CN103209708B - 免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。本发明也提供了对患者进行抗GBS感染免疫的方法，所述方法包含给予患者偶联物的步骤，所述偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。

Description

免疫原性组合物
本申请要求2010年9月16日提交的美国临时申请系列号61/383,668和2011年1月31日提交的英国专利申请号1101665.6的权益，两者通过引入全文纳入本文。
技术领域
本发明是包含无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）荚膜糖和运载体蛋白偶联物的免疫原性组合物的领域。所述组合物用于免疫。
背景技术
在针对有荚膜细菌的疫苗中使用细菌的荚膜糖已有多年历史。然而，由于糖是T非依赖性抗原，它们的免疫原性较弱。与运载体偶联可将T非依赖性抗原转化成T依赖性抗原，从而增强记忆反应并能发展出保护性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于糖偶联物，原型偶联物(conjugate)疫苗针对b型流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)(‘Hib’)[例如见参考文献84的第14章]。
其偶联物疫苗已有描述的另一种细菌是无乳链球菌（Streptococcus agalactiae），也称作“B组链球菌”，或简单称作“GBS”。Dennis Kasper及其同事进行了许多这样的工作，在例如参考文献1-9中进行了描述。已显示偶联物疫苗就各GBS血清型Ia、Ib、II、III和V而言在人体中安全且具有免疫原性[10]。然而，这些仍然需要进一步和改善的GBS偶联物疫苗。
发明内容
第一方面，本发明使用一种或多种来自GBS血清型Ia、Ib、III或V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。特别地，本发明提供了包含一种或多种这些偶联物的免疫原性组合物。所述组合物可以用作防止这些GBS血清型感染的疫苗。
第二方面，本发明提供了对患者进行抗GBS感染免疫的方法，所述方法包含给予患者偶联物的步骤,所述偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。通常，所述偶联物是本发明第一方面的免疫原性组合物中的所述GBS偶联物之一。
免疫原性组合物
在一个实施方式中，本发明提供了含有偶联物的免疫原性组合物，所述偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第二个实施方式中，本发明提供了含有偶联物的免疫原性组合物，所述偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第三个实施方式中，本发明提供了含有偶联物的免疫原性组合物，所述偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第四个实施方式中，本发明提供了含有偶联物的免疫原性组合物，所述偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。
所述免疫原性组合物可以包含多于一种偶联物。下面描述包含两种、三种或四种偶联物的本发明实施方式。这些组合物中，发明人发现了包含偶联物的组合物可以赋予除了GBS血清型Ib以外对GBS血清型Ia的保护，所述偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。这个观察与参考文献11中的描述相反，参考文献11提示了Ib型偶联物不能诱导能杀灭Ia型细菌的抗体。因此，下述包含GBS血清型Ib荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物的实施方式可以有优势，因为其提供了对血清型Ia增强的保护(当所述组合物也包含GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物时)，并且当所述组合物不包含GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物时，甚至也可以提供保护。
如上所述，所述免疫原性组合物可以包含两种偶联物。在一个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第二个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第三个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第四个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第五个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第六个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。
相似地，所述免疫原性组合物可以包含三种偶联物。在一个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，以及所述第三偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。本发明人发现了这种组合物(如下面所示例)特别适用作疫苗以防止GBS感染。因此这个实施方式是本发明优选的实施方式。在第二个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，以及所述第三偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第三个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，以及所述第三偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。在第四个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，以及所述第三偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。
采用相同方式，所述免疫原性组合物可以包含四种偶联物。在一个实施方式中，所述第一偶联物是GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，而所述第二偶联物是GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，所述第三偶联物是GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成，以及所述第四偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。
通常，上述免疫原性组合物不会包含特定提到的那些以外的任何偶联物，特别是含有来自特定提到的那些以外的GBS血清型荚膜糖的偶联物。然而，在一些实施方式中，所述组合物可以包含其他的偶联物，包括含有其他GBS血清型荚膜糖的偶联物。例如，所述组合物可以包含是GBS血清型II的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。类似地，所述组合物可以包含是GBS血清型VI的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。在另一种可能性中，所述组合物可以包含是GBS血清型VIII荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。
上述免疫原性组合物可以包含每个单位剂量的任意合适量的荚膜糖。合适量的荚膜糖可以是每个单位剂量0.1-50μg。通常，各GBS荚膜糖存在的量是1-30μg，例如2-25μg，和特别是5-20μg。合适量的荚膜糖可以包含每个单位剂量5、10和20μg。本发明人发现了这些量是合适的，特别是当所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖时。因此，在上述实施方式中，各荚膜糖的合适量/单位剂量可选自下表的编号选项，其中按照血清型指示了相关的实施方式，从中获得所述组合物的荚膜糖：
表A–包含一种偶联物的免疫原性组合物
表B–包含两种偶联物的免疫原性组合物
表C–包含三种偶联物的免疫原性组合物
对于表C中描述的剂量选项而言，本发明人发现了选项1、14和27有效，特别是当所述免疫原性组合物包含以下时：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。这些剂量选项因此优选用于本发明，特别是此实施方式。为了降低潜在毒性，使每个单位剂量的荚膜糖总量最小化可以有优势。因此，特别优选剂量选项1。
能进一步最小化每个单位剂量的荚膜糖量。特别地，合适量的荚膜糖可以是每个单位剂量0.1-5μg。通常，因此各GBS荚膜糖在每个单位剂量中存在的量可以是0.1-5μg，如0.5、2.5或5μg。例如，各GBS荚膜糖在每个单位剂量中存在的量可以是0.5-5μg、1-4μg、2-3μg或约2.5μg。本发明人设想这些量是合适的，特别是当所述免疫原性组合物包含以下时:a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。因此，这个实施方式中各荚膜糖的合适量/单位剂量可以选自下表中的编号选项：
表C’–包含来自GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖的免疫原性组合物
对于表C’中描述的剂量选项而言，本发明人特别设想选项1、14和27。在这些选项中，各GBS荚膜糖的量相同(如下面示例的更高剂量组合物)。
表D–包含四种偶联物的免疫原性组合物
在所述免疫原性组合物包含多于一种偶联物的上述实施方式中，给定荚膜糖质量与其他荚膜糖质量的比率可以变化。在上述实施方式中，各荚膜糖的合适比率(w/w)可以因此选自下表的编号选项，其中按照血清型指示了相关的实施方式，从中获得所述组合物中的荚膜糖：
表E–包含两种偶联物的免疫原性组合物
表F–包含三种偶联物的免疫原性组合物
对于表F所述比率选项而言，本发明人发现了选项1有效，特别是当所述免疫原性组合物包含以下时：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。因此，这个比率选项优选用于本发明，特别是此实施方式。
表G–包含四种偶联物的免疫原性组合物
如上面所讨论，本发明部分涉及含偶联物的免疫原性组合物，所述偶联物是GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。本发明人发现了如果所述免疫原性组合物包含一种或多种其他抗原，可以减少对这些组合物中来自GBS血清型V的荚膜糖的免疫反应。不希望受到理论限制，认为存在其他抗原造成了“免疫干扰”，对来自GBS血清型V的荚膜糖减少有响应。
本发明人发现了如果所述组合物包含佐剂，可以提高对这些免疫原性组合物中来自GBS血清型V的荚膜糖的反应。这个观察与参考文献12的描述相反，参考文献12提示了佐剂不提高对GBS偶联物的免疫反应。因此，在另一个实施方式中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含:a)GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)一种或多种不包含来自GBS血清型V的荚膜糖的抗原；和c)佐剂。成分b)的抗原可以是包含来自其他GBS血清型的荚膜糖的偶联物。例如，这些偶联物可以是GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。因此，本发明的这个实施方式包含本文所述的任意免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物，并且还包含一种或多种是GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物，其中所述组合物还包含佐剂。或者，所述成分b)的抗原可以是其他种类的抗原，如下面标题“Combinations of conjugates and other antigens（偶联物和其他抗原组合）”和“GBSprotein antigens（GBS蛋白抗原）”所述的抗原。因此，本发明的这个实施方式也包含本文所述的任意免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物，和一种或多种不包括含有其他GBS血清型荚膜糖的偶联物的抗原，其中所述组合物还包含佐剂。本发明人发现了本发明这个实施方式中的佐剂可以是例如下面所述的铝盐。技术人员能鉴定可用于这些组合物的其他佐剂。
本发明人也发现了如果此荚膜糖的剂量增加，对来自GBS血清型V荚膜糖的反应也提高。特别地，如果所述免疫原性组合物包含V型以外GBS血清型的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物，如果所述V型荚膜糖的剂量大于其他GBS血清型的荚膜糖的剂量，那么提高对V型荚膜糖的反应。因此，在另一个实施方式中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其包含:a)GBS血清型V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)一种或多种偶联物，各是V型以外GBS血清型的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成;其中所述V型荚膜糖的剂量高于来自其他GBS血清型荚膜糖的总剂量，或者高于来自其他GBS血清型荚膜糖的至少一种剂量或平均剂量。所述V型荚膜糖的剂量可以高1.1、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。当成分b)包含多于一种偶联物时，通常V型荚膜糖的剂量高于来自其他GBS血清型荚膜糖的平均剂量。所述成分b)的偶联物可以是包含来自V型以外任意GBS血清型的荚膜糖的偶联物。例如，这些偶联物可以是GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。因此，本发明的这个实施方式包含本文所述的任意免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含GBS血清型V荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物，并且还可以包含一种或多种GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物;其中所述V型荚膜糖剂量高于其他GBS血清型荚膜糖的总剂量，或者高于其他GBS血清型荚膜糖的至少一个剂量或平均剂量。本发明人也发现了更大剂量的V型荚膜糖可以减少对这些组合物中其他GBS血清型荚膜糖的免疫反应。如果所述组合物包含上述佐剂，这个结果可以降低。再者，这个观察与参考文献12的描述相反，参考文献12提示了佐剂可能不提高对GBS偶联物的免疫反应。
下面讨论了给予本发明免疫原性组合物的方法。简单说，本发明所述免疫原性组合物可以单个或多个剂量给予。本发明人发现给予单个剂量的本发明免疫原性组合物是有效的，特别是当所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖时;并且更特定当所述免疫原性组合物包含以下时：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。因此本发明优选单个剂量给予，特别是对这些实施方式而言。
或者，一个单位剂量后接第二个单位剂量可以是有效的。通常，所述第二(或第三、第四、第五等)单位剂量与第一单位剂量相同。所述第二单位剂量可以在第一单位剂量后的任何合适时间给予，特别是1、2或3个月后。例如，如果所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖，那么在第一单位剂量后3个月可以给予第二单位剂量。在另一个示例中，如果所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型V的荚膜糖，那么在第一单位剂量后1个月可以给予第二单位剂量。通常，本发明免疫原性组合物能肌肉内给予，如下面所述肌肉内给予到大腿或上臂。
如下所述，本发明免疫原性组合物可以包含一种或多种佐剂。然而，本发明人发现了使用无佐剂的组合物是有效的，特别是当所述免疫原性组合物包含来自GBS血清型Ia、Ib和/或III的荚膜糖时;并且更特定当所述免疫原性组合物包含以下时：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。省去佐剂以降低潜在毒性可以有优势。因此，本发明中优选使用不包含任何佐剂(特别不包含任何铝盐佐剂)的免疫原性组合物，特别对这些实施方式而言。
荚膜糖
本发明是基于无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的荚膜糖。所述荚膜糖共价连接到GBS的肽聚糖骨架上，并且与B组抗原不同，B组抗原是连接到肽聚糖骨架上的另一种糖。
所述GBS荚膜糖在化学上相关，但是抗原性上非常不同。所有GBS荚膜糖共有以下三糖核心：
β-D-GlcpNAc(1→3)β-D-Galp(1→4)β-D-Glcp
各种GBS血清型的区别在于修饰其核心的方式。例如，血清型Ia和III的区别在于，所述核心中采用GlcNAc(Ia)或Gal(III)来连接连续的三糖核心(图1)。血清型Ia和Ib的核心中都具有连接GlcNAc的[α-D-NeupNAc(2→3)β-D-Galp-(1→]二糖，但连接键是1→4(Ia)或1→3(Ib)。
GBS-相关疾病主要是由血清型Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII和VIII引起，超过85%是由以下五种血清型引起的：Ia、Ib、III和V。本发明优选使用来自这四种血清型中一种或多种的糖，特别是来自一种或多种血清型:Ia、Ib和III。如图2所示，这四种血清型各自的荚膜糖包括：(a)末端N-乙酰基-神经氨酸(NeuNAc)残基(一般称为唾液酸)，在所有情况下2→3连接至半乳糖残基；和(b)三糖核心内的N-乙酰基-葡糖胺残基(GlcNAc)。
所有四种糖包含所述三糖核心中的半乳糖残基，但是血清型Ia、Ib、II和III也包含各重复单位中的其他半乳糖残基。
根据本发明使用的糖可为天然形式，或也可经修饰。例如，糖可以比天然荚膜糖短，或可化学修饰。特别地，本发明使用的所述血清型V荚膜糖可以如参考文献13和14所述进行修饰。例如，特别设想如参考文献13和14所述的显著基本（substantially）脱唾液酸化血清型V荚膜糖(图3)以用于本发明。脱唾液酸化的GBS血清型V荚膜糖可通过以下方式制备：在温和酸性条件下(例如0.1M硫酸，80℃持续60分钟)处理纯化的GBS血清型V荚膜糖或者用神经氨酸酶处理，如参考文献13所述。一种优选的制备脱唾液酸化GBS血清型V荚膜糖的方法是在81℃+/-3℃用1M乙酸处理纯化的糖2小时。因此，本发明所用的糖可以是如天然发现的基本全长荚膜多糖，或可短于天然长度。可解聚全长多糖以提供用于本发明的较短片段，例如，通过在温和酸中水解、通过加热、通过大小色谱等。已报道链长影响GBS糖在兔子中的免疫原性[4]。特别地，本发明使用的所述血清型II和/或III荚膜糖可以如参考文献15和16所述进行解聚。这些文献描述了通过温和去氨基切割为含还原末端2,5-脱水-D-甘露糖残基的抗原片段来部分解聚II型和III型荚膜糖。简单说，所述荚膜糖溶解在0.5NNaOH中，并且加热到70°C约1-4小时。这个培育长度控制由标准方法(如由参考文献15所述的HPLC)测定的解聚程度。所述样品在冰水浴中冷却，然后加入冰醋酸将pH调到4。然后，所述部分N-脱酰化产物通过加入5%(wt/vol)NaNO2在4°C搅拌2h来脱氨。如下所述，所述新形成的2,5-脱水-D-甘露糖残基的游离醛可以用于偶联运载体蛋白。
报道了通过内-β-半乳糖苷酶解聚血清型III荚膜糖[参考文献1和4-6]，包含使用所述解聚材料以与破伤风类毒素运载体形成偶联物。来自GBS血清型III和VIII荚膜多糖的臭氧分解也已经用于解聚[17]。优选使用MW>30kDa的糖，并且能使用基本（substantially）全长的荚膜多糖。对血清型Ia而言，优选使用MW范围为150-300kDa的多糖，特别是175-275kDa。通常，使用MW约200kDa或约260kDa的血清型Ia糖。对血清型Ib而言，优选使用MW范围为150-300kDa的多糖，特别是175-250kDa。通常，使用MW约200kDa或约230kDa的血清型Ib糖。对血清型III而言，优选使用MW范围为50-200kDa的多糖，特别是80-150kDa。通常，使用MW约100kDa或约140kDa的血清型III糖。对血清型V而言，也优选使用MW多至约50kDa的多糖。通常，使用MW约100kDa的血清型V糖。这些分子量可通过凝胶过滤相对于葡聚糖标准品，如购自PSS公司(Polymer Standard Service)的标准品测定[18]。
所述糖可以相对于天然发现的荚膜糖进行化学修饰。例如，糖可被去-O-乙酰化(部分或全部)、去-N-乙酰化(部分或全部)、N-丙酰化(部分或全部)等。可在偶联之前、期间或之后进行去乙酰化，但优选在偶联前进行。根据具体的糖，去乙酰化可影响或不影响免疫原性。参考文献19讨论了各种血清型中GBS糖上O-乙酰化的关联，且在一些实施方式中，位置7、8和/或9处唾液酸残基的O-乙酰化在偶联前、中和后都保留，例如通过保护/去保护、通过再乙酰化等。然而，本发明所用的GBS糖通常在位置7、8和/或9处基本没有唾液酸残基的O-乙酰化。特别地，当所述GBS糖通过下述碱提取纯化时，那么通常丧失O乙酰化(参考文献19)。可通过常规试验评价去乙酰化等的效果。
可通过已知技术纯化荚膜糖，如本文引用的参考文献所述，如参考文献2和20。典型的方法包括碱提取、离心、过滤、RNA酶/DNA酶处理、蛋白酶处理、浓缩、尺寸排阻色谱、超滤、阴离子交换色谱和进一步超滤。也使用酶变溶菌素处理GBS细胞，酶变溶菌素剪切细菌细胞壁以释放所述细胞壁的成分。
作为替代，可使用参考文献21所述的纯化过程。这涉及碱提取、乙醇/CaCl2处理、CTAB沉淀和再溶。参考文献22中记载了另一种替代方法。
本发明不限于纯化自天然来源的糖，然而，可通过其它方法如全合成或部分合成获得所述糖。
偶联
本发明涉及的偶联物是GBS血清型Ia、Ib、III或V的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成。一般，糖与运载体的共价偶联增强糖的免疫原性，因为这将糖由T非依赖性抗原转变为T依赖性抗原，由此能够引发免疫记忆。偶联对于儿科疫苗特别有用[例如参考文献23]，而且是公知技术[例如在参考文献24-32中综述]。因此，本发明的方法可包括将经纯化糖与运载体分子偶联的其他步骤。
已广泛报道GBS糖的偶联，例如参见参考文献1-9。GBS糖偶联的典型现有技术方法通常涉及将纯化的糖还原性胺化到运载体蛋白，例如破伤风类毒素(TT)或CRM197[2]。还原胺化涉及运载体氨基酸侧链上的胺基与糖上的醛基。由于GBS荚膜糖在其天然形式中不包括醛基，则其一般在通过氧化（如高碘酸盐氧化）部分（如5-40%,特别10-30%,优选约20%）糖唾液酸残基来偶联前产生醛基[2，33]。已显示此方法制备的偶联物疫苗就各GBS血清型Ia、Ib、II、III和V而言在人体中安全且具有免疫原性[10]。通常，以这种方式制备本发明所述免疫原性组合物中的所有偶联物。然而，当本发明使用脱唾液酸化的血清型V荚膜糖时，那么在通过氧化（如高碘酸盐氧化）部分（如5-40%,特别10-30%,优选约20%）糖半乳糖残基来偶联前，醛基可在这种糖中生成[14]。一个替代的偶联过程涉及使用糖中的-NH2基团(来自去N-乙酰化或在引入胺后)以及双功能接头，如文献34中所述。在一些实施方式中，以这种方式制备本发明所述免疫原性组合物中的一种或多种偶联物。参考文献15和16中记载了另一种替代方法。在这个过程中，所述通过温和去氨基切割从II型或III型荚膜糖解聚的末端2,5-脱水-D-甘露糖残基的游离醛基用于还原性氨化的偶联。在这些实施方式中，以这种方式制备本发明所述免疫原性组合物中的一种或多种偶联物。
本发明包括使用运载体分子，它们一般是蛋白质。有用的运载体蛋白包含细菌毒素或类毒素，如白喉毒素或破伤风类毒素。还可使用毒素或类毒素的片段，例如破伤风类毒素的片段C[35]。白喉毒素的CRM197突变体[36-38]对本发明特别有用。其他合适的运载体蛋白包括脑膜炎奈瑟球菌(N.meningitidis)外膜蛋白复合物[39]、合成肽[40,41]、热激蛋白[42,43]、百日咳蛋白[44,45]、细胞因子[46]、淋巴因子[46]、激素[46]、生长因子[46]、人血清白蛋白(优选重组的)、包含多种来自各种病原体衍生抗原的人CD4+T细胞表位的人工蛋白[47]例如N19[48]、来自流感嗜血杆菌(H.influenzae)的蛋白D[49,50]、肺炎球菌表面蛋白PspA[51]、肺炎球菌溶血素[52]、摄铁蛋白[53]、来自艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B[54]、重组绿脓假单胞菌(P.aeruginosa)胞外蛋白A(rEPA)[55]、GBS蛋白(见下;特别是GBS67)[206]等等。
优选通过-NH2基团与运载体连接，例如在运载体蛋白中赖氨酸残基侧链或精氨酸残基侧链或在N末端。也可通过-SH基团连接，如在半胱氨酸残基侧链中。
能使用一种以上的运载体蛋白，例如用于减少运载体抑制的风险。因此不同运载体蛋白能用于不同的GBS血清型，如血清型Ia糖可以偶联于CRM197，而血清型Ib糖可以偶联于破伤风类毒素。也能对特定糖抗原使用多于一种运载体蛋白，例如血清型III糖可以分为两组，一组偶联于CRM197且另一组偶联于破伤风类毒素。然而，通常优选所有糖使用同一种运载体蛋白。
一种运载体蛋白可携带一种以上糖抗原[56,57]。例如，单个运载体蛋白可以偶联于来自血清型Ia和Ib的糖。为了实现这一目的，可以在偶联反应之前混合不同糖。然而，通常优选得到各血清组的单独偶联物，偶联后混合不同糖。单独的偶联物可基于同一运载体。
通常使用糖:蛋白质之比(w/w)为1:5(即蛋白质过量)-5:1(即糖过量)的偶联物，特别是比率1:5-2:1。当本发明使用GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物时，那么所述糖:蛋白比率(w/w)通常是约1:1-1:2，特别是约1:1.3。类似地，当本发明使用GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物时，那么所述比率(w/w)通常是约1:1-1:2，特别是约1:1.3。当本发明使用GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物时，那么所述糖:蛋白比率(w/w)通常是约3:1-1:1，特别是约2:1。然而还能使用糖:蛋白比率(w/w)约1:1-1:5（特别是约1:3.3）的GBS血清型III与运载体蛋白偶联。最终，当本发明使用来自偶联运载体蛋白的GBS血清型V荚膜糖的偶联物时，那么所述比率(w/w)通常是约2:1-1:1，特别是约1.1:1。因此通常糖过重，特别对更长的糖链而言。
组合物可包含少量游离的运载体[58]。当给定运载体蛋白在本发明组合物中游离和偶联形式存在时，未偶联形式优选整体上不多于组合物中运载体蛋白总量的5%，更优选以少于2%重量存在。
偶联后，可分离游离和偶联的糖。有许多合适的方法，包括疏水色谱、切向超滤、透析等。[也参见参考文献59和60等]。参考文献61中记载了优选方法。
在本发明组合物包含解聚寡糖时，优选在偶联前进行解聚。
偶联物与其它抗原的组合
本发明的免疫原性组合物可以包含一种或多种其他抗原。
所述其他抗原可以包含其他GBS偶联物。所述不同GBS偶联物可以包含来自相同GBS血清型的不同类型偶联物和/或来自不同GBS血清型的偶联物。生成组合物通常可以通过制备单独偶联物（例如，对于各血清型不同的偶联物）和然后组合这些偶联物。
所述其他抗原可以包含如下所示的GBS氨基酸序列。其他的抗原可包含来自非GBS病原体的抗原。因此，本发明的组合物还可包含一种或多种非GBS抗原，包括其它细菌、病毒或寄生虫抗原。这些抗原可选自下列：
–来自脑膜炎奈瑟球菌血清组B的蛋白质抗原，例如参考文献62-68中所述的那些，尤其优选蛋白质‘287’(见下文)及其衍生物(例如‘ΔG287’)。
–来自脑膜炎奈瑟氏菌（N.meningitidis）血清组B的外膜囊泡(OMV)制备物，如参考文献69、70、71、72等中所述。
–脑膜炎奈瑟球菌（N.meningitidis）血清组A、C、W135和/或Y的糖抗原，如参考文献73所公开的来自血清组C的寡糖或参考文献74所述的寡糖。
–肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的糖抗原[例如参考文献75-77；文献84的第22和23章]。
–-甲型肝炎病毒的抗原，如灭活病毒的抗原[如78，79；参考文献84的第15章]。
–-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原[如79，80；参考文献84的第16章]。
–-丙型肝炎病毒的抗原[如81]。
–百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，如百日咳博德特菌的百日咳全毒素（PT）和丝状血凝素（FHA），也可任选与百日咳杆菌黏附素（pertactin）和/或凝集原2和3的组合[例如参考文献82和83；文献84的第21章]。
–-白喉抗原，如白喉类毒素[例如，参考文献84的第13章]。
–-破伤风抗原，如破伤风类毒素[例如，参考文献84的第27章]。
–B型流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的糖抗原[如参考文献84的第14章]。
–淋病奈瑟球菌(N.gonorrheae)的抗原[例如62，63，64]。
–肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的抗原[例如85，86，87，88，89，90，91]。
–-沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)抗原[例如，92]。
–-牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)抗原[例如，93]。
–-脊髓灰质炎抗原[例如94、95；参考文献84的第24章]如IPV。
–-狂犬病抗原[如96]如冻干的灭活病毒[如97，RabAvertTM]。
–麻疹、腮腺炎和/或风疹抗原[如参考文献84的第19、20和26章]。
–流感抗原[如参考文献84的第17和18章]，如血细胞凝集素和/或神经氨酸酶表面蛋白。
–粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis）抗原[例如98]。
–嗜热链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)的抗原[例如99，100，101]。
–金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抗原[例如102]。
在采用糖或糖类抗原时，优选与运载体偶联以增强免疫原性。熟知B型流感嗜血菌、脑膜炎球菌和肺炎球菌的糖抗原的偶联。
必要时，可使有毒的蛋白质抗原脱毒(如通过化学和/或遗传方式使百日咳毒素脱毒[83])。
所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。
抗原可以吸附于铝盐。当组合物中含有一种以上偶联物时，不需要吸附所有偶联物。
一种类型的优选组合物还包含来自性传播病原体的抗原，所述病原体例如疱疹病毒;淋病奈瑟球菌（N.gonorrheae）;沙眼衣原体（C.trachomatis）等。另一种类型的优选组合物包含影响老年人和/或免疫受损对象的其它抗原，因此本发明的GBS抗原可与来自下述非GBS病原体的一种或多种抗原组合：流感病毒、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermis）、绿脓假单胞菌、嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）、单核细胞增生利斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、脑膜炎奈瑟球菌（Neisseria meningitidis）和副流感病毒。
所述组合物中抗原存在的浓度一般是至少1μg/ml。通常，任何给定抗原的浓度将足以引发针对该抗原的免疫反应。
作为本发明组合物中使用蛋白质抗原的一种替代方式，可使用编码该抗原的核酸[例如参考文献103-111]。本发明组合物的蛋白质组分可被编码该蛋白的核酸(优选DNA，如质粒形式的DNA)取代。
在实践层面上，本发明组合物中包含的抗原数可能有上限。本发明组合物中抗原(包括GBS抗原)数目可以少于20、少于19、少于18、少于17、少于16、少于15、少于14、少于13、少于12、少于11、少于10、少于9、少于8、少于7、少于6、少于5、少于4、少于3或少于2。本发明组合物中GBS抗原数目可能少于6、少于5、少于4、少于3或少于2。
药学方法和应用
本发明的免疫原性组合物还包含药学可接受的运载体。通常‘药学上可接受的运载体’包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何运载体。合适的运载体一般是代谢慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖[112]、海藻糖[113]、乳糖和脂质聚集体(如油滴或脂质体)。这种运载体为本领域普通技术人员熟知。疫苗也可含有稀释剂，如水、盐水、甘油等。此外，也可存在辅助剂，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲物质等。无菌、无热原的磷酸盐缓冲生理盐水是一种典型运载体。关于药学上可接受赋形剂的全面讨论参见参考文献114。
本发明组合物可以是水性形式(即溶液或悬浮液)或干燥形式(如冻干)。如果使用干燥的疫苗，则在注射前将其在液体介质中重建。冻干偶联物疫苗为本领域已知，如所述MenjugateTM产物以冻干形式存在。当本发明免疫原性组合物包括含有来自多于一种GBS血清型的荚膜糖的偶联物时，对偶联物通常单独制备、混合和然后冻干。这种方式中，可以制备包含两种、三种或四种等本文所述偶联物的冻干组合物。为了在冻干过程中稳定偶联物，优选可以在组合物中纳入例如1mg/ml-30mg/ml(如约25mg/ml)的糖醇(如甘露醇)和/或二糖(如蔗糖或海藻糖)。推荐使用蔗糖作为GBS偶联物疫苗的稳定剂(参考文献115)。然而，本发明的稳定剂通常是甘露醇。当干燥疫苗在注射前于液体介质中重建时，残留甘露醇的浓度通常是约2-20mg/ml，如3.75mg/ml、7.5mg/ml或15mg/ml。使用甘露醇是有优势的，因为甘露醇在化学上不同于GBS荚膜糖的单糖亚基。这意味着检测荚膜糖（例如质量控制分析）能基于没有甘露醇干扰的糖亚基存在。相反，稳定剂如蔗糖包含葡萄糖，可以干扰糖中葡萄糖亚基的检测。
组合物可装在小瓶中，或者可装在填充好的注射器中。注射器可装有或未装有针头。注射器可包含一个组合物剂量，而小瓶可包含一个剂量或多个剂量。
本发明的水性组合物也适用于从冻干形式重建其它疫苗。本发明组合物用于所述临用前重建时，本发明提供药盒，其可包括两个药瓶，或可包括一个已填充注射器和一个药瓶，其中在注射前用所述注射器的内容物再活化药瓶的内容物。
本发明组合物可以包装成单位剂型或多剂型。就多剂型而言，与预填充注射器相比更优选药瓶。可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用注射剂量一般为0.5ml体积，例如用于肌内注射时。
所述组合物的pH优选为6-8，优选约7。可使用缓冲液来维持稳定的pH。本发明的免疫原性组合物通常包含磷酸二氢钾缓冲液。所述磷酸二氢钾缓冲液可以包含约1-10mM磷酸二氢钾，如1.25mM、2.5mM或5.0mM。当组合物包含氢氧化铝盐时，优选采用组氨酸缓冲液[116]。所述组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物可以与人体等张。
本发明组合物有免疫原性，更优选是疫苗组合物。本发明疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但一般是预防性疫苗。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。“免疫有效量”指以一次剂量或一系列剂量的一部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组（例如，非人的灵长动物、灵长动物等）、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验测定的相对较宽范围内。
在各剂量内，个体糖抗原的量通常是0.1-50μg(作为糖质量测量)，特别是1-50μg或0.5-25μg，更特别是2.5-7.5μg，如约1μg、约2.5μg、约5μg、约10μg、约15μg、约20μg或约25μg。在各剂量内，GBS荚膜糖的总量通常≤70μg(作为糖质量测量)，如≤60μg。特别地，所述总量可以≤40μg(如≤30μg)或≤20μg(如≤15μg)。发明人发现了这些总量是有效的，特别是当所述免疫原性组合物包含以下时：a)GBS血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)GBS血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)GBS血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物。因此，这些总量优选用于本发明，特别是这个实施方式。为了降低潜在毒性，使每个单位剂量的荚膜糖总量最小化可以有优势。因此，优选总量≤20μg，如≤15μg、≤7.5μg或≤1.5μg。
GBS影响身体的各个部分，因此本发明的组合物可以制备成各种形式。例如，可将所述组合物制备为液体溶液或悬浮液形式的注射剂。可将所述组合物制备为采用细粉或喷雾进行肺部给药，例如作为吸入剂。可将所述组合物制备为栓剂或阴道栓。该组合物可制备成用于鼻腔、耳部或眼部给药的制剂，例如喷雾剂、滴剂、凝胶剂或粉末剂[如参考文献117和118]。已报道成功地经鼻给予肺炎球菌糖[119，120]、Hib糖[121]、MenC糖[122]和Hib和MenC糖偶联物的混合物[123]。
本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。
本发明组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨酯)，如吐温80。去污剂的存在水平通常较低，如<0.01%。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml。在一些实施方式中，可以使用浓度4-10mg/ml的NaCl，如9.0、7.0、6.75或4.5mg/ml。
本发明组合物通常包括缓冲剂。一般是磷酸盐缓冲剂。
本发明组合物与其它免疫调节剂联合给予。具体说，组合物包括一种或多种佐剂。这类佐剂包括但不限于：
A.含矿物质的组合物
适用作本发明佐剂的含有矿物质的组合物包括矿物盐，例如铝盐和钙盐(或其混合物)。钙盐包括磷酸钙(如参考文献124公开的“CAP”颗粒)。铝盐包括氢氧化物、磷酸盐、硫酸盐等，所述盐可采用任何合适形式（例如凝胶、结晶、无定形等)。优选吸附于这些盐。也可将含有矿物质的组合物制成金属盐的颗粒[125]。
可采用称为氢氧化铝和磷酸铝的佐剂。这些名称是常规名称，但仅为使用方便，因为其均不是出现的实际化合物的准确描述（例如参见参考文献126的第9章）。本发明可采用通常用作佐剂的任何"氢氧化物"或"磷酸盐"佐剂。称为"氢氧化铝"的佐剂一般是羟基氧化铝盐(通常至少部分为晶体)。称为"磷酸铝"的佐剂一般是羟基磷酸铝，也常常含有少量硫酸盐(即羟基磷酸硫酸铝)。其可通过沉淀获得，沉淀期间的反应条件和浓度影响磷酸根取代所述盐中羟基的程度。
氢氧化铝佐剂通常呈纤维形态(例如，如透射电子显微图中所见)。氢氧化铝佐剂的pI通常约11，即在生理pH下佐剂本身具有表面正电荷。据报道，pH7.4时氢氧化铝佐剂的吸附容量为1.8-2.6毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝佐剂的PO4/Al摩尔比通常为0.3-1.2，优选0.8-1.2，更优选0.95±0.1。磷酸铝通常是无定形的，尤其是羟基磷酸盐。典型的佐剂是PO4/Al摩尔比为0.84-0.92的无定形羟基磷酸铝，包含0.6mg Al3+/ml。磷酸铝通常是颗粒(如在透射电子显微图上观察到的板状形态)。抗原吸附后的典型颗粒直径范围是0.5-20μm(如约5-10μm)。据报道，pH7.4时磷酸铝佐剂的吸附容量为0.7-1.5毫克蛋白质/毫克Al+++。
磷酸铝的零电点(PZC)与磷酸根取代羟基的程度逆相关，且这种取代程度可根据用于通过沉淀制备盐的反应条件和反应物浓度而变化。也通过改变溶液中游离磷酸根离子的浓度(更多磷酸根=更酸性PZC)或加入缓冲剂如组氨酸缓冲剂(使PZC碱性更强)来改变PZC。本发明所用磷酸铝的PZC通常为4.0-7.0，更优选5.0-6.5，例如约5.7。
用于制备本发明组合物的铝盐悬浮液可以但不必定含有缓冲液(如磷酸盐或组氨酸或Tris缓冲液)。该悬浮液优选无菌且无热原。悬浮液可含有游离的水性磷酸根离子，如存在浓度为1.0-20mM，优选5-15mM，更优选约10mM。该悬浮液也可含有氯化钠。
本发明可使用氢氧化铝和磷酸铝的混合物。在这种情况下，磷酸铝多于氢氧化铝，例如重量比为至少2:1，例如，≥5:1、≥6:1、≥7:1、≥8:1、≥9:1等。
给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于10mg/ml，例如≤5mg/ml、≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选0.85mg/剂的最大值。
通常佐剂磷酸铝佐剂是无定形羟基磷酸铝，PO4/Al摩尔比为0.84-0.92，包括约0.6mg Al3+/ml。可采用低剂量磷酸铝吸附，如每剂量50-100μg Al3+/偶联物。
B.油乳剂
适用作本发明佐剂的油乳剂组合物包含鲨烯-水乳剂，如MF59(5%鲨烯、0.5%吐温80和0.5%司盘85，用微流化床配制成亚微米颗粒)[参考文献126第10章；也参见参考文献127-129]。将MF59用作FLUADTM流感病毒三价亚单位疫苗的佐剂。
用于组合物的特别优选的佐剂是亚微米水包油乳液。本文所用的优选亚微米水包油乳剂是任选地含有各种含量的MTP-PE鲨烯/水乳剂，如含有4-5%w/v鲨烯、0.25-1.0%w/v吐温80(聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯)和/或0.25-1.0%司盘85(山梨聚糖三油酸酯)，以及任选的N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)的亚微米水包油乳剂。参考文献127和130-131详细描述了亚微米水包油乳剂、其制备方法和免疫刺激剂(如胞壁酰肽)在本发明组合物中的应用。
也可将完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)用作本发明中的佐剂。
C.皂苷制剂[参考文献126的第22章]
皂苷制剂也可以用作本发明的佐剂。皂苷是在许多种类植物的树皮、叶、茎干、根甚至花中发现的甾醇糖苷和三萜糖苷的异质群体。已广泛研究了作为佐剂的分离自皂树(Quillaia saponaria Molina)树皮的皂苷。皂苷也可市售获自丽花菝葜（Smilax ornata）（墨西哥菝葜）、满天星（Gypsophilla paniculata）（婚纱花）和肥皂草（Saponariaofficianalis）（皂根）。皂苷佐剂制剂包括纯化制剂如QS21，以及脂质制剂如ISCOM。
已采用HPLC和RP-HPLC纯化皂苷组合物。已鉴定了用这些技术纯化的特定纯化组分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B和QH-C。所述皂苷优选QS21。制备QS21的方法公开于参考文献132。皂苷制剂也可包含甾醇，如胆固醇[133]。
皂苷和胆固醇的组合可用于形成称为免疫刺激复合物（ISCOM）的独特颗粒[参考文献126第23章]。ISCOM通常还包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰胆碱。任意已知的皂苷均可用于ISCOM中。ISCOM优选包含QuilA、QHA和QHC中的一种或多种。参考文献133-135中进一步描述了ISCOM。任选地，ISCOM可不含其它去污剂[136]。
开发基于皂苷的佐剂的综述可参见参考文献137和138。
D.病毒体和病毒样颗粒
病毒体和病毒样颗粒（VLP）也可以用作本发明的佐剂。这些结构通常包含一种或多种任选与磷脂组合或一起配制的病毒蛋白质。其通常无病原性，非复制型，且通常不含任意天然病毒基因组。所述病毒蛋白可重组生成或分离自全病毒。这些适用于病毒体或VLP的病毒蛋白包括衍生自流感病毒（例如HA或NA）、乙肝病毒（例如核心蛋白或衣壳蛋白）、戊肝病毒、麻疹病毒、辛德比斯病毒、轮状病毒、口蹄疫病毒、逆转录病毒、诺沃克病毒、人乳头状瘤病毒、HIV、RNA-噬菌体、Qβ-噬菌体（如外壳蛋白）、GA-噬菌体、fr-噬菌体、AP205噬菌体和Ty（如反转录转座子Ty蛋白p1）的蛋白。参考文献139-144进一步描述了VLP。例如参考文献145进一步描述了病毒体。
E.细菌或微生物衍生物
适用于本发明的佐剂包括细菌或微生物衍生物，如肠细菌脂多糖（LPS）的无毒衍生物、脂质A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物。
LPS的无毒衍生物包括单磷酰脂质A（MPL）和3-O-脱酰基MPL（3dMPL）。3dMPL是3脱-O-酰基单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。3脱-O-酰基单磷酰脂质A的优选“小颗粒”形式公开于参考文献146。3dMPL的这种“小颗粒”小到足以通过0.22μm膜过滤除菌[146]。其它无毒LPS衍生物包括单磷酰脂质A模拟物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸盐衍生物，例如RC-529[147,148]。
脂质A衍生物包括大肠杆菌（Escherichia coli）的脂质A衍生物，如OM-174。例如参考文献149和150中描述了OM-174。
适用作本发明佐剂的免疫刺激性寡核苷酸包括含CpG基序的核苷酸序列（含有通过磷酸键与鸟苷连接的非甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列）。含回文结构或聚(dG)序列的双链RNA和寡核苷酸也显示具有免疫刺激性。
CpG可以包含核苷酸修饰/类似物如硫代磷酸酯修饰，且可以是双链或单链。参考文献151、152和153公开了可能的类似物取代，例如用2’-脱氧-7-脱氮鸟苷取代鸟苷。参考文献154-159中进一步讨论了CpG寡核苷酸的佐剂作用。
CpG序列可针对TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[160]。CpG序列可特异性诱导Th1免疫反应，如CpG-A ODN，或更特异地诱导B细胞反应，如CpG-B ODN。参考文献161-163中讨论了CpG-A和CpG-B ODN。优选CpG为CpG-A ODN。
优选构建CpG寡核苷酸从而5’末端可被受体识别。任选将两个CpG寡核苷酸序列的3’端相连接形成“免疫聚体”。参见例如参考文献160和164-166。
细菌ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物可以用作本发明的佐剂。优选所述蛋白衍生自大肠杆菌（大肠杆菌不耐热肠毒素“LT”）、霍乱菌（“CT”）或百日咳菌（“PT”）。参考文献167中描述了脱毒的ADP-核糖基化毒素作为粘膜佐剂的应用，参考文献168中描述了其作为胃肠外佐剂的应用。所述毒素或类毒素优选全毒素形式，包含A和B亚基。A亚基优选含有脱毒突变；B亚基优选不突变。所述佐剂优选为脱毒的LT突变体，如LT-K63、LT-R72和LT-G192。参考文献169-176中描述了将ADP-核糖基化毒素及其脱毒衍生物，尤其是LT-K63和LT-R72用作佐剂。氨基酸取代的数字基准优选是根据参考文献177所示ADP-核糖基化毒素的A和B亚基排列，该参考文献特定通过引用全文纳入本文。
F.人免疫调节剂
适合用作本发明佐剂的人免疫调节剂包括细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12[178]等)[179]、干扰素(如干扰素-γ)、巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子。
G.生物粘着剂和粘膜粘着剂
生物粘着剂和粘膜粘着剂也可以用作本发明的佐剂。合适的生物粘着剂包括酯化透明质酸微球[180]或粘膜粘着剂如聚(丙烯酸)交联衍生物、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、多糖和羧甲基纤维素。壳聚糖及其衍生物也可用作本发明的佐剂[181]。
H.微粒
微粒也可以用作本发明的佐剂。微粒（即直径为～100nm至～150μm，更优选直径～200nm至～30μm，最优选直径～500nm至～10μm的颗粒）由生物可降解的无毒材料（例如，聚(α-羟酸)、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚己内酯等）形成，优选聚丙交酯乙交酯共聚物，并任选经处理而具有带负电表面（例如用SDS处理）或带正电表面（例如用阳离子去污剂如CTAB处理）。
I.脂质体（参考文献126第13和14章）
适用作佐剂的脂质体制剂的例子见参考文献182-183184所述。
J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制剂
适用于本发明的佐剂包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[185]。这种制剂还包括聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性剂和辛苯糖醇[186]以及聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂和至少一种其它非离子表面活性剂如辛苯糖醇[187]的组合。优选的聚氧乙烯醚选自下组：聚氧乙烯-9-月桂醚（月桂醇聚醚9）、聚氧乙烯-9-硬脂醚、聚氧乙烯-8-硬脂醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。
K.聚磷腈(PCPP)
PCPP制剂描述于例如参考文献188和189。
L.胞壁酰肽
适用作本发明佐剂的胞壁酰肽示例包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺（thr-MDP）、N-乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷酰胺（去甲-MDP）和N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺MTP-PE）。
M.咪唑并喹诺酮化合物。
适合用作本发明佐剂的咪唑并喹诺酮化合物的例子包括咪喹莫特及其同系物(例如，"瑞喹莫德3M")，见参考文献190和191所述。
N．缩氨基硫脲化合物
缩氨基硫脲化合物的例子，以及配制、制造和筛选所有适用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献192所述内容。缩氨基硫脲在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面特别有效。
O．色胺酮化合物
色胺酮化合物的例子，以及配制、制造和筛选所有适用作本发明佐剂的化合物的方法包括参考文献193所述内容。色胺酮化合物在刺激人外周血单核细胞产生细胞因子如TNF-α方面尤其有效。
本发明也可包含以上鉴定的一种或多种佐剂各方面的组合。例如，以下组合可用作本发明佐剂组合物：(1)皂苷和水包油乳剂[194]；(2)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)[195]；(3)皂苷(如QS21)+无毒LPS衍生物(如3dMPL)+胆固醇；(4)皂苷(如QS21)+3dMPL+IL12(任选+固醇)[196]；(5)3dMPL与(例如)QS21和/或水包油乳剂的组合[197]；(6)SAF，含有10%鲨烯、0.4%吐温80TM、5%普朗尼克-嵌段聚合物L121和thr-MDP，或微流体化成为亚微米乳液或涡旋振荡产生粒度较大的乳液，(7)RibiTM佐剂系统(RAS)（RI公司（RibiImmunochem）），含有2%鲨烯、0.2%吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，所述组分选自单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)；和(8)一种或多种矿物盐(如铝盐)+LPS的无毒衍生物(如3dMPL)。
用作免疫刺激剂的其它物质公开于参考文献126的第7章。
特别优选使用铝盐佐剂，抗原通常吸附于这类盐。可本发明组合物中使某些抗原吸附于氢氧化铝，而使另一些抗原结合磷酸铝。然而，通常优选只使用一种盐，如氢氧化物或磷酸盐，但二者不同时使用。并非所有偶联物都需要吸附，即某些或全部偶联物可在溶液中游离。
治疗方法
本发明还提供了一种在哺乳动物中引起免疫反应的方法，包含将本发明的药物组合物给予所述哺乳动物。免疫反应优选为保护性，优选涉及抗体。该方法可以引起加强反应。
所述哺乳动物优选人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(如幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。准备给予儿童的疫苗也可给予成年人，例如用以评估安全性、剂量、免疫原性等。优选治疗的人类别是育龄女性(如青少年和更大)。另一种优选类别是妊娠妇女。老年患者(如大于50、60、70、80或90等年龄特别是大于65岁年龄的那些),特别是生活在GBS感染风险可能增加的疗养院中那些([198])，是另一类优选治疗的人。在一些实施方式中，在给予药物组合物前，所述人中针对GBS血清型Ia荚膜糖的抗体水平检测不到。在另一些实施方式中，在给予药物组合物前，所述人中针对GBS血清型Ib荚膜糖的抗体水平检测不到。在另一些实施方式中，在给予药物组合物前，所述人中针对GBS血清型III荚膜糖的抗体水平检测不到。特别地，在给予药物组合物前，所述人中针对GBS血清型Ia荚膜糖的抗体水平检测不到，和针对GBS血清型Ib荚膜糖的抗体水平检测不到。或者或此外，在给予药物组合物前，所述人中针对GBS血清型III荚膜糖的抗体水平检测不到。针对荚膜糖的抗体水平可以使用下面人研究(1)中所述的ELISA测定。所述抗体水平可以是如给予前一个月的水平，特别地在给予前一个月内的水平(如两周内，一周内或在给予当天)。针对荚膜糖的抗体水平检测不到的女性可能在其新生儿中具有更高的GBS感染率。这是因为针对GBS荚膜糖的更高水平母体抗体与新生儿中疾病下降的风险相关[参考文献199和200]。因此，本发明特定设想向这些妇女给药。
在一些实施方式中，用白喉类毒素或其衍生物预先免疫所述患者，如下面在预先免疫患者部分中的本发明第二方面所述。在这些实施方式中，免疫原性组合物中的至少一个偶联物优选是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物。本发明人发现了对荚膜糖的免疫反应可以在所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫时，通过在白喉类毒素或其衍生物上呈递糖来提高。所述组合物中与白喉类毒素或其衍生物偶联的荚膜糖，例如可以是GBS血清型Ia、Ib或III。特别地，所述荚膜糖可以来自GBS血清型III(如下面所示例)。在这些实施方式中，通常组合物中所有GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联。当所述运载体或预先免疫抗原是白喉类毒素的衍生物时，则所述衍生物优选保留与Dt的免疫交叉反应，并且优选是CRM197。
在另一些实施方式中，用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫所述患者，如下面在预先免疫患者和破伤风类毒素运载体部分中的本发明第二方面所述。在这些实施方式中，免疫原性组合物中的至少一个偶联物优选是GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联的偶联物。对荚膜糖的免疫反应可以在所述患者用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫时，通过在破伤风类毒素或其衍生物上呈递糖来提高。所述组合物中与破伤风类毒素或其衍生物偶联的荚膜糖，例如可以是GBS血清型Ia、Ib或III。特别地，所述荚膜糖可以来自GBS血清型III。在这些实施方式中，通常组合物中所有GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联。
本发明也提供用作药物的本发明组合物。药物优选能够引起哺乳动物的免疫反应(即它是一种免疫原性组合物)，并且更优选是疫苗。
本发明也提供本发明组合物在制备引起哺乳动物免疫反应的药物中的应用。
这些应用和方法优选是防止和/或治疗由无乳链球菌（S.agalactiae）引起的疾病，如新生儿败血症或菌血症、新生儿肺炎、新生儿脑膜炎、子宫内膜炎、骨髓炎、脓毒性关节炎等。
所述预防疾病的对象可以与接受本发明偶联物的对象不相同。例如，可以给予女性偶联物(怀孕前或怀孕期间)以保护后代(所谓的‘母体免疫’[201-203])。
检测治疗性治疗功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测GBS感染。监测预防性治疗的功效的一种方式包括监测给予该组合物后对GBS抗原产生的免疫反应。
本发明中的优选组合物能在可接受百分比的人对象中产生优于各抗原组分血清保护标准的抗体效价。具有相关抗体效价的抗原是众所周知的，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由诸如WHO的组织公布。优选多于80%的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90%，更优选多于93%，最优选96-100%。
本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠外注射（例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或给予到组织间隙），或通过直肠、口服、阴道、外用、透皮、鼻内、眼部、耳部、肺部或其它粘膜给药途径完成直接递送。优选肌肉内给予到大腿或上臂。注射可以通过针头（例如皮下针头）进行，但可另外采用无针注射。肌内剂量通常为0.5ml。
本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。
剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以通过常规方法确定初免（prime）剂量之间（例如4-16周）以及初免（prime）和加强剂量之间的适当时间。
GBS蛋白抗原
如上所述，GBS蛋白能包含在本发明组合物中。这些可用作本发明偶联物的运载体蛋白、其它偶联物的运载体蛋白或非偶联蛋白质抗原。
本发明使用的GBS蛋白抗原包含参考文献99和204–206中所公开的那些。本发明使用的两个优选GBS蛋白抗原称为:GBS67;和GBS80[参见参考文献99]。本发明使用的其他优选GBS蛋白抗原称为Spb1[参见参考文献207]。下面给出这三个抗原的其它详情。
本文这三个GBS蛋白的全长序列是SEQ ID NO 1–3。因此，本发明组合物可包括(a)包含选自SEQ ID NO 1–3氨基酸序列的多肽，和/或(b)多肽，所述多肽包含(i)与一种或多种SEQ ID NO 1–3和/或(ii)SEQ ID NO 1–3的片段具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明组合物还可以包含这些GBS蛋白抗原的混合物。
特别地，本发明组合物可以包含：
(a1)包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽，和/或(b1)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 1和/或(ii)SEQ ID NO 1片段具有序列相同性的氨基酸序列;和
(a2)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的多肽，和/或(b2)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 2和/或(ii)SEQ ID NO 2片段具有序列相同性的氨基酸序列。
相似地，本发明组合物可以包含：
(a1)包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽，和/或(b1)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 1和/或(ii)SEQ ID NO 1片段具有序列相同性的氨基酸序列;和
(a2)包含氨基酸序列SEQ ID NO 3的多肽，和/或(b2)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 3和/或(ii)SEQ ID NO 3片段具有序列相同性的氨基酸序列。
相同地，本发明组合物可以包含：
(a1)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的多肽，和/或(b1)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 2和/或(ii)SEQ ID NO 2片段具有序列相同性的氨基酸序列;和
(a2)包含氨基酸序列SEQ ID NO 3的多肽，和/或(b2)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 3和/或(ii)SEQ ID NO 3片段具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明组合物可以包含：
(a1)包含氨基酸序列SEQ ID NO 1的多肽，和/或(b1)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 1和/或(ii)SEQ ID NO 1片段具有序列相同性的氨基酸序列;和
(a2)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的多肽，和/或(b2)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 2和/或(ii)SEQ ID NO 2片段具有序列相同性的氨基酸序列；和
(a3)包含氨基酸序列SEQ ID NO 3的多肽，和/或(b3)多肽，所述多肽包含(i)与SEQID NO 3和/或(ii)SEQ ID NO 3片段具有序列相同性的氨基酸序列。
本发明使用的其他三个优选GBS蛋白抗原称为:GBS104;GBS276和GBS322[参见参考文献99]。所述来自血清型V分离株2603V/R的野生型GBS104氨基酸序列在参考文献21中作为SEQ ID NO:3给出。当本文参考SEQ ID NO:1定义本发明实施方式时，参考SEQ ID NO:1可以用参考文献21的参考SEQ ID NO:3来代替。所述来自血清型V分离株2603V/R的野生型GBS276氨基酸序列在参考文献21中作为SEQ ID NO:4给出。当本文参考SEQ ID NO:2定义本发明实施方式时，参考SEQ ID NO:2可以由参考来自参考文献21的SEQ ID NO:4来替代。所述来自血清型V分离株2603V/R的野生型GBS322氨基酸序列在参考文献21中作为SEQ IDNO:5给出。当本文参考SEQ ID NO:3定义本发明实施方式时，参考SEQ ID NO:3可以由参考来自参考文献21的SEQ ID NO:5来替代。
根据具体SEQ ID NO，(i)中序列相同性程度优选大于50%(如60%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高)。这些多肽包括同系物、直向同源物、等位基因变体和功能突变体。通常认为，两个多肽序列间50%或更高的相同性表明其功能等同。优选通过MPSRCH程序(牛津分子公司(Oxford Molecular))执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。
根据具体SEQ ID NO，(ii)的片段应包含该序列中至少n个连续氨基酸，根据具体序列，n是7或更多(如8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100个或更多个)。该片段可包含该序列的至少一个T细胞表位，优选B细胞表位。可凭经验确定T和B细胞表位(如利用PEPSCAN[208,209]或相似方法)，或可预测这些表位(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[210]、基于矩阵的方法[211]、T表位(TEPITOPE)[212]、神经网络[213]、OptiMer和EpiMer[214，215]、ADEPT[216]、T位点（Tsites）[217]、亲水性[218]、抗原性指数[219]或参考文献220中公开的方法等)。其他优选片段是SEQ ID NO1–3，没有其N末端氨基酸残基或没有其N末端信号肽。能移除一个或多个结构域，例如前导或信号序列区域、跨膜区域、胞质区或细胞壁锚定基序。特定蛋白的优选片段能结合到可结合全长特定蛋白的抗体，如能结合到结合SEQ ID NO:1、2或3的抗体。如下给出一些有用片段(SEQ ID NO4-13)。
与SEQ ID NO 1-3相比，这些多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)连续氨基酸取代，即用另一具有相关侧链的氨基酸取代某一氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)不带电的极性氨基酸，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起分类为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸取代不会对生物活性产生重要影响。相对于SEQ ID NO:1-3，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)单一氨基酸缺失。相对于SEQ ID NO:1-3，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10等)插入(如各1、2、3、4或5个氨基酸)。
可以多种方式制备本发明多肽，例如化学合成(全部或部分)，用蛋白酶消化较长多肽，由RNA翻译，由细胞培养物纯化(如通过重组表达)，由生物体本身制备(如细菌培养后，或直接来自患者)等。产生长度<40个氨基酸的肽的优选方法包括体外化学合成[221,222]。尤其优选固相肽合成，例如基于tBoc或Fmoc[223]化学的方法。也可部分或完全利用酶促合成[224]。作为化学合成的替代方式，可利用生物合成，例如可通过翻译产生多肽。这一过程可以在体外或体内进行。生物学方法通常仅限于产生基于L-氨基酸的多肽，但可通过操作翻译机制(如氨基酰基tRNA分子的翻译机制)引入D-氨基酸(或其它非天然氨基酸，如碘化酪氨酸或甲基苯丙氨酸、叠氮基高丙氨酸等)[225]。然而，包含D氨基酸时，优选使用化学合成。本发明多肽的C末端和/或N末端上可能有共价修饰。
如果这些GBS蛋白包含在本发明的组合物中，那么其可采取各种形式(如天然、融合、糖基化、非糖基化、脂化、非脂化、磷酸化、非磷酸化、肉豆蔻酰化、非肉豆蔻酰化、单体、多聚体、颗粒、变性等)。其优选以纯化或基本纯化形式使用，即基本没有其他多肽(如没有天然产生的多肽)，特别是来自其GBS或宿主细胞的多肽)。
GBS67
从血清型V株2603V/R测序的GBS67的核苷酸和氨基酸序列示于参考文献99中的SEQ ID NO 3745和3746。所述氨基酸序列在本文中是SEQ ID NO:1:
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELTG EATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKLEH VKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDNSNS MNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDVVKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTENYSH KQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTDGVPTR SYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGT IYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELMRSFSSKP EYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSVMKDGIATG GPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLRDFPIPKIRD VREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLI EAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILSFILIGGAMMSI AGGIYIWKRYKKSSDMSIKKD
GBS67包含距离上述SEQ ID NO:1C末端最近的由下划线区域指示的C末端跨膜区。来自穿膜区的一个或多个氨基酸可以移除，或所述氨基酸可以在跨膜区前截断。这种GBS67片段示例示于如下SEQ ID NO:4。
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELTGEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKLEHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDNSNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDVVKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTENYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTDGVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELMRSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSVMKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS
GBS67包含指示细胞壁锚的氨基酸基序，如上面SEQ ID NO:1中斜体所示。在一些重组宿主细胞系统中，优选移除该基序以促进重组GBS67蛋白从所述宿主细胞中分泌。因此，在本发明使用的一个优选GBS67片段中，从GBS67移除所述跨膜和所述细胞壁锚定基序。这种GBS67片段示例示于如下SEQ ID NO:5。
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKTTAHPESKIEKVTAELTGEATFDNLIPGDYTLSEETAPEGYKKTNQTWQVKVESNGKTTIQNSGDKNSTIGQNQEELDKQYPPTGIYEDTKESYKLEHVKGSVPNGKSEAKAVNPYSSEGEHIREIPEGTLSKRISEVGDLAHNKYKIELTVSGKTIVKPVDKQKPLDVVFVLDNSNSMNNDGPNFQRHNKAKKAAEALGTAVKDILGANSDNRVALVTYGSDIFDGRSVDVVKGFKEDDKYYGLQTKFTIQTENYSHKQLTNNAEEIIKRIPTEAPKAKWGSTTNGLTPEQQKEYYLSKVGETFTMKAFMEADDILSQVNRNSQKIIVHVTDGVPTRSYAINNFKLGASYESQFEQMKKNGYLNKSNFLLTDKPEDIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGTIYRNGPVKEHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEEYKKNQDGTFQKLKEEAFKLSDGEITELMRSFSSKPEYYTPIVTSADTSNNEILSKIQQQFETILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLQLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSVMKDGIATGGPNNDGGILKGVKLEYIGNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEDPNTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFIKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLIEAVSPEDYQKITNKPILTFEVVKGSIKNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGI
或者，在一些重组宿主细胞系统中，优选用所述细胞壁锚定基序将重组表达蛋白锚定在细胞壁上。表达蛋白的胞外结构域可在纯化期间进行切割，或所述重组蛋白可结合灭活的宿主细胞或最终组合物中的细胞膜。
GBS67中鉴定了三个包含保守赖氨酸残基的菌毛蛋白（pilin）基序。保守的赖氨酸残基位于氨基酸残基478和488，氨基酸残基340和342，和氨基酸残基703和717。认为所述菌毛蛋白序列特别是所述保守的赖氨酸残基对GBS67的寡聚、菌毛样结构的形成重要。优选的GBS67片段包含至少一个保守的赖氨酸残基。GBS67中鉴定了两个包含保守谷氨酸残基的E盒。优选的GBS67片段包含至少一个保守的谷氨酸残基。GBS67包含预测形成α螺旋结构的几个区。这种α螺旋区很可能形成卷曲螺旋结构，并且可涉及GBS67的寡聚化。GBS67也包含与金黄色葡萄球菌（S.aureus）胶原结合表面蛋白(pfam05738)的Cna_B结构域同源的区。这可以形成β夹心结构。GBS67包含与血管假性血友病因子(vWF)A型结构域同源的区。
测序自血清型Ib株H36B的GBS67氨基酸序列示于参考文献226中的SEQ IDNO20906。所述氨基酸序列在本文中是SEQ ID NO:24:
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVTGEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNLEHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDNSNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYKKFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTRSYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGTIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSSKPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSIATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEVVKGSIQNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILSFILIGGAMMSIAGG IYIWKRHKKSSDASIEKD
在一些实施方式中，可采用所述GBS67变体。因此，当本文参考SEQ ID NO:1定义本发明实施方式时，参考SEQ ID NO:1可以用参考SEQ ID NO:24来代替。
如同测序自血清型V株2603V/R的GBS67，测序自血清型Ib株H36B的GBS67包含由离上面SEQ ID NO:24C末端最近的下划线区域指示的C末端跨膜区。来自跨膜区的一个或多个氨基酸可以移除，或所述氨基酸可以在跨膜区前截断。这种GBS67片段示例示于如下SEQ IDNO:25。
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVTGEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNLEHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDNSNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYKKFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTRSYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGTIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSSKPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSIATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEVVKGSIQNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGIIPMTGGKGILS
如同测序自血清型V株2603V/R的GBS67，测序自血清型Ib株H36B的GBS67包含指示细胞壁锚的氨基酸基序，如上面SEQ ID NO:24中斜体所示。因此，在本发明使用的一个优选GBS67片段中，从GBS67移除所述跨膜和所述细胞壁锚定基序。这种GBS67片段示例示于如下SEQ ID NO:26。
MRKYQKFSKILTLSLFCLSQIPLNTNVLGESTVPENGAKGKLVVKKTDDQNKPLSKATFVLKPTSHSESKVEKVTTEVTGEATFDNLTPGDYTLSEETAPEGYKKTTQTWQVKVESNGKTTIQNSDDKKSIIEQRQEELDKQYPLTGAYEDTKESYNLEHVKNSIPNGKLEAKAVNPYSSEGEHIREIQEGTLSKRISEVNDLDHNKYKIELTVSGKSIIKTINKDEPLDVVFVLDNSNSMKNNGKNNKAKKAGEAVETIIKDVLGANVENRAALVTYGSDIFDGRTVKVIKGFKEDPYYGLETSFTVQTNDYSYKKFTNIAADIIKKIPKEAPEAKWGGTSLGLTPEKKREYDLSKVGETFTMKAFMEADTLLSSIQRKSRKIIVHLTDGVPTRSYAINSFVKGSTYANQFERIKEKGYLDKNNYFITDDPEKIKGNGESYFLFPLDSYQTQIISGNLQKLHYLDLNLNYPKGTIYRNGPVREHGTPTKLYINSLKQKNYDIFNFGIDISGFRQVYNEDYKKNQDGTFQKLKEEAFELSDGEITELMNSFSSKPEYYTPIVTSADVSNNEILSKIQQQFEKILTKENSIVNGTIEDPMGDKINLHLGNGQTLQPSDYTLQGNDGSIMKDSIATGGPNNDGGILKGVKLEYIKNKLYVRGLNLGEGQKVTLTYDVKLDDSFISNKFYDTNGRTTLNPKSEEPDTLRDFPIPKIRDVREYPTITIKNEKKLGEIEFTKVDKDNNKLLLKGATFELQEFNEDYKLYLPIKNNNSKVVTGENGKISYKDLKDGKYQLIEAVSPKDYQKITNKPILTFEVVKGSIQNIIAVNKQISEYHEEGDKHLITNTHIPPKGI
GBS80
GBS80指推定的细胞壁表面锚家族蛋白。测序自血清型V分离株2603V/R的GBS80的核苷酸和氨基酸序列示于参考文献99中的SEQ ID NO 8779和8780。所述氨基酸序列示于下面SEQ ID NO:2:
MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKDN
GBS80包含由上面下划线序列指示的N末端前导或信号序列区。GBS80前导或信号序列区的一个或多个氨基酸可移除。这种GBS80片段示例示于如下SEQ ID NO:6：
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNTGGIGTAIFVAIGAAVMAFAVKGMKRRTKDN
GBS80包含由上述SEQ ID NO:2末端附近的下划线区域指示的C末端跨膜区。跨膜区域和/或胞质区域的一个或多个氨基酸可移除。这种片段示例示于如下SEQ ID NO:7：
MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSIPNTG
GBS80包含指示细胞壁锚的氨基酸基序，如上面SEQ ID NO:2中斜体所示。在一些重组宿主细胞系统中，优选移除该基序以促进重组GBS80蛋白从所述宿主细胞中分泌。因此所述跨膜和/或胞质区和细胞壁锚定基序可从GBS80中移除。这种片段示例示于如下SEQ IDNO:8。
MKLSKKLLFSAAVLTMVAGSTVEPVAQFATGMSIVRAAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS
或者，在一些重组宿主细胞系统中，优选用所述细胞壁锚定基序将重组表达蛋白锚定在细胞壁上。表达蛋白的胞外结构域可在纯化期间切割，或所述重组蛋白可结合灭活的宿主细胞或最终组合物中的细胞膜。
在一个实施方式中，从所述GBS80序列移除所述前导或信号序列区、所述跨膜和胞质区和所示细胞壁锚基序。这种GBS80片段示例示于如下SEQ ID NO:9：
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS
GBS80的特定免疫原性片段位于所述蛋白的N末端，本文中是SEQ ID NO:10：
AEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKG
Spb1
来自血清型III株COH1的野生型SpbI序列在本文中是SEQ ID NO:3:
MKKKMIQSLLVASLAFGMAVSPVTPIAFAAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAE YKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAV IMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSY EVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKP GSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATE YTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTELPSTGGIGTTIFY IIGAILVIGAGIVLVARRRLRS
野生型SpbI包含由上面下划线序列指示的N末端前导或信号序列区(aa1-29)。SpbI前导或信号序列区域的一个或多个氨基酸可移除。这种SpbI片段示例示于如下SEQ IDNO:11：
AETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTAS ANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTV DQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLE ENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTV RDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLG YNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTELPSTGGIGTTIFYIIGAILVIGAGIVLVARRRLRS
所述野生型SpbI序列包含指示细胞壁锚(LPSTG)的氨基酸基序。在一些重组宿主细胞系统中，优选移除该基序以促进重组SpbI蛋白从所述宿主细胞中分泌。因此，可以从SpbI除去所述细胞壁锚基序和这个基序的序列C末端。这种片段示例示于如下SEQ ID NO:12：
MKKKMIQSLLVASLAFGMAVSPVTPIAFAAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAE YKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAV IMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSY EVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKP GSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATE YTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTE
或者，在一些重组宿主细胞系统中，优选用所述细胞壁锚定基序将重组表达蛋白锚定在细胞壁上。表达蛋白的胞外结构域可在纯化期间切割，或所述重组蛋白可结合灭活的宿主细胞或最终组合物中的细胞膜。
在一个实施方式中，从SpbI中移除所述前导或信号序列区、所述细胞壁锚基序和此基序的序列C末端。这种SpbI片段示例示于如下SEQ ID NO:13：
AETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTAS ANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTV DQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLE ENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTV RDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLG YNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTE
也在SpbI中鉴定了包含保守谷氨酸残基的E盒(带下划线)，保守谷氨酸在残基423处(粗体)。所述E盒基序可能对寡聚菌毛样结构的形成很重要，且因此SpbI的有用片段可包括该保守谷氨酸残基。
所述野生型Spb1序列包括含有上游12聚TAATGGAGCTGT序列(SEQ ID NO:14)的内部蛋氨酸密码子(Met-162)，所述序列包含Shine-Dalgarno序列的核心序列(带下划线)。已经发现这个Shine-Dalgarno序列起始已截断Spb1序列的翻译。为了防止在所述位点起始翻译，能在用于表达的Spb1编码序列中破坏Shine-Dalgarno序列。尽管能突变任何合适的核苷酸以防止核糖体结合，所述序列包含作为部分Shine-Dalgarno核心和内部蛋氨酸密码子框内的GGA甘氨酸密码子。在这个密码子中的第三个碱基能突变成C、G或T，不改变编码的甘氨酸，因而避免Spb1序列中的任何改变。
本发明组合物也可以包含参考文献[227]中由氨基酸序列NH2–W–X–L–Y–Z–CO2H定义的多肽，其中:X是Spb1序列;L是可选接头;和Y是GBS80序列;W是可选的N末端序列;和Z是可选的C末端序列。下面给出这个多肽的其它详情。
这些组合物也可以包含上述一种或多种GBS蛋白抗原。特别地，本发明组合物可以包含(a)具有氨基酸序列NH2–W–X–L–Y–Z–CO2H的多肽;和(b1)包含上述氨基酸序列SEQ IDNO 1的多肽,和/或(b2)某种多肽，所述多肽包含(i)与上述SEQ ID NO 1序列和或(ii)上述SEQ ID NO 1片段具有序列相同性的氨基酸序列。
多肽NH2–W–X–L–Y–Z–CO2H
通常，所述多肽包含氨基酸序列X–L–Y,其中:X是Spb1序列;L是可选接头;和Y是GBS80序列。
X:Spb1序列
所述X部分是Spb1序列。此Spb1序列给予患者时会引起包含结合野生型Spb1蛋白抗体的抗体反应，所述蛋白如有氨基酸序列SEQ ID NO:3的无乳链球菌（S.agalactiae）蛋白(来自菌株COH1的全长野生型序列)。
所述Spb1序列可以包含与SEQ ID NO:13有至少a%相同性的氨基酸序列。a值可以选自50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或更大。所述Spb1序列可以包含SEQ ID NO:13。
所述Spb1序列可以包含SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:13的片段。所述片段通常包含SEQ ID NO:3/13的至少b个氨基酸，其中b选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200或更多。该片段通常包含SEQ ID NO:3/13的至少一个T细胞或优选B细胞表位。T和B细胞表位能通过上述方法鉴定。SEQ ID NO：13本身是如上所解释的SEQ ID NO：3的片段。
所述Spb1序列可以包含与SEQ ID NO:13有至少a%相同性的氨基酸序列，和包含如上述SEQ ID NO:13的片段。
所述X部分通常长至少c个氨基酸，其中c选自50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400或更多。
所述X部分通常不大于d个氨基酸长度，其中d选自500、480、460、440、420、400、380、360、340、320、300、280、260、240、220、200或更少。
所述X部分通常长300-500个氨基酸，如350-480、400-460、430-450。
来自血清型III株COH1的野生型SpbI序列是上面的SEQ ID NO:3。在上面“SpbI”部分所述的其特定衍生物可用于本发明这个实施方式的Spb1序列。
Y:GBS80序列
所述Y部分是GBS80序列。此GBS80序列给予患者时会引起包含结合野生型GBS80蛋白抗体的抗体反应，所述蛋白如有氨基酸序列SEQ ID NO:2的无乳链球菌（S.agalactiae）蛋白(来自菌株2603V/R的全长野生型序列)。
所述GBS80序列可以包含与SEQ ID NO:9有至少e%相同性的氨基酸序列。e值可以选自50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或更大。所述GBS80序列可以包含SEQ ID NO:9。
所述GBS80序列可以包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:9的片段。所述片段通常包含SEQ ID NO:2/9的至少f个氨基酸，其中f选自5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、175、200或更多。该片段通常包含SEQ ID NO:2/9的至少一个T细胞或优选B细胞表位。SEQ ID NO：9本身是如上所解释的SEQ ID NO：2的片段。
所述GBS80序列可以包含与SEQ ID NO:9有至少e%相同性的氨基酸序列，和包含上述SEQ ID NO:9的片段。
所述Y部分通常长至少g个氨基酸，其中g选自50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480、500、520、540、560、580、600或更多。
所述Y部分通常不大于h个氨基酸长度，其中h选自600、580、560、540、520、500、480、460、440、420、400、380、360、340、320、300、280、260、240、220、200或更少。
所述Y部分通常长350-500个氨基酸，如400-520、450-500、470-490。
来自血清型V分离株2603V/R的野生型GBS80序列是上面的SEQ ID NO:2。在上面“GBS80”部分所述的其特定衍生物可用于本发明这个实施方式的GBS80序列。
L:接头
所述多肽可选包含连接X和Y部分的L部分。所述L部分通常是短氨基酸序列，如范围为2-40氨基酸，如由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。
接头会通常包含至少一个甘氨酸残基，因而有助于结构挠性。所述接头可以包含例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个甘氨酸残基所述甘氨酸可排列为在Gly-Gly二肽序列或更长的寡Gly序列（即Glyn，其中n=2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大）中包括至少2个连续甘氨酸，如SEQ ID NO:15：
GGGG
接头可以由限制性酶的识别序列中发现的密码子编码。例如，是特定限制性酶靶标的6聚体序列能编码二肽。因此，BamHI(GGATCC)的识别序列编码Gly-Ser，并且因此接头可以包含Gly-Ser二肽序列。这种序列辅助克隆和操作。
有用的接头序列包含上面的SEQ ID NO 15和下面的SEQ ID NO 16、17和18:
GGGGSGGGGSGGGG(SEQ ID NO:16)
GGGGSGGGGSGGGGSEL(SEQ ID NO:17)
GSGGGG(SEQ ID NO:18)
然而，优选接头不包含与人多肽序列共有10个或更多毗连氨基酸的序列。例如，本发明能使用的一个富甘氨酸接头序列是14聚体SEQ ID NO:16。然而，这个14聚体也在人RNA结合蛋白(gi:8051631)中发现，并且因此优选在所述L部分中避免。
W:N-端序列
所述X部分可以是多肽的N末端，但是也可能有X的上游氨基酸。这些可选氨基酸形成W部分。
所述W部分通常是短氨基酸序列，如范围为2-40氨基酸，如由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。
W部分的示例是指导蛋白运输的前导序列，或包含辅助克隆或纯化的短肽序列（如组氨酸标签，即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更大）。其它合适的N末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见。
在新生多肽中，W部分可提供多肽的N末端甲硫氨酸（细菌中为甲酰甲硫氨酸，fMet）。然而，可从新生W部分的N末端切割一种或多种氨基酸，从而本发明多肽中所述W部分不必需包括N末端甲硫氨酸。
有用的W部分包含SEQ ID NO 19:
MAS
Z:C末端序列
所述Y部分可以是多肽的C末端，但是也可能有Y的下游氨基酸。这些可选氨基酸形成Z部分。
所述Z基序通常是短氨基酸序列，如范围为2-40氨基酸，如由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个氨基酸组成。
Z部分的示例包括指导蛋白质运输的序列，有利于克隆或纯化的短肽序列（如包含组氨酸标签，即Hisn，其中n=3、4、5、6、7、8、9、10或更大），或能提高蛋白质稳定性的序列。其他合适的C末端氨基酸序列对本领域技术人员显而易见，如谷胱甘肽S转移酶、硫氧还蛋白、金黄色葡萄球菌（S.aureus）蛋白A的14kDa片段、生物素化肽、麦芽糖结合蛋白、肠激酶标签等。一个有用的Z部分包含SEQ ID NO 20:
HHHHHH
有用的组合
对多种X、Y和L部分而言，有用的组合包括但不限于：
SEQ ID W X L Y Z
21 19 13 17 9 -
22 19 13 17 9 20
23 19 13 18 9 -
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGGGGSGGGGSGGGGSELAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS(SEQ ID NO:21)
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGGGGSGGGGSGGGGSELAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPSHHHHHH(SEQ ID NO:22)
MASAETGTITVQDTQKGATYKAYKVFDAEIDNANVSDSNKDGASYLIPQGKEAEYKASTDFNSLFTTTTNGGRTYVTKKDTASANEIATWAKSISANTTPVSTVTESNNDGTEVINVSQYGYYYVSSTVNNGAVIMVTSVTPNATIHEKNTDATWGDGGGKTVDQKTYSVGDTVKYTITYKNAVNYHGTEKVYQYVIKDTMPSASVVDLNEGSYEVTITDGSGNITTLTQGSEKATGKYNLLEENNNFTITIPWAATNTPTGNTQNGANDDFFYKGINTITVTYTGVLKSGAKPGSADLPENTNIATINPNTSNDDPGQKVTVRDGQITIKKIDGSTKASLQGAIFVLKNATGQFLNFNDTNNVEWGTEANATEYTTGADGIITITGLKEGTYYLVEKKAPLGYNLLDNSQKVILGDGATDTTNSDNLLVNPTVENNKGTEGSGGGGELAEVSQERPAKTTVNIYKLQADSYKSEITSNGGIENKDGEVISNYAKLGDNVKGLQGVQFKRYKVKTDISVDELKKLTTVEAADAKVGTILEEGVSLPQKTNAQGLVVDALDSKSNVRYLYVEDLKNSPSNITKAYAVPFVLELPVANSTGTGFLSEINIYPKNVVTDEPKTDKDVKKLGQDDAGYTIGEEFKWFLKSTIPANLGDYEKFEITDKFADGLTYKSVGKIKIGSKTLNRDEHYTIDEPTVDNQNTLKITFKPEKFKEIAELLKGMTLVKNQDALDKATANTDDAAFLEIPVASTINEKAVLGKAIENTFELQYDHTPDKADNPKPSNPPRKPEVHTGGKRFVKKDSTETQTLGGAEFDLLASDGTAVKWTDALIKANTNKNYIAGEAVTGQPIKLKSHTDGTFEIKGLAYAVDANAEGTAVTYKLKETKAPEGYVIPDKEIEFTVSQTSYNTKPTDITVDSADATPDTIKNNKRPS(SEQ IDNO:23)
所述多肽可以包含与SEQ ID NO:21有至少i%序列相同性的氨基酸序列。i值可以选自50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或更大。所述多肽可以包含SEQ ID NO:21。
所述多肽可以包含与SEQ ID NO:23有至少i%序列相同性的氨基酸序列。i值可以选自50、60、70、80、85、90、95、96、97、98、99或更大。所述多肽可以包含SEQ ID NO:23。
本发明所用多肽可包含某一氨基酸序列，所述序列：
(a)与SEQ ID NO:21或23相同(即100%相同性);
(b)与SEQ ID NO:21或23共有序列相同性;
(c)与(a)或(b)的序列相比，含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个(或更多个)单一氨基酸改变(缺失、插入、取代)，这些改变可以位于不同位置或连续出现；和
(d)用逐对比对算法与SEQ ID NO:21或23比对时，每个从N末端到C末端的x个氨基酸移动窗口(从而对于延伸至p个氨基酸的比对，p>x时存在p-x+1个这种窗口)具有至少x·y个相同的比对氨基酸，其中：x选自20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200；y选自0.50、0.60、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、0.99；并且如果x·y不是整数，则四舍五入成最接近的整数。优选的逐对比对算法是Needleman-Wunsch全局比对算法[228]，使用默认参数(如缺口开放罚分=10.0，缺口延伸罚分=0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)。用EMBOSS软件包中的needle工具能方便地实施这种算法[229]。
在(c)组内，缺失或取代可在N末端和/或C末端，或者可以在两个末端之间。因此，截短是缺失的一个例子。截短可包括在N末端和/或C末端缺失多达40个(或更多个)氨基酸。
所述多肽中的Spb1和GBS80序列可以衍生自一种或多种GBS株。例如，SEQ ID NO:21和23包含来自菌株COH1的Spb1序列，和来自菌株2603V/R的GBS80序列。
多肽
与SEQ ID NO:2、3、9、10、13、21和23相比，所述多肽或单个部分可包括一个或多个(例如1、2、5、4、5、6、7、8、9、10等)保守氨基酸置换，即用另一个具有相关侧链的氨基酸置换某一氨基酸。遗传编码的氨基酸通常分为四类：(1)酸性，即天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性，即赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性，即丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)极性不带电，即甘氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸一起分类为芳族氨基酸。通常，这些家族中的单个氨基酸的取代不会对生物活性产生重要影响。相对于参比序列，该多肽可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)单一氨基酸缺失。相对于参比序列，该多肽也可包含一个或多个(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个等)插入(如1、2、3、4或5个)。
所述多肽能以上述很多方式制备。所述多肽也可采取上述各种形式(如天然多肽、融合多肽、糖基化多肽、非糖基化多肽、脂化多肽、非脂化多肽、磷酸化多肽、非磷酸化多肽、肉豆蔻酰化多肽、非肉豆蔻酰化多肽、单体多肽、多聚体多肽、颗粒多肽、变性多肽等)。所述多肽优选以上述纯化或基本纯化形式提供。
术语“多肽”指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线形或分支聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，可以被非氨基酸打断。该术语也包括天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，如与标记组分偶联。该定义也包括，例如，含有一个或多个氨基酸类似物（包括例如，非天然氨基酸等）以及本领域已知其它修饰的多肽。多肽可以单链或结合链的形式产生。所述多肽可以是天然或非天然糖基化的(即该多肽的糖基化模式不同于相应天然产生多肽中发现的糖基化模式)。
所述多肽可以长至少40个氨基酸（如至少40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、350、400、450、500或更多）。所述多肽可以少于1100个氨基酸。
预先免疫
第二方面，本发明提供了针对感染免疫患者的方法，所述方法包含给予患者偶联物的步骤，所述偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联的偶联物，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。通常，如上所述，所述偶联物是本发明第一方面的免疫原性组合物中的所述GBS偶联物之一。换言之，本发明第一方面的免疫原性组合物可以用于本发明第二方面，其中至少一个偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联的偶联物。所述组合物中与白喉类毒素或其衍生物偶联的荚膜糖可以是例如GBS血清型Ia、Ib或III。特别地，所述荚膜糖可以来自GBS血清型III(如下面示例)。在这个方面，通常组合物中所有GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联。当所述运载体或预先免疫抗原是白喉类毒素的衍生物，则所述衍生物优选保留与Dt在免疫学上交叉反应，并且优选是CRM197。所述发明人发现GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联的偶联物似乎没有遭受运载体诱导的表位抑制(或如通常称为“运载体抑制”)，特别是来自运载体初免（prime）的抑制。如先所讨论，“运载体抑制”是某种现象，其中用运载体蛋白预先免疫动物防止其稍后引起针对所述运载体上存在的新抗原表位的免疫反应[230]。与这种已知现象相反，发明人发现了对GBS荚膜糖-白喉类毒素或其衍生物偶联物的免疫反应可以实际上通过用所述白喉类毒素或其衍生物预先免疫来提高。
如参考文献231报道，数种疫苗抗原包含相同的蛋白成分(在偶联物中用作免疫原和/或运载体蛋白)时，则有这些抗原间干扰的可能。在参考文献231中，针对与破伤风类毒素(Tt)运载体偶联的抗原的免疫反应通过针对Tt预先存在的免疫性来抑制。
参考文献232报道了DTP疫苗与Hib偶联物疫苗的组合如何被不利地影响，其中用于所述Hib偶联物的运载体与来自所述DTP疫苗的破伤风抗原相同。该作者的结论是当引入包含多种偶联物的疫苗时，应该考虑这种来自通用蛋白运载体干扰的“运载体抑制”现象。
与参考文献231和232相反，参考文献233报道了用破伤风类毒素初免（priming）对针对后续给予Hib-Tt偶联物的免疫反应没有负面影响，但是在有母体获得性抗Tt抗体的患者中观察到抑制。然而，参考文献234中报道了在有破伤风疫苗所产生现有抗Tt抗体的患者中，对基于Tt的肽偶联物的“表位抑制”影响。
参考文献235中提示了有CRM197(白喉毒素的脱毒突变体)的偶联物作为运载体在儿童中可能无效，所述儿童没有预先接受作为部分疫苗(如作为部分D-T-P或D-T疫苗)的白喉毒素。参考文献236中进一步发展了这个工作，其中观察到通过D-T免疫的运载体初免（prime）影响对后续用Hib偶联物免疫而言持久。
参考文献237中，该作者发现用白喉或破伤风类毒素运载体蛋白的预先免疫降低了在后续用与所述运载体偶联的Hib荚膜糖免疫后，抗Hib抗体水平的上升，IgG1和IgG2影响相同。也抑制了所述偶联物的运载体部分的反应。另外，观察到更普通的非表位特异性抑制，因为观察到用一种偶联物预先免疫影响针对所述运载体和四周后所给予第二偶联物糖部分的免疫反应。
参考文献238报道了在单个多价肺炎球菌偶联物疫苗中使用不同运载体蛋白，使用多种运载体以避免运载体抑制。该作者预测了有运载体蛋白的最大加载，其能在多价偶联物疫苗中耐受而不产生负面干扰。参考文献239中报道了包含混合运载体蛋白的肺炎球菌偶联物疫苗，平行引起抗肺炎球菌反应和对运载体的无意加强反应。
参考文献240中，研究白喉和破伤风加强是否能与单价脑膜炎球菌血清组C偶联物一起给予，发现了针对脑膜炎球菌偶联物的效价下降，其中所述运载体是破伤风类毒素运载体并且所述患者在免疫前接受包含破伤风的疫苗。
除了用负面影响针对糖偶联物免疫反应的运载体初免（prime）的问题外，也能发生所述逆转，如用偶联物免疫能负面影响针对所述运载体的免疫反应[241]。
因此，本发明第二方面提供了对患者进行抗GBS感染免疫的方法，所述方法包含给予患者偶联物的步骤，所述偶联物是与白喉类毒素或其衍生物偶联的荚膜糖，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。这个方面也提供了某种偶联物，所述偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，以用于免疫患者抵御GBS感染，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。这个方面也提供了某种偶联物在制造免疫患者抵御GBS感染的药物中的应用，所述偶联物是GBS荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，其中所述患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。
预先免疫的患者
所述要免疫的患者用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。所述白喉类毒素或其衍生物可以在GBS以外的生物体荚膜糖和白喉类毒素或其衍生物的偶联物中作为运载体给予。通常预先免疫会包含:白喉类毒素抗原;使用白喉类毒素或CRM197运载体的Hib荚膜糖偶联物;和/或使用白喉类毒素或CRM197运载体的肺炎球菌荚膜糖偶联物。
所述患者会接受至少一种(如1、2、3或更多)剂量的预先免疫抗原，并且根据本发明此方面用GBS偶联物免疫前，所述剂量(或最早的多剂量)会给予所述患者至少6(如6、9、12、15、18、21、24、36、48、60、120、180、240、300或更多)个月。在一个优选患者组中，所述预先免疫在出生3年内发生，如出生2年内，出生1年内，出生6个月内，或甚至出生3个月、2个月或1个月内。根据本发明此方面免疫的合适患者在上面治疗方法部分中描述。
当预先免疫抗原是白喉类毒素时，那么所述患者会通常接受所述类毒素作为D-T-P或D-T预先免疫中的‘D’抗原。这种免疫通常在2、3和4月龄时给予新生儿。当所述免疫包含百日咳疫苗时，所述疫苗可以是全细胞或细胞百日咳疫苗(‘Pw’)，但是优选无细胞百日咳疫苗(‘Pa’)。预先免疫Pa疫苗会通常包含1种、2种或3种下列熟知和良好鉴定的百日咳博德特菌（B.pertussis）抗原：(1)百日咳类毒素(‘PT’)，通过化学方法或定位诱变如‘9K/129G’突变体来脱毒[242];(2)丝状血细胞凝集素(‘FHA’);(3)百日咳杆菌粘附素(也称为‘69千道尔顿外膜蛋白’)。无细胞百日咳疫苗也包含凝集原2和/或凝集原3。所述D-T-P预先免疫中的‘T’抗原通常是破伤风类毒素。
当所述预先免疫抗原是白喉类毒素时，则所述患者也可以或者已经接受所述类毒素作为蛋白-糖偶联物中的运载体蛋白。这种偶联物包含所述‘PRP-D’Hib偶联物[参见参考文献[243]的表14-7，如所述ProHIBITTM产物。
当所述预先免疫抗原是CRM197时，则所述患者会通常用Hib偶联物和/或多价肺炎球菌偶联物预先免疫。这种免疫通常在2、3和4月龄时给予新生儿。使用CRM197运载体的Hib偶联物包含所述‘HbOC’偶联物[参考文献243的表14-7]，如所述HibTITERTM产物。使用CRM197运载体的肺炎球菌偶联物包含所述7价PCV7混合物，如所述PrevNarTM疫苗[244]。所述患者也可以用血清组C脑膜炎球菌(‘MenC’)偶联物预先免疫。使用CRM197运载体的MenC偶联物包含MeninvactTM/MenjugateTM[245]和MeningitecTM。
当用偶联抗原预先免疫时，则所述患者几乎不可避免地也接受少量游离的白喉类毒素(或衍生物)，作为所述偶联物低水平污染(如由存储中所述偶联物水解造成)的结果，但是这个少量通常不足以提供显著的免疫反应。
白喉类毒素是熟知并且良好鉴定的蛋白[例如参见参考文献243的第13章]，其能用灭活化学物如福尔马林或甲醛处理白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheriae)的ADP核糖基化外毒素获得。CRM197也熟知并且良好鉴定[246-249]，且广泛用作偶联的糖疫苗中的运载体。CRM197和Dt共有很多运载体表位。
预先免疫的结果是所述患者免疫系统已经暴露于预先免疫抗原。对用白喉类毒素(Dt)预先免疫而言，这通常指所述患者会增加抗Dt抗体反应(通常生成抗Dt效价>0.01IU/ml)并且拥有对Dt特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即用Dt的预先免疫通常足以在患者中引起记忆性抗Dt免疫反应。对于Dt(或衍生物)是偶联物内糖运载体的预先免疫，则所述预先免疫会增加抗糖反应，并且所述患者会拥有对糖特异的记忆B和/或T淋巴细胞，即所述预先免疫通常足以在患者中引起记忆性抗糖免疫反应。所述预先免疫优选足以引起所述患者中例如针对白喉疾病的保护免疫。
因此，根据本发明此方面要免疫的所述患者不同于普通患者，因为其是免疫系统已经对预先免疫抗原产生免疫反应的总群体（general population）亚组的成员，从而根据这个方面，用包含白喉类毒素（或其衍生物）运载体的GBS偶联物免疫在所述先前没有对预先免疫抗原产生免疫反应的患者亚组中引起不同的免疫反应。优选用Dt(或衍生物)作为偶联物运载体(特别是Hib偶联物)预先免疫的患者。特别优选的患者用Dt(或衍生物)作为偶联物的运载体以及用Dt作为非偶联免疫原预先免疫。
用偶联或非偶联形式的白喉类毒素(或衍生物)预先免疫，所述患者可以用其他抗原预先免疫。此类抗原包括但不限于：百日咳抗原–见上;破伤风类毒素–见上;B型流感嗜血杆菌–见上;乙型肝炎表面抗原(HBsAg);脊髓灰质炎病毒，如灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV);肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)–见上;流感病毒;BCG;甲型肝炎病毒抗原;麻疹病毒;流行性腮腺炎病毒;风疹病毒;水痘-带状疱疹病毒等。
所述患者可以用或不用一种或多种GBS偶联物预先免疫。在一些优选实施方式中，当患者第一次接受GBS偶联物时，其已经用Dt(或衍生物)预先免疫。在其他实施方式中，将GBS偶联物给予已经用(i)Dt或衍生物和(ii)GBS偶联物预先免疫的患者。
破伤风类毒素运载体
尽管上面涉及白喉类毒素运载体(和其衍生物)描述本发明第二方面，优选不使用破伤风类毒素，这个方面的替代实施方式使用破伤风类毒素(或其衍生物)运载体，优选不使用白喉类毒素。在这些替代的实施方式中，能因而修改上面定义。
例如，本发明第二方面提供了对患者进行抗GBS感染免疫的方法，所述方法包含给予患者偶联物的步骤，所述偶联物是荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联的偶联物，其中所述患者用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫。这个方面也提供了某种偶联物以用于免疫患者抵御GBS感染，所述偶联物是GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，其中所述患者用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫。这个方面也提供了某种偶联物在制造免疫患者抵御GBS感染的药物中的应用，所述偶联物是GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物，其中所述患者用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫。GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物可以不遭受运载体抑制，特别是来自运载体初免（prime）的抑制。所述对GBS荚膜糖-破伤风类毒素或其衍生物偶联物的免疫反应实际上可以通过用破伤风类毒素或其衍生物预先免疫来提高。
通常，如上所述，所述偶联物是本发明第一方面的免疫原性组合物中的所述GBS偶联物之一。换言之，本发明第一方面的免疫原性组合物可以用于本发明第二方面，其中至少一个偶联物是GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联而成。所述组合物中与破伤风类毒素或其衍生物偶联的荚膜糖可以是例如GBS血清型Ia、Ib或III。特别地，所述荚膜糖可以来自GBS血清型III。在这个方面，通常组合物中所有GBS荚膜糖与破伤风类毒素或其衍生物偶联。
破伤风类毒素是熟知的蛋白[例如参见参考文献243的第27章]，并且能通过灭活破伤风梭菌的ADP核糖基化外毒素获得。患者通常接受破伤风类毒素作为D-T-P或D-T预先免疫中的‘T’抗原，或者作为偶联物中的运载体蛋白。这种偶联物包含所述‘PRP-T’Hib偶联物[参见参考文献243的表14-7]，如所述ActHIBTM、OmniHIBTM和ProHIBITTM产物。
概述
术语“包含”涵盖“包括”以及“由......组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”表示例如，x±10%。
词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。需要时，词语“基本上”可从本发明的定义中略去。
应理解糖环可以是开放或闭合形式，而且虽然本文结构式中显示的是闭合形式，但本发明也包括开放形式。类似的，应理解糖可以吡喃糖和呋喃糖形式存在，而且虽然本文的结构式中显示的是吡喃糖形式，但也包括呋喃糖形式。还可包含糖的不同异头形式。
除非另有明确说明，包括混合两种或多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将该组合与第三种组分混合等。
抗体通常对于其靶标是特异性的。因此，其对靶标的亲和性高于无关对照蛋白，例如牛血清白蛋白。
除非另外说明，优选通过MPSRCH程序（牛津分子公司(Oxford Molecular)）执行的Smith-Waterman同源性搜索算法，利用仿射缺口搜索测定多肽序列之间的相同性，其中参数为缺口开放罚分=12、缺口延伸罚分=1。
附图说明
图1显示了GBS血清型Ia和III中重复结构之间的差异。
图2显示了GBS血清型Ia、Ib、II、III和V中荚膜糖的重复结构。
图3显示了来自GBS血清型V的荚膜糖脱唾液酸化形式的重复结构。
图4显示了给予GBS血清型III荚膜糖和CRM197偶联物（有或没有佐剂）前，用CRM197初免（prime）的影响。
具体实施方式
偶联物生成
来自无乳链球菌血清型Ia、Ib和III的纯化荚膜糖通过高碘酸盐氧化反应然后还原胺化而与运载体蛋白偶联(参考文献2)。来自无乳链球菌血清型V的纯化、脱唾液酸化荚膜糖通过高碘酸盐氧化反应然后还原胺化而与运载体蛋白偶联(参考文献14)。在大部分示例中所述运载体蛋白是CRM197。当特别说明时，破伤风类毒素用作运载体蛋白。
小鼠研究(1)
在这个研究中，佐剂对作为单价或结合疫苗的GBS血清型Ia、Ib和III偶联物的功效和免疫原性影响在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中评价。
适应参考文献250的所述母体-新生幼仔攻击小鼠模型用于评价新生儿中从活性接种疫苗dam而跨胎盘获得的特异性抗体的功效。特别地，来自查尔斯河实验室（CharlesRiver Laboratories）(意大利卡尔科)的5-6周龄雌性CD-l小鼠，通过在第1、21和最终35天的2或3次免疫（有或没有佐剂）由腹膜内注射来接种。在最终免疫之后，繁殖并保持小鼠直到递送。对非免疫幼仔90%致死(100-1000倍LD50)的GBS株(0.05mL托-休二氏（Todd-Hewitt）培养基)接种体用于攻击新生小鼠。出生48小时内通过腹膜内途径攻击。记录72小时存活幼仔数目，并且使用菲希尔精确检验在所有治疗组中比较存活率。在对照组中，dam通过相同途径并且使用相同剂量方案接受PBS。在最终免疫后两周，收集血液样品以使用两种体外试验(下述ELISA和调理吞噬作用试验)评价免疫原性。
进行所述ELISA试验以测定免疫后生成的GBS特异性抗体的效价。ELISA也用于定量针对各荚膜糖抗原的总IgG。分析来自各单独小鼠的血清，并且对各组计算几何平均效价(GMT)。荚膜糖类型Ia、Ib和III的抗体效价表示为小鼠ELISA单位(MEU)，并且基于参照系试验方法（Reference Line Assay Method）计算。
进行所述调理吞噬作用试验(OPA)以评价能进行补体介导GBS杀死的疫苗诱导抗体的效价(使用参考文献251所述的方法)。通过组合下列成分进行所述试验:细菌、吞噬细胞(从人血液或分化的HL-60细胞系中提取的PMN)，补体和免疫血清。在37°C孵育1h前和后接种等分的反应化合物以测定所述剩余菌落形成单位(CFU)。调理吞噬细胞杀伤(log杀死)的量通过从起始时间点存在的log(CFU数目)减去log(存活菌落数目)来测定。预先免疫血清和没有PMN的热灭活补体用作阴性对照。杀菌效价表示为交互血清稀释，造成50%细菌的下降。
此研究中，雌性CD1小鼠在第0和21天于佐剂（氢氧化铝或MF59）存在下，用两种剂量(各1μg)的三个不同偶联物免疫。用下表1所示类型特异株攻击新生幼仔。
表1：在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中，测定氢氧化铝或MF59存在下用GBS血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物获得的保护水平和抗体效价。
-不适用
就有氢氧化铝和MF59的全部三种血清型而言用单价疫苗实现高水平保护。然而，用佐剂MF59甚至在更高抗体效价存在下获得略微更低的存活率。
在其他实验中，小鼠用各1μg偶联物的三种组合剂量在佐剂存在下于第0、21和35天免疫。用下表2所示类型特异株攻击新生幼仔。
表2：在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中，测定有或没有佐剂时用GBS血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物的组合获得的保护水平和抗体效价。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III;-:不适用
尽管没有佐剂时获得更低的抗体效价，有或没有佐剂时在全部三种制剂中用疫苗组合获得高水平的保护。
小鼠研究(2)
在这项研究中，评价冻干对活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物的功效和免疫原性的影响。在第0和21天，有或没有佐剂情况下用两个剂量(各1μg)的三种不同偶联物免疫小鼠。用下表3所示类型特异株攻击新生幼仔。
表3：测定血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物在有或没有氢氧化铝情况下于活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中作为液体或冻干抗原给予小鼠时实现的保护水平、抗体效价和杀菌效价。
-不适用;ND:未测定
所述冻干过程不影响GBS偶联物的免疫原性。在接受液体和冻干制剂的小鼠中，抗体效价和杀菌效价相当。
小鼠研究(3)
在这项研究中，评价冻干对活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中血清型V/CRM197偶联物功效的影响。在第0和21天，有或没有佐剂情况下用两个剂量(各1、5或10μg)的偶联物免疫小鼠。用V型株攻击新生幼仔。结果示于下表4。
表4：测定血清型V/CRM197偶联物在有或没有氢氧化铝情况下于活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中作为液体或冻干抗原给予小鼠时实现的保护水平。
所述冻干过程不影响GBS偶联物的免疫原性。在接受液体和冻干制剂的小鼠中，存活率相当。
小鼠研究(4)
在这项研究中，评价不同剂量对活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物混合物功效的影响。在第0和21天，用两个剂量的无佐剂GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物的组合（各0.2、1或5μg）免疫小鼠。用下表5所示类型特异株攻击新生幼仔。
表5：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物的组合在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V
更高剂量GBS血清型V偶联物提升保护水平。
小鼠研究(5)
在这项研究中，评价不同数目剂量在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中对GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物混合物功效的影响。合适时在第0、21和35天下，用一个、两个或三个（1μg各偶联物）剂量的存在明矾佐剂的组合免疫小鼠。用下表6所示类型特异株攻击新生幼仔。
表6：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物的组合在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中于明矾佐剂存在下获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V
在这项研究中，给予血清型Ia、Ib、III和V偶联物的混合物后，测量杀菌效价。OPA效价如下所示:
Ia Ib III V
3后 515 >900 1174 135
2后 <100 455 525 <100
1后 <100 182 358 <100
免疫数量强烈影响对GBS血清型V偶联物的免疫反应。
小鼠研究(6)
在这项研究中，在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中评价与单独GBS血清型V偶联物相比，GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物的混合物的功效。在第0、21和35天，用三个剂量的1μg各偶联物或1μgGBS血清型V偶联物组合在明矾佐剂存在下免疫小鼠。用CJB111和2603V/R型V株攻击新生幼仔。结果示于下表7。
表7：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物的组合或单独GBS血清型V偶联物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中于佐剂存在下获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V
当组合物中也存在GBS血清型Ia、Ib和III偶联物时，对来自GBS血清型V的荚膜糖的免疫反应减少。小鼠研究(7)
在这项研究中，在活性雌性-新生幼仔攻击小鼠模型中评价与单独GBS血清型V偶联物相比，佐剂对GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物混合物的免疫原性和功效的影响。在第0、21和35天，用三个剂量的1μg各偶联物或1μgGBS血清型V偶联物组合在明矾佐剂存在或缺失情况下免疫小鼠。用CJB111型V株攻击新生幼仔。结果示于下表8。
表8：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物组合或单独GBS血清型V偶联物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中于佐剂存在或缺失情况下获得的保护水平、抗体效价和杀菌效价。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V;-不适用
再次，当组合物中也存在GBS血清型Ia、Ib和III偶联物时，对来自GBS血清型V的荚膜糖的免疫反应减少。加入佐剂提高了存活，尽管在这个实验中加入佐剂到单独GBS血清型V偶联物中没有这个影响。
小鼠研究(8)
在这项研究中，评价GBS血清型V偶联物的剂量增加对活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物混合物功效的影响。在第0和21天，用两个剂量的1μg各偶联物组合或者两个剂量的1μg GBS血清型Ia、Ib、III偶联物和5μg GBS血清型V偶联物组合在佐剂存在或缺失情况下免疫小鼠。用下表9所示类型特异株攻击新生幼仔。
表9：在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中，测定存在佐剂的GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物以及不同剂量GBS血清型V偶联物的组合获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V(所有在1μg)
组合+=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+CRM197-V(都为1μg，除了CRM197-V为5μg)
在这个实验中，加入佐剂再次提高了对混合物中来自GBS血清型V的荚膜糖的免疫反应。所述反应也通过增加所述组合物中这种荚膜糖的剂量来提高。然而，存在高剂量的来自GBS血清型V的荚膜糖似乎降低了对来自GBS血清型Ia、Ib和III的荚膜糖的反应。加入佐剂减少了这个结果。
小鼠研究(9)
在这项研究中，评价有GBS67和GBS80蛋白的GBS血清型Ia、Ib和III偶联物混合物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中的功效。用有或没有各种不同佐剂的组合免疫小鼠。用下表10所示类型特异株攻击新生幼仔。
表10：测定GBS血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物和GBS67与GBS80蛋白的组合在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+GBS67+GBS80
在这项研究中，给予血清型Ia、Ib、III和V偶联物和GBS67与GBS80蛋白的混合物后，测量抗体效价。五次单独实验的结果如下所示：
小鼠研究(10)
在这项研究中，评价有GBS67和GBS80蛋白的GBS血清型Ia、Ib和III偶联物混合物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中的功效。在第0、21和35天，用三个剂量组合在各种不同佐剂存在或缺失情况下免疫小鼠。用下表11所示类型特异株攻击新生幼仔。
表11：测定GBS血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物和GBS67与GBS80蛋白的组合在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+GBS67+GBS80
小鼠研究(11)
在这项研究中，评价有GBS67蛋白和SpbI GBS80融合蛋白的GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物混合物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中的功效。用存在佐剂的组合免疫小鼠。用下表12所示类型特异株攻击新生幼仔。
表12：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物、GBS67蛋白和SpbI GBS80融合蛋白的组合在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中获得的保护水平。
组合=CRM197-Ia+CRM197-Ib+CRM197-III+GBS67蛋白+SpbI GBS80融合蛋白
小鼠研究(12)
在这项研究中，评价GBS血清型Ia、Ib、III和V偶联物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中的功效。用1μg各偶联物免疫小鼠。用下表13所示类型特异株攻击新生幼仔。该实验重复两次。
表13：测定GBS血清型Ia、Ib、III和V/CRM197偶联物在活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中获得的保护水平。
包含来自GBS血清型Ib的荚膜糖的偶联物赋予针对GBS血清型Ia以及GBS血清型Ib的保护。
小鼠研究(13)
在这项研究中，测试与破伤风类毒素（TT）运载体蛋白或CRM197运载体蛋白偶联的荚膜糖，并且比较其免疫原性。在第0和21天，用两个剂量的1μg各GBS血清型Ia、Ib和III偶联物与氢氧化铝佐剂免疫雌性CD1小鼠。用下表14所示特异株类型攻击新生幼仔。
表14：测定活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型中与TT或CRM偶联的GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖实现的保护。
*%存活(存活/治疗)
用所有三种血清型的CRM197偶联物免疫的组中存活率与用TT偶联物的免疫组观察到的存活率相当。基于这些结果，选择CRM197作为进一步开发的运载体蛋白。
小鼠研究(14)
在这项研究中，评价了共价偶联过程中荚膜糖氧化水平对免疫原性的影响。用与TT和/或CRM197偶联的以不同氧化百分比制备并且在雌性CD1小鼠中测试其免疫原性的糖获得数批GBS血清型Ia、Ib和III偶联物。在第0和21天，用两个剂量(各1μg)的三种不同偶联物在氢氧化铝佐剂存在下免疫小鼠。用下表15所示类型株攻击新生幼仔。
表15：使用活性母体-新生幼仔攻击小鼠模型测定与TT或CRM197偶联的和不同氧化百分比的GBS血清型Ia和III荚膜糖的保护水平、抗体效价和杀菌效价
-不适用
当用从氧化15-20%的糖制备的偶联物免疫所述dam时，所述存活率达到峰值。所述抗体效价随着氧化水平增加而增加，对功能没有影响。对于更高的抗体效价，所述杀菌效价没有增加。基于这些结果和其他实验(数据未显示)，就全部三种血清型而言CPS氧化的最优化百分比定义为10-30%。
兔和大鼠中的增殖和发育毒理学研究
两个物种的结果显示血清型Ia、Ib和III/CRM197偶联物对胚胎或胎儿发育没有影响。
在兔中，在相对于第0天交配(前交配期)的第-35、-21和-7天与妊娠第7和20天或者仅在妊娠第7和20天，用临床剂量20/20/20μg(基于各糖的质量)，通过肌肉内注射给予有氢氧化铝佐剂的三种偶联物组合。任意剂量水平的治疗既没有造成母体毒性、对交配的影响，也没有证据显示胚胎致死、胎体毒性或致畸性。
大鼠中，当给予所述组合，并且在给予3(仅在妊娠中)或6(妊娠前或妊娠中)次注射的盐水组合对比氢氧化铝佐剂组合的组之间没有注意到区别时，相似地没有母体毒性或对生殖功能和胚胎胎儿发育影响的证据。在相对于交配第0天的第-35、-21和-7天以及在妊娠第6、12和17天或者仅在妊娠第6、12和17天，给予注射。在断奶前阶段，对F1代幼崽存活、临床条件或体重没有影响。
人研究(1)
这项研究探讨了单价GBS血清型Ia荚膜糖-CRM197偶联物疫苗。对10个对象的测试组，以5、10或20μg(测量作为糖的质量)剂量给予1或2次注射。3和2个对象的安慰剂组分别接受1和2次盐水注射。为了ELISA分析，在筛选或第一次注射后1个月，从各对象取血。另外，在研究的第3个月，所述2次注射组在其接受第二注射时取血，然后就另一次取血而言在1个月后恢复。在所述对象接受最后一次注射后6、12和24个月进行再一次取血。
所述ELISA测量针对GBS Ia(下述研究中的或Ib和III)荚膜糖的特异抗体浓度。微量滴定板用1μg/ml合适的GBS糖(与HSA偶联)涂层，并且用取自研究对象的血清37°C孵育1小时。3次洗涤后，所述板用碱性磷酸酶(AP)标记的抗人IgG第二抗体37°C孵育90分钟，然后再3次洗涤。所述底物(pNPP)加入板中，并且室温孵育30分钟。所述AP催化底物的水解，生成能通过ELISA读数仪在405nm(参照过滤650nm)定量的比色反应。使用标准曲线完成抗体浓度的评价。对各组的抗Ia抗体的几何平均浓度(μg/ml)的总结示于下表16：
表16：单价GBS血清型Ia荚膜糖CRM197偶联物疫苗研究的几何平均浓度(和几何平均比率)。
+两次注射
总体GMC数据显示了基线和晚期时间点之间的显著增加(如最终疫苗接种后1个月GMC范围为6-43μg/ml)，并且尽管随着时间有下降，研究的24个月中，所述组GMC仍然高于基线多倍(24个月时所述GMR范围为7-14)。由GMC点估计来判断，接受5μg剂量作为单个疫苗接种的组在最终疫苗接种后1个月有最高的总反应。
抗体水平≥3μg/mL的对象数目显示了最终疫苗接种后1个月，不同剂量之间(对5、10和20分别是20分之11、13和12)，和不同疫苗接种方案(对两者是20分之18)(数据未显示)之间相似数目的“响应者”。抗体水平≥5μg/mL的对象百分比证实了相同的观察(数据未显示)。这些截留值意在使得反应能在与保护相关的潜在血清学背景下评价(基于参考文献252)。这些数据提示了第二次疫苗接种或更高疫苗剂量没有可观察到的贡献。由于没有观察到剂量反应，可能成人群中最优剂量是5μg或更低。对接受5和20μg的组而言，相较1次注射，给予2次注射没有观察到持久的优势。接受10μg剂量的组显示了2次对比1次注射后更高的峰值反应(疫苗接种后1个月)，但是这个趋势在随后(稳态)时间点上逆转。
基于大量的不同标准评价安全分析。没有发生安全问题，并且没有注意到剂量依赖性反应。
人研究(2)
这项研究探讨了单价GBS血清型Ib和III荚膜糖-CRM197偶联物疫苗。对10个对象的测试组，以5、10或20μg(测量作为糖的质量)剂量给予1或2次注射。3和2个对象的安慰剂组分别接受1和2次盐水注射。为了ELISA分析，在筛选或第一次注射后1个月，从各对象取血。另外，在研究的第3个月，所述2次注射组在其接受第二次注射时取血，然后就另一次取血而言在1个月后恢复。在所述对象接受最终注射后6、12和24个月进行再一次取血。对各组的抗Ib和III抗体的几何平均浓度的总结示于下表17。
表17：单价GBS血清型III和Ib荚膜糖CRM197偶联物疫苗研究的几何平均浓度(和几何平均比率)。
+两次注射
再次，在这个小研究中，没有观察到给予2次注射相较1次有显著剂量反应或优势。
基于大量的不同标准评价安全分析。没有发生安全问题，并且没有注意到剂量依赖性反应。在反应原性指示剂中，注射点上的疼痛(对血清型Ib是98分之15的注射发生率，而对血清型III是96分之14的注射发生率)是就两种血清型引起的局部反应中最常见的主诉，并且引起的系统反应之一是头疼，但是没有观察到安慰剂和接种个体之间的明显区别。
人研究(3)
这项研究探讨了在健康、非妊娠妇女中三价GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖-CRM197偶联物疫苗。研究了两种不同的疫苗制剂，各以相同的比率组合三种糖。有或没有明矾佐剂下测试两种不同剂量(0.5ml中的5μg和20μg，测量为各糖的质量)。这项研究也对各制剂评价肌肉内1-和2次注射(间隔30天)的方案。所述疫苗也包含4.5mg氯化钠、0.34mg磷酸二氢钾和7.5mg甘露醇。研究组如下表18所概括。也测试了有20个对象的安慰剂组(两次0.9%盐水注射，间隔30天)。
表18：三价GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖-CRM197偶联物疫苗研究的研究组
为了ELISA分析免疫原性，在筛选或第一次注射后1个月，从各对象取血。所述2次注射组接受1个月时间点取血后的第二次注射。还从研究3个月的全部组中取血。对各组的抗Ia、Ib和III抗体的几何平均浓度(对基线抗体浓度调整并且排除安慰剂组)的总结示于下表19。
表19：三价GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖CRM197偶联物疫苗研究的几何平均浓度(和几何平均比率)。
+两次注射
na–无佐剂
adv–有佐剂
所述疫苗有免疫原性，在80%-100%对象中诱导跨不同血清型的GBS特异抗体增加至少2倍。比较来自8个组的GMC揭示了a)相较仅仅单次注射，第二次注射没有作用;b)相较没有佐剂，包含明矾佐剂没有作用;和c)对比5/5/5μg，更高剂量20/20/20μg没有作用。
更特异地，相较仅仅接受一次针对任何GBS血清型(Ia、Ib或III)的疫苗注射，接受两次疫苗注射对象中抗体反应没有持续增加。不考虑所述剂量(5/5/5或20/20/20μg)或所述制剂(没有明矾或明矾佐剂)，观察到第二疫苗注射缺乏作用。对GBS Ia而言，所述研究第61天时，8个组中各个GMC测量范围是7-20μg/ml。根据这些结果，相较一次注射(GMC范围[9-20μg/ml](95%CI全部重叠))，没有观察到两次注射(GMC范围[7-16μg/ml])的作用。另外，一次对比两次注射的比率是1.2[95%CI(0.7,2.0)]。这个结果指示了一次对比两次注射的实施当量(p值=0.5)。对GBS Ib而言，所述研究第61天时，8个组中各个GMC测量范围是2-7μg/ml。相较一次注射(GMC范围[4-7μg/ml](95%CI全部重叠))，没有观察到两次注射(GMC范围[2-5μg/ml])的作用。此时，一次对比两次注射的比率是1.2[95%CI(0.7,2.0)]。再次，这个结果指示了实施当量(p值=0.5)。对GBS III而言，所述研究第61天时，8个组中各个测量范围是5-13μg/ml。相较一次注射(GMC范围[5-13μg/ml](95%CI全部重叠))，没有观察到两次注射(GMC范围[5-11μg/ml])的作用。一次对比两次注射的比率是0.94[95%CI(0.55,1.66]，指示了当量(p值=0.8)。
相似地，包含明矾相较没有明矾没有增加对GMC的贡献。不考虑所述剂量(5/5/5或20/20/20μg)或注射数目，观察到缺乏明矾佐剂作用，并且在跨全部三种血清型(Ia、Ib和III)中观察到。对GBS Ia而言，在所述研究第61天，跨8个组的GMC范围为7-20μg/ml，并且显示了相较没有明矾(GMC范围[13-16μg/ml](95%CI全部重叠))，明矾没有作用(GMC范围[7-15μg/ml]。没有明矾的组相较明矾组的组GMC比率是1.6[95%CI(0.9,2.6)]，提示了没有明矾的反应潜在高于有明矾的疫苗制剂(p值=0.11)。对GBS Ib而言，在所述研究第61天，GMC范围2-7μg/ml，并且显示了相较没有明矾(GMC范围[4-7μg/ml](95%CI全部重叠))，明矾没有作用(GMC范围[2-4μg/ml]。没有明矾的组相较明矾组的组GMC比率是1.4[95%CI(0.8,2.4)]，提示了GMC值中接近当量(p值=0.2)。对GBS III而言，在所述研究第61天，GMC范围为5-13μg/ml，并且显示了相较没有明矾(GMC范围[5-13μg/ml](95%CI全部重叠))，明矾没有作用(GMC范围[5-11μg/ml]。没有明矾的组相较明矾组的组GMC比率是1.09[95%CI(0.6,1.9)]，提示了GMC值中接近当量(p值=0.7)。
最终，所述数据能评价两种剂量(5相比20μg的所述偶联物内三个糖中每一种)。所述结果提示了更高剂量(20μg)没有诱导更高抗体反应。特别地，接受5μg的对象(跨全部组)和接受20μg的对象(跨全部组)的GMC比率对GBS Ia是1.2[95%CI(0.7,2.1)];对GBS Ib是0.7[95%CI(0.4,1.2)]并且对GBS III是1.4[95%CI(0.9,2.5)]。这些比率接近1，并且对全部三种血清型而言等于1的统计测试p值>0.15，提示了两个不同剂量方案间诱导抗体的水平没有可辨别的区别。
通过局部和系统反应原性、有害事件和严重有害事件以及临床实验室结果的发生率来测量安全性。当相较安慰剂时，发现三价GBS疫苗在全部8个疫苗研究组中安全并且耐受良好。安全性通过如下评价:各疫苗接种后7天期间有与反应严重性一起发生的局部反应(即注射位点疼痛、出血斑、红斑、硬化和溶胀)和引起系统反应(即寒战、恶心、不适、肌痛、头痛、疲劳、关节痛、皮疹、发热[定义为腋窝温度≥38°C]等)的患者百分比；各疫苗接种后第1–23天报道的全部其他有害事件；多至第61天各疫苗组中有报道严重有害事件和/或造成退出研究的有害事件的对象百分比。
人研究(4)
对研究开始（study entry）(对血清型Ia、Ib和III分别是0.4、0.084和0.068μg/ml)时抗体(Ab)水平低于检测的对象反应有特殊兴趣。这个亚组分析对来自上面人研究(3)的数据实施。对各血清型而言，如下评价数据：
(a)对各注射/制剂/剂量组的GMC，和相应的95%CI
(b)所有对象的GMC，所述对象接受(i)不考虑组分配的1次注射，且这与接受2次注射的所有对象的GMC作比较。相似地，将没有接受佐剂的对象的GMC与接受明矾的对象的GMC作比较，以及将接受5/5/5μg剂量的GMC与接受20/20/20μg的所有对象的GMC作比较。所述评价基于GMC的比率，以及所述计算比率周围的双侧95%CI。
(c)相比基线至少4倍变化的对象的比例，假设作为检测最低水平的一半(lld)。
通常，对血清型III和Ia/Ib而言分别有约25%和50%妇女呈现抗体水平低于检测极限。此亚组中，在第61天与基线(其中基线值设定为半lld)相比，实现抗体水平≥4倍增加的对象的百分比范围是64-95%(血清型Ia)、80-100%(血清型III)和81-100%(血清型Ib)。
与来自全部研究组的结果相似，在研究开始时抗体水平无法检测的对象不能显示来自2次注射(对比1次注射)，来自更高剂量(对比更低剂量)或来自包含明矾(对比没有佐剂)的其他优势。就全部1次注射对比全部2次注射的对象而言GMC比例(在第61天)是1.1(0.6-1.8;血清型Ia)、0.7(0.3-1.5;血清型III)和0.9(0.5-1.4;血清型Ib);就全部5μg对比全部20μg剂量的对象而言是1.3(0.8-2.1;血清型Ia)、1.4(0.7-2.8;血清型III)和1.4(0.9-2.3;血清型Ib);就全部没有佐剂对象对比全部明矾对象而言是1.4(0.8-2.4;血清型Ia)、1(0.5-2.0;血清型III)和1.7(1.1-2.7;血清型Ib)。
小鼠研究(15)
在第0天用CRM197和氢氧化铝佐剂或者仅用氢氧化铝佐剂初免（prime）的小鼠，然后在第21天和35天用有或没有氢氧化铝佐剂的GBS血清型III/CRM197偶联物免疫。在第0天和疫苗接种前的第21天和第35天取血。从血液样品中测量对GBS血清型III多糖和CRM197运载体蛋白的IgG/IgM血清效价。
如图4所示，用CRM197运载体初免（priming）引起与未初免小鼠相比，在一次和两次疫苗剂量（有或没有佐剂）后对运载体的显著更高IgG抗体反应(P<0.0002)。初免（priming）也引起两次疫苗剂量（有或没有佐剂）后针对GBS血清型III多糖的良好抗体反应。未初免小鼠需要所述载剂从而达到与初免小鼠中观察到的相当的抗多糖抗体效价。在未初免小鼠中，当给予没有佐剂的糖偶联物疫苗时，所述抗体效价显著低于其他组(P<0.03)。
因此用CRM197初免似乎对偶联物的GBS荚膜糖成分的后续抗体反应有正影响，甚至当不含佐剂给予时。
大鼠和兔研究
在大鼠和兔中进行评价三价GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖-CRM197偶联物疫苗的潜在生殖和发育毒性的研究。
根据下表20进行所述大鼠研究：
表20：大鼠研究
±对血清型Ia/Ib/III
.*氢氧化铝,2mg/mL
在研究第1、15、29天(交配前阶段)和/或在妊娠第6、12和17天，皮下给予雌性大鼠20μg剂量（有或没有氢氧化铝）的三价疫苗对生殖功能或胚胎胎仔发育没有造成母体毒性或影响。在用三次或六次注射有或没有氢氧化铝佐剂的三价疫苗治疗的组之间没有注意到区别。另外，对F1代幼崽存活、临床条件或体重或增殖能力没有影响。
根据下表21进行所述兔研究：
表21：兔研究
±对血清型Ia/Ib/III
.*氢氧化铝,2mg/mL
在研究第1、15和29(交配前阶段)和/或在妊娠第7和20天，肌肉内给予雌性兔20μg剂量的三价疫苗和氢氧化铝既没有造成母体毒性、对交配的影响，也没有证据显示胚胎致死作用、胎体毒性或致畸性。在对照和疫苗治疗剂量的成年F1代之间没有区别。
这些研究显示三价疫苗有免疫原性，但是对妊娠大鼠或兔或其后代没有任何产前或产后影响。稳定性研究
在两个不同温度的1个月存储期间测量三价GBS血清型Ia、Ib和III荚膜糖-CRM197偶联物疫苗的稳定性。通过聚集所述三种糖偶联物制备所述疫苗，各糖偶联物以10mMKH2PO4和3%甘露醇中80μg糖/ml存在。用0.3ml溶液填充3-ml单个剂量小瓶，用溴丁基硅化的橡胶塞部分覆盖，并且接受冷冻-干燥循环。一旦冻干过程结束，所述小瓶存储在2-8°C或36-38°C。在36-38°C存储时，(使用HPAEC-PAD)检测到游离糖含量略微增加。然而，在2-8°C和36-38°C下，所述三价疫苗总体稳定存储多至一个月。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。
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Claims (11)

1.一种免疫原性组合物，其中的有效成分由以下组分构成：a)B组链球菌血清型Ia的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；b)B组链球菌血清型Ib的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；和c)B组链球菌血清型III的荚膜糖与运载体蛋白偶联而成的偶联物；其中，(i)所述组合物中B组链球菌血清型Ia、Ib和III荚膜糖各自的含量都是5μg，(ii)a)、b)和c)中的运载体蛋白是白喉类毒素或CRM197，并且(iii)所述免疫原性组合物不含佐剂。
2.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物是以单个剂量给予的组合物。
3.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述偶联物通过对10-30％糖唾液酸残基氧化偶联前生成的醛基进行还原氨化获得。
4.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述B组链球菌荚膜糖在位点7、8和/或9的唾液酸残基没有O乙酰化。
5.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物用于肌肉内给予的组合物。
6.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物包含甘露醇以稳定所述偶联物。
7.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物是用作药物的组合物。
8.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物是用于防止和/或治疗无乳链球菌(S.agalactiae)造成的疾病的疫苗。
9.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物给予妊娠妇女。
10.如权利要求1所述的免疫原性组合物，其特征在于，所述组合物给予用白喉类毒素或其衍生物预先免疫的患者，并且所述免疫原性组合物中至少一种偶联物是B组链球菌荚膜糖与白喉类毒素或其衍生物偶联而成的偶联物。
11.权利要求1所述组合物用于制备药物的用途，所述药物用于对患者进行抗B组链球菌感染的免疫，所述患者曾用白喉类毒素或其衍生物预先免疫。
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