CN102596254B

CN102596254B - 金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的偶联

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Publication number: CN102596254B
Application number: CN201080050122.1A
Authority: CN
Inventors: F·伯尔蒂; P·科斯塔蒂诺; M·R·罗马诺
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-30
Publication date: 2016-10-19
Anticipated expiration: 2030-09-30
Also published as: BR112012009014A2; JP2015221836A; WO2011138636A1; AU2010352695A1; AU2010352695B2; ES2812523T3; BR112012009014B1; CN102596254A; CA2779798A1; US8974799B2; MX338753B; US9839686B2; JP2017214601A; US20180153983A1; RU2603267C2; US20120237549A1; US20160051667A1; EP2493510B1; JP2013506651A; BR112012009014B8

Abstract

本发明提供一种制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖和运载体分子的偶联物的方法，其包括以下步骤：(a)使荚膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化该片段以便将醛基引入所述片段中的至少一个糖残基上得到氧化糖残基；和(c)通过醛基将该氧化糖残基偶联于运载体分子，从而得到该偶联物。步骤(c)中的偶联可以是直接偶联，或者可以是通过接头分子进行偶联。本发明还提供由该方法获得或可获得的偶联物。

Description

金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖的偶联

技术领域

本发明属于将细菌荚膜糖，具体是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)5型或8型荚膜多糖偶联至运载体以形成糖偶联物的领域。所述糖偶联物可用于免疫。

背景技术

在抵御有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是不依赖于T细胞的抗原，它们的免疫原性很弱。与载体偶联可将T-非依赖性抗原转化成T-依赖性抗原，从而增强记忆应答，并产生保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗基于糖偶联物，原型偶联疫苗针对流感嗜血菌(Haemohilus influenzae)(‘Hib’)[例如见参考文献97的第14章]。

已经记载其偶联疫苗的另一种细菌是金黄色葡萄球菌(S.aureus)。已经从金黄色葡萄球菌中分离到各种多糖用于糖偶联物。两种特别感兴趣的多糖是5型和8型荚膜多糖。大约60%的人金黄色葡萄球菌菌株是8型，大约30%是5型。有关5型和8型偶联物的大量工作是由Fattom等进行的，可参见文献如参考文献1-9。用于偶联5型和8型多糖的Fattom法通常包括用胱胺使纯化多糖巯基化。该反应依赖荚膜多糖中存在羧基基团。这些基团在碳二亚胺如EDAC存在下与胱胺发生反应。然后，将衍生多糖偶联于运载体蛋白如绿脓假单胞菌(Pseudomononas aeruginosa)内毒素A(ETA)，通常通过接头偶联[2]。其它研究者已通过还原胺化[10和11]；戊二醛偶联[10]；或多糖上的羟基与氰基化剂如CDAP[12]或三聚氰酰氯(cyanuric trichloride)的反应[13]偶联纯化的5型和8型荚膜多糖。

虽然已证明Fattom法制备的偶联疫苗在人体中安全且有免疫原性[5]，但仍然需要其它更好的方式来制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖的偶联物。

发明内容

本发明基于可用于代替现有技术公开的偶联方法的偶联方法。与这些方法不同，本发明方法不包括通过多糖中的羟基或羧酸基团进行偶联。因此，与现有技术相比该方法使这些基团的形式更接近天然多糖中的形式。替代使用这些基团的是，该方法包括在多糖中产生反应性醛基用于偶联。与现有技术的偶联物相比，所得的偶联物可具有不同、优选改进的免疫学特性。

因此，本发明提供将金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖偶联于运载体蛋白的另选或改进的方法和从其获得的偶联物。本发明还提供可用于本发明方法的中间体以及制备这些中间体的方法。

第一方面，本发明提供一种制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖和运载体分子的偶联物的方法，其包括以下步骤：(a)使荚膜多糖解聚得到多糖片段；(b)氧化该片段以便将醛基引入所述片段中的至少一个糖残基上得到氧化糖残基；和(c)通过所述醛基将该氧化糖残基偶联于运载体分子，从而得到该偶联物。步骤(c)中的偶联可以是直接偶联，或者可以是通过接头分子进行偶联。本发明还提供由该方法获得或可获得的偶联物。

荚膜多糖

本发明基于金黄色葡萄球菌5型和8型的荚膜多糖。5型和8型荚膜多糖的结构参见参考文献14和15，例如：

5型

→4)-β-D-ManNAcA(3OAc)-(1→4)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

近期的NMR谱图数据[16]导致将这些结构修改为：

5型

→4)-β-D-ManNAcA-(1→4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1→3)-β-D-FucNAc-(1→

8型

→3)-β-D-ManNAcA(4OAc)-(1→3)-α-L-FucNAc(1→3)-α-D-FucNAc(1→

可以相对于天然情况下发现的荚膜多糖对该多糖进行化学修饰。

例如，多糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但通常在偶联前进行。根据具体多糖，去乙酰化可能影响或不影响其免疫原性，如NeisVac-C^TM疫苗采用去-O-乙酰化的多糖，而Menjugate^TM是乙酰化的，但这两种疫苗都有效。可通过常规试验评价去乙酰化等的效果。例如，金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖上O乙酰化的相关性可参见参考文献6。据该文献称，天然多糖具有75%O-乙酰化。这些多糖将抗体诱导至多糖主链和O-乙酰基上。具有0%O-乙酰化的多糖仍然引发针对该多糖主链的抗体。两种抗体类型对O-乙酰基含量不同的金黄色葡萄球菌菌株有调理活性。因此，本发明所用的5型或8型荚膜多糖可具有0至100%O-乙酰化。例如，5型荚膜多糖的O-乙酰化程度可以是10-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。或者，可采用0%O乙酰化的5型荚膜多糖。相似地，8型荚膜多糖的O乙酰化程度可以是10-100%、10-100%、20-100%、30-100%、40100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。或者，可采用0%O乙酰化的8型荚膜多糖。在一个实施方式中，5型和8型荚膜多糖的O-乙酰化程度可以是10-100%、20-100%、30-100%、40-100%、50-100%、60-100%、70-100%、80-100%、90-100%、50-90%、60-90%、70-90%或80-90%。在其它实施方式中，使用0%O-乙酰化的5型和8型荚膜多糖。本发明所用5型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、75-100%、80-100%、90-100%或95-100%。通常5型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。相似地，本发明所用8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、75-100%、80-100%、90-100%或95-100%。通常8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。在一个实施方式中，5型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度可以是0-100%、50-100%、75-100%、80-100%、90-100%或95-100%。通常5型和8型荚膜多糖的N-乙酰化程度是100%。

多糖的O-乙酰化程度可通过本领域已知的任何方法测定，例如质子NMR(如参考文献17、18、19或20所述)。参考文献21中记载了另一种方法。可采用类似方法测定多糖的N-乙酰化程度。可通过水解去除O-乙酰基，例如用碱如无水肼[22]或NaOH[6]处理。可使用类似方法去除N-乙酰基。为了维持5型和/或8荚膜多糖上的高水平O-乙酰化，最大程度减少导致O-乙酰基水解的处理，例如在极端pH下的处理。

可通过已知技术纯化荚膜多糖，如本文引用的参考文献所述。典型方法包括用苯酚-乙醇灭活金黄色葡萄球菌细胞、离心、溶葡萄球菌素处理、RNA酶/DNA酶处理、离心、渗析、蛋白酶处理、进一步渗析、过滤、用乙醇/CaCl₂沉淀、渗析、冻干、阴离子交换色谱、渗析、冻干、大小排阻色谱、渗析和冻干[1]。另一方法包括高压灭菌金黄色葡萄球菌细胞、超滤含多糖的上清液、浓缩、冻干、用偏高碘酸钠处理以除去磷壁酸、进一步超滤、渗滤、高效大小排阻液相色谱、渗滤和冻干[23]。优选采用参考文献24所述的纯化过程。

本发明不限于纯化自天然来源的多糖，然而，可通过其它方法如全合成或部分合成获得所述多糖。

运载体分子

本发明包括使用运载体分子，它们一般是蛋白质。通常，与载体的共价偶联增强糖的免疫原性，因为偶联可以将糖由T-非依赖性抗原转变为T-依赖性抗原，由此能够引发免疫记忆。偶联对于儿科疫苗特别有用[例如参考文献25]，而且是公知技术[例如在参考文献26-34中综述的]。

优选的载体蛋白是细菌毒素，如白喉或破伤风毒素、其类毒素或突变体。本发明人发现CRM197白喉毒素突变体[35]适用。绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)外毒素A(ETA)和其无毒突变体重组外蛋白A(rEPA)已用作金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖的运载体蛋白([1]和[2])。也使用了金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-毒素)([10]和[36])、卵清蛋白[13]和人血清白蛋白[11]。这些运载体可用于本发明。

其他合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[37]、合成肽[38,39]、热激蛋白[40,41]、百日咳蛋白[42,43]、细胞因子[44]、淋巴因子[44]、激素[44]、生长因子[44]、人血清白蛋白(通常是重组的)、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4⁺T细胞表位的人工蛋白[45]例如N19[46]、来自流感嗜血杆菌(流感嗜血杆菌)的蛋白D[47-49]、肺炎球菌表面蛋白PspA[50]、肺炎球菌溶血素[51]或其无毒衍生物[52]、摄铁蛋白[53]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[54]、GBS蛋白[55]、GAS蛋白[56]等等。

其它合适的运载体蛋白包括金黄色葡萄球菌蛋白质抗原，例如下述金黄色葡萄球菌蛋白质抗原。

可以使用一种以上的载体蛋白，例如用于减少载体抑制的风险。因此，不同的运载体蛋白可用于5型和8型荚膜多糖，例如，5型多糖可偶联于CRM197而8型多糖可偶联于rEPA。也可能对某种特定多糖抗原使用超过一种运载体蛋白，例如5型多糖可以分为两组，一组偶联于CRM197且另一组偶联于rEPA。然而，通常对所有多糖使用相同的运载体蛋白。

一种载体蛋白可携带一种以上多糖抗原[57,58]。例如，一种运载体蛋白可偶联于5型和8型荚膜多糖。为了实现这一目的，可以在偶联过程之前混合不同多糖。然而，通常各多糖形成不同偶联物，偶联后混合不同多糖。单独的偶联物可基于同一运载体。

解聚

在本发明方法的步骤(a)中，将荚膜多糖解聚以得到多糖片段。已报道在偶联前通过超声处理解聚8型荚膜多糖[3]。作者得出结论，低分子量8型无免疫原性。虽然这些作者因此偏好高分子量多糖，但本发明令人惊讶地利用了分子量低于天然荚膜多糖的多糖片段。

可解聚全长多糖，以得到较短片段用于本发明的各种方法。本发明人发现，切割5型荚膜多糖中α-L-FucNAc(3OAc)和β-D-FucNAc残基之间的(1→3)糖苷键的方法尤其适用。将这些方法应用于5型荚膜多糖时，它们产生在非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段。此部分包括两个相邻羟基。相似地，这些方法应用于8型荚膜多糖时，认为它们产生在非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段，此部分包括两个相邻羟基。5型或8型多糖片段中的此相邻羟基为随后将该片段偶联于运载体分子提供柄，如下所述。

因此，本发明的另一方面提供一种处理金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的方法，其包括解聚荚膜多糖以得到在非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段的步骤。在相关方面，本发明提供一种处理金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的方法，其包括解聚荚膜多糖以得到在非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段的步骤。所述荚膜多糖可以是金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖，如上文“荚膜多糖”部分所述。本发明也提供由这些方法中任一种获得或可获得的多糖片段。

本发明人发现，可通过酸水解进行解聚。在酸水解中，优选使用弱酸如乙酸来避免在该多糖中其它基团上发生副反应。本领域技术人员能够鉴定适用于水解的酸和条件(如浓度、温度和/或时间)。例如，本发明人发现适合用2%乙酸(v/v)在90℃处理2mg/ml多糖3小时。本发明人还发现适合用5%乙酸在90℃处理2mg/ml多糖30分钟、5小时或6小时。也可能适合用其它酸，如三氟乙酸或其它有机酸进行处理。具体说，本发明人发现可使用盐酸提高解聚效率，特别是对8型荚膜多糖的解聚效率。例如，本发明人发现适合用2M盐酸在100℃处理多糖30分钟。本发明人还发现适合用2M盐酸在100℃处理1、1.5、2或2.5小时。这类盐酸处理可能导致多糖发生脱-O-乙酰化，如下所述。

其它多糖解聚方法也可能适用。这些方法包括加热、微流化[59]、声辐射[3]、氧化还原[60]或臭氧解[61]。

可通过色谱，如大小排阻色谱鉴定多糖片段。具体的分子量可通过凝胶过滤相对于支链淀粉标准品，如购自PSS公司(Polymer Standard Service)的标准品测定[62]。通常，本发明片段是质量在一定范围之内的片段的混合物。就解聚的5型荚膜多糖而言，片段的分子量通常在1-500kDa，例如5-100kDa，具体是10-50kDa，更具体是20-30kDa。相似地，就解聚的8型荚膜多糖而言，片段的分子量可以是1-500kDa，例如5-100kDa，具体是10-50kDa，更具体是20-30kDa。在一些实施方式中，选择低分子量的5型和/或8型多糖片段以用于本发明。例如，可选择和汇集对应于低分子量片段的凝胶过滤组分。所述低分子量多糖片段的分子量通常为5至20kDa。

解聚可导致荚膜多糖的O-乙酰化程度改变。例如，本发明人发现酸水解可导致O-乙酰化程度降低。在一些实施方式中，片段的O-乙酰化程度可以是10-90%、20-70%、30-50%、特别是35-45%。在其它实施方式中，片段的O-乙酰化程度可以是0-10%、0-5%、0-2%，特别是0%。

引入醛基

在该方法的步骤(b)中，将片段氧化以将醛基引入该片段中的至少一个糖残基上。这一步骤可包括将一个以上醛基引入该糖残基。具体说，可引入两个醛基。例如，步骤(a)中的解聚导致5型多糖片段在非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分时，可氧化该部分中的两个相邻羟基，以便将两个醛基引入该部分。以此方式，β-D-FucNAc-(1→部分可以是步骤(b)的糖残基。相似地，解聚导致8型多糖片段在非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分时，可氧化该部分中的两个相邻羟基，以便引入两个醛基。以此方式，α-D-FucNAc-(1→部分可以是步骤(b)的糖残基。

因此，本发明另一方面提供一种提供金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖，以便将β-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转化成两个醛基的步骤。在一个相关方面，本发明提供一种提供金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖衍生物的方法，包括氧化在其非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖，以便将α-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转化成两个醛基的步骤。所述荚膜多糖可以是上文“解聚”部分所述的多糖片段。本发明还提供由这些方法中任一种获得或可获得的金黄色葡萄球菌荚膜多糖衍生物。

典型的产醛反应包括使用高碘酸盐，特别是偏高碘酸盐(如偏高碘酸钠或钾，如NaIO₄)，以氧化相邻羟基[63]。本领域技术人员能够鉴定适合氧化的条件。例如，本发明人发现适合用NaIO₄以1:1比例(w/w)在室温下避光处理2mg/ml多糖1-2小时。本发明人还发现适合用93mMNaIO₄在室温下避光处理2mg/ml多糖8小时。可采用其它氧化条件，例如使用四氧化锇等。

偶联于运载体分子

在所述方法的步骤(c)中将氧化糖残基偶联于运载体分子可以是直接偶联或通过接头偶联。可采用任何合适的偶联反应，必要时采用任何合适的接头。

步骤(b)中的氧化产生在其非还原末端具有β-D-FucNAc(1→部分的5型多糖片段且该部分中引入两个醛基时，步骤(c)中的偶联可通过这些醛基之一实现。以此方式，氧化的β-D-FucNAc-(1→部分可以是步骤(c)的氧化糖残基。相似地，氧化产生在其非还原末端具有α-D-FucNAc(1→部分的8型多糖片段且该部分中引入两个醛基时，步骤(c)中的偶联可通过这些醛基之一实现。以此方式，氧化的α-D-FucNAc-(1→部分可以是步骤(c)的氧化糖残基。

因此，本发明另一方面提供一种提供偶联的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的方法，所述方法包括将在其非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联于运载体分子的步骤，所述部分经氧化其中的两个相邻羟基转变为两个醛基，其中所述偶联通过醛基之一实现。在一个相关方面，本发明提供一种提供偶联的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的方法，所述方法包括将在其非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖偶联于运载体分子的步骤，所述部分经氧化其中的两个相邻羟基转变为两个醛基，其中所述偶联通过醛基之一实现。所述荚膜多糖可以是上文中“引入醛基”部分所述的荚膜多糖。运载体分子可以是上文中“运载体分子”部分所述的运载体。本发明还提供由这些方法中任一种获得或可获得的偶联荚膜多糖。

将氧化糖残基或接头连接于运载体通常通过胺(-NH₂)基进行，例如运载体蛋白的赖氨酸或残基中的胺基，或精氨酸残基的胺基。连接至运载体也可通过巯基(-SH)进行，例如半胱氨酸残基侧链中的巯基。本发明人发现可通过使氧化糖残基中的醛基与运载体的胺基发生还原型胺化反应，方便地进行直接偶联。因此，本发明优选此种性质的直接偶联。相反，参考文献2提示在金黄色葡萄球菌5型和8型偶联物中接头可能有利。如果需要，本发明可采用接头偶联，例如使氧化糖残基中的醛基与接头中的胺基发生还原型胺化反应，或者通过还原型胺化将醛基转化成胺基以提供连接接头用的胺基。

还原型胺化是有机化学中的标准技术，已广泛用于生产疫苗用的荚膜多糖偶联物，包括金黄色葡萄球菌荚膜多糖[10]。在一个实施方式中，氧化糖残基中的醛基与运载体或接头中的胺基发生反应。这可通过在合适还原剂(例如氰基硼氢化物，如氰基硼氢化钠NaBH₃CN；硼烷-吡啶；三乙酸基硼氢化钠；硼氢化物交换树脂；等)存在下将多糖与运载体或接头混合方便地实现。在另一实施方式中，通过还原型胺化将醛基转化成胺基，以提供连接接头用的胺基。还原型胺化涉及氨或伯胺(NH₂R)。这可通过将铵盐(如氯化铵)与合适还原剂(如上所述)联用方便地实现。本领域技术人员能够鉴定适合还原型胺化的条件。例如，本发明人发现适合用运载体蛋白质以4:1多糖:蛋白质比例(w/w)并用NaBH₃CN以2:1多糖:NaBH₃CN比例处理10mg/ml多糖。

通过接头基团进行偶联可以使用任何已知方法，例如上述还原型胺化方法进行。在一个实施方式中，可使用双官能接头提供用于偶联于氧化糖残基中醛基的第一基团和用于偶联于运载体的第二基团。例如，可采用式X₁-L-X₂的双官能接头，其中X₁可与醛发生反应；X₂可与运载体发生反应；L是接头中的连接部分。典型的X₁基团是胺基。典型的L基团是含1-10个碳原子(如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)的直链烷基，如-(CH₂)₄-或-(CH₂)₃-。在另一实施方式中，可采用双官能接头提供用于偶联于氧化糖残基中醛基衍生的胺基(例如通过上述还原型胺化)的第一基团和用于偶联于运载体(通常偶联于运载体的胺)的第二基团。例如，可使用式X-L-X的均质双官能接头，其中两个X基团相同，并可与胺发生反应；L是接头中的连接部分。典型的X基团是N-氧琥珀酰亚胺。L通常具有式L′-L²-L′，其中L′是羰基。典型的L²基团是含1-10个碳原子(如C₁、C₂、C₃、C₄、C₅、C₆、C₇、C₈、C₉、C₁₀)的直链烷基，如-(CH₂)₄-。因此，典型接头是己二酸N羟基琥珀酰亚胺二酯(SIDEA)：

其它X基团是与HO-L-OH结合时形成酯的基团，如降冰片烷、对硝基苯甲酸和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺。其它与本发明所用胺发生反应的双官能接头包括丙烯酰卤(如丙烯酰氯)[65]、卤代酰基卤[66]、二琥珀酰亚胺基戊二酸酯、二琥珀酰亚胺基辛二酸酯、乙二醇双[琥珀酰亚胺基琥珀酸酯]等。

通常向多糖中加入摩尔过量的接头。接头/多糖反应通常在非质子溶剂(如DMSO、乙酸乙酯(ethanol acetate)等)中进行，因为接头通常不溶于水。然而，使用水溶性接头时，可采用更大范围的溶剂，包括质子溶剂如水。合适接头包括磺化形式，如磺化的SIDEA：

使用接头时，该偶联物包括接头部分。此部分既不源自多糖也不源自运载体，但是偶联物制备期间使用的第三个分子，不难与最终偶联产物中的多糖和运载体蛋白区别开。该接头部分可包括原子如碳、氢、氧和/或氮。通常是包含碳和氢的接头，也可采用还包含氧和/或氮的接头。包含氮原子的接头可包括与氮原子键合的碳原子，该氮原子进而与第二个碳原子键合(-C-N–C-)。包含氧原子的接头通常以羰基一部分的形式包括氧原子。分子量为30-500Da的接头部分是典型的。含有两个羰基的接头也是常见的。

特别有用的接头部分是-NH–C(O)–(CH₂)_n-C(O)–，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。n的值通常为4。该接头中的末端-NH–通常连接于多糖部分的碳原子。末端–C(O)–通常连接于运载体氨基酸侧链中的氮原子。优选的接头部分可通过包括以下步骤的方法方便地引入：还原型胺化氧化糖残基中的醛；所得-NH₂基团与双官能接头(如二元酸(如己二酸，HOOC-(CH₂)₄-COOH)的二酯(如二琥珀酰亚胺基酯))发生反应；和还原型胺化产物(见图6[64])。

可用于将接头连接于多糖的-NH₂基团的其它化学方式包括：

–烯丙酰化(例如，与烯丙酰氯反应)，然后进行迈克尔加成至氨基酸侧链的ε-NH2或半胱氨酸侧链的–SH[65]。所得接头是-NH–C(O)–(CH₂)₂-(丙酰胺基)。

-与卤代酰基卤发生反应，然后与氨基酸侧链的ε-NH2或半胱氨酸侧链的-SH[66]。所述接头是-NH-C(O)-CH₂-。

通常通过本发明方法产生多糖:蛋白质比例(w/w)为1:20(即蛋白质过量)至20:1(即多糖过量)的偶联物。优选比例为1:10至1:1，特别是1:5至1:2的比例，最优选约1:3。相反，通过现有技术方法制备的5型和8型荚膜多糖偶联物倾向于具有较高的比例，例如0.73:1至1.08:1，参见参考文献1、2和3。在本发明的具体实施方式中，5型荚膜多糖偶联物的多糖:蛋白质比例(w/w)为1:10至1:2；和/或8型荚膜多糖偶联物的多糖:蛋白质比例(w/w)为1:5至7:10。

组合物可包含少量游离的载体[67]。当本发明组合物中给定载体蛋白存在游离和偶联形式时，未偶联形式优选不多于组合物中载体蛋白总量的5%，更优选少于2%重量。

偶联后，可分离游离和偶联的多糖。有许多合适的分离方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。[也参见参考文献68和69等]。

偶联物与其它抗原的联用

除提供上述单独偶联物外，本发明还提供包含本发明偶联物和一种或多种其它抗原的组合物。该组合物通常是免疫原性组合物。

其它抗原可包括其它本发明偶联物，因此本发明提供包含一种以上本发明偶联物的组合物。具体说，本发明提供包含本发明5型荚膜多糖偶联物和本发明8型荚膜多糖的组合物。或者，其它抗原可以是用本发明方法以外的方法，例如参考文献1-13所述方法制备的5型或8型荚膜多糖偶联物。类似地，其它抗原可以是用参考文献59、70、71、72、73和74所述方法，特别是这些文献中举例说明的方法制备的5型或8型荚膜多糖偶联物。因此，本发明提供包含5型荚膜多糖偶联物和8型荚膜多糖偶联物的组合物，其中偶联物之一(5型偶联物或8型偶联物)是本发明偶联物，另一种偶联物不是本发明偶联物。

其它抗原可包括其它金黄色葡萄球菌抗原，包括蛋白质和糖抗原，如下所述。

额外的抗原可包含并非来自金黄色葡萄球菌病原体的抗原。因此，本发明的组合物还可包含一种或多种非金黄色葡萄球菌抗原，包括其它细菌、病毒或寄生虫抗原。这些抗原可选自下列：

-来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白质抗原，例如文献75-81中所述的那些，尤其可使用蛋白质‘287’(见下文)及其衍生物(例如‘ΔG287’)。

-来自脑膜炎奈瑟氏菌血清组B的外膜囊泡(OMV)制备物，如文献82、83、84、85等中所述。

-脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献86所述的血清组C的寡糖或参考文献87所述的寡糖。

–肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如文献88-90；文献97的第22和23章]。

–-甲型肝炎病毒，如灭活病毒的抗原[如91，92；参考文献97的第15章]。

–-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如92，93；参考文献97的第16章]。

–-丙型肝炎病毒的抗原[如94]。

–百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素（PT）和丝状血凝素（FHA），也可任选与百日咳杆菌黏附素（pertactin）和/或凝集原2和3的组合[例如参考文献95和96；文献97的第21章]。

–-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献97的第13章]。

–-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献97的第27章]。

–流感嗜血杆菌B的糖抗原[如文献97的第14章]。

–淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)的抗原[例如75，76，77]。

–肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如98，99，100，101，102，103，104]。

–-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如，105]。

--牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如，106]。

-脊髓灰质炎病毒抗原[例如107、108；文献97的第24章]，如IPV。

--狂犬病抗原[如109]如冻干的失活病毒[如110，RabAvert^TM]。

-麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献97的第19、20和26章]。

--流感抗原[如参考文献97的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。

-粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）抗原[例如111]。

-来自嗜热链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原[例如112，113，114]。

-无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）（B型链球菌）的抗原[例如56、115-117]。

–表皮葡萄球菌(S.epidrmidis)的抗原[如可由菌株ATCC-31432、SE-360和SE-10获得的I、II和/或III型荚膜多糖，如参考文献118、119和120所述]。

在采用糖或碳水化合物抗原时，通常与载体偶联以增强免疫原性。流感嗜血菌B、脑膜炎球菌和肺炎球菌的糖抗原的偶联是熟知的。

必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[96])。

在所述组合物中包含白喉抗原时，通常还包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，在包含破伤风抗原时，通常还包含白喉和百日咳抗原。相似地，在包含百日咳抗原时，通常还包含白喉和破伤风抗原。

抗原可以吸附于铝盐。

一种类型的优选组合物包含影响免疫削弱对象的其它抗原，因此本发明金黄色葡萄球菌偶联物可与来自下述非金黄色葡萄球菌病原体的一种或多种抗原组合：无乳链球菌、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、流感病毒、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、绿脓假单胞菌、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)和副流感病毒。

另一类型的优选组合物包含医源感染相关细菌的其它抗原，因此本发明金黄色葡萄球菌偶联物可与来自下述非金黄色葡萄球菌病原体的一种或多种抗原组合：艰难梭菌(Clostridium difficile)；绿脓假单胞菌；白色念珠菌(Candida albicans)；和肠外致病性大肠杆菌(Escherichia coli)。

所述组合物中各抗原的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫应答。

作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的另一种替代方式，可使用编码该抗原的核酸[例如文献121-129]。本发明的组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(通常是DNA，如质粒形式的DNA)取代。

在实践层面上，在本发明组合物中包含的抗原数可能有上限。本发明组合物中抗原(包括金黄色葡萄球菌抗原)数可以少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、或少于3种。本发明组合物中金黄色葡萄球菌抗原数可能少于6、少于5或少于4种。

药学组合物和方法

本发明提供包含(a)本发明偶联物和(b)药学上可接受的运载体的药物组合物。通常，‘药学上可接受的运载体’包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的载体。合适的运载体一般是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[130]、海藻糖[131]、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这样的载体为本领域普通技术人员熟知。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂等。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型载体。药学上可接受的赋形剂的全面讨论参见参考文献132。

本发明组合物可以是水性形式(即溶液或悬浮液)或干燥形式(如冻干)。如果使用干燥的疫苗，那么在注射前将其重建成液体介质。偶联疫苗的冻干是本领域已知的，例如Menjugate^TM产品以冻干形式提供，而NeisVac-C^TM和Meningitec^TM以水性形式提供。为了在冻干过程中稳定偶联物，通常可以在组合物中添加1mg/ml至30mg/ml(如约25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)或二糖(如蔗糖或海藻糖)。

组合物可装在药瓶中，或者可装在填充好的注射器中。注射器可装有或未装有针头。注射器可包含一个组合物剂量，而药瓶可包含一个剂量或多个剂量。

本发明的水性组合物也适用于从冻干形式重建其它疫苗。本发明组合物用于临用前重建时，本发明提供药盒，其可包括两个药瓶，或可包括一个预填充注射器和一个药瓶，其中在注射前用所述注射器的内容物再活化药瓶的内容物。

本发明组合物可以包装成单位剂型或多剂量剂型。就多剂量剂型而言，与预填充注射器相比更优选药瓶。可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用注射剂量一般为0.5ml体积，例如用于肌内注射时。

组合物的pH通常为6-8，例如约7。可使用缓冲液来维持稳定的pH。当组合物包含氢氧化铝盐时，通常采用组氨酸缓冲液[133]。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明中的组合物可以与人体等张。

本发明组合物有免疫原性，更优选是疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”指在一次剂量或一系列剂量的一部分中给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组（例如，非人的灵长动物、灵长动物等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的较宽范围内。

在各剂内，单独糖抗原的含量通常是1-50μg(以糖质量计)，如约1μg、约2.5μg、约4μg、约5μg或约10μg。

金黄色葡萄球菌会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。可将所述组合物制备为采用细粉或喷雾的用于肺部给药的制剂，例如吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。该组合物可制备成用于鼻腔、耳内或眼部给药的制剂，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献134和135]。已报道成功地经鼻给予肺炎球菌糖[136，137]、Hib糖[138]、MenC糖[139]和Hib和MenC糖偶联物的混合物[140]。

本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。

本发明组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨酯)，如吐温80。去污剂的含量水平通常较低，如<0.01%。

本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10+2mg/ml。

本发明组合物通常含有缓冲剂。一般是磷酸盐缓冲剂。

本发明组合物通常与其它免疫调节剂联合给予。具体说，组合物通常包括一种或多种佐剂。这类佐剂包括但不限于：

A.含矿物质的组合物

本发明中适合用作佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐。本发明包括矿物盐，例如氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(例如，羟基磷酸盐、正磷酸盐)、硫酸盐等[例如，参见参考文献141的第8和9章]，或不同无机化合物的混合物(如磷酸盐和氢氧化物佐剂的混合物，任选地含有过量磷酸盐)，化合物可采用任何合适的形式(例如凝胶、晶体、无定形等)，一般吸附于该盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[142]。

本发明的疫苗中可包含铝盐，使Al³⁺剂量为每剂0.2-1.0mg。

磷酸铝佐剂一般是无定形羟基磷酸铝，PO₄/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mgAl³⁺/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如50-100μgAl³⁺/偶联物/剂。采用磷酸铝并且不需要使抗原吸附于佐剂时，在溶液中包含游离的磷酸根离子(如采用磷酸盐缓冲液)比较有利。

B.油乳剂

适合用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献141第10章；也参见参考文献143-145]。将MF59用作FLUAD^TM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。

尤其可用于组合物的佐剂是亚微米水包油乳液。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE鲨烯/水乳剂，如含有4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0%司盘85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-1-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-1-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献143和146-147详细描述了亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(如胞壁酰肽)在本发明组合物中的应用。

也可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明中的佐剂。

C.皂苷制剂[参考文献141的第22章]

皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可商品化获自丽花菝葜（Smilaxornata）（墨西哥菝葜）、满天星（Gypsophilla paniculata）（婚纱花）和肥皂草（Saponariaofficianalis）（皂根）。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。

已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法参见参考文献148。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[149]。

皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物(ISCOM)的独特颗粒[参考文献141的第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任何已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献149-151中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[152]。

开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献153和154。

D.病毒体和病毒样颗粒

病毒体和病毒样颗粒（VLP）也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，不能复制，且通常不含任何天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括源自流感病毒（例如HA或NA）、乙肝病毒（例如核心蛋白或衣壳蛋白）、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体（如外壳蛋白）、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty（如反转录转座子Ty蛋白p1）的蛋白。VLP在参考文献155-160中有进一步描述。病毒体在(例如)参考文献161中有进一步描述。

E.细菌或微生物衍生物

适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌的脂多糖（LPS）的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。

LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A（MPL）和3-O-脱酰基MPL（3dMPL）。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式见参考文献162中所述。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以在过滤除菌时通过0.22μm膜[162]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC 529[163,164]。

脂质A衍生物包括大肠杆菌的脂质A衍生物，如OM-174。例如，参考文献165和166中描述了OM-174。

适合用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列（含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列）。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激作用。

CpG可以包含核苷酸修饰/类似物，如硫代磷酸酯修饰，可以是双链或单链。参考文献167、168和169公开了可能的类似取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献170-175中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。

CpG序列可能导向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[176]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫应答，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞应答，如CpG-B ODN。参考文献177-179中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。

CpG寡核苷酸优选构建成5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见，例如参考文献176和180-182。

细菌ADP-核糖基化毒素及其去毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌（大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”）、霍乱菌（“CT”）或百日咳菌（“PT”）。参考文献183中描述了将脱毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐剂，参考文献184中描述了将其用作胃肠道外佐剂。所述毒素和类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚单位。A亚单位优选含有脱毒突变；B亚单位优选不突变。所述佐剂优选脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献185-192中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。优选根据参考文献193中提出的ADP-核糖基化毒素的A和B亚单位的排列对比对氨基酸取代基编号，该参考文献的全部内容特别纳入本文作为参考。

F.人免疫调节剂

适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[194]等)[195]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。

G.生物粘着剂和粘膜粘着剂

生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[196]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[197]。

H.微粒

微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒（即直径为~100nm至~150μm，更优选直径~200nm至~30μm，最优选直径~500nm至~10μm的颗粒）由生物可降解的无毒材料（例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等）形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面（例如用SDS处理）或带正电表面（例如用阳离子去污剂如CTAB处理）。

I.脂质体（参考文献141第13和14章）

适合用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献198-200所述。

J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂

适合用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[201]。这种制剂还包括聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性剂和辛苯糖醇[202]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[203]的混合物。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9）、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。

K.聚磷腈(PCPP)

PCPP制剂参见例如参考文献204和205。

L.胞壁酰肽

适合用作本发明佐剂的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺（thr-MDP）、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺（正-MDP）和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE）。

M.咪唑并喹诺酮化合物。

适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，见参考文献206和207所述。

N．缩氨基硫脲化合物

缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献208所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

O．色胺酮化合物

色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选适合用作本发明佐剂的所有这类化合物的方法包括参考文献209所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。

本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下组合可用作本发明佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[210]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[211]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[212]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[213]；(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80^TM、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液，(7)Ribi^TM佐剂系统(RAS)（RI公司（RibiImmunochem）），含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)或细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(Detox^TM)；和(8)一种或多种无机盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。

用作免疫刺激剂的其它物质可参见参考文献141的第7章。

使用铝盐佐剂特别有用，抗原通常吸附于这类盐。Menjugate^TM和NeisVac^TM偶联物采用氢氧化物佐剂，而Meningitec^TM采用磷酸盐佐剂。本发明组合物中可能使某些抗原吸附于氢氧化铝，而使另一些抗原结合于磷酸铝。然而，通常只使用一种盐，如氢氧化物或磷酸盐，但二者不同时使用。并非所有偶联物都需要吸附，即某些或全部偶联物可游离于溶液中。

治疗方法

本发明还提供了一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包含将本发明中的药物组合物给予所述哺乳动物。免疫应答优选为保护性，优选涉及抗体。该方法可以引起增强的应答。

所述哺乳动物优选人。当预防性使用疫苗时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。用于治疗的人的优选类别是处于医源感染风险中的患者，特别是患有晚期肾病和/或进行血液透析的患者。也优选处于医源感染风险中的其它患者，如免疫缺陷患者或接受手术，特别是心脏手术的患者或外伤患者。用于治疗的人的另一优选类别是处于菌血症风险中的患者。另一优选类别是患有或曾接触过流感病毒的患者，因为金黄色葡萄球菌与这些患者的感染后肺炎相关联。

本发明也提供用作药物的本发明组合物。药物优选能够引起哺乳动物的免疫应答(即它是一种免疫原性组合物)，并且更优选是疫苗。

本发明也提供本发明偶联物在制备引起哺乳动物免疫应答的药物中的应用。

这些应用和方法优选用于预防和/或治疗金黄色葡萄球菌所致疾病，例如皮肤感染，如脓疱病、疖、蜂窝织炎、毛囊炎、麦粒肿、疔疮、痈、烫伤样皮肤综合征和脓肿、脓毒性关节炎、肺炎、乳腺炎、静脉炎、脑膜炎、尿路感染、骨髓炎、心内膜炎、中毒性休克综合征(TSS)、败血症和医源感染。

检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测金黄色葡萄球菌感染。监测预防性治疗的功效的一种方式包括监测给予该组合物后对金黄色葡萄球菌产生的免疫应答。

本发明中的优选组合物可以在可接受百分比的人对象中产生优于各抗原组分血清保护标准的抗体效价。具有相关抗体效价的抗原是众所周知的，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由如WHO一类的组织公布。优选多于80%的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90%，更优选多于93%，最优选96-100%。

本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射（例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙），或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选在大腿或上臂进行肌肉内给药。注射可以通过针头（例如皮下针头）进行，但也可以采用无针注射。肌肉内剂量一般为0.5ml。

本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。

剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以通过常规方法确定初次剂量之间（例如4-16周）以及初次和加强剂量之间的适当时机。

金黄色葡萄球菌抗原

如上所述，本发明组合物可包含一种或多种其它金黄色葡萄球菌抗原。所述抗原可以是蛋白质或糖抗原。金黄色葡萄球菌蛋白质抗原可用作本发明偶联物的运载体蛋白、其它偶联物的运载体蛋白或非偶联蛋白质抗原。金黄色葡萄球菌糖抗原可用作其它偶联物的糖或用作非偶联糖抗原。

合适的金黄色葡萄球菌糖抗原包括金黄色葡萄球菌的表多糖，它是聚N乙酰基葡糖胺(PNAG)。这种多糖出现在金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌(S.epidermidis)上，可由任一来源分离[214,215]。例如，PNAG可由金黄色葡萄球菌菌株MN8m分离[216]。糖抗原可以是具有细菌表多糖纯化过程中产生的大小的多糖，或者可以是这类多糖片段化产生的多糖，例如大小可以是从400kDa以上到75和400kDa之间，或者10和75kDa之间，或者至多30个重复单位。糖抗原可具有各种N乙酰化程度，如参考文献217所述，PNAG可以是小于40%N乙酰化的(如小于35、30、20、15、10或5%N-乙酰化的；脱乙酰化的PNAG也称为dPNAG)。PNAG的脱乙酰化表位可引发能够介导调理杀伤作用的抗体。参考文献218中描述了dPNAG的制备。PNAG可能是或不是O-琥珀酰化的，例如它可能是在少于25、20、15、10、5、2、1或0.1%残基上O-琥珀酰化的。PNAG可偶联于上述运载体分子，或者是未偶联的。

另一合适的金黄色葡萄球菌糖抗原是336型抗原，它是无O-乙酰化的β连接的己糖胺[219，220]。336型抗原与用336菌株(ATCC 55804)产生的抗体能发生交叉反应。336型抗原可偶联于上述运载体分子，或者是未偶联的。

合适的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原包括以下金黄色葡萄球菌抗原(或包含其免疫原性片段的抗原)[例如，参见参考文献221-228]：AhpC、AhpF、自溶素酰胺酶、自溶素氨基葡糖苷酶、胶原结合蛋白CAN、EbhB、GehD脂肪酶、肝素结合蛋白HBP(17kDa)、层粘连蛋白受体、MAP、MntC(也称为SitC)、MRPII、NP酶(Npase)、ORF0594、ORF0657n、ORF0826、PBP4、RAP(RNAIII激活蛋白)、Sai-1、SasK、SBI、SdrG、SdrH、SSP-1、SSP-2和玻连蛋白结合蛋白。

其他合适的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原包括clfA抗原；clfB抗原；sdrE2抗原；sdrC抗原；sasF抗原，emp抗原；sdrD抗原；spa抗原；esaC抗原；esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；isdC抗原；Hla抗原；sta011抗原；isdA抗原；isdB抗原；和sta073抗原，如上所述。本发明组合物中可存在这些抗原中的一种或多种(即1、2、3、4、5、6或多种)。这些抗原中，特别考虑到使用esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；Hla抗原；sta011抗原；和/或sta073抗原中的一种或多种(即1、2、3、4、5、6或多种)。

例如，本发明组合物还可包含金黄色葡萄球菌蛋白质抗原的下述组合之一：

(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和Hla抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如具有esxA抗原下游的esxB抗原的EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(3)esxA抗原、esxB抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(5)esxA抗原、esxB抗原和Hla抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(6)Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原。Hla抗原可以是脱毒突变体，例如包括H35L突变。

(7)esxA抗原和esxB抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(8)esxA抗原、esxB抗原和sta006抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(9)esxA抗原、esxB抗原、sta011抗原和sta073抗原。esxA和esxB抗原可联合用作杂交多肽，如下所述，例如EsxAB杂交体。

(10)sta006抗原和sta011抗原。

其他金黄色葡萄球菌抗原可参见参考文献229。

clfA

′clfA′抗原注释为′聚集因子A′。在NCTC 8325菌株中，clfA是SAOUHSC_00812且具有氨基酸序列SEQ ID NO：1(GI:88194572)。在Newman菌株中，它是nwmn_0756(GI:151220968)。

有用的clfA抗原可引发识别SEQ ID NO：1的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：1有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：1的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些clfA蛋白包括SEQ IDNO：1的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:1的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：1C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ IDNO:1N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：1的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO:1的最后368个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO:1的前39个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO:2是SEQ ID NO:1的有用片段(‘ClfA40-559’)。该片段省去接近SEQ IDNO:1的C末端的长重复区。

clfB

′clfB′抗原注释为′聚集因子B′。在NCTC 8325菌株中，clfB是SAOUHSC_02963且具有氨基酸序列SEQ ID NO：3(GI:88196585)。在Newman菌株中，它是nwmn_2529(GI:151222741)。

有用的clfB抗原可引发识别SEQ ID NO：3的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：3有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：3的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些clfB蛋白包括SEQ IDNO：3的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:3的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：3C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ IDNO：3N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：3的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO:3的最后40个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：3的前44个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，ClfB是长蛋白质，因此使用片段有帮助，例如对纯化、处理、融合、表达等有帮助。

SEQ ID NO：4是SEQ ID NO：3的有用片段(‘ClfB_45-552’)。该片段包括ClfB的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。基于ClfB的3结构域模型的其他有用片段包括：ClfB_45-360(也称为CLfBN12；SEQ ID NO：5)；ClfB_212-542(也称为CLfBN23；SEQ ID NO：6)；和ClfB_360-542(也称为CLfB N3；SEQ ID NO：7)。

sdrE2

′sdrE2′抗原注释为′富含Ser-Asp的纤维蛋白原/骨涎蛋白结合蛋白SdrE′。在Newman菌株中，sdrE2是NWMN_0525且具有氨基酸序列SEQ ID NO：8(GI:151220737)。

有用的sdrE2抗原可引发识别SEQ ID NO：8的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：8有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：8的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrE2蛋白包括SEQ IDNO：8的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:8的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：8C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ IDNO：8N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：8的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:8的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：8的前52个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrE2是长蛋白质，因此使用片段非常有帮助，例如对纯化、处理、融合、表达等有帮助。

SEQ ID NO：9是SEQ ID NO：8的有用片段(‘SdrE_53-632’)。该片段包括SdrE2的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。

sdrC

′sdrC′抗原注释为″sdrC蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sdrC是SAOUHSC_00544且具有氨基酸序列SEQ ID NO：10(GI:88194324)。

有用的sdrC抗原可引发识别SEQ ID NO：10的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：10有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：10的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrC蛋白包括SEQID NO：10的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:10的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:10C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:10N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:10的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:10的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：10的前50个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrC是长蛋白质，因此使用片段有帮助，例如对纯化、处理、融合、表达等有帮助。

SEQ ID NO:11是SEQ ID NO:10的有用片段(‘SdrC_51-518’)。该片段包括SdrC的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。

sasF

′sasF′抗原注释为′sasF蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sasF是SAOUHSC_02982且具有氨基酸序列SEQ ID NO：12(GI:88196601)。

有用的sasF抗原可引发识别SEQ ID NO：12的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：12有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：12的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sasF蛋白包括SEQID NO：12的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:12的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：12C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO：12N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：12的至少一个表位。有用的是，可省去SEQID NO:12的最后39个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：12的前37个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

emp

′emp′抗原注释为′胞外基质和胞浆结合蛋白′。在NCTC 8325菌株中，emp是SAOUHSC_00816且具有氨基酸序列SEQ ID NO：13(GI:88194575)。在Newman菌株中，它是nwmn_0758(GI:151220970)。

有用的emp抗原可引发识别SEQ ID NO：13的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：13有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：13的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些emp蛋白包括SEQ IDNO：13的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:13的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:13C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:13N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:13的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO：13的前26个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO：14、15、16和17是SEQ ID NO：13的有用片段(分别是‘Emp_35-340’、‘Emp_27-334’、‘Emp_35-334’和‘Emp_27-147’)。

sdrD

′sdrD′抗原注释为′sdrD蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sdrD是SAOUHSC_00545且具有氨基酸序列SEQ ID NO：18(GI:88194325)。

有用的sdrD抗原可引发识别SEQ ID NO：18的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：18有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：18的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sdrD蛋白包括SEQID NO：18的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:18的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:18C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:18N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:18的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:18的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：18的前52个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。天然情况下，SdrD是长蛋白质，因此使用片段非常有帮助，例如对纯化、处理、融合、表达等有帮助。

SEQ ID NO：19是SEQ ID NO：18的有用片段(‘SdrD_53-592’)。该片段包括SdrD的最暴露区域，更容易工业规模应用。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。另一具有相同C末端残基的有用片段是SdrD_394-592(也称为SdrD-N3；SEQID NO：20)。

spa

′spa′抗原注释为‘蛋白A’或‘SpA’。在NCTC 8325菌株中，spa是SAOUHSC_00069且具有氨基酸序列SEQ ID NO：21(GI:88193885)。在Newman菌株中，它是nwmn_0055(GI:151220267)。所有金黄色葡萄球菌菌株均表达良好表征的毒力因子spa的结构基因，其细胞壁锚定的表面蛋白产物具有五个高度同源的免疫球蛋白结合域，称为E、D、A、B和C[230]。这些结构域在氨基酸水平显示~80%相同性，长度为56-61个残基，并组织成串联重复[231]。SpA合成为具有N末端信号肽和C末端分选肽的前体蛋白[232，233]。细胞壁锚定的spa在葡萄球菌表面的展示丰度高[234，235]。其免疫球蛋白结合域各自由抗-平行α-螺旋构成，它们组装成三个螺旋束并可结合免疫球蛋白G(IgG)的Fc结构域[236，237]、IgM的VH3重链(Fab)(即B细胞受体)[238]、血管假性血友病因子的A1结构域[239]和/或TNF-α受体I(TNFRI)[240]，其出现在呼吸道上皮表面上。

有用的spa抗原可引发识别SEQ ID NO：21的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：21有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：21的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些spa蛋白包括SEQ IDNO：21的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:21的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:21C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:21N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:21的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:21的最后35个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：21的前36个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。参考文献241提示单个IgG结合域可能是有用的免疫原，可单用或联用。

SEQ ID NO：22是SEQ ID NO：21的有用片段(‘Spa_37-325’)。此片段含有所有五个SpAIg-结合域，并包括SpA的最暴露结构域。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。其他有用片段可省去天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个。如参考文献241的报道，其他有用片段可仅包括天然A、B、C、D和/或E结构域中的1、2、3或4个，例如仅包括SpA(A)结构域但不包括B-E，或者仅包括SpA(D)结构域但不包括A、B、C或E等。因此，本发明所用的spa抗原可包括1、2、3、4或5个IgG结合域，但理想情况下具有4个或更少。如果抗原仅包括一种类型的spa结构域(如只有Spa(A)或SpA(D)结构域)，它可包括一个以上拷贝的该结构域，例如在一条多肽链中包括多个SpA(D)结构域。该抗原内的单独结构域可相对于SEQ ID NO:21在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸上发生突变(例如，参见参考文献241，公开了在结构域D的残基3和/或24上的突变，在结构域A的残基46和/或53上的突变等)。这类突变体不应消除抗原引发识别SEQ ID NO:21的抗体的能力，但可消除抗原结合IgG的能力。在某些方面，spa抗原包括(a)结合IgG Fc的SpA结构域A、B、C、D和/或E的亚结构域中一个或多个氨基酸取代，其破坏或降低与IgG Fc结合，和(b)结合V_H3的SpA结构域A、B、C、D和/或E的亚结构域中一个或多个氨基酸取代，其破坏或降低与V_H3结合。在某些实施方式中，变体SpA包括至少或至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种变异SpA结构域D肽。

esaC

′esaC′抗原注释为′esaC′。在NCTC 8325菌株中，esaC是SAOUHSC_00264且具有氨基酸序列SEQ ID NO：23(GI:88194069)。

有用的esaC抗原可引发识别SEQ ID NO：23的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：23有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：23的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更高)。这些esaC蛋白包括SEQ ID NO：23的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:23的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：23C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO:23N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ IDNO:23的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

esxA

′esxA′抗原注释为′蛋白质′。在NCTC 8325菌株中，esxA是SAOUHSC_00257且具有氨基酸序列SEQ ID NO：24(GI:88194063)。

有用的esxA抗原可引发识别SEQ ID NO：24的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：24有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：24的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90或更高)。这些esxA蛋白包括SEQ ID NO：24的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:24的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：24C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO:24N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:24的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

esxB

′esxB′抗原注释为′esxB′。在NCTC 8325菌株中，esxB是SAOUHSC_00265且具有氨基酸序列SEQ ID NO：25(GI:88194070)。

有用的esxB抗原可引发识别SEQ ID NO：25的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：25有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：25的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或更高)。这些esxB蛋白包括SEQ ID NO：25的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:25的表位。其他优选片段缺少SEQ ID NO：25C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：25N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ IDNO:25的至少一个表位。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

sta006

′sta006′抗原注释为′铁色素结合蛋白′，在文献中也称为‘FhuD2’[242]。在NCTC8325菌株中，sta006是SAOUHSC_02554且具有氨基酸序列SEQ ID NO：26(GI:88196199)。在Newman菌株中，它是nwmn_2185(GI:151222397)。

有用的sta006抗原可引发识别SEQ ID NO：26的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：26有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：26的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta006蛋白包括SEQ ID NO：26的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:26的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：26C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：26N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:26的至少一个表位。有用的是，可省去SEQID NO：26的前17个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。sta006的突变形式可参见参考文献243。sta006抗原可脂化，例如用酰基化N末端半胱氨酸脂化。

isdC

′isdC′抗原注释为′蛋白质′。在NCTC 8325菌株中，isdC是SAOUHSC_01082且具有氨基酸序列SEQ ID NO：27(GI:88194830)。

有用的isdC抗原可引发识别SEQ ID NO：27的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：27有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：27的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200或更高)。这些isdC蛋白包括SEQ IDNO：27的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:27的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:27C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:27N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:27的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:27的最后39个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：27的前28个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。IsdB的有用片段可参见参考文献249。

参考文献244公开了有用地可包含来自IsdB和IsdH的表位的抗原。

Hla

′Hla′抗原是′α-溶血素前体′，也称为′α毒素′或′溶血素′。在NCTC 8325菌株中，Hla是SAOUHSC_01121且具有氨基酸序列SEQ ID NO：28(GI:88194865)。在Newman菌株中，它是nwmn_1073(GI:151221285)。Hla是大部分金黄色葡萄球菌菌株产生的重要毒力决定因子，具有成孔活性和溶血活性。在动物模型中抗-Hla抗体可中和毒素的有害作用，Hla在保护对抗肺炎方面特别有用。

有用的Hla抗原可引发识别SEQ ID NO：28的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：28有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：28的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些Hla蛋白包括SEQ IDNO：28的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:28的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:28C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:28N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:28的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO：28的前26个N末端氨基酸。也可以在C末端截短，例如只留下50个氨基酸(SEQ ID NO:28的残基27-76)[245]。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

本发明组合物可通过化学灭活(如使用甲醛、戊二醛或其他交联试剂)避免Hla的毒性。然而取而代之的是，优选使用Hla的突变形式，其消除了毒性活性但保持了免疫原性。这类脱毒突变体是本领域已知的。一种有用的Hla抗原在SEQ ID NO：28的残基61上有突变，该残基是成熟抗原的残基35(即省去前26个N末端氨基酸)。因此，残基61可能不是组氨酸，而可能是，例如Ile、Val或优选的Leu。该位置上也可使用His-Arg突变。例如，SEQ ID NO：29是成熟突变体Hla-H35L序列，有用的Hla抗原包括SEQ ID NO:29。另一有用突变用短序列代替长环，例如用四聚体如PSGS(SEQ ID NO:30)代替SEQ IDNO:28的残基136-174的39聚体，例如在SEQ ID NO:31(还包括H35L突变)和SEQ ID NO:32(不包括H35L突变)中。

其它有用的Hla抗原可参见参考文献246和247。

SEQ ID NO：33、34和35分别是SEQ ID NO：28的三个有用片段(分别为‘Hla27-76’、‘Hla27-89’和‘Hla27-79’)。SEQ ID NO：36、37和38是来自SEQ ID NO：29的相应片段。

sta011

′sta011′抗原注释为′脂蛋白′。在NCTC 8325菌株中，sta011是SAOUHSC_00052且具有氨基酸序列SEQ ID NO：39(GI:88193872)。

有用的sta011抗原可引发识别SEQ ID NO：39的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：39有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：39的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta011蛋白包括SEQ ID NO：39的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:39的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：39C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO：39N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：39的至少一个表位。有用的是，可省去SEQID NO：39的前23个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。sta006抗原可脂化，例如用酰基化N末端半胱氨酸脂化。

可用于制备sta011抗原的SEQ ID NO:39的变体形式包括但不限于具有各种Ile/Val/Leu取代的SEQ ID NO：40、41和42。

isdA

′isdA′抗原注释为′IsdA蛋白′。在NCTC 8325菌株中，isdA是SAOUHSC_01081且具有氨基酸序列SEQ ID NO：43(GI:88194829)。在Newman菌株中，它是nwmn_1041(GI:151221253)。

有用的isdA抗原可引发识别SEQ ID NO：43的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：43有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：43的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些isdA蛋白包括SEQID NO：43的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO:43的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO:43C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO:43N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:43的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ IDNO:43的最后38个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：43的前46个N末端氨基酸。截短以排除SEQ ID NO:43的C末端38聚体(从LPKTG基序开始)也是有用的。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

SEQ ID NO:44是SEQ ID NO:43的有用片段(SEQ ID NO:43的氨基酸40-184；‘IsdA40-184’)，其包括天然蛋白的血红素结合位点并包括抗原的最暴露结构域。它也降低该抗原与人蛋白的相似性。其它有用片段可参见参考文献248和249。

IsdA不能良好地吸附于氢氧化铝佐剂，因此组合物中的IsdA可能不吸附或吸附于另选佐剂如磷酸铝。

isdB

′isdB′抗原注释为′神经丝蛋白isdB′。在NCTC 8325菌株中，isdB是SAOUHSC_01079且具有氨基酸序列SEQ ID NO：45(GI:88194828)。已有人提出将IsdB自身用作疫苗抗原[250]，但这可能无法预防肺炎。

有用的isdB抗原可引发识别SEQ ID NO：45的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：45有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：45的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些isdB蛋白包括SEQID NO：45的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:45的表位。其他优选片段缺少SEQ IDNO：45C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQID NO：45N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO：45的至少一个表位。有用的是，可省去SEQ ID NO:45的最后36个C末端氨基酸。有用的是，可省去SEQ ID NO：45的前40个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。IsdB的有用片段可参见参考文献249和251，例如缺少SEQID NO:45的37个内部氨基酸。

在一些实施方式中，本发明组合物不包括isdB抗原。

sta073

′sta073′抗原注释为′双官能自溶素前体′。在NCTC 8325菌株中，sta073是SAOUHSC_00994且具有氨基酸序列SEQ ID NO：46(GI:88194750)。在Newman菌株中，它是nwmn_0922(GI:151221134)。蛋白组学分析揭示出这种蛋白质是分泌型或表面暴露型。

有用的sta073抗原可引发识别SEQ ID NO：46的抗体(例如给予人时)和/或可包含某氨基酸序列，所述氨基酸序列(a)与SEQ ID NO：46有50%或更高相同性(例如60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：46的至少′n′个连续氨基酸的片段，其中′n′是7或更高(例如8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高)。这些sta073蛋白包括SEQ ID NO：46的变体。(b)的优选片段包含来自SEQ IDNO:46的表位。其他优选片段缺少SEQID NO：46C末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)和/或SEQ ID NO:46N末端的一个或多个氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多个)，而保留SEQ ID NO:46的至少一个表位。有用的是，可省去SEQID NO：46的前24个N末端氨基酸。其它片段缺少一个或多个蛋白质结构域。

Sta073不能良好地吸附于氢氧化铝佐剂，因此组合物中的Sta073可能不吸附或吸附于另选佐剂如磷酸铝。

杂交多肽

本发明所用的金黄色葡萄球菌蛋白抗原可以单独多肽的形式存在于组合物中。然而，使用一种以上抗原时，它们不一定以单独多肽的形式存在。取而代之的是，至少两种(如2、3、4、5或更多种)抗原可表达成一条多肽链(‘杂交’多肽)。杂交多肽主要提供以下两个优点：首先，本身不稳定或者表达较差的多肽可以通过加入能够克服该问题的合适杂交伴侣得到改善；其次，商业生产得以简化，因为只需利用一次表达和纯化以生产可作抗原应用的两种多肽。

杂交多肽可包含来自上述各抗原的两种或多种多肽序列，或在该序列在菌株之间有部分变化的情况下，可包含相同抗原的两种或多种变体。

可使用由两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种抗原的氨基酸序列组成的杂交体。具体说，优选由两种、三种、四种或五种抗原，如两种或三种抗原的氨基酸序列组成的杂交体。

不同的杂合多肽可以在单一制剂中混合在一起。杂交体可与选自第一、第二或第三抗原组的非杂交抗原组合。在这类组合中，抗原可以一种以上杂交多肽和/或非杂交多肽的形式存在。然而，抗原优选以杂合或者非杂合形式存在，但不同时以两种形式存在。

杂交多肽可以通式NH₂-A-{-X-L-}_n-B-COOH表示，其中：X是金黄色葡萄球菌抗原的氨基酸序列，如上所述；L是任选接头的氨基酸序列；A是任选的N末端氨基酸序列；B是任选的C末端氨基酸序列；n是2或更大的整数(如2、3、4、5、6等)。n通常是2或3。

如果野生型形式中-X-部分具有前导肽序列，那么在杂交蛋白中可以包含或者略去该序列。在一些实施方式中，前导肽可缺失，除非-X-部分位于杂合蛋白的N-末端，即保留X₁的前导肽，但略去X₂...X_n的前导肽。这相当于删除所有前导肽并使用X₁的前导肽作为-A-部分。

在{-X-L-}的各个n值的情况下，接头氨基酸序列-L-可存在或不存在。例如，当n=2时，杂交体可以是NH₂-X₁-L₁-X₂-L₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-L₁-X₂-COOH、NH₂-X₁-X₂-L₂-COOH等。接头氨基酸序列-L-一般较短(如20个或更少的氨基酸，即20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1)。例子包括有利于克隆的短肽序列，聚-甘氨酸接头(即包含Gly_n，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高)，组氨酸标签(即His_n，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更高)。本领域技术人员显然了解其它合适的接头氨基酸序列。有用的接头是GSGGGG(SEQ ID NO：47)或GSGSGGGG(SEQ ID NO:48)，Gly-Ser二肽由BamHI限制位点形成，因而有助于克隆和操作，(Gly)₄四肽是常用的多聚甘氨酸接头。其它合适接头，特别是用作最后L_n的是ASGGGS(SEQ ID NO:49，例如由SEQ ID NO:50编码)或Leu-Glu二肽。

-A-是任选的N末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸，即40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白运输的前导序列，或有利于克隆或纯化的短肽序列(如组氨酸标签，即His_n，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多)。其它合适的N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。如果X₁缺少其自身的N-末端甲硫氨酸，-A-优选是提供N-末端甲硫氨酸的寡肽(例如，具有1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸)，如Met-Ala-Ser或单个Met残基。

-B-是任选的C末端氨基酸序列。其一般较短(如40个或更少的氨基酸，即39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个)。例子包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列(如包含组氨酸标签，即His_n，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更多，如SEQ ID NO:51)，或能提高蛋白质稳定性的序列。其它合适的C末端氨基酸序列对于本领域技术人员来说是显而易见的。

一种本发明杂交多肽可包括EsxA和EsxB抗原。它们从N至C末端的顺序任意。SEQID NO：52(‘EsxAB’；由SEQ ID NO：53编码)和54(‘EsxBA’)是这类杂交体的例子，它们均具有六肽接头ASGGGS(SEQ ID NO：49)。

概述

除非另有说明，本发明的实施将采用常规的化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学方法，这些方法是所述领域技术人员已知的。这些技术在文献中已有充分描述。见例如文献252-259等。

上文使用“GI”编号。GI号码，或者“基因信息识别号”(GenInfo Identifier)是NCBI将序列加入其数据库时，连续对每一序列记录指定的一串数字。GI编号与序列记录登录号没有相似之处。序列更新(如纠正或加入更多注释或信息)后，将接受新GI编号。因此与给定GI编号相关的序列是不变的。

两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。利用本领域所知软件程序，例如参考文献260的7.7.18部分所描述的软件程序，可进行比对并确定同源性百分数或序列相同性百分数。优选通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法进行比对，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献261中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。

当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B细胞表位和/或T细胞表位.可凭经验鉴定此类表位(如使用PEPSCAN[262，263]或相似方法)，或可对其进行预测(如使用詹姆森-沃尔夫抗原性指数(Jameson-Wolf antigenic index)[264]、基于矩阵的方法[265]、MAPITOPE[266]、TEPITOPE[267，268]、神经网络[269]、OptiMer和EpiMer[270,271]、ADEPT[272]、T位点[273]、亲水性[274]、抗原性指数[275]或276-280等参考文献中公开的方法)。表位是抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并结合的抗原的某部分，它们也称作“抗原决定簇”。

当抗原“结构域”被省略时，可以包括省略信号肽、胞质结构域、跨膜结构域、胞外结构域等。

术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。

与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10%。

术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。

当本发明提供一种涉及多个连续步骤的方法时，本发明还可以提供涉及比步骤总数少的方法。例如，本发明提供一种方法，其包括以下步骤：(a)解聚金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖得到多糖片段；和(b)氧化该片段以将醛基引入该片段中的至少一个糖残基上，得到氧化糖残基。不一定需要进行其它步骤(c)才能落入本发明范围，因为步骤(a)和(b)的产物可用作偶联物制备过程中的中间体，并且可使用、储存、出口等以便进行单独和后随的使用。这种后随应用可包括进行步骤(c)。或者，方法(a)和(b)的产物可以不同方式偶联于运载体分子，例如通过氧化糖残基中保留的羟基或羧基。

相似地，起始多糖材料已被部分加工时，本发明包括仅涉及某方法的后续步骤的方法。例如，本发明包括一种包括以下步骤的方法：通过醛基将5型或8型荚膜多糖中的氧化糖残基偶联于运载体分子，其中该方法的起始原料是先前解聚得到多糖片段、然后通过氧化向糖残基中引入醛基的5型或8型荚膜多糖。

可在不同时间由不同人员在不同地点(例如在不同国家)进行这些不同的步骤。

应理解糖环可以是开放或闭合形式，而且虽然本文结构式中显示的是闭合形式，但本发明也包括开放形式。类似的，应理解糖可以吡喃糖和呋喃糖形式存在，而且虽然本文的结构式中显示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。还可包含糖的不同异头形式。

伯胺可由式NH₂R表示。R基团通常是电子供体，包括C_1-8烃基，特别是C_1-8烷基，尤其是甲基。R常常是CH₃、C₂H₅或C₃H₇。烃基可用以下一个或多个基团取代，例如：卤素(如Cl、Br、F、I)、三卤甲基、NO₂、CN、N⁺(C_1-6烷基)₂O-、SO₃H、SOC_1-6烷基、SO₂C_1-6烷基、SO₃C_1-6烷基、OC(=O)OC_1-6烷基、C(=O)H、C(=O)C_1-6烷基、OC(=O)C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)₂、C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)₂、C(=O)N(C_1-6烷基)2、N(C_1-6烷基)C(=O)O(C_1-6烷基)、N(C_1-6烷基)C(=O)N(C_1-6烷基)₂、CO₂H、OC(=O)N(C_1-6烷基)₂、N(C_1-6烷基)C(=O)C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)C(=S)C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)SO₂N(C_1-6烷基)₂、CO₂C_1-6烷基、SO₂N(C_1-6烷基)₂、C(=O)NH₂、C(=S)N(C_1-6烷基)2、N(C_1-6烷基)SO₂C_1-6烷基、N(C_1-6烷基)C(=S)N(C_1-6烷基)₂、NHC_1-6烷基、SC_1-6烷基或OC_1-6烷基。术语‘烃基’包括由碳和氢组成的直链、支链或环状单价基团。因此，烃基包括烷基、烯基和炔基，环烷基(包括多环烷基)、环烯基和芳基和其组合，如烷基环烷基、烷基多环烷基、烷基芳基、烯基芳基、环烷基芳基、环烯基芳基、环烷基烷基、多环烷基烷基、芳基烷基、芳基烯基、芳基环烷基和芳基环烯基。烃基通常是C_1-14烃基，更具体是C_1-8烃基。

附图简述

图1显示利用己二酸双肼接头和碳二亚胺化学法制备金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的方案。

图2a显示利用己二酸双肼接头和碳二亚胺化学法制备金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的SDS-PAGE分析。图2a显示利用己二酸双肼接头和碳二亚胺化学法制备金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的S300Sephacryl^TM色谱图。

图3显示解聚的5型荚膜多糖的S300Sephacryl^TM色谱图。

图4A比较了解聚和天然5型荚膜多糖在¹H异头区中的1D ¹H信号。标出了一些显著的差异。图4B和4C分别比较这些多糖在2D(¹H，¹H)标量耦合谱的异头和甲基-岩藻糖区域的信号。标出了一些显著的差异。

图5a显示用本发明方法制备的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的SDS-PAGE分析。图5b显示用本发明方法制备的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的S300Sephacryl^TM色谱图。

图6显示在不同条件下解聚的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的S300Sephacryl^TM色谱图。

图7显示用本发明方法制备的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖-CRM197偶联物的SDS-PAGE分析。

图8显示金黄色葡萄球菌感染的小鼠肾脓肿模型对多种抗原的IgG应答。

图9比较小鼠肾脓肿模型对各种抗原的IgG和IgM应答。

图10显示小鼠肾脓肿模型对各种抗原的保护性应答。

图11比较小鼠肾脓肿模型对各种偶联物的IgG应答。

图12比较小鼠肾脓肿模型对各种偶联物的保护性应答。

图13A和13B比较小鼠肾脓肿模型对其它偶联物的保护性应答。

图14比较小鼠肾脓肿模型对其它偶联物的IgG和IgM应答。

图15比较小鼠肾脓肿模型对配有不同佐剂的其它偶联物的保护性应答。

图16比较金黄色葡萄球菌感染的小鼠致死模型对各种抗原的应答。

图17显示用2M盐酸解聚的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的SEC-HPLC色谱图。

图18显示用2M盐酸解聚的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的NMR谱图。

具体实施方式

偶联物的生产和鉴定

采用碳二亚胺化学法和己二酸双肼接头将纯化的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖偶联于CRM197，这种方法类似于参考文献2所用方法(见下)。在这种方法中，荚膜多糖偶联于用EDC衍生化的CRM197(图1)。该反应涉及荚膜多糖的羧基。碳二亚胺(EDC)激活羧基，使其结合衍生化运载体蛋白(CRMadh)的-NH₂基团，形成酰胺键。衍生化的CRMadh是用相同的碳二亚胺化学法制备的。

CRMadh制备：

向CRM197溶液中加入100mM MES pH6.0缓冲液，以达到最终浓度10-12mg/ml。然后加入3.5mg/ml ADH(己二酸二酰肼)和0.15(EDC/CRM，w/w)，将该反应保持在室温下并温和搅拌1h。然后，先用200mM NaCl、10mM MESpH7.3缓冲液，再用5mM MES pH7.0缓冲液，借助6-8kDa膜(SP公司(SpectraPor))对该混合物进行透析。该产物由MicroBCA、SDS-PAGE(3-8%)、HPLC和MS鉴定。发现CRMadh被6-8个ADH接头衍生化。

偶联反应：

以2mg/mL的荚膜多糖浓度，在50mM MES缓冲液pH6.04中进行该偶联反应。将衍生化的运载体蛋白CRMadh加入荚膜多糖溶液中，至终浓度为4.0mg/ml。将该溶液保持室温3小时。该反应混合物中的多糖:蛋白质比例为1:2(重量/重量)，多糖:EDC比例为1:6.66(当量/当量)，多糖:磺基NHS比例为1:0.53(当量/当量)。

3小时后，利用3-8%Tris-乙酸盐凝胶(英杰公司(Invitrogen))，通过SDS-PAGE验证偶联物的形成(图2a)。偶联后，通过凝胶过滤层析纯化偶联物(在Akta^TM系统(GE健康护理公司(G&E Healthcare))上通过S300Sephacryl^TM树脂(GE健康护理公司)，用10mM NaPi，10mM NaCl，pH7.2流动相缓冲液进行)。在215nm、254nm和280nm上检测到该偶联物(图2b)。将偶联物溶液储存于-20℃待用。偶联物中的总糖通过HPAEC-PAD分析测定，蛋白质含量通过MicroBCA实验测定，如参考文献281所述(表1)。

偶联物(批次)	蛋白质(μg/ml)	糖(μg/ml)	糖/蛋白质(w/w)
				1	26.00	12.10	0.47
2	33.90	11.00	0.32
				3	62.21	29.40	0.47
4	45.21	9.30	0.21

表1

用本发明方法将纯化的金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜多糖单独偶联于CRM197(见下)。

解聚

将纯化的荚膜多糖溶解于蒸馏水，浓度为2mg/mL。加入乙酸至终浓度为2%(v/v)，将反应保持在90℃3小时(或在B批次的情况下保持过夜)。然后用1M NaOH中和该溶液，解聚多糖在凝胶过滤柱上纯化(在Akta^TM系统(GE健康护理公司)上通过S300Sephacryl^TM树脂(GE健康护理公司)，用10mMNaPi，10mM NaCl，pH7.2流动相缓冲液进行)。在215nm检测到该糖(图3)。借助1kDa膜(SP公司(SpectraPor))，用蒸馏水对汇集组分进行透析，然后冻干。

利用¹HNMR验证切割位点为5型多糖内的(1→3)糖苷键。简要说，将天然和解聚的5型荚膜多糖的样品冻干以消除质子化的水溶剂，并溶解于氧化氘(99.9%氘，西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))。所有NMR谱图都在50℃下，利用布鲁克(Bruker)Avance III型400MHz摄谱仪，以5-mm宽带探针记录，用TopSpin 2.1软件包(布鲁克公司(Bruker))进行数据获取和加工。用标准单脉冲实验采集1D ¹H谱图，谱宽为4,000Hz，采集32k数据点。将发射机设定到残留HDO频率(4.79ppm)。用全部再循环时间以定量方式获得谱图，以保证完全覆盖各信号(5x纵向松弛时间T1)。应用0.2Hz行展宽函数后，对谱图进行傅立叶变换。用DQF-COSY脉冲序列记录2D(¹H，¹H)标量校正谱。在F2区域采集到4096个数据点，在F1区域采集到256个。

将天然多糖的1D¹H信号与公开值作比较，发现它们一致(表2)。

*4.484ppm处的HDO信号

**Jones C，Carbohydr.Res.2005，340(6)，1097-1106-4.484ppm处的HDO信号

***Jones C.Carbohydr.Res.2005，340(6)，1097-1106-H1L-FucNAc=5.005ppm，因此HDO信号在4.532ppm处，而非4.484ppm处

表2

图4A比较了解聚和天然多糖在¹H异头区中的1D ¹H信号。图4B和4C分别比较这些多糖在2D(¹H，¹H)标量耦合谱的异头和甲基-岩藻糖区域的信号。数据表明，乙酸处理导致切割5型荚膜多糖中α-L-FucNAc(3OAc)和β-D-FucNAc残基之间的(1→3)糖苷键。

氧化

将解聚的荚膜多糖溶解于蒸馏水，浓度为2mg/mL。加入NaIO₄，多糖:NaIO₄比例为1:1(重量/重量)，将该反应避光保持在室温下1-2小时。接着，借助1kDa膜(SP公司(SpectraPor))，用蒸馏水对该溶液进行透析，然后再次冻干。

偶联

将氧化的荚膜多糖溶解于200mM NaPi，1M NaCl，pH7.2缓冲液中，浓度为10mg/mL。将CRM197加入溶液中，多糖:蛋白质比例为4:1(重量/重量)；还加入NaBH₃CN(奥德里奇公司(Aldrich))，糖:NaBCNH₃比例为2:1(重量/重量)。溶液保持在37℃ 2天。用SDS-PAGE确认偶联物的形成(5型偶联物见图5a)。偶联后，通过凝胶过滤层析纯化偶联物(在AktaTM系统(GE健康护理公司)上通过S300Sephacryl^TM树脂(GE健康护理公司)，用10mM NaPi，10mMNaCl，pH7.2流动相缓冲液进行)。在215nm、254nm和280nm检测到该偶联物(5型偶联物见图5b)。将偶联物溶液储存于-20℃待用。通过HPAEC-PAD分析确定该偶联物的总糖，通过MicroBCA分析确定蛋白质含量(5型偶联物见表3a，8型偶联物见表3b)。

偶联物(批次)	蛋白质(μg/ml)	糖(μg/ml)	糖/蛋白质(w/w)
				A	51.52	1.72	0.03
B	161.80	17.10	0.11
				C	34.42	4.22	0.12
D	40.56	12.70	0.31
				E	196.00	55.17	0.28

表3a:

偶联物(批次)	蛋白质(μg/ml)	糖(μg/ml)	糖/蛋白质(w/w)
				α	518.00	82.30	0.16
β	11.00	7.94	0.72
				γ	23.22	5.57	0.24
δ	22.87	5.08	0.22

表3b

利用本发明的另一种方法将纯化的金黄色葡萄球菌5型偶联于CRM197。在该方法中，如上所述进行解聚、氧化和偶联步骤，但用上述衍生化的运载体蛋白(CRMadh)而非CRM197进行偶联步骤。偶联物中的总糖通过HPAEC-PAD分析测定，蛋白质含量通过MicroBCA实验测定(表4)。

偶联物(批次)	蛋白质(μg/ml)	糖(μg/ml)	糖/蛋白质(w/w)
				A’	58.25	2.49	0.043

表4

另选的解聚方法

在其它研究中，检测不同条件下纯化荚膜多糖的解聚。将所述多糖溶解于蒸馏水，浓度为2mg/mL。加入乙酸至终浓度为2%或5%(v/v)，将该反应保持在90℃30分钟、3小时、5小时或6小时。然后中和该溶液，并在凝胶过滤柱上纯化，如上所述。在215nm检测到该糖，进行汇集(图6)。

接着氧化汇集组分，并用水透析，如上所述。将该组分偶联于CRM197或CRMadh(如上所述)，通过凝胶过滤色谱纯化所得偶联物，如上所述(图7)。

在另一研究中，对8型荚膜多糖使用0.5M盐酸代替乙酸，将该反应保持在90℃ 2.5小时，其中每30分钟采样一次。通过NMR和SEC-HPLC分析样品。多糖没有水解，O-乙酰化水平几乎保持不变。相反，使用2M盐酸并将反应保持在100℃时，仅在30分钟后就观察到水解。在2.5小时中O-乙酰化水平逐渐降低(图17和18(用圆圈圈出乙酰基峰))。

免疫研究-脓肿模型(1)

总试验方案：根据下述方案免疫小鼠，并通过静脉内注射金黄色葡萄球菌菌悬液进行刺激。在刺激前将金黄色葡萄球菌培养物离心、洗涤两次并用PBS稀释。所需接种体需要进一步稀释，通过琼脂种板和集落形成进行试验验证。在获得器官时，对小鼠施安乐死，取出其肾脏，并用1%Triton X-100匀浆。接着稀释等份，并接种于琼脂培养基以便一式三份地测定CFU。对组织学检测来讲，肾组织在室温下在10%福尔马林中培育24小时。将组织包埋于石蜡，切薄片，用苏木精/伊红染色，显微镜检。

在第0和11天，通过腹膜内注射5μg剂量的抗原免疫3周龄的CD1小鼠，注射体积为200μl。在第0和24天从小鼠采血，在第21天用金黄色葡萄球菌刺激。在第25天获得器官。在8只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫：

第1组–单用明矾

第2组–单用5型荚膜多糖

第3组–5型荚膜多糖加明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第1批)

第5组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第1批)加明矾

偶联物诱导针对5型多糖的特异性IgG应答。明矾配方能提高应答水平(图8)。该偶联物也诱导针对5型多糖的特异性IgM应答(图9)。明矾偶联物配方也产生针对肾感染的最佳保护作用(图10)。

免疫研究-脓肿模型(2)

在第1、14和28天，通过腹膜内注射5μg剂量的抗原免疫3周龄的CD1小鼠，注射体积为200μl。在第0、27和37天从小鼠采血，在第38天用金黄色葡萄球菌刺激。在第42天获得器官。在8只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫：

第1组–单用明矾

第2组–5型荚膜多糖加明矾

第3组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第2批)加明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(批次A’)加明矾

偶联物诱导针对5型多糖的特异性IgG应答。本发明偶联物(批次A’代表)产生特别高的效价(图11)。本发明偶联物产生针对肾感染的最佳保护作用(图12)。

免疫研究-脓肿模型(3)

在第1、14和28天，通过腹膜内注射5μg剂量(或在批次A的情况下使用0.5μg剂量)的抗原免疫3周龄的CD1小鼠，注射体积为200μl。在第0、27和37天从小鼠采血，在第38天用金黄色葡萄球菌(在液体或固体培养基中培养)刺激。在第42天获得器官。在8只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫：

第1组-单用明矾

第2组-5型荚膜多糖加明矾

第3组-5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第2批)加明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第3批)加明矾

第5组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(批次A’)加明矾

第6组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次A)加明矾

第7组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次B)加明矾

本发明偶联物(由批次A’、A和B代表)产生针对肾感染的保护作用(图13A和13B)。本发明偶联物产生高效价的特异性IgG抗体和低效价的IgM抗体(图14)。

免疫研究-脓肿模型(4)

在第1和14天，通过腹膜内注射1μg剂量的抗原免疫3周龄的CD1小鼠，注射体积为200μl。在第0、13和27天从小鼠采血，在第28天用金黄色葡萄球菌刺激。在第32天获得器官。在8或9只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫：

第1组–8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次α)加明矾

第2组–8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次α)加MF59

第3组–单用明矾

第4组–单用MF59

本发明偶联物产生针对肾感染的保护作用(图15)。明矾配方产生的保护作用优于MF59配方。

免疫研究-致死模型(1)

总试验方案：根据下述方案免疫小鼠，并通过腹膜内注射金黄色葡萄球菌菌悬液进行刺激。在刺激前将金黄色葡萄球菌培养物离心、洗涤两次并用PBS稀释。所需接种体需要进一步稀释，通过琼脂种板和集落形成进行试验验证。监测动物14天，记录致死疾病。

通过腹膜内注射5μg剂量的抗原免疫CD1小鼠，注射体积为200μl。在12只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫，然后用5x10⁸CFU的5型金黄色葡萄球菌进行刺激：

第1组-PBS加明矾

第2组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次C)加明矾

第3组-5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(批次3)加明矾

本发明偶联物(由批次C代表)产生较高的存活率(图16)。

免疫研究-致死模型(2)

通过腹膜内注射2μg(糖)和10μ(蛋白质，存在时)剂量的抗原免疫CD1小鼠，注射体积为200μl。在12只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫，然后用5x10⁸CFU的5型金黄色葡萄球菌进行刺激：

第1组–PBS加明矾

第2组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次D)加明矾

第3组–5型荚膜多糖-CRMadh偶联物(第4批)加明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次D)加EsxAB、Sta006和Sta011蛋白以及明矾

第5组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次D)加HlaH35L、Sta006和Sta011蛋白以及明矾

存活数据见表5。

表5

本发明偶联物(由批次D代表)产生较高的存活率。加入金黄色葡萄球菌蛋白质抗原能提高存活率。

免疫研究-致死模型(3)

通过腹膜内注射2μg(5型多糖)、1μg(8型多糖，存在时)和10μ(蛋白质，存在时)剂量的抗原免疫CD1小鼠，注射体积为200μl。在12只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫，然后用5x10⁸CFU的5型金黄色葡萄球菌进行刺激：

第1组-PBS加明矾

第2组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)加EsxAB、Sta006和Sta011蛋白以及明矾

第3组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次β)加EsxAB、Sta006和Sta011蛋白以及明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次β)加EsxAB、Sta011和Sta073蛋白以及明矾

存活数据见表7。

表7

免疫研究-致死模型(4)

通过腹膜内注射2μg(5型荚膜多糖)、1μg(8型荚膜多糖，存在时)和10μ(蛋白质，存在时)剂量的抗原免疫CD1小鼠，注射体积为200μl。在12只小鼠的分组中，按照以下方案进行免疫，然后用5x10⁸CFU的5型金黄色葡萄球菌进行刺激：

第1组–PBS加明矾

第2组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加EsxAB、Sta006和Sta011蛋白以及明矾

第3组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加明矾

第4组–5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加EsxAB蛋白以及明矾

第5组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加Sta006蛋白以及明矾

第6组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加Sta011蛋白以及明矾

第7组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)和8型荚膜多糖-CRM偶联物(批次γ第一剂，批次δ第二剂)加Sta006和Sta011蛋白以及明矾

第8组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)加HlaH35L、Sta006和Sta011蛋白和明矾

第9组-5型荚膜多糖-CRM偶联物(批次E)加HlaH35L蛋白和明矾

存活数据见表8。

表8

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和构思内。

参考文献

[1]Fattom等(1990)Infect Immun.58(7):2367-74.

[2]Fattom等(1992)Infect Immun.60(2):584-9.

[3]Fattom等(1993)Infect Immun.61(3):1023-32.

[4]Fattom等(1996)Infect Immun.64(5):1659-65.

[5]Welch等(1996)J Am Soc Nephrol.7(2):247-53.

[6]Fattom等(1998)Infect Immun.66(10):4588-92.

[7]Fattom等(1993)Vaccine 17(2):126-33.

[8]Fattom等(2002)N Engl J Med.346(7):491-6.

[9]Robbins等(2005)Ann N Y Acad Sci.754:68-82.

[10]Reynaud-Rondier 等(1991)FEMS Microbiology Immunology76:193-200.

[11]Tollersrud等(2001)Vaccine.19(28-29):3896-903.

[12]WO03/061558.

[13]Gilbert等(1994)Vaccine.12(4):369-74.

[14]Moreau等(1990)Carbohydrate Res.339(5):285-91

[15]Fournier等(1984)Infect.Immun.45(1):87-93.

[16]Jones(2005)Carbohydrate Res.340(6):1097-106.

[17]Lemercinier和Jones(1996)Carbohydrate Res.296:83-96.

[18]Jones和Lemercinier(2002)J Pharm Biomed Anal.30(4):1233-47.

[19]WO05/033148

[20]WO 00/56357

[21]Hestrin(1949)J.Biol.Chem.180:249-261.

[22]Konadu等(1994)Infect.Immun.62:5048-5054.

[23]Gilbert等(1994)J.Microb.Meth.20:39-46.

[24]US专利申请61/256,905‘PURIFICATION OF STAPHYLOCOCCUSAUREUS TYPE5and TYPE 8 CAPSULAR SACCHARIDES’(“金黄色葡萄球菌5型和8型荚膜糖的纯化”)NOVARTIS AG(诺华公司).受让人编号53615-US-PSP.

[25]Ramsay等(2001)Lancet 357(9251):195-196.

[26]Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2:S28-36.

[27]Buttery和Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34:163-168.

[28]Ahmad和Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13:113-33,vii

[29]Goldblatt(1998)J.Med.Microbiol.47:563-567.

[30]欧洲专利0477508.

[31]美国专利5,306,492.

[32]WO98/42721.

[33]Dick等，刊于Conjugate Vaccines(《偶联疫苗》)(Cruse等编)Karger,Basel,1989,10:48-114.

[34]Hermanson Bioconjugate Techniques(《赫曼森生物偶联技术》),AcademicPress,San Diego(圣地亚哥的学术出版社)(1996)ISBN:0123423368.

[35]Research Disclosure(研究公开),453077(2002年1月)

[36]Herbelin等(1997)J Dairy Sci.80(9):2025-34.

[37]EP-A-0372501.

[38]EP-A-0378881.

[39]EP-A-0427347.

[40]WO93/17712

[41]WO94/03208.

[42]WO98/58668.

[43]EP-A-0471177.

[44]WO91/01146

[45]Falugi等(2001)Eur J Immunol 31:3816-3824.

[46]Baraldo等(2004)Infect Immun72(8):4884-7.

[47]EP-A-0594610.

[48]Ruan等(1990)J Immunol 145:3379-3384.

[49]WO00/56360.

[50]WO02/091998.

[51]Kuo等(1995)Infect Immun 63:2706-13.

[52]Michon等(1998)Vaccine.16:1732-41.

[53]WO01/72337

[54]WO00/61761.

[55]WO2004/041157.

[56]WO02/34771.

[57]WO99/42130.

[58]WO2004/011027.

[59]WO2007/113222

[60]美国专利6,045,805

[61]美国专利6,027,733和6,274,144.

[62]www.polymer.de

[63]美国专利4,356,170和4,663,160

[64]美国专利4711779.

[65]WO00/10599.

[66]美国专利4,057,685.

[67]WO96/40242.

[68]Lei等(2000)Dev Biol(Basel)103:259-264.

[69]WO00/38711；美国专利6,146,902.

[70]WO2004/080490.

[71]WO2006/032475.

[72]WO2006/032500.

[73]WO2006/065553.

[74]WO2007/118979.

[75]WO99/24578.

[76]WO99/36544.

[77]WO99/57280.

[78]WO00/22430.

[79]Tettelin等(2000)Science 287:1809-1815.

[80]WO96/29412.

[81]Pizza等(2000)Science 287:1816-1820.

[82]WO01/52885.

[83]Bjune等(1991)Lancet 338(8775):1093-1096.

[84]Fukasawa等(1999)Vaccine 17:2951-2958.

[85]Rosenqvist等(1998)Dev.Biol.Stand.92:323-333.

[86]Costantino等(1992)Vaccine 10:691-698.

[87]WO03/007985.

[88]Watson(2000)Pediatr Infect Dis J 19:331-332.

[89]Rubin(2000)Pedatr Clin North Am 47:269-285,v.

[90]Jedrzejas(2001)Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.

[91]Bell(2000)Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.

[92]Iwarson(1995)APMIS 103:321-326.

[93]Gerlich等(1990)Vaccine 8增刊：S63-68和79-80.

[94]Hsu等(1999)Clin Liver Dis 3:901-915.

[95]Gustafsson等(1996)N.Engl.J.Med.334:349-355.

[96]Rappuoli等(1991)TIBTECH9:232-238.

[97]Vaccines(2004)，Plotkin和Orenstein编.ISBN 0-7216-9688-0.

[98]WO02/02606.

[99]Kalman等(1999)Nature Genetics 21:385-389.

[100]Read等(2000)Nucleic Acids Res 28:1397-406.

[101]Shirai等(2000)J.Infect.Dis.181(增刊3)：S524-S527.

[102]WO99/27105.

[103]WO00/27994.

[104]WO00/37494.

[105]WO99/28475.

[106]Ross等(2001)Vaccine 19:4135-4142.

[107]Sutter等(2000)Pediatr Clin North Am 47:287-308.

[108]Zimmerman和Spann(1999)Am Fam Physician 59:113-118,125-126.

[109]Dreesen(1997)Vaccine 15增刊:S2-6.

[110]MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1998年1月16日；47(1):12,19.

[111]McMichael(2000)Vaccine 19增刊1:S101-107.

[112]WO02/34771.

[113]Dale(1999)Infect Dis Clin North Am 13:227-43,viii.

[114]Ferretti等(2001)PNAS USA 98:4658-4663.

[115]WO03/093306.

[116]WO2004/018646.

[117]WO2004/041157.

[118]lchiman和Yoshida(1981)J.Appl.Bacteriol.51:229.

[119]US4197290

[120]lchiman等(1991)J.Appl.Bacteriol.71:176.

[121]Robinson和Torres(1997)Seminars in Immunology 9:271-283.

[122]Donnelly等(1997)Annu Rev Immunol 15:617-648.

[123]Scott-Taylor和Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9:471-480.

[124]Apostolopoulos和Plebanski(2000)Curr Opin Mol Ther 2:441-447.

[125]Ilan(1999)Curr Opin Mol Ther 1:116-120.

[126]Dubensky等(2000)Mol Med 6:723-732.

[127]Robinson和Pertmer(2000)Adv Virus Res 55:1-74.

[128]Donnelly等(2000)Am J Respir Crit Care Med 162(4Pt 2):S190-193.

[129]Davis(1999)Mt.Sinai J.Med.66:84-90.

[130]Paoletti等(2001)Vaccine 19:2118-2126.

[131]WO00/56365.

[132]Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药物科学和实践).第20版,ISBN:0683306472.

[133]WO03/009869.

[134]Almeida和Alpar(1996)J.Drug Targeting 3:455-467.

[135]Agarwal和Mishra(1999)Indian J Exp Biol 37:6-16.

[136]WO00/53221.

[137]Jakobsen等(2002)Infect Immun 70:1443-1452.

[138]Bergquist等(1998)APMIS 106:800-806.

[139]Baudner等(2002)Infect Immun70:4785-4790.

[140]Ugozzoli等(2002)J Infect Dis 186:1358-1361.

[141]Vaccine Design(《疫苗设计》)...(1995)，Powell和Newman编.ISBN:030644867X.Plenum(普莱努出版社).

[142]WO00/23105.

[143]WO90/14837.

[144]Podda(2001)Vaccine 19:2673-80.

[145]Frey等(2003)Vaccine 21:4234-7.

[146]美国专利6,299,884.

[147]美国专利6,451,325.

[148]美国专利5,057,540.

[149]WO96/33739.

[150]EP-A-0109942.

[151]WO96/11711.

[152]WO00/07621.

[153]Barr等(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:247-271.

[154]Sjolanderet等(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:321-338.

[155]Niikura等(2002)Virology 293:273-280.

[156]Lenz等(2001)J Immunol 166:5346-5355.

[157]Pinto等(2003)J Infect Dis 188:327-338.

[158]Gerber等(2001)Virol 75:4752-4760.

[159]WO03/024480

[160]WO03/024481

[161]Gluck等(2002)Vaccine 20:B10-B16.

[162]EP-A-0689454.

[163]Johnson等(1999)Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278.

[164]Evans等(2003)Expert Rev Vaccines 2:219-229.

[165]Meraldi等(2003)Vaccine 21:2485-2491.

[166]Pajak等(2003)Vaccine 21:836-842.

[167]Kandimalla等(2003)Nucleic Acids Research 31:2393-2400.

[168]WO02/26757.

[169]WO99/62923.

[170]Krieg(2003)Nature Medicine 9:831-835.

[171]McCluskie等(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32:179-185.

[172]WO98/40100.

[173]美国专利6,207,646.

[174]美国专利6,239,116.

[175]美国专利6,429,199.

[176]Kandimalla等(2003)Biochemical Society Transactions 31(第3部分):654-658.

[177]Blackwell等(2003)J Immunol170:4061-4068.

[178]Krieg(2002)Trends Immunol 23:64-65.

[179]WO01/95935.

[180]Kandimalla等(2003)BBRC 306:948-953.

[181]Bhagat等(2003)BBRC 300:853-861.

[182]WO03/035836.

[183]WO95/17211.

[184]WO98/42375.

[185]Beignon等(2002)Ingrct Immun70:3012-3019.

[186]Pizza等(2001)Vaccine 19:2534-2541.

[187]Pizza等(2000)Int J Med Microbiol 290:455-461.

[188]Scharton-Kersten等(2000)Infect Immun 68:5306-5313.

[189]Ryan等(1999)Infect Immun 67:6270-6280.

[190]Partidos等(1999)Immunol Lett 67:209-216.

[191]Peppoloni等(2003)Expert Rev Vaccines 2:285-293.

[192]Pine等(2002)J Control Release 85:263-270.

[193]Domenighini等(1995)Mol Microbiol 15:1165-1167.

[194]WO99/40936.

[195]WO99/44636.

[196]Singh等(2001)J Cont Release 70:267-276.

[197]WO99/27960.

[198]美国专利6,090,406

[199]美国专利5,916,588

[200]EP-A-0626169.

[201]WO99/52549.

[202]WO01/21207.

[203]WO01/21152.

[204]Andrianov等(1998)Biomaterials 19:109-115.

[205]Payne等(1998)Adv Drug Delivery Review 31：185-196.

[206]Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27:571-577.

[207]Jones(2003)Curr Opin Investig Drugs4:214-218.

[208]WO04/60308

[209]WO04/64759.

[210]WO99/11241.

[211]WO94/00153.

[212]WO98/57659.

[213]欧洲专利申请0835318,0735898和0761231.

[214]Joyce等(2003)Carbohydrate Research(《碳水化合物研究》)338：903.

[215]Maira-Litran等(2002)Infect.Immun.70:4433.

[216]WO2004/043407.

[217]WO2007/113224.

[218]WO2004/043405

[219]WO98/10788.

[220]WO2007/053176.

[221]WO2007/113222.

[222]WO2005/009379.

[223]WO2009/029132.

[224]WO2008/079315.

[225]WO2005/086663.

[226]WO2005/115113.

[227]WO2006/033918.

[228]WO2006/078680.

[229]Kuroda等(2001)Lancet 357(9264):1225-1240；还参见第1218-1219页。

[230]Sjodahl(1977)J.Biochem.73:343-351.

[231]Uhlen等(1984)J.Biol.Chem.259:1695-1702和13628(Corr.).

[232]Schneewind等(1992)Cell 70:267-281.

[233]DeDent等(2008)EMBO J.27:2656-2668.

[234]Sjoquist等(1972)Eur.J.Biochem.30:190-194.

[235]DeDent等(2007)J.Bacteriol.189:4473-4484.

[236]Deisenhofer等(1978)Hoppe-Seyh Zeitsch.Physiol.Chem.359:975-985.

[237]Deisenhofer(1981)Biochemistry 20:2361-2370.

[238]Graille等(2000)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 97:5399-5404.

[239]O’Seaghdha等(2006)FEBS J.273:4831-41.

[240]Gomez等(2006)J.Biol.Chem.281:20190-20196.

[241]WO2007/071692.

[242]Sebulsky和Heinrichs(2001)J Bacteriol 183:4994-5000.

[243]Sebulsky等(2003)J Biol Chem 278:49890-900.

[244]WO2005/009378.

[245]Rable和Wardenburg(2009)Infect Immun 77:2712-8.

[246]WO2007/145689.

[247]WO2009/029831.

[248]WO2005/079315.

[249]WO2008/152447.

[250]Kuklin等(2006)Infect Immun.74(4):2215-23.

[251]WO2005/009379.

[252]Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy(《雷明顿：药物科学和实践》)，第20版，ISBN:0683306472.

[253]Methods In Enzymology(《酶学方法》)(S.Colowick和N.Kaplan编,Academic Press,Inc.(学术出版社))

[254]Handbook of Exerimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications(布莱克威尔科学出版社))

[255]Sambrook等(2001)Molecular Cloning:A Laboratoty Manual(《分子克隆：实验室手册》)，第3版(Cold Spring Harbor Laboratory Press(冷泉港实验室出版社)).

[256]Handbook of Surface and Colloidal Chemistry(《表面和胶体化学手册》)(Birdi,K.S.编，CRC出版社，1997)

[257]Ausubel等(编)(2002)Short protocols in molecular biology(《分子生物学简明方案》)，第5版，(Current Protocols(新编方法丛书)).

[258]Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course(《分子生物学技术：实验室详解教程》)(Ream等编，1998，学术出版社)

[259]PCR(Introduction to Biotechniques Series(《生物技术介绍丛书》))，第2版(Newton和Graham编，1997，Springer Verlag(施普林格出版社))

[260]Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(F.M.Ausubel等编,1987)增刊30

[261]Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489.

[262]Geysen等(1984)PNAS USA 81:3998-4002.

[263]Carter(1994)Methods Mol Biol 36:207-23.

[264]Jameson,BA等1988,CABIOS 4(1):181-186.

[265]Raddrizzani和Hammer(2000)Brief Bioinform 1(2):179-89.

[266]Bublil等(2007)Proteins 68(1):294-304.

[267]De Lalla等(1999)J.Immunol.163:1725-29.

[268]Kwok等(2001)Trends Immunol 22:583-88.

[269]Brusic等(1998)Bioinformatics 14(2):121-30

[270]Meister等(1995)Vaccine 13(6):581-91.

[271]Roberts等(1996)AIDS Res Hum Retroviruses 12(7):593-610.

[272]Maksyutov和Zagrebelnaya(1993)Comput Appl Biosci 9(3):291-7.

[273]Feller和de la Cruz(1991)Nature 349(6311):720-1.

[274]Hopp(1993)Peptide Research 6:183-190.

[275]Welling等(1985)FEBS Lett.188:215-218.

[276]Davenport等(1995)Immunogenetics 42:392-297.

[277]Tsurui和Takahashi(2007)J Pharmacol Sci.105(4):299-316.

[278]Tong等(2007)Brief Bioinform.8(2):96-108.

[279]Schirle等(2001)J Immunol Methods.257(1-2):1-16.

[280]Chen等(2007)Amino Acids 33(3):423-8.

[281]Bardotti等(2008)Vaccine.26(18):2284-96.

Claims

1.一种制备金黄色葡萄球菌5型或8型荚膜多糖和运载体分子的偶联物的方法，其包括以下步骤：

(a)使金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖解聚，以得到在非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段，或使金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖解聚，以得到在非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段；

(b)氧化所述具有β-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段，从而将β-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转变成两个醛基，或氧化所述具有α-D-FucNAc-(1→部分的多糖片段，从而将α-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转变成两个醛基；和

(c)通过所述醛基将该氧化糖残基偶联于运载体分子，从而得到该偶联物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解聚通过乙酸酸水解进行。

3.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于，所述多糖片段的平均分子量为5至100 kDa。

4.如前述权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述多糖片段的O-乙酰化程度是10-90%。

5.一种提供金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖衍生物的方法，获得该衍生物的方法为氧化在其非还原末端具有β-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖，以便将β-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转化成两个醛基的步骤。

6.一种提供金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖衍生物的方法，获得该衍生物的方法为氧化在其非还原末端具有α-D-FucNAc-(1→部分的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖，以便将α-D-FucNAc-(1→部分中的两个相邻羟基转化成两个醛基的步骤。

7.一种提供偶联的金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖的方法，所述方法包括氧化金黄色葡萄球菌5型荚膜多糖非还原末端的β-D-FucNAc-(1→部分，将β-D-FucNAc-1→部分中的两个相邻羟基转变为两个醛基，通过所述醛基之一将该氧化糖残基偶联于运载体分子。

8.一种提供偶联的金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖的方法，所述方法包括氧化金黄色葡萄球菌8型荚膜多糖非还原末端的α-D-FucNAc-(1→部分，将α-D-FucNAc-1→部分中的两个相邻羟基转变为两个醛基，通过所述醛基之一将该氧化糖残基偶联于运载体分子。

9.如权利要求1-2、7和8中任一项所述的方法，其特征在于，所述偶联是通过所述醛基与所述运载体的胺基发生还原胺化反应进行的直接偶联。

10.如权利要求1-2、7和8中任一项所述的方法，其特征在于，所述偶联是通过所述醛基与接头的胺基发生还原胺化反应进行的接头偶联。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述接头连接于所述运载体分子。

12.如权利要求1-2、7-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述偶联导致多糖:蛋白质比例(w/w)为1:5至1:2。

13.一种通过权利要求1-2、7-8任一项权利要求所述方法获得的偶联物。

14.一种通过权利要求1-2、7-8所述方法获得的偶联多糖。

15.一种免疫原性组合物，其包含权利要求13所述的偶联物。

16.一种免疫原性组合物，其包含权利要求14所述的偶联多糖。

17.如权利要求15或16所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含一种或多种选自下组的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原：clfA抗原；clfB抗原；sdrE2抗原；sdrC抗原；sasF抗原；emp抗原；sdrD抗原；spa抗原；esaC抗原；esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；isdC抗原；Hla抗原；sta011抗原；isdA抗原；isdB抗原；和sta073抗原。

18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述一种或多种金黄色葡萄球菌蛋白质抗原选自：esxA抗原；esxB抗原；sta006抗原；Hla抗原；sta011抗原；和sta073抗原。

19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含下述组合(1)-(10)之一所述的金黄色葡萄球菌蛋白质抗原：

(1)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和Hla抗原；

(2)esxA抗原、esxB抗原、sta006抗原和sta011抗原；

(3)esxA抗原、esxB抗原和sta011抗原；

(4)esxA抗原、esxB抗原、Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原；

(5)esxA抗原、esxB抗原和Hla抗原；

(6)Hla抗原、sta006抗原和sta011抗原；

(7)esxA抗原和esxB抗原；

(8)esxA抗原、esxB抗原和sta006抗原；

(9)esxA抗原、esxB抗原、sta011抗原和sta073抗原；和

(10)sta006抗原和sta011抗原。