KR20030061812A - 화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법 - Google Patents

화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역치료법에 있어서 면역자극제로서 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유사체의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드 화합물에 의해 야기된 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다.

Description

화학적인 위치 변화에 의해 면역자극 올리고누클레오티드 유사체의 면역자극 활성을 조절하는 방법{MODULATION OF IMMUNOSTIMULATORY ACTIVITY OF IMMUNOSTIMULATORY OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS BY POSITIONAL CHEMICAL CHANGES}
올리고누클레오티드는 현대 분자생물학에서 필수적인 도구가 되었고, PCR을 위한 진단학적 프로빙 방법에서부터 유전자 발현의 안티센스 억제 및 면역치료법에 이르기까지 매우 다양한 기술에 사용되고 있다. 올리고누클레오티드의 이렇게 광범한 용도로 인해 올리고누클레오티드를 합성하기 위한 신속하고, 저렴하고, 효율적인 방법에 대한 필요성이 증가되었다.
안티센스 및 진단학적 적용을 위한 올리고누클레오티드의 합성은 현재 일상적으로 수행될 수 있다[참조: Methods in Molecular Biology, Vol 20: Protocols for Oligonucleotides and Analogs pp. 165-189 (S. Agrawal, Ed., Humana Press, 1993); Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., 1991); and Uhlmann and Peyman, supra. Agrawal and Iyer, Curr. Op. in Biotech. 6: 12 (1995); and Antisense Research and Applications (Crookeand Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993]. 초기 합성 방법은 포스포디에스테르 및 포스포트리에스테르 화학을 포함하였다. 코라나(Khorana) 등의 문헌[참조: J. Molec. Biol. 72: 209 (1972)]에는 올리고누클레오티드 합성을 위한 포스포디에스테르 화학이 기재되어 있다. 리스(Reese)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 34: 3143-3179 (1978)]에는 올리고누클레오티드 및 폴리누클레오티드의 합성을 위한 포스포트리에스테르 화학이 기재되어 있다. 이러한 초기 방법들은 합성을 위해 더욱 효율적인 포스포라미디트 및 H-포스포네이트 접근법을 위한 방법을 제공하였다. 뷰케이지(Beaucage) 및 카루터스(Caruthers)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862 (1981)]에는 폴리누클레오티드 합성에서 데옥시누클레오시드 포스포라미디트의 용도가 기재되어 있다. 아그로월(Agrawal) 및 자메크닉(Zamecnik)의 미국 특허 제 5,149,798호(1992)에는 H-포스포네이트 방법에 의한 올리고누클레오티드의 최적화된 합성법이 기재되어 있다.
이러한 현대적 방법 둘 모두는 다양하게 변경된 누클레오티드간 결합을 갖는 올리고누클레오티드를 합성하기 위해 사용되었다. 아그로월(Agrawal) 및 굿차일드(Goodchild)의 문헌[참조: Tetrahedron Lett. 28: 3539-3542 (1987)]은 포스포라미디트 화학을 사용하는 올리고누클레오티드 메틸포스포네이트의 합성을 교시한다. 콘놀리(Connolly) 등의 문헌[참조: Biochemistry 23: 3443 (1984)]에는 포스포라미디트 화학을 사용하는 올리고누클레오티드 포스포로티오에이트의 합성이 기재되어 있다. 자거(Jager) 등의 문헌[참조: Biochemistry 27: 7237 (1988)]에는 포스포라미디트 화학을 사용하는 올리고누클레오티드 포스포라미데이트의 합성이기재되어 있다. 아그로월(Agrawal) 등의 문헌[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083 (1988)]에는 H-포스포네이트 화학을 사용하는 올리고누클레오티드 포스포라미데이트 및 포스포로티오에이트의 합성이 기재되어 있다.
더욱 최근에, 몇몇 연구자들은 면역치료법에서 면역자극제로서 올리고누클레오티드의 사용의 유효성을 입증하였다. 포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 면역 자극을 유도할 수 있다는 관찰은 치료학적 도구로서 이러한 부작용을 개발하는 데에 관심을 갖게 하였다. 이러한 노력은 디누클레오티드 CpG를 함유하는 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드에 중점을 두었다.
쿠라모토(Kuramoto) 등의 문헌[참조: Jpn. J. Cancer Res. 83: 1128-1131 (1992)]은 CpG 디누클레오티드를 포함하는 팔린드롬을 함유하는 포스포디에스테르 올리고누클레오티드가 인터페론-알파 및 감마 합성을 유도하고 내츄럴 킬러 활성을 향상시킬 수 있음을 교시한다. 크리에그(Krieg) 등의 문헌[참조: Nature 371: 546-549 (1995)]에는 포스포로티오에이트 CpG-함유 올리고누클레오티드가 면역자극성임이 개시되어 있다. 리앙(Liang) 등의 문헌[참조: J. Clin. Invest. 98: 1119-1129 (1996)]에는 이러한 올리고누클레오티드가 사람 B 세포를 활성화시킴이 개시되어 있다.
피세츠스키, 디. 에스.(Pisetsky, D. S.); 리치 씨. 에프.(Rich C. F.)의 문헌[참조: Life Sci. 54: 101 (1994)]은 CpG-올리고의 면역자극 활성이 이들 올리고상의 포스포로티오에이트(PS) 골격의 존재에 의해 추가로 향상된다고 교시하고 있다. 토쿠나가, 티.(Tokunaga, T.); 야마모토, 티.(Yamamoto, T.); 야마모토, 에스.(Yamamoto, S.)의 문헌[참조: Jap. J. Infect. Dis. 52:1 (1999)]은 CpG-올리고의 면역자극 활성이 CpG-모티프 및 CpG-모티프를 플랭킹하는 서열의 위치에 의존한다고 교시하였다. CpG-올리고에 의한 면역 자극의 활성화 메카니즘은 잘 이해되지 않았다. 그러나, 야마모토, 티.(Yamamoto, T.); 야마모토, 에스(Yamamoto, S.); 카타오카, 티.(Kataoka, T.); 토쿠나가, 티.(Tokunaga, T.)는 문헌[참조: Microbiol. Immunol. 38:831 (1994)]에서 CpG-올리고가 아직 특징화되지 않은 세포내 수용체/단백질에 결합함으로써 면역 캐스케이드를 자극한다고 제안하였다.
몇몇 연구자들은 이것이 궁극적으로 키나제 경로, NF-κB의 활성화 및 IL-6, IL-12, γ-IFN 및 TNF-α와 같은 여러 사이토카인의 유도를 자극함을 알아내었다[참조: Klinman, D. M.; Yi, A. K.; Beaucage, S. L.; Conover, J.; Krieg, A. M., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:2879 (1996); Sparwasser, T.; Miethke, T.; Lipford, G. B.; Erdmann, A.; Haecker, H.; Heeg, K.; Wagner, H., Eur. J. Immunol. 27: 1671 (1997); Lipford, G. B.; Sparwasser, T.; Bauer, M.; Zimmermann, S.; Koch, E. S.; Heeg, K.; Wagner, H. Eur. J., Immunol. 27: 3420 (1997); Sparwasser, T.; Koch, E. S.; Vabulas, R. M.; Lipford, G. B.; Heeg, K.; Ellart, J. W.; Wagner, H., Eur. J. Immunol. 28: 2045 (1998); and Zhao, Q.; Temsamani, J.; Zhou, R. Z.; Agrawal, S. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7: 495 (1997)].
면역치료에서 항종양제, 항바이러스제, 항균제, 항염증제 및 애쥬번트로서 CpG-PS-올리고의 용도는 보고되었다[참조: Dunford, P. J.; Mulqueen, M. J.;Agrawal, S. Antisense 97: Targeting the Molecular Basis of Disease, (Nature Biotechnology) Conference abstract, 1997, pp 40; Agrawal, S.; Kandimalla E. R. Mol. Med. Today 6: 72 (2000); Chu. R. S.; Targoni, O. S.; Krieg, A. M.; Lehmann, P. V.; Harding, C. V. J. Exp. Med. 186:1623 (1997); Zimmermann, S.; Egeter, O.; Hausmann, S.; Lipford, G. B.; Rocken, M.; Wagner, H.; Heeg, K. J. Immunol. 160: 3627 (1998)]. 몰도배누(Moldoveanu) 등의 문헌[참조: Vaccine 16: 1216-124 (1998)]은 CpG-함유 포스포로티오에이트 올리고누클레오티드가 인플루엔자 바이러스에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시하고 있다. 맥클러스키(McCluskie) 및 데이비스(Davis)의 문헌[참조: J. Immunol. 161: 4463-4466 (1998)]은 CpG-함유 올리고누클레오티드가 강력한 애쥬번트로서 작용하여 B형 간염 바이러스의 표면 항원에 대한 면역 반응을 향상시킨다고 교시하고 있다.
자오, 큐.(Zhao, Q.); 템사마니, 제이.(Temsamani, J.); 이다롤라, 피.(Idarola, P.); 지앙, 제트(Jiang, Z.); 아그로월, 에스(Agrawal, S.)의 문헌[참조: Biochem. Pharmacol. 51: 173 (1996)]은 CpG-모티프에서 데옥시누클레오시드의 2'-O-메틸리보누클레오시드의 치환이 면역자극 활성을 억제함을 교시하였고, 이는 2'-O-메틸 변경에 의한 견고한 C3'-엔도 입체형태가 CpG-모티프와 면역자극 경로에 관여하는 단백질의 적합한 인식 및/또는 상호작용을 허용하지 않음을 시사한다. 이 참고문헌은 CpG-모티프의 C와 G 사이의 인산기상에 브릿지를 형성하지 않은 산소를 메틸기로 치환시키는 것은 면역 자극 활성을 억제시킴을 추가로 교시하였고, 이는 인산기상의 음전하가 단백질 인식 및 상호작용을 위해 필수적임을 시사한다.
자오, 큐.(Zhao, Q.); 유, 디.(Yu, D.); 아그로월, 에스.(Agrawal, S.)의 문헌[참조: Bioorg. Med. Chem. Lett. 9: 3453 (1999)]은 CpG-모티프에 인접한 1개 또는 2개의 2'-데옥시누클레오시드를 5'-측상에서 2'- 또는 3'-O-메틸리보누클레오시드로 치환시키는 것이 면역자극 활성의 감소를 초래하는 반면, 동일한 치환은 이들이 CpG-모티프의 3'-측에 위치되는 경우, 무의미한 효과를 가짐을 교시하고 있다. 그러나, 자오, 큐.(Zhao, Q.); 유, 디.(Yu, D.); 아그로월, 에스.(Agrawal, S.)의 문헌[참조: Bioorg. Med. Chem. Lett. 10: 1051 (2000)]은 5'-측의 CpG-모티프로부터 2 또는 3개의 누클레오시드 만큼 떨어진 데옥시누클레오시드를 1개 또는 2개의 2'-O-메톡시에틸- 또는 2'- 또는 3'-O-메틸리보누클레오시드로 치환시키는 것이 면역자극 활성의 현저한 증가를 초래함을 교시하고 있다.
면역 자극을 담당하는 단백질/수용체 인자의 인식을 위해 필요한 CpG-모티프의 상세한 구조적 요건 및 특정한 작용기들은 아직 상세히 연구되지 않았다. 따라서, 향상된 면역자극 활성을 제공할 수 있는 새로운 면역자극 모티프가 필요하다.
본 발명은 면역치료법에 있어서 면역자극제로서의 올리고누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 유사체의 치료학적 용도에 관한 것이다.
발명의 요약
본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드 화합물에 의해 야기되는 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 방법은 면역치료법을 위한 면역자극 효과를 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 올리고누클레오티드 화합물을 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명의 발명자들은 놀랍게도 면역자극 올리고누클레오티드의 위치 변경이 이들의 면역자극 능력에 극적인 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 특히, 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인에서의 변경은 재현성있고 예측가능한 방식으로 면역자극 효과를 향상시킨다.
첫번째 일면에서, 본 발명은 면역자극 도메인 및, 임의로, 하나 이상의 증강 도메인을 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 제공한다. 일부 구체예에서, 면역자극 도메인은 비천연 피리미딘 염기를 포함하는 디누클레오티드 유사체를 포함한다. 일부 구체예에서, 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인은 하기 기술하는 바와 같이, 특정 위치에 면역자극 부분을 포함한다. 일부 구체예에서, 면역자극 올리고누클레오티드는 3'-3' 결합을 포함한다. 하나의 구체예에서, 이러한 3'-3' 결합된 올리고누클레오티드는 2개의 접근하기 쉬운 5'-말단을 갖는다.
두번째 일면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 면역자극 효과를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 비천연 피리미딘 염기를 포함하는 디누클레오티드 유사체를 면역자극 도메인내에 도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 하기 기술하는 바와 같이, 특정 위치에 면역자극 부분을 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3'-3' 결합을 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함한다.
세번째 일면에서, 본 발명은 환자에게 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
네번째 일면에서, 본 발명은 병원체에 의해 야기된 질병에 걸린 환자를 치료학적으로 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다섯번째 일면에서, 본 발명은 암환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
여섯번째 일면에서, 본 발명은 자가면역 천식과 같은 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 본 발명의 세번째 일면에 기술한 바와 같이 수행된다.
일곱번째 일면에서, 본 발명은 기도 염증 또는 알레르기를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 본 발명의 세번째 일면에 기술한 바와 같이 수행된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 여러 위치에 1',2'-디데옥시리보오스 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 2는 여러 위치에 1',2'-디데옥시리보오스 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 3은 여러 위치에 1',2'-디데옥시리보오스 치환체를 갖는 상이한 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 4는 여러 위치에 1',2'-디데옥시리보오스 치환체를 갖는 상이한 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 5는 여러 위치에 C3-링커 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 6은 여러 위치에 C3-링커 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 7은 여러 위치에 스페이서 9 또는 스페이서 18 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 8은 여러 위치에 스페이서 9 또는 스페이서 18 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 9는 여러 위치에 아미노-링커 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 10은 여러 위치에 아미노-링커 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 여러 위치에 3'-데옥시누클레오시드 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 12는 여러 위치에 3'-데옥시누클레오시드 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 13은 여러 위치에 메틸포스포네이트 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 14는 여러 위치에 메틸포스포네이트 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 15는 여러 위치에 2'-O-메틸리보누클레오시드 또는 2'-O-메톡시에틸 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 16은 여러 위치에 2'-O-메틸리보누클레오시드 또는 2'-O-메톡시에틸 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 17은 여러 위치에 5'-3', 5'-5' 또는 3'-3' 결합 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 18은 여러 위치에 β-L-데옥시누클레오티드 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 19는 여러 위치에 2'-O-프로파르길 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 20은 여러 위치에 다양한 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 21은 면역자극 디누클레오티드내에 7-데아자구아닌 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 22는 면역자극 디누클레오티드내에 6-티오구아닌 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 23은 면역자극 디누클레오티드내에 5-하이드록시시토신 또는 N4-에틸시토신 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 24는 면역자극 디누클레오티드내에 5-하이드록시시토신 또는 N4-에틸시토신 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 25는 면역자극 디누클레오티드내에 아라비노푸라노실시토신(아라시티딘; Ara-C) 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 증식 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 26은 면역자극 디누클레오티드내에 4-티오우라실 치환체를 갖는 올리고누클레오티드를 사용하는 비장 중량 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 27은 수소 결합 수용체 및 수소 결합 공여체 기로 작용하는 시토신상의 작용기를 보여주는, CpG-모티프의 화학구조식을 도시한 것이다.
도 28은 시토신(1) 및 시토신 유사체(2-7)의 화학구조식을 도시한 것이다. 누클레오시드 시티딘, 데옥시시티딘 및 관련 유사체에서, 치환체 R은 리보오스 또는 2'-데옥시리보오스이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 면역치료법을 위한 면역자극제로서의 올리고누클레오티드 및 올리고누클레오티드 유사체의 치료학적 용도에 관한 것이다. 본원에 인용된 특허 및간행물은 당분야에서의 지식 수준을 반영하며 그 전체를 본원에 참조로 삽입하였다. 본원에 인용된 임의의 참고문헌의 교시와 본 명세서의 내용이 상충되는 경우에는 본 발명의 목적을 위해 후자에 따른다.
본 발명은 면역치료법을 위한 면역자극 올리고누클레오티드 화합물에 의해 야기된 면역 반응을 향상시키는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 면역치료를 위한 면역자극 효과의 최적 레벨을 갖는 화합물 및 이러한 올리고누클레오티드 화합물을 제조하고 사용하는 방법을 추가로 제공한다.
본 발명자들은 놀랍게도 면역자극 올리고누클레오티드내에 도입된 화학적인 위치 변경이 이들의 면역자극 능력에 극적인 영향을 미친다는 것을 발견하였다. 특히, 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인에서의 변경은 요망되는 적용을 위한 재현성있는 방식으로 면역자극 효과를 향상시킬 수 있다.
첫번째 일면에서, 본 발명은 면역자극 도메인 및, 임의로, 하나 이상의 증강 도메인을 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 제공한다. 바람직한 특정 구체예에서, 면역자극 도메인은 비천연 피리미딘 누클레오티드를 포함하는 디누클레오티드 유사체를 포함한다.
본 발명의 모든 일면의 목적을 위해, 용어 "올리고누클레오티드"는 2개 이상의 데옥시리보누클레오시드의 중합체, 또는 2'- 또는 3'-치환된 누클레오시드, 2'- 또는 3'-O-치환된 리보누클레오시드, 데아자누클레오시드를 포함하는 임의의 변경된 누클레오시드, 또는 이들의 임의의 조합물을 포함한다. 이러한 단량체들은 임의의 수많은 공지된 누클레오시드간 결합에 의해 서로 커플링될 수 있다. 바람직한 특정 구체예에서, 이들 누클레오시드간 결합은 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 포스포라미데이트(앞서 언급한 것들의 3'-5', 2'-5', 3'-3' 및 5'-5' 결합을 포함), 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한 용어 올리고누클레오티드는 화학적으로 변경된 염기 또는 당을 갖고/갖거나 친지성 기, 인터컬레이팅제(intercalating agent), 디아민 및 아다만탄을 포함하지만 이에 제한되지 않는 추가적인 치환체를 갖는 중합체를 포함한다. 또한 용어 올리고누클레오티드는 펩티드 핵산(PNA), 인산기를 가진 펩티드 핵산(PHONA), 록킹된 핵산(LNA), 모폴리노핵산, 및 비-5탄당(예컨대, 6탄당) 또는 염기가 없는(abasic) 당 골격 또는 골격 섹션을 포함하는 올리고누클레오티드 뿐만 아니라 이후 추가로 기술하는 바와 같이, 비-당 링커 또는 스페이서 기를 갖는 골격 섹션을 포함하는 올리고누클레오티드를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해 용어 "2'-치환된" 및 "3'-치환된"은 (각각) 할로겐(바람직하게는 Cl, Br 또는 F) 또는 1 내지 6개의 포화되거나 포화되지 않은 탄소 원자를 함유하는 -O-저급 알킬기를 갖거나 2 내지 6개의 탄소 원자를 가진 -O-아릴 또는 알릴기를 갖는 5탄당 부분의 2'(또는 3') 위치의 치환을 의미하며, 여기서 이러한 알킬, 아릴 또는 알릴기는 예컨대, 할로, 하이드록시, 트리플루오로메틸, 시아노, 니트로, 아실, 아실옥시, 알콕시, 카르복실, 카르브알콕시 또는 아미노기로 치환되거나 치환되지 않을 수 있거나; 이러한 2' 치환은 하이드록시기(리보누클레오시드를 생성하기 위해) 또는 아미노기로 치환될 수 있지만, 2'(또는 3') H 기로는 치환되지 않는다.
본 발명의 목적을 위해, 용어 "면역자극 올리고누클레오티드 화합물"은 면역자극 디누클레오티드를 포함하는 화합물을 의미하며, 이것 없이는 화합물은 면역자극 효과를 가지지 않는다. "면역자극 디누클레오티드"는 화학식 5'-피리미딘-퓨린-3'을 갖는 디누클레오티드이며, 여기서 "피리미딘"은 천연 또는 비천연 피리미딘 누클레오시드이고 "퓨린"은 천연 또는 비천연 퓨린 누클레오시드이다. 하나의 이러한 면역자극 디누클레오티드는 CpG이다. 용어 "CpG" 및 "CpG 디누클레오티드"는 디누클레오티드 5'-데옥시시티딘-데옥시구아노신-3'을 칭하며, 여기서 p는 누클레오티드간 결합이고, 바람직하게는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 목적을 위해, "디누클레오티드 유사체"는 상기 기술한 바와 같이 면역자극 디누클레오티드이며, 여기서 피리미딘 및 퓨린 누클레오시드 중 어느 하나 또는 둘 모두는 비천연 누클레오시드이다. "비천연" 누클레오시드는 비천연 염기 및/또는 비천연 당 부분을 포함하는 누클레오시드이다. 본 발명의 목적을 위해, 염기는 티민, 구아닌, 시토신, 아데닌 및 우라실로 구성된 군으로부터 선택되지 않는 경우 비천연 염기인 것으로 생각된다. 용어 "C*pG" 및 "CpG*"는 각각 시티딘 유사체(비천연 피리미딘 누클레오시드) 또는 구아노신 유사체(비천연 퓨린 누클레오시드)를 포함하는 면역자극 디누클레오티드 유사체를 칭한다.
도 27은 CpG-모티프의 화학구조식을 도시한 것이며, 수소 결합 수용체 및 수소 결합 공여체 기로서 작용하는 시토신상의 작용기들을 보여준다. 시토신은 위치 2(케토-산소) 및 3(질소)에 2개의 수소 결합 수용체 기를 가지며, 4-위치(아미노기)에 수소 결합 공여체 기를 갖는다. 이들 기는 면역 자극을 담당하는 수용체를 잠재적으로 인식하고 이와 상호작용하는 기로서 작용할 수 있다. 도 28은 5-메틸-데옥시시토신(2), 5-메틸-데옥시이소시토신(3), 5-하이드록시-데옥시시토신(4), 데옥시우리딘(5), N4-에틸-데옥시시토신(6) 및 데옥시-P-염기(7)를 포함하는, 천연 시토신과 등구조(isostructure)인 시토신 유사체를 도시한 것이다.
따라서 하나의 구체예에서, 면역자극 디누클레오티드는 구조식 (I)의 피리미딘 누클레오시드를 포함한다:
(I)
상기 식에서, D는 수소 결합 공여체이고, D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자끄는 기 및 전자주는 기로 구성된 군으로부터 선택되고, A는 수소 결합 수용체이고, X는 탄소 또는 질소이고, S는 피리미딘 염기에 결합된 5탄당 또는 6탄당 고리이다. 일부 구체예에서, 피리미딘 누클레오시드는 비천연 피리미딘 누클레오시드이다. 즉, 구조식 (I)의 화합물은 시티딘 또는 데옥시시티딘이 아니다.
일부 구체예에서, (I)의 염기 부분은 비천연 피리미딘 염기이다. 바람직한 비천연 피리미딘 염기의 예에는 5-하이드록시시토신, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신, 바람직하게는 N4-에틸시토신 및 4-티오우라실이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구체예에서, (I)의 당 부분 S는 비천연 당 부분이다. 본 발명의 목적을 위해, "천연 당 부분"은 리보오스 또는 2'-데옥시리보오스이고, "비천연 당 부분"은 올리고누클레오티드를 위한 골격에 사용될 수 있는 리보오스 또는 2'-데옥시리보오스 이외의 임의의 당이다. 아라비노오스 및 아라비노오스 유도체는 바람직한 비천연 당 부분의 예이다.
본 발명에 따른 면역자극 도메인은 면역자극 천연 디누클레오티드 또는 비천연 디누클레오티드 유사체의 한쪽 또는 양쪽에 면역자극 부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역자극 도메인은 하기 화학식으로 도시될 수 있다:
상기 식에서, Y는 시티딘 또는 비천연 피리미딘 누클레오시드 유사체를 나타내고, Z는 구아노신 또는 비천연 퓨린 누클레오시드 유사체를 나타내고, 각각의 X는 독립적으로 본 발명에 따른 누클레오시드 또는 면역자극 부분을 나타낸다. "면역자극 부분"은 면역자극 부분의 부재시 보다 더욱 면역자극성이 되는 면역자극 올리고누클레오티드를 야기시키는 면역자극 도메인 또는 증강 도메인내의 특정 위치에서의 화학 구조물이다.
바람직한 면역자극 부분은 메틸포스포네이트, 메틸포스포노티오에이트 포스포트리에스테르, 포스포티오트리에스테르 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 트리에스테르 전구약물, 설폰, 설폰아미드, 설파메이트, 포름아세탈, N-메틸하이드록실아민, 카르보네이트, 카르바메이트, 보라노포스포네이트, 포스포라미데이트, 특히 일차 아미노-포스포라미데이트, N3 포스포라미데이트 및 N5 포스포라미데이트 및 입체특이적 결합(예컨대, (R)- 또는 (S)-포스포로티오에이트, 알킬포스포네이트 또는 포스포트리에스테르 결합)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 포스페이트 골격에서의 변경을 포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 면역자극 부분은 2'-O-메틸리보오스, 2'-O-메톡시에틸리보오스, 2'-O-프로파르길리보오스 및 2'-데옥시-2'-플루오로리보오스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 2'-치환된 5탄당; 3'-O-메틸리보오스를 포함하지만 이에 제한되지 않는 3'-치환된 5탄당; 1',2'-디데옥시리보오스; 아라비노오스, 1'-메틸아라비노오스, 3'-하이드록시메틸아라비노오스, 4'-하이드록시메틸아라비노오스 및 2'-치환된 아라비노오스 당을 포함하지만 이에 제한되지 않는 6탄당; 및 알파-아모너를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극 부분은 펩티드 핵산(PNA), 인산기를 가진 펩티드 핵산(PHONA), 록킹된 핵산(LNA), 및 알킬 링커 또는 아미노 링커를 가진 골격 섹션을 갖는 올리고누클레오티드를 포함하는, 다른 탄수화물 골격 변경 및 치환을 갖는 올리고누클레오티드를 추가로 포함한다. 알킬 링커는 분지되거나 분지되지 않고, 치환되거나 치환되지 않은, 편광적으로(chirally) 순수한 혼합물 또는 라세미 혼합물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 이러한 알킬 링커는 약 2 내지 약 18개의 탄소 원자를 갖는다. 바람직한 일부 구체예에서, 이러한 알킬 링커는 약 3 내지 약 9개의 탄소 원자를 갖는다. 이러한 알킬 링커에는 폴리에틸렌글리콜 링커 [-O-CH2-CH2-]n(n = 2 내지 9)가 포함된다. 바람직한 일부 구체예에서, 이러한 알킬 링커는 펩티드 또는 아미노산을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극 부분은 β-L-데옥시누클레오시드 및 알파-데옥시누클레오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA 이소폼을 추가로포함한다. 본 발명에 따른 바람직한 면역자극 부분은 2'-5', 2'-2', 3'-3' 및 5'-5' 결합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 비천연 누클레오시드간 결합 위치를 갖는 누클레오시드를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 바람직한 면역자극 부분은 5-하이드록시데옥시시티딘, 5-하이드록시메틸데옥시시티딘, N4-알킬데옥시시티딘, 바람직하게는 N4-에틸데옥시시티딘, 4-티오우리딘, 6-티오데옥시구아노신, 7-데아자구아노신, 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하지만 이에 제한되지 않는 니트로피롤, C5-프로피닐피리미딘 및 디아미노퓨린의 데옥시리보누클레오시드를 포함하지만 이에 제한되지 않는 변경된 헤테로사이클릭 염기를 갖는 누클레오시드를 추가로 포함한다.
이에 제한되지는 않지만 특정한 예로서 앞서 기술한 면역자극 도메인
에서
위치 X3 또는 X4에서 누클레오시드 메틸포스포네이트는 면역자극 부분이고, 위치 X1에서 치환되거나 치환되지 않은 알킬 링커는 면역자극 부분이고, 위치 X1에서 β-L-데옥시누클레오시드는 면역자극 부분이다. 면역자극 도메인내의 면역자극 부분의 대표적인 위치 및 구조에 대해서는 하기 표 1을 참조하라.
표 1
위치 전형적인 면역자극 부분
X1 C3-알킬 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커(아미노 링커),β-L-데옥시누클레오시드
X2 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
X3 누클레오시드 메틸포스포네이트
X4 누클레오시드 메틸포스포네이트, 2'-O-메틸-리보누클레오시드
일부 구체예에서, 면역자극 올리고누클레오티드는 증강 도메인을 추가로 포함한다.
"증강 도메인"은 올리고누클레오티드가 증강 도메인의 부재시 보다 증강 도메인을 함유하는 경우에 더욱 면역자극성인 올리고누클레오티드가 되게 하는 면역자극 도메인 이외의 면역자극 올리고누클레오티드 유사체의 영역이다. 증강 도메인은 면역자극 도메인에 대해 업스트림 또는 다운스트림에 존재할 수 있다. 용어 "업스트림"은 면역자극 디누클레오티드 또는 디누클레오티드 유사체(Y-Z)의 5'측 위치를 말한다. 용어 "다운스트림"은 Y-Z의 3'측 위치를 말한다.
예를 들어, 면역자극 올리고누클레오티드 유사체는 하기 구조식을 가질 수 있다:
5'-U9-U8-U7-U6-U5-U4-U3-U2-U1-X1-X2-Y-Z-X3-X4-N-N-N-3'
상기 식에서, U9-U1은 업스트림 증강 도메인을 나타내고, 여기서 각각의 U는 독립적으로 동일하거나 상이한 누클레오시드 면역자극 부분을 나타내고, N은 임의의 누클레오시드를 나타내고, X1-X4, Y 및 Z는 이전과 같다.
또한, 면역자극 올리고누클레오티드 유사체는 하기 구조식을 가질 수 있다:
5'-N-N-X1-X2-Y-Z-X3-X4-D1-D2-D3-D4-D5-D6-D7-D8-3'
상기 식에서, D1-D8은 다운스트림 증강 도메인을 나타내고, 여기서 각각의 D는 독립적으로 동일하거나 상이한 누클레오시드 또는 면역자극 부분을 나타내고, 모든 다른 기호는 상기 정의한 바와 같다.
이러한 입체배치에서, U6의 면역자극 부분은 면역자극 디누클레오티드 또는 디누클레오티드 유사체로부터 6 위치 업스트림일 것이고 D4의 면역자극 부분은 면역자극 디누클레오티드 또는 디누클레오티드 유사체로부터 4 위치 다운스트림일 것이다. "누클레오시드" 보다 용어 "위치"가 사용되는데, 그 이유는 임의의 U 또는 D 위치가 누클레오시드 또는 누클레오시드 유사체일 수 있거나 아닐 수 있는 면역자극 부분을 나타낼 수 있기 때문이다. 물론, 올리고누클레오티드 유사체는 업스트림 및 다운스트림 증강 도메인 둘 모두를 갖도록 작제될 수 있다.
표 2는 업스트림 증강 도메인을 갖는 면역자극 올리고누클레오티드내에 면역자극 부분의 대표적인 위치 및 구조를 나타낸 것이다. 표 2 및 표 3에서 언급한 바와 같이 스페이서 9 및 스페이서 18의 정의에 대해서는 도 7을 참조하라.
표 2
위치 전형적인 면역자극 부분
X2 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커
X1 C3-링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, β-L-데옥시누클레오시드
U1 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 2'-O-메틸-리보누클레오시드
U2 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 18, 3'-데옥시누클레오시드, 누클레오시드 메틸포스포네이트, β-L-데옥시누클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보누클레오시드
U3 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 누클레오시드 메틸포스포네이트, 2'-5' 결합
U2 + U3 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, β-L-데옥시누클레오시드
U3 + U4 누클레오시드 메틸포스포네이트, 2'-O-메톡시에틸-리보누클레오시드
U5 + U6 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커
X1 + U3 1',2'-디데옥시리보오스
표 3은 다운스트림 증강 도메인을 갖는 면역자극 올리고누클레오티드내에 면역자극 부분의 대표적인 위치 및 구조를 보여준다.
표 3
위치 전형적인 면역자극 부분
X3 누클레오시드 메틸포스포네이트
X4 누클레오시드 메틸포스포네이트, 2'-O-메틸-리보누클레오시드
D1 1',2'-디데옥시리보오스, 누클레오시드 메틸포스포네이트
D2 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올-링커, 누클레오시드 메틸포스포네이트, β-L-데옥시누클레오시드
D3 3'-데옥시누클레오시드, 2'-O-프로파르길-리보누클레오시드, 2'-5'-결합
D2 + D3 1',2'-디데옥시리보오스, β-L-데옥시누클레오시드
본 발명의 또 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 올리고누클레오티드는 1개 또는 2개의 접근하기 쉬운 5' 말단을 갖는다. 본 발명자들은 면역자극 디누클레오티드에 대해 영역 5'의 면역자극 부분이 면역자극 디누클레오티드에 대해 영역 3'에서의 동일한 치환 보다 면역자극 활성에 더욱 큰 영향을 가짐을 발견하였다. 이러한 관찰은 CpG-PS-올리고의 5'-플랭킹 영역이 면역자극 활성에 중요한 역할을 함을 시사한다. 또한, 발명자들은 3'-5' 또는 3'-3' 결합 방식으로 부착된 2개의 올리고누클레오티드 단위를 갖는 화합물이 2개의 올리고누클레오티드 단위가 5'-5' 결합 방식으로 부착된 화합물 보다 더욱 큰 면역자극 활성을 가짐을 발견하였다. 그러므로 바람직한 일부 구체예에서, 본 발명에 따른 면역자극 올리고누클레오티드는 3'-3' 결합을 포함한다. 이러한 일부 구체예에서, 올리고누클레오티드는 1개 또는 2개의 접근하기 쉬운 5' 말단을 갖는다.
두번째 일면에서, 본 발명은 면역자극 올리고누클레오티드의 면역자극 효과를 조절하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 첫번째 일면을 위해 상기 기술한 바와 같이, 비천연 피리미딘 염기를 포함하는 디누클레오티드 유사체를 면역자극 도메인내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 상기 기술한 바와 같이, 특정 위치에서 면역자극 부분을 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인내로 도입시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 3'-3' 결합을 올리고누클레오티드내로 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 특정 위치에 "면역자극 부분을 도입시키는 것"은 간단하게 특정화된 위치에 면역자극 부분을 갖는 올리고누클레오티드를 합성하는 것을 의미한다. 예를 들어, "위치 U6내로 면역자극 부분을 도입시키는 것"은 간단하게 예컨대, 하기 구조식을 참조로 하여, 그러한 위치에 면역자극 부분을 갖는 올리고누클레오티드를 합성시키는 것을 의미한다:
5'-U9-U8-U7-U6-U5-U4-U3-U2-U1-X1-X2-Y-Z-X3-X4-D1-D2-D3-3'.
바람직하게는, 본 발명의 본 일면에 따른 상기 방법은 표 1 내지 표 3에 기재된 바람직한 치환 패턴에 따른 면역자극 도메인 또는 업스트림 또는 다운스트림 증강 도메인내의 위치에 면역자극 부분을 도입시키는 것을 포함한다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 요망되는 위치를 수득하기 위해 적당한 사이클로 합성 공정에서 적당한 면역자극 부분 단량체 합성단위체를 간단히 이용함으로써 널리 공지된 합성 기술을 사용하여 편리하게 수행될 수 있다. 바람직한 단량체에는 포스포라미디트, 포스포트리에스테르 및 H-포스포네이트가 포함된다. PS-올리고는 예컨대, 적당한 포스포라미디트를 사용하여 CPG 고형 지지체상에서 β-시아노에틸포스포라미디트 화학을 사용하여 쉽게 합성되고, 필요한 경우 탈보호되고, C18역상 HPLC에 의해 정제되고, 증류수에 대해 투석하고, 동결건조된다. 각각의 PS-올리고의 순도는 CGE에 의해 쉽게 결정되며 분자량은 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석에 의해 확인될 수 있다.
세번째 일면에서, 본 발명은 환자에게 면역 반응을 생성시키는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법에서, 바람직하게는, 화합물의 투여는 비경구적, 경구적, 설하적, 경피적, 국소적, 비내적, 기관내적, 질내적 또는 직장내적이다. 치료학적 조성물의 투여는 질병의 증상 또는 대용 마커를 감소시키기에 효과적인 투여량과 기간 동안 공지된 절차를 사용하여 수행될 수 있다. 전신적으로 투여되는 경우, 치료학적 조성물은 바람직하게는 약 0.001 마이크로몰 내지 약 10 마이크로몰의 올리고누클레오티드의 혈중 농도를 달성하기에 충분한 투여량으로 투여된다. 국소 투여를 위해, 이 보다 훨씬 낮은 농도가 효과적일 수 있고 훨씬 높은 농도에는 내성일 수 있다. 바람직하게는, 올리고누클레오티드의 전체 투여량은 하루당 1명의 환자당 약 0.1 mg 올리고누클레오티드 내지 하루당 체중 1 kg당 약 40 mg 올리고누클레오티드일 것이다. 치료학적 유효량의 본 발명의 1종 이상의 치료학적 조성물을 단일 치료 에피소드로서 개체에게 동시에 또는 후속적으로 투여하는 것이 바람직하다. 일부 예에서, 상기 정의한 범위 미만의 투여량이 여전히 효능을 제공할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 문제의 조성물이 투여된 후에, 하나 이상의 측정은 보체 활성화, 유사분열생식, 및 트롬빈 응고물 형성의 억제로 구성된 군으로부터 선택된 생물학적 효과를 제공한다.
바람직한 특정 구체예에서, 본 발명에 따른 화합물은 면역 반응의 특이성 또는 크기를 향상시키기 위해 항생제, 항원, 알레르기원, 백신, 항체, 세포독성제,안티센스 올리고누클레오티드, 유전자 치료용 벡터, DNA 백신 및/또는 애쥬번트와 조합하여 투여된다. 화합물 또는 백신, 또는 둘 모두는 키홀 림펫 헤모시아닌, 콜레라 독소 B 서브유닛 또는 임의의 다른 면역성 캐리어 단백질과 같은 면역성 단백질과 임의로 결합될 수 있다. 프로인트 완전 애쥬번트, 모노포스포릴 지질 A(MPL), QS-21을 포함하는 사포닌, 알룸 및 이들의 조합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 과도한 애쥬번트가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 방법의 바람직한 특정 구체예는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 투여에 의해 사이토카인을 유도시킨다. 특정 구체예에서, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물은 항원, 합텐 또는 백신과 컨쥬게이션된다. 상기 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 접근하기 쉬운 5' 말단이 특정한 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 활성에 중요함을 발견하였다. 따라서, 최적의 면역자극 활성을 위해, 올리고누클레오티드는 바람직하게는 올리고누클레오티드 화합물의 3'-말단에 의해 항원 또는 백신과 컨쥬게이션된다.
본 일면의 목적을 위해 "조합하여"는 동일 환자의 동일 질병을 치료하는 과정에서의 의미이고, 동시 투여를 포함하여, 올리고누클레오티드 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트를 임의의 순서 뿐만 아니라 수일 간격 이하의 시간적으로 이격된 순서로 투여하는 것을 포함한다. 또한 이러한 조합 치료는 올리고누클레오티드, 및/또는 독립적으로 백신, 및/또는 독립적으로 애쥬번트의 단일 투여 이상의 투여를 포함할 수 있다. 올리고누클레오티드 및/또는 백신 및/또는 애쥬번트의 투여는 동일하거나 상이한 경로에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 본 일면에 따른 방법은 면역 시스템의 모델 연구를 위해 유용하고, 추가로 사람 또는 동물 질병의 치료학적 치료를 위해 유용하다.
네번째 일면에서, 본 발명은 병원체에 의해 야기된 질병에 걸린 환자를 치료학적으로 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다.
다섯번째 일면에서, 본 발명은 암 환자를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 본 발명의 세번째 일면을 위해 기술한 바와 같이 수행된다.
여섯번째 일면에서, 본 발명은 자가면역 천식과 같은 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 본 발명의 세번째 일면을 위해 기술한 바와 같이 수행된다.
일곱번째 일면에서, 본 발명은 기도 염증 또는 알레르기를 치료하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 올리고누클레오티드 유사체 면역자극 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 투여는 본 발명의 세번째 일면을 위해 기술한 바와 같이 수행된다.
하기 실시예는 본 발명의 바람직한 특정 구체예를 추가로 예증하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예
실시예 1: 면역조절 부분을 함유하는 올리고누클레오티드의 합성
올리고누클레오티드를 자동화된 DNA 합성기(Expedite 8909, PerSeptive Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 1 마이크로몰 규모로 합성하였다. 표준 데옥시누클레오시드 포스포라미디트는 퍼셉티브 바이오시스템즈(PerSeptive Biosystems)로부터 입수하였다. 1',2'-디데옥시리보오스 포스포라미디트, 프로필-1-포스포라미디트, 2'-데옥시-5-니트로인돌-리보푸라노실 포스포라미디트, 2'-데옥시-우리딘 포스포라미디트, 2'-데옥시-P 포스포라미디트, 2'-데옥시-2-아미노퓨린 포스포라미디트, 2'-데옥시-네불라린 포스포라미디트, 2'-데옥시-7-데아자구아노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-4-티오우리딘 포스포라미디트, 2'-데옥시-이소구아노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-5-메틸이소시토신 포스포라미디트, 2'-데옥시-4-티오티미딘 포스포라미디트, 2'-데옥시-K-포스포라미디트, 2'-데옥시-2-아미노아데노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-N4-에틸-시토신 포스포라미디트, 2'-데옥시-6-티오구아노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-7-데아자-잔토신 포스포라미디트, 2'-데옥시-8-브로모구아노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-8-옥소구아노신 포스포라미디트, 2'-데옥시-5-하이드록시시토신 포스포라미디트, 아라비노-시토신 포스포라미디트 및 2'-데옥시-5-프로피네시토신 포스포라미디트를 글렌 리서치(Glen Research, Sterling, VA)로부터 입수하였다. 2'-데옥시-이노신 포스포라미디트를 켐진스(ChemGenes, Ashland, MA)로부터 입수하였다.
정상 커플링 사이클 또는 포스포라미디트 제조자에 의해 권장된 커플링 사이클을 모든 포스포라미디트에 대해 사용하였다. 뷰케이지(Beaucage) 시약을 산화제로 사용하여 포스포로티오에이트 변경을 수득하였다. 합성 후에, 올리고누클레오티드를 농축된 수산화암모늄 용액과 함께 CPG-결합된 올리고누클레오티드는 1.5 내지 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 다음 수산화암모늄 상층액을 55℃에서 12시간 동안 또는 포스포라미디트 제조자에 의해 권장된 대로 인큐베이션시킴으로써 탈보호시켰다. 수산화암모늄 용액을 스피드-백(speed-vac)에서 증발 건조시키고 5'-DMTr-올리고누클레오티드를 0.1 M 암모늄 아세테이트 및 아세토니트릴중의 1:5 비 0.1 M 암모늄 아세테이트의 용매 시스템을 사용하는 C18 역상 매트릭스상에서 HPLC에 의해 정제하였다. 그런 다음 올리고누클레오티드를 80% 아세트산으로 처리하여 DMTr 기를 제거하고, 나트륨 형태로 전환시키고, 이중 멸균수에 대한 투석에 의해 탈염시켰다. 올리고누클레오티드를 0.4 μ 필터를 통해 여과시키고, 동결건조시키고, 이중 멸균수중에 재용해시켰다. 변성 PAGE 및 MALDI-TOF 질량 스펙트로메트리에 의해 특징화하였다.
실시예 2: 시토신 유사체를 함유하는 CpG-PS-올리고의 합성
실시예 1에서 개괄된 절차에 따라, 하기 올리고누클레오티드를 합성하였다:
올리고 번호 서열(5'->3') 및 변경a
1 d(CTATCTGACGTTCTCTGT)
2 D(CTATCTGAC * GTTCTCTGT)
3 D(CTATCTGACC * TTCTCTGT)
4 D(CTATCTGAC * GTTCTCTGT)
5 D(CTATCTGACC * TTCTCTGT)
aCpG-포티프를 굵게 나타내었다.C * 는 5-하이드록시시토신(올리고 2 및 3)또는 N4-에틸시토신(올리고 4 및 5).
올리고누클레오티드를 CGE 및 MALDI-TOF 질량 스펙트로메트리(337 nm N2 레이저를 사용하는 Brucker Proflex III MALDI-TOF 질량 스펙트로메트리)에 의해 특징화하였다. 각각의 올리고누클레오티드에 대해 관찰되고 계산된(괄호안에 나타냄) 분자량은 다음과 같다: 올리고 1, 5704(5704.8); 올리고 2, 5720(5720.8); 올리고 3, 5681(5680.7); 올리고 4, 5733(5733); 올리고 5, 5694(5693).
실시예 3: 치료된 마우스의 비장 중량의 분석
암컷 BALB/c 마우스(4-5주령, 19-21 g)(Charles River, Wilmington, MA)를 본 연구에 사용하였다. 상기 동물에게 상용 먹이 및 물을 즉석에서 공급하였다. 상기 동물에 멸균 PBS중에 용해된 면역자극 올리고누클레오티드 화합물 5 또는 10 mg/kg 용량을 복강내적으로 주입하였다. PBS만을 주입시킨 마우스의 1개 군을 대조표준(PBS)으로서 사용하였다. 4마리 동물을 각각의 면역자극 올리고누클레오티드 화합물에 대해 사용하였다. 마우스를 72시간 후에 희생시키고, 비장을 수집하여 칭량하였다.
실시예 4: 마우스 림프구 증식 검정에서 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 분석
CD-1, BALB/c, C57BL/6 마우스(4-8주령)로부터의 비장을 림프구의 공급원으로서 사용하였다. 단일 세포 현탁액을 슬라이드 글래스의 동결된 말단을 사용하여 온화하게 잘게 썰어냄으로써 제조하였다. 그런 다음 세포를 RPMI 완전 배지[10% 우태아 혈청(FBS)(56℃에서 30분 동안 열-불활성화됨), 50 μM 2-머캅토에탄올,100 U/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신, 2 mM L-글루타민이 보충된 RPMI 배지]중에 배양하였다. 그런 다음 세포를 최종 부피 100 ㎕의 106세포/mL의 밀도로 96-웰 디쉬에 플레이팅하였다. 면역자극 올리고누클레오티드 화합물 또는 LPS(리포다당류)를 TE 완충액(10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA) 10 ㎕중의 세포 배양액에 첨가하였다. 그런 다음 세포를 37℃에서 배양하였다. 44시간 후에, 1 μCi3H-우리딘(Amersham, Arlington Heights, IL)을 RPMI 배지중의 배양물에 첨가하고, 세포를 추가 4시간 동안 펄스-표지시켰다. 세포를 자동 세포 수집기(Skatron, Sterling, VA)에 의해 수집하고, 필터를 신틸레이션 카운터에 의해 카운팅하였다. 실험을 삼중으로 수행하였다.
실시예 5: 시토신 유사체를 함유하는 CpG-PS-올리고의 림프구 증식 활성
CpG-PS-유사체 1-5(실시예 4)의 면역자극 활성을 BALB/c 마우스 림프구 증식 검정을 사용하여 연구하였다. 요약하면, 마우스 비장 세포를 배양시키고 48시간 동안 0.1, 0.3, 1.0 및 3.0 ㎍/mL 농도로 CpG-PS-올리고와 함께 인큐베이션시키고 세포 증식을3H-우리딘 혼입에 의해 측정하였다.
도 23은 마우스 림프구 배양물중의 올리고 1-5의 용량-의존적 세포 증식 활성을 보여준다. 3.0 ㎍/mL의 용량에서, 천연 시티딘을 가진 올리고 1은 29.5±2.1의 증식 지수를 나타내었다. CpG-모티프의 데옥시시티딘의 시토신 염기가 5-하이드록시시토신으로 치환된 올리고 2는 또한 용량-의존적 림프구 증식을 나타내었다.3.0 ㎍/mL 용량에서는 23.7±2.9의 증식 지수가 올리고 2에 대해 관찰되었다. CpG-모티프의 시토신 염기 대신 N4-에틸-시토신을 함유하는 PS-올리고 4는 또한 용량-의존적 세포-증식 활성을 나타내었다. 3 ㎍/mL의 용량에서 올리고 4에 대해 관찰된 18.7±1.6의 증식 지수는 CpG-모티프의 시토신의 4-아미노기상에 거대한 소수성 치환체의 존재가 면역자극 활성을 다소 저해함을 시사한다.
5-하이드록시-데옥시시티딘이 CpG-모티프의 데옥시시티딘 위치 대신에 데옥시구아노신 위치에 위치되어 있는 올리고 3는 배지 대조표준에 대해 관찰된 지수와 유사한 증식 지수를 나타내었다(도 23). 유사하게, CpG-모티프의 데옥시구아노신이 N4-에틸데옥시시티딘으로 치환된 대조 올리고 5는 배지 대조표준과 유사한 세포 증식을 나타내었다.
CpG-모티프의 시토신 염기가 5-메틸-데옥시시토신(2; 도 28 참조), 5-메틸-데옥시이소시토신(3), 데옥시우리딘(5) 또는 데옥시-P-베이스(7)로 치환된 다른 올리고들은 동일한 검정 시스템에서 세포 증식 활성을 전혀 나타내지 않거나 무의미한 세포 증식 활성을 나타냈다. 이러한 결과는 (i) 세포 증식 활성이 CpG 모티프의 시토신 염기가 5-하이드록시시토신 또는 N4-에틸시토신(각각, 올리고 2 및 4)으로 치환되는 경우 유지되지만, (ii) 이러한 시토신 유사체로의 구아닌 염기의 치환은 세포 증식 활성의 손실을 초래함을 시사한다.
실시예 6: 시토신 유사체를 함유하는 CpG-PS-올리고에 의해 유도된 마우스에서의 비장비대증
CpG-PS-올리고의 시험관내 효과를 확인하기 위해, 올리고 1, 2 및 4(실시예4로부터)를 10 mg/kg의 용량으로 BALB/c 마우스에 복강내적으로(ip) 주입하고 비장 중량의 변화를 각각의 PS-올리고의 면역자극 활성 레벨의 지표로서 측정하였다. CpG-PS-올리고를 사용한 치료의 결과로서 비장 중량의 변화를 도 24에 제시하였다. 암컷 BALB/c 마우스(4-6주령, 19-21 gm)를 각 군에 4마리씩 상이한 군으로 나누었다. 올리고누클레오티드를 멸균 PBS중에 용해시키고 10 mg/kg의 용량으로 마우스에 복강내적으로 투여하였다. 72시간 후에, 마우스를 희생시키고, 비장을 수집하여 칭량하였다. 각각의 서클은 개별적 마우스의 비장 중량을 나타내고 +는 각 군에 대한 평균 비장 중량을 나타낸다.
CpG-모티프에 천연 데옥시시티딘을 갖는 올리고 1은 10 mg/kg의 용량에서 PBS가 주입된 마우스 대조군과 비교하여 비장 중량에 있어서 약 45% 증가를 나타내었다. CpG-모티프의 시토신 염기 대신 5-하이드록시시토신을 갖는 올리고 2는 동일 용량에서 비장 중량에 있어서 약 35% 증가를 나타내었다. CpG-모티프의 시토신 염기 대신 N4-에틸시토신을 갖는 올리고4는 대조군과 비교하여 동일 용량에서 비장 중량에 있어서 약 34% 증가를 나타내었다. 이러한 데이터는 CpG-모티프의 데옥시시티딘 대신 변경된 시티딘 유사체를 함유하는 이들 올리고에 대한 림프구 증식 검정에서 관찰된 결과를 확정시켜준다.
실시예 7: C * pG-PS-올리고의 구조-활성 관계
CpG-모티프의 시토신의 5-위치에 메틸기의 존재는(5-메틸-데옥시시토신, 2(도 28)) CpG-PS-올리고의 CpG 관련된 면역자극 효과를 완벽하게 저해한다. 시험관내 및 생체내 실험에서 관찰된 결과들을 기초로하여, 본 발명자들은 시토신 유사체를 함유하는 PS-올리고에 대한 구조-활성 관계를 구성하였다.
CpG-모티프의 시토신 염기91)의 5-메틸-이소시토신(3)으로의 치환은 5-메틸시토신(2)로의 치환의 경우와 같이, 면역자극 활성의 완전한 손실을 초래하였고, 이는 각각 2 및 4-위치에서 케토 및 아미노기를 스위칭하고/하거나 시토신의 5-위치에 소수성 메틸기를 위치시킨 결과일 수 있다.
CpG-모티프의 시토신의 5-위치에 친수성 하이드록시 치환을 함유하는 올리고 2는 천연 시토신 염기를 함유하는 올리고 1과 유사한 면역자극 활성을 나타내었다. 이러한 관찰은 거대한 친수성 기가 CpG-PS-올리고의 면역자극 활성에 대해 시토신의 5-위치에 소수성 기 보다 더 우수한 내성을 나타냄을 시사한다. 아마도 수용체상의 CpG-올리고를 위한 결합 포켓은 천연적으로는 친수성이고 시토신의 5-위치에 소수성 기를 수용할 수 없다.
CpG-모티프의 시토신 염기가 우라실(5(도 28 참조))로 치환되는 경우, 케토기는 2 및 4-위치 둘 모두에 존재하며, 면역자극 활성이 관찰되지 않았는데, 이는 시토신의 4-위치에 수소 결합 공여체 아미노기가 면역자극 활성을 위해 중요함을 시사한다. 거대한 소수성 에틸기가 CpG-모티프의 시토신의 4-아미노기상에 위치되는 경우, 감소된 림프구 증식 및 마우스의 비장 중량에서의 다소 감소된 증가가 관찰되었고, 이는 이런 위치에서 거대한 에틸기가 CpG-PS-올리고가 면역자극 활성을 담당하는 수용체 인자에 결합하는 것을 방해하지 않음을 시사한다. 에틸 치환에도 불구하고, N4-에틸시토신(6)의 4-아미노기는 수용체와의 수소 결합 형성에 참여할 수 있다. 4-위치에 위치된 질소 기가 5-위치에 고리 구조 형성에 관여하고, 4-위치에 수소 결합 공여체 아미노기를 갖지 않은 변경된 피리미딘 염기 dP는 배양물내에서 마우스 림프구 증식 활성을 갖지 않으며, 이는 CpG-모티프의 시토신의 4-아미노기가 면역자극 활성을 위해 중요함을 시사한다.
결론적으로, 본원에 제시된 결과들은 시토신의 2, 3 및 4 위치에서의 작용기가 CpG-관련된 면역자극 활성을 위해 중요함을 보여준다. 시토신의 5-위치에서 소수성 치환은 CpG-올리고의 면역자극 활성을 완전히 억제시키는 반면, 이 위치에서의 친수성 기는 내성을 나타낸다. 추가적으로, CpG-모티프의 시토신 대신에 5-하이드록시시토신 또는 N4-에틸시토신을 함유하는 CpG-PS-올리고의 면역자극 활성은 5'-플랭킹 서열에 적당한 화학적 변경을 혼입시킴으로써 현저하게 조절될 수 있으며, 이는 CpG-모티프에서 이러한 시토신 유사체가 면역자극 모티프의 일부로서 인식됨을 시사한다.
실시예 8: 말단-블로킹된 CpG-PS 올리고누클레오티드의 합성
도 17에 도시된 CpG-PS-올리고를 자동화된 합성기 및 포스포라미디트 접근법을 사용하여 합성하였다. 올리고 1(16-량체)을 누클레오시드-5'-β-시아노에틸포스포라미디트를 사용하여 합성하였다. 올리고 2, 32-량체,를 누클레오시드-3'-β-시아노에틸포스포르-아미디트 및 올리고 1의 16-량체 서열이 2회 반복된 3'-연결된 누클레오시드를 갖는 제어된 포어 글래스 지지체(CpG-고형 지지체)를 사용하여 합성하고; 따라서, 올리고 2는 정상 3'-5'-결합에 의해 연결된 2개의 16-량체(올리고 1)을 갖는다. 올리고 3, 32-량체,를 5-5'-결합에 의해 연결된 2개의 16-량체(올리고 1)를 사용하여 합성하였고, 따라서 올리고 3는 2개의 3'-말단 및 0개의 5'-말단을 갖는다. 올리고 3의 합성은 2단계로 수행되었다: 제 1 16-량체를 누클레오시드-3'-β-시아노에틸포스포라미디트 및 3'-연결된 누클레오시드를 가진 고형 지지체를 사용하여 합성한 다음 제 2 16-량체 절편의 합성을 누클레오시드-5'-β-시아노-에틸포스포라미디트를 사용하여 계속하였다. 올리고 4, 32-량체,는 3'-3'-결합에 의해 연결된 2개의 16-량체(올리고 1)를 포함하였고, 따라서 올리고 4는 2개의 5'-말단 및 0개의 3'-말단을 갖는다. 올리고 4의 합성은 2단계로 수행되었다: 제 1 16-량체를 누클레오시드-5'-β-시아노에틸포스포라미디트 및 5'-열결된 누클레오시드를 가진 고형 지지체를 사용하여 합성하고, 제 2 16-량체 절편의 합성을 누클레오시드-3'-β-시아노에틸포스포라미디트를 사용하여 계속하였다. 올리고 5-8의 합성을 각각 올리고 1-4에 대해서와 동일한 누클레오시드-β-시아노에틸포스포라미디트를 사용하여 수행하였다. 합성의 마지막에, 올리고 1-8을 농축된 암모니아 용액으로 탈보호시키고, 역상 HPLC에 의해 정제하고, 디트리틸레이팅(detritylating)하고, 탈염시키고, 투석시켰다. 각각의 PS-올리고의 순도를 CGE에 의해 체크하였고 분자량을 MALDI-TOF 질량 스펙트럼 분석에 의해 확인하였다(표 1). 올리고 1-8에서 5'-CpG 모티프의 서열 일체성 및 배향성을 이들의 각 DNA 상보 가닥(올리고 1-4에 대해 5'-AAGGTCGAGCGTTCTC-3', 및 올리고 5-8에 대해 5'-ATGGCGCACGCTGGGAGA-3')을 가진 듀플렉스의 융점(Tm)을 기록함으로써 확인하였다. 이들 듀플렉스의 Tm은 53.9±0.9℃(올리고 1-4), 61.8℃(올리고 5) 및 58.8±0.6℃(올리고 6-8)였다(올리고 5는 18-량체이고, 올리고 6-8은 36-량체가 아닌 32-량체임에 주의).
실시예 9: 말단-블로킹된 CpG-PS 올리고누클레오티드의 마우스 비장 림프구 증식 활성
실시예 8의 말단-블로킹된 CpG-PS-올리고의 면역자극 활성을 초기에 림프구 증식 검정으로 연구하였다. 전형적으로, 마우스(Balb-cC) 비장 림프구를 0.1, 1.0 및 10.0 ㎍/ml의 농도로 48시간 동안 CpG-PS-올리고와 함께 배양시키고 세포 증식을 실시예 3에 기술한 바와 같이3H-우리딘 혼입에 의해 결정하였다. 결과를 도 17에 도시하였다.
올리고 1은 세포 증식에 대해 용량-의존적 효과를 유도시켰고; 10 ㎍/ml(약 2.0 μM)의 농도에서, 증식 지수는 5.0±0.32였다. 3'-5'-결합에 의해 연결된 올리고 1의 2개의 유닛으로 구성된 올리고 2는 동일한 용량(약 1.0 μM)에서 5.8±0.28의 증식 지수를 가졌다. 5'-5'-결합에 의해 연결된 올리고 1의 2개의 유닛으로 구성된 올리고 3은 2.0±0.26의 증식 지수를 가졌으며, 이는 올리고 1 및 2에 대해 관찰된 것 보다 현저하게 낮은 면역자극 활성을 반영한다. 3'-3'-결합에 의해 연결된 올리고 1의 2개의 유닛으로 구성된 올리고 4는 7.2±0.5의 증식 지수를 가지며, 이는 올리고 1 및 2에 대해 관찰된 것 보다 큰 면역자극 활성을 반영한다.
유사한 결과들이 올리고 5-8을 사용하여 수득되었다. 올리고 5는 3.9±0.12의 증식 지수를 가졌다. 올리고 5의 2개의 유닛이 3'-5'-결합(올리고 6), 5'-5'-결합(올리고 7) 및 3'-3'-결합(올리고 8)에 의해 연결된 올리고 6-8은 각각4.9±0.2, 1.74±0.21 및 7.7±0.82의 증식 지수를 가졌다. 올리고 6-8에 대해 수득된 결과들의 비교는 2개의 올리고 5 서열들이 3'-5'-결합 또는 3'-3'-결합에 의해 연결되어 있는 올리고 6 및 8이 더 큰 면역자극 활성을 가지는 반면, 2개의 올리고 5가 5'-5'-결합에 의해 연결된 올리고 7은 올리고 5의 경우 보다 현저하게 낮은 면역억제 활성을 가졌다.
올리고 1-8의 림프구 증식 결과에 기초로 하여, 올리고가 이들의 5'-말단을 통해 연결되는 경우, 면역자극 활성이 현저하게 상실되는 반면, 이들이 3'-말단을 통해 연결되는 경우에는 면역자극 활성이 증가함이 명백하다. 3'-3'-연결된 올리고가 유리 3'-말단을 함유하는 올리고 보다 엑소누클레아제에 의한 분해에 대해 실질적으로 더 큰 안정성을 나타내었고, 이것은 또한 증가된 면역자극 활성을 야기할 수 있음을 아는 것이 중요하다. 올리고의 5'-말단이 블로킹되어 있는 올리고 3 및 7의 낮은 면역자극 활성은 올리고의 5'-말단의 접근용이성이 CpG-PS-올리고의 면역자극 활성을 위해 필수적임을 시사한다.
실시예 10: 말단-블로킹된 CpG-PS-올리고누클레오티드에 의해 유도된 마우스에서의 비장비대증
생체내에서 올리고 1-8(실시예 8)의 면역자극 활성을 확인하기 위해, 5 mg/kg 용량의 올리고누클레오티드를 Balb-C 마우스에 복강내적으로 주입하였다. 투여한지 72시간 후에 마우스를 희생시키고, 비장을 제거하고, 블로팅 건조시키고, 칭량하였다. 처리된 마우스와 비처리된 마우스의 비장 중량에서의 변화를 면역자극 활성에 대한 파라미터로서 사용하였다.
올리고 1의 5 mg/kg 용량의 투여는 PBS를 주입한 대조 마우스와 비교하여 비장 중량에 있어서 약 40%의 증가를 초래하였다. 또한 올리고 2 및 4의 투여는 비장 중량에 있어서 약 50% 증가를 초래하였다. 올리고 3의 투여는 대조 마우스와 비교하여 비장 중량에 있어서 차이가 없었다. 이러한 결과들은 5'-말단이 블로킹되어 있는 올리고 3가 접근하기 쉬운 5'-말단을 가진 올리고들과 비교하여 현저하게 낮은 면역자극 활성을 가짐을 추가로 뒷받침한다. 또한 이러한 결과를 올리고 5-8의 투여에 의해 확인하였다. 올리고 5, 6 및 8의 투여는 비장 중량에 있어서 약 40-50% 증가를 초래한 반면, 올리고 7의 투여 이후에는 비장 중량에서의 변화가 관찰되지 않았다.
상기 결과들은 CpG 모티프를 함유하는 PS-올리고의 면역자극 활성이 올리고의 5'-말단이 접근하기 쉽지 않은 경우 현저하게 최소화됨을 시사한다. 올리고 3 및 7의 면역자극 활성에 있어서 이러한 손실은 두 올리고 모두가 2개의 3'-말단을 가지고 있고 1개의 3'-말단을 가진 올리고 1, 2, 5 및 6 보다 3'-엑소누클레아제 분해에 더욱 민감하지 않기 때문에, 누클레아제 안정성에 기초하여 설명할 수는 없다. 3'-말단이 블로킹되어 있고 엑소누클레아제의 분해에 대해 매우 안정한 PS-올리고 4 및 8은 유사한 면역자극 활성을 나타내었다. 올리고 4 및 8은 이들의 증가된 생체내 안정성으로 인해 지속된 면역자극 활성을 나타낼 수 있으며, 투여한지 단지 72시간 후에 마우스를 희생시켰기 때문에 본 연구에서 생체내 안정성은 명확하지 않다.
본원에 기술한 결과들은 흥미로운 것이며 CpG-PS-올리고의 5'-말단이 면역자극 활성을 위해 중요함을 시사한다. 본원에 논의한 바와 같이, 본 발명자들은 변경된 2'- 또는 3'-치환된 리보누클레오시드에 의한 5'-플랭킹 영역에서의 데옥시누클레오시드의 치환이 증가된 면역자극 활성을 초래하였음을 밝혔다. 또한, CpG 모티프에 대해 바로 업스트림(5'-말단)에서 데옥시누클레오시드의 치환은 면역자극 활성의 현저한 억제를 초래하였고, CpG 모티프에 대해 바로 다운스트림(3'-말단)에서 데옥시누클레오시드의 치환은 면역자극 활성에 어떠한 영향도 갖지 않았다. 종합하면, 이들 결과는 면역자극을 담당하는 효소/수용체는 5'-말단으로부터의 올리고내에 CpG 모티프를 인식하며 5'-말단에 대한 접근용이성의 필요성을 시사한다.
지금까지 본 발명을 명확성과 이해를 목적으로 조금 상세하게 기술하였지만, 당업자들은 형태 및 세부사항에서의 다양한 변화가 본 발명 및 첨부된 청구항의 본질적인 범위를 벗어남이 없이 수행될 수 있음을 이해할 것이다.

Claims (38)

  1. 화학식 5'-피리미딘-퓨린-3'의 면역자극 디누클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물로서, 상기 식에서 피리미딘은 비천연 피리미딘 누클레오시드이고 퓨린은 천연 퓨린 누클레오시드 또는 비천연 퓨린 누클레오시드인 화합물.
  2. 화학식 C*pG의 면역자극 디누클레오티드를 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물로서, 상기 식에서 C*는 시티딘 유사체이고, G는 구아노신, 2'-데옥시구아노신 또는 구아노신 유사체이고, P는 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트 및 포스포로디티오에이트로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드간 결합인 화합물.
  3. 제 1항에 있어서, 비천연 피리미딘 누클레오시드가 하기 화학식 (I)을 가짐을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물:
    (I)
    상기 식에서, D는 수소 결합 공여체이고, D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자끄는 기 및 전자주는 기로 구성된 군으로부터 선택되고, A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고, X는 탄소 또는 질소이고, S는 5탄당 또는 6탄당 고리이며, 단, 상기 화학식 (I)의 피리미딘 누클레오시드는 시티딘 또는 데옥시시티딘이 아니다.
  4. 제 3항에 있어서, 비천연 피리미딘 누클레오시드가 비천연 피리미딘 염기를 포함함을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  5. 제 4항에 있어서, 비천연 피리미딘 염기가 5-하이드록시시토신, 5-하이드록시메틸시토신, N4-알킬시토신 및 4-티오우라실로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  6. 제 4항에 있어서, 비천연 피리미딘 염기가 5-하이드록시시토신 및 N4-에틸시토신으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  7. 제 4항에 있어서, 화학식 (I)의 비천연 피리미딘 누클레오시드가 비천연 당 부분을 포함함을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  8. 제 7항에 있어서, 비천연 당 부분이 아라비노오스임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  9. 하기 화학식 (II)의 면역자극 도메인을 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물:
    (II)
    상기 식에서,
    Y는 시티딘, 2'-데옥시시티딘 또는 비천연 피리미딘 누클레오시드이고;
    Z는 구아노신, 2'-데옥시구아노신 또는 비천연 퓨린 누클레오시드이고;
    X1은 천연 누클레오시드이거나 C3-알킬 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 및 β-L-데옥시누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    X2는 천연 누클레오시드 또는 아미노 링커인 면역자극 부분이고;
    X3는 천연 누클레오시드 또는 누클레오시드 메틸포스포네이트인 면역자극 부분이고;
    X4는 천연 누클레오시드 또는 누클레오시드 메틸포스포네이트 및 2'-O-메틸리보누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이며; 단, X1, X2, X3 및 X4 중 적어도 하나는 면역자극 부분이다.
  10. 제 9항에 있어서, Y가 비천연 피리미딘 누클레오시드임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  11. 제 10항에 있어서, Y가 하기 화학식 (I)을 가짐을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물:
    (I)
    상기 식에서, D는 수소 결합 공여체이고, D'은 수소, 수소 결합 공여체, 수소 결합 수용체, 친수성 기, 소수성 기, 전자끄는 기 및 전자주는 기로 구성된 군으로부터 선택되고, A는 수소 결합 수용체 또는 친수성 기이고, X는 탄소 또는 질소이고, S는 5탄당 또는 6탄당 고리이며, 단, Y는 시티딘 또는 데옥시시티딘이 아니다.
  12. 하기 화학식 (III)의 서열을 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물:
    (III)
    상기 식에서,
    Y는 비천연 피리미딘 누클레오시드이고;
    Z는 구아노신, 2'-데옥시-구아노신 또는 비천연 퓨린 누클레오시드이고;
    각각의 X는 독립적으로 천연 누클레오시드 또는 면역자극 부분이고;
    Um-U1은 업스트림 증강 도메인을 나타내며, 여기서 각각의 U는 독립적으로 천연 누클레오시드 또는 면역자극 부분이고;
    D1-Dm은 다운스트림 증강 도메인을 나타내며, 여기서 각각의 D는 독립적으로천연 누클레오시드 또는 면역자극 부분이고;
    m은 각각의 경우에 0 내지 30의 수를 나타낸다.
  13. 제 12항에 있어서, 하나 이상의 X, U 또는 D가 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  14. 제 13항에 있어서, X1이 천연 누클레오시드이거나 C3-알킬 링커, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커 및 β-L-데옥시누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    X2가 천연 누클레오시드 또는 아미노 링커인 면역자극 부분이고;
    X3가 천연 누클레오시드 또는 누클레오시드 메틸포스포네이트인 면역자극 부분이고;
    X4가 천연 누클레오시드이거나 누클레오시드 메틸포스포네이트 및 2'-O-메틸리보누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    U1이 천연 누클레오시드이거나 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커 및 2'-O-메틸리보누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    U2가 천연 누클레오시드이거나 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 18, 3'-데옥시누클레오시드, 누클레오시드 메틸포스포네이트, β-L-데옥시누클레오시드 및 2'-O-프로파르길리보누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    U3가 천연 누클레오시드이거나 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 누클레오시드 메틸포스포네이트 및 2'-5' 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    D1이 천연 누클레오시드이거나 1',2'-디데옥시리보오스 및 누클레오시드 메틸포스포네이트로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이고;
    D2가 천연 누클레오시드이거나 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커, 스페이서 9, 스페이서 18, 2-아미노부틸-1,3-프로판디올 링커, 누클레오시드 메틸포스포네이트 및 β-L-데옥시누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분이며;
    D3가 천연 누클레오시드이거나 3'-데옥시누클레오시드, 2'-O-프로파르길리보누클레오시드 및 2'-5' 결합으로 구성된 군으로부터 선택된 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  15. 제 13항에 있어서, U2 및 U3 둘 모두가 1',2'-디데옥시리보오스, C3-링커 또는 β-L-데옥시누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 동일한 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  16. 제 13항에 있어서, U3 및 U4 둘 모두가 누클레오시드 메틸포스포네이트 및 2'-O-메톡시에틸리보누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 동일한 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  17. 제 13항에 있어서, U5 및 U6 둘 모두가 1',2'-디데옥시리보오스 및 C3-링커로 구성된 군으로부터 선택된 동일한 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  18. 제 13항에 있어서, X1 및 U3 둘 모두가 1',2'-디데옥시리보오스임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  19. 제 13항에 있어서, D2 및 D3 둘 모두가 1',2'-디데옥시리보오스 및 β-L-데옥시누클레오시드로 구성된 군으로부터 선택된 동일한 면역자극 부분임을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  20. 화학식 5'-피리미딘-퓨린-3'의 면역자극 디누클레오티드; 3'-3' 결합; 및 1개 또는 2개의 접근하기 용이한 5' 말단을 포함하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물로서, 상기 식에서 피리미딘은 천연 또는 비천연 피리미딘 누클레오시드이고 퓨린은 천연 퓨린 누클레오시드 또는 비천연 퓨린 누클레오시드이며, 단, 올리고누클레오티드는 HIV-1의gag또는tat유전자와 상보성이 아닌 화합물.
  21. 제 20항에 있어서, 올리고누클레오티드가 2개의 접근하기 용이한 5' 말단을 포함함을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  22. 제 20항에 있어서, 면역자극 디누클레오티드가 비천연 피리미딘 누클레오시드를 포함함을 특징으로 하는 면역자극 올리고누클레오티드 화합물.
  23. 비천연 피리미딘 염기를 포함하는 디누클레오티드 유사체를 면역자극 도메인내에 도입시키는 것을 포함하여, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 면역자극 효과를 조절하는 방법.
  24. 면역자극 부분을 면역자극 도메인 및/또는 증강 도메인내에 도입시키는 것을 포함하여, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 면역자극 효과를 조절하는 방법.
  25. 3'-3' 결합을 올리고누클레오티드내에 도입시키는 것을 포함하여, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물의 면역자극 효과를 조절하는 방법.
  26. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 유사체 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 환자에게서 면역반응을 생성시키는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 유사체 화합물이 항생제, 항원, 알레르기원, 백신, 항체, 세포독성제, 안티센스 올리고누클레오티드, 유전자 치료용 벡터, DNA 백신, 애쥬번트 또는 이들의 조합물과 함께 투여됨을 특징으로하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물이 항원 또는 백신과 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 28항에 있어서, 컨쥬게이션이 올리고누클레오티드 화합물의 3'-말단에서 일어남을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 병원체에 의해 야기된 질병에 걸린 환자를 치료학적으로 치료하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 병원체가 바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 병원체가 기생충임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 30항에 있어서, 병원체가 세균임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 암 환자를 치료하는 방법.
  35. 제 34항에 있어서, 면역자극 올리고누클레오티드 화합물이 화학치료용 화합물과 함께 투여됨을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 유사체 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  37. 제 36항에 있어서, 자가면역 질환이 자가면역 천식임을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 1항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 따른 면역자극 올리고누클레오티드 유사체 화합물을 환자에게 투여하는 것을 포함하여, 기도 염증 또는 알레르기를 치료하는 방법.
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