BR112013015816B1 - construção de dna não-codificante, de cadeia aberta linear para imunomodulação, composição farmacêutica, vacina, e uso de uma construção de dna - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO DE DNA PARA IMUNOMODULAÇÃO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, VACINA E USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE DNA. A presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico e seu uso para a modulação do sistema imune. Fornece-se uma construção de DNA para imunomodulação que compreende pelo menos um nucleotídeo em conformação L.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a uma molécula de ácido nucleico e seu uso para a modulação do sistema imune.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Uma estratégia emergente para combater doenças complexas, tais como câncer, doenças infecciosas, alergia e asma, é utilizar o sistema imune do paciente. É sabido que o sistema imune ou a sua atividade pode ser modulado por sequências específicas de DNA. A maior parte das conhecidas sequências de DNA curtas imunomodificadoras contêm um motivo não metilado de citosina guanina (motivo CG) que foi descrito por Krieg et al. (Nature 1995 374: 6522 546-549). A ocorrência de motivos não metilados CG é substancialmente suprimida no genoma de eucariotas em comparação com procariotas ou vírus. Portanto, moléculas de DNA contendo tal motivo evoluíram como um "sinal de perigo" natural e acionam o sistema imune no combate aos patógenos procariotos ou virais. Isto pode ser explorado terapeuticamente ou profilaticamente para tratar ou prevenir doenças infecciosas, bem como não-infecciosas.

As construções de DNA compreendendo motivos não metilados CG são capazes de suscitar um considerável efeito fisiológico por fortemente estimular as células efetoras do sistema imune inato incluindo células dendríticas, macrófagos, células assassinas naturais (NK) e NKT. Os motivos CG não metilados são detectados pelo receptor de reconhecimento de padrão imune inato, receptor semelhante a Toll (TLR) 9. Embora o exato mecanismo de reconhecimento ainda não esteja completamente entendido, foram feitos progressos significativos em desvendar os caminhos subjacentes (A. Krieg, Nat. Rev. Drug Disc., 5:471-484, 2006) . Supõe-se que após a ligação das construções de DNA contendo CGs não metilados ao receptor, múltiplas cascatas de sinal são ativadas em células responsivas. A sobrerregulação das moléculas de superficie características e a secreção de citocinas, imunidade adaptativa com um predominante padrão Thl é induzida. Essas construções podem ser utilizadas em combinação com, por exemplo, anticorpos, quimioterapia ou radioterapia, vacinas ou citocinas. Doenças alérgicas e asma são na sua maioria mediadas por Th2. Aumentando a razão de Thl/Th2, respostas mediadas por Th2 são atenuados e, assim, estes tipos de doenças podem ser tratadas ou prevenidas.

Moléculas de superficie incluem, por exemplo, CD40, CD69, CD80 e CD86, dependendo do tipo de célula especifica analisada. A secreção de citocinas é também característica de distintos tipos de células; citocinas incluem, por exemplo, proteínas inflamatórias macrofágicas (MIP)-1-alfa, MIP-lbeta, interleucina (IL) -6, IL-8, interferon (IFN) -alfa, fator de necrose tumoral (TNF) -alfa, IFN-gama, proteína quimiotáxica monocitária (MCP)-1 ou IFN-gama-induzida por proteína de 10 kDa (IP-10).

Com a finalidade de prevenir ou tratar doenças, a vacinação tem sido comprovada como uma abordagem muito eficaz. A fim de assegurar uma resposta imune forte e duradoura, adjuvantes capazes de estimular células apresentadoras de antigenos, tais como as células dendriticas, que são habitualmente administradas juntamente com o antigeno, e para essa finalidade agonistas TLR9 têm-se mostrado potentes imunoestimulantes.

Independentemente das explicações dos mecanismos subjacentes pelos quais motivos não metilados CG influenciam ou modulam a resposta imune, muitas abordagens foram desenvolvidas para a modulação do sistema imune pelo uso de tais motivos. O documento WO 1998/018810 divulga que as sequências contendo imunoestimulador contendo motivos mão metilados CG são ainda mais eficazes quando são parte de uma cadeia única. No entanto, administrar uma molécula de DNA de cadeia única de cadeia aberta não é viável devido à rápida degradação dos ácidos nucleicos de cadeia única. Assim, diferentes métodos para a proteção de construções de DNA de cadeia única ou de cadeia dupla compreendendo um motivo CG não metilado foram desenvolvidos.

Para atingir resistência contra a degradação por DNA nucleases as ligações de fosfodiéster na estrutura principal de um polimero de ácido nucleico são frequentemente modificados para fosforotioatos. Além de um pouco menos de atividade estimuladora de tais ácidos nucleicos protegidos com fosforotioato, ensaios clinicos nos últimos anos mostraram que a toxicidade de uma proteção com fosforotioato exclui ou limita gravemente tais ácidos nucleicos de qualquer uso em composições farmacêuticas ou medicamentos.

Uma outra abordagem para proteger as sequências de DNA compreendendo um motivo CG é divulgado, por exemplo, no documento EP 1 196 178. Este documento divulga moléculas de ácido desoxirribonucléico curtas, compreendendo uma sequência de residues de nucleotideo fechada covalentemente, em forma de halteres, de cadeia única compreendendo motivos CG ("dSLIM"). De acordo com a divulgação do documento EP 1 196 178 os motivos CG estão localizados dentro de alças de cadeia única em ambas as extremidades da haste de cadeia dupla da molécula divulgada ou dentro da haste de cadeia dupla. As alças em forma de grampo de cabelo de cadeia única protegem uma haste de cadeia dupla de de degradação por DNA nucleases dentro ou fora da célula. O documento WO 2010/039137 divulga oligonucleotideos reguladores imunes como antagonistas para doenças mediadas por TLR tendo uma ou mais modificações químicas na sequência que flanqueia um motivo estimulador imune e/ou em um motivo de oligonucleotídeos que seriam estimuladores imunes, mas para a modificação. Assim, a intenção dos oligonucleotídeos divulgados do documento WO 2010/039137 é suprimir uma resposta imune causada por TLRs. O documento WO 2005/042018 descreve a nova denominada oligonucleotídeos de CpG de classe c, onde um oligonucleotídeo de classe c é caracterizado pelas sequências CpG, geralmente posicionadas em ou perto da extremidade 5' ou extremidade 3' da molécula, e um motivo palindrômico rico em GC, geralmente posicionado em ou perto da outra extremidade da molécula. O documento divulga as variações da sequência palindrômica de um DNA de classe c.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

No que diz respeito ao estado da técnica, é um objetivo da presente divulgação fornecer construções de DNA imunomoduladoras alternativas que são estáveis após a transferência em células eucarióticas e evitando efeitos colaterais nocivos.

A presente divulgação ensina uma construção de DNA para imunomodulação que compreende pelo menos um motivo de sequência N1N2CGN3N4, em que N^'N2e N3N4 é qualquer combinação de C, G, A, e T e C é desoxicitidina, G é desoxiguanosina, A é desoxiadenosina e T é desoxitimidina e em que a construção é uma sequência de DNA de cadeia dupla ou simples compreendendo pelo menos um nucleotídeo que está em conformação L.N1N2 pode ser um elemento selecionado a partir do grupo que compreende GT, GG, GA, ou AA, N3N4 ser um elemento selecionado a partir do grupo que compreende TC ou TT.

Como uma modalidade adicional da presente divulgação, uma construção é fornecida em que pelo menos um nucleotídeo em conformação L estar compreendido dentro dos cinco nucleotideos terminais localizados na ou perto da extremidade 5 - e/ou a 3' de uma únicacadeia de DNA.

A invenção fornece ainda uma construção de DNA com pelo menos um trecho de G de pelo menos três desoxiguanosinas consecutivas localizado perto da extremidade 5' e/ou 3', em que um trecho de G pode ser localizado entre dois motivos segundo a sequência de acordo com as reivindicações 1 ou 2. O espaçamento entre duas sequências motivos de acordo com as reivindicações 1 ou 2 pode ser a pelo menos cinco bases, especialmente quando nenhuma desoxiguanosina é um elemento da sequência. Pretende-se ainda que a sequência de DNA seja uma construção de DNA de cadeia aberta linear que compreende DNA de cadeia única ou dupla, ou seja, uma construção de DNA linear, que compreende pelo menos uma extremidade com uma alça de cadeia única. O motivo de sequência N1N2CGN3N4 tal como definido acima deve estar localizado dentro de uma região de cadeia única e/ou de cadeia dupla da sequência de DNA.

Como uma modalidade adicional a construção compreende pares de base inter- e/ou intramoleculares e, pelo menos uma região de cadeia única despareada.

Além disso, uma construção multimérica é fornecida, em que pelo menos duas construções compreendendo pares de base inter- e/ou intramoleculares e pelo menos uma região de cadeia única despareadas ligada à outra.

Além disso, construção pode compreender pelo menos um nucleotideo em conformação L ou D que é modificado com um grupo funcional selecionado a partir do grupo que compreende grupos carboxila, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, dissulfeto, tiol e aldeido. O nucleotideo modificado pode ser ligado a um composto selecionado a partir do grupo que compreende peptídeos, proteínas, carboidratos, anticorpos, moléculas sintéticas, polímeros, micro-projéteis, partículas de metal, nanopartícuias, micelas, portadores de lipídeos ou uma fase sólida.

A divulgação fornece uma construção de DNA tendo um primeiro trecho de G na extremidade 5' e três motivos sequência de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que pelo menos cinco bases estão localizadas entre o primeiro e o segundo motivo, excluindo desoxiguanosina, e um trecho de G, que está localizado entre o segundo e o terceiro motivo de sequência e em que dois dos três desoxinucleotídeos terminais 3' estão em conformação L.

As construções de acordo com a presente divulgação podem ser usadas para o tratamento de câncer ou doenças auto- imunes ou para a modulação do sistema imune.

Como mais uma modalidade da presente divulgação é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo uma construção de DNA, conforme descrito acima. Composição farmacêutica pode compreender também um quimioterápico.

Além disso, é fornecida uma vacina, que compreende uma construção de DNA, conforme descrito acima. Nela, a construção de DNA pode ser compreendida como adjuvante.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na acepção da presente divulgação uma sequência de DNA linear de cadeia aberta é designada como construção de DNA. Dita sequência de DNA podem ser de cadeia única ou parcialmente ou completamente de cadeia dupla. O termo construção de DNA não indica uma limitação do comprimento da correspondente sequência de DNA. As unidades monoméricas da construção de DNA são nucleotídeos.

A construção de DNA pode ser fabricada sinteticamente ou ser parcialmente ou totalmente de origem biológica, em que a origem biológica inclui métodos com base genética de fabricação de sequências de DNA. L-DNA ou nucleotideos em conformação L se referem a nucleotideos que compreendem L-desoxirribose como os residues de açúcar em vez da D-desoxirribose que ocorre naturalmente. L-desoxirribose é o enantiômero (imagem especular) de D- desoxirribose. As construções de DNA parcialmente ou completamente que consistem em nucleotideos em conformação L podem ser parcialmente ou completamente de cadeia única ou dupla; no entanto, nucleotideos em conformação L não podem hibridizar a nucleotideos em conformação D (Hauser et al., ácido nucleico Res. 2006 34: 5101-11). L-DNA é tão solúvel e seletivo como D-DNA. No entanto, L-DNA é resistente à degradação por enzimas naturalmente presentes, especialmente, exonucleases, L-DNA é protegido contra degradação biológica (Urata et al., ácidos nucleicos Res. 1992 20: 3325-32). Portanto, L-DNA é amplamente aplicável.

A "haste" de acordo com a presente divulgação deve ser entendida como uma dupla cadeia de DNA formada por pareamento de bases, quer dentro da mesma molécula de DNA (o que é, então, parcialmente auto-complementar) ou no âmbito de diferentes moléculas de DNA (que são parcialmente ou totalmente complementares) . Pareamento de bases intramolecular designa o pareamento de bases dentro das mesmas moléculas e o pareamento de bases entre diferentes moléculas de DNA é chamado pareamento de bases intermolecular.

Uma "alça" na acepção da presente divulgação deve ser entendida como uma região de cadeia única não pareada ou dentro ou na extremidade da estrutura de haste. Um "grampo de cabelo" é uma combinação distinta de uma haste e um alça, que ocorre quando duas regiões auto-complementares de uma mesma molécula de DNA hibridiza para formar uma haste com uma alça não pareada. Uma forma de haltere descreve uma construção de

DNA linear com estruturas de grampo de cabelo em ambas as extremidades que flanqueiam uma região de haste. Assim, a "construção de DNA linear" no contexto da presente divulgação descreve uma construção de DNA linear de cadeia aberta que compreende DNA de cadeia simples ou dupla ou uma construção de DNA linear em forma de haltere e que compreende alças em ambas as extremidades de uma haste de DNA de cadeia dupla. O termo "extremidade de DNA", seja significando uma extremidade 5' ou 3' de uma cadeia simples de DNA, se refere não só ao nucleotideo terminal, mas compreende os cinco nucleotideos terminais ou até mesmo os últimos três nucleotideos com respeito à respectiva extremidade de DNA. Uma modificação de uma extremidade de DNA se refere a pelo menos um dos respectivos nucleotideos.

Um "trecho de G" deve ser entendido na acepção da presente divulgação, como uma sequência de, pelo menos, três desoxiguanosinas consecutivas.

A "fase sólida", à qual os nucleotideos são covalentemente ou não-covalentemente ligados se refere a, mas não está limitada a, uma coluna, uma matriz, contas, vidro, incluindo vidro modificado ou funcionalizado, silica ou materiais à base de silica incluindo silicio e silicio modificado, plástico compreendendo polipropileno, polietileno, poliestireno e copolimeros de estireno e de outros materiais, acrilicos, polibutilenopoliuretanos etc., náilon ou nitrocelulose, resinas, polissacarideos, carbono , bem como vidros inorgânicos, metais, nanoparticulas e plásticos. Assim, placas de microtitulo também estão dentro do escopo de uma fase sólida de acordo com a presente divulgação.

Imunomodulação de acordo com a presente divulgação se refere à imunoestimulação e imunossupressão. Imunoestimulação significa preferencialmente que células efetoras do sistema imune são estimuladas com a finalidade de proliferar, migrar, diferenciar ou tornar-se ativas em qualquer outra forma. A proliferação de células B, por exemplo, pode ser induzida sem sinais co-estimuladores por meio de por moléculas de DNA imunoestimuladoras, que normalmente requerem um sinal co-estimulador de células T auxiliares.

A imunossupressão por outro lado deve ser entendida como a redução da ativação ou a eficácia do sistema imune. A imunossupressão é geralmente induzida por deliberadamente para prevenir, por exemplo, a rejeição de um órgão transplantado, para tratar doença enxerto-versus-hospedeiro após um transplante de medula óssea, ou para o tratamento de doenças auto-imunes, tais como, por exemplo, artrite reumatóide ou doença de Crohn.

Neste contexto, a imunomodulação também pode se referir à influência da natureza ou o caráter de uma reação imune, quer por afetar uma reação imune que ainda está em desenvolvimento ou maturando ou através da modulação do caráter de uma reação imune estabelecida. O termo "vacinação" usado nesta divulgação se refere à administração de materiais antigênicos (uma vacina) para produzir imunidade a uma doença. Vacinas podem prevenir ou melhorar os efeitos da infecção por vários patógenos, tais como virus, fungos, protozoários parasitas, bactérias, mas também das doenças alérgicas e da asma, bem como de tumores. Vacinas normalmente contêm uma ou mais adjuvantes, por exemplo ácidos nucleicos imunoestimuladores, usados para aumentar a resposta imune. A vacinação é, geralmente, considerada como o método mais eficaz e econômico de prevenção de infecções e outras doenças. O material administrado, por exemplo, pode servivo, mas formas enfraquecidas de patógenos (bactérias ou vírus), formas mortas ou inativadas destes patógenos, material purificado, tais como proteínas, ácidos nucléicos que codificam antígenos, ou de células, tais como células tumorais ou células dendríticas. Em particular, vacinação com DNA foi recentemente desenvolvida. A vacinação com DNA trabalha pela inserção (e expressão, desencadeando o reconhecimento do sistema imune) de DNA que codificam antígenos em células humanas ou animais. Algumas células do sistema imune que reconhecem as proteínas expressas montarão um ataque contra estas proteínas e contra as células que as expressam. Uma das vantagens das vacinas de DNA é que elas são muito fáceis de produzir e armazenar. Além disso, as vacinas DNA têm um número de vantagens sobre vacinas convencionais, incluindo a capacidade de induzir uma ampla gama de tipos de resposta imune.

A vacinação pode ser utilizada como uma abordagem profilática, levando à imunidade contra o antígeno no indivíduo saudável, vacinado após a exposição ao antígeno. Como alternativa, uma vacinação terapêutica pode causar uma melhor resposta do sistema imunológico do indivíduo doente vacinado, orientando o sistema imune do indivíduo para os antígenos. Tanto a vacinação profilática como terapêutica podem ser aplicadas a seres humanos, bem como animais. O termo "terapia genética", usado na presente divulgação se refere a modificação genética transitória ou permanente (por exemplo, inserção, alteração ou remoção de genes) de das células e/ou tecidos biológicos de um indivíduo, com a finalidade de tratar doenças, tais como tumores ou doenças auto-imunes. A forma mais comum de terapia gênica envolve a inserção de genes funcionais em uma localização genômica não especificada, com a finalidade de substituir um gene mutado, mas outras formas envolvem diretamente corrigir a mutação ou modificar um gene normal que permite uma infecção virai ou mesmo transferir um gene ou um fragmento do gene em uma célula para sua transcrição. "Terapia gênica autóloga" se refere à utilização de tecidos ou de células da mesma pessoa. As células ou tecidos isolados poderão ser modificados por terapia gênica e reintroduzidos no doador. Em contraste, "terapia gênica alogênica" se refere a utilização de células para terapia gênica de um individuo diferente do individuo aceptor. Após a modificação genética, as células alogênicas são introduzidas no aceptor. O termo "terapia gênica ex-vivo" se refere a uma abordagem de terapia na qual as células de um individuo, por exemplo, células-tronco hematopoéticas ou células progenitoras hematopoéticas, são geneticamente modificadas ex vivo e posteriormente introduzidas ao individuo a ser tratado. A expressão "terapia gênica in vivo" se refere a uma abordagem de terapia na qual as células de um individuo, por exemplo, células-tronco hematopoéticas ou células progenitoras hematopoéticas, são geneticamente modificadas in vivo usando vetores virais ou outras construções de expressão, por exemplo.

Terapia genética pode também ser classificada em "terapia gênica germinal" e "terapia gênica somática". No caso de "terapia gênica de linha germinal", células germinativas, ou seja, esperma ou óvulos, são geneticamente modificados. As alterações genéticas são normalmente integradas em seus genomas. Por conseguinte, a mudança devido à terapia seria hereditária e que seria passada para gerações futuras. Esta abordagem é útil para o tratamento de doenças genéticas e doenças hereditárias. No caso de "terapia de genes somáticos", os genes terapêuticos são transferidos em células somáticas de um individuo. As modificações e os efeitos serão limitados ao individuo apenas, e não serão herdadas pelos descendentes do indivíduo ou as gerações futuras

O termo "câncer" compreende doenças cancerosas ou um tumor sendo tratado ou prevenido que é selecionado a partir do grupo que compreende, mas não é limitado a, carcinomas mamários, melanoma, neoplasias de pele, linfoma, leucemia, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas de cólon, carcinomas de estômago, carcinomas de pâncreas, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, carcinomas de ovário, carcinomas cervicais, câncer de pulmão, câncer de próstata, carcinomas de células renais e/ou metástases hepáticas.

Doenças auto-imunes de acordo com a presente divulgação compreendem artrite reumatóide, doença de Crohn, lúpus eritematoso sistêmico (LES), tireoidite auto-imune, tireoidite de Hashimoto, esclerose múltipla, doença de Graves e miastenia gravis, doença celíaca e doença de Addison.

A presente divulgação fornece uma sequência de DNA linear de cadeia aberta compreendendo pelo menos um motivo CG e, pelo menos um nucleotídeo em conformação L. Devido à conformação parcial/completa em L o DNA não pode agir como substrato para enzimas de degradação de DNA específico em conformação D de ocorrência natural. Assim, as construções de DNA da presente invenção são protegidos contra degradação enzimática sem ter que usar uma estrutura de fosforotioato que tem se mostrado tóxico. Além disso, a construção de DNA apenas consiste em um número mínimo de nucleotídeos, o que os torna pequenos e, assim, significativamente melhora a sua absorção pelas células do paciente.

O efeito de CG-construções contendo o DNA depende de sua interação com TLR9, e a interação proteína-DNA depende da conformação do DNA e proteína. Uma vez que a quiralidade das moléculas simples é decisiva para a conformação do polímero resultante não era sabido se uma molécula de DNA de parcial ou completa conformação em L seria capaz de se ligar a e ativar TLR9. Dados experimentais mostram que essas moléculas de DNA protegidas são surpreendentemente adequadas para a indução de uma resposta imune. Como mostrado nos exemplos e figuras, pelo menos uma alteração parcial na quiralidade de nucleotideos individuais, obviamente, ainda permite a ligação e a ativação de TLR9. Portanto, moléculas de DNA com motivos CG e nucleotideos em conformação L podem ser usados para imunomodulação.

Surpreendentemente, o padrão de estimulação induzida difere do padrão de estimulação induzida pela molécula divulgada no documento EP 1 196 178 que revela a molécula em forma de haltere compreendendo motivos CG nas alças de cadeia única em ambas as extremidades da molécula ou na haste de cadeia dupla d ("dSLIM"), como pode ser visto nas figuras, mesmo quando se utilizam sequências de nucleotideos idênticas.

A construção de DNA pode ser de cadeia única ou parcialmente ou completamente de cadeia dupla. Isso inclui pareamento de base dentro da mesma molécula (intramolecular) ou no âmbito de diferentes moléculas (intermolecular) ou qualquer combinação dos mesmos. Também é possivel que a construção compreenda pelo menos uma região de cadeia única pareada. Como mais uma modalidade, as estruturas de grampo de cabelos estão incluidas. Devido à conformação em 1 parcial ou completa, uma meia vida mais longa da construção é assegurada, já que os nucleotideos em conformação L não são sujeitos à degradação.

Pretende-se ainda que pelo menos duas moléculas, que são de cadeia única ou parcialmente ou completamente de cadeia dupla possam se ligar uma á outra para formar construções multiméricas. Estas construções multiméricas, assim, incorporam pelo menos tantos motivos CG como parceiros de ligação, firmemente empacotados dentro de uma molécula, e são, por conseguinte, esperados que desencadeiem uma considerável resposta imune. As resultantes construções multiméricas de cadeia única ou parcialmente ou completamente de cadeia dupla podem ser covalentemente fechadas compreendendo nucleotideos em conformação L na molécula ou construções multiméricas aberta compreendendo nucleotideos em conformação L em ou perto da extremidade 5' e/ou3'para proteção contra degradação enzimática.

De acordo com a presente divulgação os motivos CG são localizados dentro da região de cadeia simples e/ou de cadeia dupla da construção. Como foi divulgado no documento EP 1 196 178, os motivos CG são capazes de desencadear uma resposta imune se eles estão incluidos na cadeia única ou na região de cadeia dupla da molécula.

A invenção compreende ainda modificações quimicas de pelo menos um nucleotídeo em conformação L ou D com um grupo funcional selecionado a partir do grupo que compreende grupos carboxila, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, dissulfeto, tiol e aldeido. Isto permite o acoplamento da construção de DNA a um composto selecionado a partir do grupo que compreende peptideos, proteínas, lipídios, vesículas, micelas, carboidratos, anticorpos, moléculas sintéticas, polimeros, micro projéteis, partículas de metal, nanoparticulas ou uma fase sólida por meio de, por exemplo, adsorção, ligação covalente ou iônica. A modificação pode ser especificamente selecionada para a respectiva finalidade. A construção pode, assim, ser usada, por exemplo, para transportar outras moléculas à célula especifica para responder aos motivos CG incorporados. Além disso, é possível por tais modificações acoplar a construção a microprojéteis que podem ser usados para transferir a construção dentro da célula. A construção também pode ser acoplada a uma fase sólida, por exemplo, uma placa de microtitulação.

A ativação tendenciosa de Thl envolve a ativação de células NK e células T citotóxicas e essas respostas imunes podem ser exploradas para terapia de câncer. Uma vez que as construções de DNA contendo motivos CG não metilados preferivelmente levam a ativação Thl, as construções da presente divulgação podem ser usadas para o tratamento de câncer. Numerosos ensaios clinicos estão em andamento envolvendo agonistas de TLR9 para o tratamento de câncer. Tais moléculas têm sido efetivamente administradas isoladamente ou em combinação com, por exemplo, radioterapia, cirurgia, quimioterapia e crioterapia (Krieg, J. Clin. Invest.2007 117: 1184-94). Devido a sua potente imunomodulação, seu pequeno tamanho e sua estabilidade as construções da presente divulgação são esperadas que sejam altamente vantajosas a este respeito. Além disso, o seu distinto perfil imunológico distingue-os de outros, menos vantajosos ligantes de TLR9, e esse perfil pode ser explorado para tratamento especifico de câncer.

Por outro lado, os agonistas de TLR9 estão também envolvidos na geração de células T reguladoras e podem, assim, ser utilizados para o tratamento de doenças auto- imunes. A via de administração parece ser uma variável que determina o efeito das construções de DNA contendo motivos CG in vivo (Krieg, J. Clin. Invest.2007 117: 1184-94). O efeito imunoestimulador de tais moléculas de DNA contendo motivos CG tem sido mostrado que aumentam a eficácia das abordagens terapêuticas padrão, tais como quimioterápicos, na terapia de câncer. Por conseguinte, são também fornecidas composições farmacêuticas que compreendem as construções da presente divulgação. Mais uma vez, as vantagens das construções da presente divulgação comparado com os agonistas de TLR9 do estado da técnica construções da presente divulgação ferramentas promissoras para o tratamento de doenças tais como câncer, doenças infecciosas, alergias e asma. O tratamento das alergias e da asma (principalmente mediada por Th2), desta forma, se beneficia da preferência da ativação de Thl.

Uma vez que os agonistas de TLR9 têm se mostrado potentes adjuvantes em vacinas, as vacinas que compreendem as construções de DNA da presente divulgação também são fornecidas. As construções da presente divulgação compreendem apenas as sequências relevantes para a estimulação de TLR9 e são estáveis devido à modificação de L-nucleotideo. Por isso, os efeitos colaterais devido a sequências não-relevantes podem ser evitados. A meia-vida mais longa da molécula assegura um eficiente estimulo de modo que uma forte resposta imune é esperada.

As moléculas de DNA da presente divulgação foram produzidas pelo uso de uma coluna de sintese e os respectivos nucleotideos (Beta-L-desoxi "NT"(n-bz) CED fosforamidita; "NT"significa adenosina, guanosina ou citidina, timidina). As moléculas de ADN foram posteriormente purificadas por meio de HPLC.

Para revelar o efeito de usar o DNA com L-ribose em vez de D-ribose, as seguintes moléculas de DNA foram usadas para experimentos iniciais descritos no presente documento (Tabela 1). Tabela 1: Sequências de construções de DNA não codificadoras imunoestimuladoras e dos controles.

Experimentos usando as sequências de Tabela 1 mostraram que as sequências lineares protegidas de L-ribose contendo motivos CG são capazes de estimular o sistema imune e a resposta imune induzida difere claramente da resposta imune induzida por dSLIM como divulgada no documento EP 1 196 178. Assim, a sequência modificada chamada ODN2216 (GGGGGACGATCGTCGGGGGG; SEQ ID 6) e modificações da mesma foram usadas para investigar a influência da diferença estrutural como a influência do trechos de G no que diz respeito à sua presença, o comprimento e a posição, o espaçamento entre os motivos CG e a distância entre nucleotideos L-ribose e os motivos CG, respectivamente, trechos de G. A Tabela 2 resume as sequências usadas e os seus efeitos em secreção de IFN-alfa e IP-10 em comparação com ODN2216 tendo os dois primeiros e os seis últimos nucleotideos modificados com fosforotioato, onde as letras em negrito representam nucleotideos compreendendo l-ribose, itálico referem-se a um trecho de G e letras sublinhadas referem-se a um motivo CG. Um tracejado deve colocar a respectiva sequência no lugar para a comparação com CKm508mas não indica uma modificação estrutural e nem umamodificação funcional da sequência Tabela 2: Efeito das sequências indicadas na secreção de IFN-alfa e IP-10 em co mparação a ODN2216 (ODN2216 tendo os dois primeiros e o último seis nucleotideos modificados com fosforotioato).

Bons resultados foram obtidos com as sequências tendo pelo menos um trecho de G, especialmente em ou perto da extremidade 3'. A estimulação é ainda dependente da presença de motivos CG(CKM477), o que mais uma vez mostra que a estimulação não é um efeito da 1-ribose, mas dos motivos CG. Os resultados obtidos com sequências modificadas dos componentes estruturais positivos que identificam ODN 2215 foram transferidos para a sequência de DNA de CKm374. A Tabela 3 mostra os resultados de utilizar as sequências modificadas em comparação com dSLIM em forma de haltere divulgada no documento EP 1 195 178. Mais uma vez, letras em negrito representam nucleotideos compreendendo 1-ribose, letras em itálico se referem a um trecho de G, letras sublinhadas duplamente representam nucleotideos modificados com fosforotioato e letras sublinhadas se referem a um motivo CG.

Como pode ser obtido a partir dos resultados da tabela 3, o trecho de G localizado diretamente na extremidade 5' parece ser vantajoso (comp. CKm532 e CKm499). Além disso, utilizando quatro em vez de três desoxiguanosinas na extremidade 5' aumenta ainda mais a estimulação de IFN-alfa e IP-10 (comp. CKm501 e CKm532).

A adição de mais um trecho de G entre os motivos CG parece ser benéfica também (comp. CKm532 e CKm520). A distância entre o primeiro e o segundo trecho de G ainda influencia a eficácia da molécula de DNA. Além disso, utilizando desoxinucleotideos compreendendo 1-ribose apenas em ou perto do 3' parece render um grau de estabilização suficiente da molécula de DNA. Um bom estimulo de IFN-alfa e IP-10 pode ser observado, o que é pretendido (veja abaixo). Porque IL-8 tem sido mostrado que é responsável pela indução de neo-angiogênese, parece ser benéfico que a secreção de IL- 8 seja induzida somente em pequenas quantidades.

Claramente, a presença e a posição escolhida cuidadosamente de trechos de G em combinação com o efeito estabilizante da desoxinucleotideos compreendendo l-ribose permite a produção de uma molécula de DNA que supera a 5 eficiência da estimulação da molécula de dSLIM. Tabela 3: Comparação do efeito da sequências indicadas em secreção de IFN-alfa, IP-10 e IL-8 em comparação com dSLIM.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A divulgação será ilustrada adicionalmente pelosexemplos e figuras sem estar limitado às modalidades divulgadas. É mostrado: Fig. 1 Eletroforese em gel de agarose de construções de DNA após digestão enzimática. Fig. 2 intensidade de GFP após estimulação deuma linha de células de macrófagos de camundongos. Fig. 3 concentração de MIP-lalfa após estimularcélulas dendriticas plasmacitóides (PDCs). Fig. 4 concentração de MIP-lbeta após estimularPDCs . Fig. 5 concentração de IL-8 após estimular PDCs. Fig. 6 concentração de IL-6 após estimular PDCs. Fig. 7 concentração de IFN-alfa após estimular20 PDCs. Fig. 8 concentração de TNF-alfa após estimularPDCs. Fig. 9 concentração de MCP-1 e IL-8 apósestimular células mononucleares de sangue periférico (PBMCs). Fig. 10 Freqüência de células T ativadas após estimular PBMCs. Fig. 11 e 12 secreção de IFN-alfa, IP-10 e IL-8 de PBMCs Fig. 13 Efeito dos desoxinucleotideos modificadocom 1-ribose terminal na estimulação de células ELAM9. Fig. 14 estimulação imune das células B e PDCs por CKM532 e dSLIM, em comparação com o estado não estimulado.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra um gel de todas as construções de DNA sendo submetidos à digestão pela T7-Polimerase do bacteriófago T7. 6 μg de cada construção de DNA foram incubados com 10 unidades de T7-Polimerase (volume total da reação: 20 μl). Depois de 0, 1, 2, 5, 30, e 1500 minutos, uma alíquota de 3 μl da mistura de incubação foi removida da amostra e diluída com 5 μl de corante de Sanger contendo formamida. Todas as alíquotas foram carregadas sobre o gel de agarose a 3%, que foi corrido em 100 Volts por 40 minutos.

A molécula de DNA não modificado lin-30L2 (pista 2) foi encontrada que é totalmente digerida após 5 minutos de incubação com T7-Polimerase, enquanto a construção de acordo com a presente invenção (CKM337; pista 3), bem como dSLIM (pista 1) e as construções modificadas com fosforotioato CKm338 (pista 4) e CKm339 (pista 5) mantido significativa presença mesmo após 1500 minutos de incubação. De fato, CKM337 apresentou a maior estabilidade de todas as moléculas testadas. Devido a sua insuficiente estabilidade, Lin 30L2 foi excluído do estudo.

A Figura 2 mostra a estimulação de células E1AM9 com diferentes construções de DNA estimuladoras. Células ELAM9 são células de macrófagos murinas TLR9-positivas (RAW264) que foram transfectadas estavelmente com dl-egfp sob o controle do promotor da elastina humana(hELAM) contendo diversos elementos de resposta NFKB. Um dia após a semeadura, as células foram estimuladas com as construções de DNA (3 μM) representadas por 7 horas. A média geométrica de intensidade da GFP foi medida por meio de citometria de fluxo.

A construção de DNA com todos os nucleotideos em conformação L com exceção do último T (CKm336) não tinha capacidade estimuladora. No entanto, a construção de DNA de nucleotideos em conformação L em ambas as extremidades (CKm337) sim que estimulou a expressão de GFP. Isso foi bastante inesperado uma vez que não era conhecido se as construções de DNA contendo motivos CG com nucleotideos em conformação L seriam capazes de se ligar a e ativar TLR9.

Além disso, espera-se que CKm337 seja absorvido pelas células mais facilmente do que dSLIM (molécula divulgada no documento EP 1 196 178), e seja menos tóxica do que as construções modificada com fosforotioato (CKm338 e CKm339).

A figura 3 e a figura 8 mostram os efeitos das construções de DNA em pDCs com relação a quimiocinas e citocinas secretadas. pDCs foram enriquecidos de PBMCs purificadas com Ficoll usando um procedimento de triagem combinado Miltenyi, Diamond PDC Kit: em primeiro lugar, as PBMCs foram esgotadas de não pDCs usando o PDC Biotin- Antibody Cocktail do kt de Miltenyi, em seguida, as células foram positivamente ordenadas para pDCs usando microesferas de diamante CD304 (BDCA-4) do PDC Diamond Kit. PDCs foram semeadas a 2,5 x 105/ml, com 10 ng/ml de IL-3 no meio (RPMI1640, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml depenicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 37 °C, 5% de CO2) , e estimuladas por 2 dias por construções individuais aplicadas a 3 μM.

Para a determinação da quantidade de compostos secretados após a estimulação de células, o sobrenadante aclarado de células estimuladas foi colhido e analisado usando um sistema multiplex (FlowCytomix de eBioscience/Bender MedSystems) ou ELISA.

Surpreendentemente, pDCs estimulados com CKm337 mostraram um efeito semelhante na secreção de MIP-lalfa, -Ibeta e IL-8 em comparação com a estimulação com dSLIM. A secreção de MIP-lalfa, -Ibeta e IL-8 após estimulação com lin CKm338 e CKm339 foi ligeiramente superior (Figuras 3, 4 e 5). No entanto, todos os construtos fosforotioato modificados herdaram várias desvantagens, como descrito acima.

Sobre a secreção de IL-6, dSLIM, CKm337 e CKm338 tiveram um efeito semelhante no pDCs. CKm339 foi ligeiramente mais eficaz (Figura 6).

De nota, CKm337 tinha um efeito surpreendentemente mais forte sobre a secreção de IFN-alfa de pDCs em comparação com todas as outras construções lineares (Figura 7).

Dslim, CKm337, CKm338 e CKm339 todos tinham um efeito semelhante na secreção de TNF-alfa de pDCs. (Figura 8) .

PBMCs foram isoladas de camadas de células brancas de seres humanos através de um gradiente de densidade Ficoll. Para a análise funcional de 105células/ml em meio (RPMI1640, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/ml de penicilina, 100 unidades/ml de estreptomicina, 2 mM de glutamina, 37 °C, 5% de CO2) foram estimulados por 2 dias por diversos compostos aplicados nas concentrações indicadas (2-3 μM).

A Figura 9 (A e B) mostra o efeito das construções de DNA ilustradas (3 μM cada) em PBMCs com relação à secreção de MCP-1 e IL-8. Como era esperado a partir dos experimentos com pDCs, a construção de DNA com todos os nucleotideos em conformação L (CKm336) não tinha capacidade estimuladora quando aplicada em PBMCs. No entanto, CKm337 foi eficaz em provocar tanto secreção de MCP-1 como de IL-8. Surpreendentemente, o seu efeito sobre a secreção IL-8foi mais forte em comparação com dSLIM e menos forte com relação a secreção de MCP-1.

Para a determinação de subpopulações de células e o estado de ativação das mesmas, marcadores de superficie característicos foram rotulados com anticorpos conjugados seletivos de fluoróforos. Coloração de anticorpos foi realizada com 106 células/conjunto de coloração; cada conjunto foi incubado com até 4 diferentes anticorpos acoplados a grupos fluoróforos, finalmente ressuspenso em 400 μl de tampão FACS e analisado por meio de citometria de fluxo em pelo menos 100.000 células vivas. A estratégia controlada para a determinação de células T e células ativadas ai foi CD3+ /CD56- com o marcador ativação CD69.

A Figura 10 mostra o efeito da construção de DNA representada (2 μM cada) no que se refere à frequência de células T ativadas dentro da população de PBMCs. Todas as cinco construções tiveram uma capacidade estimuladora comparável. Células T não expressam TLR9. Portanto, após a estimulação com o construção de DNA,células PBMCs dentro da população foram ativadas, que por sua vez foram capazes de ativar as células T.

A otimização das sequências revelou que a introdução dos trechos de G aumenta a eficácia dos oligonucleotídeos após a transfecção. A eficácia é ainda dependente da distância entre os motivos CG. As sequências de DNA lineares podem ser suficientemente protegidos contra a degradação pelo uso de L-ribose compreendendo desoxinucleotideos na extremidade 3' do oligonucleotideo (comp tabelas 2 e 3) . Os oligos CKm501 (SEQ ID NO: 33) , CKM527 (SEQ ID NO: 32), CK 532 (SEQ ID NO: 31) e CKm534 (SEQ ID NO: 34) mostrou resultados bons inesperados, como pode ser retirado da tabela 3. As Figuras 11 e 12 mostram o efeito da construção de DNA sobre a secreção de citocinas IFN-alfa (na parte superior), IP-10 (meio) e IL-8 (parte inferior) em PBMCs. Os experimentos foram realizados conforme já descrito acima.

A Figura 11 mostra que CKm501 e CKm527 causam niveis elevados de secreção de IFN-alfa e CKm527aumenta a secreção IP-10 também em comparação ao dSLIM em forma de haltere. A secreção de IL-8 é comparável baixa no que diz respeito a dSLIM, mas menor em comparação com CKm339, que é a sequência de alças de cadeia única de dSLIM em forma de haltere protegido em ambas as extremidades com desoxinucleotideos modificados com fosforotioato.

Como pode ser visto da figura 12 CKm532 mostra uma significativa e inesperada alta indução de secreção de IFN- alfa e IP-10, mas uma comparável baixa indução de secreção de IL-8. Assim, CKm532 confirma que o elemento estrutural de um trecho de G localizado diretamente na extremidade 5' e mais um trecho de G localizado entre dois motivos CG (segundo e terceiro motivo GC) parece ser de vantagem. Comparando CKm520 e CKm532 na Tabela 3 indica que a localização de um trecho de G entre o segundo e o terceiro motivo CG em CKM532 é responsável pelo aumento pretendido de secreção de IFN-alfa e IP-10, enquanto CKm520 principalmente aumenta a secreção de IL-8. Além disso, a proteção do oligo apenas com dois desoxinucleotideos compreendendo L-ribose na extremidade 3’ parece ser suficiente.

Encurtando o trecho de G na extremidade 5' resulta em uma redução da sua eficácia, como podem ser tomadas a partir da comparação de CKm532 e CKm 534 na figura 12. Mais uma vez, CKm532 demonstra as vantagens do componentes estruturais identificados no que diz respeito a uma maior secreção de IFN-alfa e IP-10 e baixa secreção de IL-8.

A Figura 13 mostra na parte superior os resultados de estimulação de células E1AM9 comas construções de DNA, que compreendem desoxinucleotideos puros com diferentes graus de modificações de L-ribose. Os nucleotideos compreendendo L- ribose são representados nas sequências na parte inferior da figura 13, em negrito. Os experimentos foram realizados em duplicata (L-dSLIM032 e L-dSLIM030).

O grau e a posição de desoxinucleotideos compreendendo L-ribose tem uma influência sobre a estimulação de células E1AM9. Uma sequência completa em conformação L (CKm 336; SEQ ID NO:2) não tem nenhum efeito estimulador, o que está de acordo com a divulgação do documento WO 2010/039137. Bons efeitos são obtidos usando motivo CG compreendendo oligos protegidos por desoxinucleotideos compreendendo L-ribose na extremidade 3' e 5' , considerando que a longa extensão dos desoxinucleotideos compreendendo L- ribose na extremidade 5' é contraproducente (comp CKm489 e CKm490). Além disso, a modificação dos motivos CG com desoxinucleotideos compreendendo L-ribose leva a uma perda de efeito. Assim, com a finalidade de alcançar bons efeitos estimuladores, os motivos CG não devem compreender L-riobose e a extensão de desoxinucleotideos modificados com L-ribose em ambas as extremidades deve ser restrita, isto é, não mais do que oito desoxinucleotideos terminais em 5' e máximo os desoxinucleotideos 3' terminal seguintes ao motivo CG.

A Figura 14 mostra a estimulação imune por CKm532 e dSLIM, em comparação com estado não estimulado. Os experimentos de FACS foram realizados de acordo com o protocolo utilizado para os experimentos descritos na Figura 10 e adaptados para as células B (estratégia controlada: CD19 positivo, CD86 como marcador de ativação) e PDCs (estratégia controlada: linhagem negativa, HLA-DR positivo e células CD123 positivas, CD40 e HLA-DR como marcador de ativação), respectivamente. Os dados apresentados são baseados em medições de três diferentes preparações de "camadas de células brancas".

A parte superior da figura 14 mostra a estimulação de células B, como evidenciado pelo marcador CD86. Claramente, CKm532 provoca um aumento de estimulação de células B, quando comparada com dSLIM e o estado não estimulado. Isso mostra o aumento ma maturação de células B, como, por exemplo, células produtoras de anticorpos, o que é uma característica importante da estimulação imunológica.

A parte inferior da figura 14 mostra a estimulação dos PDCs, conforme detectado usando o marcador HLA-DR. HLA-DR é parte de moléculas MHC, e, por conseguinte, parte dos processos de apresentação de antigeno do sistema imune. Mais uma vez, CKm532 exibe um aumento maior deste recurso de estimulação imune que dSLIM ou células não estimuladas.

Em conclusão, CKm337 (construção de D-DNA com nucleotideos em conformação L em ambas as extremidades) surpreendentemente teve um efeito estimulador sobre tanto PBMC como pDCs isolados enquanto a construção de DNA com todos os nucleotideos em conformação L (CKM336) não tinha efeito. Aparentemente, a conformação do CKm337 ainda permite a ligação aTLR9, e CKm336 é estericamente incapaz de se ligar a ou estimular TLR9. Inesperadamente, o padrão de estimulação induzida por CKm337 em comparação com dSLIM em forma de haltere e oligos modificados com fosforotioato, foi único em comparação com todos as outros construções. CKm337 induziu os montantes mais elevados de IFN-alfa por pDCs. A secreção de IL-8 por PBMC foi mais fraca em comparação com as moléculas modificadas com fosforotioato, mas mais forte em comparação com dSLIM. Em contraste, dSLIM induziu uma maior quantidade de MCP-1 secretado por PBMCs, mas Ckm337 foi comparável às moléculas modificadas com fosforotioato. Foi possivel aumentar os efeitos observados com CKm337 introduzindo os chamados trechos de G diretamente na extremidade 5' da molécula de DNA linear. Além disso, constatou-se que a mera proteção contra a degradação por desoxinucleotideos compreendendo L-ribose na extremidade 3' é suficiente para estabilizar o oligo. As características estruturais identificadas dos trechos de G, motivos CG, espaçamento dos motivos CG e proteção, usando diferentes graus e posições de desoxinucleotideos modificados com L- ribose permitem uma modulação do efeito imunoestimulador de oligonucleotídeos compreendendo L-ribose. Parece bastante evidente que a presente divulgação revela novas ferramentas para a construção de construções de DNA imunoestimulador para uma estimulação específica de células ou do sistema imune. IFN-alfa tem sido conhecida como uma citocina antiviral por muitos anos. Estimula o desenvolvimento de células Thl, promovendo, assim, os efeitos das moléculas de ADN contendo CG. O IFN-alfa também apresenta atividade antitumoral em camundongo e malignidades humanas e é capaz de diminuir a tumorigenicidade de células tumorais transplantadas, parcialmente pela ativação de células T citotóxicas e assim aumentando a probabilidade de citólise de células tumorais. A atividade de células NK e macrófagos, ambos também importantes para citotoxicidade antitumoral, são também aumentadas por IFN-alfa (Brassard et al., J. Leukoc. Biol. 2002 71: 565-81). Por conseguinte, espera-se que o aumento da quantidade de IFN-alfa após estimulação com o as construções de DNA da presente divulgação seja benéfico para o tratamento do câncer. IP-10 demonstrou recentemente ser uma potente proteína angiostática in vivo. Assim, a indução de IP-10 especialmente no tratamento de doenças tumorais parece ser vantajosa também. IL-8 é uma citocina pró-inflamatória, que é conhecida por mediar a ativação e migração de neutrófilos no tecido do sangue periférico. A infiltração neutrofílica resultante pode ser parcialmente responsável pela inibição do crescimento do tumor, como foi mostrado no caso do câncer de ovário (Lee et al., J. Trans Am Clin Climatol Assoe. 2000 164: 2769-75). Além disso, a IL-8 também é quimiotática para células T e basófilos. Por conseguinte, para o tratamento ou prevenção de pelo menos alguns tipos de tumores é vantajoso seletivamente sobrerregular IL-8 em resposta a construções de DNA contendo CG. Por outro lado, tem sido estabelecido que a IL-8 desencadeia a angiogênese de modo que a indução de secreção de IL-8 poderia ser contraproducente. Assim, os diferentes graus de indução de IL-8 por diferentes moléculas de DNA da presente invenção poderiam permitir uma adaptação da molécula para os efeitos terapêuticos desejados. A MCP-1 é conhecida por desempenhar um papel para orecrutamento de monócitos/macrófagos para os locais de lesão e infecção e, consequentemente, está possivelmente envolvida na estimulação de respostas anti-tumorais no hospedeiro. Foi demonstrado que MCP-1 pode ativar monócitos para ser mais citostáticos contra diversos tipos de células tumorais in 10 vitro(Zachariae et al., J. Exp. Med. 1990 171: 2177-82).Portanto, semelhantes a IL-8 é benéfico modular a expressão de MCP-1 dependendo do contexto de tumor especifico. Assim, o padrão de citocinas especificas induzidas é benéfico para o tratamento e prevenção de distintos tipos 15 de tumores. Obviamente, o contexto especifico em que o motivo CG não metilado é apresentado a TLR9 determina o respectivo padrão de estimulação individual induzida em células responsivas.

Claims (18)

1. CONSTRUÇÃO DE DNA NÃO-CODIFICANTE, DE CADEIA ABERTA LINEAR PARA IMUNOMODULAÇÃO, sem uma estrutura de fosfortioato, dita construção caracterizada por compreender pelo menos um motivo de sequência N1N2CGN3N4, em que N1N2 é um elemento selecionado do grupo compreendendo GT, GG, GA, AT ou AA, N3N4 é um elemento selecionado do grupo compreendendo CT ou TT, em que C é desoxicitidina, G é desoxiguanosina, A é desoxiadenosina e T é desoxitimidina, e em que o motivo de sequência compreende pelo menos um nucleotídeo que está em conformação L dentro dos cinco nucleotídeos terminais localizados na extremidade 5'- e/ou a 3' de uma única cadeia de DNA.

2. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por pelo menos um trecho de G de pelo menos três desoxiguanosinas consecutivas estar localizado perto da extremidade 5' e/ou 3'.

3. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por um trecho de G de pelo menos três desoxiguanosinas consecutivas estar localizado entre dois motivos de sequência de acordo com a reivindicação 1.

4. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por pelo menos cinco bases estarem localizadas entre dois motivos de sequência de acordo com a reivindicação 1, excluindo desoxiguanosina.

5. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a construção é caracterizada por compreender DNA de cadeia única ou dupla.

6. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por o motivo de seqüência N1N2CGN3N4 tal como definido na reivindicação 1 estar localizado dentro de uma região de cadeia única e/ou de cadeia dupla da seqüência de DNA.

7. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender pares de base inter- e/ou intramoleculares e, pelo menos uma região de cadeia única despareada.

8. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada por pelo menos duas construções se ligarem uma com a outra.

9. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por pelo menos um nucleotídeo em conformação L ou D ser modificado com um grupo funcional selecionado a partir do grupo que compreende grupos carboxila, amina, amida, aldimina, cetal, acetal, éster, éter, dissulfeto, tiol e aldeído.

10. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por o nucleotídeo modificado ser ligado a um composto selecionado a partir do grupo que compreende peptídeos, proteínas, carboidratos, anticorpos, lipídios, micelas, vesículas, moléculas sintéticas, polímeros, micro- projéteis, partículas de metal, nanopartículas ou uma fase sólida.

11. CONSTRUÇÃO, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada por compreender um primeiro trecho de G na extremidade 5' e três motivos sequência de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que pelo menos cinco bases estão localizadas entre o primeiro e o segundo motivo, excluindo desoxiguanosina, e um trecho de G, que está localizado entre o segundo e o terceiro motivo de seqüência e em que dois dos três desoxinucleótidos terminais 3'estão em conformação L.

12. CONSTRUÇÃO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por compreender pelo menos um trecho de G adicional.

13. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender ainda um quimioterápico.

15. VACINA, caracterizada por compreender uma construção de DNA de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

16. VACINA, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por a construção de DNA ser compreendida como adjuvante.

17. USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, uma composição farmacêutica de acordo com qualquer um das reivindicações 10 ou 11 ou uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer ou doenças auto-imunes.

18. USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE DNA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 ou 14 ou uma vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 ou 16, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para a modulação do sistema imune.