DE60132471T2

DE60132471T2 - Modulation der immunostimulatorischen aktivität von immunostimulierenden oligonukleotidanaloga durch positionelle chemische veränderungen

Info

Publication number: DE60132471T2
Application number: DE60132471T
Authority: DE
Inventors: Ekambar R. Southboro KANDIMALLA; Quiyan Southboro ZHAO; Dong Westboro YU; Sudhir Shrewsbury AGRAWAL
Original assignee: Idera Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aceragen Inc
Priority date: 2000-09-26
Filing date: 2001-09-26
Publication date: 2009-01-15
Anticipated expiration: 2021-09-27
Also published as: US20070072198A1; ATE384072T1; KR20080013028A; JP2004509970A; US20080027214A1; US8030462B2; US7824696B2; US20040266709A1; AU2001294750B2; US7790168B2; US7262286B2; AU2001294750C1; US8716253B2; CA2423487C; US7833538B2; US20040266710A1; EP1322656A2; AU9475001A; US8476416B2; EP2292632A2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide oder Oligonukleotidanaloga als immunstimulierende Mittel in immuntherapeutischen Anwendungen.
Zusammenfassung des Standes der Technik
Oligonukleotide sind zu unverzichtbaren Werkzeugen in der modernen Molekularbiologie geworden und werden in einer Vielzahl von Techniken, die von diagnostischen Sondenverfahren über PCR bis zu Antisense-Hemmung der Genexpression und immuntherapeutischen Anwendungen reichen, verwendet. Diese weit verbreitete Verwendung von Oligonukleotiden führte zu einem ansteigenden Bedarf für schnelle, kostengünstige und wirksame Verfahren zur Synthese von Oligonukleotiden.
Die Synthese von Oligonukleotiden für Antisense- und Diagnoseanwendungen kann nunmehr routinemäßig erfolgen; vgl. z. B. Methods in Molekular Biology, Band 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Seiten 165–189 (S. Agrawal, Hrsg., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Seiten 87–108 (F. Eckstein, Hrsg., 1991); Uhlmann und Peyman, Methods Mol. Biol. 20: 355–389 (1993); Agrawal und Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995) und Antisense Research and Applications (Crooke und Lebleu, Hrsg., CRC Press, Boca Raton, 1993). Frühe synthetische Vorgehensweisen beinhalteten Phosphodiester- und Phosphotriesterchemien. Khorana et al., J. Molec. Biol. 72: 209 (1972) beschreiben Phosphodiesterchemie für eine Oligonukleotidsynthese. Reese, Tetrahedron Lett. 34: 3143–3179 (1978) beschreibt Phosphotriesterchemie für eine Synthese von Oligo nukleotiden und Polynukleotiden. Diese frühen Vorgehensweisen sind größtenteils den wirksameren Phosphoramidit- und H-Phosphonat-Vorgehensweisen für eine Synthese gewichen. Beaucage und Caruthers, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862 (1981) beschreiben die Verwendung von Desoxynukleosidphosphoramiditen für eine Polynukleotidsynthese. Agrawal und Zamecnik, US-PS 5,149,798 (1992) beschreiben eine optimierte Synthese von Oligonukleotiden durch den H-Phosphonat-Ansatz.
Beide dieser modernen Ansätze wurden für eine Synthese von Oligonukleotiden mit einer Vielzahl von modifizierten Internukleotidbindungen verwendet. Agrawal und Goodchild, Tetrahedron Lett. 28: 3539–3542 (1987) beschreiben eine Synthese von Oligonukleotid-Methylphosphonaten unter Verwendung von Phosphoramiditchemie. Connolly et al., Biochemistry 23: 3443 (1984) beschreiben eine Synthese von Oligonukleotid-Phosphorothioaten unter Verwendung von Phosphoramiditchemie. Jager et al., Biochemistry 27: 7237 (1988) beschreiben eine Synthese von Oligonukleotid-Phosphoramidaten unter Verwendung von Phosphoramiditchemie. Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079–7083 (1988) beschreiben eine Synthese von Oligonukleotid-Phosphoramidaten und -Phosphorothioaten unter Verwendung von H-Phosphonatchemie.
In jüngerer Zeit haben mehrere Forscher die Möglichkeit der Verwendung von Oligonukleotiden als immunstimulierende Mittel bei immuntherapeutischen Anwendungen gezeigt. Die Feststellung, dass Phosphodiester- und Phosphorothioat-Oligonukleotide eine Immunstimulierung induzieren können, warf Interesse hinsichtlich einer Entwicklung dieser Nebenwirkung als ein therapeutisches Werkzeug auf. Diese Bestrebungen fokussierten sich auf Phosphorothioat-Oligonukleotide mit dem Dinukleotid CpG.
Kuramoto et al., Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128–1131 (1992) beschreiben, dass Phosphodiester-Oligonukleotide mit einem Palindrom, das ein CpG-Dinukleotid enthält, eine Synthese von Interferon-alpha und -gamma induzieren kann und natürliche Killeraktivität verstärken kann. Krieg et al., Nature 371: 546–549 (1995) beschreiben, dass Phosphorothioat-CpG-enthaltende Oligonukleotide immunstimulierend sind. Liang et al., J. Clin. Invest. 98: 1119–1129 (1996) beschreiben, dass solche Oligonukleotide humane B-Zellen aktivieren.
Pisetsky, D. S. und Reich, C. F., Life Sci. 54: 101 (1994) beschreiben, dass die immunstimulierende Aktivität von CpG-Oligos weiter durch das Vorliegen eines Phosphorothioat (PS)-Rückgrats in diesen Oligos verstärkt wird. Tokunaga, T.; Yamamoto, T.; Yamamoto, S., Jap. J. Infect. Dis. 52: 1 (1999) beschreiben, dass die immunstimulierende Aktivität von CpG-Oligos von der Position eines CpG-Motivs und den Sequenzen, die das CpG-Motiv flankieren, abhängig ist. Der Mechanismus einer Aktivierung der Immunstimulierung durch CpG-Oligos ist nicht vollständig bekannt. Yamamoto, T.; Yamamoto, S.; Kataoka, T.; Tokunaga, T., Microbiol. Immunol. 38: 831 (1994) deuten jedoch die Möglichkeit an, dass CpG-Oligos eine Immunkaskade durch Bindung an ein bisher noch nicht charakterisiertes intrazelluläres Rezeptor/Protein-Molekül anschalten.
Mehrere Forscher fanden heraus, dass dies letztendlich Stresskinase-Wege, eine Aktivierung von NF-κB und eine Induzierung verschiedener Cytokine wie IL-6, IL-12, γ-IFN und TNF-α auslöst (vgl. z. B. Klinman, D. M.; Yi, A. K.; Beaucage, S. L.; Conover, J.; Krieg, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2879 (1996); Sparwasser, T.; Miethke, T.; Lipford, G. B.; Erdmann, A.; Haecker, H.; Heeg, K.; Wagner, H., Eur. J. Immunol. 27: 1671 (1997); Lipford, G. B.; Sparwasser, T.; Bauer, M.; Zimmermann, S.; Koch, E. S.; Heeg, K.; Wagner, H., Eur. J. Immunol. 27: 3420 (1997); Sparwasser, T.; Koch, E. S.; Vabulas, R. M.; Lipford, G. B.; Heeg, K.; Ellart, J. W.; Wagner, H., Eur. J. Immunol. 28: 2045 (1998) und Zhao, Q.; Temsamani, J.; Zhou, R. Z.; Agrawal, S., Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495 (1997)).
Die Verwendung von CpG-PS-Oligos als antitumorale, antivirale, antibakterielle und entzündungshemmende Mittel und als Adjuvanzien in einer Immuntherapie wurde beschrieben (vgl. z. B. Dunford, P. J.; Mulqueen, M. J.; Agrawal, S., Antisense 97: Targeting the Molecular Basis of Disease, (Nature Biotechnology) Konferenz-Zusammenfassung, 1997, Seite 40; Agrawal, S.; Kandimalla, E. R., Mol. Med. Today 6: 72 (2000); Chu, R. S.; Targoni, O. S.; Krieg, A. M.; Lehmann, P. V.; Harding, C. V., J. Exp. Med. 186: 1623 (1997); Zimmermann, S.; Egeter, O.; Hausmann, S.; Lipford, G. B.; Rocken, M.; Wagner, H.; Heeg, K., J. Immunol. 160: 3627 (1998)). Moldoveanu et al., Vaccine 16: 1216–124 (1998) beschreiben, dass CpG-enthaltende Phosphorothioat-Oligonukleotide eine Immunantwort gegen Influenzavirus verstärken. McCluskie und Davis, J. Immunol. 161: 4463–4466 (1998) beschreiben, dass CpG-enthaltende Oligonukleotide als wirksame Adjuvanzien fungieren, die eine Immunreaktion gegen das Oberflächenantigen von Hepatitis B verstärken.
Zhao, Q.; Temsamani, J.; Idarola, P.; Jiang, Z.; Agrawal, S., Biochem. Pharmacol. 51: 173 (1996) beschreiben, dass ein Austausch von Desoxynukleosiden in einem CpG-Motiv durch 2'-O-Methylribonukleoside die immunstimulierende Aktivität unterdrückt, was nahe legt, dass eine durch eine 2'-O-Methyl-Modifizierung induzierte steife C3'-Endo-Konformation keine richtige Erkennung und/oder Wechselwirkung eines CpG-Motivs mit den Proteinen ermöglicht, die an dem immunstimulierenden Weg beteiligt sind. Diese Literaturstelle beschreibt ferner, dass ein Austauscher einer Methylgruppe für ein unverbrücktes Sauerstoffatom an der Phosphatgruppe zwischen C und G eines CpG-Motivs eine immunstimulierende Aktivität supprimiert, was nahe legt, dass die negative Ladung an der Phosphatgruppe für eine Proteinerkennung und -Wechselwirkung von Nöten ist.
Zhao, Q.; Yu, D.; Agrawal, S., Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3453 (1999) beschreiben, dass eine Substitution von einem oder zwei 2'-Desoxynukleosiden, die zu dem CpG-Motiv benachbart sind, durch 2'- oder 3'-O-Methylribonukleoside auf der 5'-Seite eine Verringerung der immunstimulierenden Aktivität hervorruft, während die gleichen Substitutionen eine nicht-signifikante Wirkung aufweisen, wenn sie auf die 3'-Seite des CpG-Motivs gesetzt wurden. Jedoch beschreiben Zhao, Q.; Yu, D.; Agrawal, S., Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051 (2000), dass die Substitution eines Desoxynukleosids, das zwei oder drei Nukleoside von dem CpG-Motiv entfernt liegt, auf der 5'-Seite durch ein oder zwei 2'-O-Methoxyethyl- oder 2'- oder 3'-O-Methylribonukleoside zu einer signifikanten Zunahme der immunstimulierenden Aktivität führt. Agrawal, S.; Zhao, Q., Current Opinion in Chemical Biology 2(4), 519–528 (1998) beschreiben chemisch modifizierte Oligonukleotide, die ein CG-Dinukleotid enthalten.
Die genauen strukturellen Erfordernisse und spezifischen funktionellen Gruppen eines CpG-Motivs, die für die Erkennung eines Protein/Rezeptor-Faktors notwendig sind, der für eine Immunstimulierung verantwortlich ist, wurden bisher nicht im Detail untersucht. Es gibt daher einen Bedarf für neue immunstimulierende Motive, die eine verbesserte immunstimulierende Aktivität bereitstellen können.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft eine Verstärkung der durch immunstimulierende Oligonukleotidverbindungen verursachten Immunreaktion. Die Erfindung ermöglicht eine Erhöhung der immunstimulierenden Wirkung für immuntherapeutische Anwendungen.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass eine positionelle Modifizierung von immunstimulierenden Oligonukleotiden deren immunstimulierende Fähigkeiten dramatisch beeinflusst.
In einem ersten Aspekt wird erfindungsgemäß eine immunstimulierende Oligonukleotidverbindung bereitgestellt, die ein immunstimulierendes Dinukleotid der Formel C*pG umfasst, worin C* ein Cytidinanalogon der Formel (I):
ist, worin D ein Wasserstoffbindungsdonor ist, D' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Wasserstoffbindungsdonor, Wasserstoffbindungsakzeptor, hydrophiler Gruppe, hydrophober Gruppe, elektronenziehender Gruppe und elektronenspendender Gruppe, A ein Wasserstoffbindungsakzeptor oder eine hydrophile Gruppe ist, X ein Kohlenstoff- oder Stickstoffatom ist und S ein Pentose- oder Hexosezuckerring ist,
wobei das Cytidinanalogon der Formel (I) eine nicht natürlicherweise auftretende Cytosinbase umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5-Hydroxycytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, N4-Alkylcytosin und 4-Thiouracil, oder Arabinose als nicht natürlicherweise auftretende Zuckergruppe umfasst,
und worin G Guanosin, 2'-Desoxyguanosin oder ein Guanosinanalogon ist und p eine Internukleotidbindung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphodiester, Phosphorothioat und Phosphorodithioat.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung ist die nicht natürlicherweise auftretende Cytosinbase ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 5-Hydroxycytosin und N4-Ethylcytosin. In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung ist das Cytidinanalogon Aracytosin.
In manchen Ausführungsformen umfasst die erfindungsgemäße immunstimulierende Oligonukleotidverbindung eine 3'-3'-Bindung.
In einem zweiten Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Erzeugung einer Immunreaktion bei einem Patienten bereitgestellt.
In einer Ausführungsform dient die erfindungsgemäß hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung einer Verabreichung der immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung in Verbindung mit einem Antibiotikum, einem Antigen, einem Allergen, einer Vakzine, einem Antikörper, einem cytotoxischen Mittel, einem Antisense-Oligonukleotid, einem Gentherapievektor, einer DNA-Vakzine, einem Adjuvanz oder einer Kombination davon. In einer Ausführungsform ist die immunstimulierende Oligonukleotidverbindung mit einem Antigen oder Vakzin konjugiert, wobei eine solche Konjugation vorzugsweise an dem 3'-Ende der Oligonukleotidverbindung vorliegt.
In einem dritten Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine therapeutische Behandlung eines Patienten mit einer durch ein Pathogen erzeugten Erkrankung bereitgestellt. Vorzugsweise ist das Pathogen ein Virus, ein Parasit oder ein Bakterium.
In einem vierten Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung eines Krebspatienten bereitgestellt. In manchen Ausführungsformen dient die erfindungsgemäß hergestellte pharmazeutische Zusammensetzung einer Verabreichung der immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum.
In einem fünften Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung einer Autoimmunerkrankung bereitgestellt. In einer Ausführungsform ist die Autoimmunerkrankung Autoimmunasthma.
In einem sechsten Aspekt wird erfindungsgemäß die Verwendung einer erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung von Atemwegsentzündung oder Allergie bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 1',2'-Didesoxyribose-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
2 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 1',2'-Didesoxyribose-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
3 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung verschiedener Oligonukleotide mit 1',2'-Didesoxyribose-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
4 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung verschiedener Oligonukleotide mit 1',2'-Didesoxyribose-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
5 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit C3-Linker-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
6 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit C3-Linker-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
7 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Spacer 9- oder Spacer 18-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
8 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Spacer 9- oder Spacer 18-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
9 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Aminolinker-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
10 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Aminolinker-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
11 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 3'-Desoxynukleosid-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
12 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 3'-Desoxynukleosid-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
13 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Methylphosphonat-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
14 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit Methylphosphonat-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
15 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 2'-O-Methylribonukleosid- oder 2'-O-Methoxyethyl-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
16 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 2'-O-Methylribonukleosid- oder 2'-O-Methoxyethyl-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
17 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 5'-3'-, 5'-5'- oder 3'-3'-Bindung-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
18 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit β-L-Desoxynukleotid-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
19 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit 2'-O-Propargyl-Substitutionen an verschiedenen Positionen.
20 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit verschiedenen Substitutionen an verschiedenen Positionen.
21 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer 7-Deazaguanin-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
22 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer 6-Thioguanin-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
23 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer 5-Hydroxycytosin- oder N4-Ethylcytosin-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
24 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer 5-Hydroxycytosin- oder N4-Ethylcytosin-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
25 zeigt Ergebnisse von Proliferationstests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer Arabinofuranosylcytosin (Aracytidin; Ara-C)-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
26 zeigt Ergebnisse von Milzgewicht-Tests unter Verwendung von Oligonukleotiden mit einer 4-Thiouracil-Substitution in dem immunstimulierenden Dinukleotid.
27 zeigt die chemische Struktur eines CpG-Motivs, wobei funktionelle Gruppen an dem Cytosin gezeigt sind, die als Wasserstoffbindungsakzeptor- und Wasserstoffbindungsdonorgruppen dienen.
28 zeigt die chemischen Strukturen von Cytosin (1) und Cytosinanaloga (2–7). In den Nukleosiden Cytidin, Desoxycytidin und verwandten Analoga ist der Substituent R Ribose oder 2'-Desoxyribose.
GENAUE BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft Oligonukleotide und Oligonukleotidanaloga als immunstimulierende Mittel für immuntherapeutische Anwendungen. Die hier genannten Patente und Veröffentlichungen geben das Maß an Wissen in dem Fachgebiet wieder. Für den Fall, dass ein Widerspruch zwischen der Lehre einer jeglichen hier genannten Literaturstelle und der Beschreibung besteht, soll das letztere für die erfindungsgemäßen Zwecke gelten.
Die Erfindung betrifft eine Verstärkung der Immunreaktion, die durch immunstimulierende Oligonukleotidverbindungen verursacht wird, für immuntherapeutische Anwendungen. Somit werden erfindungsgemäß Oligonukleotidverbindungen mit einem optimalen Maß an immunstimulierender Wirkung für eine Immuntherapie und die Verwendung solcher Oligonukleotidverbindungen bereitgestellt.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass positionelle chemische Modifikationen, die in immunstimulierende Oligonukleotide eingebracht werden, dramatisch deren immunstimulierende Fähigkeiten beeinflussen.
Für alle erfindungsgemäßen Aspekte umfasst der Begriff "Oligonukleotid" Polymere aus zwei oder mehreren Desoxyribonukleosiden oder einem jeglichen modifizierten Nukleosid, einschließlich 2'- oder 3'-substituierter Nukleoside, 2'- oder 3'-O-substituierter Ribonukleoside, Deazanukleoside oder einer jeglichen Kombination davon. Solche Monomere können miteinander durch eine jegliche der zahlreichen bekannten Internukleosidbindungen gekoppelt werden. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen können diese Internukleosidbindungen Phosphodiester-, Phosphotriester-, Phosphorothioat-, Phosphorodithioat- oder Phosphoramidatbindungen sein, einschließlich 3'-5'-, 2'-5'-, 3'-3'- und 5'-5'-Bindungen einer jeglichen der vorstehenden Bindungen, oder Kombinationen davon. Der Begriff Oligonukleotid umfasst auch Polymere mit chemisch modifizierten Basen oder Zuckern und/oder mit weiteren Substituenten, einschließlich in nicht begrenzender Weise lipophiler Gruppen, interkalierender Mittel, Diamine und Adamantan. Der Begriff Oligonukleotid umfasst auch Peptidnukleinsäuren (PNA), Peptidnukleinsäuren mit Phosphatgruppen (PHONA), locked-Nukleinsäuren (LNA), Morpholinonukleinsäuren und Oligonukleotide, die Nicht-Pentose-Zucker (z. B. Hexose)- oder abasische Zucker-Rückgrate oder Rückgratabschnitte umfassen, sowie Oligonukleotide, die Rückgratabschnitte mit Nicht-Zucker-Linker- oder Spacer-Gruppen umfassen, wie nachstehend weiter beschrieben.
Erfindungsgemäß betreffen die Begriffe "2'-substituiert" und "3'-substituiert" (jeweils) eine Substitution der 2'-(oder 3'-)Position der Pentosegruppe mit einem Halogen (vorzugsweise Cl, Br oder F) oder einer -O-Niederalkylgruppe mit 1–6 gesättig ten oder ungesättigten Kohlenstoffatomen oder mit einer -O-Aryl- oder -Allylgruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen, wobei eine solche Alkyl-, Aryl- oder Allylgruppe nicht-substituiert oder beispielsweise durch Halogen-, Hydroxy-, Trifluormethyl-, Cyan-, Nitro-, Acyl-, Acyloxy-, Alkoxy-, Carboxyl-, Carbalkoxy- oder Aminogruppen substituiert sein kann. Eine solche 2'-Substitution kann auch durch eine Hydroxygruppe (um ein Ribonukleosid zu erzeugen) oder eine Aminogruppe, jedoch nicht durch eine 2'-(oder 3'-)-H-Gruppe erfolgen.
Erfindungsgemäß betrifft der Begriff "immunstimulierende Oligonukleotidverbindung" eine Verbindung, die ein immunstimulierendes Dinukleotid umfasst, ohne das die Verbindung keine immunstimulierende Wirkung aufweisen würde. Ein "immunstimulierendes Dinukleotid" ist ein Dinukleotid der Formel 5'-Pyrimidin-Purin-3', worin "Pyrimidin" ein natürlicherweise auftretendes oder nicht-natürlicherweise auftretendes Pyrimidinnukleosid ist und "Purin" ein natürlicherweise auftretendes oder nicht-natürlicherweise auftretendes Purinnukleosid ist. Ein solches immunstimulierendes Dinukleotid ist CpG. Die Begriffe "CpG" und "CpG-Dinukleotid" betreffen das Dinukleotid 5'-Desoxycytidin-Desoxyguanosin-3', worin p eine Internukleotidbindung ist, die vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphodiester-, Phosphorothioat- und Phosphorodithioatbindungen.
Erfindungsgemäß ist ein "Dinukleotidanalogon" ein vorstehend beschriebenes immunstimulierendes Dinukleotid, worin eines oder beide der Pyrimidin- und Purin-Nukleoside ein nicht-natürlicherweise auftretendes Nukleosid ist/sind. Ein "nicht-natürlicherweise auftretendes" Nukleosid ist ein Nukleosid, das eine nicht-natürlicherweise auftretende Base und/oder eine nicht-natürlicherweise auftretende Zuckergruppe enthält. Erfindungsgemäß wird eine Base als nicht-natürlicherweise auftretend betrachtet, falls sie nicht aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Thymin, Guanin, Cytosin, Adenin und Uracil. Die Begriffe "C*pG" und "CpG*" betreffen immunstimulierende Dinukleotidanaloga, die ein Cytidinanalogon (nicht-natürlicherweise auftretendes Pyrimidinnukleosid) oder ein Guanosinanalogon (nicht-natürlicherweise auftretendes Purinnukleosid) umfassen.
27 zeigt die chemische Struktur eines CpG-Motivs, wobei die funktionellen Gruppen an dem Cytosin gezeigt sind, die als Wasserstoffbindungsakzeptor- und Wasserstoffbindungsdonorgruppen dienen. Cytosin weist zwei Wasserstoffbindungsakzeptorgruppen an den Positionen 2 (Keto-Sauerstoff) und 3 (Stickstoff) und eine Wasserstoffbindungsdonorgruppe an der 4-Position (Aminogruppe) auf. Diese Gruppen können als mögliche erkennende und wechselwirkende Gruppen im Zusammenhang mit Rezeptoren dienen, die für eine Immunstimulation verantwortlich sind. 28 zeigt Cytosinanaloga, die die gleiche Struktur wie natürlicherweise auftretendes Cytosin aufweisen, einschließlich 5-Methyldesoxycytosin (2), 5-Methyldesoxyisocytosin (3), 5-Hydroxydesoxycytosin (4), Desoxyuridin (5), N4-Ethyldesoxycytosin (6) und Desoxy-P-Base (7).
Das in der erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung vorliegende immunstimulierende Dinukleotid umfasst ein Pyrimidinnukleosid der Struktur (I):
worin D ein Wasserstoffbindungsdonor ist, D ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Wasserstoffbindungsdonor, Wasserstoffbindungsakzeptor, hydrophiler Gruppe, hydrophober Gruppe, elektronenziehender Gruppe und elektronenspendender Gruppe, A ein Wasserstoffbindungsakzeptor oder eine hydrophile Gruppe ist, X ein Kohlenstoff- oder Stickstoffatom ist und S ein Pentose- oder Hexosezuckerring ist, der mit der Pyrimidinbase verbunden ist, wobei die Basengruppe in (I) eine nicht natürlicherweise auftretende Pyrimidinbase ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5-Hydroxycytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, N4-Alkylcytosin, vorzugsweise N4-Ethylcytosin, und 4-Thiouracil, oder worin die Zuckergruppe S in (I) Arabinose als nicht-natürlicherweise auftretende Zuckergruppe ist. Erfindungsgemäß ist eine "natürlicherweise auftretende Zuckergruppe" Ribose oder 2'-Desoxyribose und eine "nicht-natürlicherweise auftretende Zuckergruppe" ist ein jeglicher Zucker außer Ribose oder 2'-Desoxyribose, der in dem Rückgrat für ein Oligonukleotid verwendet werden kann. Arabinose und Arabinosederivate sind Beispiele für bevorzugte nicht-natürlicherweise auftretende Zuckergruppen.
Die Erfinder haben festgestellt, dass Verbindungen mit zwei Oligonukleotideinheiten, die mittels einer 3'-5'- oder 3'-3'-Bindung angefügt sind, eine stärkere immunstimulierende Aktivität aufweisen als Verbindungen, bei denen die zwei Oligonukleotideinheiten mittels einer 5'-5'-Bindung angefügt sind. In manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst daher das erfindungsgemäße immunstimulierende Oligonukleotid eine 3'-3'-Bindung. In manchen solchen Ausführungsformen weisen die Oligonukleotide ein oder zwei zugängliche 5'-Enden auf.
Die erfindungsgemäßen immunstimulierenden Oligonukleotidverbindungen sind für die Erzeugung einer Immunreaktion in einem Patienten verwendbar.
Gemäß dieses erfindungsgemäßen Aspekts erfolgt eine Verabreichung von Verbindungen vorzugsweise parenteral, oral, sublingual, transdermal, topisch, intranasal, intratracheal, intravaginal oder intrarektal. Eine Verabreichung der therapeutischen Zusammensetzungen kann unter Verwendung bekannter Verfahren bei Dosen und für Zeitspannen erfolgen, die wirksam sind, um Symptome oder Surrogatmarker der Erkrankung zu verringern. Bei einer systemischen Verabreichung wird die therapeutische Zusammensetzung vorzugsweise bei einer Dosis verabreicht, die ausreicht, um einen Blutspiegel des Oligonukleotids von etwa 0,001 Mikromolar bis etwa 10 Mikromolar zu erreichen. Für eine lokale Verabreichung können viel geringere Konzentrationen wirksam sein und viel höhere Konzentrationen können toleriert werden. Vorzugsweise wird eine Gesamtdosis des Oligonukleotids etwa 0,1 mg Oligonukleotid pro Patient pro Tag bis etwa 40 mg Oligonukleotid pro kg Körpergewicht pro Tag betragen. Es kann erstrebenswert sein, eine therapeutisch wirksame Menge einer oder mehrerer therapeutischer Zusammensetzungen an ein Individuum als eine einzelne Behandlungsepisode gleichzeitig oder aufeinander folgend zu verabreichen. In manchen Fällen können Dosen, die unterhalb der vorstehend beschriebenen Bereiche liegen, immer noch wirksam sein. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgen nach Verabreichung der Zusammensetzung ein oder mehrere Messungen von biologischen Wirkungen, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Komplementaktivierung, Mitogenese und Hemmung der Thrombin-Gerinnselbildung.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden erfindungsgemäße Verbindungen zusammen mit Antibiotika, Antigenen, Allergenen, Vakzinen, Antikörpern, cytotoxischen Mitteln, Antisense-Oligonukleotiden, Gentherapievektoren, DNA-Vakzinen und/oder Adjuvanzien verabreicht, um die Spezifität oder das Ausmaß der Immunreaktion zu verstärken. Die Verbindung oder die Vakzine oder beides kann gegebenenfalls mit einem immunogenen Protein wie Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke, Choleratoxin B-Untereinheit oder einem jeglichen anderen immunogenen Trägerprotein verbunden werden. Ein jegliches der Vielzahl an Adjuvanzien kann verwendet werden, einschließlich in nicht begrenzender Weise Freund'sches vollständiges Adjuvanz, Monophosphoryl-Lipid A (MPL), Saponine, einschließlich QS-21, Alaun und Kombinationen davon. In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen werden durch eine Verabreichung von immunstimulierenden Oligonukleotidverbindungen Cytokine induziert. In bestimmten Ausführungsformen werden die immunstimulierenden Oligonukleotidverbindungen an ein Antigen, Hapten oder an eine Vakzine konjugiert. Wie vorstehend beschrieben haben die Erfinder festgestellt, dass ein zugängliches 5'-Ende für die Aktivität bestimmter immunstimulierender Oligonukleotidverbindungen wichtig ist. Dementsprechend wird für eine optimale immunstimulierende Aktivität das Oligonukleotid vorzugsweise an ein Antigen oder eine Vakzine mittels des 3'-Endes der Oligonukleotidverbindung konjugiert.
Bezüglich dieses Aspekts bedeutet "zusammen mit" in dem Verlauf einer Behandlung der gleichen Erkrankung bei dem gleichen Patienten und umfasst eine Verabreichung des Oligonukleotids und/oder der Vakzine und/oder des Adjuvanz in einer jeglichen Reihenfolge, einschließlich einer gleichzeitigen Verabreichung, sowie einer Verabreichung in einer zeitlich beabstandeten Reihenfolge, wobei die Verabreichung in einem zeitlichen Abstand von bis zu mehreren Tagen erfolgen kann. Eine solche Kombinationsbehandlung kann auch mehr als eine einzelne Verabreichung des Oligonukleotids und/oder unabhängig der Vakzine und/oder unabhängig des Adjuvanz umfassen. Die Verabreichung des Oligonukleotids und/oder der Vakzine und/oder des Adjuvanz kann auf dem gleichen oder auf verschiedenen Wegen erfolgen.
Die nachstehenden Beispiele sollen bestimmte bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen weiter veranschaulichen, sind jedoch nicht begrenzend für den Schutzumfang der Erfindung zu verstehen. Diejenigen Beispiele, die nicht durch den Gegenstand der Patentansprüche abgedeckt sind, werden lediglich für Vergleichszwecke beschrieben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Synthese von Oligonukleotiden mit immunmodulierenden Gruppen
Oligonukleotide wurden in einem Maßstab von 1 Mikromolar unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegeräts (Expedite 8909, PerSeptive Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Standard-Desoxynukleosid-Phosphoramidite wurden von PerSeptive Biosystems bezogen. 1',2'-Didesoxyribosephosphoramidit-, Propyl-1-phosphoramidit-2'-desoxy-5-nitroindolribofuranosylphosphoramidit-, 2'-Desoxyuridinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-P-phosphoramidit-, 2'-Desoxy-2-aminopurinphosphoramidit-, 2'-Desoxynebularinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-7-deazaguanosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-4-thiouridinphosphoramidit-, 2'-Desoxyisoguanosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-5-methylisocytosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-4-thiothymidinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-K-phosphoramidit-, 2'-Desoxy-2-aminoadenosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-N4-ethylcytosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-6-thioguanosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-7-deazaxanthosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-8-bromguanosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-8-oxoguanosinphosphoramidit-, 2'-Desoxy-5-hydroxycytosinphosphoramidit-, Arabinocytosinphosphoramidit- und 2'-Desoxy-5-propincytosinphosphoramidit-Verbindungen wurden von Glen Research (Sterling, VA) bezogen. 2'-Desoxyinosinphosphoramidit-Verbindungen wurden von ChemGenes (Ashland, MA) bezogen.
Normale Kopplungszyklen oder ein durch den Phosphoramidit-Hersteller empfohlener Kopplungszyklus wurden für alle Phosphoramidite verwendet. Beaucage-Reagenz wurde als Oxidationsmittel verwendet, um Phosphorothioat-Modifikation zu erhalten. Nach einer Synthese wurden die Oligonukleotide durch Inkubation von CpG-gebundenen Oligonukleotiden in konzentrierter Ammoniumhydroxidlösung für 1,5 bis 2 Stunden bei Raumtemperatur und darauf folgende Inkubation des Ammoniumhydroxid-Überstands für 12 Stunden bei 55°C oder wie durch den Phosphoramidit-Hersteller empfohlen entschützt. Die Ammoniumhydroxid-Lösung wurde zur Trockne in einer Speed-Vac verdampft und 5'-DMTr-Oligonukleotide mittels HPLC auf einer C18-Reverse-Phase-Matrix unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems von 0,1 M Ammoniumacetat und eines 1:5-Verhältnisses von 0,1 M Ammoniumacetat in Acetonitril aufgereinigt. Die Oligonukleotide wurden sodann mit 80% Essigsäure behandelt, um die DMTr-Gruppe zu entfernen, in die Natriumform umgewandelt und mittels Dialyse gegen zweifach destilliertes Wasser entsalzt. Oligonukleotide wurden durch 0,4 μ-Filter filtriert, lyophilisiert und erneut in zweifach destilliertem Wasser gelöst. Eine Charakterisierung wurde durch denaturierende PAGE und MALDI-TOF-Massenspektrometrie erreicht.
Beispiel 2: Synthese von CpG-PS-Oligos mit Cytosinanaloga
Unter Befolgung der in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden die nachstehenden Oligonukleotide synthetisiert:

^a CpG-Motiv ist in Fettdruck gezeigt. C* steht für 5-Hydroxycytosin (Oligos 2 und 3) oder N4-Ethylcytosin (Oligos 4 und 5).

Die Oligonukleotide wurden durch CGE und MALDI-TOF-Massenspektrometrie (Brucker Proflex III MALDI-TOF-Massenspektrometer mit 337 nm N2-Laser) charakterisiert. Die für jedes Oligonukleotid festgestellten und berechneten (in Klammern gezeigt) Molekulargewichte waren wie folgt: Oligo 1, 5704 (5704,8); Oligo 2, 5720 (5720,8); Oligo 3, 5681 (5680,7); Oligo 4, 5733 (5733); Oligo 5, 5694 (5693).
Beispiel 3: Analyse von Milzgewichten in behandelten Mäusen
Weibliche BALB/c-Mäuse (4–5 Wochen, 19–21 g, Charles River, Wilmington, MA) wurden in dieser Untersuchung verwendet. Die Tiere wurden mit käuflich verfügbarer Nahrung und Wasser nach Belieben gefüttert. Den Tieren wurde intraperitoneal eine Dosis der immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung als Lösung in sterilem PBS von 5 oder 10 mg/kg injiziert. Eine Gruppe an Mäusen erhielt nur PBS und diente als Kontrollgruppe (PBS). Vier Tiere wurden für jede immunstimulierende Oligonukleotidverbindung verwendet. Die Mäuse wurden 72 Stunden später getötet, die Milz entnommen und gewogen.
Beispiel 4: Analyse von immunstimulierenden Oligonukleotidverbindungen in einem Mäuse-Lymphozyten-Proliferationstest
Die Milz aus CD-1-, BALB/c-, C57BL/6-Mäusen (4–8 Wochen) wurde als Lymphozytenquelle verwendet. Einzelzellsuspensionen wurden durch vorsichtiges Zerkleinern mit den gefrosteten Enden von G1as-Objektträgern hergestellt. Zellen wurden sodann in RPMI-Vollmedium [RPMI-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) (Hitze-inaktiviert bei 56°C für 30 Minuten), 50 μM 2-Mercaptoethanol, 100 U/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin] kultiviert. Die Zellen wurden sodann in 96 Loch-Schalen bei einer Dichte von 10⁶ Zellen pro Milliliter in einem Endvolumen von 100 μl ausgebracht. Immunstimulierende Oligonukleotidverbindungen oder LPS (Lipopolysaccharid) wurden zu der Zellkultur in 10 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA) gegeben. Die Zellen wurden sodann bei 37°C kultiviert. Nach 44 Stunden wurde 1 μCi ³H-Uridin (Amersham, Arlington Heights, IL) zu der Kultur in 20 μl RPMI-Medium gegeben und die Zellen weitere 4 Stunden impulsmarkiert. Die Zellen wurden durch einen automatischen Zellernter (Skatron, Sterling, VA) geerntet und die Filter wurden durch einen Szintillationszähler ausgezählt. Die Experimente erfolgten dreifach.
Beispiel 5: Lymphozyten-Proliferationsaktivität von CpG-PS-Oligos mit Cytosinanaloga
Die immunstimulierende Aktivität von CpG-PS-Oligos 1–5 (Beispiel 2) wurde unter Verwendung eines BALG/c-Mäuse-Lymphozyten-Proliferationstests untersucht. Zusammengefasst wurden Mäuse-Milzzellen kultiviert und mit CpG-PS-Oligos bei 0,1 0,3, 1,0 und 3,0 μg/ml 48 Stunden inkubiert und die Zellproliferation durch Einbau von ³H-Uridin gemessen.
23 zeigt die Dosis-abhängige zellproliferierende Aktivität der Oligos 1–5 in Mäuse-Lymphozyten-Kulturen. Bei einer Dosis von 3,0 μg/ml zeigte Oligo 1 mit einem natürlichen Cytidin einen Proliferationsindex von 29,5 ± 2,1. Oligo 2, bei dem die Cytosinbase des Desoxycytidins in dem CpG-Motiv durch ein 5-Hydroxycytosin ersetzt ist, zeigte auch eine Dosis-abhängige Lymphozytenproliferation. Ein Proliferationsindex von 23,7 ± 2,9 bei einer Dosis von 3,0 μg/ml wurde für Oligo 2 festgestellt. PS-Oligo 4, das N4-Ethylcytosin anstelle der Cytosinbase in dem CpG-Motiv enthielt, zeigte auch eine Dosis-abhängige zellproliferierende Aktivität. Der Proliferationsindex von 18,7 ± 1,6, der für Oligo 4 bei einer Dosis von 3 μg/ml festgestellt wurde, legt nahe, dass das Vorliegen einer raumgreifenden hydrophoben Substitution an der 4-Aminogruppe des Cytosins in einem CpG-Motiv leicht die immunstimulierende Aktivität hemmt.
Oligo 3, bei dem sich ein 5-Hydroxydesoxycytidin an der Desoxyguanosinposition anstelle der Desoxycytidinposition in dem CpG-Motiv befand, zeigte einen Proliferationsindex, der ähnlich zu dem war, der für Mediumkontrolle festgestellt wurde (23). In ähnlicher Weise zeigte das Kontroll-Oligo 5, bei dem das Desoxyguano sin in dem CpG-Motiv durch N4-Ethyldesoxycytidin substituiert war, eine Zellproliferation ähnlich zu der der Medium-Kontrolle.
Weitere Oligos, bei denen die Cytosinbase in dem CpG-Motiv durch 5-Methyldesoxycytosin (2; vgl. 28), 5-Methyldesoxyisocytosin (3), Desoxyuridin (5) oder Desoxy-P-Base (7) ersetzt war, zeigten keine oder eine nicht-signifikante Zellproliferationsaktivität in dem gleichen Testsystem. Diese Ergebnisse legen nahe, dass (i) Zellproliferationsaktivität aufrecht erhalten bleibt, wenn die Cytosinbase des CpG-Motivs durch 5-Hydroxycytosin oder N4-Ethylcytosin (Oligos 2 und 4) ersetzt ist, jedoch (ii) eine Substitution der Guaninbase mit diesen Cytosinanaloga zu einem Verlust der Zellproliferationsaktivität führt.
Beispiel 6: Splenomegalie bei Mäusen, induziert durch CpG-PS-Oligos mit Cytosinanaloga
Um die in vitro-Wirkungen von CpG-PS-Oligos zu bestätigen, wurden Oligos 1, 2 und 4 (aus Beispiel 2) intraperitoneal (ip) in BALB/c-Mäuse bei einer Dosis von 10 mg/kg injiziert und die Veränderung des Milzgewichts als ein Anzeichen des Ausmaßes der immunstimulierenden Aktivität eines jeden PS-Oligos gemessen. Die Veränderung des Milzgewichts als ein Ergebnis einer Behandlung mit CpG-PS-Oligos ist in 24 gezeigt. Weibliche BALB/c-Mäuse (4–6 Wochen, 19–21 g) wurden in unterschiedliche Gruppen mit jeweils vier Mäusen pro Gruppe aufgeteilt. Oligonukleotide wurden in sterilem PBS gelöst und intraperitoneal an die Mäuse bei einer Dosis von 10 mg/kg verabreicht. Nach 72 Stunden wurden die Mäuse getötet und die Milz entnommen und abgewogen. Jeder Kreis stellt das Milzgewicht für eine einzelne Maus dar und das + stellt das mittlere Milzgewicht für jede Gruppe dar.
Oligo 1, das ein natürliches Desoxycytidin in dem CpG-Motiv aufweist, zeigte eine Zunahme des Milzgewichts bei einer Dosis von 10 mg/kg von ungefähr 45% im Vergleich zu der Kontrollgruppe von Mäusen, die PBS erhielt. Oligo 2, das ein 5-Hydroxycytosin anstelle der Cytosinbase in dem CpG-Motiv aufweist, zeigte eine Zunahme des Milzgewichts von etwa 35% bei der gleichen Dosis. Oligo 4, das ein N4-Ethylcytosin anstelle der Cytosinbase in dem CpG-Motiv aufweist, zeigte eine Zunahme des Milzgewichts bei der gleichen Dosis von etwa 34% im Vergleich zu der Kontrollgruppe. Diese Daten bestätigen die Ergebnisse, die in den Lymphozyten-Proliferationstests festgestellt wurden, für diese Oligos mit modifizierten Cytidinanaloga anstelle des Desoxycytidins in dem CpG-Motiv.
Beispiel 7: Struktur-Aktivität-Beziehungen von C*pG-PS-Oligos
Das Vorliegen einer Methylgruppe in der 5-Position von Cytosin (5-Methyldesoxycytosin, 2 (28)) in einem CpG-Motiv beseitigt vollständig CpG-bezogene immunstimulierende Wirkungen von CpG-PS-Oligos. Basierend auf den in den in vitro- und in vivo-Experimenten festgestellten Ergebnissen erstellten wir Struktur-Aktivität-Beziehungen für die PS-Oligos mit Cytosinanaloga.
Der Austausch der Cytosinbase (1) in dem CpG-Motiv durch 5-Methylisocytosin (3) führte zu einem vollständigen Verlust der immunstimulierenden Aktivität wie es bei 5-Methylcytosin (2) der Fall ist. Dies könnte ein Ergebnis einer Veränderung der Keto- und Aminogruppen an den 2- bzw. 4-Positionen und/oder eines Einfügens einer hydrophoben Methylgruppe an der 5-Position von Cytosin sein.
Oligo 2 mit einer hydrophilen Hydroxysubstitution an der 5-Position des Cytosins in dem CpG-Motiv zeigte eine immunstimulierende Aktivität, die ähnlich zu der von Oligo 1 war, das die natürlicherweise auftretende Cytosinbase enthält. Diese Feststellung legt nahe, dass raumgreifende hydrophile Gruppen besser als hydrophobe Gruppen an der 5-Position von Cytosin für eine immunstimulierende Aktivität von CpG-PS-Oligos toleriert werden. Möglicherweise ist die Bindetasche für die CpG-Oligos an dem Rezeptor hydrophil und kann keine hydrophobe Gruppe an der 5-Position von Cytosin aufnehmen.
Wenn die Cytosinbase in dem CpG-Motiv durch Uracil (5 (vgl. 28)), worin Ketogruppen sowohl an der 2-, als auch 4-Position vorhanden sind, ersetzt wurde, wurde keine immunstimulierende Aktivität festgestellt, was nahe legt, dass eine Aminogruppe als Wasserstoffbindungsdonor an der 4-Position von Cytosin für eine immunstimulierende Aktivität entscheidend ist. Wenn eine große hydrophobe Ethylgruppe auf die 4-Aminogruppe des Cytosins in einem CpG-Motiv gesetzt wird, wird eine verringerte Lymphozytenproliferation und eine leicht verringerte Zunahme des Milzgewichts bei Mäusen festgestellt, was nahe legt, dass eine raumgreifende Ethylgruppe an dieser Position nicht mit der Bindung des CpG-PS-Oligos an die Rezeptorfaktoren, die für eine immunstimulierende Aktivität verantwortlich sind, wechselwirkt. Trotz der Ethylsubstitution kann die 4-Aminogruppe von N4-Ethylcytosin (6) an einer Wasserstoffbindungsbildung mit einem Akzeptor teilhaben. Die modifizierte Pyrimidinbase dP, worin die Stickstoffgruppe an der 4-Position an einer Ringstrukturbildung mit der 5-Position beteiligt ist und die keine Aminogruppe als Wasserstoffbindungsdonor an der 4-Position aufweist, wies keine Mäuse-Lymphozyten-Proliferationsaktivität in Kulturen auf, was nahe legt, dass die 4-Aminogruppe von Cytosin in einem CpG-Motiv für eine immunstimulierende Aktivität entscheidend ist.
Zusammengefasst zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass die funktionellen Gruppen an den Positionen 2, 3 und 4 des Cytosins für eine CpG-bezogene immunstimulierende Aktivität wichtig sind. Eine hydrophobe Substitution an der 5-Position von Cytosin supprimiert vollständig eine immunstimulierende Aktivität eines CpG-Oligos, während eine hydrophile Gruppe an dieser Position gut toleriert wird. Des Weiteren kann die immunstimulierende Aktivität von CpG-PS-Oligos mit 5-Hydroxycytosin oder N4-Ethylcytosin anstelle von Cytosin in dem CpG-Motiv signifikant durch Einbau von geeigneten chemischen Modifikationen in der 5'-flankierenden Sequenz moduliert werden, was nahe legt, dass diese Cytosinanaloga in einem CpG-Motiv als Teil eines immunstimulierenden Motivs erkannt werden.
Beispiel 8: Synthese von Enden-blockierten CpG-PS-Oligonukleotiden
Die in 17 gezeigten CpG-PS-Oligos wurden unter Verwendung eines automatischen Synthesegeräts und des Phosphoramidit-Verfahrens synthetisiert. Oligo 1 (16mer) wurde unter Verwendung von Nukleosid-5'-β-cyanethylphosphoramiditen synthetisiert. Oligo 2, ein 32mer, wurde unter Verwendung von Nukleosid-3'-β-cyanethylphosphoramiditen und einem Träger aus kontrolliertem Porenglas (CpG-Festträger) mit einem 3'-gekoppelten Nukleosid, worin die 16mer-Sequenz von Oligo 1 zweifach wiederholt war, synthetisiert. Daher wies Oligo 2 zwei 16mere (Oligo 1) auf, die mittels einer normalen 3'-5'-Bindung miteinander verbunden waren. Oligo 3, ein 32mer, wurde mit zwei 16meren (Oligo 1), die durch eine 5'-5'-Bindung verbunden waren, synthetisiert. Somit wies Oligo 3 zwei 3'-Enden und kein 5'-Ende auf. Eine Synthese von Oligo 3 erfolgte in zwei Schritten: das erste 16mer wurde unter Verwendung von Nukleosid-3'-β-cyanethylphosphoramiditen und einem Festträger mit einem 3'-gekoppelten Nukleosid synthetisiert und eine Synthese des zweiten 16mer-Segments wurde sodann unter Verwendung von Nukleosid-5'-β-cyanethylphosphoramiditen fortgesetzt. Oligo 4, ein 32mer, umfasste zwei 16mere (Oligo 1), die durch eine 3'-3'-Bindung verbunden waren. Somit wies Oligo 4 zwei 5'-Enden und kein 3'-Ende auf. Eine Synthese von Oligo 4 erfolgte in zwei Schritten: das erste 16mer wurde unter Verwendung von Nukleosid-5'-β-cyanethylphosphor amiditen und einem Festträger mit einem 5'-gekoppelten Nukleosid synthetisiert und die Synthese des zweiten 16mer-Segments wurde unter Verwendung von Nukleosid-3'-β-cyanethylphosphoramiditen fortgesetzt. Eine Synthese der Oligos 5–8 erfolgte durch Verwendung der gleichen Nukleosid-β-cyanethylphosphoramidite wie sie für Oligos 1–4 verwendet wurden. Bei Abschluss der Synthese wurden Oligos 1–8 mit konzentrierter Ammoniaklösung entschützt, durch reverse Phase-HPLC aufgereinigt, detrityliert, entsalzt und dialysiert. Die Reinheit eines jeden PS-Oligos wurde durch CGE überprüft und das Molekulargewicht durch MALDI-TOF-massenspektrometrische Analyse bestätigt. Richtigkeit der Sequenz und Richtung des 5'-CpG-Motivs in den Oligos 1–8 wurden durch Aufzeichnung der Schmelztemperaturen (T_ms) der Duplexe mit ihren entsprechenden komplementären DNA-Strängen (5'-AAGGTCGAGCGTTCTC-3 für Oligos 1–4 und 5'-ATGGCGCACGCTGGGAGA-3' für Oligos 5–8) überprüft. Die T_ms dieser Duplexe betrugen 53,9 ± 0,9°C (Oligos 1–4), 61,8°C (Oligo 5) und 58,8 ± 0,6°C (Oligos 6–8) (Hinweis: Oligo 5 war ein 18mer und Oligos 6–8 waren 32mere, jedoch keine 36mere).
Beispiel 9: Mäusemilz-Lymphozyten-Proliferationsaktivität von Enden-blockierten CpG-PS-Oligonukleotiden
Die immunstimulierende Aktivität der Enden-blockierten CpG-PS-Oligos aus Beispiel 8 wurde anfänglich in einem Lymphozyten-Proliferationstest untersucht. Typischerweise wurden Milzlymphozyten aus Mäusen (Balb-C) mit CpG-PS-Oligos bei Konzentrationen von 0,1, 1,0 und 10,0 μg/ml für 48 Stunden kultiviert und die Zellproliferation durch Einbau von ³H-Uridin wie in Beispiel 3 beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt.
Oligo 1 induzierte eine Dosis-abhängige Wirkung auf die Zellproliferation. Bei einer Konzentration von 10 μg/ml (∼2,0 μM) betrug der Proliferationsindex 5,0 ± 0,32. Oligo 2, das aus zwei Einheiten von Oligo 1 bestand, die durch eine 3'-5'-Bindung verbunden waren, wies einen Proliferationsindex von 5,8 ± 0,28 bei der gleichen Dosis auf (∼1,0 μM). Oligo 3, das aus zwei Einheiten von Oligo 1 bestand, die durch eine 5'-5'-Bindung verbunden waren, wies einen Proliferationsindex von 2,0 ± 0,26 auf, was eine signifikant, niedrigere immunstimulierende Aktivität widerspiegelt als sie mit den Oligos 1 und 2 festgestellt wurde. Oligo 4, das aus zwei Einheiten von Oligo 1 bestand, die durch eine 3'-3'-Bindung verbunden waren, wies einen Proliferationsindex von 7,2 ± 0,5 auf, was eine größere immunstimulierende Aktivität widerspiegelt als sie mit den Oligos 1 und 2 festgestellt wurde.
Ähnliche Ergebnisse wurden mit den Oligos 5–8 erhalten. Oligo 5 wies einen Proliferationsindex von 3,9 ± 0,12 auf. Die Oligos 6–8, bei denen zwei Einheiten von Oligo 5 durch eine 3'-5'-Bindung (Oligo 6), 5'-5'-Bindung (Oligo 7) und 3'-3'-Bindung (Oligo 8) verbunden sind, wiesen Proliferationsindizes von 4,9 ± 0,2, 1,74 ± 0,21 bzw. 7,7 ± 0,82 auf. Ein Vergleich der Ergebnisse, die mit den Oligos 6–8 erhalten wurden, zeigt, dass Oligos 6 und 8, bei denen zwei Oligo 5-Sequenzen durch eine 3'-5'-Bindung oder eine 3'-3'-Bindung miteinander verbunden waren, eine größere immunstimulierende Aktivität aufwiesen, während Oligo 7, bei dem zwei Oligo 5 durch eine 5'-5'-Bindung miteinander verbunden waren, eine signifikant geringere immunstimulierende Wirkung als Oligo 5 aufwies.
Basierend auf den Lymphozyten-Proliferationsergebnissen der Oligos 1–8 wird deutlich, dass, wenn Oligos über ihre 5'-Enden miteinander verbunden sind, ein signifikanter Verlust an immunstimulierender Aktivität auftritt, während, wenn sie über ihre 3'-Enden miteinander verbunden sind, eine Zunahme der immunstimulierenden Aktivität auftritt. Es ist wichtig anzumerken, dass 3'-3'-verbundene Oligos eine wesentlich höhere Stabilität gegenüber einem Abbau durch Exonukleasen aufwiesen als Oligos, die ein freies 3'-Ende enthielten, was auch in einer erhöhten immunstimulierenden Aktivität resultieren könnte. Die geringere immunstimulierende Aktivität der Oligos 3 und 7, in denen das 5'-Ende der Oligos blockiert ist, legt nahe, dass die Zugänglichkeit zu dem 5'-Ende eines Oligos wesentlich für die immunstimulierende Aktivität von CpG-PS-Oligos ist.
Beispiel 10: Splenomegalie in Mäusen, induziert durch Enden-blockierte CpG-PS-Oligonukleotide
Um die immunstimulierende Aktivität der Oligos 1–8 (Beispiel 8) in vivo zu bestätigen, wurde eine Dosis von 5 mg/kg an Oligonukleotiden intraperitoneal in Balb-C-Mäuse injiziert. Die Mäuse wurden 72 Stunden nach Verabreichung getötet, die Milz entfernt, trocken getupft und gewogen. Eine Veränderung des Milzgewichts bei behandelten und unbehandelten Mäusen wurde als ein Parameter für eine immunstimulierende Aktivität eingesetzt.
Eine Verabreichung einer Dosis von 5 mg/kg an Oligo 1 verursachte eine Zunahme des Milzgewichts von etwa 40% im Vergleich zu den Kontrollmäusen, die PBS erhielten. Eine Verabreichung der Oligos 2 und 4 verursachte ebenfalls eine Zunahme des Milzgewichts von etwa 50%. Eine Verabreichung von Oligo 3 verursachte keinen Unterschied hinsichtlich des Milzgewichts im Vergleich zu Kontrollmäusen. Diese Ergebnisse stützen weiterhin die Feststellung, dass Oligo 3, bei dem das 5'-Ende blockiert war, eine signifikant geringere immunstimulierende Aktivität als Oligos aufwies, bei denen das 5'-Ende zugänglich war. Diese Ergebnisse wurden auch bei der Verabreichung der Oligos 5–8 bestätigt. Eine Verabreichung der Oligos 5, 6 und 8 verursachte eine Zunahme des Milzgewichts von etwa 40–50%, während keine Veränderung des Milzgewichts nach Verabreichung von Oligo 7 festgestellt wurde.
Die vorstehenden Ergebnisse legen nahe, dass die immunstimulierende Aktivität von PS-Oligos mit einem CpG-Motiv signifikant minimiert wird, wenn das 5'-Ende des Oligos nicht zugänglich ist. Dieser Verlust an immunstimulierender Aktivität der Oligos 3 und 7 kann nicht durch Nuklease-Stabilität erklärt werden, da beide Oligos zwei 3'-Enden aufweisen und gegenüber einem 3'-Exonukleaseabbau nicht mehr zugänglich sind als die Oligos 1, 2, 5 und 6, die ein 3'-Ende aufweisen. Die PS-Oligos 4 und 8, bei denen die 3'-Enden blockiert sind und die sehr stabil gegenüber einem Abbau durch Exonukleasen sind, zeigten ähnliche immunstimulierende Aktivität. Die Oligos 4 und 8 könnten eine anhaltende immunstimulierende Aktivität aufgrund ihrer erhöhten in vivo-Stabilität aufweisen, was in der vorliegenden Untersuchung nicht ersichtlich ist, da die Mäuse lediglich 72 Stunden nach Verabreichung getötet wurden. Es erfolgen Untersuchungen, bei denen Mäuse zu Zeitpunkten von mehr als 72 Stunden nach Verabreichung getötet werden.
Die hier beschriebenen Ergebnisse sind verblüffend und legen nahe, dass das 5'-Ende von CpG-PS-Oligos für eine immunstimulierende Aktivität von entscheidender Bedeutung ist. Wie hierin erörtert, haben wir gezeigt, dass eine Substitution von Desoxynukleosiden in 5'-flankierenden Regionen durch modifizierte 2'- oder 3'-substituierte Ribonukleotide zu einer erhöhten immunstimulierenden Aktivität führte. Des Weiteren verursachte eine Substitution von Desoxynukleosiden unmittelbar stromaufwärts (5'-Ende) zu dem CpG-Motiv eine signifikante Suppression und eine Substitution von Desoxynukleosiden unmittelbar stromabwärts (3'-Ende) zu dem CpG-Motiv wies keine Wirkung auf die immunstimulierende Aktivität auf. Zusammengefasst legen diese Ergebnisse nahe, dass die Enzym/Rezeptor-Verbindung, die für die Immunstimulierung verantwortlich ist, das CpG-Motiv in Oligonukleotiden ausgehend von dem 5'-Ende erkennt und eine Zugänglichkeit gegenüber dem 5'-Ende erforderlich macht.
Obwohl die vorstehende Erfindung zu einem gewissen Grad detailliert für die Zwecke der Klarheit und des Verständnisses beschrieben wurde, wird der Fachmann beim Lesen dieser Offenbarung erkennen, dass verschiedene Änderungen hinsichtlich der Form und der Details durchgeführt werden können, ohne von dem eigentlichen Schutzumfang der Erfindung und der beigefügten Ansprüche abzuweichen. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Immunstimulierende Oligonukleotidverbindung, die ein immunstimulierendes Dinukleotid der Formel C*pG umfasst, worin C* ein Cytidinanalogon der Formel (I) :
ist, worin D ein Wasserstoffbindungsdonor ist, D' ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoffatom, Wasserstoffbindungsdonor, Wasserstoffbindungsakzeptor, hydrophiler Gruppe, hydrophober Gruppe, elektronenziehender Gruppe und elektronenspendender Gruppe, A ein Wasserstoffbindungsakzeptor oder eine hydrophile Gruppe ist, X ein Kohlenstoff- oder Stickstoffatom ist und S ein Pentose- oder Hexosezuckerring ist, wobei das Cytidinanalogon der Formel (I) eine nicht natürlicherweise auftretende Cytosinbase umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5-Hydroxycytosin, 5-Hydroxymethylcytosin, N4-Alkylcytosin und 4-Thiouracil, oder Arabinose als nicht natürlicherweise auftretende Zuckergruppe umfasst, und worin G Guanosin, 2'-Desoxyguanosin oder ein Guanosinanalogon ist und p eine Internukleotidbipdung ist, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Phosphodiester, Phosphorothioat und Phosphorodithioat.
Immunstimulierende Oligonukleotidverbindung nach Anspruch 1, wobei die nicht natürlicherweise auftretende Cytosinbase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus 5-Hydroxycytosin und N4-Ethylcytosin.
Immunstimulierende Oligonukleotidverbindung nach Anspruch 1, wobei das Cytidinanalogon Aracytosin ist.
Immunstimulierende Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–3, die eine 3'-3'-Bindung umfasst.
Verwendung einer immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Erzeugung einer Immunreaktion bei einem Patienten.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einer Verabreichung der immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung in Verbindung mit einem Antibiotikum, einem Antigen, einem Allergen, einer Vakzine, einem Antikörper, einem cytotoxischen Mittel, einem Antisense-Oligonukleotid, einem Gentherapievektor, einer DNA-Vakzine, einem Adjuvanz oder einer Kombination davon dient.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die immunstimulierende Oligonukleotidverbindung mit einem Antigen oder Vakzin konjugiert ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei eine solche Konjugation an dem 3'-Ende der Oligonukleotidverbindung vorliegt.
Verwendung einer immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine therapeutische Behandlung eines Patienten mit einer durch ein Pathogen erzeugten Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Pathogen ein Virus, ein Parasit oder ein Bakterium ist.
Verwendung einer immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung eines Krebspatienten.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung einer Verabreichung der immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung in Verbindung mit einem Chemotherapeutikum dient.
Verwendung einer immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung einer Autoimmunerkrankung.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Autoimmunerkrankung Autoimmunasthma ist.
Verwendung einer immunstimulierenden Oligonukleotidverbindung nach einem der Ansprüche 1–4 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung für eine Behandlung von Atemwegsentzündung oder Allergie.