JP6840332B2 - 免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体 - Google Patents

免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体 Download PDF

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Description

本発明は、免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体に関し、詳細には２本鎖オリゴヌクレオチドと担体が複合化されてなり、インターフェロン-α (IFN-α)やインターフェロン-β (IFN-β)のようなＩ型インターフェロンおよびインターロイキン-１２ (IL-12)のようなサイトカインの誘導活性に優れ、アジュバントとしての作用を有する複合体に関する。
自然免疫は微生物の感染に対する生体の初期防御反応である。微生物の構成成分はToll-like receptors (TLRs)，NOD-like receptors (NLRs)，RIG-I-like receptors (RLRs)、DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors（DAI）、IFN-γ-inducible protein 16 (IFI16)、DDX41、cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)などの受容体によって認識されることで様々な免疫応答を引き起こす。
Toll-like receptors (TLRs)は1回型膜貫通型受容体でリガンドが結合することにより、ホモダイマー又はへテロダイマーを形成し、シグナルを伝達する。ヒトでは１０種類存在し，そのうち、核酸を認識するのは、ＴＬＲ３（二本鎖ＲＮＡを認識）、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８（一本鎖ＲＮＡを認識）、及びＴＬＲ９（非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡを認識する）である。ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８及びＴＬＲ９は、主としてＥＲ，エンドソームなどの細胞内オルガネラ膜に局在し，エンドソームでリガンドを認識しシグナルを伝達する。一方、細菌やウイルス由来の糖，脂質，タンパク質を認識するＴＬＲ１（トリアシルリポプロテインなどを認識），ＴＬＲ２（ペプチドグリカンなどを認識），ＴＬＲ４（リポ多糖などを認識），ＴＬＲ５（フラジェリンなどを認識），ＴＬＲ６（ジアシルリポプロテインなどを認識）はいずれも細胞表面に存在し，細胞表面で微生物の表層成分を認識しシグナルを伝達する。
NOD-like receptors (NLRs)は30を超える大きなファミリーをなしている細胞内受容体である。主として微生物由来のペプチドグリカンを特異的認識している。
RIG-I-like receptors (RLRs)は細胞質内ＲＮＡヘリカーゼファミリーであり、細胞質内に存在するＲＮＡを認識する。
DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors（DAI）、IFN-γ-inducible protein 16 (IFI16)、DDX41、cyclic GMP-AMP synthase (cGAS)は細胞質内ＤＮＡ受容体として同定されたが、その他にも細胞質内ＤＮＡ受容体の存在が示唆されている。
以上のように様々な受容体が個別に又は共同して免疫活性に関与しており、その全容解明はなされていない。
感染症や癌、アレルギー等は免疫活性を増強することによって改善される。これらの疾患に対して、非メチル化シトシン‐グアニン配列（CpG）を含む合成されたオリゴデオキシヌクレオチド（以下「ODN」と表す場合がある）を免疫活性化医薬として利用する研究開発が2000年以降活発に行われている。これまでに開発されたCpG ODNは、大きく3つのクラス （クラスA、クラスB、およびクラスC）に分類されている。
クラスA（Dタイプとも呼ばれる）のCpG-A ODNは、ホスホジエステル骨格のパリンドローム配列にCpGを含み、その両末端 (3’および5’末端) にホスホロチオエート骨格のポリグアニン配列が付加された1本鎖ODNである（例えば、表１に示すODN2216、ODN1585、D35）。CpG-A ODNは、ホスホジエステル骨格のパリンドローム配列によって2つの分子が相補的に2本鎖を形成し、さらに両末端のポリグアニン配列がグアニン四量体を形成する性質を有するため、2つの2本鎖CpG-A ODNがさらに自己会合的に四量体を形成する。この四量体が、さらに2本鎖CpG-A ODNや1本鎖CpG-A ODN分子と自己会合することによって高次構造を形成する（非特許文献１）。CpG-A ODNは、主に樹状細胞のTLR9に認識されインターフェロン-α (IFN-α)やインターフェロン-β (IFN-β)などのI型インターフェロン (IFN) を誘導する（特許文献１、非特許文献２）。
クラスB （Kタイプとも呼ばれる）のCpG-B ODNは、CpGを含むホスホロチオエート骨格のみからなる1本鎖ODNである（例えば、表１に示すODN1826、ODN2006、K3）。CpG-B ODNは、主にB細胞のTLR9によって認識されインターロイキン-6 (IL-6)やIL-12あるいは腫瘍壊死因子 (tumor necrosis factors, TNFs)などの炎症性サイトカインを誘導する（非特許文献３）。CpG-B ODNを、カチオン性ペプチドやカチオン性リポソームなどに静電的に結合させて複合体化すると、CpG-Aと同様にI型IFNを誘導することが知られている（非特許文献４）。
クラスCのCpG-C ODNは、3’末端側にパリンドローム配列を含むホスホロチオエート骨格のみからなる1本鎖ODNで、5’末端側と3’末端側の両方にCpGを含んでいる（例えば、表１に示すODN2395）。CpG-C ODNはパリンドローム配列によって2つの分子が部分的な2本鎖を形成している。CpG-C ODNは、CpG-AとCpG-Bの中間的な性質を示し、炎症性サイトカインとI型IFNの両方を誘導する（非特許文献５）。
特開２００８−５１６６３４号公報
Klein et al. Higher order structure of short immunostimulatory oligonucleotides studies by atomic force microscopy. Ultramicroscopy, 110: 689-693 (2010) Krug et al. Identification of CpG oligonucleotide sequences with high induction of IFN-alpha/beta in plasmacytoid dendritic cells. Eur. J. Immunol. 31: 2154-2163 (2001) Hartmann et al. Delineation of a CpG phosphorothioate oligodeoxynucleotide for activating primate immune responses in vitro and in vivo. J. Immunol. 164: 1617-1624 (2000) Gungor B., Yagci FC., Tincer G., Bayyurt B., Alpdundar E., Yildiz S., Ozcan M., Gurcel I., Gurcel M. CpG ODN nanorings induce IFNα from plasmacytoid dendritic cells and demonstrate potent vaccine adjuvant activity. Science Translational Medicine 6, 235ra61 (2014) Poeck et al. Plasmacytoid dendritic cells, antigen, and CpG-C license human B cells for plasma cell differentiation and immunoglobulin production in the absence of T-cell help. Blood, 103: 3058-3064 (2004)
これら従来のCpG ODNは、ODN骨格の全部あるいは一部がホスホロチオエート化、即ち、ODNを構成するヌクレオチドのリン酸基のいずれかの酸素原子が硫黄原子によって置換されている。ホスホロチオエート骨格を有するODNは、体内のDNA分解酵素に耐性となり、また、ホスホジエステル骨格のみからなるODNに比べて細胞への取り込み効率が向上する。しかし、ホスホロチオエート骨格を有するODNは、タンパク質と非特異的に結合し、それによる副作用の懸念があることが指摘されている。
また、CpG-A ODNは、上述のように高次構造を有するが、該構造は合成の過程で自然に生成する種々の高次構造が混在している形態である。これを、特定の高次構造が形成されるように工業的に制御する事はおろか、高いIFN誘導効果を示す高次構造を特定する事も不可能といってよく、このことがCpG-A ODNの臨床への応用を妨げている。上記非特許文献４は、CpG-Bをカチオン性ペプチドと複合化することで均一なナノ環状構造を作製することを提案しているが、ODNの塩基数、担体との比率等が限られ、設計の自由度に欠ける。
そこで、本発明はホスホロチオエート化されていなくてもI型IFN誘導活性に優れ、且つ、工業的生産に適する、免疫刺激オリゴヌクレオチドを提供することを目的とする。
上記目的を達成するために種々検討したところ、驚くことに、CpGを含みホスホロチオエート化されていない1本鎖ODNを線状の2本鎖ODNとし、該２本鎖ODNを担体と複合体化すると、TLR9に認識されてI型IFNを誘導することを見出し、本発明を完成した。即ち、本発明は、以下のものである：
［１］１０〜１００塩基対を含む線状の２本鎖オリゴヌクレオチドであって、該２本鎖を構成する各１本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルを介したシトシン-グアニン配列（CpG）を２〜２０個含み、各１本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合の９０％以上がホスホジエステル結合である、２本鎖オリゴヌクレオチド；
［２］前記各１本鎖オリゴヌクレオチドが、パリンドローム配列を含まない、［１］記載の２本鎖オリゴヌクレオチド；
［３］各１本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合が全てホスホジエステル結合である、［１］又は［２］に記載の２本鎖オリゴヌクレオチド；
［４］１本鎖オリゴヌクレオチドが、下記塩基配列及び該配列においてCpG以外の１〜３塩基が欠損、置換もしくは付加された配列のいずれかの配列を有する、［１］〜［３］のいずれか１項に記載の２本鎖オリゴヌクレオチド
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（ 配列番号１）
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号２）
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号３）
5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’（配列番号４）；
［５］ 担体と、該担体と複合体化された［１］〜［４］のいずれか１項記載の２本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体；
［６］ 該担体が、リポソーム、高分子化合物、及び無機化合物から選択される、［５］記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体；
［７］ 平均粒径が１００ｎｍ以上、好ましくは２５０ｎｍ以上、より好ましくは７００ｎｍ以上である、［５］又は［６］に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体；
［８］ ２本鎖オリゴヌクレオチドと担体との重量比が０．０５：１〜１０：１、好ましくは０．１：１〜１０：１、より好ましくは０．１５：１〜１０：１である、［５］又は［６］に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体；
［９］ ［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を含む、ワクチンのアジュバント。
［１０］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防のための方法であって、感染症の原因となる病原体由来の無毒化あるいは弱毒化された抗原と、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を、連続して或いは同時に投与することにより、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得すること含む、方法；
［１１］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防用ワクチン製造における、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用；
［１２］ ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防のための、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
［１３］ガンの治療又は予防のための方法であって、
ガン抗原又はその一部分と、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を、連続して或いは同時に投与することにより、体内にがん抗原に対する細胞傷害性T細胞（ＣＴＬ）を誘導し、ガン抗原を提示するがん細胞を攻撃させることにより、ガンを治療または予防する方法；
［１４］ガン治療又は予防用ワクチン製造における、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用；
［１５］ガン治療又は予防のための、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
［１６］ ［５］〜［８］のいずれか１項記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を含む、アレルギー治療又は予防のための医薬組成物；
［１７］ アレルゲン又はその一部を更に含む［１６］に記載の医薬組成物。
［１８］アレルギーの治療又は予防のための方法であって、
［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を投与することにより、アレルゲン特異的なヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）細胞をヘルパー２Ｔ（Ｔｈ２）細胞よりも活性化させることによって、アレルギーを治療または予防する方法；
［１９］さらにアレルゲン又はその一部を前記免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体と連続して或いは同時に投与することを含む、［１８］に記載の方法；
［２０］アレルギー治療又は予防用医薬製造における、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用；
［２１］アレルギー治療又は予防のための、［５］〜［８］のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
上記本発明の２本鎖オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間の結合の９０％以上がホスホジエステル結合であり、ホスホロチオエート結合を実質的に含まないので、副作用の懸念がない。また、複合体化も容易であり、得られる複合体は、構造及び大きさが制御されており、アジュバントとしての応用が期待される。該複合体は、抗原提示細胞のTLR9によって認識され、主にI型IFNを誘導し、その誘導量はCpG-B ODNを同じ担体に同じ方法で担持させたときに比べて有意に高い。
図１は、実施例１に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIFN-βの誘導（相対的発現量）を示すグラフである。本発明のCpG ODN複合体であるB24-PDとリポフェクトアミン2000は、2本鎖において高いIFN-β誘導能を示した。*, p < 0.05 図２は、実施例２に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIFN-βの誘導を示すグラフである。本発明の２本鎖CpG ODN複合体は、48塩基対以上で高いIFN-β誘導能を示した。*, p < 0.05 図３は、実施例３に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIL-12の誘導を示すグラフである。本発明の2本鎖CpG ODN複合体はIFN-βのみならず、IL-12誘導能も保持していることが示された。*, p < 0.05 図４は、実施例４に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIFN-βの誘導を示す。本発明のホスホジエステル2本鎖線状CpG ODNからのIFN-β誘導には担体との複合体化が必須であることが示された。*, p < 0.05 図５は、実施例５に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIFN-βの誘導を示す。リポフェクトアミン2000以外のカチオン性リポソームにおいても、本発明の2本鎖CpG ODN複合体はIFN-βを誘導することが示された。*, p < 0.05 図６は、図４に示すリポフェクトアミン2000との複合体と図５に示すDOTAPとの複合体のIFN-β誘導量を比較して示す。本発明の2本鎖CpG ODNは、リポフェクトアミン2000と複合化したときの方が、DOTAPと複合化するよりも高いIFN-β誘導能を示した。*, p < 0.05 図７は、実施例６に示す、マウスマクロファージ様細胞からのIFN-βの誘導を示す。リン酸カルシウム粒子においても、本発明の2本鎖CpG ODN複合体は高いIFN-β誘導能を示した。*, p < 0.05 図８は、実施例７に示す、ヒト形質細胞様樹状細胞からのIFN-αの誘導を示す。本発明の2本鎖CpG ODNをDOTAPと複合化したときに高いIFN-α誘導能を示した。*, p < 0.05 図９は、実施例７に示す、ヒトB細胞からのIL-6の誘導を示す。ホスホジエステル2本鎖線状CpG ODNは、遊離の状態でも、DOTAPと複合体化してもIL-6の誘導量は1本鎖に比べて低いことが示された。また、1本鎖および2本鎖のホスホロチオエートCpG ODNに比べても低いことが示された。*, p < 0.05 図１０は、実施例７に示す、ヒト単球からのIFN-αの誘導を示す。本発明の2本鎖CpG ODN複合体は、細胞質DNA受容体にも認識されIFN-αを誘導することが示された。*, p < 0.05 図11は時間経過によるリポフェクトアミン2000のサイズの変化を示したグラフである。リポフェクトアミン2000は、時間経過とともに集塊を形成することが示された。 図12はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体サイズとIFN-β誘導量の関係を示したグラフである。複合体サイズが700 nm以上でマウスマクロファージ様細胞への刺激において、高いIFN-β誘導能があることが示された。 図13はリポフェクトアミン2000へのds B72-PDの結合量がIFN-β誘導に及ぼす影響を示したグラフである。培養液中のリポフェクトアミン2000の濃度が5 μg/ml のとき、ds B72-PDの結合量は、リポフェクトアミン2000の重量に対して少なくとも0.5以上であれば、マウスマクロファージ様細胞に対する刺激において高いIFN-β誘導能が得られることが示された。 図14はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体の添加濃度がIFN-βに及ぼす影響を示したグラフである。マウスマクロファージ様細胞からのIFN-β誘導量はds B72-PDとリポフェクトアミン2000複合体の添加量に依存することが示された。 図15はds B72-PDの配列を一部改変した2本鎖CpG ODNとリポフェクトアミン2000の複合体によるマウスマクロファージ様細胞からのIFN-β誘導を示したグラフである。いずれの2本鎖CpG ODN (ds B72M1-PD、ds B72M2-PD、ds B72M3-PD、ds B72M4-PD、ds B72M5-PD)複合体においてもds B72-PD複合体と同様に高いIFN-β誘導能を示した。 図16はds B72-PDの配列を一部改変した2本鎖CpG ODNとDOTAPの複合体によるマウスマクロファージ様細胞からのIFN-β誘導を示したグラフである。いずれの2本鎖CpG ODN (ds B72M1-PD、ds B72M2-PD、ds B72M3-PD、ds B72M4-PD、ds B72M5-PD)複合体においてもds B72-PD複合体よりも高いIFN-β誘導能を示した。 図17はds B48-PDの配列を一部改変した2本鎖CpG ODNとリポフェクトアミン2000の複合体によるマウスマクロファージ様細胞からのIFN-β誘導を示したグラフである。いずれの2本鎖CpG ODN (ds 48M1-PD、dsB48M2-PD、ds B48M3-PD、ds B48M4-PD、ds B48M5-PD、ds CpG48-PD)複合体においてもTLR9を介したIFN-β誘導が示された。 図18はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるOVA特異的CD8陽性T細胞の誘導効果を示したグラフである。6匹のマウスにおける血液中のCD8陽性T細胞中のOVA特異的CD8陽性T細胞の割合の平均値は、OVAとともにds B72-PD複合体を投与した群で有意に増加していることが示された。**, p < 0.05; NS,有意性なし 図19はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるOVA特異的IgG1抗体の産生効果を示したグラフである。6匹のマウスにおける血清中のOVA特異的IgG1抗体量の平均値は、OVAのみの投与に比べて、OVAとともにds B72-PD複合体を投与した群で有意に増加していることが示された。**, p < 0.05 図20はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるOVA特異的IgG2a抗体の産生効果を示したグラフである。6匹のマウスにおける血清中のOVA特異的IgG2a抗体量の平均値は、OVAのみの投与に比べて、OVAとともにds B72-PD複合体を投与した群で有意に増加していることが示された。**, p < 0.05；NS,有意性なし 図21はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるOVA特異的IgE抗体の産生効果を示したグラフである。6匹のマウスにおける血清中のOVA特異的IgE抗体量の平均値は、OVAとともにds B72-PD複合体を投与した群で増加しているが、有意な増加ではないことが示された。NS,有意性なし 図22はヒト末梢血単核球中のCD80陽性細胞の割合を示したグラフである。CD80は抗原提示に必要な共刺激因子のひとつである。ds B72-PD複合体におけるCD80誘導能はds CpG-free72-PD複合体より高く、その誘導能はCpG-AであるODN2216（図中のA2216）の複合体と同程度であった。 図23はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるRAW264.7細胞のIFN-β誘導能を、プラスミドベクターpAcGFP-N1とリポフェクトアミン2000の複合体と比較したグラフである。線状構造であるds B72-PDの複合体の方が、環状構造であるプラスミドベクターの複合体よりも高いIFN-β誘導能を有することが示された。*, p < 0.05 図24はds B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体によるRAW264.7細胞のIL-12誘導能を、プラスミドベクターpAcGFP-N1とリポフェクトアミン2000の複合体と比較したグラフである。線状構造であるds B72-PDの複合体の方が、環状構造であるプラスミドベクターの複合体よりも高いIL-12誘導能を有することが示された。*, p < 0.05
＜２本鎖オリゴヌクレオチド＞
本発明において、「オリゴヌクレオチド」は、オリゴデオキシヌクレオチド（ODN）であり、アデニン(A)、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びチミン（Ｔ）から選ばれる塩基に、デオキシリボースを介してリン酸が結合された構成単位の複数からなる。
本発明の２本鎖CpG ODNは１０〜１００塩基対、好ましくは２０〜８０塩基対を含む。該２本鎖を構成する各１本鎖CpG ODNは、互いに塩基長が異なっていてもよく、又、完全に相補的な塩基配列を有していなくてもよい。少なくとも、CpGおよびCpGの前後それぞれ3塩基が相補的であることが好ましい。より好ましくは、１本鎖CpG ODN同士が８０％以上の相補性を有し、さらに好ましくは９０％以上の相補性を有する。最も好ましくは各１本鎖CpG ODNの塩基長が等しく、１００％の相補性を有し、3’および5’末端においても2本鎖を形成している。
該２本鎖CpG ODNは線状である。線状構造の代表例としては、２重らせん構造の中心線が線状である構造が挙げられる。但し、本発明において「線状」とは、２重らせん構造の中心線の両端が閉じた環状構造、例えばプラスミドDNAのような２本鎖環状構造及び1本鎖DNAに非相補的配列が連続することによって形成される大きなループ構造、又は塊状構造、例えばCpG-A ODNの四量体構造、を除く広い構造を包含する。また、線状構造の一部又は端部に、数塩基〜１０塩基長程度の２本鎖を形成していない直線状もしくは小さいループ状の部分を含んでいてもよい。
各１本鎖CpG ODNは、ホスホジエステルを介して結合されたシトシン-グアニン配列（CpG）を２〜２０個、好ましくは４個以上、より好ましくは６個以上含む。CpG以外のヌクレオチドは任意であってよい。塩基配列中のCpGの位置は特に限定されないが、3’および5’末端から１ヌクレオチド以上離れていることが好ましい。また、CpG同士は１以上のヌクレオチドにより分離されていることが好ましい。
各１本鎖CpG ODNにおけるヌクレオチド間の結合は、全結合数の９０％以上、好ましくは９５％以上、最も好ましくは１００％の結合がホスホジエステル結合である。ホスホジエステル結合として、例えば前述したヌクレオチドのリン酸基の酸素原子が硫黄原子に置換されたホスホロチオエート結合、ヌクレオチドの糖が修飾された2'-O,4'-C-methano-bridged nucleic acid (2',4'-BNA)やその誘導体である3’-amino-BNA、5’-amino-BNA構造などを全結合数の１０％以下で含んでもよい。
各１本鎖CpG ODNは、パリンドローム配列を含まずともＩ型ＩＦＮを誘導する効果を奏し、好ましくはパリンドローム配列を含まない。
本発明における１本鎖CpG ODNの好ましい例は、下記の塩基配列、及び該配列においてCpG以外の１〜３塩基が欠損、置換もしくは付加された配列のいずれかの配列を有する：

5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（ 配列番号１）
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号２）
5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号３）
5’-ATCGACTCTCGAGCGTTCTC-3’（配列番号４）

上記配列は、ヌクレオチド間の全ての結合がホスホジエステル結合であるが、上述のとおり、一部がホスホロチオエート結合等であってもよい。また、他の１本鎖CpG ODNは、上記配列と相補性である配列を有する。なお、表１に関して説明したとおり、本明細書において大文字の塩基はホスホジエステルにより結合されていることを意味する。
線状2本鎖CpG ODNの調製は、それぞれの1本鎖CpG ODNを核酸合成装置により別々に合成した後、バッファ中で等モルずつ混合し、約８８〜約９８℃で、約５〜約３０分間加熱後、約０．１〜約２℃／分で徐々に温度を降下させることによって得ることができる。このとき、それぞれの1本鎖CpG ODNはお互い相補的な塩基配列をもち、それぞれの1本鎖CpG ODNの相補的な塩基が水素結合を形成することによって2本鎖CpG ODNとなる。
線状2本鎖CpG ODNを得る別法としては、バクテリアやウイルスのゲノムODNを鋳型として、CpGを含む領域をPCRによって増幅させる方法がある。さらには、環状プラスミドODNを宿主細胞中で増幅させ、回収した環状プラスミドを制限酵素で切断して得ることもできる。
＜免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体＞
本発明の第２の側面は、上記のようにして調製された2本鎖CpG ODNと生理学的に許容しうる担体とが複合体化された免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体である。複合体化させることによって、I型IFN誘導能が顕著となる。「生理学的に許容しうる担体」とは、体内の細胞、組織あるいは器官に、本発明の目的を阻害するような障害を及ぼさない物質を指す。このような担体の例には、たとえば、高分子化合物、エマルション、リポソーム、無機化合物粒子、金属粒子、金属酸化物粒子、炭素系粒子、およびこれらの修飾物が包含され、好ましくはカチオン性である。
高分子化合物としては、カチオン性ポリマーであるポリエチレンイミン、キトサン、ポリリシン、LL-37、Tatなどが例示される。これらのカチオン性ポリマーは本発明の2本鎖CpG ODNと静電的に結合する。生分解性ポリマーであるpoly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA)にDNAを内包する方法もある。また、デンドリマー等の多量体も担体として利用しうる。
エマルションとしては、水／油型エマルションや水／油／水型エマルションが例示され、その水相に2本鎖CpG ODNを内包する方法などがありうる。リポソームとしては、脂質二重膜で構成されたリポソームに2本鎖CpG ODNを内包する方法や、カチオン性リポソーム、例えば長鎖アルキル基とアミノ基もしくはアンモニウム基を含むもの、に2本鎖CpG ODNを静電的に結合する方法などがある。
無機化合物粒子としては、たとえばリン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子、シリカナノ粒子などが例示される。金属粒子としては、金粒子、銀粒子、白金粒子、シリコンナノ粒子などがある。金属酸化物粒子としては、酸化亜鉛粒子や二酸化チタン粒子、アルミナ粒子、ジルコニア粒子などが例示される。炭素系粒子には、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンなどが例示される。
これらの担体粒子のサイズは特に限定しないが、長さ又は最も長い径の平均（Ｄ５０）が１０ｎｍ〜１μｍであることが好ましく、より好ましくは１００〜８００ｎｍである。粒子形状は特に限定されず、球状、フレーク状、円柱状等であってよい。
上記担体のうち、カチオン性リポソーム及び無機化合物粒子が好ましく、長鎖アルキル基とアミノ基もしくはアンモニウム基を含むカチオン性リポソーム、例えばリポフェクトアミン（Lipofectamine）（商標）、DOTAP(N-[1-(2,3-Dioleoyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammonium methylsulfate)、 DMTAP（dimyristoyltrimethylammonium propane）、DOAB（dimethyldioctadecylammonium (bromide salt)）、DODAP（1，2-dioleoyl-3-dimethylammonium-propane）、DC-CHOL（3b-[N-(N’，N’-dimethylaminoethane)-caramoyl]cholesterol hycrochloride）、DOSPA(N-[2-[(1,5,10,14-Tetraazatetradecane-1-yl)carbonylamino]ethyl]-N,N-dimethyl-2,3-bis(oleoyloxy)-1-propanaminium)等あるいは、電荷を持たないDOPE（1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin）等との混合物であってもよく（たとえば、DOSPA/DOPE (3:1 wt/wt)）、無機化合物としてリン酸カルシウムやDEAEデキストランが好ましい。或いはこれらの混合物が好ましい。
本発明の2本鎖CpG ODNのこれらの担体との複合体化方法は特に限定されない。表面が正に帯電している担体には2本鎖CpG ODNを適当なバッファ中で混合することによって静電的に結合させることができる。2本鎖CpG ODNはリン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子、フラーレン、カーボンナノチューブ、カーボンナノホーンに吸着する。また、表面が正に帯電していない担体への担持方法としては、担体粒子の表面を、正電荷をもつ物質、たとえばポリエチレンイミン、キトサン、ポリリシンなど、で修飾して2本鎖CpG ODNを静電的に結合させる、あるいは、担体粒子表面にマレイミド基を導入し、一方、線状2本鎖CpG ODNの末端にチオール基を導入することによって共有結合を形成させることなどの方法がある。
該2本鎖CpG ODNと担体との重量比は、2本鎖CpG ODNの塩基鎖長、担体の性状、共に使用する抗原等に応じて、適宜調整することが好ましい。典型的には、2本鎖CpG ODN：担体の重量比を０．０５：１〜１０：１とする。
オリゴヌクレオチド複合体の効果は、TLR9を有する細胞、たとえばヒト及びマウスの形質細胞様樹状細胞、マウスマクロファージ、マウス定常型樹状細胞、に与えた後、I型IFNや炎症性サイトカインの遺伝子の発現量を定量すること、あるいはI型IFNや炎症性サイトカインの分泌量を定量することによって求めることができる。たとえば、遺伝子発現量はリアルタイム定量PCRなどによって、分泌量はELISA法などによって定量することができる。
該複合体は、抗原やアレルゲンとともに与えることによってアジュバント効果を発揮することが期待できる。該複合体は、遊離の抗原やアレルゲンと混合して投与することができる。また、抗原やアレルゲンを該複合体と同一の担体に複合化させて投与する方法、あるいは抗原やアレルゲンを予め2本鎖CpG ODNと結合させてから担体に複合化させて投与する方法がある。さらに、抗原やアレルゲンを該複合体と別の担体に複合化し、該複合体と混合して投与する方法などがある。
抗原やアレルゲンの担体との複合体化方法は特に限定されないが、たとえば、カチオン性リポソームの中空に抗原やアレルゲンを内包した後、カチオン性リポソームの表面に線状2本鎖CpG ODNを静電的に結合する方法や、リン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子の表面に線状2本鎖CpG ODNと抗原あるいはアレルゲンを同時に吸着させる方法などがある。
また、リン酸カルシウム粒子、水酸化アパタイト粒子、炭酸アパタイト粒子を調製する際の原料液に線状2本鎖CpG ODNと抗原あるいはアレルゲンを混合しておくことによって、これらの粒子の中に線状2本鎖CpG ODNと抗原あるいはアレルゲンを同時に内包することもできる。予め線状2本鎖CpG ODNに抗原やアレルゲンを結合させてから担体に担持する場合には、線状2本鎖CpG ODNの末端をチオール基で修飾し、一方、抗原やアレルゲンのアミノ基にマレイミド基を導入し、チオール基とマレイミド基を共有結合させる方法などがある。
抗原の例としては、手足口病ウイルス抗原、デング熱ウイルス抗原、及びウエストナイル熱ウイルス抗原などが挙げられる。また、アレルゲンの例としては、スギ花粉アレルゲン、ブタクサアレルゲン、イネアレルゲン、及びダニアレルゲンなどが挙げられる。また、癌細胞の抗原なども挙げられる。
ワクチンとは、感染症の予防に用いる医薬品を指す。無毒化あるいは弱毒化された抗原を投与することで、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得する。特に限定しないが、毒性を弱めた微生物やウイルスを使用する生ワクチンとしては、BCG、経口生ポリオ(OPV)ワクチン、痘苗（天然痘）、麻疹ワクチン、風疹ワクチン、麻疹・風疹混合ワクチン（MRワクチン)、流行性耳下腺炎（おたふく）、ワクチン水痘ワクチン、黄熱ワクチン、ロタウイルスワクチン、帯状疱疹ワクチンなどが実用化されている。化学処理などにより死んだウイルス、細菌、リケッチア、或いは抗原部分のみを培養したものを含めた不活化ワクチンとしては、インフルエンザウイルスワクチン、肺炎球菌ワクチン、狂犬病ワクチン、コレラワクチン、二種混合（DT）ワクチン（ジフテリア・破傷風混合ワクチン）、三種混合（DPT）ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風混合ワクチン）、四種混合(DPT-IPV)ワクチン（ジフテリア・百日咳・破傷風・不活化ポリオ混合ワクチン）、日本脳炎ワクチン、百日咳ワクチンなどが実用化されている。
がんワクチンは、がんの治療又は予防目的で使用されるワクチンのことを指す。抗原（がん抗原）としては、正常細胞ではまったく発現していないか、発現していても少量であり、癌細胞においては過剰に発現している抗原タンパク質の全長または一部分（ペプチド）を用いる。特に限定しないが、悪性黒色腫（メラノーマ）におけるMAGE、乳癌などにおけるHER2/neu、大腸癌におけるCEA、各種白血病や各種癌におけるWT1、悪性黒色腫、食道癌、胃癌、卵巣癌などにおけるNY-ESO-1などが挙げられる。これらのがん抗原タンパク質（又はその分解ペプチド）を体内の細胞傷害性T細胞（CTL）が認識し、癌細胞を攻撃する（細胞性免疫）。癌抗原（ペプチド）を人為的に投与し、特異的なCTLを誘導（分化増殖）することでがんを治療するのが、がんワクチン療法である。
なお、発がんウイルスの感染阻止を目的とするワクチンもがんワクチンに含まれる。B型肝炎ウィルスワクチン（肝硬変を経て肝がんを引き起こす）やヒトパピローマウイルス（子宮頸がんを引き起こす）などが実用化されている。
花粉症やハウスダストアレルギーの患者は、それぞれのアレルゲンに特異的なヘルパー2Ｔ（Ｔｈ２）経路がヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）経路に対して優勢になっている。すなわち、アレルゲン特異的なＴｈ１経路を活性化し、Ｔｈ２経路に対して優勢にすることが治療戦略のひとつである。マウスにおいてはＩｇＧ２ａ/ＩｇＧ１の比がＴｈ１／Ｔｈ２の比の指標となるが、ヒトにおいてはＩｇＧ４/ＩｇＧ１の比がＴｈ１／Ｔｈ２の比の指標となる場合もある。
本願に係る治療対象として、ヒトを含む哺乳動物（サルなどの霊長類；イヌ、ネコなどのコンパニオンアニマル；馬、ブタ、牛、ヤギ、羊などの家畜；ラット、マウスなどの実験動物）、鳥類（野鳥又は鶏や七面鳥などの家禽）或いは魚類（水産養殖の生物種：例えば、アユやサケ科魚類などの淡水魚や、ブリ、カンパチなどの海水魚）が挙げられが、ＴＬＲ９が発現している種であれば特に限定しなくてよい。
以下、本発明を実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
＜1本鎖CpG ODN及び線状2本鎖CpG ODNの調製＞
表２に示した各配列を有する1本鎖CpG ODN、及び該塩基配列と相補する配列を有する1本鎖ODNを合成し、ハイブリダイゼーションさせることによって２本鎖CpG ODNを調製した。ハイブリダイゼーションは、表２に示した各配列番号の1本鎖CpG ODNと、これと相補する1本鎖CpG ODNをTESバッファ(10 mM Tris-HCl pH8.0、1 mM EDTAおよび0.25 mM NaCl)中で等モル比で混合し、95℃で10分間インキュベーション後、温度を30℃ まで60 分かけて下げることにより行った。このハイブリダイゼーションにより完全な線状2本鎖ODNを得た。
比較用に、表３に示した各配列番号の１本鎖及び２本鎖ODNを、及び、参考用に表４に示した各配列番号の１本鎖及び２本鎖ODNを、上記と同様の手順で調製した。なお、表３のB24-PT（配列番号５）は、表１のODN2006と同じである。
1本鎖ODNであるB24-PT（配列番号5）、K3-PT（配列番号8）、B24-PD（配列番号1）、K3-PD（配列番号4）、CpG-free24-PD（配列番号9）、およびこれらの線状2本鎖ODNを、カチオン性リポソームであるリポフェクトアミン(登録商標)2000 (Life Technologies) に重量比が1:1になるようにそれぞれを混合して静電的に結合させた。
TLR9を含む細胞としてマウスのマクロファージの細胞株であるRAW264.7を用いた。該細胞株を、3.3 x 105 cells/mlの密度でイーグル最小必須培地(MEM)に播種した。24時間後、B24-PT、K3-PT、B24-PD、K3-PD、CpG-free24-PD、およびこれらの2本鎖ODNとリポフェクトアミン2000の複合体を、リポフェクトアミン2000の濃度が5μg/mlになるように添加した。すなわち、リポフェクトアミン2000に結合しているODN（B24-PT、K3-PT、B24-PD、K3-PD、およびこれらの2本鎖DNA）は、5μg/mlの濃度で添加されたことになる。6時間後、細胞を回収し、ISOGEN（日本ジーン製）で全RNAを抽出した後、逆転写酵素（TaKaRa Bio）でcDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、IFN-β遺伝子の発現量をリアルタイム定量PCRによって測定した。IFN-β遺伝子の発現量は、GAPDH遺伝子の発現量によりノーマライゼーションした。リアルタイム定量PCRによるIFN-β発現量測定のためのプライマー配列は、forward, 5’-GGTCCGAGCAGAGATCTTCA-3’（配列番号２９）; reverse, 5’-TCACTACCAGTCCCAGAGTCC-3’ （配列番号３０）、GAPDH遺伝子発現量測定のためのプライマー配列は、forward, 5’-GTGGACCTCATGGCCTACAT-3’ （配列番号３１）; reverse, 5’-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3’ （配列番号３２）であった。
図１に示すように、B24-PTおよびK3-PTのリポフェクトアミン2000との複合体は1本鎖でも2本鎖でも、IFN-βの誘導は認められなかった。一方、B24-PDおよびK3-PDにおいては、2本鎖で顕著に高いIFN-βが誘導された。また、2本鎖B24-PDの方が、2本鎖K3-PDに比べて、高いIFN-β誘導能を有していた。
上記のとおり、実施例１において、2本鎖B24-PDとリポフェクトアミン2000の複合体で、RAW264.7細胞からのTLR9を介した高いIFN-β誘導が観察された。2本鎖B24-PDは24塩基対で、それぞれの鎖にCpGを4つ含んでいる。2本鎖B24-PDを2つつなげた2本鎖B48-PDは、48塩基対で、それぞれの鎖にCpGを8つ含んでいる。また、2本鎖B24-PDを3つつなげた2本鎖B72-PDは、72塩基対で、それぞれの鎖にCpGを12個含んでいる。これらの2本鎖CpG ODNを、実施例１と同様な方法でリポフェクトアミン2000に結合させ、RAW264.7細胞を刺激した。
結果を図２に示す。図２において、「ds」は２本鎖であること、「PT」はホスホチオエート骨格であること、及び「PD」はホスホジエステル骨格であることを示す。図２に示すように、2本鎖B48-PDによるIFN-β誘導量は、2本鎖B24-PDよりも顕著に高かった。しかしながら、2本鎖B72-PDによるIFN-β誘導量は、2本鎖B48-PDと変わりなかった。ここから、高いIFN-β誘導量とCpG配列数とは単純な比例関係にはなく、最適な数があることが示唆された。一方、ホスホロチオエート化した2本鎖B72-PTは、IFN-βをほとんど誘導しなかった。これは、ホスホロチオエート化した2本鎖CpG ODNでは、CpGの数を増やしてもIFN-β誘導能は向上しないことを意味している。
RAW264.7細胞はTLR9のみならずDAI、IFI16、DDX41、cGASのような細胞質DNA受容体をもっている。細胞質DNA受容体は、塩基配列に関係なく2本鎖DNAを認識してI型IFNを誘導する。したがって、2本鎖B24-PD、2本鎖B48-PDおよび2本鎖B72-PDによるIFN-βは、TLR9と細胞質DNA受容体の両方を介して誘導されたと考えられる。そこで、それぞれ24塩基対、48塩基対および72塩基対の、CpGを含まない2本鎖CpG-free24-PD 、2本鎖CpG-free48-PDと2本鎖B72-PDからのIFN-β誘導量を調べた。
図２に示すように、それぞれ24塩基対、48塩基対および72塩基対の、CpGを含まない2本鎖CpG-free24-PD 、2本鎖CpG-free48-PDと2本鎖B72-PDからのIFN-β誘導量は、2本鎖CpG-free24-PD 、2本鎖B48-PDおよび2本鎖B72-PDに比べて有意に低かった。ここから、2本鎖CpG-free24-PD 、2本鎖B48-PDおよび2本鎖B72-PDからのIFN-β誘導の大部分はTLR9を介していることが分かった。
実施例２と同じ条件において、炎症性サイトカインであるIL-12の誘導量をリアルタイム定量PCRによって測定した。IL-12誘導量測定のためのプライマー配列は、forward, 5’-GAAAGGCTGGGTATCGG-3’ （配列番号３３）; reverse, 5’-GGCTGTCCTCAAACTCAC-3’ （配列番号３４）であった。図３に示すように、2本鎖B24-PD、2本鎖B48-PD、および2本鎖B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体は、いずれもRAW264.7細胞からIL-12を誘導した。また、その誘導量は、IFN-βと異なり、2本鎖B24-PDの方が、2本鎖B48-PDおよび2本鎖B72-PDよりも高かった。この結果は、ホスホジエステルの2本鎖CpG ODNの複合体には、IFN-βのみならず、IL-12誘導能も保持していることを示している。
複合体を形成していない、遊離の2本鎖B72-PD及び2本鎖B72-PDと、それらとリポフェクトアミン2000の複合体とのIFN-β誘導量を比較した。2本鎖B72-PDとリポフェクトアミン2000の複合体は実施例１と同様な方法で調製した。RAW264.7細胞の培養も実施例１と同様に行った。リポフェクトアミン2000と複合体を形成していない遊離の2本鎖B72-PDは50μg/mlの濃度になるように培地に添加した。この濃度は、リポフェクトアミン2000と複合体化した2本鎖B72-PDの濃度 (5μg/ml)の10倍である。
図４に示すように、2本鎖B72-PDは、リポフェクトアミン2000と複合体化させたときのみIFN-βを誘導した。これは、ホスホジエステルの2本鎖CpG ODNによるIFN-β誘導のためには、複合体化が必須であることを意味している。
2本鎖B72-PDおよび2本鎖CpG-free72-PDを、カチオン性リポソームであるDOTAP (Roche Life Science) に重量比が1:6になるようにそれぞれを混合して静電的に結合させた。実施例１と同様な方法でRAW264.7細胞を培養し、DOTAPが30μg/mlの濃度になるように培地中に添加した。すなわち、培地中で、DOTAPと複合体化されている2本鎖B72-PDおよび2本鎖CpG-free72-PDの濃度は5μg/mlである。一方、DOTAPと複合体化していない遊離の2本鎖B72-PDおよび2本鎖CpG-free72-PDは50μg/mlの濃度になるように培地に添加した。この濃度は、DOTAPと複合体化した2本鎖B72-PDの濃度 (5μg/ml)の10倍である。
図５に示すように、DOTAPと複合体化した2本鎖B72-PDもIFN-βを誘導した。DOTAPと複合体化した2本鎖CpG-free72-PDはIFN-βをほとんど誘導しないことから、DOTAPと複合体化した2本鎖B72-PDによるIFN-βは、細胞質DNA受容体ではなく、TLR9を介していることがわかる。
図６は、2本鎖B72-PD について、図５に示すDOTAPとの複合体と、図４に示すリポフェクトアミン2000との複合体のIFN-β誘導量を比較して示す。図6に示すように、DOTAPと複合体化した2本鎖B72-PDからのIFN-β誘導量は、リポフェクトアミン2000と複合体化したときに比べ、有意に低かった。これは、ホスホジエステルの2本鎖CpG ODNを複合体化させる担体が、IFN-β誘導に大きく影響することを示している。
1本鎖B72-PD、2本鎖B72-PDおよび2本鎖CpG-free72-PDをリン酸カルシウム粒子の表面に結合し、RAW264.7細胞からのTLR9に依存したIFN-β誘導を調べた。2モル／ｌのCaCl2溶液2.48μlに蒸留水を17.52 μl加え、全体を20μlとした。この溶液12.5μlを2x Hank’s Balanced Salt Solution (Life Technologies社製) 100μlに添加し、リン酸カルシウムの沈殿を得た。このリン酸カルシウムの沈殿は、長さ約150 nmのロッド状の粒子からなっていた。得られたリン酸カルシウムの粒子（約11.6μg）に、1本鎖B72-PD、2本鎖B72-PDおよび2本鎖CpG-free72-PDをそれぞれ5μgずつ吸着させた。これを、RAW264.7細胞にODN濃度が5μg/mlとなるように添加し、6時間後にIFN-βの誘導量を測定した。
図７に示すように、リン酸カルシウムの粒子と複合体化した2本鎖B72-PDは、1本鎖B72-PDに比べ顕著に高いIFN-β誘導能を示した。また、リン酸カルシウムの粒子と複合体化した2本鎖CpG-free72-PDはIFN-βをほとんど誘導しないことから、リン酸カルシウムの粒子と複合体化した2本鎖B72-PDによるIFN-βは、細胞質DNA受容体ではなく、TLR9を介していることがわかる。さらに、この結果は、カチオン性リポソーム以外の粒子にホスホジエステル線状2本鎖CpG ODNを結合させても、IFN-βを誘導できることを示している。
Cellular Technology Limited (OH, USA)から購入したヒト末梢血単核球 (Cellular Technology Limited., OH, USA)を遠心で回収し、800μlのautoMACS Rincing Solution (Militenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany)に懸濁した後、200μlのCD14 MicroBeads (Militenyi Biotech)を加え6℃で15分間 インキュベートした。このMicro Beadsを遠心で集め、1000μlのautoMACS Rincing Solutionに懸濁した後、この懸濁液を磁場下(MidiMACS Separation Unit, Militenyi Biotech)でLS column (Militenyi Biotech)に通した。CD14+ 単球はこのカラムから回収された。このカラムの溶出液から、CD304 MicroBeads (Militenyi Biotech)およびCD20 MicroBeads (Militenyi Biotech)を使用して上記と同様な方法によってCD304+形質細胞様樹状細胞およびCD20+ B細胞をそれぞれ単離した。また、単離したB細胞、形質細胞様樹状細胞および単球のヒト末梢血単核球中の割合は、それぞれ1.2〜2.0%、0.1〜0.63%、および12〜20%であった。
ヒト末梢血単核球から単離したB細胞および形質細胞様樹状細胞を、96-well flat-bottom plateに2x104cells/wellの密度になるように播種した。これらの細胞は、200μlのRPMI 1640 (Invitrogen, Life Technologies, CA, USA)に 10% (v/v) FBS, 1 ml L-glutamine, 100 U/ml penicillin, 100 μg/ｍｌstreptomycineを添加した培地で培養した。
B24-PT、B72-PT、B72-PD、CpG-free72-PD、およびこれらの2本鎖DNAを、実施例5と同様な方法でDOTAPと複合体化し、形質細胞様樹状細胞の播種と同時に添加した。48時間後、IFN-αの誘導量をIFN-α Enzyme-linked immunosorbent assay kit (IFN-α ELISA kit, Affymetrix, CA, USA)にて測定した。
図８に示すように、B24-PTおよびB72-PTでは、2本鎖にしてもIFN-α誘導量は大きく変わらないが、B72-PDは2本鎖にすることにより1本鎖に比べて顕著にIFN-α誘導量が増加した。また、2本鎖CpG-free72-PDからのIFN-α誘導がないことから、2本鎖B72-PDとDOTAPの複合体からのIFN-αは、TLR9に依存していることを意味している。
次に、B24-PT、B72-PD、CpG-free72-PD、およびこれらの2本鎖DNAを、実施例１と同様な方法でDOTAPと複合体化し、B細胞の播種と同時に添加した。また、DOTAPと複合体化していない遊離のB24-PT、B72-PD、CpG-free72-PD、およびこれらの2本鎖DNA は、50μg/mlの濃度になるように培地中に添加した。48時間後、IL-6の誘導量をIL-6 ELISA kit (Affymetrix)によって測定した。
図９に示すように、DOTAPと複合体化していない、遊離の1本鎖B24-PTおよび1本鎖B72-PDは、ともにIL-6を誘導した。しかし、2本鎖においては、B24-PTがIL-6を誘導したが、B24-PDはIL-6を誘導しなかった。DOTAPとの複合体においても、1本鎖B72-PDはIL-6を誘導したが、2本鎖B72-PDはIL-6を誘導しなかった。一方、2本鎖B24-PTとDOTAPとの複合体はIL-6を誘導した。2本鎖B72-PDにIL-6のような炎症性サイトカイン誘導能がないことは、ホスホジエステルの2本鎖CpG ODNの副作用が小さいことを示唆している。
B24-PT、B72-PT、B72-PD、CpG-free72-PD、およびこれらの2本鎖DNAを、実施例１と同様な方法でDOTAPと複合体化し、単球の播種と同時に添加した。48時間後、IFN-αの誘導量を測定した。
図１０に示すように、2本鎖B72-PDはIFN-αを誘導した。ヒトの単球はTLR9をもっていないこと、2本鎖CpG-free72-PDもIFN-αを誘導することから、2本鎖B72-PDからのIFN-αの誘導は細胞質DNA受容体を介していると考えられる。これは、2本鎖B72-PDのようなホスホジエステルの2本鎖CpG ODNの複合体が、TLR9をもたない細胞に取り込まれた場合にもIFN-αを誘導することを示している。
リポフェクトアミン2000を50 μg/mlの濃度でOptiMEM (Thermo Fisher Scientific Ltd.)に分散させ動的光散乱計でサイズを測定すると、図11に示すように時間経過とともにサイズが大きくなった。次に、時間経過の異なる様々なサイズのリポフェクトアミン2000とds B72-PD（配列番号３の２本鎖）との複合体を実施例１に記載の方法で調製した。形成された複合体のサイズは安定で、元のリポフェクトアミン2000のサイズとほぼ同じであった。これらサイズの異なる複合体によって実施例１に記載の方法でRAW264.7細胞を刺激した。RAW264.7細胞に与えた複合体のサイズと複合体を添加して6時間後のIFN-β誘導量の関係を図12に示す。リポフェクトアミン2000と2本鎖B72-PDの複合体は、700 nm以上で高いIFN-β誘導能を示した。
表２配列番号３のB72-PDと、これと完全に相補する1本鎖ODNを用いて実施例１に記載した方法で2本鎖のds B72-PDを調製した。このds B72-PDとリポフェクトアミン2000を重量比が１：２および１：１になるように混合し、それぞれのサイズが737±213 nmおよび692±129 nmの複合体を得た。3.4x105cells/mlの細胞密度で播種し、16時間培養したRAW264.7細胞をリポフェクトアミン2000の濃度が5 μg/mlになるようにこれらの複合体で6時間刺激したときのIFN-β誘導量を図13に示す。IFN-β誘導量はどちらの複合体においても同程度であった。この結果から、培養液中におけるリポフェクトアミン2000の濃度が5 μg/mlのとき、ds B72-PDの結合量はリポフェクトアミン2000の重量に対し0.5以上あればよいことがわかる。
表２配列番号３のB72-PDと、これと完全に相補する1本鎖CpG ODNを用いて実施例１に記載した方法で2本鎖のds B72-PDを調製した。このds B72-PDとリポフェクトアミン2000を重量比が１：２になるように混合し複合体を形成させた。この複合体のサイズは737±213 nmであった。3.4x105 cells/mlの細胞密度で播種し、16時間培養したRAW264.7細胞にリポフェクトアミン2000の濃度が1、2および5 μg/mlになるようにこの複合体を添加し、6時間後のIFN-β誘導量を測定した。図14に示すように複合体の添加量が多くなるほどIFN-βの誘導量も高くなった。
表５に示したホスホジエステルからなる72塩基の1本鎖CpG ODN、及び該塩基配列と相補する配列を有する1本鎖ODNを合成し、実施例１に記載した方法で2本鎖CpG ODNを調製した。表５に示した配列番号１８〜２２のCpG ODNは表２配列番号3のB72-PDの塩基配列を一部改変したものであり、改変した塩基を二重下線で示す。表5配列番号１８のB72M1-PDは表２配列番号3のB72-PDとは5個の塩基配列が異なっている。表5配列番号１９のB72M2-PDは表２配列番号3のB72-PDとは7個の塩基配列が異なっている。表5配列番号２０および配列番号２１のB72M3-PDおよびB72M4-PDは表２配列番号3のB72-PDとは12個の塩基配列が異なっている。表5配列番号２２のB72M5-PDは表２配列番号3のB72-PDとは14個の塩基配列が異なっている。

これらの2本鎖CpG ODNとリポフェクトアミン2000との複合体の調製、およびこれらの複合体によるRAW264.7細胞の刺激は実施例１に記載した方法にて行った。結果を図15に示す。表５に示したいずれの2本鎖CpG ODNとリポフェクトアミン2000との複合体においても、ds B72-PDとリポフェクトアミンの複合体と同様に高いIFN-β誘導能を示した。また、これらの2本鎖CpG ODN複合体はCpGを含まない2本鎖のCpG-free72-PD複合体よりも顕著に高いIFN-βを誘導したことから、IFN-βの誘導の大部分はTLR9に依存していることがわかる。
次に、実施例５に記載の方法で、これらの2本鎖CpG ODNとDOTAPとの複合体を調製し、これらの複合体でRAW264.7細胞を刺激した。結果を図16に示す。表５に示したいずれの2本鎖CpG ODNとDOTAPとの複合体においても、ds B72-PDとDOTAPの複合体と同等以上のIFN-β誘導能を示した。
表６に示したホスホジエステルからなる48塩基の1本鎖CpG ODN、及び該塩基配列と相補する配列を有する1本鎖ODNを合成し、実施例１に記載した方法で2本鎖CpG ODNを調製した。表６に示した配列番号２３〜２７のCpG ODNは表２配列番号２のB48-PDの塩基配列を一部改変したものであり、改変した塩基を二重下線で示す。表６配列番号２３のB48M1-PDは表２配列番号２のB48-PDとは5個の塩基配列が異なっている。表６配列番号２４のB48M2-PDは表２配列番号２のB48-PDとは7個の塩基配列が異なっている。表６配列番号２５および配列番号２６のB48M3-PDおよびB48M4-PDは表２配列番号２のB48-PDとは12個の塩基配列が異なっている。表６配列番号２７のB48M5-PDは表２配列番号２のB48-PDとは14個の塩基配列が異なっている。表６配列番号２８のCpG48-PDはCpGを10個含みCpGの前後の２塩基の配列が表２配列番号２のB48-PDおよび表６配列番号２３〜２７と異なっている。
これらの2本鎖CpG ODNとリポフェクトアミン2000との複合体の調製、およびこれらの複合体によるRAW264.7細胞の刺激は実施例１に記載した方法にて行った。結果を図17に示す。ds B48M1-PD、ds 48M2-PDおよびds B48M3-PDはds B48-PDよりもIFN-β誘導量は低下したが、依然、高いレベルのIFN-β誘導能を有していることがわかる。また、ds B48M4-PD、ds B48M5-PDおよびds CpG48-PDではさらにIFN-β誘導能が低下したが、ds CpG-free72-PDよりも高いことから、これらによるIFN-βの誘導もTLR9を介していることがわかる。
表２配列番号３のB72-PDと、これと完全に相補する1本鎖ODNを用いて実施例１に記載した方法で2本鎖のds B72-PDを調製した。このds B72-PDとリポフェクトアミン2000を重量比が１：１になるように混合し、複合体を形成させた。この複合体溶液をAmicon Ultra 0.5mL Centrifugal Filter (Merck Millipore, Darmstadt, Germany)を用いて10倍濃縮することによって100μl中にds B72-PDを50μg含む複合体溶液を調製した。すなわち、この濃縮溶液100μlには、50μgのds B72-PDが50μgのリポフェクトアミン2000に静電的に結合している複合体が含まれている。50μgのds B72-PDを含む複合体溶液100μlと、200μgのモデル抗原卵白アルブミン (ＯＶＡ)を含む100μl溶液を混合し、６匹の６週令マウス (C57BL/6J)の背部皮下に投与した。同様にして調製したds B72-PD複合体とＯＶＡを７日後に再度、マウス背部皮下に投与した。採血は、２回目の投与から７日後、すなわち１回目の投与から１４日後に、インフルラン吸入麻酔下で後大静脈より行った。採血した血液の一部をEDTA処理し、残りは遠心分離後、血清を採取した。EDTA処理した血液は、溶血および固定処理後、PE-Cy5 hamster anti-mouse CD3抗体、FITC-rat anti-mouse CD8抗体、およびH2-Kb SIINFEKL Class I iTAgTM MHC tetramerで反応させ、ＦＡＣＳによりＯＶＡ特異的CD8陽性T細胞の割合を調べた。血清に含まれるＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥはＥＬＩＳＡにより定量した。ＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａおよびＯＶＡ特異的ＩｇＥの産生量は、200μgのOVAを含む100μl溶液を７日毎に２回、背部皮下投与した６匹のマウスおよび何も投与していない６匹のマウスと比較した。
ＯＶＡ特異的CD8陽性T細胞の割合の結果を図１８に示す。ds B72-PD複合体とＯＶＡを投与したマウス群における血液中のＣＤ８陽性Ｔ細胞に対するＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合は、ＯＶＡのみを投与したマウス群よりも有意に増加し、ds B72-PD複合体の抗原特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導効果が示された。一方、ＯＶＡのみを投与したマウスにおいて、ＯＶＡ特異的ＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合の有意な増加は認められず、抗原のみの投与では抗原特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞の誘導が困難であることが示された。
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体の産生量を図１９に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体の産生量は、ＯＶＡのみを投与したマウス群においても有意に増加した。ds B72-PD複合体とＯＶＡを投与したマウス群では、ＯＶＡのみを投与したマウス群よりも、さらにＯＶＡ特異的ＩｇＧ１抗体の産生量が有意に増加していた。
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体の産生量を図２０に示す。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体の産生量は、ds B72-PD複合体とＯＶＡを投与したマウス群では、ＯＶＡのみを投与したマウス群よりも、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａ抗体の産生量が有意に増加していた。一方、ＯＶＡのみを投与したマウス群において、ＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの有意な増加は認められず、抗原のみの投与ではＯＶＡ特異的ＩｇＧ２ａの誘導が困難であることが示された。
血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の産生量を図２１に示す。ds B72-PD複合体とＯＶＡを投与したマウス群では、ＯＶＡのみを投与したマウス群よりも、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の産生量の平均値が増加したが、有意な増加は観察されなかった。
ＩｇＧは遅発性の免疫反応に関与し、ＩｇＥは即効性の免疫反応に関与する。従って、 ds B72-PD複合体は、抗原と共に投与された場合、抗原性を増強することが出来、ワクチン抗原と併用することにより、その効果を増強するために使用することが可能である。一方、即効性の免疫反応（アナフィラキシーなど）に影響を与えないため、安全性が高いことが示唆できた。
ヒト末梢血単核球 (Cellular Technology Limited., OH, USA)を96-well flat-bottom plateに1x106 cells/wellの密度になるように播種し、DOTAPに静電的相互作用で結合させたds B72-PD、ds CpG-free72-PD、ODN2216 (図中ではA2216)、B24-PTを5μg/ml (DOTAP濃度は30μg/ml)の濃度になるように添加した。これらの細胞をRPMI1640に10% (v/v) FBS、10 mM HEPES、2 mM L-glutamineを加えた培地で培養した。6時間後に細胞を回収し、PerCP/Cy5.5 anti-human CD303 (BDCA-2)、FITC anti-human CD14、Alexa Fluor 700 anti-human CD20, PE anti-human CD80と室温で15分間反応させ、PBSで洗浄した後、セルアナライザー (SP6800, SONY)で、共刺激因子であるCD80を発現しているCD80陽性細胞の割合を解析した。
ヒト末梢血単核球中のCD80陽性細胞の割合を図22に示す。いずれのDOTAP複合体においてもCD80陽性細胞の割合は、無処理に比べて増加していた。ds B72-PD複合体におけるCD80陽性細胞の割合はCpG-AであるA2216とDOTAPの複合体と同程度であった。ds CpG-free72-PD複合体におけるCD80陽性細胞の割合は、ds B72-PD複合体あるいはA2216複合体よりも低かった。また、CD80陽性細胞の割合の増加は、B24-PT複合体においても観察された。
ヒト末梢血単核球において、CD80を発現している主な細胞種はB細胞、単球、および樹状細胞であると考えられるので、CD20陽性細胞（主にB細胞）、CD14陽性細胞（主に単球）、CD303陽性細胞（主に樹状細胞）におけるCD80陽性細胞の割合を調べた。結果を表７に示す。CD20陽性細胞中のCD80陽性細胞の割合はds B72-PD複合体で最も高く、ds B72-PD複合体がB細胞を活性化していることが示唆されたが、ds CpG-free72-PD複合体におけるCD80陽性細胞の割合は無処理に比べて大きな増加は認められなかった。CD14陽性細胞中のCD80陽性細胞の割合はA2216複合体で最も高かったが、ds B72-PD複合体においても、CD80陽性細胞の大幅な増加が観察された。さらに、CD303陽性細胞中のCD80陽性細胞の割合においては、いずれの複合体においても高いCD80誘導能が認められたが、ds B72-PD複合体が最も高い誘導能を示した。
抗原提示細胞が免疫反応を開始するには，2種類のシグナルが必要である。第一のシグナルはT細胞レセプターを介した抗原特異的なシグナルであり、第二のシグナルは共刺激分子を介した非抗原特異的なシグナルである。ds B72-PD複合体は効率よく、共刺激分子であるCD80を誘導することから、ds B72-PD複合体が抗原性補強剤（アジュバンド）として有効であることが示唆された。
実施例１に記載した方法でリポフェクトアミン2000とds B72-PD、ds CpG-free72-PD、およびプラスミドベクターpAcGFP-N1 (TaKaRa Bio, Siga, Japan)の複合体を調製し、それぞれの複合体でRAW264.7細胞を刺激した。6時間後にIFN-β誘導量を測定した結果を図２３に、IL-12誘導量を測定した結果を図２４に示す。IFN-βおよびIL-12のいずれも、ds B72-PD複合体による誘導能はpAcGFP-N1複合体よりも有意に高かった。4700塩基対からなるpAcGFP-N1は、CpGを含むホスホジエステル2本鎖環状DNAであるが、線状のds B72-PD複合体は環状の2本鎖DNAよりも高いIFN-β誘導能およびIL-12誘導能を有していることが示された。
本発明の２本鎖オリゴヌクレオチド複合体は、TLR9を介した高いI型IFN誘導活性を有し、且つ、炎症性サイトカイン誘導活性が低い。該複合体は、ホスホロチオエートによる副作用の懸念が無く、調製も容易であり、アレルギー等の治療薬、ワクチンアジュバント等として有用である。

Claims (21)

  1. １０〜１００塩基対を含む線状の２本鎖オリゴヌクレオチドであって、該２本鎖を構成する各１本鎖オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルを介したシトシン-グアニン配列（CpG）を２〜２０個含み、各１本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合の９０％以上がホスホジエステル結合であり、上記１本鎖オリゴヌクレオチドが下記塩基配列及び該配列においてCpG以外の１〜３塩基が欠損、置換もしくは付加された配列のいずれかの配列を有する、２本鎖オリゴヌクレオチド：
    5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号２）
    5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号３）。
  2. 前記各１本鎖オリゴヌクレオチドが、パリンドローム配列を含まない、請求項１記載の２本鎖オリゴヌクレオチド。
  3. 各１本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間の結合が全てホスホジエステル結合である、請求項１又は２記載の２本鎖オリゴヌクレオチド。
  4. １本鎖オリゴヌクレオチドが、下記いずれかの配列を有する、請求項１〜３のいずれか１記載の２本鎖オリゴヌクレオチド。
    5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号２）
    5’-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3’（配列番号３）
  5. 担体と、該担体と複合体化された請求項１〜４のいずれか１項記載の２本鎖オリゴヌクレオチドとを含む、免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  6. 該担体が、リポソーム、高分子化合物、及び無機化合物から選択される、請求項５記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  7. 平均粒径が１００ｎｍ以上である、請求項５又は６記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  8. ２本鎖オリゴヌクレオチドと担体との重量比が０．０５：１〜１０：１である、請求項５又は６に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  9. 請求項５〜８のいずれか１項記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を含む、ワクチンのアジュバント。
  10. ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防に用いるための請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体であって、感染症の原因となる病原体由来の無毒化あるいは弱毒化された抗原と連続して或いは同時に投与することにより、体内に病原体に対する抗体産生を促し、感染症に対する免疫を獲得するための、免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  11. ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防用ワクチン製造における、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
  12. ヒトを含む哺乳動物、鳥類或いは魚類の感染症予防のための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  13. ガンの治療又は予防に用いるための請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体、
    ガン抗原又はその一部分と、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を、連続して或いは同時に投与することにより、体内にがん抗原に対する細胞傷害性T細胞（ＣＴＬ）を誘導し、ガン抗原を提示するがん細胞を攻撃させることにより、ガンを治療または予防する、免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  14. ガン治療又は予防用ワクチン製造における、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
  15. ガン治療又は予防のための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  16. 請求項５〜８のいずれか１項記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体を含む、アレルギー治療又は予防のための医薬組成物。
  17. さらにアレルゲン又はその一部を含む、請求項１６に記載の医薬組成物。
  18. アレルギーの治療又は予防のための請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体であって、
    アレルゲン特異的なヘルパー１Ｔ（Ｔｈ１）細胞をヘルパー２Ｔ（Ｔｈ２）細胞よりも活性化させることによって、アレルギーを治療または予防するための免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  19. さらにアレルゲン又はその一部を前記免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体と連続して或いは同時に投与するための、請求項１８に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
  20. アレルギー治療又は予防用医薬製造における、請求項５〜８のいずれか１項に記載の疫刺激オリゴヌクレオチド複合体の使用。
  21. アレルギー治療又は予防のための、請求項５〜８のいずれか１項に記載の免疫刺激オリゴヌクレオチド複合体。
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