Thr Val Gly Ser Leu Lys Thr Ser Ala Val Pro 340 345 350 Ser Thr Ser Thr Met Ser Gln Glu Pro Glu Leu Leu Ile Ser Gly Met 355 360 365 Glu Lys Pro Leu Pro Leu Arg Thr Asp Phe Ser 370 375

Claims (32)

  1. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제(STimulator of INterferon Genes)) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 dsDNA가 대략 30개 뉴클레오티드 길이인, STING 활성화제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 dsDNA가 대략 70개 뉴클레오티드 길이인, STING 활성화제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 dsDNA가 AT 풍부하거나 GC 풍부한 것인, STING 활성화제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단이 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된 것인, STING 활성화제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 세 번째 염기마다 변형된 것인, STING 활성화제.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 1)의 서열을 갖고, 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된 것이거나; 또는 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (서열번호 2)의 서열을 갖고, 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된 것인, STING 활성화제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 STING 활성화제 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 STING 활성화제를 포함하는 멸균 조성물.
  10. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 벡터.
  11. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 백신.
  12. 제11항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 벡터에 존재하는, 백신.
  13. 제11항에 있어서, 상기 벡터가 바이러스 또는 플라스미드 벡터인, 백신.
  14. 제12항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 백시니아 바이러스 및 변형된 백시니아 앙카라 (MVA, modified vaccinia Ankara) 바이러스로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 백신.
  15. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, STING의 활성화를 필요로 하는 대상에서 STING을 활성화시키는 방법.
  16. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상에서 면역 반응을 자극시키는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 대상이 암 또는 미생물 감염을 앓고, 방법.
  18. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 종양의 크기를 감소시키는 방법.
  19. 25 내지 90개의 뉴클레오티드를 포함하고 변형된 5' 말단을 갖는 이중 가닥 DNA (dsDNA)를 포함하며, STING(인터페론 유전자의 자극제) 신호전달을 유도하는 STING 활성화제를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 암을 치료하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 암이 난소암, 결장암, 흑색종, 유방암 또는 폐암인, 방법.
  21. 제18항 또는 제 20항에 있어서, 상기 대상의 종양 크기가 약 25 내지 50%, 약 40 내지 70% 또는 약 50 내지 90% 이상 감소되는, 방법.
  22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 활성화제가 종양내, 정맥내, 동맥내, 복강내, 비강내, 근육내, 피부내 또는 피하로 투여되는, 방법.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 활성화제가 면역 세포의 종양으로의 침윤을 유도하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 면역 세포가 대식세포 또는 다른 식세포인, 방법.
  25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 활성화제 올리고뉴클레오티드가 세포에서 시토졸로 유지되는, 방법.
  26. 제15항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 STING 활성화제가 Cxcl10 및/또는 제1형 IFN 사이토카인 생성을 유도하는, 방법.
  27. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsDNA가 대략 30개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  28. 제15항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsDNA가 대략 70개 뉴클레오티드 길이인, 방법.
  29. 제15항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 dsDNA가 AT 풍부하거나 GC 풍부한 것인, 방법.
  30. 제15항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단이 변형된 것인, 방법.
  31. 제15항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 세 번째 염기마다 변형된 것인, 방법.
  32. 제15항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 활성화제가 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (서열번호 1)의 서열을 갖고, 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된 것이거나; 또는 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (서열번호 2)의 서열을 갖고, 선택적으로 처음 3개 및 마지막 3개의 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트 연결에 의해 변형된 것인, 방법.
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