ES2812523T3 - Conjugación de polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus de tipo 5 y de tipo 8 - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la preparación de un conjugado de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 y una molécula transportadora, en el que la molécula transportadora es CRM197, que comprende las etapas de: (a) despolimerización del polisacárido capsular mediante hidrólisis ácida, para dar lugar a un fragmento de polisacárido; (b) oxidación del fragmento para introducir un grupo aldehído en al menos un resto de sacárido en el fragmento, para dar lugar a un resto de sacárido oxidado; y (c) acoplamiento del resto de sacárido oxidado a la molécula transportadora a través del grupo aldehído, dando lugar de este modo al conjugado.

Description

DESCRIPCIÓN

Conjugación de polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus de tipo 5 y de tipo 8

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la conjugación de sacáridos capsulares bacterianos, en particular polisacáridos capsulares de Staphylococcus aureus de tipo 5 o tipo 8, con transportadores, para formar glucoconjugados. Los glucoconjugados son útiles para inmunización.

Antecedentes de la técnica

Los sacáridos capsulares de bacterias se han utilizado durante muchos años en vacunas contra bacterias encapsuladas. Sin embargo, como los sacáridos son antígenos independientes de T, son poco inmunogénicos. La conjugación con un transportador puede convertir antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, potenciando de este modo las respuestas de memoria y permitiendo que se desarrolle la inmunidad protectora. Por lo tanto, las vacunas de sacáridos más eficaces se basan en glucoconjugados, y el prototipo de vacuna conjugada fue contra Haemophilus influenzae tipo b ('Hib') [por ejemplo, véase el capítulo 14 de la ref. 97].

Otra bacteria para la que se han descrito vacunas conjugadas es Staphylococcus aureus (S. aureus). Se han aislado diversos polisacáridos de S. aureus para su uso en glucoconjugados. Dos polisacáridos de particular interés son los polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8. Aproximadamente el 60 % de las cepas de S. aureus humanas son de tipo 8 y aproximadamente el 30 % son de tipo 5. Gran parte del trabajo sobre conjugados de tipo 5 y tipo 8 lo han realizado Fattom y col., y se describe en documentos tales como las referencias 1 a 9. El procedimiento de Fattom para la conjugación de polisacárido de tipo 5 y tipo 8 implica normalmente la tiolación de un polisacárido purificado utilizando cistamina. La reacción se basa en la presencia de grupos carboxilato en el polisacárido capsular. Estos grupos reaccionan con la cistamina en presencia de una carbodiimida, por ejemplo, e Da C. A continuación, el polisacárido derivatizado se conjuga con una proteína transportadora tal como la endotoxina A (ETA) de Pseudomononas aeruginosa, normalmente a través de un engarce [2]. Otros investigadores han llevado a cabo la conjugación de polisacáridos capsulares purificados de tipo 5 y tipo 8 mediante aminación reductora [10 y 11]; acoplamiento de glutaradehído [10]; o reacción de grupos hidroxilo en los polisacáridos con agentes cianilantes como CDAP [12] o tricloruro cianúrico [13]. La conjugación por aminación reductora también se desvela en el documento WO2005/000346. Que describe la conjugación de polisacáridos meningocócicos con el fragmento C del toxoide tetánico mediante aminación reductora.

Aunque se ha demostrado que las vacunas conjugadas preparadas mediante el procedimiento de Fattom son seguras e inmunogénicas en humanos [5], sigue existiendo la necesidad de formas adicionales y mejores de preparar conjugados de polisacáridos capsulares de S. aureus tipo 5 o tipo 8.

Divulgación de la invención

El ámbito de la invención está definido por las reivindicaciones. Cualquier referencia en la descripción a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

La invención se basa en un procedimiento de conjugación que puede utilizarse en lugar de los procedimientos de conjugación desvelado en la técnica anterior. A diferencia de estos procedimientos, el procedimiento de la invención no implica la conjugación a través de grupos hidroxilo o carboxilato en el polisacárido. Por lo tanto, el procedimiento deja estos grupos en una forma más cercana que la técnica anterior a la forma observada en el polisacárido nativo. En lugar de utilizar estos grupos, el procedimiento implica la generación de grupos aldehído reactivos en el polisacárido para su uso en la conjugación. Los conjugados resultantes pueden tener propiedades inmunológicas distintas, preferentemente mejoradas, en comparación con los conjugados de la técnica anterior.

Por lo tanto, la invención proporciona procedimientos alternativos o mejorados para la conjugación de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o de tipo 8 a una proteína transportadora y los conjugados obtenidos a partir de esto. La invención también proporciona intermedios que son útiles en los procedimientos de la invención y procedimientos para la preparación de estos intermedios.

En un primer aspecto, la invención proporciona un procedimiento para la preparación de un conjugado de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 y una molécula transportadora que es CRM 197, que comprende las etapas de: (a) despolimerización del polisacárido capsular mediante hidrólisis ácida, para dar lugar a un fragmento de polisacárido; (b) oxidación del fragmento para introducir un grupo aldehído en al menos un resto de sacárido en el fragmento, para dar lugar a un resto de sacárido oxidado; y (c) acoplamiento del resto de sacárido oxidado a una molécula transportadora a través del grupo aldehído, dando lugar de este modo al conjugado. El acoplamiento de la etapa (c) puede ser directo o puede ser a través de una molécula de engarce. La invención también proporciona un conjugado obtenido u obtenible mediante este procedimiento.

Los polisacáridos capsulares

La invención se basa en los polisacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 y tipo 8. Las estructuras de los polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 se describieron en las referencias 14 y 15 como:

Tipo 5

^-4)-p-D-ManNAcA(3OAc)-(1 ^ - 4)-a-L-FucNAc(1 3)-p-D-FucNAc-(1

Tipo 8

^-3)-p-D-ManNAcA(4OAc)-(1 ^ - 3)-a-L-FucNAc(1 3)-p-D-FucNAc-(1

Los datos de espectroscopia de RMN recientes [16] han conducido a una revisión de estas estructuras a:

Tipo 5

^-4)-p-D-ManNAcA-(1 4)-p-L-FucNAc(3OAc)-(1 3)-p-D-FucNAc-(1 ^ -

Tipo 8

^-3)-p-D-ManNAcA(4OAc)-(1 ^ - 3)-a-L-FucNAc(1 3)-a-D-FucNAc(1 ^ -

El polisacárido puede modificarse químicamente con respecto al polisacárido capsular que se encuentra en la naturaleza.

Por ejemplo, el polisacárido puede estar des-O-acetilado (parcial o totalmente), des-N-acetilado (parcial o totalmente), N-propionado (parcial o totalmente), etc. La desacetilación puede producirse antes, durante o después de la conjugación, pero normalmente se produce antes de la conjugación. Dependiendo del polisacárido particular, la desacetilación puede afectar o no a la inmunogenicidad, por ejemplo, la vacuna NeisVac-C™ utiliza un polisacárido des-O-acetilado, mientras que Menjugate™ está acetilado, pero ambas vacunas son eficaces. El efecto de la desacetilación etc. puede evaluarse mediante ensayos rutinarios. Por ejemplo, la importancia de la O-acetilación en polisacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 u tipo 8 se analizan en la referencia 6. En este documento se dice que los polisacáridos nativos tienen el 75 % de O-acetilación. Estos polisacáridos indujeron anticuerpos contra la estructura principal del polisacárido y los grupos O-acetilo. Los polisacáridos con el 0 % de O-acetilación aún suscitaban anticuerpos contra la estructura principal del polisacárido. Ambos tipos de anticuerpos eran opsónicos contra cepas de S. aureus que variaban en su contenido de O-acetilo. Por consiguiente, los polisacáridos capsulares de tipo 5 o de tipo 8 utilizados en la presente invención pueden tener entre el 0 y 100 % de O-acetilación. Por ejemplo, el grado de O-acetilación del polisacárido capsular de tipo 5 puede ser del 10-100 %, 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. Como alternativa, se puede utilizar polisacárido capsular de tipo 5 O-acetilado al 0 %. De forma similar, el grado de O-acetilación del polisacárido capsular de tipo 8 puede ser del 10-100 %, 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60­ 100 %, 70-100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. Como alternativa, se puede utilizar polisacárido capsular de tipo 8 O-acetilado al 0 %. En una realización, el grado de O-acetilación de los polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 puede ser del 10-100 %, 20-100 %, 30-100 %, 40-100 %, 50-100 %, 60-100 %, 70­ 100 %, 80-100 %, 90-100 %, 50-90 %, 60-90 %, 70-90 % u 80-90 %. En otras realizaciones, se utilizan polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8 O-acetilados al 0 %. El grado de N-acetilación del polisacárido capsular de tipo 5 utilizado en la invención puede ser del 0-100 %, 50-100 %, 75-100 %, 80-100 %, 90-100 % o 95-100 %. Normalmente, el grado de N-acetilación del polisacárido capsular de tipo 5 es del 100%. De forma similar, el grado de N-acetilación del polisacárido capsular de tipo 8 utilizado en la invención puede ser del 0-100 %, 50-100 %, 75-100 %, 80-100 %, 90­ 100 % o 95-100 %. Normalmente, el grado de N-acetilación del polisacárido capsular de tipo 8 es del 100 %. En una realización, el grado de N-acetilación de los polisacáridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 puede ser del 0-100 %, 50­ 100 %, 75-100 %, 80-100 %, 90-100 % o 95-100 %. Normalmente, el grado de N-acetilación del polisacárido capsular de tipo 5 y de tipo 8 es del 100 %.

El grado de O-acetilación del polisacárido se puede determinar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, mediante RMN de protones (por ejemplo, como se describe en las referencias 17, 18, 19 o 20). En la referencia 21 se describe un procedimiento adicional. Para determinar el grado de N-acetilación del polisacárido pueden utilizarse procedimientos similares. Los grupos O-acetilo pueden eliminarse por hidrólisis, por ejemplo, mediante tratamiento con una base tal como hidrazina anhidra [22] o NaOH [6]. Para eliminar grupos N-acetilo pueden utilizarse procedimientos similares. Para mantener altos niveles de O-acetilación en polisacáridos capsulares tipo 5 y/o 8, los tratamientos que conducen a la hidrólisis de los grupos O-acetilo se minimizan, por ejemplo, tratamientos a extremos de pH.

Los polisacáridos capsulares pueden purificarse mediante técnicas conocidas, como se describe en las referencias en el presente documento. Un procedimiento típico implica la inactivación de las células de S. aureus por fenol-etanol, centrifugación, tratamiento con lisostafina, tratamiento con ARNasa/ADNasa, centrifugación, diálisis, tratamiento con proteasa, diálisis adicional, filtración, precipitación con etanol/CaCh, diálisis, criodesecación, cromatografía de intercambio aniónico, diálisis, criodesecación, cromatografía de exclusión por tamaño, diálisis y criodesecación [1]. Un procedimiento alternativo implica someter a autoclave células de S. aureus, ultrafiltración del sobrenadante que contiene polisacáridos, concentración, liofilización, tratamiento con metaperyodato de sodio para eliminar el ácido teicoico, ultrafiltración adicional, diafiltración, cromatografía líquida de exclusión por tamaño de alto rendimiento, diálisis y criodesecación [23]. Preferentemente, se utiliza el procedimiento de purificación descrito en la referencia 24.

Sin embargo, la invención no se limita a polisacáridos purificados a partir de fuentes naturales y los polisacáridos pueden obtenerse por otros procedimientos, tales como síntesis total o parcial.

La molécula transportadora

La invención implica el uso de moléculas transportadoras, las cuales normalmente son proteínas. En general, la conjugación covalente de los sacáridos a los transportadores potencia la inmunogenicidad de los sacáridos, ya que los convierte de antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, lo que permite la sensibilización de la memoria inmunológica. La conjugación es particularmente útil para vacunas pediátricas [por ejemplo, ref. 25] y es una técnica muy conocida [por ejemplo, revisada en las ref. 26 a 34].

Las proteínas transportadoras pueden ser toxinas bacterianas, tales como toxinas diftéricas o tetánicas, o toxoides o mutantes de las mismas. Los inventores han descubierto que el mutante de la toxina diftérica CRM197 [35] es adecuado, y este transportador se utiliza en la presente solicitud. La exotoxina A (ETA) de Pseudomonas aeruginosa y su exoproteína A mutante recombinante no tóxica (rEPA) se han utilizado como proteínas transportadoras para los polisacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 ([1] y [2]). También se han utilizado la a-hemolisina de S. aureus ([10] y [36]), la ovoalbúmina [13] y seroalbúmina humana [11].

Otras proteínas transportadoras incluyen el complejo de proteínas de membrana externa de N. meningitidis [37], péptidos sintéticos [38,39], proteínas de choque térmico [40,41], proteínas tosferínicas [42,43], citocinas [44], linfocinas [44], hormonas [44], factores de crecimiento [44], seroalbúmina humana (normalmente, recombinante), proteínas artificiales que comprenden múltiples epítopos de linfocito T CD4+ humano de diversos antígenos procedentes de patógenos [45] tales como N19 [46], proteína D de H. influenzae [47-49], proteína de la superficie neumocócica PspA [50], neumolisina [51] o sus derivados no tóxicos [52], proteínas de captación de hierro [53], toxina A o B de C.difficile [54], una proteína GBS [55], una proteína GAS [56], etc.

Otras proteínas transportadoras incluyen antígenos proteicos de S. aureus, por ejemplo, los antígenos proteicos de S. aureus que se indican a continuación.

Es posible utilizar más de una proteína transportadora, por ejemplo, para reducir el riesgo de supresión por transportador. Por lo tanto, se pueden utilizar distintas proteínas transportadoras para los polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8, por ejemplo, el polisacárido de tipo 5 podría conjugarse con CRM197 mientras que el polisacárido de tipo 8 podría conjugarse con rEPA. Además, es posible utilizar más de una proteína transportadora para un antígeno de polisacárido particular, por ejemplo, el polisacárido de tipo 5 podría estar en dos grupos, con un grupo conjugado con CRM197 y el otro conjugado con rEPA. Normalmente, sin embargo, se utiliza la misma proteína transportadora para todos los polisacáridos.

Una única proteína transportadora podría transportar más de un antígeno de polisacárido [57,58]. Por ejemplo, una única proteína transportadora podría tener conjugados con ella polisacáridos capsulares de tipo 5 y tipo 8. Para conseguir este objetivo, antes del procedimiento de conjugación se pueden mezclar distintos polisacáridos. Normalmente, sin embargo, hay conjugados distintos para cada polisacárido, mezclándose los distintos polisacáridos después de la conjugación. Los conjugados distintos pueden estar basados en el mismo transportador.

Despolimerización

En la etapa (a) del procedimiento de la invención, el polisacárido capsular se despolimeriza para dar lugar a un fragmento de polisacárido. Se ha informado de la despolimerización del polisacárido capsular de tipo 8 mediante tratamiento con ultrasonidos antes de la conjugación [3]. Los autores concluyeron que el tipo 8 de bajo peso molecular no era inmunogénico. Aunque estos autores favorecieron, por lo tanto, los polisacáridos de alto peso molecular, la presente invención, sorprendentemente, hace uso de fragmentos de polisacáridos con un peso molecular más bajo que los polisacáridos capsulares nativos.

Los polisacáridos de longitud completa se pueden despolimerizar para dar lugar a fragmentos más cortos para su uso en la invención mediante diversos procedimientos. Los inventores han descubierto que los procedimientos que dan como resultado la escisión de enlaces glucosídicos (1 ^ 3) entre los restos a-L-FucNAc(3OAc) y p-D-FucNAc en el polisacárido capsular de tipo 5 son particularmente adecuados. Cuando estos procedimientos se aplican al polisacárido capsular tipo 5, dan como resultado un fragmento de polisacárido que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor. Esta fracción incluye dos grupos hidroxilo próximos. De forma similar, cuando estos procedimientos se aplican al polisacárido capsular tipo 8, se cree que dan como resultado un fragmento de polisacárido que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, fracción que también incluye dos grupos hidroxilo próximos. Los grupos hidroxilo próximos en el fragmento de polisacárido de tipo 5 o tipo 8 proporcionan un asa para la posterior conjugación del fragmento a una molécula transportadora, como se describe a continuación.

Por consiguiente, en el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 que comprende la etapa de despolimerización del polisacárido capsular, para dar lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor. En un aspecto relacionado, también se desvela un procedimiento para el tratamiento de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 que comprende la etapa de despolimerización del polisacárido capsular, para dar lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor. El polisacárido capsular puede ser un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 como se describe anteriormente en "El polisacárido capsular". Además, se desvela un fragmento de polisacárido obtenido u obtenible mediante cualquiera de estos procedimientos.

Los inventores han descubierto que la despolimerización puede llevarse a cabo mediante hidrólisis ácida. Para la hidrólisis ácida, se prefiere utilizar un ácido suave, por ejemplo, ácido acético, para evitar reacciones secundarias en otros grupos dentro del polisacárido. El experto en la materia sería capaz de identificar los ácidos y las condiciones adecuados (por ejemplo, de concentración, temperatura y/o tiempo) para la hidrólisis. Por ejemplo, los inventores han descubierto que es adecuado un tratamiento de un polisacárido a 2 mg/ml con ácido acético al 2 % (v/v) a 90 °C durante 3 horas. Los inventores también han descubierto que es adecuado un tratamiento a 2 mg/ml con ácido acético al 5 % a 90 °C durante 30 minutos, 5 o 6 horas. También puede ser adecuado el tratamiento con otros ácidos, por ejemplo, ácido trifluoroacético u otros ácidos orgánicos. En particular, los inventores han descubierto que se puede aumentar la eficacia de la despolimerización, en particular para el polisacárido capsular de tipo 8, utilizando ácido clorhídrico. Por ejemplo, los inventores han descubierto que es adecuado un tratamiento del polisacárido con ácido clorhídrico 2 M a 100 °C durante 30 minutos. Los inventores también han descubierto que es adecuado un tratamiento con ácido clorhídrico 2 M a 100 °C durante 1, 1,5, 2 o 2,5 horas. Dicho tratamiento con ácido clorhídrico puede dar como resultado la des-O-acetilación del polisacárido, por ejemplo, como se describe a continuación.

Para la despolimerización del polisacárido pueden ser adecuados otros procedimientos. Estos procedimientos incluyen calentamiento, microfuidificación [59], radiación sónica [3], oxidación-reducción [60] u ozonolisis [61].

Los fragmentos de polisacárido se pueden identificar mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño. Las masas moleculares específicas se pueden medir mediante filtración en gel con respecto a patrones de pululano, tal como los disponibles de Polymer Standard Service [62]. Normalmente, el fragmento utilizado en la invención es una mezcla de fragmentos con masas dentro de un intervalo de valores. Para el polisacárido capsular de tipo 5 despolimerizado, la masa molecular del fragmento varía normalmente varía entre 1-500 kDa, por ejemplo, entre 5 y 100 kDa, particularmente entre 10 y 50 kDa y más particularmente entre 20 y 30 kDa. De forma similar, para el polisacárido capsular de tipo 8 despolimerizado, la masa molecular del fragmento puede variar entre 1-500 kDa, por ejemplo, entre 5 y 100 kDa, particularmente entre 10 y 50 kDa y más particularmente entre 20 y 30 kDa. En algunas realizaciones, se seleccionan fragmentos de polisacárido de tipo 5 y/o de tipo 8 de bajo peso molecular para su uso en la invención. Por ejemplo, las fracciones de filtración en gel correspondientes a fragmentos de bajo peso molecular pueden seleccionarse y agruparse. Los fragmentos de polisacárido de bajo peso molecular tienen normalmente una masa molecular que varía entre 5 y 20 kDa.

La despolimerización puede dar como resultado un cambio en el grado de O-acetilación del polisacárido capsular. Por ejemplo, los inventores han descubierto que la hidrólisis ácida puede dar como resultado una disminución del grado de O-acetilación. En algunas realizaciones, el grado de O-acetilación del fragmento puede ser del 10-90 %, 20-70 %, 30-50 %, particularmente del 35-45 %. En otras realizaciones, el grado de O-acetilación del fragmento puede ser del 0-10 %, 0-5 %, 0-2 %, particularmente del 0 %.

Introducción de un grupo aldehido

En la etapa (b) del procedimiento, el fragmento se oxida para introducir un grupo aldehído en al menos un resto de sacárido en el fragmento. Esta etapa puede implicar la introducción de más de un grupo aldehído en el resto de sacárido. En particular, se pueden introducir dos grupos aldehído. Por ejemplo, cuando la despolimerización de la etapa (a) da como resultado un fragmento de polisacárido de tipo 5 que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, los dos grupos hidroxilo próximos en esta fracción se pueden oxidar para introducir dos grupos aldehído en la fracción. De esta manera, la fracción p-D-FucNAc-(1 ^ puede ser el resto de sacárido de la etapa (b). De forma similar, cuando la despolimerización da como resultado un fragmento de polisacárido de tipo 8 que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, los dos grupos hidroxilo próximos en esta fracción se pueden oxidar para introducir dos grupos aldehído. De esta manera, la fracción a-D-FucNAc-(1 ^ puede ser el resto de sacárido de la etapa (b).

Por consiguiente, en el presente documento se desvela un procedimiento para proporcionar un derivado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5, que comprende la etapa de oxidación de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en dos grupos aldehído. En un aspecto relacionado, también se desvela un procedimiento para proporcionar un derivado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8, que comprende la etapa de oxidación de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en dos grupos aldehído. El polisacárido capsular puede ser un fragmento de polisacárido como se describe anteriormente en "Despolimerización". Además se desvela un derivado de polisacárido capsular de S. aureus obtenido u obtenible mediante cualquiera de estos procedimientos.

Las reacciones típicas para producir aldehídos incluyen el uso de sales de peryodato y, en particular, metaperyodatos (por ejemplo, metaperyodato de sodio o potasio, por ejemplo, NaIO4), para oxidar grupos hidroxilo próximos [63]. El experto en la materia sería capaz de identificar las condiciones adecuadas para la oxidación. Por ejemplo, los inventores han descubierto que es adecuado un tratamiento de polisacárido a 2 mg/ml con NaIO⁴ en una relación(p/p) de 1:1 a temperatura ambiente durante 1-2 horas en la oscuridad. Los inventores también han descubierto que es adecuado un tratamiento de polisacárido a 2 mg/ml con NaIO⁴93 mM a temperatura ambiente durante 8 horas en la oscuridad. Se pueden utilizar otras condiciones de oxidación, por ejemplo, el uso de tetróxido de osmio, etc.

Acoplamiento a una molécula transportadora

El acoplamiento del resto de sacárido oxidado a la molécula transportadora en la etapa (c) del procedimiento puede ser directo o mediante un engarce. Si se desea puede utilizarse cualquier reacción de conjugación adecuada, con cualquier engarce adecuado.

Cuando la oxidación de la etapa (b) da como resultado un fragmento de polisacárido de tipo 5 que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, en que se han introducido dos grupos aldehido en la fracción, el acoplamiento en la etapa (c) puede ser a través de uno de estos grupos aldehido. De esta manera, la fracción p-D-FucNAc-(1 ^ oxidada puede ser el resto de sacárido oxidado de la etapa (c). De forma similar, cuando la oxidación da como resultado un fragmento de polisacárido de tipo 8 que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en el extremo no reductor, en que se han introducido dos grupos aldehido en la fracción, el acoplamiento en la etapa (c) puede ser a través de uno de estos grupos aldehido. De esta manera, la fracción a-D-FucNAc-(1 ^ oxidada puede ser el resto de sacárido oxidado de la etapa (c).

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento para proporcionar un conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 que comprende la etapa de acoplamiento a una molécula transportadora de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, que se ha oxidado para convertir dos grupos hidroxilo próximos en dos grupos aldehido, en el que el acoplamiento es a través de uno de los grupos aldehido. En un aspecto relacionado, la invención proporciona un procedimiento para proporcionar un conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 que comprende la etapa de acoplamiento a una molécula transportadora de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, que se ha oxidado para convertir dos grupos hidroxilo próximos en dos grupos aldehido, en el que el acoplamiento es a través de uno de los grupos aldehido. El polisacárido capsular puede ser un polisacárido capsular como se describe anteriormente en "Introducción de un grupo aldehido". La molécula transportadora puede ser un transportador como se describe anteriormente en "La molécula transportadora" encima. La invención también proporciona un polisacárido capsular conjugado obtenido u obtenible mediante cualquiera de estos procedimientos.

La unión del resto de sacárido oxidado o engarce al transportador es normalmente a través de un grupo amina (-NH²), por ejemplo, en la cadena lateral de una lisina o un resto en una proteina transportadora, o de un resto de arginina. La unión al transportador también puede ser a través de un grupo sulfidrilo (-SH), por ejemplo, en la cadena lateral de un resto de cisterna. Los inventores han descubierto que el acoplamiento directo puede lograrse convenientemente haciendo reaccionar un grupo aldehido en el resto de sacárido oxidado con un grupo amina en el transportador mediante aminación reductora. Por lo tanto, en la presente invención se prefiere el acoplamiento directo de esta naturaleza. Por el contrario, la referencia 2 sugiere que los engarces pueden ser ventajosos en los conjugados de S. aureus de tipo 5 y 8. Si se desea, en la presente invención puede utilizarse el acoplamiento a través de un engarce, por ejemplo, haciendo reaccionar un grupo aldehido en el resto de sacárido oxidado con un grupo amina en el engarce mediante aminación reductora, o convirtiendo el grupo aldehido en un grupo amina mediante aminación reductora, para proporcionar un grupo amina para la unión del engarce.

La aminación reductora es una técnica convencional en quimica orgánica y se ha utilizado ampliamente en la producción de conjugados de polisacáridos capsulares para uso en vacunas, entre ellos los polisacáridos capsulares de S. aureus [10]. En una realización, un grupo aldehido en el resto de sacárido oxidado reacciona con un grupo amina en el transportador o engarce. Esto se puede lograr de manera conveniente combinando el polisacárido con el transportador o engarce en presencia de un agente reductor apropiado (por ejemplo, cianoborohidruros, tales como cianoborohidruro de sodio NaBH^aCN; borano-piridina; triacetoxiborohidruro de sodio; resina de intercambio de borohidruro; etc.). En otra realización, un grupo aldehido se convierte en un grupo amina mediante aminación reductora para proporcionar un grupo amina para la unión del engarce. La aminación reductora implica amoniaco o una amina primaria (NH²R). Esto se puede lograr convenientemente utilizando una sal de amonio (por ejemplo, cloruro de amonio) en combinación con un agente reductor apropiado (por ejemplo, como se enumera anteriormente). El experto en la materia seria capaz de identificar las condiciones adecuadas para la aminación reductora. Por ejemplo, los inventores han descubierto que es adecuado el tratamiento de un polisacárido a 10 mg/ml con proteina transportadora en una relación (p/p) de polisacárido:proteina de 4:1 y NaBH^aCN en una relación de polisacárido:NaBH^aCN de 2:1. El acoplamiento a través de un grupo de engarce se pueden realizar utilizando cualquier procedimiento conocido, por ejemplo, los procedimientos de aminación reductora descritos anteriormente. En una realización, se puede utilizar un engarce bifuncional para proporcionar un primer grupo para acoplar al grupo aldehido en el resto de sacárido oxidado y un segundo grupo para acoplar al transportador. Por ejemplo, se puede utilizar un engarce bifuncional de fórmula X¹-L-X², en que X¹ puede reaccionar con el aldehido; X² puede reaccionar con transportador; y L es una fracción enlazadora en el engarce. Un grupo X¹ tipico es un grupo amina. Los grupos L tipicos son alquilos de cadena lineal con 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, C¹, C², C³ , C⁴, C⁵ , C⁶ , C⁷, C^e , C^g, C¹⁰) por ejemplo -(CH²)⁴- o -(CH²)^a-. En otra realización, se puede utilizar un engarce bifuncional para proporcionar un primer grupo para acoplar a un grupo amina derivado del grupo aldehido en el resto de sacárido oxidado (por ejemplo, mediante aminación reductora como se describe anteriormente) y un segundo grupo para acoplar al transportador (normalmente, para el acoplamiento a una amina en el transportador). Por ejemplo, se puede utilizar un engarce homobifuncional de fórmula X-L-X, en que los dos grupos X son iguales entre sí y pueden reaccionar con las aminas; y en que L es una fracción enlazadora en el engarce. Un grupo X típico es N-oxisuccinimida. L tiene normalmente la fórmula -L'-L²-L'-, en que L' es carbonilo. Los grupos L² típicos son alquilos de cadena lineal con 1 a 10 átomos de carbono (por ejemplo, C¹, C², C³ , C⁴, C⁵ , C^e, C⁷ , C⁸ , C⁹ , C¹⁰) por ejemplo -(CH²)⁴-. Por lo tanto, un engarce típico es el diéster de N-hidroxisuccimimida diéster del ácido adípico (SIDEA):

Otros grupos X son los que forman ésteres cuando se combinan con HO-L-OH, tal como norbornano, ácido pnitrobenzoico y sulfo-N-hidroxisuccinimida. Otros engarces bifuncionales reactivos con aminas para su uso con la invención incluyen haluros de acriloílo (por ejemplo, cloruro) [65], haloacilhaluros [66], glutarato de disuccinimidilo, suberato de disuccinimidilo, bis[succinimidilsuccinato] de etilenglicol, etc.

El engarce generalmente se añadirá en exceso molar al polisacárido. La reacción del engarce/polisacárido generalmente tendrá lugar en un disolvente aprótico (por ejemplo, DMSO, acetato de etanol, etc.), ya que los engarces son normalmente insolubles en agua. Sin embargo, cuando se utilicen engarces solubles en agua, está disponible entonces una gama más amplia de disolventes, incluidos los disolventes próticos tales como el agua. Los engarces adecuados incluyen formas sulfonadas, tales como SIDEA sulfonado:

Cuando se utilice un engarce, el conjugado comprenderá una fracción de engarce. Esta fracción no se origina ni en el polisacárido ni en el transportador, sino que es una tercera molécula utilizada durante la preparación del conjugado, y se puede distinguir fácilmente tanto del polisacárido como de la proteína transportadora en un producto conjugado final. La fracción de engarce puede incluir átomos tales como carbono, hidrógeno, oxígeno y/o nitrógeno. Son típicos los engarces que comprenden carbono e hidrógeno, y también se utilizan normalmente engarces que comprenden adicionalmente oxígeno y/o nitrógeno. Los engarces que incluyen átomos de nitrógeno pueden incluir un átomo de carbono enlazado a un átomo de nitrógeno, que a su vez está enlazado a un segundo átomo de carbono (-C-N-C-). Los engarces que incluyen un átomo de oxígeno normalmente lo incluyen como parte de un grupo carbonilo. Son típicas las fracciones de engarce con un peso molecular de entre 30-500 Da. Además, son típicos los engarces que contienen dos grupos carbonilo.

Una fracción de engarce particularmente útil es -NH-C(O)-(CH²)ⁿ-C(O)-, en la que n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10. El valor de n es normalmente de 4. El -NH- terminal de este engarce habitualmente está unido a un átomo de carbono de la fracción de polisacárido. El -C(O)-terminal habitualmente está unido a un átomo de nitrógeno en una cadena lateral de aminoácidos en el transportador. Se puede introducir convenientemente una fracción de engarce preferida mediante un procedimiento que implica: aminación reductora del aldehído en el resto de sacárido oxidado; reacción del grupo -NH2 resultante con un engarce bifuncional que es un diéster (por ejemplo, un disuccinimidil éster) de un ácido dioico (por ejemplo, de ácido adípico, HOOC-(CH²)⁴-COOH); y aminación reductora del producto (véase la Figura 6 [64]).

Otras químicas que pueden utilizarse para unir un engarce a un grupo -NH2 en el polisacárido, incluyen:

- acriloilación (por ejemplo, mediante reacción con cloruro de acriloílo), seguido de la adición de tipo Michael a la £-NH² de una cadena lateral de aminoácido o a un -SH de una cadena lateral de cisteína [65]. El engarce resultante es -NH-C(O)-(CH²)²-(propionamido).

- reacción con un haloacilhaluro, seguido de la reacción con la £-NH2 de una cadena lateral de aminoácido o con un -SH de una cadena lateral de cisteína [66]. El engarce es -NH-C(O)-CH2-.

Normalmente se producen mediante el procedimiento de la invención conjugados con una relación (p/p) de polisacárido:proteína de entre 1:20 (es decir, proteína en exceso) y 20:1 (es decir, polisacárido en exceso). Se prefieren relaciones de 1:10 a 1:1, en particular, relaciones entre 1:5 y 1:2 y, muy preferentemente, de aproximadamente 1:3. Por el contrario, los conjugados de polisacárido capsular de tipo 5 y tipo 8 fabricados mediante procedimientos de la técnica anterior tienden a tener relaciones más altas, por ejemplo, entre 0,73:1 y 1,08:1 en las referencias 1, 2 y 3. En realizaciones particulares de la invención, la relación (p/p) de polisacárido:proteína para el conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 está entre 1:10 y 1:2; y/o la relación (p/p) de polisacárido:proteína para el conjugado de polisacárido capsular de tipo 8 está entre 1:5 y 7:10.

Las composiciones pueden incluir una pequeña cantidad de transportador libre [67]. Cuando una proteína transportadora dada está presente tanto en forma libre como conjugada en una composición de la invención, la forma no conjugada es preferentemente no más del 5 % de la cantidad total de la proteína transportadora en la composición en su totalidad, y más preferentemente está presente en menos del 2 % en peso.

Después de la conjugación, los polisacáridos libres y conjugados se pueden separar. Hay muchos procedimientos adecuados, incluida la cromatografía hidrófoba, la ultrafiltración tangencial, la diafiltración etc. [véanse también las ref.

68 y 69, etc.].

Combinaciones de conjugados y otros antígenos

Además de proporcionar conjugados individuales como se describe anteriormente, la invención proporciona una composición que comprende un conjugado de la invención y uno o más antígenos adicionales. La composición es normalmente una composición inmunogénica.

El antígeno (o antígenos) adicional puede comprender conjugados adicionales de la invención, por lo que la invención proporciona una composición que comprende más de un conjugado de la invención. En particular, la presente invención proporciona una composición que comprende un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 de la invención y un conjugado de polisacárido capsular de tipo 8 de la invención. Como alternativa, el antígeno o antígenos adicionales pueden ser conjugados de polisacárido capsular de tipo 5 o tipo 8 preparados mediante procedimientos distintos a los de la invención, por ejemplo, los procedimientos de las referencias 1 a 13 anteriores. El antígeno o antígenos adicionales pueden ser, de manera similar, conjugados de polisacárido capsular de tipo 5 o tipo 8 preparados mediante los procedimientos de las referencias 59, 70, 71, 72, 73 y 74, y particularmente los procedimientos ejemplificados en esos documentos. Por consiguiente, la invención proporciona una composición que comprende un conjugado de polisacárido capsular de tipo 5 y un conjugado de polisacárido capsular de tipo 8, en la que uno de los conjugados (el conjugado de tipo 5 o el conjugado de tipo 8) es un conjugado de la invención y el otro conjugado no es un conjugado de la invención.

El antígeno o antígenos adicionales pueden comprender otros antígenos de S. aureus, entre ellos antígenos proteicos y de sacáridos, como se indica a continuación.

El antígeno o antígenos adicionales pueden comprender antígenos de patógenos que no sean S. aureus. Por lo tanto, las composiciones de la invención pueden comprender adicionalmente uno o más antígenos que no sean de S. aureus, entre ellos antígenos adicionales bacterianos, víricos o parasitarios. Estos pueden seleccionarse de los siguientes:

- un antígeno proteico de N. meningitidis, serogrupo A, como los de las ref. 75 a 81, siendo particularmente útiles la proteína '287' (ver a continuación) y derivados (por ejemplo, 'AG287').

- una preparación de vesículas de membrana externa (OMV, forma siglada de outer-membrane vesicles) de N. meningitidis serogrupo B, tales como los desvelados en las ref. 82, 83, 84, 85 etc.

- un antígeno de sacárido de N. meningitidis serogrupo A, C, W135 y/o Y, tal como el oligosacárido desvelado en la ref. 86 del serogrupo C o los oligosacáridos de la ref. 87.

- un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, las ref. 88-90; capítulos 22 y 23 de la ref. 97]. - un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 91, 92; capítulo 15 de la ref. 97]. - un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o central [por ejemplo, 92,93; capítulo 16 de la ref. 97].

- un antígeno del virus de la hepatitis C, [por ejemplo, 94].

- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como la holotoxina pertúsica (PT) y la hemaglutinina filamentosa (FHA) de B. pertussis, opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo. las ref.

95 y 96; capítulo 21 de la ref. 97].

- un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico por ejemplo, [capítulo 13 de la ref. 97].

- un antígeno del tétanos, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo, capítulo 27 de la ref. 97].

- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, el capítulo 14 de la ref. 97]

- un antígeno de N. gonorrhoeae [por ejemplo, 75, 76, 77].

- un antígeno de Chlamydia pneumoniae [por ejemplo, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104].

- un antígeno de Chlamydia trachomatis [por ejemplo, 105].

- un antígeno de Porphyromonas gingivalis [por ejemplo, 106].

- antígeno (o antígenos) de polio [por ejemplo, 107, 108; capítulo 24 de la ref. 97], tal como IPV.

- antígeno (o antígenos) de la rabia [por ejemplo, 109], tal como virus inactivados liofilizados [por ejemplo, 110, RabAvert™].

- antígenos del sarampión, de las paperas y/o la rubéola [por ejemplo, capítulos 19, 20 y 26 de la ref. 97].

- antígeno (o antígenos) de la gripe [por ejemplo, capítulos 17 y 18 de la ref. 97], tal como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.

- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 111].

- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 112, 113, 114].

- un antígeno de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 56, 115-117].

- un antígeno de S. epidermidis [por ejemplo, polisacárido capsular de tipo I, II y/o III obtenible de las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10, como se describe en las ref. 118, 119 y 120.

Cuando se utiliza un antígeno de sacárido o carbohidrato, normalmente se conjuga con un transportador para potenciar la inmunogenicidad. La conjugación de antígenos de sacárido de H. influenzae B, meningocócicos y neumocócicos es muy conocida.

En caso necesario, los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse (por ejemplo, destoxificación de toxina tosferínica por medios químicos y/o genéticos [96]).

Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, es típico incluir también un antígeno del tétanos y antígenos tosferínicos. De forma similar, cuando se incluye un antígeno del tétanos, también es típico incluir antígenos de difteria y tosferínicos. De forma similar, cuando se incluye un antígeno de tosferínico, también es típico incluir antígenos de difteria y tétanos.

Los antígenos se pueden adsorber en una sal de aluminio.

Un tipo de composición preferida incluye antígenos adicionales que afectan al inmunodeprimido, por lo que los conjugados de S. aureus de la invención se pueden combinar con uno o más antígenos de los siguientes patógenos que no son S. aureus: Steptococcus agalactiae, Staphylococcus epidermis, virus de la gripe, Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis y virus paragripal.

Otro tipo de composición preferida incluye antígenos adicionales de bacterias asociadas a infecciones hospitalarias, por lo que los conjugados de S. aureus de la invención se pueden combinar con uno o más antígenos de los siguientes patógenos que no son S. aureus: Clostridium difficile; Pseudomonas aeruginosa; Candida albicans; y Escherichia coli extraintestinal patógena.

Los antígenos en la composición estarán normalmente presentes a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para suscitar una respuesta inmunitaria contra ese antígeno.

Como alternativa al uso de antígenos proteicos en la composición de la invención, puede utilizarse ácido nucleico que codifique el antígeno [por ejemplo, ref. 121 a 129]. Por lo tanto, los componentes proteicos de las composiciones de la invención pueden reemplazarse por un ácido nucleico (normalmente ADN, por ejemplo, en forma de plásmido) que codifica la proteína.

En términos prácticos, puede haber un límite superior para el número de antígenos incluidos en las composiciones de la invención. El número de antígenos (incluidos los antígenos de S. aureus) en una composición de la invención puede ser de menos de 20, de menos de 19, de menos de 18, de menos de 17, de menos de 16, de menos de 15, de menos de 14, de menos de 13, de menos de 12, de menos de 11, de menos de 10, de menos de 9, de menos de 8, de menos de 7, de menos de 6, de menos de 5, de menos de 4 o de menos de 3. El número de antígenos de S. aureus en una composición de la invención puede ser de menos de 6, de menos de 5 o de menos de 4.

Composiciones y procedimientos farmacéuticos

La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (a) un conjugado de la invención y (b) un transportador farmacéuticamente aceptable. Los 'transportadores farmacéuticamente aceptables' típicos incluyen cualquier transportador que no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición. Normalmente, los transportadores adecuados son grandes, macromoléculas metabolizadas lentamente tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, sacarosa [130], trehalosa [131], lactosa y agregados lipídicos (tales como gotas de aceite o liposomas). Dichos transportadores son muy conocidos por los expertos en la materia. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Adicionalmente, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Es un transportador típico la solución salina fisiológica tamponada con fosfato estéril sin pirógenos. En la referencia 132 se encuentra disponible un análisis detallado de los excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones de la invención pueden estar en una forma acuosa (es decir, soluciones o suspensiones) o en una forma seca (por ejemplo, liofilizadas). Si se utiliza una vacuna seca, se reconstituirá en un medio líquido antes de la inyección. La liofilización de vacunas conjugadas es conocida en la técnica, por ejemplo, el producto Menjugate™ se presenta en forma liofilizada, mientras que NeisVac-C™ y Meningitec™ se presentan en forma acuosa. Para estabilizar conjugados durante la liofilización, puede ser típico incluir en la composición un alcohol de azúcar (por ejemplo, manitol) o un disacárido (por ejemplo, sacarosa o trehalosa), por ejemplo, entre a 1 mg/ml y 30 mg/ml (por ejemplo, aproximadamente 25 mg/ml).

Las composiciones pueden presentarse en viales o pueden presentarse en jeringuillas precargadas. Las jeringuillas se pueden suministrar con o sin agujas. Una jeringuilla incluirá una dosis única de la composición, mientras que un vial puede incluir una dosis única o múltiples dosis.

Las composiciones acuosas de la invención también son adecuadas para reconstituir otras vacunas a partir de una forma liofilizada. Cuando se vaya a utilizar una composición de la invención para tal reconstitución extemporánea, la invención proporciona un kit, que puede comprender dos viales o puede comprender una jeringuilla precargada y un vial, utilizándose los contenidos de la jeringuilla para reactivar el contenido del vial antes de la inyección.

Las composiciones de la invención pueden envasarse en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiples. Para formas de dosis múltiples, se prefieren los viales a las jeringuillas precargadas. Los volúmenes de dosificación eficaces se pueden establecer de forma rutinaria, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de 0,5 ml, por ejemplo, para inyección intramuscular.

El pH de la composición está normalmente entre 6 y 8, por ejemplo, alrededor de 7. Puede mantenerse un pH estable mediante el uso de un tampón. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, es típico utilizar un tampón de histidina [133]. La composición puede ser estéril y/o estar exenta de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a los seres humanos.

Las composiciones de la invención son inmunogénicas y más preferentemente son composiciones de vacuna. Las composiciones que comprenden vacunas de acuerdo con la invención pueden ser o bien profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacuna comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno (o antígenos), así como cualquier otro componente, según sea necesario. Por 'cantidad inmunológicamente eficaz', se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo del estado de salud y físico del individuo que se vaya a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo que se vaya a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico responsable y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre dentro de un intervalo relativamente amplio que puede determinarse mediante ensayos rutinarios.

Dentro de cada dosis, la cantidad de un antígeno de sacárido individual estará generalmente entre 1-50 |jg (medido como masa de sacárido), por ejemplo, aproximadamente 1 jg , aproximadamente 2,5 jg , aproximadamente 4 jg , aproximadamente 5 jg o aproximadamente 10 jg .

S. aureus afecta a diversas zonas del cuerpo y, por lo tanto, las composiciones de la invención se pueden preparar de diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. La composición puede prepararse para administración pulmonar, por ejemplo, en forma de un inhalador, utilizando un polvo fino o un aerosol. La composición puede prepararse en forma de un supositorio o óvulo vaginal. La composición puede prepararse para administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como un aerosol, gotas, gel o polvo [por ejemplo, las ref. 134 y 135]. Se ha informado el éxito con la administración nasal de sacáridos neumocócicos [136, 137], sacáridos de Hib [138], sacáridos de MenC [139] y de mezclas de conjugados de sacáridos de Hib y MenC [140].

Las composiciones de la invención pueden incluir un antimicrobiano, particularmente cuando se envasa en formato de dosis múltiples.

Las composiciones de la invención pueden comprender detergente, por ejemplo, un Tween (polisorbato), tal como Tween 80. Los detergentes generalmente están presentes en niveles bajos, por ejemplo, <0,01 %.

Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (por ejemplo, cloruro de sodio) para proporcionar tonicidad. Es típica una concentración de NaCl 10+2 mg/ml.

Las composiciones de la invención incluirán generalmente un tampón. Es típico un tampón de fosfato.

Las composiciones de la invención generalmente se administrarán junto con otros agentes inmunorreguladores. En particular, las composiciones habitualmente incluirán uno o más adyuvantes. Dichos adyuvantes incluyen, pero sin limitación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en las composiciones de la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. Las composiciones de la invención pueden incluir sales minerales tales como hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la ref. 141], o mezclas de distintos compuestos minerales (por ejemplo, una mezcla de un adyuvante de fosfato y uno de hidróxido, opcionalmente con un exceso del fosfato), tomando los compuestos cualquier forma adecuada (por ejemplo, gel, cristalina, amorfa, etc.), y siendo típica la adsorción a la sal (o sales). Las composiciones que contienen minerales también pueden formularse como una partícula de sal metálica [142].

En las vacunas que comprenden composiciones de la invención se pueden incluir sales de aluminio de manera que la dosis de Al3+ esté entre 0,2 y 1,0 mg por dosis.

Un adyuvante de fosfato de aluminio típico es el hidroxifosfato de aluminio amorfo con una relación molar de PO^Al de entre 0,84 y 0,92, incluido a 0,6 mg de Al3+/ml. Puede utilizarse la adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio, por ejemplo, entre 50 y 100 |jg de Al3+ por conjugado por dosis. Cuando se utiliza fosfato de aluminio y no se desea adsorber un antígeno en el adyuvante, esto se ve favorecido por la inclusión de iones fosfato libres en solución (por ejemplo, mediante el uso de un tampón fosfato).

B. Emulsiones oleosas

Las composiciones de emulsión oleosa adecuadas para su uso como adyuvantes incluyen emulsiones de escualenoagua, tales como MF59 (escualeno al 5 %, Tween 80 al 0,5 % y Span 85 al 0,5 %, formulados en partículas submicrométricas utilizando un microfluidizador) [Capítulo 10 de la ref. 141; véanse también las ref. 143-145]. MF59 se utiliza como adyuvante en la vacuna antigripal a subunidades trivalente FLUAD™.

Los adyuvantes particularmente útiles para su uso en las composiciones son las emulsiones submicrométricas de aceite en agua. Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas preferidas para su uso en el presente documento son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente cantidades variables de MTP-PE, tal como una emulsión submicrométrica de aceite en agua que contiene escualeno al 4-5% p/v, Tween 80 al 0,25-1,0% p/v (monooleato de polioxietilensorbitano) y/o Span 85 al 0,25-1,0% (trioleato de sorbitano) y, opcionalmente, N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosfoforiloxi)-etilamina (MTP-PE). En las referencias 143 y 146-147 se describen en detalle emulsiones submicrométricas de aceite en agua, procedimientos de fabricación de las mismas y agentes inmunoestimulantes, tales como péptidos de muramilo, para su uso en las composiciones.

Además, se pueden utilizar como adyuvantes el adyuvante completo de Freund (ACF) y el adyuvante incompleto de Freund (AIF).

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 1411

Además, pueden utilizarse como adyuvantes formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoides que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. Las saponinas aisladas de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina se han estudiado extensamente como adyuvantes. La saponina también se puede obtener en el mercado de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officinalis (hierba jabonera). Las formulaciones adyuvantes de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones lipídicas, tales como los ISCOM (forma siglada de immunostimulating complex, complejo inmunoestimulante).

Las composiciones de saponina se han purificado utilizando HPLC y RP-HPLC. Se han identificado las fracciones purificadas específicas que utilizan estas técnicas, entre ellas QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C. Preferentemente, la saponina es QS21. En la ref. 148 se desvela un procedimiento de producción de QS21. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como el colesterol [149].

Las combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden utilizar para formar partículas singulares llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM) (capítulo 23 de la ref. 141). Normalmente, los ISCOM también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. En los ISCOM se puede utilizar cualquier saponina conocida. Preferentemente, el ISCOM incluye uno o más de QuilA, QHA y QHC. Los ISCOM se describen adicionalmente en las ref. 149-151. Opcionalmente, los ISCOM puede carecer de un detergente (o detergentes) adicional [152].

Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponina se puede encontrar en las ref. 153 y 154.

D. Virosomas y partículas similivíricas

Además, se pueden utilizar como adyuvantes en la divulgación virosomas y partículas similivíricas (las VLP, forma siglada de virus-like particles). Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinadas o formuladas con un fosfolípido. Generalmente son no patógenos, no se replican y generalmente no contienen nada del genoma vírico nativo. Las proteínas víricas pueden producirse de forma recombinante o aislarse a partir de virus completos. Estas proteínas víricas, adecuadas para su uso en virosomas o en las VLP, incluyen proteínas procedentes del virus de la gripe (tales como la HA o la NA), virus de la hepatitis B (tales como las proteínas central o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, virus Sindbis, rotavirus, y virus de la fiebre aftosa, retrovirus, virus de Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos Qp (tales como las proteínas de la cubierta), fagos GA, fagos fr, fagos AP2o5 y Ty (tales como la proteína p1 del retrotransposón Ty). Las VLP se analizan adicionalmente en las ref. 155-160. Los virosomas se analizan adicionalmente, por ejemplo, en la ref. 161

E. Derivados bacterianos o microbianos

Los adyuvantes adecuados incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido (LPS) enterobacteriano, derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de los mismos.

Los derivados no tóxicos de LPS incluyen monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3-O-desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 o 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferente de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado se desvela en la ref. 162. Dichas "pequeñas partículas" de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para filtrarse de forma estéril a través de una membrana de 0,22 pm [162]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen miméticos de monofosforil lípidos A, tales como derivados de fosfato de aminoalquil glucosaminida, por ejemplo, RC-529 [163, 164].

Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli, tales como OM-174. OM-174 se describe, por ejemplo, en las ref. 165 y 166.

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes incluyen secuencias nucleotídicas que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleotídica que contiene una citosina no metilada unida mediante un enlace fosfato a una guanosina). Además, se ha demostrado que los ARN bicatenarios y los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) son inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótido tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Las referencias 167, 168 y 169 desvelan posibles sustituciones análogas, por ejemplo, la sustitución de guanosina por 2'-desoxi-7-desazaguanosina. El efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG se analiza adicionalmente en las ref. 170-175.

La secuencia CpG puede dirigirse al TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT (176). La secuencia CpG puede ser específica para la inducción de una respuesta inmunitaria Th1, tal como un ODN CpG-A, o puede ser más específica para la inducción de una respuesta de linfocitos B, tal como un ODN CpG-B. Los ODN CpG-A y CpG-B se analizan en las ref. 177-179. Preferentemente, el CpG es un ODN CpG-A.

Preferentemente, el oligonucleótido CpG se construye de modo que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento del receptor. Opcionalmente, pueden unirse en sus extremos 3' dos secuencias de oligonucleótido CpG para formar "inmunómeros". Véanse, por ejemplo, las ref. 176 y 180-182.

Se pueden utilizar como adyuvantes toxinas ribosilantes de ADP bacterianas y derivados destoxificados de las mismas. Preferentemente, la proteína se obtiene de E. coli (enterotoxina termolábil "LT" de E. coli), cólera ("CT") o pertussis ("PT"). El uso de toxinas ribosilantes de ADP destoxificadas como adyuvantes de la mucosa se describe en la ref. 183, y como adyuvantes parenterales en la ref. 184. La toxina o toxoide está preferentemente en forma de una holotoxina, que comprende las subunidades A y B. Preferentemente, la subunidad A contiene una mutación destoxificante; preferentemente, la subunidad B no está mutada. Preferentemente, el adyuvante es un mutante de LT destoxificado tal como LT-K63, LT-R72 y LT-G192. El uso como adyuvantes de toxinas ribosilantes de ADP y sus derivados destoxificados, particularmente LT-K63 y LT-R72, se puede encontrar en las ref. 185-192. La referencia numérica para las sustituciones de aminoácido se basa preferentemente en los alineamientos de las subunidades A y B de las toxinas ribosilantes de ADP expuestos en la ref. 193.

F. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen citocinas, tales como las interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, lL-6, IL-7, IL-12 [194], etc.) [195], interferones (por ejemplo, interferón y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

G. Bioadhesivos y mucoadhesivos

Además, pueden utilizarse como adyuvantes bioadhesivos y mucoadhesivos. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado [196] o mucoadhesivos tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa. Además, pueden utilizarse como adyuvantes el quitosano y derivados del mismo [197].

H. Micropartículas

Además, pueden utilizarse como adyuvantes micropartículas. Las micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 |jm de diámetro, más preferentemente, de ~200 nm a ~30 jm de diámetro y muy preferentemente, de ~500 nm a ~10Mm de diámetro) formadas de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(ahidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida-co-glicólido) son preferentes, tratadas opcionalmente para tener una superficie con carga negativa (por ejemplo, con SDS) o una superficie con carga positiva (por ejemplo, con un detergente catiónico, tal como CTAB).

I. Liposomas (capítulos 13 y 14 de la ref. 141)

En las ref. 198-200 se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes.

J. Formulaciones polioxietilen éter y polioxietilen éster

Los adyuvantes adecuados incluyen de polioxietilén éteres y polioxietilén ésteres [201]. Dichas formulaciones incluyen adicionalmente tensioactivos de polioxietilén sorbitano en combinación con un octoxinol [202], así como polioxietilén alquil éteres o tensioactivos de éster en combinación con al menos un tensioactivo no iónico adicional, tal como un octoxinol [203]. Los polioxietilén éteres preferidos se seleccionan del siguiente grupo: polioxietilén-9-lauril éter (laureth 9), polioxietilén-9-esteoril éter, polioxietilén-8-esteoril éter, polioxietilén-4-lauril éter, polioxietilén-35-lauril éter y polioxietilén-23-lauril éter.

K. Polifosfaceno (PCPP)

Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, en las ref. 204 y 205.

L. Muramil péptidos

Los ejemplos de muramil péptidos adecuados para su uso como adyuvantes incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE).

M. Compuestos de imidazoquinolona.

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M"), descritos adicionalmente en las ref. 206 y 207.

N. Compuestos de tiosemicarbazona.

Los ejemplos de compuestos de tiosemicarbazona, así como los procedimientos de formulación, fabricación y cribado de los compuestos, todos adecuados para su uso como adyuvantes, incluyen los descritos en la ref. 208. Las tiosemicarbazonas son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

O. Compuestos de triptantrina.

Los ejemplos de compuestos de triptantrina, así como los procedimientos de formulación, fabricación y cribado de los compuestos, todos adecuados para su uso como adyuvantes, incluyen los descritos en la ref. 209. Los compuestos de triptantrina son particularmente eficaces en la estimulación de células mononucleares de sangre periférica humanas para la producción de citocinas, tales como TNF-a.

Las composiciones de la invención también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, pueden utilizarse como composiciones adyuvantes las siguientes combinaciones: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [210]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) y un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) [211]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado no tóxico de LPS (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [212]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [213]; (6) SAF, que contiene escualano al 10 %, Tween 80™ al 0,4 %, polímero de bloques pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya esté microfluidificados en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de mayor tamaño de partícula. (7) sistema adyuvante Ribi™ (SAR), (Ribi Immunochem), que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforil lípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y estructura de pared celular (CWS, forma siglada de cell wall skeleton), preferentemente MPL CWS (Detox™); y (8) una o más sales minerales (tal como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).

Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se desvelan en el capítulo 7 de la ref. 141.

El uso de adyuvantes de sal de aluminio es particularmente útil, y los antígenos generalmente se adsorben en tales sales. Los conjugados Menjugate™ y NeisVac™ utilizan un adyuvante de hidróxido, mientras que Meningitec™ utiliza un adyuvante de fosfato. En las composiciones de la invención, es posible adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. Normalmente, sin embargo, solo se utiliza una sal, por ejemplo, un hidróxido o un fosfato, pero no ambas. No todos los conjugados necesitan adsorberse, es decir, todos o algunos pueden estar en solución.

Procedimientos de tratamiento

Cualquier referencia en el presente documento a procedimientos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

La invención también proporciona un procedimiento para la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero. La respuesta inmunitaria es preferentemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos. El procedimiento puede generar una respuesta reforzadora.

El mamífero es preferentemente un ser humano. Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferentemente un adulto. Una vacuna destinada a niños también se puede administrar a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, la dosificación, la inmunogenicidad, etc. Una clase de seres humanos preferida para el tratamiento son los pacientes con riesgo de infección hospitalaria, particularmente aquellos con insuficiencia renal terminal y/o en hemodiálisis. Además, se prefieren otros pacientes con riesgo de infección hospitalaria, por ejemplo, pacientes inmunodeficientes o que se han sometido a cirugía, especialmente cirugía cardíaca, o traumatismo. Otra clase de seres humanos preferida para el tratamiento son los pacientes con riesgo de bacteriemia. Otra clase preferida son los pacientes que padecen o han estado expuestos previamente al virus de la gripe, dado que en estos pacientes S. aureus se ha relacionado la neumonía posinfección.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como medicamento. El medicamento es preferentemente capaz de generar una respuesta inmunitaria en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es más preferentemente una vacuna.

La divulgación también proporciona el uso de un polipéptido de la divulgación en la fabricación de un medicamento, para la generación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.

Estos usos y procedimientos son, preferentemente, para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad provocada por S. aureus, por ejemplo, infecciones de la piel, tales como impétigo, diviesos, celulitis foliculitis, orzuelos, furúnculos, ántrax, síndrome de dermatitis exfoliativa y abscesos, artritis séptica, neumonía, mastitis, flebitis, meningitis, infecciones urinarias, osteomielitis, endocarditis, síndrome de choque tóxico (SCHT), septicemia e infecciones hospitalarias.

Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección por S. aureus tras la administración de la composición de la invención. Una forma de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias contra los antígenos de S. aureus después de la administración de la composición.

Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpos en un paciente que es superior al criterio de seroprotección para cada componente antigénico para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpos asociado por encima del cual se considera que un hospedador ha seroconvertido contra el antígeno son bien conocidos, y tales títulos son publicados por organizaciones tales como la OMS. Preferentemente, más del 80 % de una muestra estadísticamente significativa de sujetos es de seroconvertidos, más preferentemente más del 90 %, aún más preferentemente más del 93 % y muy preferentemente del 96-100 %.

En general, las composiciones de la invención se administrarán directamente a un paciente. Puede lograrse el suministro directo mediante inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, vía intraperitoneal, vía intravenosa, vía intramuscular o al espacio intersticial de un tejido) o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, auditiva, pulmonar u otra administración en la mucosa. Se prefiere la administración intramuscular en el muslo o el brazo. La inyección puede ser mediante una aguja (por ejemplo, una aguja hipodérmica), pero también se puede utilizar como alternativa la inyección sin aguja. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.

La invención puede utilizarse para suscitar inmunidad sistémica y/o mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser una pauta de una sola dosis o una pauta de múltiples dosis. Pueden utilizarse múltiples dosis en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. Una pauta de dosis primaria puede ir seguida por una pauta de dosis de refuerzo. La sincronización adecuada entre las dosis de sensibilización (por ejemplo, entre 4-16 semanas), y entre la sensibilización y el refuerzo, se puede determinar de manera rutinaria.

Antígenos de S. aureus

Como se ha menciona anteriormente, en las composiciones de la invención se pueden incluir uno o más antígenos adicionales de S. aureus. Los antígenos pueden ser antígenos proteicos o de sacárido. Los antígenos proteicos de S. aureus se pueden utilizar como proteínas transportadoras para conjugados o como antígenos proteicos no conjugados. Los antígenos de sacárido de S. aureus se pueden utilizar como los sacáridos para otros conjugados o como antígenos de sacárido no conjugados.

Los antígenos de sacárido de S. aureus adecuados incluyen el exopolisacárido de S. aureus, que es una poli-N-acetilglucosamina (PNAG). Este polisacárido está presente tanto en S. aureus como en S. epidermidis, y se puede aislar de cualquier fuente [214, 215]. Por ejemplo, la PNAG puede aislarse de la cepa MN8m de S. aureus [216]. El antígeno de sacárido puede ser un polisacárido que tiene el tamaño que surge durante la purificación del exopolisacárido a partir de las bacterias, o puede ser un polisacárido conseguido mediante la fragmentación de tal polisacárido, por ejemplo, el tamaño puede variar de más de 400 kDa a entre 75 y 400 kDa, o entre 10 y 75 kDa, o hasta 30 unidades de repetición. El antígeno de sacárido puede tener diversos grados de N-acetilación y, como se describe en la referencia 217, la PNAG puede estar menos del 40 % N-acetilada (por ejemplo, menos del 35, 30, 20, 15, 10 o 5 % N-acetilada; la PNAG desacetilada también se conoce como dPNAG). Los epítopos desacetilados de PNAG pueden suscitar anticuerpos que son capaces de participar en la destrucción opsónica. La preparación de dPNAG se describe en la referencia 218. La PNAG puede estar O-succinilada o no, por ejemplo, puede estar O-succinilada en menos del 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 o 0,1 % de los restos. La PNAG puede conjugarse a una molécula transportadora como se describe anteriormente o alternativamente puede no estar conjugada.

Otro antígeno de sacárido de S. aureus adecuado es el antígeno de tipo 336, que es una hexosamina unida en p sin O-acetilación [219, 220]. El antígeno de tipo 336 presenta una reacción cruzada con anticuerpos producidos contra la cepa 336 (ATCc 55804). El antígeno de tipo 336 puede conjugarse a una molécula transportadora como se describe anteriormente o alternativamente puede no estar conjugado.

Los antígenos proteicos de S. aureus adecuados incluyen los siguientes antígenos de S. aureus (o antígenos que comprenden un fragmento (o fragmentos) inmunogénico de los mismos) [por ejemplo, véanse las referencias 221­ 228]: AhpC, AhpF, Autolisina amidasa, Autolisina glucosaminidasa, Proteína de unión al colágeno CAN, EbhB, Lipasa GehD, Proteína de unión a heparina HBP (17 kDa), Receptor de laminina, MAP, MntC (también conocido como SitC), MRPII, Npasa, ORF0594, ORF0657n, ORF0826, PBP4, RAP (proteína activadora de ARN 111), Sai-1, SasK, OSE, SdrG, SdrH, SSP-1, SSP-2 y proteína de unión a vitronectina.

Los antígenos adecuados adicionales de proteínas de S. aureus incluyen un antígeno clfA; un antígeno clfB; un antígeno sdrE2; un antígeno sdrC; un antígeno sasF, un antígeno emp; un antígeno sdrD; un antígeno spa; un antígeno esaC; un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno isdC; un antígeno Hla; un antígeno sta011; un antígeno isdA; un antígeno isdB; y un antígeno sta073, como se describe a continuación. Uno o más (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6 o más) de estos antígenos pueden estar presentes en una composición de la invención. De estos antígenos, el uso de uno o más (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6 o más) de un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno Hla; un antígeno sta011; y/o un antígeno sta073, se prevé específicamente.

Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender adicionalmente una de las siguientes combinaciones de antígenos proteicos de S. aureus:

(1) Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno Hla. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera provechosa como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido de EsxAB con un antígeno esxB corriente abajo de un antígeno esxA. El antígeno Hla puede ser un mutante destoxificado, por ejemplo, que incluya una mutación H35L.

(2) Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno sta011. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. (3) Un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno sta011. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera provechosa como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. (4) Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno Hla, un antígeno sta006 y un antígeno sta011. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. El antígeno Hla puede ser un mutante destoxificado, por ejemplo, que incluya una mutación H35L. (5) Un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno Hla. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera provechosa como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. El antígeno Hla puede ser un mutante destoxificado, por ejemplo, que incluya una mutación H35L.

(6) Un antígeno Hla, un antígeno sta006 y un antígeno sta011. El antígeno Hla puede ser un mutante destoxificado, por ejemplo, que incluya una mutación H35L.

(7) Un antígeno esxA y un antígeno esxB. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera provechosa como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB.

(8) Un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno sta006. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar de manera provechosa como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. (9) Un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta011 y un antígeno sta073. Los antígenos esxA y esxB se pueden combinar como un polipéptido híbrido, como se analiza a continuación, por ejemplo, un híbrido EsxAB. (10) Un antígeno sta006 y un antígeno sta011.

En la referencia 229 se desvelan antígenos de Staphylococcus aureus adicionales.

clfA

El antígeno 'clfA' se señala como 'factor de aglutinación A'. En la cepa NCTC 8325, clfA es SAOUHSC_00812 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 (GI:88194572). En la cepa Newman es nwmn_0756 (GI:151220968).

Los antígenos clfA útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 1 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 1, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas clfA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 1. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID n O: 1, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Los 368 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 1 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 39 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 1 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La SEQ ID NO: 2 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 1 ('ClfA40-559'). Este fragmento omite la región repetitiva larga hacia el C-terminal de la SEQ ID NO: 1.

clfB

El antígeno 'clfB' se señala como 'factor de aglutinación B'. En la cepa NCTC 8325, clfB es SAOUHSC_02963 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 (GI (forma siglada de GenInfo Identifier, identificador de GenInfo):88196585). En la cepa Newman es nwmn_2529 (GI:151222741).

Los antígenos clfB útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 3 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas clfB incluyen variantes de la SEQ ID NO: 3. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID n O: 3, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Los 40 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 3 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 44 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 3 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. ClfB es naturalmente una proteína larga, por lo que el uso de fragmentos es útil, por ejemplo, para la purificación, manipulación, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 4 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 3 ('ClfB45-552'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de ClfB y se utiliza más fácilmente a escala industrial. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otros fragmentos útiles, basándose en un modelo de 3 dominios de ClfB, incluyen: ClfB45-360 (también conocido como CLfB-N12; SEQ ID NO: 5); ClfB212-542 (también conocido como CLfB-N23; Se Q ID NO: 6); y ClfB360-542 (también conocido como CLfB-N3; SEQ ID NO: 7).

sdrE2

El antígeno 'sdrE2' se señala como 'proteína de unión a sialoproteína ósea/fibrinógeno rica en Ser-Asp SdrE'. En la cepa Newman, sdrE2 es NWMN_0525 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8 (GI: 151220737).

Los antígenos sdrE2 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 8 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 8, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrE2 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 8. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 8, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Los 38 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 8 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 52 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 8 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. SdrE2 es naturalmente una proteína larga, por lo que el uso de fragmentos es muy útil, por ejemplo, para la purificación, manipulación, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 9 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 8 ('SdrE53-632'). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrE2 y se utiliza más fácilmente a escala industrial. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas.

sdrC

El antígeno 'sdrC' se señala como 'proteína sdrC'. En la cepa NCTC 8325, sdrC es SAOUHSC_00544 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 (GI:88194324).

Los antígenos sdrC útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 10 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrC incluyen variantes de la SEQ ID NO: 10. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 10, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Los 38 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 10 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 50 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 10 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. SdrC es naturalmente una proteína larga, por lo que el uso de fragmentos es útil, por ejemplo, para la purificación, manipulación, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 11 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 10 ('SdrC5-^i-518 '). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrC y se utiliza más fácilmente a escala industrial. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas.

sasF

El antígeno 'sasF' se señala como 'proteína sasF'. En la cepa NCTC 8325, sasF es SAOUHSC_02982 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 (GI:88196601).

Los antígenos sasF útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 12 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 12, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sasF incluyen variantes de la SEQ ID NO: 12. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 12, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Los 39 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 12 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 37 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 12 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

emp

El antígeno 'emp' se señala como 'proteína de unión a plasma y matriz extracelular'. En la cepa NCTC 8325, emp es SAOUHSC_00816 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13 (GI:88194575). En la cepa Newman es nwmn_0758 (GI: 151220970).

Los antígenos emp útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 13 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 13, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas emp incluyen variantes de la SEQ ID NO: 13. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 13, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Los primeros 26 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 13 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

Las SEQ ID NO: 14, 15, 16 y 17 son fragmentos útiles de la SEQ ID NO: 13 ('Emp^35-340', 'Emp^27-334', 'Emp^35-334' y 'Emp^27-147', respectivamente).

sdrD

El antígeno 'sdrD' se señala como 'proteína sdrD'. En la cepa NCTC 8325, sdrD es SAOUHSC_00545 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18 (GI:88194325).

Los antígenos sdrD útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 18 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 18; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sdrD incluyen variantes de la SEQ ID NO: 18. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 18, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Los 38 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 18 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 52 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 18 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. SdrD es naturalmente una proteína larga, por lo que el uso de fragmentos es muy útil, por ejemplo, para la purificación, manipulación, fusión, expresión, etc.

La SEQ ID NO: 19 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 18 ('SdrDsaW). Este fragmento incluye el dominio más expuesto de SdrD y se utiliza más fácilmente a escala industrial. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otro fragmento útil, con el mismo resto de extremo C, es SdrD394-592 (también conocido como SdrD-N3; SEQ ID NO: 20).

spa

El antígeno 'spa' se señala como 'proteína A' o 'SpA'. En la cepa NCTC 8325, spa es SAOUHSC_00069 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21 (GI:88193885). En la cepa Newman es nwmn_0055 (GI:151220267). Todas las cepas de S. aureus expresan el gen estructural de spa, un factor de virulencia bien caracterizado cuyo producto de proteína de superficie anclada a la pared celular tiene cinco dominios de unión a inmunoglobulina altamente homólogos denominados E, D, A, B y C [230]. Estos dominios presentan ~ 80 % de identidad a nivel de aminoácidos, tienen una longitud de 56 a 61 restos y están organizados como repeticiones en tándem [231]. La SpA se sintetiza como una proteína precursora con un péptido señal N-terminal y una señal de localización C-terminal [232, 233]. Spa anclada en la pared celular se presenta en gran abundancia en la superficie estafilocócica [234, 235]. Cada uno de sus dominios de unión a inmunoglobulina se compone de hélices a antiparalelas que se ensamblan en un haz de tres hélices y pueden unirse al dominio Fc de la inmunoglobulina G (IgG) [236, 237], la cadena pesada VH3 (Fab) de IgM (es decir, el receptor de linfocitos B) [238], el factor von Willebrand en su dominio A1 [239] y/o el receptor I de TNF-a (TNFRI) [240], que se presentan en las superficies de los epitelios de las vías respiratorias.

Los antígenos spa útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 21 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 21, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas spa incluyen variantes de la SEQ ID NO: 21. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 21, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Los 35 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 21 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 36 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 21 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. La referencia 241 sugiere que dominios de unión a IgG individuales, solo o en combinación, podrían ser inmunógenos útiles.

La SEQ ID NO: 22 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 21 ('Spa37-325'). Este fragmento contiene los cinco dominios de unión a Ig de SpA e incluye el dominio de SpA más expuesto. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otros fragmentos útiles pueden omitir 1, 2, 3 o 4 de los dominios naturales A, B, C, D y/o E. Como se informa en la referencia 241, otros fragmentos útiles pueden incluir solo 1, 2, 3 o 4 de los dominios naturales A, B, C, D y/o E, por ejemplo, comprenden solo el dominio SpA(A) pero no B a E, o comprenden solo el dominio SpA(D) pero no A, B, C o E, etc. Por los tanto, un antígeno spa útil con la invención puede incluir 1,2, 3, 4 o 5 dominios de unión a IgG, pero idealmente tiene 4 o menos. Si un antígeno incluye solo un tipo de dominio de spa (por ejemplo, solo el dominio Spa(A) o SpA(D)), puede incluir más de una copia de este dominio, por ejemplo, múltiples dominios SpA (D) en una única cadena polipeptídica. Un dominio individual dentro del antígeno puede estar mutado en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos con respecto a la SEQ ID NO: 21 (por ejemplo, véase la ref. 241, que desvela mutaciones en los restos 3 y/o 24 del dominio D, en el resto 46 y/o 53 del dominio A, etc.). Dichos mutantes no deben eliminar la capacidad del antígeno para suscitar un anticuerpo que reconozca la SEQ ID NO: 21, pero puede eliminar la unión del antígeno a IgG. En determinados aspectos, un antígeno de spa incluye una sustitución en (a) una o más sustituciones de aminoácido en un subdominio de unión a Fc de IgG del dominio A de SpA, B, C, D y/o E que altera o disminuye la unión al Fc de IgG, y (b) una o más sustitución de aminoácido en un subdominio de unión a Vh3 del dominio A de SpA, B, C, D y/o E, que altera o disminuye la unión a Vh3. En determinadas realizaciones, una SpA variante comprende al menos o como máximo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más péptidos del dominio D de SpA variantes.

esaC

El antígeno 'esaC' se señala como 'esaC'. En la cepa NCTC 8325, esaC es SAOUHSC_00264 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 (GI:88194069).

Los antígenos esaC útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 23 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 23; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 23, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). Estas proteínas esaC incluyen variantes de la SEQ ID NO: 23. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID n O: 23, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

esxA

El antígeno 'esxA' se señala como 'proteína'. En la cepa NCTC 8325, esxA es SAOUHSC_00257 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24 (GI:88194063).

Los antígenos esxA útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 24 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 24; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 24, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o más). Estas proteínas esxA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 24. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID n O: 24, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

esxB

El antígeno 'esxB' se señala como 'esxB'. En la cepa NCTC 8325, esxB es SAOUHSC_00265 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 (GI:88194070).

Los antígenos esxB útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 25 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 25; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 25, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 o más). Estas proteínas esxB incluyen variantes de la SEQ ID NO: 25. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 25. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID n O: 25, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 25. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

sta006

El antígeno 'sta006' se señala como 'proteína de unión a ferricromo' y también se ha denominado 'FhuD2' en la bibliografía [242]. En la cepa NCTC 8325, sta006 es SAOUHSC_02554 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26 (GI:88196199). En la cepa Newman es nwmn_2185 (GI: 151222397).

Los antígenos sta006 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 26 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 26; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 26, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sta006 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 26. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 26. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 26, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 26. Los primeros 17 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 26 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. Las formas mutantes de sta006 se informan en la referencia 243. Un antígeno sta006 se puede lipidar, por ejemplo, con una cisteína del extremo N acilada.

isdC

El antígeno 'isdC' se señala como 'proteína'. En la cepa NCTC 8325, isdC es SAOUHSC_01082 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27 (GI:88194830).

Los antígenos isdC útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 27 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 27; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 27, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más). Estas proteínas isdC incluyen variantes de la SEQ ID NO: 27. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 27. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 27, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 27. Los 39 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 27 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 28 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 27 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. Los fragmentos útiles de IsdB se desvelan en la referencia 249.

La referencia 244 desvela antígenos que incluyen de manera provechosa epítopos tanto de IsdB como de IsdH.

Hla

El antígeno 'Hla' es el 'precursor de alfa-hemolisina', también conocida como 'toxina alfa' o simplemente 'hemolisina'. En la cepa NCTC 8325, Hla es SAOUHSC_01121 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 28 (GI:88194865). En la cepa Newman es nwmn_1073 (GI:151221285). Hla es un determinante de virulencia importante producido por la mayoría de las cepas de S. aureus, que tiene actividad formadora de poros y hemolítica. Los anticuerpos anti-Hla pueden neutralizar los efectos perjudiciales de la toxina en modelos animales, y Hla es particularmente útil para proteger frente a la neumonía.

Los antígenos Hla útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 28 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 28; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 28, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Hla incluyen variantes de la SEQ ID NO: 28. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 28. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 28, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 28. Los primeros 26 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 28 pueden omitirse de manera provechosa. El truncamiento en el extremo C-terminal también puede utilizarse, por ejemplo, dejando solo 50 aminoácidos (restos 27-76 de la SEQ ID NO: 28) [245]. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La toxicidad de Hla puede evitarse en las composiciones de la invención mediante inactivación química (por ejemplo, utilizando formaldehído, glutaraldehído u otros reactivos de reticulación). En cambio, se prefiere sin embargo utilizar formas mutantes de Hla que eliminan su actividad tóxica al tiempo que conservan su inmunogenicidad. Dichos mutantes destoxificados ya se conocen en la técnica. Un antígeno Hla útil tiene una mutación en el resto 61 de la SEQ ID NO: 28, que es el resto 35 del antígeno maduro (es decir, después de omitir los primeros 26 aminoácidos N-terminales). Por lo tanto, el resto 61 puede no ser histidina y, en cambio, puede ser, por ejemplo, Ile, Val o preferentemente Leu. Además, en esta posición se puede utilizar una mutación His-Arg. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 29 es la secuencia de Hla-H35L mutante madura y un antígeno Hla útil comprende la SEQ ID NO: 29. Otra mutación útil sustituye un bucle largo por una secuencia corta, por ejemplo, para reemplazar un 39mero en los restos 136-174 de la SEQ ID NO: 28 con un tetrámero tal como Ps Gs (SEQ ID No : 30), como en la SEQ ID NO: 31 (que también incluye la mutación H35L) y la SEQ ID NO: 32 (que no incluye la mutación H35L).

En las referencias 246 y 247 se desvelan antígenos Hla adicionales útiles.

Las SEQ ID NO: 33, 34 y 35 son tres fragmentos útiles de la SEQ ID NO: 28 ('Hla27-76', 'Hla27-89' y 'Hla27-79', respectivamente). Las SEQ ID NO: 36, 37 y 38 son los fragmentos correspondientes de la SEQ ID NO: 29.

sta011

El antígeno 'sta011' se señala como 'lipoproteína'. En la cepa NCTC 8325, sta011 es SAOUHSC_00052 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ iD NO: 39 (GI:88193872).

Los antígenos sta011 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 39 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 39; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 39, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sta011 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 39. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 39. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 39, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 39. Los primeros 23 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 39 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. Un antígeno sta006 se puede lipidar, por ejemplo, con una cisteína del extremo N acilada.

Las formas variantes de la SEQ ID NO: 39 que se pueden utilizar para preparar antígenos sta011 incluyen, pero sin limitación, las SEQ ID NO: 40, 41 y 42 con diversas sustituciones de Ile/Val/Leu.

isdA

El antígeno 'isdA' se señala como 'proteína isdA'. En la cepa NCTC 8325, isdA es SAOUHSC_01081 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 (GI:88194829). En la cepa Newman es nwmn_1041 (GI: 151221253).

Los antígenos isdA útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 43 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 43; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 43, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas isdA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 43. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 43, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Los 38 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 43 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 46 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 43 pueden omitirse de manera provechosa. El truncamiento para excluir el 38mero C-terminal de la SEQ ID NO: 43 (comenzando con el motivo LPKTG) también es útil. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

La SEQ ID NO: 44 es un fragmento útil de la SEQ ID NO: 43 (aminoácidos 40-184 de la SEQ ID NO: 43; 'IsdA^-W ) que incluye el sitio de unión al hemo de la proteína natural e incluye el dominio más expuesto del antígeno. Además, reduce la similitud del antígeno con proteínas humanas. Otros fragmentos útiles se desvelan en las referencias 248 y 249.

IsdA no se adsorbe bien a los adyuvantes de hidróxido de aluminio, por lo tanto, el IsdA presente en una composición puede estar no adsorbido o puede estar adsorbido a un adyuvante alternativo, por ejemplo, a un fosfato de aluminio.

isdB

El antígeno 'isdB' se señala como 'proteína de neurofilamento isdB'. En la cepa NCTC 8325, isdB es SAOUHSC_01079 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 45 (GI:88194828). Se ha propuesto a IsdB para su uso como antígeno vacunal por sí solo [250], pero este puede no prevenir la neumonía.

Los antígenos isdB útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 45 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 45; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 45, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas isdB incluyen variantes de la SEQ ID NO: 45. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 45, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Los 36 aminoácidos C-terminales finales de la SEQ ID NO: 45 pueden omitirse de manera provechosa. Los primeros 40 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 45 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína. Los fragmentos útiles de IsdB se desvelan en las referencias 249 y 251, por ejemplo que carecen de 37 aminoácidos internos de la SEQ ID NO: 45.

En algunas realizaciones, las composiciones de la invención no incluyen un antígeno isdB.

sta073

El antígeno 'sta073' se señala como 'precursor de autolisina bifuncional'. En la cepa NCTC 8325, sta073 es SAOUHSC_00994 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 46 (GI:88194750). En la cepa Newman es nwmn_0922 (GI:151221134). El análisis proteómico ha revelado que esta proteína se secreta o se expone a la superficie.

Los antígenos sta073 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administra a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 46 y/o puede comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 46; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 46, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas sta073 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 46. Los fragmentos preferentes de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 46. Otros fragmentos preferentes carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 46, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 46. Los primeros 24 aminoácidos N-terminales de la SEQ ID NO: 46 pueden omitirse de manera provechosa. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.

Sta073 no se adsorbe bien a los adyuvantes de hidróxido de aluminio, por lo tanto, el Sta073 presente en una composición puede estar no adsorbido o puede estar adsorbido a un adyuvante alternativo, por ejemplo, a un fosfato de aluminio.

Polipéptidos híbridos

Los antígenos proteicos de S. aureus utilizados en la invención pueden estar presentes en la composición como polipéptidos individuales separados. Sin embargo, cuando se utilice más de un antígeno, no es necesario que estén presentes como polipéptidos separados. En cambio, al menos dos (por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más) antígenos pueden expresarse como una única cadena polipeptídica (un polipéptido 'híbrido'). Los polipéptidos híbridos ofrecen dos ventajas principales: en primer lugar, puede complementare un polipéptido que pueda ser inestable o que se exprese mal solo añadiendo un compañero de híbrido adecuado que solvente el problema; en segundo lugar, la fabricación comercial se simplifica, ya que solo es necesario emplear una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que son antigénicamente útiles.

El polipéptido híbrido puede comprender dos o más secuencias polipeptídicas de cada uno de los antígenos enumerados anteriormente, o dos o más variantes del mismo antígeno en los casos en que la secuencia tiene variabilidad parcial entre cepas.

Son útiles los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, son útiles nueve o diez antígenos. En particular, son preferentes los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro o cinco antígenos, tal como de dos o tres antígenos.

Pueden mezclarse entre sí distintos polipéptidos híbridos en una sola formulación. Los híbridos pueden combinarse con antígenos no híbridos seleccionados del primer, segundo o tercer grupo de antígenos. En tales combinaciones, un antígeno puede estar presente en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. Se prefiere, sin embargo, que un antígeno esté presente como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambos.

Los polipéptidos híbridos pueden representarse mediante la fórmula NH²-A-{-X-L-}ⁿ-B-COOH, en la que: X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno de S. aureus, como describe anteriormente; L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional; A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un número entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.). Normalmente, n es 2 o 3.

Si una fracción -X-tiene una secuencia de péptido líder en su forma de tipo silvestre, esta puede estar incluida u puede omitirse en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, se eliminarán los péptidos líder, salvo para el de la fracción -X- ubicada en el extremo N de la proteína híbrida, es decir, se conservará el péptido líder de X¹, pero los péptidos líderes de X² ... Xⁿ se omitirán. Esto equivale a delecionar todos los péptidos líder y utilizar el péptido líder de X¹ como fracción -A-.

Para cada n casos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos de engarce -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2 el híbrido puede ser NH²-X¹-L¹-X²-L²-COOH, NH²-X¹-X²-COOH, NH²-X¹-L¹-X²-COOH, NH²-X¹-X²-L²-COOH, etc. La secuencia (o secuencias) de aminoácidos de engarce -L- normalmente serán cortas (por ejemplo, 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, engarces de poliglicina (es decir, que comprenden Glyⁿ en que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y etiquetas de histidina (es decir, Hisⁿ en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos de engarce adecuadas. Un engarce útil es GSGGGG (SEQ ID NO: 47) o SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 48), formándose el dipéptido de Gly-Ser a partir de un sitio de restricción de BamHI, ayudando de este modo a la clonación y la manipulación, y siendo el tetrapéptido (Gly)⁴ un engarce de poliglicina típico. Otros engarces adecuados, particularmente para su uso como la Lⁿ final son la ASGGGS (SEQ ID No : 49, por ejemplo, codificada por SEQ ID n O: 50) o un dipéptido Leu-Glu.

-A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, de 40 o menos aminoácidos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, etiquetas de histidina, es decir, Hisn, en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos N-terminales adecuadas. En caso de que X1 carezca de su propia metionina N-terminal, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina N-terminal, por ejemplo, Met-Ala-Ser o un único resto de Met.

-B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden etiquetas de histidina, es decir, Hisn, en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como la SEQ ID NO: 51), o secuencias que potencian la estabilidad de la proteína. Resultarán evidentes para un experto en la materia otras secuencias de aminoácidos C-terminales adecuadas.

Un polipéptido híbrido de la invención puede incluir antígenos tanto EsxA como EsxB. Estos pueden estar en cualquier orden, en el extremo N o C. Las SEQ ID NO: 52 ('EsxAB'; codificado por la SEQ ID NO: 53) y 54 ('EsxBA') son ejemplos de tales híbridos, teniendo ambos engarces hexapeptídicos ASGGGS (SEQ ID NO: 49).

Aspectos generales

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra cosa, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las referencias 252-259, etc.

Más arriba se utiliza la numeración "IG". Un número IG, o "identificador de GenInfo", es una serie de dígitos asignados consecutivamente a cada registro de secuencia procesado por el NCBI cuando las secuencias se añaden a sus bases de datos. El número IG no se parece al número de referencia del registro de secuencia. Cuando se actualiza una secuencia (por ejemplo, para corrección o para añadir más anotaciones o información), recibe un nuevo número IG. Por lo tanto, la secuencia asociada con un número IG dado nunca se cambia.

Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos son iguales al comparar las dos secuencias. Pueden determinarse este alineamiento y el porcentaje de homología o identidad de secuencia utilizando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 260. Se determina un alineamiento preferido mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de hueco afín con una penalización por apertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la ref. 261.

Cuando la invención se refiera a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPSCAN [262.263] o procedimientos similares) o pueden predecirse (por ejemplo, utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf [264], estrategias basadas en matriz [265], MAPITOPE [266], TEPITOPE [267, 268], redes neurales [269], OptiMer y EpiMer [270, 271], ADEPT [272], Tsites [273], hidrofilia [274], índice antigénico [275] o los procedimientos desvelados en las referencias 276-280, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que son reconocidos por y se unen a los sitios de unión a antígeno de los anticuerpos o de los receptores de linfocito T, y también pueden denominarse "determinantes antigénicos".

Cuando se omita un "dominio" del antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplasmático, de un dominio transmembrana, de un dominio extracelular, etc.

La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.

El término "aproximadamente", en relación con un valor numérico x, significa, por ejemplo, x±10 %.

La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", por ejemplo, una composición que está "sustancialmente exenta" de Y puede estar completamente exentas de Y. Cuando sea necesario, la palabra "sustancialmente" puede omitirse de la definición de la invención.

Cuando la invención proporcione un procedimiento que implique múltiples etapas secuenciales, también se desvela en el presente documento un procedimiento que implica menos del número total de etapas. Por ejemplo, la invención proporciona un procedimiento que comprende las etapas de: (a) despolimerización de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 por hidrólisis ácida, para dar lugar a un fragmento de polisacárido; y (b) oxidación del fragmento para introducir un grupo aldehído en al menos un resto de sacárido en el fragmento, para dar lugar a un resto de sacárido oxidado. La etapa adicional (c) no necesita realizarse inmediatamente, ya que el producto de las etapas (a) y (b) tiene utilidad como intermedio en la preparación del conjugado, y puede utilizarse, almacenarse, exportarse, etc., para uso posterior y por separado. Este uso posterior podría implicar la realización de la etapa (c). Como alternativa, el producto de las etapas (a) y (b) podría acoplarse a una molécula transportadora de una manera distinta, por ejemplo, mediante un grupo hidroxilo o carboxilo que se retiene en el resto de sacárido oxidado.

De forma similar, cuando un material de polisacárido de partida ya se encuentra parcialmente procesado, también se desvelan procedimientos que implican solo las últimas etapas de un procedimiento. Por ejemplo, la divulgación abarca un procedimiento que comprende una etapa de acoplamiento de un resto de sacárido oxidado en un polisacárido capsular de tipo 5 o de tipo 8 a una molécula transportadora a través de un grupo aldehído, en que el material de partida para el procedimiento es un polisacárido capsular de tipo 5 o de tipo 8 que se despolimerizó previamente para dar lugar un fragmento de polisacárido y, a continuación se oxidó para introducir un grupo aldehído en el resto de sacárido.

Estas distintas etapas pueden realizarse en momentos muy distintos por distintas personas en distintos lugares (por ejemplo, en distintos países).

Se apreciará que los anillos de azúcar pueden existir en forma abierta y cerrada y que, mientras que en el presente documento se muestran en las fórmulas estructurales las formas cerradas, las formas abiertas también están abarcada por la invención. De forma similar, se apreciará que los azúcares pueden existir en las formas de piranosa y furanosa, y que, mientras que en el presente documento se muestran en las fórmulas estructurales las formas de piranosa, las formas de furanosa también están abarcadas. Además, están abarcadas distintas formas anoméricas de azúcares.

Una amina primaria se puede representar mediante la fórmula NH²R. El grupo R normalmente será un donante de electrones e incluye hidrocarbilo C^1-8, particularmente alquilo C^1-8, especialmente metilo. R es a menudo -CH³, -C²H⁵ o -C³H⁷. El hidrocarbilo puede estar sustituido por uno o más grupos, tales como: halógeno (por ejemplo, Cl, Br, F, I), trihalometilo, -NO² , -CN, -N+(alquil C^1-6)²O-, -SO³H, -SOalquilo C^1-6, -SO²alquilo C^1-6, -SO³alquilo C^1-6, -OC(=O)Oalquilo C^1-6, -C(=O)H, -C(=O)alquilo C^1-6, -OC(=O)alquilo C^1-6, -N(alquil C^1-6)², alquilo C^1-6, -N(alquil C^1-6)² , -C(=O)N(alquil C^1-6)², -N(alquil C^1-6)C(=O)O(alquil C^1-6), -N(alquil C^1-6)C(=O)N(alquil C^1-6)², -CO²H, -OC(=O)N(alquil C^1-6)² , -N(alquil C^1-6)C(=O)alquil C^1-6, -N(alquil C^1-6)C(=S)alquilo C^1-6, -N(alquil C^1-6)SO²N(alquil C^1-6)² , -CO²alquilo C^1-6, -SO²N(alquil C^1-6)² , -C(=O)NH², -C(=S)N(alquil C^1-6)² , -N(alquil C^1-6)SO²alquilo C^1-6, -N(alquil C^1-6)C(=S)N(alquil C^1-6)² , alquilo -NH-C^1-6, -S-alquilo C^1.6 o alquilo -O- C^1.6. El término 'hidrocarbilo' incluye grupos monovalentes lineales, ramificados o cíclicos que consisten en carbono e hidrógeno. Por lo tanto, los grupos hidrocarbilo incluyen grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, grupos cicloalquilo (incluido policicloalquilo), cicloalquenilo y arilo, y combinaciones de los mismos, por ejemplo, grupos alquilcicloalquilo, alquilpolicicloalquilo, alquilarilo, alquenilarilo, cicloalquilarilo, cicloalquenilarilo, cicloalquilalquilo, policicloalquilalquilo, arilalquilo, arilalquenilo, arilcicloalquilo y arilcicloalquenilo. Los hidrocarbilos típicos son hidrocarbilo C^1-14, más particularmente hidrocarbilo C^1-8.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un esquema para la fabricación del conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 utilizando un engarce de dihidrazina del ácido adípico y química de carbodiimida.

La Figura 2a muestra un análisis por SDS-PAGE del conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 fabricado utilizando un engarce de dihidrazina del ácido adípico y química de carbodiimida. La Figura 2b muestra un cromatograma de Sephacryl S300™ del conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 fabricado utilizando un engarce de dihidrazina del ácido adípico y química de carbodiimida.

La Figura 3 muestra un cromatograma de Sephacryl™ S300 de polisacárido capsular de tipo 5 despolimerizado.

La figura 4A compara las señales de ¹H ID en la región anomérica de ¹H para polisacárido capsular de tipo 5 nativo y despolimerizado. Se señalan algunas diferencias notables. Las Figuras 4B y 4C comparan las regiones anomérica y de metil-fucosa respectivamente de los espectros de acoplamiento escalar 2D (¹H, ¹H) para estos polisacáridos. Se señalan algunas diferencias notables.

La Figura 5a muestra un análisis por SDS-PAGE de un conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 fabricado utilizando un procedimiento de la invención. La Figura 5b muestra un cromatograma de Sephacryl™ S300 de un conjugado de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 fabricado utilizando un procedimiento de la invención.

La Figura 6 muestra un cromatograma de Sephacryl™ S300 de polisacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 despolimerizados en diversas condiciones.

La Figura 7 muestra un análisis por SDS-PAGE de conjugados de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5-CRM197 fabricados utilizando procedimientos de la invención.

La Figura 8 muestra la respuesta de IgG frente a diversos antígenos en un modelo de absceso renal de ratón de infección por S. aureus.

La Figura 9 compara las respuestas de IgG e IgM frente a diversos antígenos en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 10 muestra las respuestas protectoras frente a diversos antígenos en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 11 compara la respuesta de IgG frente a distintos conjugados en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 12 compara las respuestas protectoras frente a distintos conjugados en el modelo de absceso renal de ratón.

Las Figuras 13A y 13B compara las respuestas protectoras frente a conjugados adicionales en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 14 compara las respuestas de IgG e IgM frente a antígenos adicionales en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 15 compara las respuestas protectoras frente a un conjugado adicional en el modelo de absceso renal de ratón.

La Figura 16 compara las respuestas frente a diversos antígenos en un modelo letal de ratón de infección por S. aureus.

La Figura 17 muestra un cromatograma de SEC-HPLC (forma siglada de Size Exclusión Chromatography-HPLC, cromatografía por exclusión de tamaño-HPLC) de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 despolimerizado con ácido clorhídrico 2 M.

La Figura 18 muestra un espectro de RMN de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 despolimerizado con ácido clorhídrico 2 M.

Modos para llevar a cabo la invención

Producción y caracterización de conjugados

Se conjugó un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 purificado con CRM197 utilizando la química de carbodiimida y un engarce de dihidrazina del ácido adípico, de forma similar al procedimiento utilizado en la referencia 2 (véase más abajo). En este procedimiento, el polisacárido capsular se conjuga con CRM197 derivatizado utilizando EDC (Figura 1). La reacción implica a los grupos carboxilo del polisacárido capsular. La carbodiimida (EDC) activa los grupos carboxilo para unirse al -NH2 grupo de la proteína transportadora derivatizada (CRMadh), formando un enlace amida. La CRMadh derivatizada se prepara utilizando la misma química de carbodiimida.

Preparación de CRMadh:

A una solución de CRM197 se le añadió tampón MES 100 mM pH 6,0 para llegar a una concentración final de 10­ 12 mg/ml. A continuación, se añade 3,5 mg/ml de ADH (dihidrazida del ácido adípico) y 0,15 (EDC/CRM, p/p) y la reacción se mantuvo en agitación suave durante 1 h a TA. A continuación, la mezcla se dializó en primer lugar frente a NaCl 200 mM, Tampón MES 10 mM pH 7,3 y después frente a tampón MES 5 mM pH 7,0, utilizando una membrana de 6-8 kDa (SpectraPor). El producto se caracterizó mediante MicroBCA, SDS-Page (al 3-8 %), HPLC y MS. Se descubrió que la CRMadh estaba derivatizada con un engarce de ADH de 6-8).

Reacción de conjugación:

La reacción de conjugación se realizó a una concentración de polisacárido capsular de 2 mg/ml en tampón MES 50 mM pH 6,04. La proteína transportadora derivatizada, CRMadh, se añadió a la solución de polisacárido capsular hasta una concentración final de 4,0 mg/ml. La solución se mantuvo a TA durante 3 h. La relación de polisacárido:proteína en la mezcla de reacción era de 1:2 (peso/peso), la relación de polisacárido: EDC era de 1:6,66 (equivalente/equivalente) y la relación de polisacárido:SulfoNHS era de 1:0,53 (equivalente/equivalente).

Después de 3 h, la formación del conjugado se verificó mediante SDS-PAGE utilizando un gel de Tris-acetato al 3-8 % NuPAGE® (Invitrogen) (Figura 2a). Después de la conjugación, el conjugado se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (realizada en un sistema Akta™ (G&E Healthcare) utilizando una resina S300 Sephacryl™ (G&E Healthcare), con NaPi 10 mM, NaCl 10 mM, tampón de fase móvil pH 7,2). El conjugado se detectó a 215 nm, 254 nm y 280 nm (Figura 2b). La solución de conjugado se reservó a -20 °C hasta su uso posterior. El sacárido total en el conjugado se determinó mediante análisis HPAEC-PAD (forma siglada de High-Performance Anion-Exchange Chromatography: cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento) y el contenido de proteínas mediante ensayo MicroBCA, como se describe en la referencia 281 (Tabla 1).

TABLA 1

Los polisacáridos capsulares de S. aureus de tipo 5 y tipo 8 purificados se conjugaron por separado con CRM197 utilizando un procedimiento de la invención (véase más adelante).

Despolimerización

Se disolvió polisacárido capsular purificado en agua destilada a 2 mg/ml. Se añadió ácido acético hasta una concentración final del 2 % (v/v) y la reacción se mantuvo a 90 °C durante 3 horas (o durante una noche en el caso del Lote B). A continuación, la solución se neutralizó con NaOH 1 M y el polisacárido despolimerizado se purificó en una columna de filtración en gel (realizado en un sistema Akta™ (G&E Healthcare) utilizando una resina S300 Sephacryl™ (G&E Healthcare), con NaPi 10 mM, NaCl 10 mM, tampón de fase móvil pH 7,2). El sacárido se detectó a 215 nm (Figura 3). Las fracciones agrupadas se dializaron frente a agua destilada utilizando una membrana de 1 kDa (SpectraPor) y se liofilizaron.

Utilizando RMN 1H se verificó que el sitio de escisión estaba en los enlaces glucosídicos (1 3) dentro del polisacárido de tipo 5. Brevemente, se liofilizaron muestras de polisacárido capsular de tipo 5 nativo y despolimerizado para eliminar el disolvente de agua protonada y se disolvieron en óxido de deuterio (deuterio al 99,9 %, Sigma-Aldrich). Todos los espectros de RMN se registraron a 50 °C en un espectrómetro Bruker Avance III de 400 MHz, utilizando una sonda de banda ancha de 5 mm y el paquete de programas informáticos TopSpin 2.1 (Bruker) para la adquisición y procesamiento de datos. Se recogieron los espectros de H1 ID utilizando un experimento convencional de un pulso sobre un ancho espectral de 4.000 Hz y recogiendo 32k puntos de datos. El transmisor se ajustó en la frecuencia de HDO residual (4,79 ppm). Los espectros se obtuvieron de manera cuantitativa utilizando un tiempo de reciclado total para garantizar una recuperación completa de cada señal (5x Tiempo de relajación longitudinal T1). Los espectros se transformaron con Fourier después de aplicar una función de ensanchamiento de línea de 0,2 Hz. Los espectros de correlación escalar 2D (1H, 1H) se registraron mediante la secuencia de pulsos DQF-COSY. Se recogieron 4096 puntos de datos en el dominio F2 y 256 en el dominio F1.

Las señales de 1H ID para el polisacárido nativo se compararon con los valores publicados y se descubrió que concordaban (Tabla 2).

TABLA 2

continuación

La figura 4A compara las señales de 1H ID en la región anomérica de 1H para los polisacáridos nativo y despolimerizado. Las Figuras 4B y 4C comparan las regiones anomérica y de metil-fucosa respectivamente de los espectros de acoplamiento escalar 2D (1H, 1H) para estos polisacáridos. Los datos demuestran que el tratamiento con ácido acético da como resultado la escisión de enlaces glucosídicos (1 ^ 3) entre los restos a-L-FucNAc(3OAc) y p-D-FucNAc en el polisacárido capsular de tipo 5.

Oxidación

Se disolvió el polisacárido capsular despolimerizado en agua destilada a 2 mg/ml. se añadió NaIO4 a una relación de polisacárido:NaIO4 de 1:1 (peso/peso) y la reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 1-2 horas en la oscuridad. A continuación se dializó la solución frente a agua destilada utilizando una membrana de 1 kDa (SpectraPor) y se liofilizó otra vez.

Conjugación

El polisacárido capsular oxidado se disolvió en un tampón de NaPi 200 mM, NaCl 1 M, pH 7,2, a una concentración de 10 mg/ml. Se añadió CRM197 a la solución en una relación de polisacárido:proteína de 4:1 (peso/peso) y se añadió NaBHaCN (Aldrich) a una relación de sacárido:NaBCNH3 de 2:1 (peso/peso). La solución se mantuvo a 37 °C durante 2 días. Para confirmar la formación del conjugado se utilizó SDS-PAGE (para el conjugado de tipo 5 véase la Figura 5a). Después de la conjugación, el conjugado se purificó mediante cromatografía de filtración en gel (realizada en un sistema Akta™ (G&E Healthcare) utilizando una resina S300 Sephacryl™ (G&E Healthcare), con NaPi 10 mM, NaCl 10 mM, tampón de fase móvil pH 7,2). El conjugado se detectó a 215 nm, 254 nm y 280 nm (para el conjugado de tipo 5 véase la Figura 5b). La solución de conjugado se reservó a -20 °C hasta su uso posterior. El sacárido total en el conjugado se determinó mediante análisis por HPAEC-PAD y el contenido de proteínas mediante ensayo MicroBCA (véase las Tabla 3a para el conjugado de tipo 5 y la Tabla 3b para el conjugado de tipo 8).

TABLA 3a

TABLA 3b

Se conjugó S. aureus de tipo 5 purificado con CRM197 utilizando otro procedimiento de la invención. En este procedimiento, las etapas de despolimerización, oxidación y conjugación se llevaron a cabo como se describe anteriormente, excepto en que la etapa de conjugación se llevó a cabo con la proteína transportadora derivatizada descrita anteriormente (CRMadh) en lugar de con CRM197. El sacárido total en el conjugado se determinó mediante análisis por HPAEC-PAD y el contenido de proteínas mediante ensayo MicroBCA (Tabla 4).

TABLA 4

Procedimientos alternativos de despolimerización

En otros estudios, se analizaron distintas condiciones para la despolimerización del polisacárido capsular purificado. Se disolvió el polisacárido en agua destilada a 2 mg/ml. Se añadió ácido acético hasta una concentración final del 2 % o del 5 % (v/v) y la reacción se mantuvo a 90 °C durante 30 minutos, 3 horas, 5 horas o 6 horas. A continuación, la solución se neutralizó y purificó en una columna de filtración en gel como se describe anteriormente. El sacárido se detectó a 215 nm y se agrupó (Figura 6).

A continuación, las fracciones agrupadas se oxidaron y dializaron frente a agua como se describe anteriormente. Las fracciones se conjugaron con CRM197 o CRMadh como se describe anteriormente y los conjugados resultantes se purificaron mediante cromatografía de filtración en gel también como se describe anteriormente (Figura 7).

En otro estudio, para el polisacárido capsular de tipo 8 se utilizó ácido clorhídrico a 0,5 M en lugar de ácido acético, y la reacción se mantuvo a 90 °C durante 2,5 horas, tomándose muestras de la reacción cada 30 minutos. Las muestras se analizaron mediante RMN y SEC-HPLC. El polisacárido no se hidrolizó y el nivel de O-acetilación se mantuvo casi sin cambios. Por el contrario, cuando se utilizó ácido clorhídrico a 2 M y la reacción se mantuvo a 100 °C, se observó hidrólisis incluso después de solo 30 minutos. El nivel de O-acetilación descendió gradualmente durante las 2,5 horas (Figuras 17 y 18 (con un círculo señalando el pico de acetilo)).

Estudio de inmunización - modelo de absceso (1)

Protocolo de ensayo general: Los ratones se inmunizaron de acuerdo con el programa descrito a continuación y se expusieron mediante inyección intravenosa de una suspensión bacteriana de S. aureus. El cultivo de S. aureus se centrifugó, se lavó dos veces y se diluyó en PBS antes de la exposición. Se necesitaron diluciones adicionales para el inóculo deseado, lo que se verificó experimentalmente mediante siembra en placas de agar y formación de colonias. Para recoger los órganos, los ratones se sometieron a eutanasia y los riñones se extrajeron y homogeneizaron en Triton X-100 al 1 %. A continuación, se diluyeron alícuotas y se sembraron en placas en medio de agar para la determinación por triplicado de las UFC. Para la histología, se incubó tejido renal a temperatura ambiente en formalina al 10% durante 24 horas. Los tejidos se incluyeron en parafina, se cortaron en forma fina, se tiñeron con hematoxilina/eosina y examinaron por microscopía.

Se inmunizaron ratones CD1 de 3 semanas de edad los días 0 y 11 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 5 |jg de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Se extrajo sangre a los ratones los días 0 y 20, y se expusieron con S. aureus el día 21. El día 25 se recogieron los órganos. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de ocho ratones de acuerdo con el siguiente esquema:

Grupo 1 - Alumbre solo

Grupo 2 - Polisacárido capsular de tipo 5 solo

Grupo 3 - Polisacárido capsular de tipo 5 más alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 1)

Grupo 5 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 1) más alumbre

El conjugado indujo una respuesta de IgG específica contra el polisacárido de tipo 5. La formulación de alumbre proporcionó una respuesta mejorada (Figura 8). El conjugado también indujo una respuesta de IgM específica contra el polisacárido de tipo 5 (Figura 9). La formulación de conjugado con alumbre también proporcionó la mejor protección frente a la infección renal (Figura 10).

Estudio de inmunización - modelo de absceso (2)

Se inmunizaron ratones CD1 de 3 semanas de edad los días 1, 14 y 28 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 5 jg de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Se extrajo sangre a los ratones los días 0, 27 y 37, y se expusieron con S. aureus el día 38. El día 42 se recogieron los órganos. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de ocho ratones de acuerdo con el siguiente esquema:

Grupo 1 - Alumbre solo

Grupo 2 -Polisacárido capsular de tipo 5 más alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 2) más alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote A') más alumbre

Los conjugados indujeron una respuesta de IgG específica contra el polisacárido de tipo 5. Los conjugados de la invención (representados por el lote A') proporcionaron un título particularmente alto (Figura 11). Los conjugados de la invención proporcionaron la mejor protección frente a la infección renal (Figura 12).

Estudio de inmunización - modelo de absceso (3)

Se inmunizaron ratones CD1 de 3 semanas de edad los días 1, 14 y 28 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 5 |jg (o dosis de 0,5 |jg en el caso del lote A) de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Se extrajo sangre a los ratones los días 0, 27 y 37, y se expusieron con S. aureus (cultivada en medio líquido o sólido) el día 38. El día 42 se recogieron los órganos. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de ocho ratones de acuerdo con el siguiente esquema:

Grupo 1 - Alumbre solo

Grupo 2 -Polisacárido capsular de tipo 5 más alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 2) más alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 3) más alumbre

Grupo 5 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote A') más alumbre

Grupo 6 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote A) más alumbre

Grupo 7 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote B) más alumbre

Los conjugados de la invención (representados por el lote A', A y B) proporcionaron protección frente a la infección renal (Figuras 13A y 13B). Los conjugados de la invención proporcionaron títulos altos de anticuerpos IgG específicos con títulos bajos de anticuerpos IgM (Figura 14).

Estudio de inmunización - modelo de absceso (4)

Se inmunizaron ratones CD1 de 3 semanas de edad los días 1 y 14 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 1 jg de antígeno en un volumen de inyección de 200 j l . Se extrajo sangre a los ratones los días 0, 13 y 27, y se expusieron con S. aureus el día 28. El día 32 se recogieron los órganos. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de ocho o nueve ratones de acuerdo con el siguiente esquema:

Grupo 1 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote a) más alumbre

Grupo 2 -Conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote a) más MF59

Grupo 3 - Alumbre solo

Grupo 4 - MF59 solo

Los conjugados de la invención proporcionaron protección frente a la infección renal (Figura 15). La formulación de alumbre proporcionó una mejor protección que la formulación de MF59.

Estudio de inmunización - modelo letal (1)

Protocolo de ensayo general: Los ratones se inmunizaron de acuerdo con el programa descrito a continuación y se expusieron mediante inyección intraperitoneal de una suspensión bacteriana de S. aureus. Los cultivos de S. aureus se centrifugaron, se lavaron dos veces y se diluyeron en PBS antes de la exposición. Se necesitaron diluciones adicionales para el inóculo deseado, lo que se verificó experimentalmente mediante siembra en placas de agar y formación de colonias. Los animales se controlaron durante 14 días y se registró la enfermedad letal.

Se inmunizaron ratones CD1 mediante inyección intraperitoneal con una dosis de 5 jg de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de doce ratones de acuerdo con el siguiente esquema, antes de la exposición a 5x108 UFC de S. aureus de tipo 5:

Grupo 1 - PBS más alumbre

Grupo 2 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote C) más alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 3) más alumbre

Los conjugados de la invención (representados por el lote C) proporcionaron una mayor supervivencia (Figura 16).

Estudio de inmunización - modelo letal (2)

Se inmunizaron ratones CD1 mediante inyección intraperitoneal con dosis de 2 |jg (sacárido) y 10 j (proteína, cuando estaba presente) de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de doce ratones de acuerdo con el siguiente esquema, antes de la exposición a 5x108 UFC de S. aureus de tipo 5: Grupo 1 - PBS más alumbre

Grupo 2 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote D) más alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRMadh (Lote 4) más alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote D) más EsxAB, proteínas Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 5 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote D) más proteínas HlaH35L, Sta006 y Sta011 y alumbre

Los datos de supervivencia se presentan en la Tabla 5.

TABLA 5

Los conjugados de la invención (representados por el lote D) proporcionaron una mayor supervivencia. La supervivencia se potenció mediante la adición de antígenos proteicos de S. aureus.

Estudio de inmunización - modelo letal (3)

Se inmunizaron ratones CD1 mediante inyección intraperitoneal con dosis de 2 jg (polisacárido de tipo 5), 1 jg (polisacárido de tipo 8, cuando estaba presente) y 10 j (proteína, cuando estaba presente) de antígeno en un volumen de inyección de 200 jl. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de doce ratones de acuerdo con el siguiente esquema, antes de la exposición a 5x108 UFC de S. aureus de tipo 5:

Grupo 1 - PBS más alumbre

Grupo 2 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) más EsxAB, proteínas Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote p) más EsxAB, proteínas Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote p) más EsxAb , proteínas Sta011 y Sta073 y alumbre

Los datos de supervivencia se presentan en la Tabla 7.

TABLA 7

Estudio de inmunización - modelo letal (4)

Se inmunizaron ratones CD1 mediante inyección intraperitoneal con dosis de 2 jg (polisacárido capsular de tipo 5), 1 jg (polisacárido capsular de tipo 8, cuando estaba presente) y 10 j (proteína, cuando estaba presente) de antígeno en un volumen de inyección de 200 pl. Las inmunizaciones se llevaron a cabo en grupos de doce ratones de acuerdo con el siguiente esquema, antes de la exposición a 5x108 UFC de S. aureus de tipo 5:

Grupo 1 - PBS más alumbre

Grupo 2 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más EsxAB, proteínas Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 3 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más alumbre

Grupo 4 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más proteína EsxAB y alumbre

Grupo 5 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más proteína Sta006 y alumbre

Grupo 6 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más proteína Sta011 y alumbre

Grupo 7 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (lote E) y conjugado de polisacárido capsular de tipo 8-CRM (lote y primera dosis, lote 8 segunda dosis) más proteínas Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 8 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote E) más proteínas HlaH35L, Sta006 y Sta011 y alumbre

Grupo 9 - Conjugado de polisacárido capsular de tipo 5-CRM (Lote E) más proteína HlaH35L y alumbre

Los datos de supervivencia se presentan en la Tabla 8.

TABLA 8

REFERENCIAS

[1] Fattom y col. (1990) Infect Immun. 58(7):2367-74.

[2] Fattom y col. (1992) Infect Immun. 60(2):584-9.

[3] Fattom y col. (1993) Infect Immun. 61(3):1023-32.

[4] Fattom y col. (1996) Infect Immun. 64(5):1659-65.

[5] Welch y col. (1996) J Am Soc Nephrol. 7(2):247-53.

[6] Fattom y col. (1998) Infect Immun. 66(10):4588-92.

[7] Fattom y col. (1993) Vaccine 17(2):126-33.

[8] Shinefield y col. (2002) N Engl J Med. 346(7):491-6.

[9] Robbins y col. (2005) Ann N Y Acad Sci. 754:68-82.

[10] Reynaud-Rondier y col. (1991) FEMS Microbiology Immunology 76:193-200.

[11] Tollersrud y col. (2001) Vaccine. 19(28-29):3896-903.

[12] Documento WO03/061558.

[13] Gilbert y col. (1994) Vaccine. 12(4):369-74.

[14] Moreau y col. (1990) Carbohydrate Res. 339(5):285-91

[15] Fournier y col. (1984) Infect. Immun. 45(1):87-93.

[16] Jones (2005) Carbohydrate Res. 340(6):1097-106.

[17] Lemercinier y Jones (1996) Carbohydrate Res. 296:83-96.

[18] Jones y Lemercinier (2002) J Pharm Biomed Anal. 30(4):1233-47.

[19] Documento WO05/033148

[20] Documentos WO 00/56357

[21] Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180:249-261.

[22] Konadu y col. (1994) Infect. Immun. 62:5048-5054.

[23] Gilbert y col. (1994) J. Microb. Meth. 20:39-46.

[24] Solicitud de patente de Estados Unidos 61/256. 905 'PURIFICACIÓN DE SACÁRIDOS CAPSULARES DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS DE TIPO 5 Y TIPO 8' (NOVARTIS AG). N.° de referencia del cesionario 53615-US-PSP.

[25] Ramsay y col. (2001) Lancet 357(9251):195-196.

[26] Lindberg (1999) Vaccine 17 Supl. 2:S28-36.

[27] Buttery y Moxon (2000) JR Coll Physicians Lond 34:163-168.

[28] Ahmad y Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13:113-33, vii.

[29] Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563-567.

[30] Patente europea 0477508.

[31] Patente de Estados Unidos 5.306.492.

[32] Documento WO98/42721.

[33] Dick y col. en Conjugate Vaccines (eds. Cruse y col.) Karger, Basel, 1989, 10:48-114.

[34] Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368.

[35] Research Disclosure, 453077 (enero de 2002)

[36] Herbelin y col. (1997) J Dairy Sci. 80(9):2025-34.

[37] Documento EP-A-0372501.

[38] Documento EP-A-0378881.

[39] Documento EP-A-0427347.

[40] Documento WO93/17712

[41] Documento WO94/03208.

[42] Documento WO98/58668.

[43] Documento EP-A-0471177.

[44] Documento WO91/01146

[45] Falugi y col. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.

[46] Baraldo y col. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.

[47] Documento EP-A-0594610.

[48] Ruan y col. (1990) J Immunol 145:3379-3384.

[49] Documento WO00/56360.

[50] Documento WO02/091998.

[51] Kuo y col. (1995) Infect Immun 63:2706-13.

[52] Michon y col. (1998) Vaccine. 16:1732-41.

[53] Documento WO01/72337

[54] Documento WO00/61761.

[55] Documento WO2004/041157.

[56] Documento WO02/34771.

[57] Documento WO99/42130.

[58] Documento WO2004/011027.

[59] Documento WO2007/113222

[60] Patente de Estados Unidos 6.045.805

[61] Patentes de Estados Unidos 6.027.733 y 6.274.144.

[62] www.polymer.de

[63] Patentes de Estados Unidos 4.356.170 y 4.663.160

[64] Patente de Estados Unidos 4711779.

[65] Documento WO00/10599.

[66] Patente de Estados Unidos 4.057.685.

[67] Documento WO96/40242.

[68] Lei y col. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259-264.

[69] Documento WO00/38711; patente de Estados Unidos 6.146.902.

[70] Documento WO2004/080490.

[71] Documento WO2006/032475.

[72] Documento WO2006/032500.

[73] Documento WO2006/065553.

[74] Documento WO2007/118979.

[75] Documento WO99/24578.

[76] Documento WO99/36544.

[77] Documento WO99/57280.

[78] Documento WO00/22430.

[79] Tettelin y col. (2000) Science 287:1809-1815.

[80] Documento WO96/29412.

[81] Pizza y col. (2000) Science 287:1816-1820.

[82] Documento WO01/52885.

[83] Bjune y col. (1991) Lancet 338(8775):1093-1096.

[84] Fukasawa y col. (1999) Vaccine 17:2951-2958.

[85] Rosenqvist y col. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.

[86] Costantino y col. (1992) Vaccine 10:691-698.

[87] Documento WO03/007985.

[88] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[89] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.

[90] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[91] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[92] Iwarson (1995) APMIS 103:321-326.

[93] Gerlich y col. (1990) Vaccine 8 Supl:S63-68 y 79-80.

[94] Hsu y col. (1999) Clin Liver Dis 3:901-915.

[95] Gustafsson y col. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.

[96] Rappuoli y col. (1991) TIBTECH 9:232-238.

[97] Vaccines (2004) eds. Plotkin y Orenstein. ISBN 0-7216-9688-0.

[98] Documento WO02/02606.

[99] Kalman y col. (1999) Nature Genetics 21:385-389.

[100] Read y col. (2000) Nucleic Acids Res 28:1397-406.

[101] Shirai y col. (2000) J. Infect. Dis. 181(Supl. 3):S524-S527.

[102] Documento WO99/27105.

[103] Documento WO00/27994.

[104] Documento WO00/37494.

[105] Documento WO99/28475.

[106] Ross y col. (2001) Vaccine 19:4135-4142.

[107] Sutter y col. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[108] Zimmerman y Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.

[109] Dreesen (1997) Vaccine 15 Supl.:S2-6.

[110] MMWR Morb Mortal Wkly Rep 16 de enero de 1998;47(1):12, 19.

[111] McMichael (2000) Vaccine 19 Supl. 1:S101-107.

[112] Documento WO02/34771.

[113] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.

[114] Ferretti y col. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.

[115] Documento WO03/093306.

[116] Documento WO2004/018646.

[117] Documento WO2004/041157.

[118] lchiman y Yoshida (1981) J. Appl. Bacteriol. 51:229.

[119] Documento US4197290

[120] lchiman y col. (1991) J. Appl. Bacteriol. 71:176.

[121] Robinson y Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271-283.

[122] Donnelly y col. (1997) Annu Rev Immunol 15:617-648.

[123] Scott-Taylor y Dalgleish (2000) Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

[124] Apostolopoulos y Plebanski (2000) Curr Opin Mol Ther 2:441-447.

[125] Ilan (1999) Curr Opin Mol Ther 1:116-120.

[126] Dubensky y col. (2000) Mol Med 6:723-732.

[127] Robinson y Pertmer (2000) Adv Virus Res 55:1-74.

[128] Donnelly y col. (2000) Am J Respir Crit Care Med 162(4 Pt 2):S190-193.

[129] Davis (1999) Mt. Sinai J. Med. 66:84-90.

[130] Paoletti y col. (2001) Vaccine 19:2118-2126.

[131] Documento WO00/56365.

[132] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20a edición, ISBN: 0683306472.

[133] Documento WO03/009869.

[134] Almeida y Alpar (1996) J. Drug Targeting 3:455-467.

[135] Agarwal y Mishra (1999) Indian J Exp Biol 37:6-16.

[136] Documento WO00/53221.

[137] Jakobsen y col. (2002) InfectImmun 70:1443-1452.

[138] Bergquist y col. (1998) APMIS 106:800-806.

[139] Baudner y col. (2002) Infect Immun 70:4785-4790.

[140] Ugozzoli y col. (2002) J Infect Dis 186:1358-1361.

[141] Vaccine Design... (1995) eds. Powell y Newman. ISBN: 030644867X. Plenum.

[142] Documento WO00/23105.

[143] Documento WO90/14837.

[144] Podda (2001) Vaccine 19:2673-80.

[145] Frey y col. (2003) Vaccine 21:4234-7.

[146] Patente de Estados Unidos 6.299.884.

[147] Patente de Estados Unidos 6.451.325.

[148] Patente de Estados Unidos 5.057.540.

[149] Documento WO96/33739.

[150] Documento EP-A-0109942.

[151] Documento WO96/11711.

[152] Documento WO00/07621.

[153] Barr y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[154] Sjolanderet y col. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[155] Niikura y col. (2002) Virology 293:273-280.

[156] Lenz y col. (2001) J Immunol 166:5346-5355.

[157] Pinto y col. (2003) J Infect Dis 188:327-338.

[158] Gerber y col. (2001) Virol 75:4752-4760.

[159] Documento WO03/024480

[160] Documento WO03/024481

[161] Gluck y col. (2002) Vaccine 20:B10-B16.

[162] Documento EP-A-0689454.

[163] Johnson y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[164] Evans y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[165] Meraldi y col. (2003) Vaccine 21:2485-2491.

[166] Pajak y col. (2003) Vaccine 21:836-842.

[167] Kandimalla y col. (2003) Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[168] Documento WO02/26757.

[169] Documento WO99/62923.

[170] Krieg (2003) NatureMedicine 9:831-835.

[171] McCluskie y col. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32:179-185.

[172] Documento WO98/40100.

[173] Patente de Estados Unidos 6.207.646.

[174] Patente de Estados Unidos 6.239.116.

[175] Patente de Estados Unidos 6.429.199.

[176] Kandimalla y col. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (parte 3):654-658.

[177] Blackwell y col. (2003) J Immunol 170:4061-4068.

[178] Krieg (2002) Trends Immunol 23:64-65.

[179] Documento WO01/95935.

[180] Kandimalla y col. (2003) BBRC 306:948-953.

[181] Bhagat y col. (2003) BBRC 300:853-861.

[182] Documento WO03/035836.

[183] Documento WO95/17211.

[184] Documento WO98/42375.

[185] Beignon y col. (2002) Infect Immun 70:3012-3019.

[186] Pizza y col. (2001) Vaccine 19:2534-2541.

[187] Pizza y col. (2000) Int J Med Microbiol 290:455-461.

[188] Scharton-Kersten y col. (2000) Infect Immun 68:5306-5313.

[189] Ryan y col. (1999) Infect Immun 67:6270-6280.

[190] Partidos y col. (1999) Immunol Lett 67:209-216.

[191] Peppoloni y col. (2003) Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[192] Pine y col. (2002) J Control Release 85:263-270.

[193] Domenighini y col. (1995) Mol Microbiol 15:1165-1167.

[194] Documento WO99/40936.

[195] Documento WO99/44636.

[196] Singh y col.] (2001) J Cont Release 70:267-276.

[197] Documento WO99/27960.

[198] Patente de Estados Unidos 6.090.406

[199] Patente de Estados Unidos 5.916.588

[200] Documento EP-A-0626169.

[201] Documento WO99/52549.

[202] Documento WO01/21207.

[203] Documento WO01/21152.

[204] Andrianov y col. (1998) Biomaterials 19:109-115.

[205] Payne y col. (1998) Adv Drug Delivery Review 31:185-196.

[206] Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[207] Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4:214-218.

[208] Documento WO04/60308

[209] Documento WO04/64759.

[210] Documento WO99/11241.

[211] Documento WO94/00153.

[212] Documento WO98/57659.

[213] Solicitudes de Patente Europea 0835318, 0735898 y 0761231.

[214] Joyce y col. (2003) Carbohydrate Research 338:903.

[215] Maira-Litran y col. (2002) Infect. Immun. 70:4433.

[216] Documento WO2004/043407.

[217] Documento WO2007/113224.

[218] Documento WO2004/043405

[219] Documento WO98/10788.

[220] Documento WO2007/053176.

[221] Documento WO2007/113222.

[222] Documento WO2005/009379.

[223] Documento WO2009/029132.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la preparación de un conjugado de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 o tipo 8 y una molécula transportadora, en el que la molécula transportadora es CRM197, que comprende las etapas de:

(a) despolimerización del polisacárido capsular mediante hidrólisis ácida, para dar lugar a un fragmento de polisacárido;

(b) oxidación del fragmento para introducir un grupo aldehído en al menos un resto de sacárido en el fragmento, para dar lugar a un resto de sacárido oxidado; y

(c) acoplamiento del resto de sacárido oxidado a la molécula transportadora a través del grupo aldehído, dando lugar de este modo al conjugado.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido es un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 y la etapa 1(a) da lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1^- en su extremo no reductor.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polisacárido es un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 y la etapa 1(a) da lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que:

(a) la despolimerización se lleva a cabo mediante hidrólisis ácida utilizando ácido acético;

(b) la masa molecular promedio del fragmento está entre 5 y 100 kDa; y/o

(c) el grado de O-acetilación del fragmento es del 10-90 %.

5. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la etapa (c) comprende la etapa de oxidación del fragmento de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en dos grupos aldehído.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que la etapa (c) comprende la etapa de oxidación del fragmento de polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor, para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción a-D-FucNAc (1 ^ en dos grupos aldehído.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el procedimiento es para

(a) la preparación de un conjugado de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 5 y la molécula transportadora, que comprende las etapas de: (a) despolimerización del polisacárido capsular, para dar lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor; (b) oxidación del fragmento para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción p-D-FucNAc-(1 ^ en dos grupos aldehído; y (c) acoplamiento del fragmento oxidado a una molécula transportadora a través de uno de los grupos aldehído, dando lugar de este modo al conjugado; o

(b) la preparación de un conjugado de un polisacárido capsular de S. aureus de tipo 8 y la molécula transportadora, que comprende las etapas de: (a) despolimerización del polisacárido capsular, para dar lugar a un fragmento de polisacárido que tiene una fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en su extremo no reductor; (b) oxidación del fragmento para convertir dos grupos hidroxilo próximos en la fracción a-D-FucNAc-(1 ^ en dos grupos aldehído; y (c) acoplamiento del fragmento oxidado a una molécula transportadora a través de uno de los grupos aldehído, dando lugar de este modo al conjugado.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el acoplamiento es:

(a) acoplamiento directo haciendo reaccionar el grupo aldehído con un grupo amina en el transportador mediante aminación reductora; o

(b) a través de un engarce haciendo reaccionar el grupo aldehído con un grupo amina en el engarce mediante aminación reductora, en el que, opcionalmente, el engarce está unido a la molécula transportadora.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el acoplamiento da como resultado una relación de polisacárido:proteína (p/p) de entre 1:5 y 1:2.

10. Un conjugado obtenido u obtenible mediante el procedimiento de cualquier reivindicación precedente.

11. Un conjugado de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en un procedimiento de prevención y/o tratamiento de una enfermedad provocada por S. aureus.

12. Una composición inmunogénica que comprende un conjugado de acuerdo con la reivindicación 10, o un conjugado para el uso de la reivindicación 11.

13. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 12, que comprende adicionalmente uno o más antígenos proteicos de S. aureus seleccionados del grupo que consiste en un antígeno clfA; un antígeno clfB; un antígeno sdrE2; un antígeno sdrC; un antígeno sasF; un antígeno emp; un antígeno sdrD; un antígeno spa; un antígeno esaC; un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno isdC; un antígeno Hla; un antígeno sta011; un antígeno isdA; un antígeno isdB; y un antígeno sta073.

14. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 13, en la que el uno o más antígenos proteicos de S. aureus se seleccionan del grupo que consiste en un antígeno esxA; un antígeno esxB; un antígeno sta006; un antígeno Hla; un antígeno sta011; y un antígeno sta073.

15. Una composición inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 14, en la que la composición comprende antígenos proteicos de S. aureus de acuerdo con una de las combinaciones (1) a (10) siguientes:

(1) un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno Hla;

(2) un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta006 y un antígeno sta011;

(3) un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno sta011;

(4) un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno Hla, un antígeno sta006 y un antígeno sta011;

(5) un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno Hla;

(6) un antígeno Hla, un antígeno sta006 y un antígeno sta011;

(7) un antígeno esxA y un antígeno esxB;

(8) un antígeno esxA, un antígeno esxB y un antígeno sta006;

(9) un antígeno esxA, un antígeno esxB, un antígeno sta01 y un antígeno sta073; y

(10) un antígeno sta006 y un antígeno sta011.